JP5769969B2 - Axl抗体 - Google Patents
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Description
(a)配列番号16、22、28に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号17、23、29に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号18、24、30に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む少なくとも1つの重鎖アミノ酸配列、
ならびに/または
(d)配列番号13、19、25に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号14、20、26に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号15、21、27に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む少なくとも1つの軽鎖アミノ酸配列
を含む、AXLの細胞外ドメインと結合する、その断片または派生物を含めた抗体、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体に関する。
(a)配列番号16に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号17に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号18に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号13に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号14に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号15に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含み、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である。
(a)配列番号22に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号23に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号24に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号19に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号20に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号21に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含み、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である。
(a)配列番号28に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号29に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号30に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号25に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号26に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号27に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖を含み、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である。
酸配列の根底にあるDNA配列中にこのような修飾を導入するための方法は当業者によく知られている、例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Yを参照。
(a)配列番号7〜12、13〜30、37〜42、43〜46のポリペプチドをコードする核酸配列、
(b)配列番号1〜6、31〜36に示す核酸配列、
(c)(a)または(b)中の配列のいずれかと相補的な核酸、および
(d)ストリンジェントな条件下で(a)、(b)または(c)とハイブリダイズすることができる核酸配列
からなる群から選択される単離核酸分子に関する。
概評
実施した実験および得られた結果を含めた以下の実施例は例示目的にすぎず、本発明を制限するものとして解釈すべきではない。
全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)参照配列(NM_021913)に従うヒト受容体チロシンキナーゼAXL転写産物変異体1の完全長コード配列を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびSamHIの隣接認識エレメントを介してpLXSNにサブクローニングし、それによってレトロウイルス発現ベクターpLXSN-hAXLを生成した。
モノクローナルラット抗AXL抗体を、Lou/CまたはLong Evansラットに腹膜内と皮下の両方にRat 1-AXLcl.2の約10×106個の凍結細胞を注射することによって産生した。8週間隔後、最終追加抗原刺激を融合前3日に腹膜内および皮下に与えた。ミエローマ細胞系P3X63-Ag8.653とラット免疫系脾臓細胞の融合は標準手順に従い実施し、105のハイブリドーマが生成した。2週間後、ハイブリドーマ由来の第一の上清を回収し、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞とNIH3T3-Mock対照細胞の結合の一次FACSスクリーニングにおいて試験した。AXL結合に関して陽性であったクローンをさらに培養した。これらのクローンの50ml上清から、抗体を精製し、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞とNIH3T3-Mock対照細胞上のAXLの特異的結合に関して再分析した。NIH3T3-Mock対照細胞ではなくNIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞と特異的に結合する精製抗体をAkt-キナーゼリン酸化ELISAにおいてさらに試験して、かつアイソタイプを決定するためのELISAを実施した。ラット抗体の精製のために、上清を20分間5,00Ogで遠心分離にかけ、その後滅菌濾過した。500μlのタンパク質GセファロースFFを加え、スピニングホイール上で少なくとも1時間4℃でインキュベートした。セファロースを遠心分離にかけ、上清を捨て、タンパク質Gマトリクスはクエン酸バッファー(10OmM)pH2.1を利用するタンパク質溶出の前にPBSで二回洗浄した。溶出分画は1MのトリスpH8.0を加えることによってすぐに中性pHに再度中和し、PBSで透析した。
この実施例は、本発明のラット抗AXL抗体とマウスおよびカニクイザルAXL、ならびにヒトAXLファミリーの他のメンバー、ヒトMerおよびヒトSkyの交差反応性を扱う。マウスおよびサルAXLコード配列ならびにヒトMerおよびSkyのpcDNA3へのサブクローニングの後、それぞれの発現構築体をHEK293T線維芽細胞にトランスフェクトした。これらのタンパク質と結合する本発明のラット抗AXL抗体の能力は、FACS分析によって試験した。
この試験では、マウスAXL発現構築体pcDNA3-mAXLを生成した。マウスAXLの完全長コード配列は、鋳型としてマウス心臓cDNA(Ambion)および全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のマウスAXLの参照配列(NM_009465)に従う適切なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。マウスAXLをコードする完全長配列は、したがって2つの重複PCR断片、5'断片および3'断片によって覆われた。これらの断片の増幅用のプライマーは以下の通りであった:
EcoRI認識配列を有する5'断片用の順方向プライマーMOUSE1:
5'-GCGAATTCGCCACCATGGGCAGGGTCCCGCTGGCCTG-3'
5'断片用の逆方向プライマーMOUSE2:
5'-CAGCCGAGGTATAGGCTGTCACAGACACAGTCAG-3'
3'断片用の順方向プライマーMOUSE3:
5'-GCACCCTGTTAGGGTACCGGCTGGCATATC-3'
Notl認識配列を有する3'断片用の逆方向プライマーMOUSE4:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCTCCGTCCTCCTGCCCTG-3'
5'断片はEcoRIおよびBstEIIで消化し、3'断片はBstEIIおよびNotlで消化し、かつpcDNA3はEcoRIおよびNotlで切断した。単離および精製断片の3因子の結合を実施し、DH5α細菌細胞に軽質転換した。単コロニーを得て、アンピシリンの存在の下で増殖した。市販のプラスミド精製キット(Qiagen)を使用して、マウスAXL発現ベクターpcDNA3-mAXLを精製し、HEK293T細胞への後の一過性トランスフェクションのために配列を確認した。
この試験では、カニクイザルAXL発現構築体pcDNA3-cyAXLを生成した。カニクイザルAXLの完全長コード配列は、鋳型としてカニクイザル脳組織から調製したcDNAを使用してPCR増幅した。カニクイザルAXLのヌクレオチド配列が入手不能であったので、ヒトAXLとの有意な相同性を仮定して、それぞれのプライマーを設計した。カニクイザルAXLをコードする完全長配列は、したがって2つの重複PCR断片、5'断片および3'断片によって覆われた。これらの断片の増幅用のプライマーは以下の通りであった:
EcoRI認識配列を有する5'断片用の順方向プライマーCYNO1:
5'-CGGAATTCGCCACCATGGCGTGGCGGTGCCCCAG-3'
5'断片用の逆方向プライマーCYNO2:
5'-CTCTGACCTCGTGCAGATGGCAATCTTCATC-3'
3'断片用の順方向プライマーCYNO3:
5'-GTGGCCGCTGCCTGTGTCCTCATC-3'
Notl認識配列を有する3'断片用の逆方向プライマーCYNO4:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCACCATCCTCCTGCCCTG-3'
5'断片はEcoRIおよびDraIIIで消化し、3'断片はDraIIIおよびNotlで消化し、かつpcDNA3はEcoRIおよびNotlで切断した。単離および精製断片の3因子の結合を実施し、DH5α細菌細胞に軽質転換した。単コロニーを得て、アンピシリンの存在の下で増殖した。市販のプラスミド精製キット(Qiagen)を使用して、カニクイザルAXL発現ベクターpcDNA3-cyAXLを精製し、HEK293T細胞への後の一過性トランスフェクションのために配列を確認した。カニクイザルのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである:
ATGGCGTGGCGGTGCCCCAGGATGGGCAGGGTCCCGCTGGCCTGGTG
CTTGGCGCTGTGCGGCTGGGTGTGCATGGCCCCCAGGGGCACACAGG
CTGAAGAAAGTCCTTTCGTGGGTAACCCAGGGAATATCACAGGTGCCC
GGGGACTCACGGGCACCCTTCGGTGTCAGCTCCAGGTTCAGGGAGAG
CCCCCCGAGGTACACTGGCTTCGGGACGGACAGATCCTGGAGCTCGC
GGACAGTACCCAGACCCAGGTGCCCCTGGGTGAAGATGAGCAGGATGA
CTGGATAGTGGTCAGCCAGCTCAGAATCGCCTCCCTACAGCTTTCCGAC
GCGGGACAGTACCAGTGTTTGGTGTTTCTGGGACATCAGAACTTCGTGT
CCCAGCCTGGCTACGTAGGGCTGGAGGGCTTACCTTACTTCCTGGAGG
AGCCTGAGGACAGGACTGTGGCCGCCAACACCCCCTTCAACCTGAGCT
GCCAAGCCCAGGGACCCCCAGAGCCCGTGGACCTACTCTGGCTCCAG
GATGCTGTCCCCCTGGCCACAGCTCCAGGTCATGGTCCCCAGCGCAAC
CTGCATGTTCCAGGGCTGAACAAGACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCC
ATAACGCCAAGGGAGTCACCACATCCCGCACGGCCACCATCACAGTGC
TCCCCCAGCAGCCCCGTAACCTCCATCTGGTCTCCCGCCAACCCACGG
AGCTGGAGGTGGCTTGGACTCCAGGCCTGAGCGGCATCTACCCCCTGA
CCCACTGCACCCTGCAGGCTGTGCTGTCAGACGATGGGATGGGCATCC
AGGCGGGAGAACCAGACCCCCCAGAGGAGCCCCTCACCTTGCAAGCAT
CTGTGCCCCCCCACCAGCTTCGGCTGGGCAGCCTCCATCCTCACACCC
CTTATCACATCCGTGTGGCATGCACCAGCAGCCAGGGCCCCTCATCCT
GGACACACTGGCTTCCTGTGGAGACGCCGGAGGGAGTGCCCCTGGGC
CCCCCTGAGAACATTAGTGCCACGCGGAATGGGAGCCAGGCCTTCGTG
CATTGGCAGGAGCCCCGGGCGCCCCTGCAGGGTACCCTGTTAGGGTA
CCGGCTGGCGTATCAAGGCCAGGACACCCCAGAGGTGCTAATGGACAT
AGGGCTAAGGCAAGAGGTGACCCTGGAGCTGCAGGGGGACGGGTCTG
TGTCCAATCTGACAGTGTGTGTGGCAGCCTACACTGCTGCTGGGGATG
GACCCTGGAGCCTCCCAGTACCCCTGGAGGCCTGGCGCCCAGGGCAA
GCACAGCCAGTCCACCAGCTGGTGAAGGAAACTTCAGCTCCTGCCTTC
TCGTGGCCCTGGTGGTATATACTGCTAGGAGCAGTCGTGGCCGCTGCC
TGTGTCCTCATCTTGGCTCTCTTCCTTGTCCACCGGCGAAAGAAGGAGA
CCCGTTATGGAGAAGTGTTCGAGCCAACAGTGGAAAGAGGTGAACTGG
TAGTCAGGTACCGCGTGCGCAAGTCCTACAGTCGCCGGACCACTGAAG
CTACCTTGAACAGCCTGGGCATCAGTGAAGAGCTGAAGGAGAAGCTGC
GGGATGTGATGGTGGACCGGCACAAGGTGGCCCTGGGGAAGACTCTG
GGAGAAGGAGAGTTTGGAGCCGTGATGGAAGGCCAGCTCAACCAGGA
CGACTCCATCCTCAAGGTGGCTGTGAAGACAATGAAGATTGCCATCTGC
ACAAGGTCAGAGCTGGAGGATTTCCTGAGTGAAGCAGTCTGCATGAAG
GAATTCGACCATCCCAATGTCATGAGGCTCATCGGTGTCTGTTTCCAGG
GTTCTGAACGAGAGAGCTTTCCAGCACCTGTGGTCATCTTACCTTTCAT
GAAGCATGGAGACCTACACAGCTTCCTCCTCTATTCCCGGCTTGGGGA
CCAGCCAGTGTACCTGCCCACTCAGATGCTAGTGAAGTTCATGGCGGA
CATCGCCAGTGGCATGGAATATCTGAGTACCAAGAGATTCATACACCGG
GACCTGGCGGCCAGGAACTGCATGCTGAATGAGAACATGTCCGTGTGT
GTGGCGGACTTCGGGCTCTCCAAGAAGATCTACAACGGGGACTACTAC
CGCCAGGGACGTATCGCCAAGATGCCAGTCAAGTGGATTGCCATTGAG
AGTCTAGCTGACCGTGTCTACACGAGCAAGAGTGATGTGTGGTCCTTC
GGGGTGACAATGTGGGAGATTGCCACAAGAGGCCAAACCCCATATCCA
GGCGTGGAGAACAGCGAGATTTATGACTATCTGCGCCAGGGAAATCGC
CTGAAGCAGCCTGCGGACTGTCTGGATGGACTGTATGCCTTGATGTCG
CGGTGCTGGGAGCTAAATCCCCAGGACCGGCCAAGTTTTACAGAGCTG
CGGGAAGATTTGGAGAACACACTGAAGGCCTTGCCTCCTGCCCAGGAG
CCTGACGAAATCCTCTATGTCAACATGGATGAAGGTGGAGGTTATCCTG
AACCTCCCGGCGCTGCTGGAGGAGCTGACCCCCCAACCCAGCTAGACC
CTAAGGATTCCTGTAGCTGCCTCACTTCGGCTGAGGTCCATCCTGCTGG
ACGCTATGTCCTCTGCCCTTCCACAGCCCCTAGCCCCGCTCAGCCTGC
TGATAGGGGCTCCCCAGCAGCCCCAGGGCAGGAGGATGGTGCC
MAWRCPRMGRVPLAWCLALCGWVCMAPRGTQAEESPFVGNPGNITGAR
GLTGTLRCQLQVQGEPPEVHWLRDGQILELADSTQTQVPLGEDEQDDWIV
VSQLRIASLQLSDAGQYQCLVFLGHQNFVSQPGYVGLEGLPYFLEEPEDRT
VAANTPFNLSCQAQGPPEPVDLLWLQDAVPLATAPGHGPQRNLHVPGLNK
TSSFSCEAHNAKGVTTSRTATITVLPQQPRNLHLVSRQPTELEVAWTPGLS
GIYPLTHCTLQAVLSDDGMGIQAGEPDPPEEPLTLQASVPPHQLRLGSLHP
HTPYHIRVACTSSQGPSSWTHWLPVETPEGVPLGPPENISATRNGSQAFV
HWQEPRAPLQGTLLGYRLAYQGQDTPEVLMDIGLRQEVTLELQGDGSVSN
LTVCVAAYTAAGDGPWSLPVPLEAWRPGQAQPVHQLVKETSAPAFSWPW
WYILLGAVVAAACVLILALFLVHRRKKETRYGEVFEPTVERGELVVRYRVRK
SYSRRTTEATLNSLGISEELKEKLRDVMVDRHKVALGKTLGEGEFGAVMEG
QLNQDDSILKVAVKTMKIAICTRSELEDFLSEAVCMKEFDHPNVMRLIGVCF
QGSERESFPAPVVILPFMKHGDLHSFLLYSRLGDQPVYLPTQMLVKFMADI
ASGMEYLSTKRFIHRDLAARNCMLNENMSVCVADFGLSKKIYNGDYYRQG
RIAKMPVKWIAIESLADRVYTSKSDVWSFGVTMWEIATRGQTPYPGVENSEI
YDYLRQGNRLKQPADCLDGLYALMSRCWELNPQDRPSFTELREDLENTLK
ALPPAQEPDEILYVNMDEGGGYPEPPGAAGGADPPTQLDPKDSCSCLTSA
EVHPAGRYVLCPSTAPSPAQPADRGSPAAPGQEDGA
この試験では、ヒトMer発現構築体pcDNA3-hMerを生成した。ヒトMerの完全長コード配列は、EcoRIおよびXbaIを用いたベクターpCMV6-XL4-ヒトMer(Origene#TC116132)の切断によって得た。同じ制限エンドヌクレアーゼを用いたpcDNA3の消化後、両方の断片を連結してpcDNA3-hMerを生成した。Kozakコンセンサス配列を導入するために、pcDNA3-hMer中のヒトMerコード配列の5'領域を、ヒトMerのNCBI参照配列(NM_006343)に従う適切なプライマーを使用してPCR増幅した。これらの断片の増幅用のプライマーは以下の通りであった:
EcoRI認識配列およびKozakコンセンサス配列を有する順方向プライマーMER1:
5'-CGGAATTCGCCACCATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGC-3'
5'断片用の逆方向プライマーMER2:
5'-TCGGCTGCCATTCTGGCCAACTTCC-3'
PCR産物およびpcDNA3-hMerはEcoRIおよびEcoRVで消化し、連結させて、その中でKozakコンセンサス配列が完全長ヒトMerコード配列に先行するpcDNA3-Kozak-hMerを生成した。DH5α細菌細胞に軽質転換し、単コロニーを得て、アンピシリンの存在の下で増殖した。市販のプラスミド精製キット(Qiagen)を使用して、pcDNA3-Kozak-hMer発現ベクターを精製し、HEK293T細胞への後の一過性トランスフェクションのために配列を確認した。
この試験では、ヒトSky発現構築体pcDNA3-hSkyを生成した。ヒトSkyの完全長コード配列は、鋳型としてベクターpCMV6-XL4-ヒトSky(Origene#MG1044_A02)およびヒトSkyのNCBI参照配列(NM_006293)に従う適切なプライマーを使用してPCR増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りであった:
EcoRI認識配列を有する順方向プライマーSKY1:
5'-CGGAATTCGCCACCATGGCGCTGAGGCGGAGC-3'
XhoI認識配列を有する逆方向プライマーSKY2:
5'-GCCCTCGAGCTAACAGCTACTGTGTGGCAGTAG-3'
PCR産物およびpcDNA3はEcoRIおよびXhoIで消化し、連結させて、pcDNA3-hSky発現ベクターを生成した。DH5α細菌細胞に軽質転換し、単コロニーを得て、アンピシリンの存在の下で増殖した。市販のプラスミド精製キット(Qiagen)を使用して、pcDNA3-hSky発現ベクターを精製し、HEK293T細胞への後の一過性トランスフェクションのために配列を確認した。
マウスAXL、カニクイザルAXL、ヒトMerまたはヒトSkyの一過性発現のために、HEK293T細胞は、リン酸カルシウム法を施用して、pcDNA3空ベクター、pcDNA3-hAXL、pcDNA3mAXL、pcDNA3-cyAXL、pcDNA3-hMer、またはpcDNA3-hSkyのいずれかで一時的にトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション前に、16ml培地中の3×106個のHEK293T細胞を15cmの細胞組織培養皿に接種し、30時間7%CO2および37℃で増殖した。720μlのddH2O中のそれぞれの発現構築体または空ベクターの32μgのDNAを2.5MのCaCl2および2×BBS(pH6.96)と混合し、10分間室温に保った。溶液を細胞培養物に軽く加え、8時間3%CO2および37℃でインキュベートした。次いで培地を新たな増殖培地と交換し、24時間7%CO2および37℃で細胞を培養した。
FACS分析用に、2×105個の細胞をPBS中10mM EDTAで採取し、FACSバッファー(PBS、3%FCS、0.4%アジド)で一回洗浄し、96ウエルの丸底プレートに接種した。上清を除去するために、プレートを3分間1,000rpmで遠心分離にかけ、細胞は10μg/mlのアイソタイプ対照抗体1D5ならびに抗AXL11D5、11B7、10D12、6E7、2A1、11D7および12B7一次抗体溶液に再懸濁した(100μl/ウエル)。氷上で1時間のインキュベーション後、細胞を冷却FACSバッファーで二回洗浄し、FACSバッファー中に1:50に希釈した(100μl/ウエル)PE結合ロバ抗ラット(Jackson)二次抗体または対照用のPE結合ロバ抗マウス二次抗体と再懸濁した。光から保護し、細胞は氷上で30分間インキュベートし、FACSバッファーで二回洗浄し、Epics XL-MCLフローサイトメーター(Beckman Coulter)を使用して分析した。
ELISA実験を実施して、本発明のラット抗AXL抗体がAXLのリガンドGas6介在性活性化を阻害することができるかどうか調べた。Gas6介在性のAXL活性化は、増大した受容体チロシンリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり3×104個の細胞を正常増殖培地中、平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、増殖培地を無血清培地に交換して、一晩24時間で細胞を餓死させた。さらに一晩で、黒色Maxi-Sorp96ウエルプレート(Nunc)を2μg/mlのPBSおよび4℃においてマウス抗ホスホチロシン抗体4G10でコーティングした。第3日に、4G10抗体溶液を除去し、Maxi-SorpウエルをPBS0.5%BSAで少なくとも4時間室温においてブロッキングした。平行して、細胞を10μg/mlのマウス対照抗体72A1およびラット抗AXL抗体2A1、11D7、11D5、11B7、6E7、および10D12と37℃で1時間プレインキュベートし、400ng/mlのGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。次いで培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0,5%のアプロチニン)を補充した溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTritonX-100)中で細胞を溶かした。一方、ブロッキングバッファーを除去し、溶解物を移動させ4℃で一晩インキュベートする前に、Maxi-Sorpプレートを洗浄バッファー(PBS、0.05%のTween20)で6回洗浄した。第4日にプレートを洗浄バッファーで6回洗浄した後、室温において2時間0.5μg/mlのPBSで、ビオチニル化ラット抗AXL抗体12B7と共にウエルをインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで6回洗浄し、PBS中に1:4,000希釈したAP結合ストレプトアビジン(Chemicon#SA110)をそれぞれのウエルに加え、室温において30分間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄バッファーで6回洗浄し、AttoPhos基質溶液(Roche#11681982)を加えた。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長においてそれぞれのウエルの蛍光を回収した。
次に、ELISA実験を実施して、本発明のラット抗AXL抗体がp42/p44MAP-キナーゼのリガンドGas6介在性活性化を阻害することができるかどうか調べた。Gas6介在性のp42/p44MAP-キナーゼ活性化は、増大したタンパク質(Thr202/Tyr204)のリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり2×104個の細胞を平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、正常増殖培地を無血清培地に交換して、36時間で細胞を餓死させた。その後、細胞は10μg/mlのアイソタイプ対照抗体1D5ならびにラット抗AXL抗体11D5、11B7、および2A1と37℃で1時間プレインキュベートし、次いで400ng/mlのGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。培地を除去し、室温で30分間、PBS(pH7.5)に溶かした4%ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞は洗浄バッファー(PBS、0.1%のTween20)で二回洗浄した。細胞は洗浄バッファー中1%のH2O2、0.1%のNaN3で急冷し、室温において20分間インキュベートした。その後、冷却溶液を除去し、細胞は洗浄バッファーで二回洗浄し、PBS、0.5%BSAで4時間4℃においてブロッキングした。PBS中に1:500希釈した抗ホスホp44/p42MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)一次抗体(ポリクローナルウサギ;Cell Signaling#9101)、0.5%BSA、5mMEDTAを一晩4℃において加えた。第4日に抗体溶液を除去し、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。PBS中に1:2,500希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(Dianova#111-036-045)、0.5%BSAを次いでそれぞれのウエルに加え、室温において1.5時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで3回、およびPBSで2回、それぞれ5分間洗浄した。テトラメチルベンジジン(TMB、Calbiochem)を加え、620nmでモニターした。100μlの250nMHClを加えることによって反応を停止させ、Vmaxプレートリーダー(Thermo Lab Systems)を使用して620nmの参照波長で、450nmにおいて吸光度を読み取った。
さらに、ELISA実験を実施して、本発明のラット抗AXL抗体がAkt-キナーゼのリガンドGas6介在性活性化を阻害することができるかどうか調べた。Gas6介在性のAkt-キナーゼ活性化は、増大したタンパク質(Ser473)のリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり2×104個の細胞を平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、正常増殖培地を血清低下(DMEM、0.5%のFCS、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞用)または無血清(癌細胞系用)培地に交換して、36時間で細胞を餓死させた。その後、細胞は10μg/mlのアイソタイプ対照抗体1D5ならびにラット抗AXL抗体11D5、11B7、および2A1と37℃で1時間プレインキュベートし、次いで400ng/mlのGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。培地を除去し、室温で30分間、PBS(pH7.5)に溶かした4%ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞は洗浄バッファー(PBS、0.1%のTween20)で二回洗浄した。細胞は1%のH2O2、0.1%のNaN3、洗浄バッファー中で急冷し、室温において20分間インキュベートした。その後、冷却溶液を除去し、細胞は洗浄バッファーで二回洗浄し、PBS、0.5%BSAで4時間4℃においてブロッキングした。PBS中に1:500希釈した抗ホスホAkt(Ser473)一次抗体(ポリクローナルウサギ;Cell Signaling#9271)、0.5%BSA、5mMEDTAを一晩4℃において加えた。第4日に抗体溶液を除去し、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。PBS中に1:2,500希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(Dianova#111-036-045)、0.5%BSAを次いでそれぞれのウエルに加え、室温において1.5時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで3回、およびPBSで2回、それぞれ5分間洗浄した。テトラメチルベンジジン(TMB、Calbiochem)を加え、620nmでモニターした。100μlの250nMHClを加えることによって反応を停止させ、Vmaxプレートリーダー(Thermo Lab Systems)を使用して620nmの参照波長で、450nmにおいて吸光度を読み取った。
ラット抗AXL抗体11B7と11D5のキメラ派生物を本発明の一部として生成した(以下参照)。本発明のラット抗AXL抗体と本発明の対応するキメラ抗AXL抗体が、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞中のAkt-キナーゼのリガンドGas6介在性活性化を同程度で阻害することができたかどうか調べるために、ELISA実験を実施した。抗体介在性のAkt-キナーゼ阻害は、低下したタンパク質(Ser473)のリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり2×104個の細胞を平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、正常増殖培地を血清低下(DMEM、0.5%のFCS)培地に交換して、36時間で細胞を餓死させた。その後、細胞は50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、および1μg/mlのラット抗AXL抗体11B7またはキメラ抗AXL抗体ch11B7、ならびに50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、および10μg/mlのラット抗AXL抗体11D5またはキメラ抗AXL抗体ch11D5と37℃で1時間プレインキュベートし、次いで400ng/mlのGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。培地を除去し、室温で30分間、PBS(pH7.5)に溶かした4%ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞は洗浄バッファー(PBS、0.1%のTween20)で二回洗浄した。細胞は1%のH2O2、0.1%のNaN3、洗浄バッファー中で急冷し、室温において20分間インキュベートした。その後、冷却溶液を除去し、細胞は洗浄バッファーで二回洗浄し、PBS、0.5%BSAで4時間4℃においてブロッキングした。PBS中に1:500希釈した抗ホスホAkt(Ser473)一次抗体(ポリクローナルウサギ;Cell Signaling#9271)、0.5%BSA、5mMEDTAを一晩4℃において加えた。第4日に抗体溶液を除去し、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。PBS中に1:2,500希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(Dianova#111-036-045)、0.5%BSAを次いでそれぞれのウエルに加え、室温において1.5時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで3回、およびPBSで2回、それぞれ5分間洗浄した。テトラメチルベンジジン(TMB、Calbiochem)を加え、620nmでモニターした。100μlの250nMHClを加えることによって反応を停止させ、Vmaxプレートリーダー(Thermo Lab Systems)を使用して620nmの参照波長で、450nmにおいて吸光度を読み取った。
本発明のラット抗AXL抗体が、それらがAXL-ECDドメイン上の類似した結合エピトープに関して互いに競合するかどうか調べた。したがって、ビオチニル化抗AXL抗体と抗AXL抗体とプレインキュベートしたAXL-ECDドメインコーティングプレートの結合を、競合ELISAにおいて決定した。簡潔には、30μgのアイソタイプ対照抗体1D5ならびにラット抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7、および2A1を、製造者の説明書に従いSulfo-NHS-ビオチン(Pierce#21217)でビオチニル化し、Micro-BioSpinP6カラムSSC(BIO-RAD #732-6200)を使用して精製した。第1日に、黒色96ウエルMaxi-Sorpプレート(Nunc)を、4℃で一晩PBSに溶かした100μl/ウエルの1μg/mlのヒトAXL-ECD(R&D Systems#154-AL)でコーティングした。第2日に、コーティングしたMaxi-Sorpプレートをブロッキングバッファー(PBS、1%のBSA、0.05%のTWEEN-20)で室温において2時間ブロッキングし(250μl/ウエル)、その後室温において1時間ブロッキングバッファー中で10μg/mlで(100μl/ウエル)、PBSまたは非ビオチニル化アイソタイプ対照抗体1D5ならびに非ビオチニル化ラット抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7、または2A1と共にインキュベートした。抗体溶液を洗浄せずに除去し、100μl/ウエルのPBSまたはビオチニル化アイソタイプ対照抗体1D5ならびにビオチニル化ラット抗AXL抗体11B7、11D5、6E7、10D12、11D7、または2A1は、ブロッキングバッファー中に0.5μg/mlで加え、室温において15分間インキュベートした。洗浄バッファー(PBS、0,1%のTWEEN-20)で6回洗浄した後、ブロッキングバッファー中1:4,000に希釈した80μl/ウエルのAP結合ストレプトアビジン(Chemicon#SA110)を加え、室温において20分間インキュベートし、再度洗浄バッファーで6回洗浄し、最後にPBSで一回洗浄した。検出用に、100μl/ウエルのAttophos基質溶液(Roche#11681982)を加えた。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長においてそれぞれのウエルの蛍光を回収した。
異なる細胞の移動および増殖率ならびに培養条件を調べるために、in vitro創傷治癒/擦過傷アッセイが長年利用されている。これらのアッセイは一般に、最初に融合性細胞単層を増殖することを含む。次いで小領域を分離し、例えばピペット先端でこの層の線を傷つけることによって一群の細胞を破壊または除去する。細胞が移動し損傷部位を充填するとき(「創傷」)、開いた裂け目を次いで経時的に顕微鏡によって調べる。簡潔には、1.5×106個のNCI-H292肺癌細胞を12ウエル皿のウエル当たりに接種し、正常増殖培地(RPMI、10%のFCS)中で培養した。8時間後、細胞をPBSで洗い流し、一晩24時間血清低下培地(RPMI、0.5%のFCS)中で餓死させた。滅菌した200μlピペットの先端を使用して、ウエル当たり3つの別個の均一な創傷を融合性NCI-H292細胞単層を介して傷つけた。細胞はPBSで軽く洗い流し、比較用に、添加剤なし、10μg/mlのアイソタイプ対照抗体1D5、アンタゴニストラット抗AXL抗体11D5、11B7、6E7、または10D12、キメラ抗AXL抗体chn11D5IgG2およびchn11B7IgG2、アゴニストラット抗AXL抗体2A1および11D7、ならびに10μg/mlのErbituxまたは5μMのSutentを含有する低血清培地(RPMI、10%のFCS)でインキュベートした。細胞を24時間で洗浄領域に移動させ、PBSで一回洗浄し、氷冷メタノール(100%)で-20℃において固定した。細胞をクリスタルバイオレット(0.5%、20%メタノール中)で染色した後、水で洗い流し、一晩乾燥させ、創傷の写真を撮影した。
トランスマイグレーションの実験を実施して、本発明の抗体が細胞移動を阻害するかどうか調べた。この目的のために、第1日の朝に、NIH3T3-AXLcl.7細胞を15cm皿上、正常増殖培地中に接種し、それを夕方に血清低下培地(DMEM、0.5%のFCS)に交換して、36時間で細胞を餓死させた。翌日、FluoroBlock96ウエルプレート(Becton Dickinson#351164、8μm孔径)を、37℃において一晩10μgコラーゲンI/ml0.1M酢酸でコーティングした。第3日に、血清低下培地(DMEM、0.5%のFCS)をさらに4時間、無血清培地(DMEM、0%のFCS、0.1%のBSA)に交換した。PBS中10mM EDTAで細胞を採取し、4×105個の細胞/mlの細胞密度および10μg/mlの抗体濃度で45分、ラット抗AXL抗体4A6、11B7または2A1と共にプレインキュベートした。次いでウエル当たり50μlの細胞懸濁液(20,000細胞)を、FluoroBlock96ウエルプレートの上部チャンバーに置き、ウエル当たり400ng/mlマウスGas6(R&D Systems)有りまたはなしの225μlの培地(DMEM、0%のFCS、0.1%のBSA)を底部チャンバーにおいて使用した。細胞は37℃において7時間移動させ、その後4.2μMのカルセイン-AM(Molecular Probes#C3099)PBS中、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2で37℃において1時間染色した。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、530nmの波長においてそれぞれのウエルの蛍光を測定した。
in vitroにおいて実験を実施して、Gas6誘導性細胞増殖を阻害する本発明のラット抗AXL抗体の能力を決定した。この目的のために、ウエル当たり2,500個のNIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞を、一晩96ウエルプレート上のFCS含有培地中に接種した。翌日、血清低下培地(DMEM、0.5%のFCS)において10時間で細胞を餓死させ、その後20μg/mlのマウス対照抗体72A1、アンタゴニストラット抗AXL抗体11D5および11B7、ならびにアゴニスト抗体2A1と共に、DMEM、0.5%FCS中で1時間37℃においてプレインキュベートした。細胞は抗体溶液に直接リガンドを加えることによって400ng/mlマウスGas6(R&D Systems)有りまたはなしで処理し、次いで96時間増殖させた。AlamarBlue(商標)(BIOSOURCE#DAL1100)を加え、暗所で37℃においてインキュベートした。吸光度は30分毎に590nmで測定した。AlamarBlue(商標)を加えた4時間後にデータを得た。
アポトーシスの誘導およびカスパーゼの活性化は、増殖因子離脱、化学療法剤または放射線への露出、またはFas/Apo-1受容体介在性細胞死プロセスの開始を含めた様々な刺激から生じる可能性がある。Gas6-AXL相互作用は、血清飢餓NIH3T3線維芽細胞(Goruppiら、1996、Oncogene 12、471〜480頁)または肺内皮細胞(Healyら、2001、Am.J.Physiol.、280、1273〜1281頁)を含めた一定範囲の細胞型のアポトーシスからの防御と関係があることが示されてきている。この実施例において本発明者らは、本発明のラット抗AXL抗体は血清飢餓NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞のGas6介在性抗アポトーシスに干渉し、したがってアポトーシスを誘導するかどうか調べた。したがってアポトーシス率は、細胞のカスパーゼ-3/7活性の測定によって決定した。この目的のために、NIH3T3-AXLcl.7細胞を黒色透明底96ウエルプレート中にウエル当たり1.5×103個の細胞の密度で接種した(100μl/ウエル)。翌日、正常増殖培地を血清低下培地(DMEM、0.5%のFCS)と交換して、一晩24時間で細胞を餓死させた。翌日、DMEM、0%のFCS、0.01%のBSA中に80μg/mlで、アイソタイプ対照抗体1D5、アンタゴニストラット抗AXL抗体11B7および11D5、ならびにアゴニストラット抗AXL抗体11D7および2A1の抗体溶液を調製した。細胞はPBSで洗浄し、60μlのDMEM、0%のFCS、0.01%のBSAで覆い、10μlのそれぞれの抗体溶液を加えた。37℃で1時間のインキュベーション後、10μlのDMEM、0%のFCS、0.01%のBSA、3.2μg/mlのマウスGas6(R&D Systems)有りまたはなしを加え(抗体およびGas6の最終濃度はそれぞれ10μg/mlおよび400ng/mlであった)、細胞はさらに5時間37℃においてインキュベートした。以下のステップは、Apo-ONE Homogenwousカスパーゼ-3/7アッセイ(Promega、G7791)に対する技術告示を指す。簡潔には、培養プレートをインキュベーターから除去し、20分間室温で平衡状態に保った。60μlのApo-ONE基質と6mlバッファーを解凍し、組合せ、サンプルに加えた(75μl/ウエル)。ウエルの中身を30秒間軽く攪拌し、光から保護し、室温で1時間インキュベートした。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、485nmの励起波長および530nmの発光波長においてそれぞれのウエルの蛍光を測定した。
AXLは、in vitroでの内皮細胞の移動、増殖、および管形成を含めた多数の血管新生挙動の重要なレギュレーターである(Hollandら、Cancer Res:65、9294〜9303頁、2005)。したがって、本発明のラット抗AXLモノクローナル抗体11B7および11D5を、HUVEC球状系細胞のVEGF-A誘導性血管発芽に対する阻害効果に関して試験した。これらの実験は本来公開されたプロトコル(KorffおよびAugustin:J Cell Sci 112:3249〜58頁、1999)を修正して進めた。簡潔には、プラスチック皿において懸滴法で500個のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をピペッティングして、一晩で球状系細胞を凝集させることによって、記載されたように(KorffおよびAugustin:J Cell Biol 143:1341〜52頁、1998)球状系細胞を調製した。次いで50個のHUVEC球状系細胞を0.9mlのコラーゲン溶液中に接種し(2mg/ml)、24ウエルプレートの個々のウエルにピペッティングして重合させた。低濃度のラット抗AXL抗体11B7および11D5(1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M)を重合前にコラーゲン溶液中で直接混合し、一方増殖因子VEGF-A(最終濃度25ng/ml)を、重合ゲルの上部での100μlの10倍濃縮希釈標準溶液のピペッティングによって30分後に加えた。プレートは24時間37℃においてインキュベートし、4%のパラホルムアルデヒドを加えることによって固定した。HUVEC球状系細胞の発芽強度は、倒立顕微鏡およびデジタル画像ソフトウェアAnalysis3.2(Softイメージングシステム、Munster、ドイツ)を使用して、球状系細胞当たりの累積発芽長を決定する画像解析システムによって定量化した。10個のランダムに選択した球状系細胞の累積発芽長の平均を、個々のデータ点として分析した。
治療用抗体の抗腫瘍有効性は、ヒト異種移植腫瘍試験において評価されることが多い。これらのモデル系では、ヒト腫瘍を免疫不全マウス中で異種移植片として増殖させ、腫瘍増殖阻害の程度によって治療有効性を測定する。この試験の目的は、本発明のアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7が、ヌードマウス中のヒト前立腺癌細胞の腫瘍増殖に干渉するかどうか評価することであった。簡潔には、第0日に、7〜8週齢のオスNMRI-nu/nuマウス(およその重量:順化後30g)に、2l/分の酸素流量において1.5〜2.0体積パーセントのイソフルランで麻酔をかけ、25μlのPBS中の1×106個のPC-3-LN細胞を前立腺中に同所に移植した。PC-3-LN細胞は、ルシフェラーゼ-ネオマイシン融合タンパク質をコードするレトロウイルスに感染したPC-3前立腺癌細胞系に由来する。したがって腫瘍増殖の発症および腫瘍増殖の進行は、in vivo生物発光イメージングによって測定可能であった。この目的のために、ルシフェリンをマウスに腹膜内(i.p.)注射して、NightOWLLB981生物発光イメージングシステム(Berthold Technologies、ドイツ)を使用して注射後10分で発光を測定した。初回治療の前に、動物を無作為に分け、統計的検定を実施して、各10匹の動物の治療群中の開始腫瘍体積(平均、中央および標準偏差)の均一性を保証した。第8日に全ての治療を開始し、第34日まで続け、次に第35日に解剖した。25mg/kgの25mg/kgのアイソタイプ対照抗体1D5およびアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7を、週に3回(月曜日、水曜日、金曜日)それぞれ群1および2の動物に腹膜内(i.p.)投与した。群3の動物には一日一回40mg/kgのSutentを経口(p.o.)投与した。群4の動物には4日間隔でそれぞれ12.5mg/kgのTaxotereを3回静脈内(i.v.)注射した。治療群の概要は以下に与える。
「Rat anti-AXL antibodies of the invention reduce human prostate carcinoma growth in nude mice」で記載されたのと同じ実験において、他の器官へのPC-3-LN腫瘍細胞の再局在化(転移)を解剖後に分析して、本発明のアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7の抗転移効果を評価した。この目的のために、選択した器官(肝臓、脾臓、肺、大腿骨、および腰椎の一部)を解剖後に回収し、均質化し、ルシフェリンを補充した。その後、NightOWLLB981生物発光イメージングシステム(Berthold Technologies、ドイツ)を使用して発光を測定した。
この試験では、17の異なるヒト悪性腫瘍におけるAXL発現を、組織マルチアレイ形式でホルマリン固定パラフィン包埋組織において免疫組織化学的に分析した。それぞれの腫瘍型に関して、腫瘍組織の対および非悪性腫瘍組織との適合を調べた。簡潔には、組織を16〜20時間4%の中性緩衝ホルマリン固定し、パラフィン包埋した。60コア組織マイクロアレイ(TMA)の構築用に、各症例の健常組織の1つの穿孔および対応する腫瘍組織の1つの穿孔が病理学者によって選択された。正常対照組織穿孔(それぞれの組織型の3個)を有する96コアTMAをFDAガイドラインに関して生成した。それぞれの穿孔は直径1.5mmであった。
17A.ラット抗体可変ドメインのヌクレオチド配列
ラット抗AXL抗体の可変ドメインをハイブリドーマ細胞からクローニングした。RNAはRNA抽出キットRNeasy(RNeasy midi-キット、Qiagen)を利用して調製した。抗体遺伝子をコードするcDNAは、製造者の説明書に従い5'RACEキット(Invitrogen)を使用して調製する。
kappa_GSP1:GATGGATGCATTGGTGCAGC
新_kappa_GSP1:ATAGATACAGTTGGTGCAGC
重鎖_GSP1:CAGGGTCACCATGGAGTTA
GSP2プライマー:
XhoI-hGSP2:CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG
XhoI-kGSP2:CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG
11B7:kappaGSP1;XhoI-kGSP2
重鎖GSP1;XhoI-hGSP2
10D12:kappa_GSP1、新_kappa_GSP1;XhoI-kGSP2
重鎖GSP1;XhoI-hGSP2
11D5:新_kappa_GSP1;XhoI-kGSP2
重鎖GSP1;XhoI-hGSP2
ラット抗体可変ドメインの配列を、クローニングした配列決定遺伝子からpLXSN-ESKベクターに翻訳した。所与のアミノ酸配列は可変ドメインの1つの位置で始まる。抗体とその標的の特異的結合に必要とされる相補性決定領域(CDR)は、Kabat(KabatらSequences of Proteins of Immunological Interest、Fifth Edition.NIH Publication No.91〜3242頁、1991)に従い定義される。Kabatの定義は可変ドメイン内の配列変動性に基づく。抗体の抗AXL特異的CDR領域は配列番号13〜30で列挙する。個々のCDRは以下の位置を含む:
CDR-L1:24〜34
CDR-L2:50〜56
CDR-L3:89〜97
CDR-H1:31〜35b
CDR-H2:50〜65
CDR-H3:95〜102
4.5g/Lのグルコース、1%のグルタミン、1%のピルビン酸塩、1%のPen/Strepを含むDMEMを使用して37℃、5〜7%のCO2において、CellineCL1000バイオリアクター(Integra Biosciences)中でハイブリドーマを培養した。FCSの補充は、栄養区画に関して1%のFCSおよび細胞区画に関して5%低IgGFCSである。採取および培地交換は週に2回実施する。細胞増殖に応じた1/1〜>1/3の細胞分裂。生産性はSDS-PAGE分析によって週に1回試験する。精製まで上清は-20℃で保存する。実験培養物のマイコプラズマ試験は週に1回実施する。
・rSDS-PAGEゲル分析;クーマシーまたは銀染色
・BCA試験(Pierce#23227BCAタンパク質アッセイキット;ラットIgG標準#31233)
・分析用サイズ排除(Superdex200Tricorn10/300GL、250μl中約250mg;0.5ml/分、Akta Explorer100)
・エンドトキシン試験(LAL、CambrexQCL-1000(登録商標)色原体LAL終点アッセイ#US50-648U)
・細胞ベースの活性アッセイ(FACS結合;pAkt;pAXL)を含む。
ヒトAXL過剰発現NIH3T3細胞をPBS中10mM EDTAとのインキュベーションによって採取し、FACSバッファー(PBSpH7.4、3%のFCS、0.1%のNaN3)中に1ml当たり6百万個の細胞で再懸濁した。丸底マイクロタイタープレートにおいて、100μlの細胞懸濁液を、FACSバッファー中に40μg/mlと0.002μg/mlの間の濃度(266および0.01nM)で、抗体11B7、11D5、ch11B7-IgG2またはch11D5-IgG2を含有する100μlの抗体溶液に加えた。抗体の結合は氷上において2時間進行させた。次いで、細胞はウエル当たり250μlのFACSバッファーで二回洗浄し、FACSバッファー中に1:50希釈した200μlの二次抗体(抗ラットPE;Jackson)に再懸濁した。45分のインキュベーション後、再度細胞をFACSバッファーで二回洗浄し、FACS分析用に500mlのPBSに再懸濁した。分析はBeckman-CoulterFACSFC500で実施した。見かけの親和性定数KDappを決定するために、平均蛍光値を平均蛍光と対応する抗体濃度([M])の比に対してプロットした。直線の逆勾配から生じた計算上のKDappを以下に挙げる:
ヒトkappa軽鎖および重鎖IgG1/2遺伝子を、以下に記載したようにヒトボランティアの末梢血単核細胞(PBMC)からクローニングした:
2) RT-γ2: GGG CTT GCC GGC CGT G
3) RT-κ: TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG
4) 5'Blp: AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT
5) 3'Bam(GAG): AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G
6) 5'Bsi: AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT
7) 3'Bam(CTT): AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT
κ-鎖増幅:
94℃ 120秒
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 45秒サイクル35回
72℃ 10分
γ-鎖増幅:
94℃ 120秒
94℃ 30秒
45℃ 30秒
72℃ 60秒サイクル5回
94℃ 30秒
50℃ 30秒
72℃ 60秒サイクル35回
72℃ 10分
94℃ 120秒
94℃ 30秒
55℃ 30秒
72℃ 60秒サイクル35回
72℃ 10分
VL-11B7-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TGC CTC
VL-11D5-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GTC TCC ATC
VL-11D5-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG
VH-11B7/11D5-3': AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GAC TCC TTG GCC
キメラ抗体のラット可変領域を、免疫グロブリンドメインに関するBLAST検索によってタンパク質レベルでヒト抗体生殖細胞配列と比較した。同一のCDRループ長をさらに有していたV-遺伝子内の最も近いヒト相当物を同定した。結合したDセグメントとJセグメントを、類似の手法中のラット配列とのそれらの相同性に従いV-BASEデータベース(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)から選択した。
VL11B7ヒト:Vκ1-012+Jk1
VL11B7ヒト:VH4-59+D4-4(リーディングフレーム3)+JH4
VL11D5ヒト:Vκ1-L1+Jκ4
VL11D5ヒト:VH4-59+D4-4(リーディングフレーム3)+JH4
ラット抗Axl抗体11B7および11D5のキメラ派生物を本発明の一部として生成した(以下参照)。本発明のラット抗Axl抗体と本発明の対応するキメラ抗Axl抗体が、in vitroにおいて同程度でリガンドGas6介在性Axl活性化を阻害することができたかどうか調べるために、CaSki子宮頸癌細胞においてELISA実験を実施した。したがってGas6介在性Axl活性化を、増大した受容体チロシンリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり3×104個の細胞を正常増殖培地中、平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、増殖培地を無血清培地に交換して、一晩24時間で細胞を餓死させた。さらに一晩で、黒色Maxi-Sorp96ウエルプレート(Nunc)を2μg/mlのPBSおよび4℃においてマウス抗ホスホチロシン抗体4G10でコーティングした。第3日に、4G10抗体溶液を除去し、Maxi-SorpウエルをPBS0.5%BSAで少なくとも4時間室温においてブロッキングした。平行して、細胞は50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml、および10μg/mlのラット抗Axl抗体11B7またはキメラ抗Axl抗体ch11B7と37℃で1時間プレインキュベートし、後に400ng/mlのGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。次いで培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0,5%のアプロチニン)を補充した溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTritonX-100)中で細胞を溶かした。一方、ブロッキングバッファーを除去し、溶解物を移動させ4℃で一晩インキュベートする前に、Maxi-Sorpプレートを洗浄バッファー(PBS、0.05%のTween20)で6回洗浄した。第4日にプレートを洗浄バッファーで6回洗浄した後、室温において2時間0.5μg/mlのPBSで、ビオチニル化ラット抗Axl抗体12B7と共にウエルをインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで6回洗浄し、PBS中に1:4,000希釈したAP結合ストレプトアビジン(Chemicon#SA110)をそれぞれのウエルに加え、室温において30分間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄バッファーで6回洗浄し、AttoPhos基質溶液(Roche#11681982)を加えた。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長においてそれぞれのウエルの蛍光を回収した。
本発明のラット抗Axl抗体と本発明の対応するキメラ抗Axl抗体が、CaSki子宮頸癌細胞においてp42/p44MAP-キナーゼのGas6誘導性活性化も同程度で阻害することができたかどうかをさらに確認するために、ELISA実験を実施した。ここでは、Gas6誘導性p42/p44MAP-キナーゼ活性化は、増大したタンパク質(Thr202/Tyr204)のリン酸化によって検出した。簡潔には、第1日に、ウエル当たり2×104個の細胞を平底96ウエルプレート中に接種した。翌日、正常増殖培地を無血清培地に交換して、24時間で細胞を餓死させた。その後、細胞は50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml、および10μg/mlのラット抗Axl抗体11B7またはキメラ抗Axl抗体ch11B7と37℃で1時間プレインキュベートし、次いで400ng/mlのmGas6(R&D Systems)有りまたはなしで37℃において10分間処理した。培地を除去し、室温で30分間、PBS(pH7.5)に溶かした4%ホルムアルデヒドで細胞を固定した。ホルムアルデヒド溶液を除去し、細胞は洗浄バッファー(PBS、0.1%のTween20)で二回洗浄した。細胞は1%のH2O2、0.1%のNaN3、洗浄バッファー中で急冷し、室温において20分間インキュベートした。その後、冷却溶液を除去し、細胞は洗浄バッファーで二回洗浄し、PBS、0.5%BSAで4時間室温においてブロッキングした。PBS中に1:1,000希釈した抗ホスホp44/p42MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)一次抗体(ポリクローナルウサギ;Cell Signaling#9101)、0.5%BSA、0.05%Tween20、5mMEDTAを一晩4℃において加えた。第4日に抗体溶液を除去し、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。PBS中に1:2,500希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(Dianova#111-036-045)、0.5%BSA、0.05%Tween20、5mMEDTAを次いでそれぞれのウエルに加え、室温において1.5時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで3回、それぞれ5分間洗浄した。テトラメチルベンジジン(TMB、Calbiochem)を加え、620nmでモニターした。100μlの250nMHClを加えることによって反応を停止させ、Vmaxプレートリーダー(Thermo Lab Systems)を使用して620nmの参照波長で、450nmにおいて吸光度を読み取った。
本発明のラット抗Axl抗体は、血清飢餓NIH3T3-Axlcl.7線維芽細胞のGas6介在性抗アポトーシスに干渉することが判明したので、アンタゴニスト抗Axl抗体はアポトーシスを誘導する際に化学療法剤と相乗作用し、それによって薬剤耐性の克服に貢献し得るかどうかという疑問が生じた。この実施例では、ドキソルビシンを含めた幾つかの作用物質に対する高レベルの耐性を示す(Fairchildら、1987、Cancer Research、47、5141〜5148頁;Xuら、2002、The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics、302、963〜971頁)、(本来MCF-7/AdrR)NCI/ADR-RES細胞、卵巣癌細胞系(Liscovitch and Ravid、2007、Cancer Letters、245、350〜352頁)を、アンタゴニスト抗Axl抗体11B7および/またはドキソルビシンとインキュベートし、かつアポトーシス率はTUNEL染色によって決定した。簡潔には、正常増殖培地中の3×104個のNCI/ADR-RES細胞を8チャンバー培養スライド(BD Falcon、カタログ番号354118)のウエル当たりに接種し、それら37℃で1時間は同じ培地でプレインキュベートした。翌朝、正常増殖培地を除去し、細胞を洗浄し、血清低下(0.5%FCS)培地で培養した。夕方に、アイソタイプ対照抗体1D5またはアンタゴニスト抗Axl抗体11B7を、それぞれ10μg/mlの最終濃度で加えた。第3日の朝に、100μM、150μM、または200μMの最終濃度でドキソルビシンを加え、細胞は37℃でインキュベートした。24時間後、細胞はPBSで一回洗い流し、室温で20分間PBS(pH7.5)中4%ホルムアルデヒドで固定し、5分間空気乾燥させ、-20℃で保存した。市販のFluorescein-FragEL(商標)キット(Oncogene、カタログ番号 QIA39、現在はMerck-Calbiochemを介して流通)を使用して、供給者のマニュアル説明書(「Fluorescein-FragEL(商標)of cell preparations fixed on slides)の章、ページ10)に従いTUNEL染色を実施した。蛍光顕微鏡検査法を施用して、細胞を分析し写真を撮影した。
軟寒天アッセイを実施して、単独または化学療法剤との組合せのいずれかで足場非依存性細胞増殖を阻害する、本発明のラット抗Axl抗体の能力を調べた。軟寒天コロニー形成アッセイは形質転換細胞を試験するための標準的なin vitroアッセイである。形質転換細胞のみが軟寒天中で増殖することができるからである。簡潔には、750C-8161メラノーマ細胞を未治療状態に保ったか、または37℃で30分間IMDM培地(Gibco)において15μg/mlでアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7とプレインキュベートしたかのいずれかであった。その後、細胞をDifco高級寒天溶液と組合せ、それぞれ0.35%、0.2%、および7.5μg/mlの寒天、FCS、および11B7の濃度で50μlの上部寒天細胞懸濁液を生成した。この細胞懸濁液は20%FCSを含有する50μlの0.7%アガロース底部層の上部に平板培養し、0.2%FCSおよび一致濃度のシスプラチンを含有する別の50μlの供給層溶液で最後に覆った。サンプル当たり全150μlで、11B7およびシスプラチンの最終濃度はそれぞれ2.5μg/mlおよび1.5μM、1.0μM、0.75μM、0.5μM、または0.25μMであった。コロニーを5日間形成させ、次いで37℃で3時間50μlのMTT(Sigma、1mg/ml、PBS中)で染色した。HTS Bonitコロニー形成ソフトウェア(Lemnatec、Wuerselen)と併せてScanalyzer HTSカメラシステムを使用して、シスプラチンの有無の下でのアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7の影響を三連で分析した。
前の実施例中で、ドキソルビシンと同時投与した本発明のアンタゴニスト抗Axl抗体の相乗効果を、卵巣癌細胞系NCI/ADR-RESなどの多剤耐性癌細胞におけるアポトーシスの誘導および薬剤耐性の克服に関して観察した。さらに、足場非依存性コロニー増殖を低減する際の本発明のアンタゴニスト抗Axl抗体とシスプラチンの組合せ効果を、メラノーマ細胞系C-8161で検出した。したがって、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、癌細胞または癌疾患に罹患する患者を、照射および/または1つまたは複数のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。特に、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、メラノーマ細胞またはメラノーマに罹患する患者を、照射および/またはシスプラチン、ダカルバジン、テモゾロミド/テモダール、ムホラン/フォテムスチン、パクリタキセル、またはドセタキセルだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。さらに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、卵巣癌細胞または卵巣癌に罹患する患者を、照射および/またはドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、メルファラン、アルトレタミン、トポテカン、イフォスファミド、エトポシド、または5-フルオロウラシルだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。追加的に、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、前立腺癌細胞または前立腺癌に罹患する患者を、照射および/またはミトザントロン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、またはビンブラスチンだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。さらに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、胃腸/胃癌細胞または胃腸/胃癌に罹患する患者を、照射および/または5-フルオロウラシル、マイトマイシンC、シスプラチン、ドキソルビシン、メトトレキセート、エトポシド、ロイコボリン、エピルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、またはイリノテカンだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。さらに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、乳癌細胞または乳癌に罹患する患者を、照射および/またはドキソルビシン、エピルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シクロホスファミド、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、ビノレルビン、またはトラスツズマブだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。さらに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、子宮頸癌細胞または子宮頸癌に罹患する患者を、照射および/またはシスプラチン、イフォスアミド、イリノテカン、5-フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、またはトポテカンだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。さらに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、膵臓癌細胞または膵臓癌に罹患する患者を、照射および/またはゲムシタビン、カペシタビン、または5-フルオロウラシルだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。最後に、他の癌型を除外せずに、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または薬剤耐性の克服、腫瘍細胞の生存の抑制、腫瘍細胞の成長および/または増殖の阻害、腫瘍細胞の移動、拡散および転移の低減、または腫瘍血管新生の阻害における相乗効果は、肺癌細胞または肺癌に罹患する患者を、照射および/またはシスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ビノレルビン、ビンクリスチン、イフォスアミド、ゲムシタビン、メトトレキセート、シクロホスファミド、ロムスチン、またはトポテカンだけには限られないが、これらであることが好ましい任意のさらなる抗腫瘍薬と組合せたアンタゴニスト抗Axl抗体で治療するとき予想される。
(1)AXLの細胞外ドメインと結合し、AXL活性を少なくとも部分的に阻害するモノクローナル抗体。
(2)AXL介在シグナル伝達を低減および/または妨害する、(1)に記載のモノクローナル抗体。
(3)AXLリン酸化を低減および/または妨害する、(1)または(2)に記載のモノクローナル抗体。
(4)細胞増殖を低減および/または妨害する、(1)から(3)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(5)血管新生を低減および/または妨害する、(1)から(4)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(6)細胞移動を低減および/または妨害する、(1)から(5)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(7)腫瘍転移を低減および/または妨害する、(1)から(6)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(8)AXL介在抗アポトーシスを低減および/または妨害する、(1)から(7)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(9)AXL介在PI3Kシグナル伝達を低減および/または妨害する、(1)から(8)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(10)組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体、またはそれらの断片である、(1)から(9)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(11)キメラ抗体であり、配列番号38、39、41、42からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/または配列番号37、40からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識する抗体である、(10)に記載のモノクローナル抗体。
(12)ヒト化抗体であり、配列番号44、45からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/または配列番号43、46からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識する抗体である、(10)に記載のモノクローナル抗体。
(13)Fab断片、Fab'断片、F(ab')断片、Fv断片、ダイアボディ、または単鎖抗体分子である、(1)から(12)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(14)IgG1型、IgG2型、IgG3型またはIgG4型である、(1)から(13)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(15)標識基と結合した、(1)から(14)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(16)エフェクター基と結合した、(1)から(15)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(17)足場タンパク質である、(1)から(16)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(18)(a)配列番号16、22、28に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号17、23、29に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号18、24、30に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む少なくとも1つの重鎖アミノ酸配列、
ならびに/または
(d)配列番号13、19、25に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号14、20、26に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号15、21、27に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む少なくとも1つの軽鎖アミノ酸配列
を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である、(1)から(17)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(19)(a)配列番号16に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号17に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号18に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号13に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号14に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号15に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である、(1)から(17)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(20)(a)配列番号22に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号23に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号24に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号19に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号20に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号21に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である、(1)から(17)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(21)(a)配列番号28に示すCDRH1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH1配列、
(b)配列番号29に示すCDRH2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号30に示すCDRH3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRH3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
ならびに/または
(d)配列番号25に示すCDRL1、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL1配列、
(e)配列番号26に示すCDRL2、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号27に示すCDRL3、またはそれと1もしくは2アミノ酸異なるCDRL3配列
からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖
を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である、(1)から(17)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(22)配列番号8、10、12からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸、および/または配列番号7、9、11からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するモノクローナル抗体である、(1)から(17)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(23)(a) (1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体、その抗体断片または派生物をコードする核酸配列、
(b)配列番号1〜6、31〜36に示す核酸配列、
(c)(a)または(b)中の配列のいずれかと相補的な核酸、および
(d)ストリンジェントな条件下で(a)、(b)または(c)とハイブリダイズすることができる核酸配列
からなる群から選択される単離核酸分子。
(24)(23)に記載の核酸配列を含むベクター。
(25) 発現ベクターであり、核酸配列が制御配列と作動可能に連結した、(24)に記載のベクター。
(26)(24)または(25)に記載のベクターを含む宿主。
(27) ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞である、(26)に記載の宿主。
(28)非ヒトトランスジェニック動物である、(26)に記載の宿主。
(29)(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体を製造する方法であって、(26)、(27)または(28)に記載の宿主から前記ポリペプチドを得るステップを含む方法。
(30)抗AXL抗体、好ましくは(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体、(23)に記載の核酸分子、(24)または(25)に記載のベクター、(26)、(27)または(28)に記載の宿主、または(29)に記載の方法によって生成するポリペプチドを含む医薬組成物。
(31)薬剤として許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントを含む、(30)に記載の医薬組成物。
(32)さらなる活性作用物質を含む、(30)または(31)に記載の医薬組成物。
(33)過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、(30)から(32)のいずれか一つに記載の医薬組成物。
(34)前記過剰増殖性疾患がAXLの発現、過剰発現および/または活動亢進と関係がある、(30)から(33)のいずれか一つに記載の医薬組成物。
(35)前記過剰増殖性疾患が乳癌、肺癌および他のAXL発現または過剰発現癌、および腫瘍転移の形成からなる群から選択される、(33)に記載の医薬組成物。
(36)過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体。
(37)過剰増殖性疾患の診断、予防または治療用の医薬組成物を製造するための、(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体の使用。
(38)前記過剰増殖性疾患が(33)または(34)で定義した過剰増殖性疾患である、(36)または(37)に記載の使用。
(39)AXLの発現と関係がある状態を診断するための方法であって、サンプルを(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体と接触させるステップ、およびAXLの存在を検出するステップを含む方法。
(40)状態が(34)または(35)に記載の過剰増殖性疾患である、(39)に記載の方法。
(41)患者中のAXLの発現と関係がある状態を予防または治療するための方法であって、有効量の少なくとも(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
(42)状態が(34)または(35)に記載の過剰増殖性疾患である、(41)に記載の方法。
(43)患者が哺乳動物患者、特にヒト患者である、(41)または(42)に記載の方法。
(44)抗AXL抗体、好ましくは(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体、(23)に記載の核酸分子、または(24)または(25)に記載のベクターを含むキット。
(45)さらなる抗腫瘍薬をさらに含む、(44)に記載のキット。
(46)薬剤耐性癌の治療用の医薬組成物を製造するための抗AXL抗体の使用。
(47)抗AXL抗体が(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体である、(46)に記載の使用。
(48)過剰増殖性疾患の治療用の抗腫瘍薬との同時投与用の医薬品を製造するための抗AXL抗体の使用。
(49)抗AXL抗体が(1)から(22)のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体である、(48)に記載の使用。
Claims (14)
- AXLの細胞外ドメインと結合し、AXL活性を少なくとも部分的に阻害するモノクローナル抗体であって、
(a)配列番号22に示すCDRH1、
(b)配列番号23に示すCDRH2、および
(c)配列番号24に示すCDRH3
であるCDRを含む重鎖アミノ酸配列、
ならびに
(d)配列番号19に示すCDRL1、
(e)配列番号20に示すCDRL2、および
(f)配列番号21に示すCDRL3
であるCDRを含む軽鎖アミノ酸配列
を含む、モノクローナル抗体。 - AXL介在シグナル伝達を低減及び/または妨害する、AXLリン酸化を低減及び/または妨害する、細胞増殖を低減及び/または妨害する、血管新生を低減及び/または妨害する、細胞移動を低減及び/または妨害する、腫瘍転移を低減及び/または妨害する、AXL介在抗アポトーシスを低減及び/または妨害する、並びに/あるいはAXL介在PI3Kシグナル伝達を低減及び/または妨害する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- キメラ抗体であり、配列番号41、42からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/または配列番号40を含む軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸を含み、または
ヒト化抗体であり、配列番号45からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、および/または配列番号46を含む軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。 - 配列番号10を含む重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸、および/または配列番号9を含む軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- (a)請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗体断片または派生物をコードする核酸配列を含む核酸、
(b)配列番号3、4、34〜36に示す核酸配列を含む核酸、
(c)(a)または(b)中の配列のいずれかと相補的な核酸、
からなる群から選択される単離核酸分子。 - 請求項5に規定される核酸配列を含むベクター。
- ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞、または非ヒトトランスジェニック動物である、請求項6に記載のベクターを含む宿主。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項7に記載の宿主から前記ポリペプチドを得るステップを含む方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、請求項5に記載の核酸分子、請求項6に記載のベクター、請求項7に記載の宿主、または請求項8に記載の方法によって生成するポリペプチドを含む医薬組成物。
- AXLの発現、過剰発現および/または活動亢進と関係がある、または乳癌、肺癌および他のAXL発現または過剰発現癌、および腫瘍転移の形成からなる群から選択される、過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、請求項9に記載の医薬組成物。
- 請求項10に規定される過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、請求項5に記載の核酸分子、または請求項6に記載のベクター、並びにさらなる抗腫瘍薬を含むキット。
- 薬剤耐性癌の治療用の医薬組成物を製造するための抗AXL抗体の使用であって、抗AXL抗体が請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体である使用。
- 過剰増殖性疾患の治療用の抗腫瘍薬との同時投与用の医薬品を製造するための抗AXL抗体の使用であって、抗AXL抗体が請求項1から4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体である使用。
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