BRPI0608855A2 - composições de anticorpo anti - madcam processo para a preparação das mesmas e uso de anticorpo anti - madcam - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçõES DE ANTICORPO ANTI-MAdCAM PROCESSO PARA A PREPARAçAO DAS MESMAS E USO DE ANTICORPO ANTI-MAdCAM. A presente invenção relaciona-se a composições de anticorpos anti-MAdCAM compreendendo um agente quelante, e uso dos mesmos para preparar composições farmacêuticas líquidas para tratar doenças inflamatórias em um paciente.

Description

"COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO ANTI-MAdCAM"
Referência cruzada relacionadas à patentes e pedidos de patente
Este pedido reivindica o beneficio do Pedido de Patente Provisória Seriada dos EUA No. 60/752.712, depositada em 8 de Março de 2005; Pedido de Patente Provisória Seriada dos EUA No. 60/762.456, depositada em 26 de Janeiro de 2006; Pedido de Patente Provisória Seriada dos EUA No. 60/659.766, depositada em 8 de Março de 2005; Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 60/728.165, depositada em 19 de Outubro de 2005, todos dos quais são incorporados por referência aqui em sua totalidade.
Antecedente
A invenção relaciona-se às composições de anticorpos e métodos de anticorpos estabilizantes, e às composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo anticorpos anti-MAdCAM, e métodos de redução da instabilidade do anticorpo anti-MAdCAM.
A molécula de adesão celular a adressina mucosa (MAdCAM) é um membro da superfamilia da imunoglobulina dos receptores de adesão celular. Enquanto a MAdCAM desempenha um papel fisiológico na sobrevivência imune do intestino, ela parece facilitar o excessivo extravasamento de linfócito na doença do intestino inflamado sob condições de inflamação crônica do trato gastrointestinal. Anticorpos que inibem a ligação dos linfócitos a4(37+ a MAdCAM têm sido vistos reduzir o recrutamento de linfócitos, extravasamento tissular, inflamação e severidade da doença em modelos animais.Anticorpos que se ligam e inibem a atividade da MAdCAM têm sido relatados na literatura. Por exemplo, o Pedido de Patente Internacional Número PCT/US2005/000370 relata vários anticorpos monoclonais humanos para MAdCAM, incluindo um anticorpo tendo seqüências de aminoácidos de cadeia pesada e leve do anticorpo 7.16.6. Uma linhagem de hibridoma celular produzindo um anticorpo 7.16.6 foi depositada na Coleção Européia de Culturas Celulares (ECACC), H.P.A. em CA-MR, Porton Down, Sallsbury, Wiltshire SP4 OJG em 9 de Setembro de 2003 com Depósito N° 03090909.
Um modo possível de administrar tais anticorpos MAdCAM é parenteralmente. Composições anti-MAdCAM, como é o caso de todas as composições de proteina, são sujeitas a relação com respeito a degradação quimica e fisica do anticorpo na composição ao longo do tempo. Em geral, composições de anticorpo anti-MAdCAM devem exibir estabilidade quimica e fisica aceitáveis sob a variação esperada de estocagem e condições de uso, isto é, as composições de anticorpo anti-MAdCAM devem ter uma meia vida suficiente e ainda permanecer biologicamente ativa. O pedido presente revela composições novas de anticorpo anti-MAdCAM qu exibem estabilidade quimica e/ou fisica aumentada relativa às composições anti-MAdCAM previamente reveladas na literatura.
Resumo
Em um aspecto, a presente invenção prove uma composição liquida farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica à seqüência aminoácida de cadeia pesadamostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo uma seqüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a cadeia aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4, em que o anticorpo se liga a MAdCAM humana; e um agente quelante.
A presente invenção também prove um método para preparação de uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo misturas de pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal com um agente quelante farmaceuticamente aceitável em uma quantidade que reduz a instabilidade do anticorpo, em que quando a composição é estocada por um período de cerca de 26 semanas em uma temperatura de cerca de 40° C; a diminuição entre um agregado da área do pico do cromatograma para a composição farmacêutica liquida estável compreendendo anticorpos anti-MAdCAM monoclonais e o agente quelante; e um agregado da área do pico do cromatograma para uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocado por um periodo de cerca de 26 semanas em uma temperatura de cerca de 40° C.é pelo menos cerca de 2%.
A presente invenção também prove um método para estabilizar pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal em uma composição farmacêutica liquida compreendendo a formação de uma composição liquida compreendendo pelo menos um anticorpo e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, em que quando a composição é estocada por um periodo de cerca de 2 6 semanas em uma temperatura de cerca de 40° C; a diminuição entre uma área agregada do pico do cromatograma para a composição farmacêutica liquida estável compreendendopelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal e o agente quelante; e uma área agregada do pico do cromatograma para uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocado por um periodo de cerca de 26 semanas em uma temperatura de cerca de 40% é pelo menos cerca de 2% .
A presente invenção também prove um método para o tratamento de uma doença inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao paciente uma composição farmacêutica liquida compreendendo: uma quantidade terapeutica-mente efetiva do anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e um agente quelante farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também prove um equipamento para preparar uma composição liquida do anticorpo estabilizado compreendendo: um primeiro recipiente compreendendo pelo menos um anticorpo anti- MAdCAM monoclonal 7.16.6 em solução, e um segundo recipiente compreendendo um agente quelante farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também prove um artigo de fabricação compreendendo um recipiente que contém uma mistura de pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável.
A presente invenção também prove uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpoanti-MAdCAM monoclonal e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, em que a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e em que a proporção molar de anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,00001 a cerca de 450.
A presente invenção também prove uma composição liquida farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal, em que o anticorpo se liga à MAdCAM humana; e um agente quelante.
A presente invenção também prove uma composição liquida farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica à seqüência aminoácida da cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo uma seqüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica à seqüência aminoácida da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO:4, em que o anticorpo se liga à MAdCAM humana; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contém uma concentração de anticorpo que é pelo menos cerca de 10 mg/mL.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições testes diferindo na concentração de mAb após estocagem a 40° C por mais de 26 semanas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC);
A Figura 2 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições teste diferindo na concentração de EDTA após a estocagem a 40°C por mais de 26 semanas, por SEC;
A Figura 3 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições teste diferindo na con-centração de PS80 após a estocagem a 40° C por mais de 26 semanas, por SEC;
A Figura 4 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições teste diferindo nas espécies de tampão após a estocagem a 40° C por mais de 26 semanas, por SEC;
A Figura 5 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições teste diferindo nas espécies de estabilizadores/tonificantes após a estocagem a 40°C por mais de 26 semanas, por SEC;
A Figura 6 é um gráfico que ilustra a porcentagem de agregação em várias composições teste diferindo nas espécies de tensoativo após a estocagem a 40° C por mais de 26 semanas, por SEC.
Descrição detalhada da invenção
Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente feitos de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas através da presente especificação a menos que de outra forma indicado. Ver, por exemplo, Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Har-bor, N. I.- (1989) e Ausubel e colaboradores, Current Proto-cols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. I. (1990) . Reações enzimáticas e técnicas de purificação são feitas de acordo com as especificações do fabricante, comocomumente realizado na técnica ou como descrito aqui. As nomenclaturas utilizadas na conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de quimica analítica, quimica orgânica sintética, e quimica medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Técnicas padrões são utilizadas para sintese quimica, análises quimicas, preparação farmacêutica, formulação, e distribuição, e tratamento de pacientes. Definições:
A fim de ajudar o leitor no entendimento da seguinte descrição, as seguintes definições são providas;
Como aqui utilizado, o termo "composição" como é relacionado a um anticorpo anti-MAdCAM quer dizer descrever o anticorpo em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável compreendendo um agente quelante. Por exemplo, as composições da invenção têm uma meia vida aumentada e/ou estabilidade como comparada à técnica de reconhecidas composições compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto ou uma porção antigeno-ligante que compete com o anticorpo intacto pelo ligante especifico. Ver geralmente, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.I.. (1989). Porções antigeno-ligante podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou porclivagem enzimática ou quimica dos anticorpos intactos. Em algumas modalidades, as porções antigeno-ligante incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e região determinante de complementariedade (CDR), anticorpos cadeia única(scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptídeos quecontêm, pelo menos uma porção de um anticorpo que é suficien-te para conferir ligação antígeno específica ao polipeptí-deo. Do N-terminal ao C-terminal, ambos os domínios variá-veis da cadeia leve e pesada compreendem as regiões FR1, C-DR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. a alocação de aminoácidos acada domínio está em acordo com as definições de Kabat, Se-quences of Proteins of Immunological Interest (National Ins-titutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), ou Chothia e colabo-radores, Nature 342:878-883 (1989).
Como aqui utilizado, um anticorpo que é referidopelo número tem as mesmas seqüências de cadeia pesada e levecomo um anticorpo monoclonal que é obtido do hibridoma domesmo número. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 7.16.6 temas mesmas seqüências aminoácidas pesada e leve como uma ob-tida do hibridoma 7.16.6. Então, a referência ao anticorpo7.16.6 inclui o anticorpo que tem as seqüências aminoácidasde cadeia pesada e leve mostradas na SEQ ID NO. 2 e 4. Étambém incluído um anticorpo faltando uma lisina terminal nacadeia pesada, como esta é normalmente perdida em uma pro-porção de anticorpos durante a fabricação.
Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" com-preende proteínas nativas ou artificiais, fragmentos protéi-cos e análogos de polipeptídeos de uma seqüência protéica.Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.
Como aqui utilizado, um fragmento Fd significa umfragmento de anticorpo que consiste dos domínios VH e CH 1;um fragmento Fv consiste dos domínios VL e VH de um braçoúnico de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward e colabora-dores, Nature 341:544-546 (1989)) consiste de um domínio VH.
0 termo "ou uma porção antígeno-específico do mes-mo" quando utilizado com o termo "anticorpo" refere-se a umpolipeptídeo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carbó-xi-terminal, mas onde a seqüência aminoácida remanescente éidêntica às posições correspondentes na seqüência de ocor-rência natural. Em algumas modalidades, fragmentos são pelomenos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos longos. Em outras modalida-des, os fragmentos são pelo menos 14, pelo menos 20, pelomenos 50, ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 de ami-noácidos longos.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclo-nal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de an-ticorpos substancialmente homogêneos, isto é, anticorpos in-dividuais compreendendo a população são idênticos, excetopara possíveis mutações de ocorrência natural que pode estarpresentes em quantidades menores o faltando uma lisina C-terminal. Anticorpos monoclonais são altamente específicos,sendo direcionados contra um sítio antigênico único. Alémdisso, em contraste às preparações de anticorpos convencio-nais (policlonal), que tipicamente incluem anticorpos dife-rentes, direcionados contra determinantes diferentes (epíto-pos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um de-terminante único no antígeno. O modificador "monoclonal" in-dica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma popula-ção substancialmente homogênea de anticorpos, e não serconstruída como requerendo a produção do anticorpo por qual-quer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclo-nais a serem utilizados de acordo com a presente invençãopodem ser feitos por método de hibridoma primeiro descritopor Kohler, e colaboradores, Nature 256:495 (1975), ou podeser feito por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo,Pat. EUA No. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podemtambém ser isolados de bibliotecas de anticorpo de bacterió-fagos utilizando técnicas descritas em Clackson, e colabora-dores, Nature 352:624-628 (1991) e Marks, e colaboradores,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.
Como aqui utilizado, os termos "anticorpo isolado"ou "anticorpo purificado" refere-se a um anticorpo que porvirtude de sua origem ou fonte de derivação tem de um a qua-tro dos seguintes: (1) não é associado com componentes natu-ralmente associados que acompanham o mesmo em seu estado na-tivo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3)é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) nãoocorre na natureza. Então, um anticorpo que é quimicamentesintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferenteda célula em que é naturalmente originado é isolado e puri-ficado de seus componentes naturalmente associados. Um anti-corpo pode também ser feito substancialmente livre de compo-nentes naturalmente associados por isolamento e purificação,utilizando técnicas de purificação de proteína bem conheci-das na técnica. Exemplos de anticorpos isolados/purificadosincluem um anticorpo anti-MAdCAM que tem sido purificado porafinidade utilizando MAdCAM, um anticorpo anti-MAdCAM quetem sido sintetizado por um hibridoma ou outra linhagem ce-lular in vitro, e um anticorpo anti-MAdCAM humano derivadode um camundongo transgênico.
Um anticorpo é "substancialmente puro", "substan-cialmente homogêneo", ou "substancialmente purificado" quan-do pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra exibe uma es-pécie única de anticorpo. 0 anticorpo pode ser monomérico oumultimérico. Um anticorpo substancialmente puro tipicamentecompreenderá cerca de' 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% p/p de umaamostra de anticorpo, mais usualmente cerca de 95%, e prefe-rivelmente será mais de 99% de pureza. A pureza do anticorpoou homogeneidade pode ser indicada por um número de meiosbem conhecidos na técnica tais como eletroforese em gel depoliacrilamida de uma amostra de anticorpo, seguido por vi-sualização de uma banda de polipeptideo única sob corando ogel com um corante bem conhecido na técnica. Para certospropósitos, resolução mais alta pode ser alcançada pelo usoda HPLC ou outros meios bem conhecidos na técnica para puri-ficação .
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo humano" étencionado incluir anticorpos tendo regiões variáveis econstante derivado de seqüências de imunoglobulina de li-nhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invençãopodem incluir residuos aminoácidos não codificados por se-quencias de imunoglobulina de linhagem germinativa humana(por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese sitio-especifica ou aleatória in vitro ou por mutação somática invivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. Entretan-to, o termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, nãotenciona incluir anticorpos em que seqüências CDR derivadasde linhagem germinativa de outras espécies mamíferas, talcomo um camundongo, tenha sido enxertado em seqüências es-truturais humanas.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo recombi-nante humano" tenciona incluir todos os anticorpos humanosque são preparados, expressos, criados ou isolados por meiosrecombinantes, tais anticorpos expressos utilizando um vetorde expressão recombinante transfectado em uma célula hospe-deira, anticorpos isolados de um recombinante, biblioteca deanticorpo humano combinatorial, anticorpos isolados de umanimal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico paragenes da imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor,L.D., e colaboradores (1992) Nucl. Acids. Res. 20:6287-6295)ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados porqualquer outro meio que envolve "processamento" de seqüên-cias gênicas de imunoglobulina humana para outras seqüênciasde DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos têm regiõesvariáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglo-bulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalida-des, entretanto, tais anticorpos recombinantes humanos sãosujeitos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal trans-gênico para seqüência Ig humana é utilizado, mutagênese so-mática in vivo) e então as seqüências aminoácidas das regi-ões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências queenquanto derivadas de e relacionadas as seqüências VH e VLde linhagem germinativa humana, podem não existir natural-mente dentro do repertório de anticorpo humano da linhagemgerminativa in vivo.
Como aqui utilizado, o termo "polinucleotideo"significa uma forma polimérica de nucleotideos de pelo menos10 bases de comprimento, ou ribonucleotideos ou deoxinucleo-tideos ou uma forma modificada de ou tipo de nucleotideo. Otermo inclui formas de fita simples e dupla.
Como aqui utilizado, o termo "polinucleotideo iso-lado" significa um polinucleotideo genômico, cDNA, ou de origem sintética ou alguma combinação dos mesmos, que porvirtude de sua origem ou fonte de derivação, o "polinucleo-tideo isolado" tem de uma a três dos seguintes: (1) não éassociado com toda ou uma porção de um polinucleotideo comque o "polinucleotideo isolado" é encontrado na natureza,(2) é operavelmente ligado a um polinucleotideo ao qual nãoé ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza com par-te de uma seqüência maior.
Como aqui utilizado, o termo "nucleotideos de o-corrência natural" incluem deoxiribonucleotideos e ribonu-cleotideos. O termo "nucleotideos modificados" como aqui u-tilizados inclui nucleotideos com grupos açúcar modificadosou substituídos e semelhantes. O termo "oligonucleotideo li-gado" referido aqui inclui oligonucleotideos ligado tais co-mo fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosfo-rodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosfoto-amidato, e semelhantes. Ver, por exemplo, La Planche e cola-boradores, Nucl. Acids. Res. 14:9081 (1986); Stec e colabo-radores, J. Am. Chem. Soe. 106:6077 (1984); Stein e colabo-radores, Nucl. Acids. Res. , 16:3209 (1988); Zon e colabora-dores, Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon e colabora-dores, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach,pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Ox-ford Inglaterra (1991); Patente dos EUA No. 5.151.510; Uhi-mann e Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), as revelaçõesda qual são aqui incorporadas por referência. Um oligonucle-otideo pode incluir uma marcação para detecção, se desejado.
Seqüências "operacionalmente ligadas" incluem ambas as expressões de seqüências controle que são continuascom o gene de interesse e a expressão de seqüências de con-trole que atuam em trans ou a uma distância do gene controlede interesse. O termo "expressão de seqüência controle" comoaqui utilizado significa seqüências polinucleotidicas quesão necessárias para efetuar a expressão e processamento deseqüências codificantes as quais elas são ligadas. Expres-sões de seqüências controle incluem iniciação da transcriçãoapropriada, terminação, seqüências promotoras e iniciadoras;eficiente processamento de sinais de RNA tais como processamento e sinais de poliadenilação; seqüências que estabilizamo mRNA citoplasmático; seqüências que aumentam a eficiênciade tradução (isto é, seqüência consenso Kozak); seqüênciasque aumentam a estabilidade da proteina; e quando desejado,seqüências que aumentam a secreção protéica. A natureza detais seqüências controles difere dependendo do organismo dohospedeiro; em procariotos, tais seqüências controle geral-mente incluem promotor, sitio de ligação ribossomal, e se-qüência de terminação da transcrição; em eucariotos, geral-mente, tais seqüências controle incluem promotores e seqüên-cia de terminação de transcrição. 0 termo "seqüências con-trole" é tencionado incluir, no minimo, todos os componentescuja presença é essencial para expressão e processamento, epode também incluir componentes adicionais cuja presença évantajosa, por exemplo, seqüências lider e seqüências par-ceiras de fusão.
Como aqui utilizado, o termo "vetor" significa umamolécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácidonucléico ao qual ela tem sido ligada. Em algumas modalida-des, o vetor é uma seqüência lider e seqüências parceiras defusão, isto é, uma alça de fita dupla de DNA circular, emque segmentos adicionais de DNA podem estar ligados no geno-ma viral, Em algumas modalidades, os vetores são capazes dereplicação autônoma em um hospedeiro celular no qual elessão introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo umaorigem bacteriana de replicação e vetores epissomais de ma-mífero) ; Em outras modalidades, os vetores (por exemplo, ve-tores não epissomais de mamífero) podem ser integrados nogenoma da célula hospedeira sob introdução na célula hospe-deira, e assim são replicadas ao adiante com o genoma hospe-deiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionara expressão dos genes para os quais eles são operativamenteligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores deexpressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de ex-pressão") .
Como aqui utilizado, os termos "célula hospedeirarecombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") signifi-ca uma célula em que um vetor de expressão recombinante temsido introduzido. Deve ser entendido que "célula hospedeirarecombinante" e "célula hospedeira" significam não somente acélula sujeita em particular, mas também a progênie de tal5 célula. Porque certas modificações podem ocorres em geraçõessucessoras devido a ou mutação ou influências do meio, talprogênie pode não, de fato, ser idêntica à célula parental,mas são ainda incluídas no objetivo do termo "células hospe-deiras" como aqui utilizadas.
Como aqui utilizado, os termos "é capaz de ligarespecificamente" refere-se a quando um anticorpo se liga aum antigeno com uma constante de dissociação que é < 1 nM emais preferivelmente < 10 pM.
Como aqui utilizado, os termos "seletivamente hi-bridizado" significa detectavelmente e especificamente liga-do Polinucleotideos, oligonucleotideos e fragmentos dosmesmos de acordo com a invenção seletivamente hibridizam comfitas de ácido nucléico sob hibridização e condições de la-vagem que minimizam quantidade apreciáveis de ligantes de-tectáveis para ácidos nucléicos não específicos. Condiçõesde "alto rigor" ou "alta rigidez" podem ser utilizadas paraalcançar condições de hibridização seletiva como conhecidona técnica e discutido aqui. Um exemplo de condições de "al-to rigor" ou "alta rigidez" é a incubação de um polinucleo-tideo com outro polinucleotideo, em que um polinucleotideopode ser fixado a uma superfícies sólida tal como uma mem-brana, em um tampão de hibridização de 6X SSPE ou SSC, 50%formamida, 5X reagente de Denhardt, 0,5% SDS, 100 ug/mL deDNA de esperma de salmão fragmentado e de.snaturado em umatemperatura de hibridização de 42°C por 12-16 horas, seguidopor duas lavagens a 55 °C utilizando um tampão de lavagem deIX SSC, 0,5% SDS. Ver também Sambrook e colaboradores, acima, pp. 9.50-9.55.
O termo "porcentagem de identidade de seqüência"no contexto de seqüências de ácido nucléico significa a por-centagem de residuos quando uma primeira seqüência contíguaé comparada e alinhada para correspondência máxima a uma se-gunda seqüência contígua. O comprimento da seqüência de i-dentidade de comparação pode ser através de um comprimentode pelo menos cerca de nove nucleotideos, usualmente pelomenos cerca de 18 nucleotideos, mais usualmente pelo menoscerca de 24 nucleotideos, tipicamente pelo menos cerca de 28nucleotideos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucle-otideos, e pref erivelmente pelo menos cerca de 36, 48 oumais nucleotideos. Existe um número de diferentes algoritmosconhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir aidentidade da seqüência de nucleotideo. Por exemplo, sequências de polinucleotideos podem ser comparadas utilizandoFASTA, Gap ou Bestfit, que são programas na Wisconsin Pac-kage Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison,Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FAS-TA 2 e FASTA 3, prove alinhamentos e porcentagem de identi-dade de seqüência das regiões de melhor sobreposição entreas seqüências consultada e pesquisada (Pearson, MethodsEnzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol.132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258(1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); aqui incor-porados por referência). A menos que de outra forma especi-ficado, parâmetros padrões para um programa particular oualgoritmo são utilizados. Por exemplo, a porcentagem de i-dentidade de seqüência entre seqüências de ácido nucléicopodem ser determinadas utilizando FASTA com seus parâmetrospadrões (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para oganho de matriz) ou utilizando Gap com seus parâmetros pa-drões como provido na Versão 6.1 GCG, aqui incorporada porreferência.
Uma referência a uma seqüência de "polinucleoti-deo" ou um "ácido nucléico" compreende seu complemento a me-nos que de outra forma especificado. Então, a referência aoácido nucléico tendo uma seqüência particular deve ser en-tendida por compreender sua fita complementar, com sua se-qüência complementar.
O termo "substancial similaridade" ou "substancialsimilaridade de seqüência", quando referindo a um ácido nu-cléico ou fragmento do mesmo, significa que quando alinhadootimamente com inserções ou deleções de nucleotideo apropri-ado com outro ácido nucléico (ou sua fita complementar), háidentidade de seqüência nucleotidica em pelo menos 85%, pre-ferivelmente em pelo menos cerca de 90%, e mais preferivel-mente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das ba-ses nucleotidicas, como medida por qualquer algoritmo bemconhecido da seqüência de identidade, tais como FASTA, BLASTou Gap, como discutido acima.
Como aplicado à polipeptideos, o termo "identidadesubstancial", "porcentagem de identidade" ou "% idêntica"significa que suas seqüências de peptideos, quando otimamen-te alinhadas, tais como por programas GAP ou BESTFIT utili-zando ausência de pesos padrões, como fornecido com os pro-gramas, dividem pelo menos 70%, 75% ou 80% de identidade deseqüência, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identi-dade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 96%,97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência. Em certas moda-lidades, posições de residuo que não são idênticas diferempor substituições de aminoácidos conservados. Uma "substitu-ição de aminoácido conservado" é um que um residuo de amino-ácido é substituído por outro residuo de aminoácido tendo umgrupo de cadeia lateral R com propriedades quimicas simila-res (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, umasubstituição de aminoácido conservado não mudará substanci-almente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casosonde duas ou mais seqüências diferem entre si por substitui-ções conservativas, a porcentagem de identidade de seqüênciapode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conser-vativa da substituição. Meios para fazer este ajuste são bemconhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Pe-arson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Exemplos degrupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com proprie-dades quimicas similares incluem 1) cadeias laterais alifá-ticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas]-hidroxila: serina e treonina;3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina;4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, etriptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, ehistidina; 6) cadeias laterais acidicas: ácido aspártico eácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre:cisteina e metionina. Grupos de substituição de aminoácidosconservados são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato,e asparagina-glutamina.
A identidade de seqüência para polipeptideos, étipicamente medida utilizando programas de análises de se-qüência. Programa de análise de proteina verifica a repeti-ção ou igualdade entre seqüências utilizando medidas de si-milaridade determinada para várias substituições, deleções eoutras modificações, incluindo substituições de aminoácidosconservados. Por exemplo, GCG contém programas tais como"Gap" e "Bestfit" que podem ser utilizados com parâmetrospadrões como especificado com os programas, para determinara homologia da seqüência ou identidade da seqüência entrepolipeptideos intimamente relacionados, tais como polipepti-deos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entreuma proteina selvagem e um mutante da mesma. Ver, por exem-plo, Versão GCG 6.1. Seqüências de polipeptideo também podeser comparada utilizando FASTA, utilizando os parâmetros pa-drões ou recomendados, ver Versão GCG 6.1 (Universidade deWisconsin WI) . FASTA (por exemplo, FASTA 2 e FASTA 3) provealinhamentos e porcentagem de identidade de seqüência dasregiões de melhor sobreposição entre as seqüências consulta-da e pesquisada (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990);Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Outro algo-ritmo preferido quando comparando uma seqüência da invençãoa uma base de dados contendo um grande número de seqüênciasde diferentes organismos no programa de computador BLAST,especialmente blastp ou tblastn, utilizando parâmetros pa-drões como fornecido com os programas. Ver, por exemplo,Altschul e colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990);Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-402(1997). O comprimento das seqüências de polipeptídeo compa-radas por homologia serão geralmente pelo menos cerca de 16resíduos de aminoácidos, usualmente pelo menos cerca de 20resíduos, mais usualmente pelo menos cerca de 24 resíduos,tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos, e preferivel-mente mais que cerca de 35 resíduos. Quando procurando umabase de dados contendo seqüências de um grande número de di-ferentes organismos, é preferível comparar seqüências amino-ácidas.
Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos detempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico de-sejado, que inclui tratamento ou prevenção profilática dedoenças inflamatórias. É para ser notado que valores de do-sagem podem variar com a severidade da condição a ser alivi-ada. É ainda para ser entendido que para qualquer pacienteparticular, regimes de dosagem específicos devem ser ajusta-dos ao longo do tempo de acordo com a necessidade individuale o julgamento profissional que está administrando ou super-visionando a administração das composições, e que variaçõesde dosagens apresentadas aqui são exemplos somente e nãotencionam limitar o objetivo ou prática da composição rei-vindicada. Da mesma forma, uma quantidade terapeuticamenteefetiva de anticorpo ou porção de anticorpo pode variar deacordo com fatores tais como estado da doença, idade, sexo epeso do indivíduo, a habilidade do anticorpo ou porção doanticorpo para elicitar uma resposta desejada no indivíduo,e a via desejada de administração da composição de anticor-po. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma emque qualquer efeito tóxico ou em detrimento do anticorpo ouporção do anticorpo são ultrapassados por efeitos terapeuti-camente benéficos.
Como aqui utilizado, o termo "sacarídeo" refere-sea uma classe de moléculas que são derivadas de álcoois poli-idricos.
Como aqui utilizado, o termo "paciente" para pro-pósitos de tratamento incluem qualquer paciente, e preferi-velmente é um paciente que está em necessidade de tratamentode uma doença inflamatória. Para propósitos de prevenção, opaciente é qualquer paciente, e preferivelmente é um pacien-te que está em risco por, ou está pré-disposto a desenvolveruma doença inflamatória. O termo "paciente" tenciona incluirorganismos vivos, por exemplo, procariotos e eucariotos. E-xemplos de pacientes incluem mamíferos, por exemplo, huma-nos, cachorros, vacas, cavalos, porcos, ovelha, cabra, ga-tos, camundongos, coelhos, ratos e animais transgênicos nãohumanos. Em modalidades especificas da invenção, o pacienteé um humano.
Como aqui utilizado, o termo "tratamento" refere-se a ambos, tratamento terapêutico e medidas profiláticas oupreventivas, em que o objetivo é prevenir ou reduzir (dimi-nuir) a doença ou condição patológica objetivada. Aqueles emnecessidade de tratamento incluem aqueles já com a doençabem como aqueles passíveis de ter a doença ou aqueles em quea doença é para ser prevenida.
Quando introduzindo elementos da presente invençãoou modalidade(s) preferida(s) da mesma, os artigos "um", "o"e "referido" são tencionados significar que há um ou maisdos elementos. Os termos "compreendendo", "compreende","compreender", "incluindo" e "tendo" são -tencionados ser in-cluídos e significa que podem ser elementos adicionais alémde outros elementos listados.
Anticorpos anti-MAdCAM:
Em acordo com a presente invenção, tem sido desco-berto que a estabilidade de certos anticorpos anti-MAdCAMmonoclononais que são descritos aqui podem ser aumentados emsolução por mistura de anticorpos anti-MAdCAM com um agentequelante farmaceuticamente aceitável, tal como ácido etile-nodiaminotetraacético ("EDTA").
Enquanto não desejando estar ligado por teoria, éacreditado que a presença de um agente quelante na composi-ção da presente invenção ajuda a aumentar a estabilidade doanticorpo polipeptideo por reduzir a incidência de um oumais dos seguintes: agregação, fragmentação, oxidação, ins-tabilidade de congelamento/degelo, e/ou deaminação do anti-corpo anti-MAdCAM. A presente invenção compreende composi-ções de anticorpo anti-MAdCAM tendo estabilidade quimicae/ou física como comparado para composições de anticorpopreviamente reveladas.
Então, em certos aspectos, a presente invençãoprove uma composição farmacêutica líquida compreendendo umagente quelante aceitável, tal como EDTA e pelo menos um an-ticorpo anti-MAdCAM monoclonal ou uma porção antígeno-ligante do mesmo. Em ainda outros aspectos, as composiçõesanti-MAdCAM líquida acima mencionadas compreendendo um agen-te quelante pode incluir excipientes farmaceuticamente acei-táveis adicionais, incluindo, mas não limitados a um ou maisexcipientes que são escolhidos de tampões, agentes de toni-cidade , tensoativos e misturas dos mesmos.
A presente invenção prove novas composições com-preendendo anticorpos anti-MAdCAM. Como aqui utilizado, afrase "anticorpo anti-MAdCAM" refere-se a qualquer anticor-po, ou qualquer porção, que é capaz de ligar a qualquer por-ção de um polipeptídeo MAdCAM que pode estar presente dentroou isolado de qualquer animal. Em certas modalidades, o po-lipeptídeo MAdCAM é um polipeptídeo MAdCAM humano.
Anticorpos anti-MAdCAM adequados para uso com apresente invenção pode ser escolhido de anticorpos policlo-nais ou monoclonais. Em certos aspectos, o anticorpo anti-MAdCAM monoclonal pode ser um anticorpo murino, quimérico,humanizado ou humano. Em modalidades adicionais, o anticorpoanti-MAdCAM monoclonal é um anticorpo anti-MAdCAM monoclonalhumano.
Em certas modalidades, os anticorpos anti-MAdCAMque são adequados para uso com a presente invenção incluemaqueles anticorpos anti-MAdCAM e métodos para preparar osmesmos que são descritos no Pedido Internacional NúmeroPCT/US2005/000370, depositado em 7 de Janeiro de 2005 e pu-blicada em 28 de Julho de 2005. Em outras modalidades, osanticorpos anti-MAdCAM que são adequados para uso com a pre-sente invenção incluem aqueles anticorpos anti-MAdCAM mono-clonais tendo as seqüências aminoácidas pesada e leve do an-ticorpo designado 7.16.6 no Pedido Internacional NúmeroPCT/US2005/000370.
Em adição, tais anticorpos anti-MAdCAM podem serescolhidos baseados nas diferenças nas seqüências aminoáci-das na região constante de suas cadeias pesadas. Por exem-plo, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser escolhidos da clas-se IgG, que têm cadeias pesadas do tipo "gama". A classe esubclasse de anticorpos anti-MAdCAM podem ser determinadaspor qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classee subclasse de um a anticorpo podem ser determinadas utili-zando anticorpos que são específicos para uma classe e sub-classe particular do anticorpo. Tais anticorpos são comerci-almente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determi-nadas por ELISA, ou Western Blot bem como outras técnicas.Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determina-das por sequenciamento de todos ou uma porção dos domíniosconstantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, com-parando suas seqüências aminoácidos para seqüências aminoá-cidas conhecidas das várias classes e subclasses de imuno-globulinas, e determinando a classe e subclasse de anticor-pos .O anticorpo anti-MAdCAM podem ser uma moléculaIgG, uma I.gM, uma IgE, uma IgA, ou uma IgD. Em modalidadesadicionais, o anticorpo anti-MAdCAM é uma IgG e é uma sub-classe IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Entretanto, como será apre-ciado, é geralmente não desejável matar células expressandoMAdCAM. De preferência, um geralmente desejado para simpli-ficar a inibição do ligante MAdCAM com seu ligante para mi-tigar a regulação negativa de célula T. Um dos maiores meca-nismos através do qual os anticorpos matam células é atravésda fixação do complemento e participação em CDC. A regiãoconstante de um anticorpo possui um importante papel na co-nexão com a habilidade do anticorpo para fixar o complementoe participar na CDC. Então, geralmente um seleciona o isoti-po de anticorpo para ou prover a habilidade da fixação docomplemento, ou não. No caso da presente invenção, geralmen-te, como mencionado acima, é geralmente não preferido utili-zar um anticorpo que mate as células. Existe um número deisotipos de anticorpos que são capazes de fixação do comple-mento e CDC, incluindo, sem limitação, os seguintes: IgM mu-tina, IgG2a murina, IgG2b murina, igG3 murina, IgM humana,IgGl humana e IgG3 humana. Em contraste, isotipos preferidosque não sejam capazes da fixação do complemento e CDC inclu-em, sem limitação, IgG2 e IgG4 humana. Em adição a diferen-ças na seqüência de cadeia pesada, os anticorpos IgG diferemdentro de suas subclasses baseadas no número de ligaçõesdissulfeto e comprimento da região da dobradiça. Por exem-plo, as subclasses IgG2 têm várias diferenças distintas dasoutras subclasses. As subclasses IgG2 e IgG4 são conhecidaspor ter 4 ligações dissulfeto dentro da sua região dobradi-ça, enquanto IgGl tem 2 e IgG3 tem 11 ligações de dissulfe-to. Outras diferenças para anticorpos IgG2 incluem sua habi-lidade reduzida de atravessar a placenta e a inabilidade dosanticorpos IgG2 de ligar aos receptores Fc de linfócito. En-tão, em certas modalidades, o anticorpo anti-MAdCAM é sub-classe IgG2 ou IgG4. Em outra modalidade preferida, o anti-corpo anti-MAdCAM é subclasse IgG2.
Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpode cadeia única (scFv) em que os domínios VL e VH são unidospara formar um molécula monovalente através do ligante sin-tético que permite a eles serem feitos como uma cadeia deproteína única (Bird. e colaboradores, 242:423-426 (1988) eHuston e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85:5879-5883 (1988)) . Em algumas modalidades, os anticorpos são dia-corpos, isto é, são anticorpos bivalentes em que domínios VHe VL são expressos em uma única cadeia polipeptidica, masutilizando um ligante que é também curto para permitir a u-nião entre os dois domínios na mesma cadeia, assim forçandoos domínios a unir com domínios complementares de outra ca-deia e criando dois sítios de ligação do antígeno (Ver, porexemplo, Holliger, P. e colaboradores, Proc. Natl. Acad.Sei. EUA 90:6444-6448 (1993), e Poljak, R. J. e colaborado-res , Structure 2:1121-1123 (1994)). Em algumas modalidades,um ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incor-porados em uma molécula ou covalentemente ou não covalente-mente para torná-la uma imunoadesina que liga especificamen-te a MAdCAM. Em tais modalidades, o CDR(s) pode ser incorpo-rado com parte de uma cadeia de polipeptideo maior, pode sercovalentemente ligada a outra cadeia polipeptidica, ou podeser não covalentemente incorporada.
Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-MAdCAMtem seletividade (ou especificidade) para MAdCAM que é pelomenos 100 vezes maior que sua seletividade para qualquer ou-tro polipeptideo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MAdCAM não exibe qualquer ligante especifico apreciável paraqualquer outra proteína pura que MAdCAM. Um pode determinara especificidade do anticorpo anti-MAdCAM para MAdCAM utili-zando métodos bem conhecidos na técnica seguindo os ensina-mentos da especificação. Por exemplo, um pode determinar aseletividade utilizando Western blot, FACS, ELISA ou RIA.Então, em algumas modalidades, o anticorpo anti-MAdCAM mono-clonal é capaz de especificamente ligar a MAdCAM.
Em algumas modalidades, a lisina C-terminal de ca-deia pesada do anticorpo anti-MAdCAM da invenção não estápresente. Em várias modalidades da invenção, as cadeias pe-sada e leve dos anticorpos anti-MAdCAM podem opcionalmenteincluir uma seqüência sinal.
A tabela 2 lista a seqüência de identificadores(SEQ ID NOS) dos ácidos nucléicos que codificam as cadeiaspesada e leve e as correspondentes seqüências de aminoácidospreditas para o anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6. En-quanto seqüências de DNA codificando um polipeptideo sinalsão mostradas na seqüência de identificadores (SEQ ID NOS),o anticorpo tipicamente não compreende um polipeptideo sinalporque o polipeptideo sinal é geralmente eliminado duranteas modificações pós-tradução. Em várias modalidades da in-venção, uma ou ambas das cadeias pesada e leve dos anticor-pos anti-MAdCAM incluem uma seqüência sinal (ou uma porçãoda seqüência sinal). Em outra modalidade da invenção, nem acadeia pesada nem a leve dos anticorpos anti-MAdCAM incluemuma seqüência sinal.
Tabela 1:
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Em algumas modalidades, a molécula de ácido nu-cléico compreende uma seqüência nucleotidica que codifica aseqüência aminoácida VL do anticorpo monoclonal 7.16.6 (SEQID NO:4), ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, areferida porção compreende pelo menos a região CDR3. Em al-gumas modalidades, o ácido nucléico codifica a seqüência a-minoácida da cadeia leve CDRs do referido anticorpo. Em al-gumas modalidades, a referida porção é uma porção contiguacompreendendo CDR1-CDR3.
Em ainda outra modalidade, a molécula de ácido nu-cléico codifica uma seqüência aminoácida VL que é pelo menos70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticaa seqüência aminoácida VL do anticorpo 7.16.6 ou uma seqüên-cia aminoácida de SEQ ID NO:4. Moléculas de ácido nucléicoda invenção incluem ácido nucléicos que hibridizam sob con-dições altamente rigorosas, tais como aquelas descritas aci-ma, para uma seqüência de ácido nucléico codificando a se-qüência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO:4.
Em modalidades adicionais, a molécula de ácido nu-cléico compreende uma seqüência nucleotidica que codificapelo menos uma porção da seqüência aminoácido VH de 7.16.6(SEQ ID NO:2) ou a referida seqüência tendo umas mutações deaminoácidos conservados e/ou um total de três ou menos subs-tituições de aminoácidos não conservados. Em várias modali-dades a seqüência codifica um ou mais regiões de CDR, prefe-rivelmente uma região CDR3, todas as três regiões CDR, umaporção contígua incluindo CDR1-CDR3, ou a região VH inteira.
Em algumas modalidades, a molécula de ácido nu-cléico codifica uma seqüência de aminoácido VH que é pelomenos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou100% idêntica a seqüência aminoácida VH da SEQ ID NO:2. Mo-léculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléi-cos que hibridizam sob condições altamente rigorosas, taiscomo aquelas descritas acima, para uma seqüência nucleotidi-ca codificando a seqüência de aminoácido de cadeia pesada daSEQ ID NO:2.
Em outros aspectos, a presente invenção prove umacomposição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos umanticorpo purificado que liga a MAdCAM, em que o anticorpocompreende uma seqüência aminoácida de cadeia pesada com pe-lo menos 95% de identidade de seqüência a SEQ ID NO:2 e umaseqüência aminoácida de cadeia leve com pelo menos 95% deidentidade de seqüência a SEQ ID NO:4. Em outros aspectos, oanticorpo compreende uma seqüência de cadeia pesada com pelomenos 99% de identidade de seqüência a SEQ ID NO:2 e uma se-qüência aminoácida de cadeia leve com pelo menos 99% de i-dentidade. de seqüência a SEQ ID NO:4. Em ainda outros aspec-tos, o anticorpo compreende uma seqüência aminoácida de ca-deia pesada que compreende a região variável da SEQ ID NO:2e uma seqüência aminoácida de cadeia leve que compreende aregião variável SEQ ID NO:4. Em aspectos adicionais, o anti-corpo compreende uma seqüência aminoácida de cadeia pesadacompreendendo SEQ ID NO:2 e uma seqüência aminoácida de ca-deia leve compreendendo SEQ IDNO:4.
Em uma modalidade da presente invenção, o anticor-po anti-MAdCAM especificamente liga-se a um epitopo confor-macional da MAdCAM humana.
Preparação de Composições de Anticorpo Anti-MAdCAMMonoclonal
O anticorpo anti-MAdCAM tipicamente é formuladocomo uma composição farmacêutica para administração parente-ral a um paciente. Em uma modalidade, a composição farmacêu-tica é uma composição liquida. Em outra modalidade, a compo-sição farmacêutica é uma composição liquida.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo anti-MAdCAM e um agente quelante farmacêutica-mente aceitável. Em outra modalidade, a invenção é direcio-nada a uma composição farmacêutica liquida compreendendo pe-lo menos um anticorpo anti-MAdCAM e EDTA. Em outra modalida-de, a invenção é direcionada a uma composição farmacêuticaliquida compreendendo pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM,um agente que1ante farmaceuticamente aceitável, e um tampãofarmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invençãoé direcionada a uma composição farmacêutica liquida compre-endendo pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM, um agente que-lante farmaceuticamente aceitável e histidina. Em outra mo-dalidade , a invenção é direcionada a uma composição farma-cêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, ED-TA, e histidina. Em outra modalidade, a invenção é direcio-nada a uma composição farmacêutica liquida compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM, DTPA, e histidina.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente a-ceitável, e agente de tonicidade farmaceuticamente aceitá-vel . Em outra modalidade, a invenção é direcionada a umacomposição farmacêutica liquida compreendendo um anticorpoanti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente aceitável,e trealose. Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, EDTA, e trealose. Em outra modalidade, ainvenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquidacompreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, DTPA, e trealose.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente a-ceitável, e um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Emoutra modalidade, a invenção é direcionada a uma composiçãofarmacêutica aceitável compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, EDTA, e um tensoativo farmaceuticamente aceitável.Em outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composi-ção farmacêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-MAdCAm, DTPA, e um tensoativo farmaceuticamente aceitável.Em outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composi-ção farmacêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente aceitável sele-cionado do grupo consistindo de EDTA e DTPA, e polisorbato80.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um tampão farmaceuticamente aceitável, eum tensoativo farmaceuticamente aceitável. Em outra modali-dade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêuticaliquida compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, histidina, eum tensoativo farmaceuticamente aceitável. Em outra modali-dade , a invenção é direcionada a uma composição liquida far-macêutica compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM, histidina,e polisorbato 80.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente a-ceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável, e um tenso-ativo farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente a-ceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável, e um agentede tonicidade farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM, um agente quelante farmaceuticamente a-ceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável, um tensoa-tivo farmaceuticamente aceitável, e um agente de tonicidadefarmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida compreendendo um anti-corpo anti-MAdCAM e histidina.
O termo "composição farmacêutica" refere-se a pre-parações que são de tal forma como permitir a atividade bio-lógica dos ingredientes ativos para ser efetivo. "Excipien-tes farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) sãoaqueles, que pode razoavelmente (isto é, segurança) ser ad-ministrado a um paciente para prover uma dose efetiva do in-grediente ativo empregado. O termo "excipiente" ou "veiculo"como utilizado aqui se refere a uma substância inerte, que écomumente utilizado como um agente diluente, veiculo, pre-servativo, ligante ou estabilizante para fármacos. Como aquiutilizado, o termo "diluente" refere-se a um solvente farma-ceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administra-ção para um humano) e é útil para a preparação das composi-ções líquidas aqui. Diluentes exemplares incluem, mas nãosão limitadas a água estéril e água bacteriostática para in-jeção (BWFI).
0 anticorpo anti-MAdCAM presente na composiçãofarmacêutica liquida pode ser como previamente descrita nes-te pedido. Em uma modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende um anticorpo anti-MAdCAM compreendendo umaseqüência aminoácida VL que é 90%, 95% ou 99% idêntica a se-qüência aminoácida VL mostrado na SEQ ID NO:4, e ainda com-preende uma seqüência aminoácida VH que é 90%, 95% ou 99%idêntica a seqüência aminoácida VH mostrado na SEQ ID NO: 2.Em outra modalidade, a composição farmacêutica liquida com-preende um anticorpo anti-MAdCAM que é anticorpo anti-MAdCAMmonoclonal 7.16.6.
A concentração do anticorpo anti-MAdCAM nas compo-sições farmacêuticas liquidas da presente invenção é geral-mente pelo menos cerca de 0,1 miligramas por mililitro(mg/mL) ou maior, pelo menos cerca de 1,0 mg/mL ou maior,pelo menos cerca de 10 mg/mL ou maior, pelo menos cerca de50 mg/mL ou maior, pelo menos cerca de 75 mg/mL ou maior,pelo menos cerca de 100 mg/mL ou maior, ou pelo menos cercade 200 mg/mL ou maior. Em certas modalidades, a concentraçãodo anticorpo anti-MAdCAM geralmente varia de cerca de 1mg/mL a cerca de 200 mg/mL, de cerca de 2 mg/mL a cerca de100 mg/mL, de cerca de 5 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, de cercade 10 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, de cerca de 50 mg/mL a cer-ca de 90 mg/mL, de cerca de 60 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, decerca de 65 mg/mL a cerca de 85 mg/mL, ou é cerca de 75mg/mL. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-MAdCAM na composição farmacêutica liquida varia de cerca de50 mg/mL a cerca de 100 mg/mL.
Como aqui utilizado, os termos "agente quelante"geralmente refere-se a um excipiente que pode formar pelomenos uma ligação (por exemplo, covalente, iônica, ou de ou-tra forma) ao ion metal. Um agente quelante é tipicamente umligante multidentado que pode ser utilizado nas composiçõesliquidas como um estabilizante para complexo com espécies,que podem promover instabilidade. Sempre, compostos que po-dem atuar como um agente quelante terão grupos funcionaisrico em elétron. Grupos funcionais ricos em elétron adequa-dos incluem grupos de ácido carboxilico, grupos hidróxi egrupos amino. Rearranjo desses grupos nos ácidos aminopoli-carboxilico, ácido hidroxipolicarboxilico, ácido hidroxiami-nocarboxilico, e semelhantes, resultam em frações que têm acapacidade de ligar a metal.
Entretanto, a presente invenção não tenciona serlimitada a agentes quelantes que aumentam a estabilidade doanticorpo primariamente por habilidade do agente quelantepara formar ligações com um ion metal. Assim, a presente in-venção não tenciona ser limitada por mecanismo especificapelo qual o agente quelante estabiliza as composições dapresente invenção e os excipientes chamados agentes quelan-tes aqui podem alcançar sua estabilidade de anticorpo aumen-tando as propriedades primariamente através de mecanismosque são no geral não relacionadas a habilidade do agentequelante para formar ligações com um ion metal.Agentes quelantes que são adequados para uso napresente invenção, incluem, mas não são limitados a ácidosaminopolicarboxilicos, ácidos hidroxiaminocarboxilicos, gli-cinas N-substituidas, ácido 2-(2-amino-2-oxoctil)aminoetanosulfônico (BES), deferoxamina (DEF), ácido citrico, niacina-mida, e desoxicolatos. Exemplos de ácidos aminopolicarboxi-licos adequados incluem ácido etilenodiaminotetraacético(EDTA), ácido 5 dietilenotriamina pentaacético (DTPA), ácidonitriloacético (NTA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético(ADA), ácido bis(aminoetil)glicoléter, N,N,N',N'-tetraacético(EGTA), ácido trans-diaminocicloexano tetraacético (DCTA),ácido glutâmico, e ácido aspártico. Exemplos de ácidos hi-droxiaminocarboxilicos adequados incluem ácido N-hidroxi-etiliminodiacético (HIMDA), N,N-bis-hidroxietilglicina (bi-cina) e N-(trisidroximetilmetil) 10 glicina (tricina) . Umexemplo de glicina N-substituida adequada é glicilglicina.Um exemplo de um desoxicolato adequado é desoxicolato de só-dio .
Agentes quelantes utilizados na invenção podem es-tar presentes, onde possivel, como um ácido livre ou uma ba-se livre do composto (por exemplo, referido alternadamenteaqui como "EDTA" ou "edetato") ou como uma forma de sal cor-respondente (por exemplo, o correspondente sal de adição á-cida ou sal de adição base, tais como edetato dissódico) .Sais de adição ácida adequados, por exemplo, incluem saisalcalino metal (por exemplo, sais de sódio ou potássio) ,sais de metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio), e saispodem ser preparados utilizando outros ions metais ligadosfracamente. Como é conhecido na técnica, a natureza do sal eo número de cargas a serem neutralizadas dependerão do núme-ro de grupos carboxila presentes e o pH no qual o agentequelante estabilizante é fornecido. Como é também conhecidona técnica, agentes quelantes têm comprimentos variantes como qual ions alvos particulares são ligados. Por meio de i-lustração adicional, sais adequados de EDTA incluem edetatode dipotássio, edetato de dissódio, edetato de cálcio dissó-dio, edetato de sódio, edetato trissódio, e edetato de po-tássio; e um sal adequado de deferoxamina (DEF) é mesilatode deferoxamina (DFM).
Agentes quelantes utilizados na invenção podem es-tar presentes na forma anidra, solvatada ou hidratada docomposto ou sal correspondente. Onde o agente quelante estáum uma forma solvatada ou hidratada, ele pode estar presenteem estados variantes de solvatação ou hidratação (incluindo,por exemplo, formas anidras, hidratadas, diidratadas e trii-dratadas) . A fim de ainda, ilustrar, um hidrato adequado deEDTA é EDTA diidrato de disódio; e formas adequadas de ácidocitrico inclui ácido citrico anidro, ácido citrico monoidra-tado, e citrato-diidrato trissódio.
Agentes quelantes adequados utilizando em uma com-posição de anticorpo da presente invenção também incluem,por exemplo, aqueles que ligam a metais iônicos em soluçãopara tornar-los incapazes de reagir com 02 disponível, assimminimizando ou prevenindo a geração de radicais hidroxilasque são livres para reagir com e degradam o anticorpo. Ou-tros agentes quelantes tais como DFM podem diminuir a forma-ção de espécies de oxigênio reduzido, formação de espéciesacídicas reduzidas (por exemplo, deamidação) e/ou fragmenta-ção de anticorpo reduzida. Em ainda outras modalidades, oagente quelante pode reduzir ou prevenir a agregação dos an-ticorpos nas composições descritas aqui. Tais agentes que-lantes podem reduzir ou prevenir a degradação de um anticor-po que é formulado sem a proteção de um agente quelante.
Quando uma concentração de um agente quelante éreferida a, é mencionado que a concentração relatada repre-senta a concentração molar do ácido livre ou base livre doagente quelante. Por exemplo, a concentração do agente que-lante em certas composições farmacêuticas líquidas geralmen-te variam de cerca de 0,3 micromolar a cerca de 50 milimo-lar, de cerca de 3,0 micromolar a cerca de 10,0 milimolar,de cerca de 30 micromolar a cerca de 5,0 milimolar, de cercade 0,1 milimolar a cerca de 1 milimolar. Em modalidades es-pecificas, a concentração de agente quelante na composiçãofarmacêutica liquida pode ser cerca de 3 micromolar, cercade 13 micromolar, cerca de 27 micromolar, cerca de 0,27 mi-limolar, cerca de 1 milimolar ou cerca 2,7 milimolar. Em umamodalidade, a concentração de agente quelante é cerca de0,27 milimolar.A menos que de outra forma declarado, as con-centrações listadas aqui são aquelas concentrações em condi-ções ambiente, (isto é, a 25 °C e pressão atmosférica).
Em uma modalidade, o agente quelante é selecionadodo grupo consistindo de EDTA, DTPA, DFM e misturas dos mes-mos. Em outra modalidade, o agente quelante é DFM. Em outramodalidade, o agente quelante é EDTA. EM outra modalidade, oagente quelante é DTPA. Em outra modalidade, a composiçãofarmacêutica liquida compreende EDTA em uma quantidade vari-ando de cerca de 0,3 micromolar a cerca de 50 milimolar, eem algumas modalidades, de cerca de 0,1 milimolar a cerca de1,0 milimolar. Em outra modalidade, a composição farmacêuti-ca liquida compreende EDTA em uma quantidade de cerca de0,27 milimolar.
Como notado acima, as composições farmacêuticaslíquidas da presente invenção opcionalmente podem ainda com-preender um tampão farmaceuticamente aceitável em adição aum agente quelante. Como aqui utilizado, o termo "tampão"refere-se a uma composição que permite uma composição de an-ticorpo liquida para resistir mudanças de pH. Em certas mo-dalidades, o tampão adicionado permite uma composição de an-ticorpo liquida para resistir mudanças no pH pela ação deseus componentes conjugados ácido-base.
Exemplos de tampões adequados incluem, mas não sãolimitados a, acetato (por exemplo, acetato de sódio), succi-nato (por exemplo, succinato de sódio), gluconato, citrato,e outros tampões de ácido orgânico, incluindo, mas não limi-tado a, tampões tais como aminoácidos (por exemplo, histidi-na), ácido acético, ácido fosfórico e fosfatos, ascorbato,ácido tartárico, ácido maléico, glicina, lactato, ácido lá-tico, ácido ascórbico, imidazóis, ácido carbônico e bicarbo-natos, ácido succinico, ácido benzóico de sódio e benzoatos,gluconato, edetato (EDTA), acetato, malato, imidazol, tris,fosfato, e misturas dos mesmos.
Em uma modalidade, o tampão é histidina. O materi-al de partida histidina utilizado para preparar as composi-ções farmacêuticas liquidas da presente invenção pode exis-tir em diferentes formas. Por exemplo, a histidina pode seruma forma enantiomérica (por exemplo, L- ou D-enantiômero)ou racêmica, uma forma de ácido livre ou base livre da hsi-tidina, uma forma de sal (por exemplo, um sal monoidroclore-to, diidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, ou acetato) dehistidina, uma forma solvato de histidina, uma forma hidra-tada (por exemplo monoidrato) de histidina, ou uma forma a-nidra de histidina. A pureza do sal e/ou base de histidinautilizada para preparar as composições farmacêuticas liqui-das geralmente podem ser pelo menos 98%, pelo menos cerca de99%, ou pelo menos cerca de 99,5%. Como utilizado aqui, otermo "pureza" no contexto de histidina refere-se a purezaquimica da histidina como entendido na técnica, por exemplo,como descrito em O índice Merck, 13° ed., 0'Neil e colabora-dores ed. (Merck & Co., 2001).
Quando uma concentração de um tampão é referida a,é tencionado que a concentração citada representa a concen-tração molar da forma de ácido livre ou base livre do tam-pão. Por exemplo, a concentração do tampão quando presenteem certas composições farmacêuticas liquidas pode variar decerca de 0,1 milimolar (mM) a cerca de 100 mM. Em uma moda-lidade, a concentração do tampão é de cerca de 1 mM a cercade 50 mM, Em outra modalidade a concentração do tampão é decerca de 5 mM a cerca de 20 mM. Em várias modalidades, aconcentração de tampão é cerca de 1 mM, cerca de 5 mM, cercade 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM,cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45mM, cerca de 50 mM, cerca de 55 mM, cerca de 60 mM, cerca de65 mM, cerca de 70 mM, cerca de 75 mM, cerca de 80 mM, cercade 85 mM, cerca de 90 mM, cerca de 95 mM ou cerca de 100 mM.
Em uma modalidade, a concentração de histidina na composiçãofarmacêutica é cerca de 10 mM. Em uma modalidade, a composi-ção farmacêutica contém cerca de 10 mM de L-histidina (naforma de base).
Em geral, o tampão é utilizado para manter um ni-vel de pH aceitável (que pode afetar a estabilidade do anti-corpo) na composição farmacêutica liquida. A composição far-macêutica liquida tipicamente é tamponada para manter um pHna variação de cerca de 4 a cerca de 8; de cerca de 4,5 acerca de 7; ou de cerca de 5,2 a cerca de 5,8. Variações in-termediárias dos pHs acima citados são também tencionadasserem parte desta invenção. Por exemplo, variações de valo-res utilizando uma combinação de qualquer dos valores cita-dos cima como limites superior e/ou inferior são tencionadosserem incluídos. Em uma modalidade, a composição farmacêuti-ca liquida é tamponada para manter um pH de cerca de 5,5.
Como notado acima, as composições farmacêuticaslíquidas da presente invenção opcionalmente podem ainda com-preender um agente de tonicidade farmaceuticamente aceitávelem adição a um agente quelante. Como aqui utilizado, os ter-mos "agente de tonicidade" ou "tonificante" refere-se a umexcipiente que pode ajustar a pressão osmótica de uma compo-sição de anticorpo liquida para isotônica de modo que a com-posição de anticorpo é fisiologicamente compatível com ascélulas do tecido corporal do paciente. Em ainda outras mo-dalidades, o "agente de tonicidade" pode contribuir para umaumento na estabilidade de qualquer um dos anticorpos anti-MAdCAM descritos aqui. Uma composição "isotônica" é uma quetem essencialmente a mesma pressão osmótica como sangue hu-mano. Composições isotônicas geralmente têm uma pressão os-mótica de cerca de 250 a 350 mOsm. O termo "hipotônico" des-creve uma composição com uma pressão osmótica abaixo que dosangue humano. Correspondentemente, o termo "hipertônico" éutilizado para descrever uma composição com uma pressão os-mótica acima que a do sangue humano. Isotonicidade pode sermedida utilizando uma pressão a vapor ou osmômetro tipo con-gelamento, por exemplo.
O agente de tonicidade utilizado para preparar ascomposições farmacêuticas liquidas da presente invenção po-dem existir em formas diferentes. Por exemplo, o agente detonicidade pode ser uma forma enantiomérica (por exemplo, J-ou D-enantiômero) ou racêmico; isômeros tais como alfa oubeta, incluindo alfa, alfa ou beta, beta, ou alfa, beta oubeta, alfa; uma forma de ácido livre ou base livre; uma for-ma hidratada (por exemplo, monoidrato) , ou uma forma anidra.
Em uma modalidade, o agente de tonicidade é um sa-carideo. Sacarideos são comumente referidos como carboidra-tos e podem conter quantidades diferentes de unidades de a-çúcar (sacarideo), por exemplo, monossacarideos, dissacari-deos e polissacarideos. Sacarideos que são adequados parauso como um agente de tonicidade na presente invenção, in-cluem, mas não são limitados a, sacarideos selecionados dogrupo consistindo de frutose, glicose, manose, sorbose, xi-lose, lactose, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dex-trina, ciclodextrina, amido solúvel, hidroxietil amido, gli-canas solúveis em água, e misturas dos mesmos. Em uma moda-lidade, o agente de tonicidade é sacarose.
Em outra modalidade, o agente de tonicidade é umpoliol. Como aqui utilizado, o termo "poliol" refereOse a umexcipiente com múltiplos grupos hidroxilas, e incluem açúca-res (reduzindo e não reduzindo açúcares), açúcares álcoois eaçúcares ácidos. Em uma modalidade, o poliol tem um peso mo-lecular que é menor que cerca de 600 kD (por exemplo, na va-riação de cerca de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redu-tor" é um que contém um grupo hemiacetal que pode reduzirions metais ou reagir covalentemente com lisina e outrosgrupos amino em proteínas e um "açúcar não redutor" é um quenão tem essas propriedades de um açúcar redutor. Polióis quesão adequados para uso como um agente de tonicidade na pre-sente invenção, incluem, mas não são limitados a polióis se-lecionados do grupo consistindo de manitol, trealose, sorbi-tol, eritritol, isomalte, lactitol, maltitol, xilitol, gli-cerol, lactitol, propileno glicol, polietileno glicol, ino-sitol, e misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o agente detonicidade é um açúcar não redutor selecionado do grupo con-sistindo de sacarose, trealose, sorbose, melezitose, rafino-se, e misturas dos mesmos. Em outra modalidade, o agente detonicidade é um açúcar não redutor selecionado do grupo con-sistindo de trealose e sacarose, e misturas dos mesmos. Emoutra modalidade, o agente de tonicidade é manitol. Em outramodalidade, o agente de tonicidade é D-manitol. Em outra mo-dalidade, o agente de tonicidade é trealose. Em outra moda-lidade, o agente de tonicidade é diidrato de oc-trealose. Emoutra modalidade, o agente de tonicidade é um sal, tal comocloreto de sódio.
A concentração do agente de tonicidade quando pre-sente em uma composição farmacêutica liquida pode variar decerca de 1,0 milimolar a cerca de 600 milimolar, de cerca de10 milimolar a cerca de 400 milimolar, ou de cerca de 100milimolar a cerca de 300 milimolar. Em uma modalidade, aconcentração do agente de tonicidade varia de cerca de 200milimolar a cerca de 250 milimolar. Em outra modalidade, aconcentração do agente de tonicidade na composição farmacêu-tica liquida é cerca de 222 milimolar, cerca de 238 milimolar, ou cerca de 247 milimolar.
Em ainda outra modalidade, o agente de tonicidadeé manitol e está presente na composição farmacêutica liquidaem uma concentração de 247 milimolar. Em outra modalidade, oagente de tonicidade é trealose e está presente na composição farmacêutica liquida em uma concentração de 222 milimo-lar. Em outra modalidade, o agente de tonicidade é trealosee está presente na composição farmacêutica liquida em umaconcentração de 238 milimolar.
Como notado acima, as composições farmacêuticasliquidas da presente invenção opcionalmente podem ainda com-preender um tensoativo farmaceuticamente aceitável em adiçãoa um agente quelante. Como aqui utilizado, o termo "tensoa-tivo" refere-se a um excipiente que pode alterar a tensão desuperfícies de uma composição de anticorpo liquida. Em cer-tas modalidades, o tensoativo reduz a tensão de superfíciesde uma composição de anticorpo liquida. Em ainda outras mo-dalidades, o "tensoativo" pode contribuir para um aumento deestabilidade de qualquer um dos anticorpos anti-MAdCAM des-critas acima. Por exemplo, o tensoativo pode reduzir a agre-gação do anticorpo formulado e/ou minimizar a formação departiculados na composição e/ou reduzirem a adsorção. 0 ten-soativo pode também aumentar a estabilidade do anticorpo du-rante e após um ciclo de congelamento/descongelamento.
Tensoativos adequados incluem tensoativos de poli-sorbato, poloxâmero 18, tensoativo triton tal como Triton X-100®, tensoativos polisorbato tais como Tween 20® e Tween80®, dodecil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, oc-til glicosideo de sódio, lauril-sulfobetaina, miristil-sulfobetaina, linoleil-sulfobetaina, estearil-sulfobetaina,lauril-sulfobetaina, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina,linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaina,miristil-betaina, cetil-betaina, lauroamidopropil-betaina,cocamidopropil-betaina, linoleaminopropil-betaina, mirista-midopropil-betaina, palmidopropil-betaina, isoestearamido-propil-betaina, miristamidopropil-dimetilamina, palmidopro-pil-dimetilamina, isostearamidopropil-dimetilamina, metilcocoil-taurato de sódio, metil oleil-taurato disódio, clore-to diidroxipropil peg 5 linoleamônio, polietileno glicol, emisturas dos mesmos.
Em uma modalidade, o tensoativo é um tensoativopolisorbato compreendendo pelo menos um excipiente que é se-lecionado do grupo consistindo de polisorbato 20, polisorba-to 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61, poli-sorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85,e misturas dos mesmos. Em outra modalidade, a composiçãofarmacêutica liquida compreende polisorbato 80.
A concentração de tensoativo quando presente nacomposição farmacêutica liquida pode variar de cerca de0, 005 milimolar a cerca de 10 milimolar, de cerca de 0,007milimolar a cerca de 5,0 milimolar, ou de cerca de 0,01 mi-limolar a cerca de 1,0 milimolar. Em outra modalidade, aconcentração de tensoativo é de cerca de 0,05 milimolar acerca de 1,0 milimolar. Em outra modalidade, a composiçãofarmacêutica liquida contém cerca de polisorbato 80 0,30 mi-limolar .
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menor 95% idêntica a seqüência aminoácida de cadeia pe-sada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leva mostrado na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a um MAdCAM humano; e um agentequelante.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo umaseqüência aminoácida que é pelo menos 95% a uma seqüênciaaminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO:4, em que oanticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um agente quelante;e em que a composição é substancialmente livre de ions clo-reto ou ions acetato ou ambos.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo anti-MAdCAM monoclonal, em que o anticorpo seliga a uma MAdCAM humana; e um agente quelante; e em que acomposição é substancialmente livre de ions cloreto ou ionsacetato ou ambos.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a seqüência aminoácida de cadeia pe-sada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração do anticorpo que é pelo menos cerca de 50mg/mL, pelo menos cerca de 60 mg/mL, pelo menos cerca de 70mg/mL, pelo menos cerca de 80 mg/mL, pelo menos cerca de 90mg/mL, ou pelo menos cerca de 100 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 10 mg/mLa cerca de 2 00 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma • se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se lega a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 15 mg/mLa cerca de 200 mg/mL.
Em uma modalidade da presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreendendo umaseqüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4;em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 20 mg/mLa cerca de 200 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica líquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 50 mg/mLa cerca de 20 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica líquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 100mg/mL a cerca de 2 00 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica líquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipi-ente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que varia de cerca de 65 mg/mLa cerca de 85 mg/mL.
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menosum anticorpo compreendendo uma seqüência aminoácida que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeiapesada mostrada na SEQ ID NO: 2, e ainda compreende uma se-qüência aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma se-qüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 4,em que o anticorpo se liga a uma MAdCAM humana; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a composição contémuma concentração de anticorpo que é cerca de 75 mg/mL.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de0,3 micromolar a cerca de 50 milimolar de agente quelante.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de 30micromolar a cerca de 5.0 milimolar de agente quelante.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de0,27 milimolar de agente quelante.Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de0,3 micromolar a cerca de 50 milimolar de EDTA.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de 30micromolar a cerca de 10,0 milimolar de EDTA.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de0,1 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de EDTA.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de0,27 milimolar de EDTA.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de DTPA.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de deferoxamina
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; e de cerca de 1mM a cerca de 100 mM de histidina.Em outra modalidade, a composição farmacêuticaliquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200mg/mL de anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cercade 30 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de agente quelan-te; e de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0, 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de agente quelante; e decerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trealose.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de agente quelante; e decerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trealose;e cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0, 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de agente quelante; e decerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trealose;e cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; e de cercade 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de polisorbato80.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA; e de cerca de10 milimolar a cerca de 400 milimolar de agente de tonicida-de; de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de tampão; e de cercade 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de tensoativo.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6/ de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA; de cerca de 10milimolar a cerca de 400 milimolar de agente de tonicidade;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; de cerca de0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de um tensoativo.
Em outra modalidade, a composição farmacêutica li-quida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mLde anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de cerca de 30micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA; de cerca de 10milimolar a cerca de 400 milimolar de trealose; de cerca de1 mM a cerca de 100 mM de histidina; de cerca de 0,005 mili-molar a cerca de 10 milimolar de um tensoativo.
Em certos aspectos da presente invenção, as compo-sições de anticorpo anti-MAdCAM líquidas compreendem de cer-ca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anticorpo anti-MAdCAMmonoclonal 7.16.6; de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM dehistidina; de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimo-lar de polisorbato 80; de cerca de 30 micromolar a cerca de5,0 milimolar de EDTA; de cerca de 10 milimolar a cerca de400 milimolar de trealose.
Em outros aspectos da presente invenção, as compo-sições de anticorpo anti-MAdCAM líquidas compreendem de cer-ca de 50 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de anticorpo anti-MAdCAMmonoclonal 7.16.6; de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM de his-tidina; de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolarde polisorbato 80; de cerca de 30 micromolar a cerca de 5,0milimolar de EDTA; de cerca de 100 milimolar a cerca de 300milimolar de trealose.
Em outros aspectos da presente invenção, as compo-sições de anticorpo anti-MAdCAM liquidas compreendem de cer-ca de 65 mg/mL a cerca de 85 mg/mL de anticorpo anti-MAdCAMmonoclonal 7.16.6; de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM de his-tidina; de cerca de 0,05 milimolar a cerca de 0,5 milimolarde polisorbato 80; de cerca de 0,1 milimolar a cerca de 1milimolar de EDTA; de cerca de 10 milimolar a cerca de 200milimolar a cerca de 250 milimolar de trealose.
Em outras aspectos da presente invenção, as composições de anticorpo anti-MAdCAM liquidas compreendem de cer-ca de 75 mg/mL de anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6;de cerca de 20 mM de histidina; de cerca de 0,3 milimolar depolisorbato 80; de cerca de 0,27 milimolar de EDTA; e decerca de 238 milimolar de trealose.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida estável compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM e um agente quelante farmaceuticamenteaceitável, em que a concentração molar do anticorpo varia decerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a con-centração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003milimolar a cerca de 50 milimolar, e em que a proporção mo-lar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de0,00001 a cerca de 450; de cerca de 0,0001 a cerca de 100;de cerca de 0, 005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cercade 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cer-ca de 3; ou é cerca de 1,9.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida estável compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 e um agente quelante farmaceu-ticamente aceitável, em que a concentração molar do anticor-po varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 mili-molar e a concentração molar do agente quelante varia decerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e em que aproporção molar do anticorpo para agente quelante varia decerca de 0, 00001 a cerca de 450; de cerca de 0,0001 a cercade 100; de cerca de 0,005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 acerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1a cerca de 3; ou é cerca de 1,9.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida estável compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM 7.16.6, um agente quelante farmaceuti-camente aceitável, e histidina; em que a concentração molardo anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de1,35 milimolar, e a concentração molar do agente quelantevaria de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, eem que a concentração molar. de histidina varia de cerca de 1milimolar a cerca de 100 milimolar; e em que a proporção molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de0, 00001 a cerca de 450; de cerca de 0, 0001 a cerca de 100;de cerca de 0, 005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cercade 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cer-ca de 1; ou é cerca de 0,5.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida estável compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM 7.16.6, um agente quelante farmaceuti-camente aceitável, e histidina; em que a concentração molardo anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de1,35 milimolar, e a concentração molar do agente quelantevaria de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, eem que a concentração molar de histidina varia de cerca de 5milimolar a cerca de 30 milimolar; e em que a proporção mo-lar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de0, 00001 a cerca de 100; de cerca de 0, 005 a cerca de 50; decerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5;de cerca de 0,1 a cerca de 3; ou é cerca de 1,9.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada a
uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo umanticorpo anti-MAdCAM 7.16.6, um agente quelante farmaceuti-camente aceitável, e histidina; em que a concentração molardo anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de1,35 milimolar, e a concentração molar do agente quelantevaria de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, ea concentração molar de histidina varia de cerca de 5 mili-molar a cerca de 20 milimolar; e em que a proporção molar doanticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,005 acerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 3; ou é cercade 1,9.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada auma composição farmacêutica liquida estável compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6, um agente quelante farmaceuti-camente aceitável, e histidina; em que a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina varia de cerca de 5 milimolar a cerca de 20 milimolar; e em que a proporção molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 3; ou é cerca de 1,9.
Em outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6, um agente quelante farmaceuticamente aceitável, e histidina; em que a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina varia de cerca de 20 milimolar; e em que a proporção molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 3; ou é cerca de 1,9.
Métodos de Produção de Anticorpos Anti-MAdCAM e Produção de Anticorpos de Linhagens Celulares:
Anticorpos em acordo com a invenção podem ser preparados através da utilização de um camundongo transgênico que tem uma porção substancial do anticorpo humano produzin-do um genoma inserido, mas que é obtido deficiente na produção de anticorpos endógenos murinos. Tais camundongos, então, são capazes de produzir moléculas de imunoglobulinas humanas e anticorpos e são deficientes na produção de moléculas de imunoglobulina humana e anticorpos. Tecnologias utilizadas para alcançar os mesmos são discutidas abaixo.
É possivel produzir animais transgênicos (por e-xemplo, camundongos) que são capazes, sob imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Em particular, entretanto, uma modalidade da produção transgênica em camundongos e anticorpos dos mesmos é revelada no Pedido Internacional Número PCT/US2005/000370. Através do uso de tal tecnologia, anticorpos que ligam a MAdCAM e hibridomas produzindo tais anticorpos podem ser preparados.
Anticorpos humanos evitam certos problemas associados com anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes murina ou de rato. A presença de tais proteínas derivadas de camundongos ou ratos pode levar a uma rápida depuração dos anticorpos ou podem levar a degeneração de uma resposta imune contra o anticorpo por um paciente que recebe a administração de tais anticorpos.
Por exemplo, tem sido descrito que a deleção homo-zigota do gene da região de junção da cadeia pesada do anti-corpo (JH) em camundongos mutantes de linhagem germinativa e quimérica resulta na completa inibição da produção de anticorpo endógena. A transferência do gene da preparação da imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camun-dongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos sob desafio do antigeno (por exemplo, MAdCAM). Ver, por exemplo, Jakobovits e colaboradores, Proc. Natl. Sei. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits e colaboradores, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann e colaboradores, Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal e colaboradores, Nature 355:258 (1992). Anticorpos humanos podem também ser derivados de bibliotecas de exposição de bacteriófagos (Hoogenboom e colaboradores, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks e colaboradores, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan e colaboradores, Nature Biotech 14:309 (1996)).
Em algumas modalidades, anticorpos anti-MAdCAM humanos podem ser produzidos por imunização de um animal transgênico não humano, por exemplo, camundongo XENOMOUSE®, cujo genoma compreende genes da imunoglobulina humana a fim de que o camundongo recombinante produz anticorpos humanos. Camundongos XENOMOUSE® são cepas de camundongos projetados que compreendem grandes fragmentos da cadeia pesada de imunoglobulina humana e loci da cadeia leve e são deficientes na produção de anticorpo de camundongo. Camundongos XENOMOUSE® produzem um repertório humano do tipo adulto dos anticorpos humanos completos e geram anticorpos humanos antige-no-especificos. Em algumas modalidades, os camundongos XENOMOUSE® contêm aproximadamente 80% do gene do repertório de anticorpo humano V através da introdução de fragmentos de cromossoma artificial de levedura na configuração de linhagem germinativa de tamanho de megabase (YAC) da loci da cadeia pesada e loci da cadeia leve kappa.humana. Em outrasmodalidades, camundongos XENOMOUSE® ainda contêm aproximadamente todo o locus da cadeia leve lambda. Ver, por exemplo, Green e colaboradores, Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes EUA 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963 e 6.150.584. Ver também WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096, W096/33735, W098/16654, W098/24893, WO98/50433, WO99/45031, WO99/53049, WO/00/09560 e W.O00/037504 .
Em algumas modalidades, o animal não humano compreendendo os genes da imunoglobulina humana são animais que têm um "minilocus" da imunoglobulina humana. Na abordagem minilocus, um locus Ig exógeno é mimetizado através da inclusão dos genes individuais do locus Ig. Então, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, um domínio constante um, e um segundo domínio constante (preferi-velmente um domínio constante gamma) são formados em uma construção para inserção em um animal. Esta abordagem é descrita, entre o resto, na Patente EUA Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.770, 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721,367, 5.789.215 e 5.643.763.
Dessa forma, em algumas modalidades, anticorpos humanos podem ser produzidos por imunização de um animal não humano compreendendo em seu genoma algum ou todo do loci da cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina humana com an-tigeno MAdCAM.
Em algumas modalidades, o antigeno MAdCAM é isolado e/ou MAdCAM purificada. Em uma modalidade preferida, oantígeno MAdCAM é MAdCAM humana. Em algumas modalidades, o antigeno MAdCAM é um fragmento de MAdCAM. Em algumas modalidades, o fragmento MAdCAM compreende pelo menos um epitopo de MAdCAM. Em outras modalidades, o antigeno MAdCAM é uma célula que expressa ou super expressa MAdCAM ou um fragmento da mesma em sua superfície. Em ainda outras modalidades, o antigeno MAdCAM é uma proteína de fusão MAdCAM. MadCAM pode ser purificada de fontes naturais utilizando técnicas conhecidas. Em adição, proteína MAdCAm recombinante é comercialmente disponível.
Em uma modalidade preferida, o animal não humano é um animal XENOMOUSE® (Abgenix inc, Fremont, CA). Outro animal não humano que pode ser utilizado é um camundongo trans-gênico por Medarex (Medarex, Inc., Princeton, NJ) .
A imunização de animais pode ser por qualquer método conhecido na fcnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunização de animais não humanos tais como camundongos, ratos, cabra, porcos, boi e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Labe, acima, e Patente EUA 5.994.619. Em uma modalidade preferida, o antigeno MAdCAM é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes exemplares incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptideos muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes) . Tais adjuvantes podem proteger o polipeptideo de rápida dispersão por seqüestro em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secre-tar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferivelmente, se um poli-peptideo está sendo administrado, o horário de imunização pode envolver duas ou mais administrações do polipeptideo, estendido por várias semanas.
Após a imunização de um animal com um antigeno MAdCAM, células produtoras de anticorpo e/ou anticorpos podem ser obtidas do animal. Em algumas modalidades, o soro contendo anticorpo anti-MAdCAM é obtido do animal por sangria ou sacrifício do animal. 0 soro pode ser utilizado como é obtido do animal, uma fração da imunoglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos anti-MAdCAM podem ser purificados do soro.
Em algumas modalidades, linhagens celulares imortalizadas produtoras de anticorpo são preparadas de células do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e linfonodo e/ou células B esplênicas são imortalizadas. Métodos de imortalização de células incluem, mas não são limitados a, transfectar as mesmas com oncogenes, infectando as mesmas com um virus oncogênico, cultivando os mesmos sob condições que selecionam as células imortalizadas, sujeitando as mesmas a compostos carcinogênicos ou mutantes, fundindo as mesmas com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inativando um gene supressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, acima. Em uma modalidade preferida, o animal imunizado é um animal não humano que expressa genes da imunoglobulina humana e células B esplênicas são fundidas a uma linhagem de célula de mielomadas mesmas espécies como o animal não humano. Em uma modalidade mais preferida, o animal imunizado é um animal XENOMOU-SE® e a linhagem de célula de mieloma é um mieloma de camundongo não secretório. Se a fusão com células de mieloma é utilizada, as células de mieloma preferivelmente não secretam polipeptideos de imunoglobulina (uma linhagem celular não secretória). Células imortalizadas são selecionadas utilizando MAdCAM, uma porção das mesmas, ou uma célula expressando MAdCAM. Em uma modalidade preferida, a seleção inicial é feita utilizando um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio. Um exemplo de seleção por ELISA é provido em WO00/37504.
Células produtoras de anticorpo anti-MAdCAM, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e ainda filtradas para características desejáveis, incluindo crescimento sólido, alta produção de anticorpo e características desejáveis do anticorpo, como discutido ainda abaixo. Hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singenêicos, em animais que falta um sistema imune, por exemplo, camundongos "nude", ou em cultura de célula in vitro. Métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos pelos versados na técnica.
Como será apreciado, anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser recombinantemente expressos nas linhagens celulares outras que linhagens de célula de hibri-doma. Seqüências de ácido nucléico codificando os cDNAs ou clones genômicos para os anticorpos particulares podem ser utilizados para transformação de células de hospedeiro mami-fero ou não mamífero adequados.
A presente invenção também compreende moléculas de ácido nucléico codificando anticorpos anti-MAdCAM. Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucléico diferentes codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglo-bulina anti-MAdCAM. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina anti-MAdCAM. Em uma modalidade, o ácido nucléico codifica um anticorpo anti-MAdCAM da invenção.
Uma molécula de ácido nucléico codificando a cadeia pesada ou toda cadeia leve do anticorpo anti-MAdCAM ou porções do mesmo pode ser isolada de qualquer fonte que produz tal anticorpo. Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucléico são isoladas de uma célula B isolada de um animal imunizado com anti-MAdCAM ou uma célula imortalizada derivada de tal célula B que expressa um anticorpo anti-MAdCAM. Métodos de isolamento de mRNA codificando um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sam-brook e colaboradores, Molecular Cloning 3o Ed. Vol. 3 (1989). 0 mRNA pode ser utilizado para produzir cDNA para uso na reação de polimerase em cadeia (PCR) ou clonagem de cDNA de genes do anticorpo- Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucléico é isolada de um hibridoma que tem como uma de seus parceiros de fusão uma célula produzindo imunoglobulina humana de um animal transgênico não humano. Em uma modalidade ainda mais preferida, a célula produzindo imunoglobulina humana é isolada de um animal XENOMOÜSE®. Em outra modalidade, a célula produzindo imunoglobulina humanaé de um animal transgênico não humano, não camundongo, como descrito acima. Em outra modalidade, o ácido nucléico é isolado de um animal não transgênico, não humano. As moléculas de ácido nucléico isoladas de um animal não humano podem ser utilizadas, por exemplo, para anticorpos humanizados.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico codificando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção pode compreender uma seqüência nucleotidica codificando um dominio VH da invenção formado junto a uma seqüência nucleotidica codificando um dominio constante da cadeia pesada de qualquer fonte. Similarmente, uma molécula de ácido nucléico codificando uma cadeia leve de um anticorpo an-ti-MAdCAM da invenção pode compreender uma seqüência nucleotidica codificando um dominio VL da invenção formado junto a uma seqüência nucleotidica codificando um dominio constante de cadeia leve de qualquer fonte.
Em um aspecto adicional da invenção, moléculas de ácido nucléico codificando o dominio variável das cadeias pesada (VH) e leve (VL) são "convertidos" para genes de anticorpo de comprimento inteiro. Em uma modalidade, moléculas de ácido nucléico codificando os domínios VH e VL são convertidos para genes de anticorpo de comprimento inteiro por inserção em um vetor de expressão já codificando os domínios constantes da cadeia pesada (CH) ou cadeia leve (CL) , respectivamente, tal que o segmento VH é operativamente ligado ao(s) segmento (s) CH dentro do vetor, e o segmento VL é operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Em outra modalidade, moléculas de ácido nucléico codificando os domi-nios VH e/ou VL são convertidas em genes de anticorpo de comprimento inteiro por ligação, por exemplo, ligando uma molécula de ácido nucléico codificando uns domínios VH e/ou VL a uma molécula de ácido nucléico codificando um dominio CH e/ou CL utilizando técnicas de biologia molecular padrões . Seqüências de ácido nucléico de genes do dominio constante da' cadeia pesada e leve da imunoglobulina são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kabat e colaboradores, Sequences of Proteins of Immuological Interest, 5o Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Moléculas de ácido nucléico codificando as cadeias pesada e/ou leve de comprimento inteiro podem então ser expressas de uma célula dentro da qual eles têm sido introduzidos e o anticorpo anti-MAdCAM isolado.
A presente invenção também prove vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção ou uma porção antigeno-ligante do mesmo. A invenção também prove vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou porção antigeno-ligante da mesma. A invenção ainda prove vetores compreendendo moléculas de ácido nucléico codificando proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpo, e sondas dos mesmos.
Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MAdCAm, ou porções antigeno-ligantes da invenção são expressos por inserção de DNAs codificando cadeias leve e pesada de comprimento parcial ou inteiro, obtidas como descrito acima, em vetores de expressão tais como os genes são operativamenteligados as seqüências controle de expressão necessárias tais como seqüências controle transcricional e traducional. Vetores de expressão incluem plasmideos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-associado (VAA), virus de planta como virus mosaico de couve-flor, virus mosaico de tabaco, cosmideos, YACs, episomas derivados de EBV, e semelhantes. 0 gene do anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências controle transcricional e traducional dentro do vetor serve sua função tencionada de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vetor de expressão e seqüências controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula de expressão do hospedeiro utilizada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em uma modalidade preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos o vetor de expressão por métodos padrões (por exemplo, ligação dos sítios de restrição complementar no fragmento do gene de anticorpo e vetor, ou ligação abrupta de fita dupla de DNA se nenhum sítio de restrição está presente).
Um vetor conveniente é um que codifique uma seqüência de imunoglobulina CH ou CL funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados projetados de forma que qualquer seqüência VH ou VL possa facilmente ser inserida e expressa como descrita acima. Em tais vetores, o processamento usualmente ocorre entre o sítio de processamento do doador na região J inserida e o sítio aceptor do processamento precedendo o domínio C humano, e também nas regiões deprocessamento que ocorre dentro dos exons CH. Poliadenilação e terminação de transcrição ocorrem nos sitios cromossomais nativos a jusante das regiões codificantes. O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptideo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado em um vetor tal que o peptideo sinal está ligado junto ao amino terminal da cadeia de imunoglobulina. 0 peptideo sinal pode ser um peptideo sinal de imunoglobulina ou um peptideo sinal heterólogo (isto é, um peptideo sinal de uma proteina não imunoglobulina) .
Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores recombinantes de expressão da invenção carreiam seqüências regulatórias que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. Será apreciado pelos versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das seqüências regulatórias podem depender de tais de tais fatores como a escolha da célula hospedeira para serem transformadas, o nivel de expressão daproteina desejada etc. Seqüências regulatórias preferidas para expressão em célula hospedeira de mamifero incluem elementos virais que direcionam altos niveis de expressão protéica em células de mamifero, tal como promotores e/ou e-nhancers derivados de retrovirus (tal como retrovirus LTRs), citomegalovirus (CMV) (tal como o promotor/enhancer CMV) , Virus Simio 40 (VS40) (tal como o promotor/enhancer VS40), adenovirus, (por exemplo o promotor tardio principal de ade-novirus (AdMLP)), polioma e fortes promotores mamíferos taiscomo imunoglobulina nativa e promotores de actina. Para adicional descrição dos elementos regulatórios virais, e seqüências dos mesmos, ver, por exemplo, Patente EUA No. 5.168.062, Patente EUA No. 4.510.245 e Patente EUA No.4.968.615. Métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, bem como transformação de plantas é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Únicos 6.517.529, aqui incorporadas por referência. Métodos de expressão de polipeptideos em células de bactérias ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, são também bem conhecidos na técnica .
Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulatórias, os vetores recombinantes de expressãoda invenção podem carrear seqüências adicionais, tal como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores passíveis de seleção. O gene marcador selecionável facilita a seleção das células hospedeiras dentro das qual o vetor tem sido introduzido (ver, por exemplo, Patente EUA No. 4.399.216, 4.634.685 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tais como G418, higromicina ou metrotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor tem sido introduzido.Genes marcadores passíveis d seleção preferidos incluem o gene da diidrofolato redutase (DHFR) (para uso nas células dhfr-hospedeiras com seleção/amplificação de metrotrexato) , o gene de resistência a neomicina (para seleção G418), e ogene da glutamato sintetase.
Moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos anti-MAdCAM e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para a transformação de uma célula hospedeira mamifera, de planta, bacteriana ou de levedura. Anticorpos da invenção podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as seqüências de cadeia pesada e leve da imunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recuperável da mesma.
Transformação pode ser feita por qualquer método conhecido para introdução de polinucleotideos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotamento do polinu-cleotideo em um virus (ou em um vetor viral) e transduzindo uma célula hospedeira com o virus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado por Pat. EUA Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455. O procedimento.de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodos para introdução de polinucleotideos heterólogos em células mamíferas são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a transfecção mediada por dextran, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de proto-plasma, eletroporação, bombardeamento de partícula, encapsulamento de polinucleotideo(s) em lipossomas, peptideos conjugados, dendrimeros, e microinjeção direta de DNA no núcleo.
Linhagens de células mamíferas disponíveis comohospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas da Coleção de Tipo de Cultura Americana (ATCC), incluindo, mas não limitada a células de ovários de hamster Chinês (CHO), células NSO, células HeLa, células de rim de hamster recém nascido (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e um número de outras linhagens celulares. Células não mamíferas incluindo, mas não limitadas a bacterianas, leveduras, e plantas podem também serem utilizadas para expressar anticorpos recombi-nantes. Sítio direcionado a mutagênese do domínio CH2 do anticorpo para eliminar a glicosilação pode ser preferido a fim de prevenir mudanças ou na imunogenicidade, farmacociné-tica, e/ou funções efetoras resultando da glicosilação não humana. Os métodos de expressão são selecionados por determinação de qual sistema gera os níveis mais altos de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação a MAd-CAM constitutiva.
Ademais, a expressão de anticorpos da invenção (ou outras frações do mesmo) da produção de linhagens celulares pode ser aumentada utilizando um número de técnicas conhecidas. Por exemplo, a glutamina sintetase e sistemas de expressão do gene DHFR são abordagens comuns para o aumento da expressão sob cercas condições. Clones celulares com altaexpressão podem ser identificados utilizando técnicas convencionais, tais como clonagem por diluição limitada e tecnologia Microdrop. O sistema Glutamina Sintetase é discutido no total ou em parte na conexão com Patente Européia Nos.0216 846, O 256 055 e 0 323 997 e Pedido de Patente Européia No. 89303964.4.
Em conexão com a produção transgênica em mamíferos, anticorpos podem também ser produzidos em, e recuperados de, leite de cabra, vacas, ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, Pat. EUA Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957 .
Os anticorpos anti-MAdCAM expressados nas linhagens celulares como descrito acima podem ser purificados e/ou isolados do material celular associado. Os anticorpos podem estar presentes nas células totais, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. A purificação é feita a fim de eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, cromatografia em coluna e outras bem conhecidas na técnica. Ver Ausubel, F. e colaboradores, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (1987) .
Na presente invenção, é possível que os anticorpos anti-MAdCAM da presente invenção expressos por diferentes linhagens de células ou em animais transgênicos terão modelos de glicosilação diferentes de cada um. Entretanto, todos os anticorpos anti-MAdCAM codificados por ácidos nucléicos e aminoácidos providos aqui são considerados parte da presente invenção, sem levar em consideração o modelo de glicosilação ou modificação ou deleção do mesmo.
Como .aqui utilizado, o termo "glicosilação" signi-fica o modelo de unidades de carboidrato que são covalente-mente ligados a um anticorpo. Quando é dito que os anticorpos anti-MAdCAM aqui têm um modelo de glicosilação particular, significa que a maioria dos anticorpos anti-MAdCAM referenciados têm esse modelo de glicosilação particular. Em outros aspectos, quando é referido que os anticorpos anti-MAdCAM aqui têm um modelo de glicosilação particular, significa que um maior que ou igual número a 50%, 75%, 90%, 95%, 99% ou 100% dos anticorpos anti-MAdCAM têm este modelo de glicosilação particular.
Os anticorpos anti-MAdCAM da presente invenção também compreendem variantes de glicosilação dos mesmos (por exemplo, por inserção de um sitio de glicosilação ou deleção de qualquer sitio de glicosilação por deleção, inserção ousubstituição de resíduos aminoácidos adequados). Para propósitos da presente invenção, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser glicosilados ou não glicosilados. Quando os anticorpos anti-MAdCAM são glicosilados eles podem ter qualquer dos possíveis modelos de glicosilação. Além disso, cada cadeia pesada dentro de um anticorpo pode ter o mesmo modelo de glicosilação ou as duas cadeias pesadas podem ter modelos de glicosilação diferentes.
Rotas de Administração e Dosagens:
As composições desta invenção podem ser em soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusões). A forma preferida depende do modo tencionado de administração e aplicação terapêutica. Composições preferidas tipicas estão na forma de soluções injetáveis ou infusiveis, taiscomo composições similares àquelas utilizadas para imunização passiva de humanos. 0 modo de administração preferido é parental (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradermal, intraperitoneal, intramuscular, e intraesternal) ou por técnicas de infusão, na forma de liquido injetável estéril ou suspensões olagenosas. Como será apreciada pelos versados na técnica, a via e/ou rota de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Em uma modalidade preferida, o anticorpo administrado injeção intramuscular, subcutânea ou intradérmica. As comsposições terapêuticas tipicamente são estáveis sob condições de fabricação e estocagem.
A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, ou lipossoma. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do anticorpo anti-MAdCAM na quantidade requerida em um diluente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização (por exemplo, esterilização por filtração). Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. Tais suspensões podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida utilizando aqueles agentes dispersores umidade adequados e agentes de suspensão ou outros agentes aceitáveis. A preparação injetável podem também ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parentalmente aceitável, por exemplo como uma solução em 1,3-butadienol. Dentre os veículos aceitáveis e solventesque podem ser empregados está água, solução de Ringer, e solução de cloreto de sódio isotônica. Em adição, óleos estéreis ficados são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo suave fixado pode ser empregado, incluindo mono- ou di-glicerideos sintéticos. Em adição, ácidos graxos poliinsatu-rados n-3 podem encontrar uso na preparação de injetáveis.
Em caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferíveis de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó de ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado de uma solução previamente estéril por filtração da mesma. A propriedade de fluidez de.uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, por manutenção do tamanho da partícula requerida no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.
Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser causada por incluir na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearatos e gelatina ou por formular a composição em uma forma de absorção prolongada tal como, deposições, lipossomas, microsesferas poliméricas, géis poliméricos e implantes.
Outros métodos para administração de anticorpos descritos aqui incluem adesivos dermais que liberam os medicamentos diretamente na pele o paciente. Tais adesivos podem conter os anticorpos da presente invenção em uma solução liquida opcionalmente tamponada, dissolvida e/ou dispersa em um adesivo, ou dispersa em um polímero.Ainda outros métodos para administração de anticorpos descritos aqui incluem gotas liquidas oftalmológicas para os olhos.
0 anticorpo pode ser administrado uma vez, mas mais preferivelmente é administrado múltiplas vezes. Por e-xemplo, o anticorpo pode ser administrado de uma dose diária a uma a cada seis meses ou mais. A administração pode ser em um horário tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses.
O anticorpo pode também ser administrado continuamente através de um mini-bomba. 0 anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou pelo menos o período de tempo até a doença ser tratada, paliada ou curada. O anticorpo tipicamente pode ser administrado como parte de uma composição farmacêutica como descrito acima.
As composições da invenção podem ser incluir uma quantidade terapeuticamente efetiva ou uma quantidade profi-laticamente preferida de um anticorpo ou uma porção antige-no-ligante da invenção. Na preparação da composição, a quantidade terapeuticamente efetiva do anticorpo anti-MAdCAM presente na composição pode ser determinado, por exemplo, por levando em conta os volumes de doses desejados e modo(s) de administração, a natureza e severidade da condição a ser tratada, e a idade e tamanho do paciente.
Exemplos, não limitando variações de dose para ad-ministração das composições farmacêuticas da presente invenção a um paciente são de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 200 mg/kg (expressos em termos de miligramas (mg) de anticorpo anti-MAdCAM administrado por quilograma (kg) de peso do paciente), de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, de cerca de 5,0 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 mg/kg. Para propósitos da presente invenção, uma média de pesos de pacientes humanos é de cerca de 70 kg.
Variações intermediárias para qualquer das concentrações citadas aqui, por exemplo, cerca de 6-94 mg/kg, são também tencionadas a serem parte desta invenção. Por exemplo, variações de valores utilizando uma combinação de qualquer um dos valores recitados como superior e/ou inferior são tencionados para serem incluídos.
Regimes de dosagem possam também ser ajustados para prover a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática) por administração de várias doses divididas a um paciente ao longo do tempo ou adose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária para fácil administração e uniformidade de dosagem.
Forma de dosagem unitária aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens u-nitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada do compostoativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitária da invenção são ditadas por e diretamente dependente de (a) características únicas do anticorpo anti-MAdCAM ou porção e a terapêutica particular ou efeito profilático a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes a técnica do composto tal como um anticorpo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
As composições líquidas da presente invenção podem ser preparadas como formas de dosagem unitária. Por exemplo, uma forma de dosagem por frasco por conter de 1 a 1000 mili-litros (mL) de diferentes concentrações de um anticorpo anti-MAdCAM. Em outras modalidades, uma dose única por frasco por conter cerca de 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL ou 100 mL de diferentes concentrações do anticorpo anti-MAdCAM. Se necessário essas preparações podem ser ajustadas a uma concentração desejada por adição a um diluente estéril para cada frasco.
Avaliação da Estabilidade:
A presente invenção compreende composições farmacêuticas líquidas estáveis compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM como descrito aqui e um agente quelante farmaceutica-mente aceitável. Uma composição estável é desejável para manter ou resistir a mudanças em, por exemplo, a aparência e integridade do produto (incluindo degradação potencialmente fisica ou quimica levando a uma redução da atividade biológica) . Várias técnicas analíticas e indicadores para medir aestabilidade da proteina são reportados na literatura e um número dessas técnicas e indicadores são revisados em Pepti-de and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Ver. 10:29-30 (1993). Em geral, as composições farmacêuticas liquidas da presente invenção exibem estabilidade aumentada quando sujeitas as baixas temperaturas de es-tocagem por um periodo de tempo, e/ou quando sujeitos a um ou mais ciclos de congelamento/descongelamento.
Em uma modalidade, a composição quando estocada a uma temperatura de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C por pelo menos 12 meses, preferivelmente pelo menos cerca de 18 meses e mais preferivelmente pelo menos cerca de 24 meses, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocado sob as mesmas condições para o mesmo periodo.
Em outra modalidade, a composição quando estocada em uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 30 °C pelo menos cerca de 3 meses, preferivelmente pelo menos 6 meses, e mais pref erivelmente pelo menos 12 meses, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocado sob as mesmas condições para o mesmo tempo.
Em outra modalidade, a composição quando estocada em uma temperatura de cerca de 40 °C por pelo menos 1 mês, preferivelmente pelo menos cerca de 2 meses, e mais preferi-velmente pelo menos cerca de 3 meses é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelan-te que é estocado sob as mesmas condições para o mesmo tempo.
Como aqui utilizado, o termo "em ciclo congela/descongela" refere-se a técnicas para uso de uma amostra de anticorpo liquida após o estoque congelado, em que a temperatura da amostra é menor a uma temperatura de 0 °C ou menor a fim de congelar a amostra liquida, e então sujeitando a amostra a uma temperatura que restaurará seu estado liquido por um periodo suficiente de tempo para permitir o uso da amostra, seguida por e retorno para o estoque congelado, preferivelmente em uma temperatura de 0 °C ou menor. Como aqui utilizado, o termo "estocagem congelada" refere-se a congelar e manter uma amostra de anticorpo previamente liquida em uma temperatura de 0 °C ou abaixo, e preferivelmente -20°C ou menor.
Em uma modalidade, a composição quando sujeita a pelo menos 1 ciclo congela/descongela, preferivelmente pelo menos 2 ciclos congela/descongela, mais preferivelmente pelo menos 3 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 ciclos congela/descongela, ainda mais prefe-rivelmente pelo menos 5 ciclos congela/descongela, e ainda mais preferivelmente pelo menos 6 ciclos congela/descongela, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é sujeita às mesmas condições congela/descongela.
Em uma modalidade, a composição satisfaz duas ou mais das seguintes condições:
(a) a composição quando estocada em uma temperatu-ra de cerca de 2 °C a cerca de 8 °C por pelo menos 12 meses, preferivelmente pelo menos cerca de 18 meses e mais preferi-velmente pelo menos cerca de 24 meses, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocada sob as mesmas condições para o mesmos tempo;
(b) a composição quando estocada em uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 30 °C por pelo menos 3 meses, preferivelmente pelo menos cerca de 6 meses e mais preferivelmente pelo menos cerca de 12 meses, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocada sob as mesmas condições para o mesmos tempo;
(c) a composição quando estocada em uma temperatura de cerca de 40 °C por pelo menos 1 mês, pref erivelmente
pelo menos cerca de 2 meses e mais pref erivelmente pelo menos cerca de 3 meses, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é estocada sob as mesmas condições para o mesmo tempo;
(d) a composição quando sujeita a pelo menos 1 ciclo congela/descongela, preferivelmente pelo menos 2 ciclos congela/descongela, mais preferivelmente pelo menos 3 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 5 ciclos congela/descongela, e ainda mais preferivel-mente pelo menos 6 ciclos congela/descongela, é mais estável que uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é sujeita às mesmas condições conge-la/descongela.
Em outra modalidade, a composição satisfaz três ou mais das condições discutidas imediatamente acima.
Para propósitos do presente pedido, agregação de anticorpo, fragmentação do anticorpo, e/ou descoloração da composição, por exemplo, podem ser utilizados como indicadores de estabilidade da composição. Em geral, as composições farmacêuticas líquidas da presente invenção exibem um nivel menor de pelo menos um da agregação do anticorpo, fragmentação do anticorpo e descoloração da composição quando sujeito a um ou mais das condições de estocagem ou congela/descongela acima descritas relativas às composições de outra forma idênticas faltando o agente quelante que são sujeitas às mesmas condições.
A proteina de agregação em uma composição farmacêutica liquida pode ser medida por vários métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem cromatografia de fil-tração em gel para separar proteínas baseado em seus pesos moleculares. Um "gel" é uma matriz de água e um polímero, tais como agarose ou acrilamida polimerizada. A presente invenção também compreende o uso de HPLC (cromatografia liquida de alta performance)de gel filtração. Outros métodos reconhecidos de medir a agregação incluem cromatografia de mudança de cátion, que é a técnica de cromatografia liquida geral de cromatografia de troca iônica utilizando colunas de ânion. Os cátions trocados na presente invenção são de moléculas de proteina. Desde que os agregados de proteina multi-valentes podem ter alguns múltiplos da rede carregada do mo-nômero da proteína antígeno ligantes, os agregados podem ser retidos mais fortemente, e podem ser separados das moléculas de monômero. Um trocador cationico preferido é uma coluna de ácido poliaspártico. Então, uma proteína monomérica pode ser facilmente distinguida de um agregado. Entretanto, aqueles versados na técnica realizarão que os ensaios de agregados da invenção não são limitados a qualquer tipo particular de cromatografia em coluna, de modo que ela é capaz de separar as duas formas de moléculas de proteína.
A fragmentação da proteína em uma composição farmacêutica líquida pode ser medida por vários métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, croma-tografia por exclusão de tamanho, detecção ultravioleta (por exemplo, a 214 nanômetros), SDS-PAGE e/ou espectrometria de massa Ionização/Dessorção de Matriz Assistida por Laser/ tempo de vôo (MALDI/TOF MS). Fragmentação de proteína resultando em uma alteração de carga (por exemplo, ocorrendo como um resultado de desaminação) pode ser avaliada,, por exemplo, por cromatografia de troca iônica ou focalização isoelétrica(IEF).
A descoloração da composição geralmente pode ser medida por observação visual da própria composição. As presentes composições farmacêuticas líquidas compreendendo, um agente quelante geralmente reduzem a descoloração da composição (por exemplo, rosa ou amarelo) e/ou mantém a claridade de composição (por exemplo, turvação, escuridão e /ou formação de partículas) relativa a composições de outra forma idênticas que não contêm um agente quelante. Para propósitosda presente invenção, o termo "descoloração" refere-se a ambas as trocas na cor (por exemplo, de claro e sem cor para rosa ou amarelo) e mudanças na claridade (por exemplo, de claro e sem cor para turvo, escuro e/ou tendo particulados). A descoloração da composição geralmente pode ser medida utilizando técnicas adicionais tais como por deleção ultravioleta a 214 nanômetros, detecção em outros comprimentos de ondas tais como na variação visivel/perto da UV e/ou por comparação visual contra uma escala de cor padrão das composições com e sem o agente quelante. Ver PhEru 5.0, 2005 Mo-nograph 2.2.2.
Em uma modalidade, a agregação do anticorpo é determinada após a composição é sujeita a pelo menos uma das seguintes condições:
(a) a composição é estocada em uma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C por pelo menos 12 meses, pre-ferivelmente pelo menos cerca de 18 meses e mais preferivel-mente pelo menos cerca de 24 meses;
(b) a composição é estocada em uma temperatura de cerca de 25°C a cerca de 30°C por pelo menos cerca de 3 meses, preferivelmente pelo menos 6 meses, e mais preferi-velmente pelo menos cerca de 12 meses;
(c) a composição é estocada em uma temperatura de cerca de 40°C por pelo menos 1 mês, pref erivelmente pelo menos cerca de 18 meses, e mais pref erivelmente pelo menos cerca de 3 meses; ou
(d) a composição é sujeita a pelo menos 1 ciclo congela/descongela, preferivelmente pelo menos 2 ciclos con-gela/descongela, mais preferivelmente pelo menos 3 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 5 ciclos congela/descongela, e ainda mais preferivel-mente pelo menos 6 ciclos congela/descongela. Agregados de anticorpo são então separados cromatograficamente dos monô-meros (por exemplo, utilizando HPLC) e a extensão de agregação determinada do cromatograma resultante. As composições farmacêuticas líquidas estáveis da presente invenção tipicamente têm uma área de pico agregada em um cromatograma que é menor que cerca de 6%, menor que cerca de 5%, menor que cerca de 4%, menor que cerca de 3%, menor que cerca de 2%, ou menor que cerca de 1,5% da área do pico total no cromatograma. Em um exemplo especifico desta técnica para medida de agregação, a composição é estocada por 24 semanas a 40 °C e separação cromatografica é então conduzida utilizando SE-HPLC com detecção ultravioleta a 214 nanômetros.
Em geral, a diferença entre a área do pico do cromatograma agregado para uma composição farmacêutica liquida estável da presente invenção e a área do pico do cromatograma agregado para uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelante que é sujeito às mesmas condições é pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, ou pelo menos cerca de 4,5%.
Em outra modalidade, a fragmentação do anticorpo é determinada após a composição ser sujeita a pelo menos uma das seguintes condições:
(a) a composição é estocada em uma temperatura decerca de 2 °C a cerca de 8 °C por pelo menos 12 meses, pre-ferivelmente pelo menos cerca de 18 meses e mais preferivel-mente pelo menos cerca de 24 meses;
(b) a composição é estocada em uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de 30 °C por pelo menos cerca de 3meses, preferivelmente pelo menos 6 meses, e mais preferi-velmente pelo menos cerca de 12 meses;
(c) a composição é estocada em uma temperatura de cerca de 40 °C por pelo menos 1 mês, pref erivelmente pelomenos cerca de 2 meses, e mais pref erivelmente pelo menos cerca de 3 meses; ou
(d) a composição é sujeita a pelo menos 1 ciclo congela/descongela, preferivelmente pelo menos 2 ciclos congela/descongela, mais preferivelmente pelo menos 3 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 4 ciclos congela/descongela, ainda mais preferivelmente pelo menos 5 ciclos congela/descongela, e ainda mais preferivel-mente pelo menos 6 ciclos congela/descongela. Fragmentos de anticorpos são então separados eletroforeticamente da composição (por exemplo, SDS-PAGE) e a extensão de fragmentação determinada do eletroforograma resultante ou gel de imagens. As composições farmacêuticas liquidas estáveis da presente invenção tipicamente têm volume de fragmento de banda no gel SDS-PAGE que é menor que cerca de 9%, menor que cerca de 8%, menor que cerca de 7%, menor que cerca de 6%, menor que cerca de 5%, ou menor que cerca de 4,5% do volume total da banda no gel. Em um exemplo especifico desta técnica para medida de fragmentação, a composição é estocada por 24 semanas a40 °C e então analisada utilizando SDS-PAGE reduzida (rSDS-PAGE) com volumes de banda determinados por mapeamento com ou um Personal Densitometer PDQC-90 da Molecular Dynamics ou um Densitômetro de Imagem Bio- Rad GS800.
Em geral, a diferença entre o volume do fragmento da banda para a composição farmacêutica liquida estável da presente invenção e o volume do fragmento da banda por uma composição de outra forma idêntica faltando o agente quelan-te que é sujeito às mesmas condições é pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menor cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%.
Métodos de Prevenção/Tratamento:
Quaisquer dos tipos de anticorpos descritos aqui podem ser utilizados terapeuticamente. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é um a anticorpo humano. Em outra modalidade preferida, a MAdCAM é humana e o paciente é um paciente humano. Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é uma anticorpo IgG2. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero que expressa uma proteina MAdCAM que reage de forma cruzada com o anticorpo anti-MAdCAM. O anticorpo pode ser administrado a um mamífero não humano expressando MAdCAM com o qual o anticorpo reage cruzadamente (isto é, um primata) para propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos desta invenção.
A presente invenção prove um método para o tratamento de uma doença inflamatória em um paciente, compreen-dendo a administração a um paciente de uma composição farmacêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM; e um agente quelante sozinho ou em combinação com outros excipi-entes escolhidos de um tampão, um agente de tonicidade, ou um tensoativo, e misturas dos mesmo. Em modalidades adicionais, o paciente acima mencionado é um que está em necessidade de prevenção ou tratamento de uma doença inflamatória.
Em outra modalidade, a presente invenção prove um método para o tratamento de uma condição de doença inflamatória em um paciente, compreendendo a administração a um paciente a composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6; e excipiente farmaceuticamente a-ceitável compreendendo um agente quelante ou em combinação com outros excipientes escolhidos de um tampão, um agente de tonicidade, ou um tensoativo, e misturas dos mesmos.
Em várias modalidades desta invenção, a doença in-flamatória pode ser, mas não é limitada a doenças inflamató-rias do trato gastrointestinal incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, gastrite, doença dofigado, esclerose biliar primária, clorangite esclerosante, doenças inflamatórias também incluem mas não são limitadas a doença abdominal (incluindo peritonite, apendicite, doença do trato biliar), mielite. transversa aguda, dermatite alérgica (incluindo pele alérgica, eczema alérgico, pele atopy, eczema atópico, dermatite atópica, inflamação cutânea, eczema inflamatório, dermatite inflamatória, dermatite por picada de pulga, dermatite militar, eczema militar, pele ao áca-ro do pó de casa), espondilite anquilosante (sindrome deReiter), asma, inflamação das vias aéreas, ateroesclerose,arterioesclerose, atresia biliar, inflamação da bexiga, cân-cer de mama, inflamação cardiovascular (incluindo vasculite,infarto nailfold reumatóide, úlceras na perna, polimiosite,inflamação vascular crônica, pericardite, doença pulmonarobstrutiva crônica), pacreatite crônica, inflamação perineu-ral, colite (incluindo colite amébica, colite infectiva, co-ute bacteriana, colite de Crohn, colite isquêmica, coliteulcerativa, proctocolite idiopática, doença inflamatória dointestino, colite pseudo membranosa) , distúrbios do colágenovascular (artrite reumatóide, SLE, esclerose sistêmica pro-gressiva, doença do tecido conectivo, diabetes mellitus) ,doença de Crohn (enterite regional, ileite granulomatosa,ileocolite, inflamação do sistema digestivo) , doença desmie-linizante (incluindo mielite, esclerose múltipla, esclerosedisseminada, encefalomielite disseminada, desmielinação pe-rivenosa, deficiência de vitamina B12, sindrome Guillain-Barre, retrovirus associado a MS), dermatomiosite, diverti-culite, diarréias exsudativas, gastrite, hepatite granuloma-tosa, inflamação granulomatosa, colecistite, diabetes melli-tus insulino dependente, doenças hepato-inflamatórias (fi-brose hepática, cirrose biliar primária, hepatite, colangiteesclerosante), inflamação do pulmão (fibrose pulmonar idio-pática, granuloma eosinofilico do pulmão, histiocistose pul-monar X, inflamação peribronquiolar, bronquite aguda), lin-fogranuloma venéreo, melanoma maligno, doença boca/dente(incluindo gengivite, doença periodontal) , mucosite, sistemamucoesquelético (miosite), esteatohepatite não alcoólica(doença do figado gorduroso não alcoólica), inflamação ocu-lar & orbital (incluindo uveite, neurite óptica, ulceraçâoreumatóide periférica, inflamação córnea periférica), osteo-artrite, osteomielite, inflamação faringea, poliartrite,proctite, psoriase, injúria por radiação, sarcoidose, neuro-patia celular falciforme, tromboflevite superficial, sindro-me da resposta inflamatória sistêmica, tireoidite, lúpus e-ritematoso sistêmico, doença hospedeiro versus enxerto, in-juria de queimadura aguda, sindrome de Behcet, sindrome deSjogren.
Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo an-ti-MAdCAM é administrado a um paciente com colite.Artigos de Fabricação
Em outra modalidade da invenção, um artigo de fa-bricação é provido compreendendo um recipiente, que recebe acomposição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos umdos anticorpos monoclonais anti-MAdCAM da presente invençãoem uma composição compreendendo um agente quelante sozinhoou em combinação com outros excipientes farmaceuticamenteativos, e opcionalmente prove instruções para seu uso. Reci-pientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,bolsas e seringas. 0 recipiente pode ser formado de uma va-riedade de materiais tais como vidro ou plástico. Um recipi-ente exemplar é um frasco de vidro de uso único de 3-20 cm3.Alternativamente, para uma composição multidose, o recipien-te pode ser um frasco de vidro de 3-100 cm3. 0 recipientecontém a composição e o rótulo em, ou associado com o reci-piente pode ser formado de uma variedade de materiais taiscomo vidro ou plástico. Um exemplo de recipiente é um frascode vidro de uso único de 3-20 cm3. Alternativamente, parauma composição multidose, o recipiente pode ser um frasco devidro de 3-100 cm3. O recipiente mantém a composição, e orótulo no, ou associado com o recipiente pode indicar dire-ções para uso. O artigo de fabricação pode ainda incluir ou-tros materiais desejáveis de um comercial e pontos de vistasdo usuário, incluindo outros tampões, diluentes, enchimen-tos, agulhas, seringas, e inserção de pacotes com instruçõespara uso, contra-indicações, e/ou listas de efeitos colate-rais potenciais.
A presente invenção também prove um equipamentopara preparação de uma composição liquida de um anticorpoestabilizado compreendendo um primeiro recipiente, compreen-dendo um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6 em solução,e um segundo recipiente compreendendo uma quantidade sufici-ente de um agente quelante sozinho ou em combinação com ou-tros excipientes em solução para estabilizar o anticorpo.
Os seguintes exemplos descrevem modalidades da in-venção. Outras modalidades dentro do objetivo das reivindi-cado aqui será aparente para um versado na técnica da consi-deração da especificação ou prático da invenção como revela-do aqui. É tencionado que a especificação, junto com os e-xemplos, seja considerada somente exemplar, com o objetivo eespirito da invenção sendo indicado pelas reivindicações,que seguem os exemplos. Nos exemplos, todas as porcentagenssão dadas em uma base de peso a menos que de outra forma in-dicada. O versado na técnica apreciará que as quantidades depeso e/ou proporções peso para volume recitadas nos exemplospodem ser convertidas para mols e/ou molaridades utilizandoos pesos moleculares reconhecidos na técnica dos ingredien-tes recitados. Quantidades de peso aqui exemplificadas (porexemplo, gramas) são para os volumes (por exemplo, de solu-ções tampão, composição de anticorpo etc) recitados. 0 ver-sado na técnica apreciará que as quantidades de peso podemser proporcionalmente ajustadas quando a volumes da composi-ção diferentes são desejados.
Exemplo 1
Geração de anti-MAdCAM produzindo hibridomasAnticorpos da invenção foram preparados de acordocom o presente Exemplo. Referência a PCT/US2005/000370.
Preparação do Imunógeno Primário
Dois imunógenos foram preparados para imunizaçãode camundongos XenoMouse®: (i) uma proteina de fusão MAdCAM-IgGi Fc e (ii) membranas celulares preparadas de células es-tavelmente transfectadas com MAdCAM.
(i)Proteina de Fusão MAd-CAM-IgGi Fc
Construção do vetor de expressão:
Um fragmento de cDNA EcoRI/BglII codificando o do-minio tipo imunoglobulina extracelular maduro de MAdCAM foicortado de um clone Incyte pINCY (3279276) e clonado nos lu-gares EcoRI /ManHI do vetor pIGl (Simmons, D. L. (1993) emDevelopment: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Ox-ford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127)) para gerar em umaconstrução a fusão IgGi Fc. 0 inserto resultante foi retira-do com EcoRI/NorI e clonado em pCDNA3.1+ (Invitrogen). 0MAdCAM-Igd Fc cDNA no vetor teve a seqüência confirmada. Aseqüência aminoácida da proteina de fusão MAdCAM-IgGi Fc émostrada abaixo:
Proteina de Dusão MAdCAM-IgGi FcMDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQLTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDOLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMiSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYRSD. IAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5)
Sublinhado: peptideo sinal
Negrito: domínio extracelular da MAdCAM
Expressão/Purificação da Proteina Recombinante:
Células CHO-DHFR foram transfectadas com pCD-NA3.1+vetor contendo cDNA da proteina de fusão MAdCAM-IgGiFc e clones estáveis expressando uma proteina de fusão MAd-CAM-IgGi Fc selecionada no meio de Iscove contendo 600 ^g/mLde G418 e 100 ng/mL de metotrexato. Para a expressão protéi-ca, um bioreator de fibra vazio foi plaqueado com célulasCHO expressando estavelmente MAdCAM-IgGl Fc em meio Iscovecontendo 10% de soro bovino fetal IgG baixa (Gibco), aminoá-cidos não essenciais (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piru-vato de sódio (Gibco), 100 ug/mL de G418 e 100 ng/mL de me-totrexato, e utilizado para gerar meio sobrenadante concen-trado. A proteina de fusão MAdCAM-IgGl Fc foi purificada dosobrenadante coletado por cromatografia de afinidade. Breve-mente, o sobrenadante foi aplicado a uma coluna de SefaroseProteina G HiTrap (5 mL, Pharmacia) (2 mL/min), lavada com25 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl (5 volumes da coluna) eeluido com 100 mM de glicina pH 2,5 (1 mL/min), imediatamen-te neutralizando frações para pH 7,5 com 1M de Tris pH 8.Frações contendo proteina de fusão MAdCAM-IgGi Fc foram i-dentificadas por SDS-PAGE, colocadas junto e aplicadas a umacoluna Sephacryl S100 (Pharmacia), pré-equilibrada com 35 mMde Bis Tris pH 6,5, 150 mM de NaCl. O filtração gel foi fei-ta a 0,35 mL/min, coletando um pico de proteina de fusãoMAdCAM-IgGl Fc em cerca de 3x5 mL frações. Essas amostrasforam juntadas e aplicadas a uma coluna Resource Q (6 mL,Pharmacia), pré-equilibrada em 35 mM de Bis Tris pH 6,5. Acoluna foi lavada com 5 volumes da coluna de 35 mM de BisTris pH 6,5 NaCl (6 mL/min) e a proteina de fusão MAdCAM-IgGi Fc eluida em uma fração de 4-6 mL com 35 mM de Bis TrispH 6,5, 400 mM de NaCl. Neste estágio a proteina estava 90%pura e migrando como uma banda única em aproximadamente 68kD por SDS-PAGE. Para uso como um imunógeno e todos os en-saios subseqüentes, o material foi tamponado em 25 mM de HE-PES pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 100 mM de NaCl, 50%de glicerol e estocado como alíquotas a -80°C.
(ii) Membranas celulares estavelmente expressandoMadCAM
Um fragmento Sacl/Notl compreendendo nucleotideos645-1222 da seqüência MAdCM publicada (Shyjan AM, e colabo-radores, J. Immunol., 156, 2851-7 (1996)) foi amplificadapor PCR de uma biblioteca de cDNA de dois pontos e clonadaem sitios Sacl/Notl do vetor pIND-Hygro (Invitrogen). Umfragmento Saci, compreendendo a seqüência codificante5 adicional foi sub-clonada dentro desta construção pCDNA3.1MAdCAM-IgGi Fc, para gerar o cDNA MAdCAM de comprimento com-pleto. Um fragmento Kpnl/Notl contendo o MAdCAM cDNA foi en-tão clonado em sitios correspondentes em um vetorpEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen) e substituindo a seqüência codi-ficante CAT. 0 inserto cDNA teve a seqüência verificada u-tilizada em transfecções para gerar clones únicos estavel-mente expressos em células Flpin NIH 3T3 (Invitrogen) portecnologia Flp recombinase, de acordo com as instruções dofabricante. Clones estavelmente expressos foram selecionadospor suas habilidades em dar superte a ligação da linhagem decélla linfoblastóide B humana a4p7+ JY (Chain BM, e colabora-dores, J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)), destacada abai-xo. Clones estáveis de células CHO expressando MAdCAM forampreparados da mesma maneira, uilizando células CHO Flpin(Invitrogen).
Células Flpin NIH-3T3 expressando MAdCAM foramcrescidas em Meio Eagles modificado da Dulbecco (Gibco),contendo 2 mM de L-glutamina, 10 % de soro fetal bovino doa-dor (Gibco) e 200 ^g/mL de Higromicina B (Invitrogen) e ex-pandido em garrafas cilíndricas. Células CHO Flpin e expres-sando MAdCAM foram crescidas em Meio Eagles modificado daDulbecco/ Ham F12 (Gibco), contendo 2 mM de L-glutamina, 10%de soro fetal bovino doador (Gibco) e 350 (_ig/mL de Higromi-cina B (Invitrogen) e expandido em garrafas cilíndricas. Cé-lulas foram coletadas por uso de uma solução de dissociaçãonão enzimática de célula (Sigma) e separando, lavando em so-lução salina tamponada com fosfato por centrifugação. Mem-branas celulares foram preparadas do concentrado celular porduas etapas de homogeneização politron em 25 mM de Bis TrispH 8, 10 mM de MgCl2, 0,015% (p/v) de apretinina, 100 U/mLde bacitracina e centrifugação. O concentrado final foi res-suspendido no mesmo tampão, e 50x106 equivalentes a célulasaliquotados em epperdorfs de parede fina e rodado a>100.000g para gerar concentrados de membrana celular paraimunoensaios com camundongos XenoMouse. O sobrenandante foidecantado e as membranas foram estocadas em eppendorfs a -80°C até serem requeridas. A confirmação da expressão daproteína nas membranas celulares foi determinada por SDS-PAGE e Western blotting com um anticorpo anti-peptideo decoelho construído contra os resíduos N-terminal de MAdCAM([C]-KPLQVEPPEP).
Imunização e geração de hibridoma:
Camundongos XENOMOUSE® de oito a dez semanas deidade foram imunizados intraperitonealmente ou em suas patastraseiras com ou a proteína de fusão MAdCAM-IgGi recombinan-te purificada (10 |ag/dose/camundongo) , ou membranas celula-res preparadas de ou células CHO expressando estavelmenteMAdCAM ou células NIH 3T3 (lOxlO6 células/dose/camundongo).Esta dose foi preparada cindo para sete vezes ao longo de umperíodo de três a oito semanas. Quatro dias antes da fusão,o camundongo recebeu uma injeção final do dominio extracelu-lar da MAdCAM humana em PBS. Linfócitos do baço e linfonodode camundongos imunizados foram fundidos com a linhagem decélula P3-X63-Ag8.653 de mieloma não secretório e foram su-jeitas a seleção HAT como previamente descrito (Galfre eMilstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Um painel de hi-bridomas secretando IgG2k humana especifica para MAdCAM foirecuperado e sub-clonado.
0 hibridoma seguinte produzindo anticorpos anti-MAdCAM designado como segue foi depositado na Coleção Euro-péia de Cultura de Células (ECACC), H.P.A. em CAMR, PortonDown, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG em 9 de Setembro de 2003;Hibridoma 7.16.6, Depósito No. 03090909.
Exemplo 2
Composições de Anticorpo
As seguintes composições são referidas nos Exemplos que seguem:
Tabela 2
<table>table see original document page 99</column></row><table><table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>
Exemplo 3
Um estudo foi conduzido para avaliar o efeito devários tampões diferentes na agregação do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6.
Preparação de soluções tampão:
As soluções tampões foram preparadas por primeirodissolvendo uma quantidade de espécies de tampão em água (a-proximadamente 90% do alvo) . O pH de cada solução tampão foientão ajustado para 5,5 por adição de uma quantidade sufici-ente de uma solução ácida ou básica. Após ajuste do pH, umaquantidade adicional de água foi adicionada para prover umaconcentração de tampão de 20 mM. A concentração de tampão de20 mM foi selecionada para assegurar razoável estabilidadede pH no pH selecionado de 5,5. A solução tampão foi entãofiltrada através de um filtro de esterilização (tamanho doporo de 0,22 mícron) em um receptáculo esterilizado para usosubseqüente.
Preparação das composições de Anticorpo:As composições de anticorpo foram preparadas comosegue. Um volume de solução de anticorpo foi obtido como10,5 mg/mL em 20 mM de tampão de acetato de sódio oH 5,5 +140 mM de cloreto de sódio. Mudanças do tampão deste volumede solução nas soluções da composição foram realizadas porcentrifugação a 4500x g utilizando um corte de peso molecu-lar de membrana (por exemplo, 30 kD). Aproximadamente 8 tro-cas de volume foram feitas e a solução de anticorpo finalfoi preparada em cerca de 10 mg/mL de concentração. Concen-trações de anticorpo foram determinadas por método de espec-trometria Visivel em Ultravioleta utilizando um coeficientede extinção de 1,56 (mg/mL)-1 cm"1 a 280 nm. As composiçõescom todos os ingredientes foram então esterilizadas por fil-tração através de filtro de membrana de 0,22 micron estéril.As composições filtradas foram então enchidas em frascos la-vados e autoclavados, que foram fechados com tampas revesti-das com Daikyo777-l Flurotec®, seladas com dobra e colocadasem câmaras estabilizadas.
Especificamente, três composições liquidas compre-endendo anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 e tamponadas com aceta-to, EDTA, ou uma combinação de acetato, citrato e fosfatoforam preparados. As composições foram então estocadas por 6semanas a 40 °C e medidas da agregação foram tomadas.
Tabela 3
<table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table>
*Aumento relativo na % de agregação é calculadapor:
[{(% agregação em 6 semanas/40C) - (% de agregaçãono inicio)}*100]/[% de agregação no inicio]
Análise da Agregação:
As composições de anticorpos foram estocadas a 40°C. Nas seis semanas, cada composição foi analisada para a-gregação utilizando cromatografia de exclusão por tamanho(CET). A cromatografia por exclusão por tamanho foi realiza-da utilizando uma coluna gel G3000SWXL-G2000SWXL TSK, 0,2 Mde fosfato de sódio, fase móvel pH 7, uma taxa de vôo de 0,7mL/min, e detecção UV a 214 nm. Niveis de agregação foramcalculados por integração das áreas sob os picos de cromato-grama para cada composição e reportando as áreas integradassob os picos de espécies de peso moleculares mais altos comouma porcentagem da área do pico total. Como é mostrada naTabela 3, a composição tamponada com ESTA mostrou o menornivel de agregação e menor aumento relativo na agregação.
Exemplo 4
Um estudo foi conduzido para avaliar o efeito daconcentração tampão e presença/ausência de outros excipien-tes da fragmentação do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6.
As composições mostradas na Tabela 4 foram prepa-<table>table see original document page 109</column></row><table>Como mostrado na Tabela 4, a presença de EDTA nascomposições líquidas resultam em menor formação de LMM quenas composições contendo nenhum EDTA.
Exemplo 5
Um estudo foi conduzido para acessar o efeito doEDTA, nas composições liquidas de anticorpo anti-MAdCAM, naagregação e fragmentação.
As soluções tampão foram preparadas por métodosdescritos no Exemplo 3. As composições de anticorpo forampreparadas como segue. Um volume de solução de anticorpo foiobtido como 9,6 mg/mL em 20 mM de tampão de acetato de sódiopH 5,5. Trocas de tampão deste volume de solução nas solu-ções de composição foram realizadas por centrifugação a5000x g utilizando uma membrana de corte de peso molecular(por exemplo, 30 kD) . Aproximadamente 8 volumes de trocasforam feitos e a solução de anticorpo final foi preparada emcerca de 8 mg/mL ou cerca de 30 mg/mL de concentração deproteína. Concentrações de anticorpos foram determinadas pe-lo método de espectrometria visível em ultravioleta (UV-Vis)utilizando um coeficiente de extinção de 1,56 (mg/mL)"1 cm"1a 280 nm. Uma solução concentrada de polisorbato 80 (PS80)(tipicamente 20 mg/mL) foi preparada por diluição e dissolu-ção de PS80 pelo tampão apropriado. O concentrado PS80 foientão adicionado às soluções de anticorpo para obter as com-posições finais descritas. As composições com todos os in-gredientes foram então esterilizadas por filtração atravésde filtro de membrana de 0,22 mícron estéril. As composiçõesfiltradas foram então enchidas em frascos lavados e autocla-vados. Os frascos foram fechados com tampas revestidas comDalkyo 777-1 Flurotec®, seladas dobradas, e colocadas em câ-maras estabilizadas.
As composições na Tabela 5 foram estocadas a 40 °Cpor 28 semanas, e avaliadas por método CET descritas o Exem-plo 3.
Tabela 5
<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>15 30±6 acetato Manitol 0,4 Na2EDTA. 0,7
de só- 4 5 mg/mL 2H20,
dio, 20 0, 02
mM, pH mg/mL
5,5 <table>table see original document page 113</column></row><table>
Este exemplo mostra que a presença de EDTA nascomposições liquida resulta em menor agregação e menor for-mação de espécies LMM.
Exemplo 6
Um estudo foi conduzido para comparar o efeito dostampões de acetato e histidina na agregação e fragmentaçãodo anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6. As composições mostradasnas Tabelas 7 e 8 foram preparadas por métodos descritos noExemplo 5. As composições na Tabela 7 foram estocadas a 40°C por 26 semanas e analisadas por métodos CET descritos no
Exemplo 3.
Tabela 7
<table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table>
Este exemplo mostra que as composições utilizandocomo tampão tiveram menor formação de agregado queas composições utilizando acetato no mesmo pH.
Exemplo 7
Um estudo foi conduzido para avaliar a propesão deagragação do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 em composições emvárias concentrações do anticorpo. Neste estudo as composi-ções na Tabela 9 foram preparadas por métodos descritos noExemplo 5. As composições na Tabela 9 foram estocadas a 5°C,25 °C ou 40 °C por 26 semanas e então analisadas por métodosCET descritos no Exemplo 3.
Tabela 9
<table>table see original document page 116</column></row><table>
Como mostrado na Tabela 9, a propensão para agre-gação aumenta com as concentrações aumentando as concentra-ções de anticorpo. Entretanto, após estocagem por 26 sema-nas, o efeito estabilizante das composições mostradas na Ta-bela 9 é demonstrado por dados de condição acelerada (esto-cagem a 25 °C e 40 °C) que mostra relativamente baixos ni-veis de agregação com composições de alta concentração.
Exemplo 8
Um estudo foi conduzido para avaliar a propensãode agregação do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 mas composiçõescom vários niveis de EDTA. As composições foram preparadascomo descrito acima no exemplo 5, exceto que a concentraçãofinal do anticorpo foi ajustada para 80+10 mg/mL. As compo-sições na Tabela 10 foram estocadas por 26 semanas a 5 °C ou26 °C e então analisadas por CET como descrito acima.
Tabela 10
<table>table see original document page 117</column></row><table>
Como mostrado, existe um aumento de 0,05 mg/mL e0,10 mg/mL relative a 0,02 mg/mL de EDTA, e em cada caso, aagregação em presença de EDTA é menor após estocagem a 5 °Cpor 26 semanas.
Exemplo 9
Um estudo foi conduzido para avaliar a estabilida-de de composições do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 com váriosniveis de Polisorbato 80. As composições foram preparadascomo descritas acima, mas com a concentração final de anti-corpo aj ustada para 8 0±mg/mL. As composições na Tabela 11foram estocadas por 26 semanas a 25 °C ou 40 °C e então ana-lisadas por CET como descrito acima.
Tabela 11
<table>table see original document page 118</column></row><table>
As composições na Tabela 12 foram sujeitas a es-tresse por agitação aplicado por agitação orbital em 300 rpmpor 24 horas em temperatura ambiente. As composições forampreparadas como descritas acima, mas com concentração finalde anticorpo aj ustada para 85±mg/mL.
Tabela 12
<table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table>
Embora o estudo de estabilidade de estocagem acimadescrito mostra um leve aumento nos niveis de agregação so-lúvel com niveis aumentados de polisorbato 80, o estudo deestresse de agitação indica que um nivel de polisorbato 80de 0,4 mg/mL prove proteção adequada de estresse de agitação.
Exemplo 10
Em estudo foi feito para avaliar a propensão deagregação do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6 em composições comvários tampões. As composições foram preparadas como descri-tas acima, e ajustadas a uma concentração final de anticorpode 80±10 mg/mL. As composições na Tabela 13 foram estocadasa 25 °C ou 40 °C por 26 semanas.
Tabela 13
<table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table> O nivel de agregação foi menor na composição comtampão histidina.
Exemplo 11
Um estudo foi feito para avaliar a propensão deagregação das composições do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6nas composições com vários açúcares e polióis. As composi-ções foram preparadas como descrito acima, e ajustadas a umaconcentração final de anticorpo de 80±10 mg/mL. As composi-ções na Tabela 14 foram estocadas a 40 °C por 26 semanas.
Tabela 14
<table>table see original document page 120</column></row><table>
O nivel de agregação foi menor com a composiçãocontendo trealose.Exemplo 12
Um estudo foi feito para avaliar a propensão deagregação das composições do anticorpo anti-MAdCAM 7.16.6nas composições com vários tensoativos e PEG. As composiçõesforam preparadas como descrito acima, e ajustadas a uma con-centração final de anticorpo de 80±10 mg/mL. A concentraçãofinal de uma quantidade apropriada de soluções estoques con-centradas de tensoativo ou PEG. As composições na Tabela 15foram estocadas a 40 °C por 26 semanas.
Tabela 15
<table>table see original document page 121</column></row><table>
Composições contendo PS80 e Poloxâmero 407 apre-sentaram marginalmente melhor que os tensoativos e anfifíli-cos .
Exemplo 13
Um estudo foi feito para avaliar a oxidação Met256nas composições com ou trealose ou sacarose. As composiçõesforam preparadas como descrito acima, e ajustadas a uma con-centração final de anticorpo de 80±10 mg/mL. As composiçõesna Tabela 16 foram estocadas a 5 °C ou 40 °C por 26 semanas.Oxidação de metionina foi medida por digestão enzimática daproteína utilizando a endoproteinase Lisil e os fragmentosde peptídeo resultantes foram separados por HPLC de fase re-versa com 214 nm de detecção de absorbância. O fragmentopeptídeo contendo metionina ou sua forma oxidada foi monito-rado. A porcentagem de oxidação foi calculada pela área dopico de metionina oxidada relativa àquela de metionina pa-rente .
Tabela 16
<table>table see original document page 122</column></row><table>As composições contendo trealose mostram menorpropensão para oxidação relativa de metionina àquelas decontendo sacarose.
Exemplo 14
Um estudo foi feito para avaliar o desempenho deestabilidade quimica de composições de concentração de altaconcentração de anticorpo. As composições nas Tabelas 17 e18 foram preparadas como descrito acima, e ajustadas a umaconcentração de anticorpo final de 80±10 mg/mL. As composi-ções na Tabela 17 foram estocadas a 5 °C por 26 semanas. Aestabilidade quimica foi verificada por iCE. Medidas feitasconduzidas por preparação da mistura de proteina com marca-dores pl, metilcelulose, e farmalitos para uma concentraçãofinal de proteina de aproximadamente 0,22 ug/mL. A corridade eletroforese foi feita com foco de tempo de 6 minutos a3000 volts e padrão de absorbância de 280 nm. Porcentagemrelativa de várias espécies carregadas foi determinada porsua respectiva área sob o pico.
Tabela 17
<table>table see original document page 123</column></row><table>As composições na Tabela 17 mostram boa estabili-dade quimica, como nenhuma mudança significante nas princi-pais espécies bem como nas espécies totais acidicas ou espé-cies básicas totais.
As composições na Tabela 18 foram estocadas a 5 °Cpor 26 semanas, e ensaiadas por SDS-PAGE reduzida para de-terminar a pureza. Os géis de SDS-PAGE foram corridos utili-zando NuPAGE 4-12% gel Bis-Tris, e corante azul coloidal (a-zul Coomassie). Para os géis reduzidos, a redução foi alcan-çada por agente de redução Nu-PAGE. A porcentagem de purezanos géis reduzidos foi estimada densitometricamente por: %pureza = (% de cadeia pesada + % de cadeia leve).
Tabela 18
<table>table see original document page 124</column></row><table>
As composições ma Tabela 18 mostram nenhuma mudan-ça significativa na pureza após a estocagem por 26 semanas a5 °C, indicando boa estabilidade quimica.
Exemplo 15
Um estudo foi feito para avaliar o desempenho decomposições de alta concentração contra o estresse congela-descongela.
As composições na Tabela 19 foram preparadas comodescritas acima, e ajustadas para uma concentração final deanticorpo de 50±10 mg/mL. As composições na Tabela 19 foramsujeitas a três ciclos congela-descongela a -70°C/5°C ou -20°C/5°C. Os estudos foram conduzidos em frascos de vidro de2 mL com 1 mL de enchimento. Medidas SE_HPLC foram conduzi-das utilizando 0,2 M de fosfato de sódio, pH 7 na fase mó-vel, coluna TSK gel G3000SWXL, e uma taxa de vôo de 0,7mA/min, padrão a 214 nm. Quantidade agregada foi determinadapela soma dos picos relacionados ao anticorpo que eluiramantes do monômero do anticorpo.
Tabela 19
<table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table>
As composições na Tabela 19 não mostraram aumentona agregação após 3 ciclos congela-descongela em ou70°C/5°C ou -20°C/5°C.
As composições na Tabela 2 0 foram preparadas comodescritas acima, ajustadas a uma concentração final de anti-corpo de 7 5±15 mg/mL. As composições na Tabela 2 0 foram su-jeitas a quatro ciclos congela-descongela a -2 0°C/5°C. Essesestudos congela-descongela foram conduzidos em frascos devidro de 10 mL com 10 mL de enchimento. Medidas CET foramconduzidas como indicado acima neste exemplo.
Tabela 20
<table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table>agregação após quatro ciclos congela-descongela a -20°C/5°C.
Exemplo 16
Um estudo foi feito para acessar a estabilidade deuma composição de alta concentração durante a estocagem con-gelada. A composição na Tabela 21 foi preparada como descri-ta acima, e a concentração final do anticorpo foi ajustada acerca de 75 mg/mL. A composição na Tabela 21 foi estocada a-20°C por 13 semanas, e a agregação acessada como descritono Exemplo 15.
Tabela 21
<table>table see original document page 128</column></row><table>
A composição de alta concentração (75 mg/mL de an-ticorpo) não mostra aumento na agregação após 13 semanas deestocagem a -20°C.
Exemplo 17
Um estudo foi conduzido para acessar a viscosidadede uma composição de alta concentração. A composição na Ta-bela 22 foi preparada como descrita acima, e a concentraçãofinal do anticorpo foi ajustada a cerca de 75 mg/mL. A s me-didas de viscosidade foram conduzidas por aplicação de umataxa de corte média de 300s-1 para a composição colocada emuma placa de reômetro.<table>table see original document page 129</column></row><table>SEQÜÊNCIAS
Seqüência sinal: sublinhadaSEQ ID NO.l
Seqüência Nucleotidica da Cadeia Pesada 7.16.61 atggactgqa cctggagcat ccttttcttq gtggcaqcaq caacagatgc51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCAGACC1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCAACAGC AAGCTCACCG1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC1401 GGGTAAATGA
SEQ ID NO.2
Seqüência Protéica da Cadeia Pesada 7.16.6 Predita1 mdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS51 YGINWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO. 3
Seqüência Nucleotidica da Cadeia Leve Kappa 7.16.6
1 atclaggctcc ctgctcagct cctgggqctq ctaatgctct ggatacctgq51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGASEQ ID NO.4
Seqüência Protéica da Cadeia Leve Kappa 7.16.6
1 mrlpagllgl Imlwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO:5
Proteina de Fusão MAdCAM-IgGi FcMDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQLTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Pharmacia and Upjohn Company, LLCDas, Tapan
Nema, Sandeep Singh, Satish Ganser, Scott Allen, CoreyZeng, David
<120> "Composições de Anticorpo An ti-MAdCAM"
<130> PC 33248
<150> 60/659,766
<151> 2005-03-08
<150> 60/728,165
<151> 2005-10-19
<150> 60/752,712
<151> 2005-12-20
<150> 60/762,456
<151> 2005-01-26
<160> 5
<170> Versão de Patente In 3.3
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcccag 60gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctc4gt gaaggtctcc 120tgcaaggctt ctggttacac ctttaccagc tatggtatca actgggtgcg acaggcccct 180ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc agcgtttaca gtggtaacac aaactatgca 240cagaaggtcc agggcagagt caccatgacc gcagacacat ccacgagcac agcctacatg 300gacctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagggtagc 360agctcgtccg gagactacta ttacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480
acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540
acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 600
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 660
acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 720
gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 780-
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 960
acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagc9t gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410
<210> 2<211> 469<212> PRT
<213> Homo sapíens<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Ser lie Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr Gly
15 10 15
Ala His Ser Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45
Thr Ser Tyr Gly lie Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp lie Ser Vai Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala65 70 75 80
Gin Lys Vai Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser vai vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr225 230 235 240
Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr260 265 270
Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai vai vai Asp vai
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai
290 295 300
Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser305 310 315 320
Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala
340 345 350
Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370 375 380
vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala385 390 395 400
Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys465
<210> 3<211> 723
<212> DNA
<213> Homo sapiéns
<400> 3
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg atccagtgca 60gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 120atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catactgatg gaacgaccta tttgtattgg 180tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 240tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 300agccgggtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaaaatat acagcttccg 360tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720tga 723
<210> 4<211> 239<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp lie Pro
15 10 15
Gly Ser Ser Ala Asp lie Vai Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser
20 25 30
Vai Thr Pro Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser35 40 45Leu Leu His Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys
50 55 60
Pro Gly Gin Pro Pro Gln Leu Leu lie Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe65 70 75 80
Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly lie Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Asn lie Gln Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235
<210> 5
<211> 543
<212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 5
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gin Ser Leu Gin Vai Lys Pro Leu Gin Vai Glu Pro Pro Glu
20 25 30
Pro Vai Vai Ala Vai Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gin Leu Thr Cys Arg
35 40 45
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Vai Gin Trp Arg Gly Leu Asp
50 55 60
Thr ser Leu Gly Ala Vai Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Vai Leu Thr65 70 75 80
Vai Arg Asn Ala ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg vai cys Vai Gly
85 90 95
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln His Thr Vai Gln Leu Leu Vai Tyr
100 105 110
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Vai ser Pro Ala Ala Leu Vai Pro Gly
115 120 125
Asp Pro Glu Vai Ala Cys Thr Ala His Lys Vai Thr Pro Vai Asp Pro
130 135 140
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Vai Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly145 150 155 160
Ala Gin Ala Leu Gly Pro Glu Vai Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln
165 170 175
Gly Asp Glu Asp Vai Leu Phe Arg Vai Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro
180 185 190
Pro Leu Gly Thr Pro Vai Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gin Ala lie Pro Vai Leu210 215 220
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser225 230 235 240
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro
245 250 255
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro
260 265 270
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro
275 280 285
Ala Pro Gin Gln Gly Ser Thr His Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Arg Thr Arg Arg Pro Glu lie Gln Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His305 310 315 320
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai
325 330 335
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
340 345 350
Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu
355 360 365
Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys
370 375 380
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser385 390 395 400
Vai Leu Thr vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
405 410 415
Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie
420 425 430
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu Pro435 440Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys450 455
Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp465 470
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys485
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser500
Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser515 520
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser530 535 445
Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu460
lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn475 480
Ala Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser490 495
Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg505 510
Cys ser vai Met His Glu Ala Leu525
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys540

Claims (24)

1. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de compre-ender :pelo menos um agente que1ante; epelo menos um anticorpo compreendendo:uma seqüência aminoácida que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeia pesada mostradana SEQ ID NO:2; euma seqüência aminoácida que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência aminoácida de cadeia leve mostradana SEQ ID NO:4;em que o anticorpo se liga a MAdCAM humana.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é uma composiçãoliquida e o anticorpo é um anticorpo IgG2 humano e o anti-corpo não compreende uma seqüência sinal.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo compreende umaseqüência aminoácida de cadeia pesada com pelo menos 99% deidentidade de seqüência a SEQ ID NO:2 e uma seqüência amino-ácida de cadeia leve com pelo menos 9 9% de identidade a SEQID NO:4.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpo compreende umaseqüência aminoácida de cadeia pesada compreendendo SEQ IDNO: 2 e uma seqüência aminoácida de cadeia leve compreendendoSEQ ID NO:4.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelomenos um agente que1ante que é EDTA.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição ainda compreendeum tampão.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelemenos um agente quelante que é EDTA, e ainda compreende umahistidina.
8 . Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição ainda compreendeum tampão e um tensoativo,
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição ainda compreendeum tampão, um tensoativo, e um agente de tonicidade.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelomenos um agente , quelante que é EDTA, e ainda compreende umtampão, um tensoativo, e um agente de tonicidade.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelomenos um agente quelante que é EDTA, e ainda compreende umahistidina, um tensoativo, e um agente de tonicidade.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelomenos um agente quelante que é EDTA, e ainda compreende umahistidina, polisorbato 80, e um agente de tonicidade.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende pelomenos um agente quelante que é EDTA, e ainda compreende his-tidina, polisorbato 80, e trealose.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimo-lar de um agente quelante; ede cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimo-lar de EDTA; ede cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimo-lar de um agente quelante;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de um tampão;de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimo-lar de um tensoativo; ede cerca de 100 milimolar a cerca de 400 milimolarde um agente de tonicidade.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimo-lar de EDTA;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina;de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimo-lar de polisorbato 80; ede cerca de 100 milimolar a cerca de 400 milimolarde um agente de tonicidade.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL de anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimo-lar de EDTA;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina;de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimo-lar de polisorbato 80; ede cerca de 100 milimolar a cerca de 400 milimolarde trealose.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende:de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de an-ticorpo;de cerca de 0,001 milimolar a cerca de 1,0 milimo-lar de EDTA;de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de histidina ;de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de po-lisorbato 80; ede cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL de trealose.
20. Composição estável, CARACTERIZADA pelo fato decompreender pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM monoclonal eum agente quelante, em que a composição compreende uma quan-tidade do agente quelante suficiente para estabilizar a com-posição quando mantida em uma temperatura de cerca de 40 °Cpor um período de pelo menos cerca de 26 semanas.
21. Composição farmacêutica liquida, CARACTERIZADApelo fato de compreender pelo menos um anticorpo anti-MAdCAMmonoclonal e um agente quelante farmaceuticamente aceitável,em que a concentração molar do anticorpo varia de cerca de0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentraçãomolar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar acerca de 50 milimolar, e em que a proporção molar do anti-corpo para o agente quelante varia de cerca de 0,00001 acerca de 450.
22. Composição farmacêutica liquida, CARACTERIZADApelo fato de compreender:pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüên-cia aminoácida que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüênciaaminoácida pesada mostrada na SEQ ID NO:2, e ainda compreen-dendo uma seqüência aminoácida que é pelo menos 95% idênticaa uma seqüência aminoácida de cadeia leve mostrada na SEQ IDNO:4, em que o anticorpo se liga à MAdCAM humana;e um excipiente farmaceuticamente aceitável, emque a composição contém uma concentração de anticorpo que épelo menos cerca de 50 mg/mL.
23. Processo para preparação de uma composiçãofarmacêutica liquida, CARACTERIZADA pelo fato de compreendera mistura de pelo menos um anticorpo anti-MAdCAM tendo umaseqüência aminoácida de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2 e umaseqüência aminoácida de cadeia leve de SEQ ID NO:4, em solu-ção, com pelo menos um agente quelante.
24. Método para o tratamento de uma doença infla-matória em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreen-der a administração a um paciente de uma composição farma-cêutica liquida compreendendo:a) uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelomenos um anticorpo anti-MadCAM; eb) um agente quelante farmaceuticamente aceitável.
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