CN106913869B

CN106913869B - 一种抗ctla-4单克隆抗体制剂及其应用

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Publication number: CN106913869B
Application number: CN201710163713.3A
Authority: CN
Inventors: 李俊峰; 刘晓林; 曹魏
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2017-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2037-03-17
Also published as: CN106913869A

Abstract

本发明公开了一种抗CTLA‑4单克隆抗体制剂及其应用。本发明公开一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的组合物，该组合物由溶质和溶剂组成，所述溶质含有抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体、缓冲剂、渗透压调节剂和螯合剂，所述溶剂为水。与现有的抗CTLA‑4单克隆抗体制剂相比，本发明所提供的抗CTLA‑4单克隆抗体制剂的稳定性高，可以增加其临床应用的安全性。

Description

一种抗CTLA-4单克隆抗体制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单克隆抗体制剂及其应用。

背景技术

CTLA-4与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达上具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活的T细胞表面。但是作为淋巴细胞激活的共刺激信号，CTLA-4与CD28分子的功能是相反的，在正常情况下，T细胞的激活依赖于第一信号(抗原抗体复合物的形成)和第二信号(B7介导的活化信号)双活化。而CTLA-4与B7结合将产生抑制性信号并抑制T细胞活化。作为CTLA-4阻断剂的单克隆抗体(CTLA-4mAb)，可以特异地解除CTLA-4对机体的免疫抑制，激活T细胞，在抗肿瘤及寄生虫等疾病的基因治疗中有广泛的应用前景。

IBI310(伊匹单抗仿制药)就是根据以上机理设计研发的大分子单抗药物。它是一种重组全人源抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体，是上市药物YERVOY(ipilimumab)的仿制药，其给药途径设计为静脉滴注，剂量预计为3mg/kg。伊匹单抗(ipilimumab)的制剂组分包括：DTPA(二乙基三胺五乙酸)、甘露醇、氯化钠、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、PS80(聚山梨酯80)，pH值为7.0。该制剂化学稳定性不高，产品容易发生化学降解反应。这些变化可能会对最终产品的安全性和有效性产生影响。因此，建立一个合适的制剂处方以保障产品的稳定性和安全性非常重要。IBI310作为伊匹单抗的仿制药，由于其结构的复杂性，在非优化制剂中蛋白容易发生聚集且电荷变异体易于从碱性组分转化为酸性组分。

单克隆抗体由于具有特异性强、半衰期长的优点,在药物蛋白开发中逐渐受到重视。目前,单克隆抗体药物是通过发酵生产的,主要在CHO细胞表达,在细胞培养、纯化、制剂工艺及储存过程中会发生糖基化、氧化、脱氨基以及聚集、降解、异构化,这些过程几乎都会造成单克隆抗体的表面电荷的不均一性。单克隆抗体表面电荷的不均一性的变化会影响单克隆抗体的空间构象甚至造成生物活性的变化以及容易发生自我聚集。这些不利因素在将这类药物制成稳定、安全、有效的制剂方面提出了巨大挑战。

提高抗CTLA-4单克隆抗体制剂的物理化学稳定性，使电荷异构体的生成速率减慢，提高产品的质量均一性和一致性，延长产品的货架期，提高其临床使用稳定性是亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提高抗CTLA-4单克隆抗体制剂的稳定性。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的组合物，该组合物由溶质和溶剂组成，所述溶质含有抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体、缓冲剂、渗透压调节剂和螯合剂，所述溶剂为水，所述组合物的pH为6.0～6.5；

所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体在所述组合物中的浓度为2.5～7.5mg/ml，优选为5.0mg/ml；

所述缓冲剂在所述组合物中的浓度为4.84～9.68mg/ml，优选为5.88mg/ml；

所述渗透压调节剂在所述组合物中的浓度为2.93～8.78mg/ml，优选为5.85mg/ml；

所述螯合剂在所述组合物中的浓度为0.02～0.06mg/ml，优选为0.04mg/ml。

上述组合物中，所述缓冲剂为枸橼酸钠或三羟甲基氨基甲烷；

所述渗透压调节剂为氯化钠；

所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠。

上述任一所述的组合物中，所述组合物还包含蛋白保护剂；

所述蛋白保护剂在所述组合物中的浓度为5～15mg/ml。

上述组合物中，所述蛋白保护剂为甘露醇和/或精氨酸；优选地，所述蛋白保护剂为甘露醇和精氨酸，甘露醇在所述组合物中的浓度为10.02mg/ml，精氨酸在所述组合物中的浓度为4.36mg/ml。

上述任一所述的组合物中，所述组合物还包含非离子型表面活性剂；

所述非离子型表面活性剂在所述组合物中的浓度为0.5-0.9mg/ml，优选为0.7mg/ml。

上述组合物中，所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80和/或聚山梨酯20。

上述组合物中，所述溶质由所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体、所述缓冲剂、所述渗透压调节剂、所述螯合剂，所述蛋白保护剂和所述非离子型表面活性剂组成；

所述螯合剂在所述组合物中的浓度为0.02～0.06mg/ml，优选为0.04mg/ml；

所述蛋白保护剂在所述组合物中的浓度为5～15mg/ml；

所述非离子型表面活性剂在所述组合物中的浓度为0.5-0.9mg/ml，优选为0.7mg/ml；

优选地，所述溶质由所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体、所述缓冲剂、所述渗透压调节剂、所述螯合剂、所述蛋白保护剂和所述非离子型表面活性剂组成；其中所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体在所述组合物中的浓度为5.0mg/ml，所述缓冲剂在所述组合物中的浓度为5.88mg/ml，所述渗透压调节剂在所述组合物中的浓度为5.85mg/ml，所述螯合剂在所述组合物中的浓度为0.04mg/ml，所述非离子型表面活性剂在所述组合物中的浓度为0.7mg/ml；

所述缓冲剂优选为枸橼酸钠或三羟甲基氨基甲烷；

所述渗透压调节剂优选为氯化钠；

所述螯合剂优选为乙二胺四乙酸二钠；

所述蛋白保护剂优选为甘露醇和/或精氨酸，更优选地，所述蛋白保护剂为甘露醇和精氨酸，甘露醇在所述组合物中的浓度为10.02mg/ml，精氨酸在所述组合物中的浓度为4.36mg/ml；

所述非离子型表面活性剂优选为聚山梨酯80和/或聚山梨酯20。

上述任一所述的组合物中，所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体由2条轻链和2条重链组成，一条轻链和一条重链之间均通过二硫键连接，重链和重链之间通过二硫键连接；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列分别如SEQ ID No.1的第46位至第57位、第73位至第79位、第112位至第120位所示，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ IDNo.2的第45位至第51位、第70位至第76位、第118位至第126位所示；

所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID No.1的第23位至第130位所示，重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ IDNo.2的第20位至第137位所示；

所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体(IBI310)轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为解决以上技术问题，本发明还提供一种制备如上任一项所述的组合物的方法，在配制所述组合物时，在所述溶剂中加入其余溶质后再加入所述非离子型表面活性剂，最后再进行定容。

为解决以上技术问题，本发明还提供上述任一项所述的组合物在制备如下(1)-(6)任一所示的产品中的应用：

(1)抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的产品；

(2)解除细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4对T淋巴细胞活化的抑制的产品；

(3)解除细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4对机体免疫的抑制的产品；

(4)激活T淋巴细胞的产品；

(5)预防和/或治疗其中T淋巴细胞活性被抑制的疾病的产品；

(6)提高机体免疫水平的产品；

所述产品优选为制剂，再优选为静脉滴注用制剂；

所述疾病优选为晚期转移性恶性黑色素瘤。

本发明的抗CTLA-4单克隆抗体制剂可作为静脉滴注用制剂。并且，可将IBI310替换为其他抗CTLA-4单克隆抗体(包括基因工程技术获得的抗CTLA-4单克隆抗体)制备得到具有同样稳定性的抗CTLA-4单克隆抗体制剂。

本发明所提供的抗CTLA-4单克隆抗体制剂可以使其所含有的抗CTLA-4单克隆抗体在常规存储条件下稳定保存，并且即使在高温加速条件下也具有提高的稳定性，该制剂具有较长的保质期，可以增加其临床应用的安全性。

附图说明

图1为Protein A亲和纯化后目的蛋白的SDS-PAGE检测结果。

图2为Protein A亲和纯化后目的蛋白的CEX-HPLC检测结果。

图3为Protein A亲和纯化后目的蛋白的SEC-HPLC检测结果。

图4为伊匹单抗的亲和力检测结果。

图5为56B3-29F6的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白的亲和力检测结果。

图6为IBI310重链测序片段经DNASTAR-Seqman软件拼接的结果。

图7为IBI310轻链测序片段经DNASTAR-Seqman软件拼接的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所采用的还原型SDS-PAGE方法如下：按《中华人民共和国药典》(2010年版，三部)附录ⅣC，采用还原型SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度，面积归一化法计算样品纯度。

下述实施例中所采用的电荷变异体检测(CEX-HPLC)方法如下：按照《中华人民共和国药典》(2010年版，三部)附录ⅢB进行测定，用弱阳离子分析柱对样品进行检测，面积归一化法计算样品酸、碱和主成分纯度。

下述实施例中所采用的分子排阻色谱(SEC-HPLC)方法如下：按照《中华人民共和国药典》(2010年版，三部)附录ⅢB进行测定，用亲水硅胶体积排阻色谱柱对样品进行检测，用面积归一化法计算样品纯度。

下述实施例中的伊匹单抗处方制剂的原研药为YERVOY(ipilimumab)Injection，Bristol-Myers Squibb公司，Application No.:125377；Approval Date:3/25/2011，下述实施例中采用的伊匹单抗为该原研药；其仿制药为重组全人源抗CTLA-4单克隆抗体注射液(简称IBI310注射液)，信达生物制药(苏州)有限公司产品。

中国仓鼠卵巢细胞系S亚型(CHO-S)为Invitrogen公司产品，产品目录号为A13696-1。

CD FortiCHO为Invitrogen公司产品，产品目录号为A11483-01。

Anti-Clumping Agent(防结块剂)为Invitrogen公司产品，产品目录号为0010057AE。

MTX(氨甲喋呤)为Calbiochem公司产品，产品目录号为A6770。

Puro(嘌呤霉素)为Invitrogen公司产品，产品目录号为A11138-03。

实施例1、抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)的制备

IBI310的氨基酸序列与伊匹单抗(Ipilimumab)的氨基酸序列相同。

一、载体构建

根据Freedom^TMCHO-S^TM kit说明书，分别将IBI310的重链基因(SEQ ID No.4)和轻链基因(SEQ ID No.3)插入表达载体Freedom^TM pCHO1.0(Freedom^TMCHO-S^TM kit，GIBCO产品，产品目录号为A13696-01)的第一个和第二个目的基因表达框架，构建成IBI310抗体表达质粒pCHO1.0-IHEKR。

二、表达质粒转染宿主细胞

根据Free Style^TM pMAX Reagent说明书，通过Invitrogen化学转染试剂(FreeStyle^TM pMAX Reagent，货号：16447-100)将IBI310抗体表达质粒pCHO1.0-IHEKR转入CHO-S宿主细胞中，完成转染。

三、转染后加压筛选

将转染48小时后的6瓶细胞悬液过滤后分别分装至两个方瓶中。使用含有Puro、MTX的筛选培养基(表1)，在培养箱中静置培养，7天后检测细胞活率，根据细胞活率数值完成第一、二阶段加压筛选。

表1培养基组分表

四、细胞群产量检测

对第一和第二阶段分别得到的12个细胞群采用6孔板5天静置培养的方法进行高产细胞群的筛选。用Fortebio定量法检测上清抗体表达量。该方法通过Protein A sensor检测不同浓度的标准样品，建立标准曲线来计算待测样品的浓度，选取抗体表达量最高的细胞群YY 310-2 10/100-50/1000。

五、阳性单克隆筛选

利用有限稀释法对选取的细胞群YY 310-2 10/100-50/1000进行单克隆。用克隆培养基(表1)，经96孔板、6孔板两个阶段，进行高产克隆的筛选。根据6孔板筛选结果，将抗体表达量最高的12个克隆扩增培养并进行补糖实验，获得抗体表达量相对较高的细胞株56B3。

六、亚克隆细胞株的筛选

为保证构建主细胞库所用细胞的单克隆性，对IBI310原始克隆细胞库内的产量和稳定性均好的细胞株56B3进行了亚克隆。所用亚克隆方法同为有限稀释法，经96孔板、6孔板两个阶段筛选出3个高产亚克隆：56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6，建立了由该3个亚克隆构成的原始亚克隆细胞库。

七、确定最终生产用细胞株

56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6三个亚克隆的收获液经Protein A亲和纯化得到目的蛋白。以伊匹单抗为对照，采用SDS-PAGE法检测，结果如图1所示。

图1中，M为蛋白Marker(NEB产品，货号为P7703)；ST:伊匹单抗；25D11、26D5和29F6分别代表56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白。

图1表明，56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6亚克隆细胞株所表达的目的蛋白的相对分子量大小和纯度与伊匹单抗一致。

以伊匹单抗为对照，CEX-HPLC法检测各亚克隆的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白的电荷异构，结果如图2所示。

图2中，亚克隆25D11、26D5和29F6分别代表56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白。

图2表明，56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6亚克隆细胞株所表达的目的蛋白与伊匹单抗相比，主峰一致。

以伊匹单抗为对照，SEC-HPLC法检测各亚克隆的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白的纯度，结果如图3所示。

图3中，亚克隆25D11、26D5和29F6分别代表56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白。

图3表明，56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6亚克隆细胞株所表达的目的蛋白的保留时间与伊匹单抗一致，纯度均较高。

以伊匹单抗为对照，对56B3-29F6的收获液经Protein A亲和纯化得到的目的蛋白进行亲和力检测，结果如图4和图5所示。

图4和图5表明，亚克隆56B3-29F6表达的目的蛋白的亲和力与伊匹单抗相近。

对56B3-25D11、56B3-26D5和56B3-29F6这3个亚克隆细胞株进行60天稳定性检测，结果显示：56B3-29F6细胞株抗体产量无降低，56B3-25D11和56B3-26D5两个细胞株的抗体产量有所降低。最终选定56B3-29F6为IBI310亚克隆。

八、原始细胞株的鉴定

对原始细胞株56B3-29F6进行基因组内目的基因测序，表达产物鉴定，质谱确定分子量。对重链和轻链采用PCR产物测序的方法。

IBI310重链测序片段经DNASTAR-Seqman软件拼接后(如图6所示)，得到基因序列HC Seqman，该序列与伊匹单抗重链目的基因的理论序列进行Blast对比，结果表明二者完全一致。

IBI310轻链测序片段经DNASTAR-Seqman软件拼接后(如图7所示)，得到基因序列LC Seqman，该序列与伊匹单抗轻链目的基因的理论序列进行Blast对比，结果表明二者完全一致。

九、细胞表达产物的鉴定

细胞株56B3-29F6进行摇瓶流加培养14天。收获液经Protein A亲和纯化后进行通过液相色谱-质谱联用检测样品的分子量，IBI310的分子量和伊匹单抗的分子量完全相同，如表2所示。

表2伊匹单抗与IBI310分子量对比

抗CTLA-4单克隆抗体IBI310由2条轻链和2条重链组成，一条轻链和一条重链之间均通过二硫键连接，重链和重链之间通过二硫键连接；轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第23位至第130位所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第20位至第137位所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列分别如SEQ ID No.1的第46位至第57位、第73位至第79位、第112位至第120位所示，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID No.2的第45位至第51位、第70位至第76位、第118位至第126位所示。

该单克隆抗体的轻链的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，重链的编码基因序列如SEQ ID No.4所示；轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID No.3的第67位至第390位所示，重链可变区的编码基因序列如SEQ ID No.4的第58位至第411位所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的编码基因序列分别如SEQ ID No.3的第136位至第171位、第217位至第237位、第334位至第360位所示，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的编码基因序列分别如SEQ IDNo.4的第133位至第153位、第208位至第228位、第352位至第378位所示。

实施例2、抗CTLA-4单克隆抗体制剂A

抗CTLA-4单克隆抗体制剂A的组成如下：该制剂由溶质和溶剂组成，溶质为实施例1制备的抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)、枸橼酸钠、甘露醇、精氨酸、氯化钠、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)和聚山梨酯80，溶剂为注射用水；抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为5mg/ml，枸橼酸钠在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为5.88mg/ml，甘露醇在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为10.02mg/ml，精氨酸在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为4.36mg/ml，氯化钠在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为5.85mg/ml，EDTA-2Na在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为0.04mg/ml，聚山梨酯80在抗CTLA-4单克隆抗体制剂A中的浓度为0.7mg/ml；pH为6.0。

在配制抗CTLA-4单克隆抗体制剂A时，溶质中非离子型表面活性剂聚山梨酯80最后加入再进行定容，其他溶质的添加则无先后顺序。

将抗CTLA-4单克隆抗体制剂A无菌分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得该制剂的成品。

实施例3、抗CTLA-4单克隆抗体制剂B

抗CTLA-4单克隆抗体制剂B的组成如下：该制剂由溶质和溶剂组成，溶质为实施例1制备的抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、精氨酸、氯化钠、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)和聚山梨酯20，溶剂为注射用水；抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为2.5mg/ml，三羟甲基氨基甲烷在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为4.84mg/ml，精氨酸在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为5mg/ml，氯化钠在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为2.93mg/ml，EDTA-2Na在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为0.02mg/ml，聚山梨酯20在抗CTLA-4单克隆抗体制剂B中的浓度为0.5mg/ml；pH为6.5。

在配制抗CTLA-4单克隆抗体制剂B时，溶质中非离子型表面活性剂聚山梨酯20最后加入再进行定容，其他溶质的添加则无先后顺序。

将抗CTLA-4单克隆抗体制剂B无菌分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得该制剂的成品。

实施例4、抗CTLA-4单克隆抗体制剂C

抗CTLA-4单克隆抗体制剂C的组成如下：该制剂由溶质和溶剂组成，溶质为实施例1制备的抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)、枸橼酸钠、甘露醇、氯化钠、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)和聚山梨酯80，溶剂为注射用水；抗CTLA-4单克隆抗体(IBI310)在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为7.5mg/ml，枸橼酸钠在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为9.68mg/ml，甘露醇在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为15mg/ml，氯化钠在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为8.78mg/ml，EDTA-2Na在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为0.06mg/ml，聚山梨酯80在抗CTLA-4单克隆抗体制剂C中的浓度为0.9mg/ml；pH为6.0。

在配制抗CTLA-4单克隆抗体制剂C时，溶质中非离子型表面活性剂聚山梨酯80最后加入再进行定容，其他溶质的添加则无先后顺序。

将抗CTLA-4单克隆抗体制剂E无菌分装至西林瓶中，加盖橡胶塞和铝塑盖，获得该制剂的成品。

实施例5、抗CTLA-4单克隆抗体制剂A、B、C的加速稳定性实验

对实施例2、3和4制备的抗CTLA-4单克隆抗体制剂进行加速稳定性实验，以酸性组分、碱性组分和主成分的百分含量的变化和蛋白纯度的主峰含量作为判定手段，分别通过电荷变异体(CEX-HPLC检测)和蛋白纯度(SDS-PAGE检测)表征制剂中抗CTLA-4单克隆抗体的化学稳定性。

采用电荷变异体检测(CEX-HPLC)方法和还原型SDS-PAGE方法分析实施例2、3、4制备的抗CTLA-4单克隆抗体制剂A、B、C以及伊匹单抗在37±2℃高温加速条件下下贮存0h和1个月的蛋白电荷变异体含量的变化以及蛋白纯度的变化，结果分别如表3和表4所示。

表3 37±2℃蛋白电荷变异体比较结果

表4 37±2℃蛋白纯度比较结果

抗CTLA-4单克隆抗体的结构复杂，导致其化学性质不稳定，蛋白容易发生聚集且电荷变异体易于从碱性组分转化为酸性组分。表3和表4的结果表明，抗CTLA-4单克隆抗体制剂A、B和C的电荷变异体含量的变化和蛋白纯度的下降均显著慢于伊匹单抗处方制剂。

同时经过观察发现，抗CTLA-4单克隆抗体制剂A、B和C的其他稳定性指标如外观、蛋白浓度、浊度等在该加速条件下均与伊匹单抗处方制剂相当。

以上结果表明，本发明的实施例2、3和4分别制备的抗CTLA-4单克隆抗体制剂A、B和C可以使其中所含有的抗CTLA-4单克隆抗体的化学降解速率降低，提高抗CTLA-4单克隆抗体的物理化学稳定性，使得该单克隆抗体能稳定存在于制剂处方中。与现有的抗CTLA-4单克隆抗体制剂相比，本发明所制备的抗CTLA-4单克隆抗体制剂具有提高的产品质量均一性和一致性以及延长的产品货架期，稳定性高，可以增加其临床的安全性。

序列表

<110>信达生物制药（苏州）有限公司

<120>一种抗CTLA-4单克隆抗体制剂及其应用

<160>4

<210>1

<211>237

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly

65 70 75 80

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210>2

<211>467

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210>3

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atggacttcc aggtgcagat catctccttc ctgctgatca gcgcctccgt gattatgagc 60

cggggcgaga tcgtgctgac ccaaagccct ggcacactca gcctgtcccc tggagagcgg 120

gctacactgt cctgcagggc cagccagtcc gtgggatcct cctacctggc ctggtaccag 180

cagaaacccg gccaggctcc caggctgctg atctatggcg ctttctccag ggccaccgga 240

atccccgata ggttcagcgg ctccggaagc ggaaccgact tcaccctgac catcagcagg 300

ctggagcccg aggactttgc cgtgtattac tgccagcagt acggatcctc cccctggaca 360

ttcggccagg gcacaaaggt ggagatcaag aggaccgtcg ccgccccctc cgtctttatc 420

ttccccccct ccgacgagca actgaagagc ggcacagcct ccgtggtctg cctcctgaac 480

aacttctacc ccagggaggc caaggtccag tggaaagtgg acaacgccct gcagtccggc 540

aactcccagg aaagcgtcac cgagcaggac tccaaggact ccacatacag cctgtccagc 600

accctgaccc tcagcaaggc cgattacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtcaca 660

caccagggcc tgtcctcccc cgtcaccaag agctttaacc ggggcgagtg ctgatga 717

<210>4

<211>1407

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgggctggt ccctgatcct cctcttcctg gtggctgtcg ccacaagggt cctgagccag 60

gtgcagctcg tcgaatccgg aggaggagtc gtgcagcctg gcaggtccct caggctgagc 120

tgtgctgcct ccggcttcac cttcagctcc tacaccatgc attgggtgcg gcaggctcct 180

ggcaaaggcc tcgaatgggt caccttcatc agctacgatg gcaacaacaa gtattacgcc 240

gacagcgtga agggcaggtt caccatctcc cgggacaaca gcaagaacac cctctacctc 300

cagatgaaca gcctgagggc tgaggacacc gccatttatt actgcgctcg gaccggatgg 360

ctcggccctt ttgattactg gggccaaggc acactggtga ccgtgagcag cgcctccacc 420

aagggaccca gcgtgttccc tctggctccc agctccaagt ccacaagcgg cggaacagct 480

gctctgggat gcctggtcaa ggactatttc cctgagcccg tgacagtgag ctggaactcc 540

ggagccctga ccagcggagt gcatacattc cccgccgtcc tccagagctc cggactctac 600

tccctgtcct ccgtggtgac cgtgcctagc agctccctcg gcacacagac ctatatctgt 660

aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaaa gagtcgagcc caagagctgc 720

gacaagaccc acacctgccc tccctgtcct gctcctgaac tgctgggcgg acccagcgtc 780

ttcctgttcc ctcccaaacc caaggatacc ctgatgatct ccaggacccc tgaggtgacc 840

tgcgtggtcg tggacgtgtc ccacgaggat cccgaagtga agttcaactg gtacgtggac 900

ggagtggaag tccataacgc caagaccaag ccccgggagg agcagtacaa ctccacatat 960

agggtcgtgt ccgtgctcac cgtcctgcat caggactggc tcaacggcaa ggagtacaaa 1020

tgcaaggtca gcaacaaagc tctccctgcc cccatcgaga agaccatcag caaggctaaa 1080

ggccagcccc gggaacctca agtctacacc ctgccccctt ccagggatga gctgaccaag 1140

aaccaggtca gcctcacctg tctggtgaag ggcttctacc cttccgacat cgctgtggag 1200

tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tataagacca caccccccgt gctggactcc 1260

gatggcagct tcttcctgta ctccaagctg acagtggata agtccaggtg gcagcagggc 1320

aacgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca atcactatac ccaaaagtcc 1380

ctctccctga gccctggcaa atgatga 1407

Claims

1.一种抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的组合物，该组合物由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质由抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体、缓冲剂、渗透压调节剂、螯合剂、蛋白保护剂和非离子型表面活性剂组成；

所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体在所述组合物中的浓度为5mg/ml；

所述缓冲剂为枸橼酸钠，其在所述组合物中的浓度为5.88mg/ml；

所述渗透压调节剂为氯化钠，其在所述组合物中的浓度为5.85mg/ml；

所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，其在所述组合物中的浓度为0.04mg/ml；

所述蛋白保护剂为甘露醇和精氨酸，甘露醇在所述组合物中的浓度为10.02mg/ml，精氨酸在所述组合物中的浓度为4.36mg/ml；

所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80，其在所述组合物中的浓度为0.7mg/ml；

所述组合物的pH为6.0；

所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体由2条轻链和2条重链组成，一条轻链和一条重链之间均通过二硫键连接，重链和重链之间通过二硫键连接；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3序列分别如SEQ ID No.1的第46位至第57位、第73位至第79位、第112位至第120位所示，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID No.2的第45位至第51位、第70位至第76位、第118位至第126位所示。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第23位至第130位所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第20位至第137位所示。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：所述抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的单克隆抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述的组合物的方法，在配制所述组合物时，在所述溶剂中加入其余溶质后再加入所述非离子型表面活性剂，最后再进行定容。

5.权利要求1-3任一项所述的组合物在制备如下(1)-(6)任一所示的产品中的应用：

(1)抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的产品；

(4)激活T淋巴细胞的产品；

(5)预防和/或治疗其中T淋巴细胞活性被抑制的疾病的产品；

(6)提高机体免疫水平的产品。