JPH1084958A - 抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体 - Google Patents
抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH1084958A JPH1084958A JP8245062A JP24506296A JPH1084958A JP H1084958 A JPH1084958 A JP H1084958A JP 8245062 A JP8245062 A JP 8245062A JP 24506296 A JP24506296 A JP 24506296A JP H1084958 A JPH1084958 A JP H1084958A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth factor
- monoclonal antibody
- fibroblast growth
- amino acid
- fgf6
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 繊維芽細胞増殖因子６（ＦＧＦ６）を抗原と
して特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 【解決手段】 ＦＧＦ６のアミノ酸配列のうち、ＦＧＦ
ファミリーに属する他のメンバーのアミノ酸配列と相同
性の低い領域のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原に
用いて哺乳動物を免疫し、その哺乳動物の脾細胞と培養
細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、そのハイブ
リドーマを培養してその培養液からモノクローナル抗体
を採取する。
して特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 【解決手段】 ＦＧＦ６のアミノ酸配列のうち、ＦＧＦ
ファミリーに属する他のメンバーのアミノ酸配列と相同
性の低い領域のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原に
用いて哺乳動物を免疫し、その哺乳動物の脾細胞と培養
細胞とを融合してハイブリドーマを作製し、そのハイブ
リドーマを培養してその培養液からモノクローナル抗体
を採取する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、繊維芽細胞増殖因
子６（以下、「ＦＧＦ６」という。）の検知に有用な抗
ＦＧＦ６モノクローナル抗体及びその製造法に関する。
子６（以下、「ＦＧＦ６」という。）の検知に有用な抗
ＦＧＦ６モノクローナル抗体及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】繊維芽細胞増殖因子（以下、「ＦＧＦ」
という。）ファミリーについては、該ファミリーに属す
るメンバーのうち現在９番までクローニングされている
が、初めて１９８５年にクローニングされたＦＧＦ１
（ａＦＧＦ）およびＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）は、生体内で
発生、細胞分化、細胞増殖、形態形成、ガン化等の非常
に重要な生命現象に関与していることが明らかになって
いる（今村亨ら，臨床科学25，1012-1021(1989);三井洋
司ら，蛋白核酸酵素36(7),1237-1246(1991)）。ごく最
近１０番目のメンバーが見出されたが、その詳細は明ら
かではない。近年、その他のメンバーも、生体内での重
要な機能が徐々に明らかとなりつつある（R.F. Tutrone
et al., J. Urol. 149, 633-639 (1993); B. Feldman,
Science 267, 246-249 (1995); Jean M. Hebert et a
l., Cell 78, 1017-1025(1994); F.Coulier et al., P
rog. Growth Factor Res. 5, 1-14 (1994); S. Werner
et al., J. Invest. Dermatol. 105, 579-584 (1995);
H. Ohuchi et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. 20
4(2), 882-888 (1994)）。
という。）ファミリーについては、該ファミリーに属す
るメンバーのうち現在９番までクローニングされている
が、初めて１９８５年にクローニングされたＦＧＦ１
（ａＦＧＦ）およびＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）は、生体内で
発生、細胞分化、細胞増殖、形態形成、ガン化等の非常
に重要な生命現象に関与していることが明らかになって
いる（今村亨ら，臨床科学25，1012-1021(1989);三井洋
司ら，蛋白核酸酵素36(7),1237-1246(1991)）。ごく最
近１０番目のメンバーが見出されたが、その詳細は明ら
かではない。近年、その他のメンバーも、生体内での重
要な機能が徐々に明らかとなりつつある（R.F. Tutrone
et al., J. Urol. 149, 633-639 (1993); B. Feldman,
Science 267, 246-249 (1995); Jean M. Hebert et a
l., Cell 78, 1017-1025(1994); F.Coulier et al., P
rog. Growth Factor Res. 5, 1-14 (1994); S. Werner
et al., J. Invest. Dermatol. 105, 579-584 (1995);
H. Ohuchi et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. 20
4(2), 882-888 (1994)）。
【０００３】その中で、ＦＧＦファミリーの６番目のメ
ンバーであるＦＧＦ６については、癌遺伝子として知ら
れるＦＧＦ４の遺伝子をもとにｃＤＮＡがクローニング
された（H. Sakamoto et al., Biochem. Biophys. Res.
Com. 151, 965-97 (1988);S. Iida et al., Oncogene
7, 303-309 (1992)）。細胞内で異常に発現すると癌化
を引き起こすことが解っている（I. Marics et al., On
cogene 4, 335-340 (1989)）。最近では脳の発生過程で
何らかの機能を持っていること、脳内で定常的に発現し
ていること（小沢和夫ら, 生化学 67(7), 569 (199
5)）、また、交感神経への分化誘導能（瀬尾美鈴ら, 生
化学67(7), 5878 (1995)）、軟骨への分化誘導能（多田
孝一郎ら, 生化学67(7), 581 (1995)）等を持っている
ことなどが遺伝子レベルで明らかとなってきた。これら
の事実は生体内でのＦＧＦ６の異常が種々の疾病を引き
起こす原因になりうることを遺伝子レベルで示唆するも
のである。従って、ＦＧＦ６の挙動をタンパク質レベル
で捉えることは、これらの疾病の原因解明や診断にとっ
て重要であると言うことができる。
ンバーであるＦＧＦ６については、癌遺伝子として知ら
れるＦＧＦ４の遺伝子をもとにｃＤＮＡがクローニング
された（H. Sakamoto et al., Biochem. Biophys. Res.
Com. 151, 965-97 (1988);S. Iida et al., Oncogene
7, 303-309 (1992)）。細胞内で異常に発現すると癌化
を引き起こすことが解っている（I. Marics et al., On
cogene 4, 335-340 (1989)）。最近では脳の発生過程で
何らかの機能を持っていること、脳内で定常的に発現し
ていること（小沢和夫ら, 生化学 67(7), 569 (199
5)）、また、交感神経への分化誘導能（瀬尾美鈴ら, 生
化学67(7), 5878 (1995)）、軟骨への分化誘導能（多田
孝一郎ら, 生化学67(7), 581 (1995)）等を持っている
ことなどが遺伝子レベルで明らかとなってきた。これら
の事実は生体内でのＦＧＦ６の異常が種々の疾病を引き
起こす原因になりうることを遺伝子レベルで示唆するも
のである。従って、ＦＧＦ６の挙動をタンパク質レベル
で捉えることは、これらの疾病の原因解明や診断にとっ
て重要であると言うことができる。
【０００４】ＦＧＦファミリーは、各メンバーの間で約
３０％の相同性があり、ＦＧＦ４の類似体として発見さ
れたＦＧＦ６は、特にＦＧＦ４との相同性が約７０％と
高く、ＦＧＦ６の組換えタンパクを抗原として抗体を作
製した場合、作製された抗体はＦＧＦ４と交差反応する
可能性が非常に高い。市販されているヒトＦＧＦ６の組
換えタンパクを抗原として抗体を作製した場合、作製さ
れた抗体はＦＧＦファミリーの他のメンバーと交差反応
する可能性が高い。さらに、ヒトＦＧＦ６はマウスＦＧ
Ｆ６との相同性が９０％以上あるため、市販のヒトＦＧ
Ｆ６の組換えタンパクは免疫対象であるマウス内での抗
原性が非常に弱く、抗体が形成されないばかりか、抗原
として大量投与した場合、マウスのショック死を引き起
こす可能性もある。
３０％の相同性があり、ＦＧＦ４の類似体として発見さ
れたＦＧＦ６は、特にＦＧＦ４との相同性が約７０％と
高く、ＦＧＦ６の組換えタンパクを抗原として抗体を作
製した場合、作製された抗体はＦＧＦ４と交差反応する
可能性が非常に高い。市販されているヒトＦＧＦ６の組
換えタンパクを抗原として抗体を作製した場合、作製さ
れた抗体はＦＧＦファミリーの他のメンバーと交差反応
する可能性が高い。さらに、ヒトＦＧＦ６はマウスＦＧ
Ｆ６との相同性が９０％以上あるため、市販のヒトＦＧ
Ｆ６の組換えタンパクは免疫対象であるマウス内での抗
原性が非常に弱く、抗体が形成されないばかりか、抗原
として大量投与した場合、マウスのショック死を引き起
こす可能性もある。
【０００５】ＦＧＦ６を特異的に認識するポリクローナ
ル抗体は既にR&D Systems Inc.(USA)より市販されてい
るが、ポリクローナル抗体は動物をその都度免疫し、そ
の血中より調製しなければならないために、ロットごと
の抗体価のばらつきが大きく再現性に乏しいという欠点
がある。一方、モノクローナル抗体もR&D Systems Inc.
より市販されている。しかし、本抗体は組換えＦＧＦ６
を免疫原として作製されているため、ＦＧＦ４及びＦＧ
Ｆ５との交差性が認められている。また、ＦＧＦ６の作
用を中和する目的で使用できるが、生化学的に重要な手
法であるウエスタンブロッティングで使用することはで
きない等、非常に欠点が多い。現在のところＦＧＦファ
ミリーの中でＦＧＦ６のみを認識するモノクローナル抗
体は存在していない。
ル抗体は既にR&D Systems Inc.(USA)より市販されてい
るが、ポリクローナル抗体は動物をその都度免疫し、そ
の血中より調製しなければならないために、ロットごと
の抗体価のばらつきが大きく再現性に乏しいという欠点
がある。一方、モノクローナル抗体もR&D Systems Inc.
より市販されている。しかし、本抗体は組換えＦＧＦ６
を免疫原として作製されているため、ＦＧＦ４及びＦＧ
Ｆ５との交差性が認められている。また、ＦＧＦ６の作
用を中和する目的で使用できるが、生化学的に重要な手
法であるウエスタンブロッティングで使用することはで
きない等、非常に欠点が多い。現在のところＦＧＦファ
ミリーの中でＦＧＦ６のみを認識するモノクローナル抗
体は存在していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＦＧＦファ
ミリーの他のメンバーを抗原として認識せず、ＦＧＦ６
を特異的に認識するモノクローナル抗体、及びその製造
方法、並びにこのモノクローナル抗体を用いてＦＧＦ６
を検知する方法を提供することを課題とする。
ミリーの他のメンバーを抗原として認識せず、ＦＧＦ６
を特異的に認識するモノクローナル抗体、及びその製造
方法、並びにこのモノクローナル抗体を用いてＦＧＦ６
を検知する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＦＧＦ６のアミ
ノ酸配列のうちＦＧＦファミリーの他のメンバーの配列
と相同性が低い配列を有するペプチドを免疫原として用
いることにより、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに結
合せず、ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗
体が得られることを見い出し、本発明を完成させた。
解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＦＧＦ６のアミ
ノ酸配列のうちＦＧＦファミリーの他のメンバーの配列
と相同性が低い配列を有するペプチドを免疫原として用
いることにより、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに結
合せず、ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗
体が得られることを見い出し、本発明を完成させた。
【０００８】すなわち、本発明は、下記性質を有する抗
繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体を提供する。 （ａ）繊維芽細胞増殖因子６に結合する。 （ｂ）繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６以外のものに
結合しない。
繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体を提供する。 （ａ）繊維芽細胞増殖因子６に結合する。 （ｂ）繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６以外のものに
結合しない。
【０００９】また、本発明は、前記配列が、配列表配列
番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部であること
を特徴とする前記抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナ
ル抗体を提供する。
番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部であること
を特徴とする前記抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナ
ル抗体を提供する。
【００１０】また、本発明は繊維芽細胞増殖因子６のア
ミノ酸配列のうち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属
するメンバーであって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６
以外のもののアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結
合物を用いて哺乳動物を免疫した後、前記哺乳動物の脾
細胞を取り出し、前記脾細胞と培養細胞とを融合してハ
イブリドーマを作製し、前記ハイブリドーマを培養して
その培養物から抗体タンパクを採取する行程を含む、請
求項１記載のモノクローナル抗体の製造方法を提供す
る。
ミノ酸配列のうち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属
するメンバーであって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６
以外のもののアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドと担体との結
合物を用いて哺乳動物を免疫した後、前記哺乳動物の脾
細胞を取り出し、前記脾細胞と培養細胞とを融合してハ
イブリドーマを作製し、前記ハイブリドーマを培養して
その培養物から抗体タンパクを採取する行程を含む、請
求項１記載のモノクローナル抗体の製造方法を提供す
る。
【００１１】また、本発明は、モノクローナル抗体を用
いた免疫学方法により繊維芽細胞増殖因子６を検地する
方法において、前記モノクローナル抗体を用いる方法、
好ましくは脳機能の鑑定法を提供する。
いた免疫学方法により繊維芽細胞増殖因子６を検地する
方法において、前記モノクローナル抗体を用いる方法、
好ましくは脳機能の鑑定法を提供する。
【００１２】なお、本明細書において、「ＦＧＦ６に特
異的に結合する」とは、ＦＧＦ６と反応して該ＦＧＦ６
を抗原として特異的に認識し、かつＦＧＦファミリーに
属する前記ＦＧＦ６以外のメンバーには結合しないこと
を言う。
異的に結合する」とは、ＦＧＦ６と反応して該ＦＧＦ６
を抗原として特異的に認識し、かつＦＧＦファミリーに
属する前記ＦＧＦ６以外のメンバーには結合しないこと
を言う。
【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。ＦＧＦ６
を含むＦＧＦファミリーのｃＤＮＡ配列は既に知られて
おり（M.Jaye et al., Science, 251, (1986); J. A. A
braham et al., EMBO J., 5, 2523-2528 (1986); R. Mo
ore et al., EMBO J., 5, 919-924(1986); P. Delli-Bo
viet al., Cell, 50, 729-737 (1987); X. Zhan et a
l., Mol Cel Biol., 8, 3487-3495 (1988); I. Marics
et al., Oncogene, 4, 335-340 (1989); J. S. Rubinet
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 802-806 (198
9); A. Tanaka et al., FEBS Lett., 363(3), 226-230
(1995); M. Miyamoto et al., Mol. Cel. Biol., 13, 4
251- 4259 (1993)）、推定上のアミノ酸配列も既に知ら
れている。
を含むＦＧＦファミリーのｃＤＮＡ配列は既に知られて
おり（M.Jaye et al., Science, 251, (1986); J. A. A
braham et al., EMBO J., 5, 2523-2528 (1986); R. Mo
ore et al., EMBO J., 5, 919-924(1986); P. Delli-Bo
viet al., Cell, 50, 729-737 (1987); X. Zhan et a
l., Mol Cel Biol., 8, 3487-3495 (1988); I. Marics
et al., Oncogene, 4, 335-340 (1989); J. S. Rubinet
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 802-806 (198
9); A. Tanaka et al., FEBS Lett., 363(3), 226-230
(1995); M. Miyamoto et al., Mol. Cel. Biol., 13, 4
251- 4259 (1993)）、推定上のアミノ酸配列も既に知ら
れている。
【００１４】本発明者らはこれらのｃＤＮＡ配列をアミ
ノ酸配列に翻訳し、比較した（図１〜図８）。その結
果、ＦＧＦ６のアミノ酸配列のうち、配列表配列番号１
に示したアミノ酸配列を有する部分が、ＦＧＦファミリ
ーに属するメンバーであって、かつＦＧＦ６以外のもの
（ＦＧＦファミリーの他のメンバー）と相同性が低いこ
とを見いだした。
ノ酸配列に翻訳し、比較した（図１〜図８）。その結
果、ＦＧＦ６のアミノ酸配列のうち、配列表配列番号１
に示したアミノ酸配列を有する部分が、ＦＧＦファミリ
ーに属するメンバーであって、かつＦＧＦ６以外のもの
（ＦＧＦファミリーの他のメンバー）と相同性が低いこ
とを見いだした。
【００１５】また、この部分の近隣には糖鎖の付加する
推定上の配列があり（図１）、この部分がＦＧＦ６のタ
ンパク表面に出ている可能性が高いことも見いだした。
尚、図１〜８中の［＊］はアミノ酸が一致している部
分、アンダーラインは抗原として選定した部分を示して
おり、また各図中、上段はＦＧＦ６のアミノ酸配列を、
下段はＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列
を示している。
推定上の配列があり（図１）、この部分がＦＧＦ６のタ
ンパク表面に出ている可能性が高いことも見いだした。
尚、図１〜８中の［＊］はアミノ酸が一致している部
分、アンダーラインは抗原として選定した部分を示して
おり、また各図中、上段はＦＧＦ６のアミノ酸配列を、
下段はＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列
を示している。
【００１６】本発明者らは、これらの点に注目し、上記
配列を有するペプチド（以下、「ＦＧＦ６に特異的なペ
プチド」ともいう。）の合成をTANA LABORATORIES, L.
C.（Texas, USA）に委託した。入手したペプチドを用い
て哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培
養細胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、
このハイブリドーマにＦＧＦ６に特異的なモノクローナ
ル抗体を生産させることに成功した。
配列を有するペプチド（以下、「ＦＧＦ６に特異的なペ
プチド」ともいう。）の合成をTANA LABORATORIES, L.
C.（Texas, USA）に委託した。入手したペプチドを用い
て哺乳動物を免疫した後、脾細胞を取り出し、これを培
養細胞と融合することによりハイブリドーマを作製し、
このハイブリドーマにＦＧＦ６に特異的なモノクローナ
ル抗体を生産させることに成功した。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態につ
いて、ＦＧＦ６に特異的なモノクローナル抗体及びその
製造法を中心に製造手順に沿って説明する。 ＜１＞抗原 哺乳動物を免疫する際に用いるＦＧＦ６に特異的なペプ
チドは、そのアミノ酸配列として配列表配列番号１に示
す配列が挙げられるが、ＦＧＦ６のアミノ酸配列のう
ち、ＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列と
相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有
していれば、本発明において使用することができる。こ
のようなペプチドは、例えばＦＧＦ６の酵素分解物から
単離することにより部分的に得ることができるが、常法
により化学合成することが好ましい。例えば、市販され
ているペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入
力すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプ
チドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入
手してもよい。
いて、ＦＧＦ６に特異的なモノクローナル抗体及びその
製造法を中心に製造手順に沿って説明する。 ＜１＞抗原 哺乳動物を免疫する際に用いるＦＧＦ６に特異的なペプ
チドは、そのアミノ酸配列として配列表配列番号１に示
す配列が挙げられるが、ＦＧＦ６のアミノ酸配列のう
ち、ＦＧＦファミリーの他のメンバーのアミノ酸配列と
相同性の低い領域のアミノ酸配列の少なくとも一部を有
していれば、本発明において使用することができる。こ
のようなペプチドは、例えばＦＧＦ６の酵素分解物から
単離することにより部分的に得ることができるが、常法
により化学合成することが好ましい。例えば、市販され
ているペプチドシンセサイザーを用いて、上記配列を入
力すれば上記ペプチドを得ることができる。また、ペプ
チドの受託合成サービスを行っている会社に依託して入
手してもよい。
【００１８】かくして得られるペプチド（以下、「合成
ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いる
ことができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：Keyhole Limpet Hemocyanin）、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：Bovine Serum Albumin）、卵白アル
ブミン（ＯＶＡ：Ovalbumin）等の担体と結合させて用
いることもできる。このような担体を用いると、ペプチ
ドのみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場
合でも抗原性を上げることができる。なお、この場合は
担体に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマ
を選択する段階で取り除くことができる。 ＜２＞哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限はなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５
μｇ／ｇ〜５０μｇ／ｇの容量で、フロイントの完全ア
ジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜２週
間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上後
に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法が
挙げられる。
ペプチド」ともいう）は、そのまま抗原としても用いる
ことができるし、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：Keyhole Limpet Hemocyanin）、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：Bovine Serum Albumin）、卵白アル
ブミン（ＯＶＡ：Ovalbumin）等の担体と結合させて用
いることもできる。このような担体を用いると、ペプチ
ドのみでは抗原性が低い場合、あるいは抗原性がない場
合でも抗原性を上げることができる。なお、この場合は
担体に対する抗体もできるが、それらはハイブリドーマ
を選択する段階で取り除くことができる。 ＜２＞哺乳動物の免疫 上記抗原で免疫する哺乳動物は、免疫実験に通常用いら
れている哺乳動物であれば特に制限はなく、マウス、ラ
ット、ウサギ等が例示できる。また、免疫する方法は、
通常の免疫の手法に則って行えば良く、例えば、合成ペ
プチド或いは担体に結合させた合成ペプチドを、０．５
μｇ／ｇ〜５０μｇ／ｇの容量で、フロイントの完全ア
ジュバントまたは不完全アジュバントとともに１〜２週
間毎に数回投与を繰り返し、最終投与の２週間以上後
に、合成ペプチドのみを投与して最終免疫を行う方法が
挙げられる。
【００１９】そのときの合成ペプチドあるいは担体に結
合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５μ
ｇ／ｇ〜５０μｇ／ｇ程度が適当である。投与量が０．
５μｇ／ｇ未満では抗体を十分に生成しないことがあ
る。また、５０μｇ／ｇを越えても更なる免疫効果は期
待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目的とす
る抗体が得られない恐れがある。 ＜３＞ハイブリドーマの作製 このようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日後
に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細胞
と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下で
融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細胞
−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。
合させた合成ペプチドの投与量は、１回当たり０．５μ
ｇ／ｇ〜５０μｇ／ｇ程度が適当である。投与量が０．
５μｇ／ｇ未満では抗体を十分に生成しないことがあ
る。また、５０μｇ／ｇを越えても更なる免疫効果は期
待できず、さらに、生体内で免疫抑制が生じ、目的とす
る抗体が得られない恐れがある。 ＜３＞ハイブリドーマの作製 このようにして免疫した動物を、最終免疫後３〜４日後
に屠殺し、脾臓を摘出し、脾細胞を取り出す。この細胞
と、融合相手である培養細胞とを融合促進剤の存在下で
融合し、得られた融合細胞を選別することにより脾細胞
−培養細胞ハイブリドーマを得ることができる。
【００２０】融合相手の培養細胞としては、脾細胞と融
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。
合するものであれば特に制限はないが、一般には、ミエ
ローマ細胞（骨髄腫細胞）が適当である。また、細胞融
合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにす
るために、特定の選別用の薬物マーカーを有するものが
好ましい。
【００２１】例えば、ヒポキサンチン・グアニン・ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別で
きる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株、Ｐ３
／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１株、ＦＯ株、ＳＰ２／０−Ａ
ｇ１４株等のミエローマ細胞の市販株が挙げられるが、
これらには限定されない。
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損したものが挙げられ
る。このような細胞は、ヒポキサンチン・アミノプテリ
ン及びチミジンを添加した培地（ＨＡＴ培地）中で生育
できないが、この細胞と正常細胞との融合細胞はＨＡＴ
培地中でも生育できるようになり、未融合細胞と区別で
きる。具体的には、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株、Ｐ３
／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１株、ＦＯ株、ＳＰ２／０−Ａ
ｇ１４株等のミエローマ細胞の市販株が挙げられるが、
これらには限定されない。
【００２２】細胞融合は通常ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ
等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細
胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞
融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいは
ＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞
をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート
等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育さ
せる。 ＜４＞ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すなわちＦＧＦ
６に特異的なペプチドに結合するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選別する。
等の培地中で、抗体産生細胞（脾細胞）とミエローマ細
胞とを１０：１〜２：１の混合比で、融合促進剤ととも
に混合することにより行われる。融合促進剤としては、
細胞融合実験で通常用いられている融合剤であれば特に
制限はなく、具体的には、センダイウイルスや平均分子
量５００〜７０００のポリエチレングリコールが例示で
きる。また電気パルスによって融合させてもよい。細胞
融合を終えた細胞は、例えばＲＰＭＩ１６４０あるいは
ＭＥＭ培地などで希釈し、遠心分離により洗浄した細胞
をＨＡＴ培地等の選択培地に浮遊させ、マルチプレート
等に分注して培養を行い、ハイブリドーマのみを生育さ
せる。 ＜４＞ハイブリドーマの選別 上記のようにして得られるハイブリドーマは、抗原に用
いたペプチドのうち異なる抗原決定部位に対するモノク
ローナル抗体や担体に用いた蛋白に対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ株の混合体であるの
で、これらの中から前記合成ペプチド、すなわちＦＧＦ
６に特異的なペプチドに結合するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを選別する。
【００２３】この選別の方法としては、抗原に用いた合
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質で標識した第二
抗体を加え、結合した標識の量から合成ペプチドに結合
する抗体量を知ることができる。或は、ハイブリドーマ
が産生する抗体を固相化し、これを合成ペプチド、酵素
等で標識した第二抗体と順次インキュベートしてもよ
い。
成ペプチドを使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
が好ましい。例えば、合成ペプチドをプラスチックプレ
ート等に固相化しておき、これにハイブリドーマ培養上
清、さらに酵素、蛍光物質或は発光物質で標識した第二
抗体を加え、結合した標識の量から合成ペプチドに結合
する抗体量を知ることができる。或は、ハイブリドーマ
が産生する抗体を固相化し、これを合成ペプチド、酵素
等で標識した第二抗体と順次インキュベートしてもよ
い。
【００２４】さらに、合成ペプチドに結合するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから、ＦＧＦ６に
結合し、ＦＧＦファミリーに属するメンバーであって前
記ＦＧＦ６以外のものに結合しないモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択する。
ーナル抗体を産生するハイブリドーマから、ＦＧＦ６に
結合し、ＦＧＦファミリーに属するメンバーであって前
記ＦＧＦ６以外のものに結合しないモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを選択する。
【００２５】このようにして得られたハイブリドーマの
１株は、平成８年９月１１日より工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８４９とし
て寄託されている。 ＜５＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の調製 上記のようにして得られたハイブリドーマからＦＧＦ６
に特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例
えば、適当な培地中で培養した抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清、あるいは抗体産生ハイブリドーマをマウス
腹膣内で培養し得られた腹水を常法に従って硫安分画、
ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等で精製
すればよい。 ＜６＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の利用法 本発明のモノクローナル抗体は、ＦＧＦ６と特異的に反
応するので、ウェスタンブロットあるいはミクロオート
ラジオグラフィーにおける染色用抗体、培養細胞、皮膚
組織等の免疫染色における染色用抗体、さらには培養系
に添加することによりＦＧＦ６の作用を抑える中和抗体
として使用可能であり、ＦＧＦ６の定性あるいは定量の
ための検知用試薬として利用することができる。例え
ば、本発明のモノクローナル抗体を用いて軟骨や脳を染
色し、軟骨細胞や脳細胞中のＦＧＦ６の役割を探求する
ことができる。さらに、例えば脳細胞中のＦＧＦ６を検
知することにより、脳機能の鑑定を行うこともできる。
１株は、平成８年９月１１日より工業技術院生命工学工
業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市
東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ−１５８４９とし
て寄託されている。 ＜５＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の調製 上記のようにして得られたハイブリドーマからＦＧＦ６
に特異的に結合するモノクローナル抗体を得るには、例
えば、適当な培地中で培養した抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清、あるいは抗体産生ハイブリドーマをマウス
腹膣内で培養し得られた腹水を常法に従って硫安分画、
ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等で精製
すればよい。 ＜６＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の利用法 本発明のモノクローナル抗体は、ＦＧＦ６と特異的に反
応するので、ウェスタンブロットあるいはミクロオート
ラジオグラフィーにおける染色用抗体、培養細胞、皮膚
組織等の免疫染色における染色用抗体、さらには培養系
に添加することによりＦＧＦ６の作用を抑える中和抗体
として使用可能であり、ＦＧＦ６の定性あるいは定量の
ための検知用試薬として利用することができる。例え
ば、本発明のモノクローナル抗体を用いて軟骨や脳を染
色し、軟骨細胞や脳細胞中のＦＧＦ６の役割を探求する
ことができる。さらに、例えば脳細胞中のＦＧＦ６を検
知することにより、脳機能の鑑定を行うこともできる。
【００２６】
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。 ＜１＞ハイブリドーマの作製 ペプチドの合成および担体（ＫＬＨ）への結合は、TANA
LABORATORIES, L. C.(Texas, USA) に依頼した。
LABORATORIES, L. C.(Texas, USA) に依頼した。
【００２７】上記の担体結合合成ペプチド１００μｇを
生理食塩水５０μｌに溶かし、完全フロイントアジュバ
ント（シグマ(SIGMA)製）５０μｌと混合乳化したもの
を、８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）の皮下
に投与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結
合合成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混
合乳化液１００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の
投与から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解し
た生理食塩水５０μｌを静脈注射した。
生理食塩水５０μｌに溶かし、完全フロイントアジュバ
ント（シグマ(SIGMA)製）５０μｌと混合乳化したもの
を、８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア）の皮下
に投与した。その後１週間目と２週間目に、上記担体結
合合成ペプチド−不完全フロイントアジュバント等量混
合乳化液１００μｌを腹腔内投与した。更に、３回目の
投与から２週間後に、５０μｇの合成ペプチドを溶解し
た生理食塩水５０μｌを静脈注射した。
【００２８】３日後、上記マウスから脾臓を摘出し、脾
細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４
（大日本製薬から購入）を、細胞融合に合わせて対数増
殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。１０
8個の脾細胞に対し、２×１０7個のミエローマを上記培
地中で混合し、遠心分離により細胞をペレットにした。
上清を除いた後、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４００
０（シグマ社製：ポリエチレングリコール）を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分
間穏やかに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０
培地２ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しな
がら滴下した。
細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、洗浄を行った。
一方、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４
（大日本製薬から購入）を、細胞融合に合わせて対数増
殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。１０
8個の脾細胞に対し、２×１０7個のミエローマを上記培
地中で混合し、遠心分離により細胞をペレットにした。
上清を除いた後、３７℃に保温した５０％ＰＥＧ４００
０（シグマ社製：ポリエチレングリコール）を含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地１ｍｌを１分間で徐々に滴下し、１分
間穏やかに撹拌した。更に、３７℃のＲＰＭＩ１６４０
培地２ｍｌを２分間で、更に８ｍｌを３分間で撹拌しな
がら滴下した。
【００２９】滴下終了後、遠心分離により上清を除いた
後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌ
に懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベー
クライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注し
た。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２
５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培
養上清を半分除き５０μｌのＧＩＴ培地を添加した。
後、細胞ペレットをＧＩＴ培地（和光純薬製）４０ｍｌ
に懸濁し、これを４枚の９６ウェルプレート（住友ベー
クライト製）に、１ウェルにつき１００μｌずつ分注し
た。翌日２５μｌのＨＡＴ培地を添加し、更に４日後２
５μｌのＨＡＴ培地を添加した。１週間培養した後、培
養上清を半分除き５０μｌのＧＩＴ培地を添加した。
【００３０】細胞融合から約２週間後、ミエローマと脾
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメン
ト抗体；ケミコン(CHEMICON)社製）を用いたサンドウィ
ッチＥＬＩＳＡ法により検定した。このうち抗体価の高
かったウェル中の培養上清を、抗原を市販のＦＧＦ６組
換えタンパク（シグマ社製)に変更した上記と同様のサ
ンドウィッチＥＬＩＳＡ法によってさらに検定した。最
終的に抗体価の高かったウェル中のハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によるクローニングを行い、モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。この株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本
国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ
−１５８４９として寄託されている。 ＜２＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、ＦＧＦ
６に特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を行っ
た。
細胞が融合したハイブリドーマのみがコロニーを形成し
たが、さらに、コロニーの直径が約１ｍｍになるまで培
養を続けた。この時点で培養上清に分泌された抗体を、
上記の合成ペプチドと市販の二次抗体（西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃフラグメン
ト抗体；ケミコン(CHEMICON)社製）を用いたサンドウィ
ッチＥＬＩＳＡ法により検定した。このうち抗体価の高
かったウェル中の培養上清を、抗原を市販のＦＧＦ６組
換えタンパク（シグマ社製)に変更した上記と同様のサ
ンドウィッチＥＬＩＳＡ法によってさらに検定した。最
終的に抗体価の高かったウェル中のハイブリドーマにつ
いて限界希釈法によるクローニングを行い、モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。この株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本
国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ
−１５８４９として寄託されている。 ＜２＞ＦＧＦ６に特異的に結合するモノクローナル抗体
の調製 上記で得られたハイブリドーマ細胞株を培養し、ＦＧＦ
６に特異的に結合するモノクローナル抗体の採取を行っ
た。
【００３１】ハイブリドーマをＧＩＴ培地で培養し、細
胞濃度が約５×１０6個／ｍｌになったところで培養上
清を遠心分離により回収し、これをポアサイズ０．２２
μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテインＡカラム
キット（アマシャム・ジャパン製）により精製し、抗Ｆ
ＧＦ６モノクローナル抗体を得た。 ＜３＞抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体の評価 （１）抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体のＦＧＦ６との反
応性 上記で得られたモノクローナル抗体について、市販のＦ
ＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７の組換えタンパ
ク（シグマ社製）を用いたエンザイムイムノブロット法
により特異性の評価を行った。５〜２０％の密度勾配ポ
リアクリルアミドゲル（パジェル：アトー社製)を用い
た電気泳動に供した。アプライ量は、１レーン当りタン
パク量として１００ｎｇである。なお、電気泳動は常法
に従って行った。ゲルをトランスファーバッファー（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭグリシン）に浸漬した
後、ブロッティング装置（セミドライブロッティング装
置：アトー(ATTO)製)を用い、泳動物をゲルから、予め
トランスファーバッファーに浸漬したメンブレン（イモ
ビロン(Immobilon)；ミリポア社製)へ転写した。
胞濃度が約５×１０6個／ｍｌになったところで培養上
清を遠心分離により回収し、これをポアサイズ０．２２
μｍのフィルターでろ過し、ろ液をプロテインＡカラム
キット（アマシャム・ジャパン製）により精製し、抗Ｆ
ＧＦ６モノクローナル抗体を得た。 ＜３＞抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体の評価 （１）抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体のＦＧＦ６との反
応性 上記で得られたモノクローナル抗体について、市販のＦ
ＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７の組換えタンパ
ク（シグマ社製）を用いたエンザイムイムノブロット法
により特異性の評価を行った。５〜２０％の密度勾配ポ
リアクリルアミドゲル（パジェル：アトー社製)を用い
た電気泳動に供した。アプライ量は、１レーン当りタン
パク量として１００ｎｇである。なお、電気泳動は常法
に従って行った。ゲルをトランスファーバッファー（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ；１９２ｍＭグリシン）に浸漬した
後、ブロッティング装置（セミドライブロッティング装
置：アトー(ATTO)製)を用い、泳動物をゲルから、予め
トランスファーバッファーに浸漬したメンブレン（イモ
ビロン(Immobilon)；ミリポア社製)へ転写した。
【００３２】泳動物を転写したメンブレンを、ＴＢＳバ
ッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ；５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ；ｐＨ７．５）に１５分間浸漬した後、ブロッキング
バッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳバッファー）に浸
し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。
ッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ；５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ；ｐＨ７．５）に１５分間浸漬した後、ブロッキング
バッファー（５％スキムミルクあるいは１％ＢＳＡ及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳバッファー）に浸
し、２５℃で１時間緩やかに振とうした。
【００３３】その後、メンブレンを０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＴＢＳバッファー（ＴＴＢＳバッファー）を
用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で
得られたモノクローナル抗体溶液（１０倍希釈液を約２
ｍｌ）に浸漬し、約１時間、２５℃で緩やかに振とうし
た。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶
（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント抗体：ケミコン(CHEMICO
N)社製、２０，０００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、
２５℃で約１時間緩やかに振とうした。
２０を含むＴＢＳバッファー（ＴＴＢＳバッファー）を
用いて洗浄（１５分１回，５分２回）し、前記＜２＞で
得られたモノクローナル抗体溶液（１０倍希釈液を約２
ｍｌ）に浸漬し、約１時間、２５℃で緩やかに振とうし
た。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の二次抗体溶
（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ Ｆｃフラグメント抗体：ケミコン(CHEMICO
N)社製、２０，０００倍希釈液を約２ｍｌ）に浸漬し、
２５℃で約１時間緩やかに振とうした。
【００３４】泳動したメンブレンをＴＴＢＳバッファー
により洗浄（１５分１回、５分４回）した後、市販のＨ
ＲＰ検出キット（アマシャム製；ＥＣＬキット）を使用
して、抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体が結合した泳動物
のバンドを検出した。なお、ＨＲＰが結合したバンド
は、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用して
も検出することができる。
により洗浄（１５分１回、５分４回）した後、市販のＨ
ＲＰ検出キット（アマシャム製；ＥＣＬキット）を使用
して、抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体が結合した泳動物
のバンドを検出した。なお、ＨＲＰが結合したバンド
は、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用して
も検出することができる。
【００３５】エンザイムイムノブロット法の結果を図９
に示す。この結果から明らかなように、上記で得られた
モノクローナル抗体はＦＧＦ６に結合するが、ＦＧＦ
４、ＦＧＦ５及びＦＧＦ７には結合しない。また、抗原
として使用した合成ペプチドは他のＦＧＦファミリーと
全く相同性がない部分であり、ＦＧＦファミリーの他の
メンバーとも反応しない。すなわち、本モノクローナル
抗体は、相互に相同性の高いＦＧＦファミリーのメンバ
ーの中でＦＧＦ６に特異的に反応することがわかった。 （２）抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体のアイソタイプの
決定 市販のアイソタイピングキット（アマシャム製）に付属
のメンブレンを、抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体（ハイ
ブリドーマ培養上清）とキット付属の二次抗体の混合溶
液に浸漬し室温で１５分間インキュベートした。メンブ
レンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳによる５分
間洗浄を２回繰り返した後、キット付属の発色剤にメン
ブレンを浸漬し室温で１５分間以上インキュベートしア
イソタイプを検出した。その結果抗ＦＧＦ６モノクロー
ナル抗体のアイソタイプは、κ軽鎖をもったＩｇＧ１で
あることがわかった。
に示す。この結果から明らかなように、上記で得られた
モノクローナル抗体はＦＧＦ６に結合するが、ＦＧＦ
４、ＦＧＦ５及びＦＧＦ７には結合しない。また、抗原
として使用した合成ペプチドは他のＦＧＦファミリーと
全く相同性がない部分であり、ＦＧＦファミリーの他の
メンバーとも反応しない。すなわち、本モノクローナル
抗体は、相互に相同性の高いＦＧＦファミリーのメンバ
ーの中でＦＧＦ６に特異的に反応することがわかった。 （２）抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体のアイソタイプの
決定 市販のアイソタイピングキット（アマシャム製）に付属
のメンブレンを、抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体（ハイ
ブリドーマ培養上清）とキット付属の二次抗体の混合溶
液に浸漬し室温で１５分間インキュベートした。メンブ
レンを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳによる５分
間洗浄を２回繰り返した後、キット付属の発色剤にメン
ブレンを浸漬し室温で１５分間以上インキュベートしア
イソタイプを検出した。その結果抗ＦＧＦ６モノクロー
ナル抗体のアイソタイプは、κ軽鎖をもったＩｇＧ１で
あることがわかった。
【００３６】
【発明の効果】本発明の抗ＦＧＦ６モノクローナル抗体
は、ＦＧＦ６に特異的に結合するものであり、ＦＧＦ６
の検知に用いることができ、骨や脳機能の鑑定等に利用
することができる。
は、ＦＧＦ６に特異的に結合するものであり、ＦＧＦ６
の検知に用いることができ、骨や脳機能の鑑定等に利用
することができる。
【００３７】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Thr Leu Leu Asp Ser Arg Gly Trp Gly Thr Leu Leu Ser Arg Ser Arg 1 5 10 15
【図１】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ１のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図２】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ２のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図３】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ３のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図４】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ４のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図５】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ５のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図６】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ７のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図７】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ８のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図８】ＦＧＦ６に対するＦＧＦ９のアミノ酸配列の相
同性を示す図である。
同性を示す図である。
【図９】ＦＧＦ６のエンザイムイムノブロットにより電
気泳動の結果を表す写真である。
気泳動の結果を表す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 加藤 明美 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポーラ 化成工業株式会社戸塚研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 下記性質を有する抗繊維芽細胞増殖因子
６モノクローナル抗体。 （ａ）繊維芽細胞増殖因子６に結合する。 （ｂ）繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６以外のものに
結合しない。 - 【請求項２】 繊維芽細胞増殖因子６のアミノ酸配列の
うち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６以外のものの
アミノ酸配列と相同性の低い領域を抗原として認識す
る、請求項１記載の抗繊維芽細胞増殖因子６モノクロー
ナル抗体。 - 【請求項３】 前記領域が、配列表配列番号１に示すア
ミノ酸配列の少なくとも一部であることを特徴とする請
求項２記載の抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗
体。 - 【請求項４】 繊維芽細胞増殖因子６のアミノ酸配列の
うち、繊維芽細胞増殖因子ファミリーに属するメンバー
であって、かつ前記繊維芽細胞増殖因子６以外のものと
のアミノ酸配列と相同性の低い領域のアミノ酸配列の少
なくとも一部を有するペプチドと担体との結合物を用い
て哺乳動物を免疫した後、前記ほ乳動物の脾細胞を取り
出し、前記脾細胞と培養細胞とを融合してハイブリドー
マを作製し、前記ハイブリドーマを培養してその培養物
から抗体蛋白を採取する行程を含む、請求項１記載のモ
ノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項５】 モノクローナル抗体を用いた免疫学的手
法により繊維芽細胞増殖因子６を検知する方法におい
て、請求項１記載のモノクローナル抗体を用いる方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の方法により脳細胞中の繊
維芽細胞増殖因子６を検知することを特徴とする、脳機
能の鑑定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8245062A JPH1084958A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8245062A JPH1084958A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084958A true JPH1084958A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17128029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8245062A Pending JPH1084958A (ja) | 1996-09-17 | 1996-09-17 | 抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084958A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015221804A (ja) * | 2007-11-12 | 2015-12-10 | ユー３・ファーマ・ゲーエムベーハー | Ａｘｌ抗体 |
| CN114181321A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-15 | 中国海洋大学 | 花鲈fgf6a、fgf6b以及fgf18重组蛋白及其制备方法和应用 |
-
1996
- 1996-09-17 JP JP8245062A patent/JPH1084958A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015221804A (ja) * | 2007-11-12 | 2015-12-10 | ユー３・ファーマ・ゲーエムベーハー | Ａｘｌ抗体 |
| CN114181321A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-03-15 | 中国海洋大学 | 花鲈fgf6a、fgf6b以及fgf18重组蛋白及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brimijoin et al. | Production and characterization of separate monoclonal antibodies to human acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. | |
| EP0344134B1 (en) | Monoclonal antibody specific to a fibronectin sequence expressed in transformed cells, hybridoma secreting said antibody and use of said monoclonal antibody in the diagnosis of tumors | |
| EP4265717A1 (en) | Mouse anti-mcr-1/mcr-2 protein hybridoma cell strain, monoclonal antibody and use | |
| CZ318194A3 (en) | Monoclonal antibodies against glucoprotein p | |
| UA78489C2 (en) | Monoclonal antibody, chimeric antibody, completely humanized antibody, antibody to antiidiotypic antibody or fragment thereof to receptor of lipoproteins of low density (lpld) of human, a method for obtaining and use thereof | |
| EP2088159A1 (en) | Antibody recognizing c-domain of midkine | |
| CA2058041A1 (en) | Anti-igf-ii monoclonal antibody | |
| EP0411974A1 (en) | Monoclonal antibodies to a neurofibrillary tangle antigen | |
| JPH1084958A (ja) | 抗繊維芽細胞増殖因子６モノクローナル抗体 | |
| JP3472664B2 (ja) | 抗繊維芽細胞増殖因子５モノクローナル抗体 | |
| JP3920556B2 (ja) | 短縮型ミッドカイン（ｔＭＫ）タンパク質特異的モノクローナル抗体及びその用途 | |
| WO2022121899A1 (zh) | 一种特异性结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用 | |
| US8349569B2 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
| JP3522877B2 (ja) | 抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメント | |
| US20030144473A1 (en) | Peptides for the production of preparations for the diagnosis and therapy of autoimmun diseases | |
| JP3623271B2 (ja) | 抗チロシナーゼモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメント | |
| EP4170021A1 (en) | Mouse anti-mcr-1 protein hybridoma cell strain, monoclonal antibody, and application | |
| JPH0949836A (ja) | 抗体による蛋白質構造の評価方法 | |
| JP3532945B2 (ja) | 抗ヒトチロシナーゼモノクローナル抗体 | |
| CN117866086A (zh) | 结合人微囊蛋白-1的单克隆抗体及应用 | |
| JP3994369B2 (ja) | 酒石酸耐性酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体 | |
| CN117164711A (zh) | 一种抗神经纤维丝轻链蛋白的抗体 | |
| JPH08157500A (ja) | Ｆａｓ抗原の定量法 | |
| CN113999306A (zh) | 一种获得识别空间构象表位抗体的方法 | |
| CN115956089A (zh) | 抑制性抗enpp1抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051129 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060126 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060221 |