TW201439118A - Ｂｍｐ－６抗體 - Google Patents

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TW201439118A
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Abstract

本發明係關於結合至人類BMP-6之抗體或其抗原結合片段、包括該等抗體或其抗原結合片段之組合物及使用其治療慢性疾病性貧血之方法。

Description

BMP-6抗體
本發明係關於醫學領域。更具體而言，本發明係關於結合人類BMP-6且可用於治療諸如癌性貧血或慢性腎病性貧血(CKD)等慢性疾病性貧血(ACD)之抗體或其抗原結合片段。
BMP-6係骨形態發生蛋白(BMP)家族之成員；在BMP家族中存在20個以上的成員。BMP家族成員係起始SMAD途徑中之信號傳導從而引起細胞中之轉錄調節的配體。BMP-6基因敲除小鼠經報導為可生長且可繁殖，並顯示正常骨及軟骨發育，而密切相關之BMP-7基因敲除小鼠在出生後即死亡且伴隨腎、眼及骨缺陷。已顯示，BMP-6或BMP-7之個別基因敲除並未改變心臟生成，但BMP-6及BMP-7雙基因敲除確實展現心臟之若干缺陷及延遲，且胚胎因心功能不全而死亡。亦已顯示，小鼠模型中BMP-7之存在在防止與纖維化相關之慢性心臟病之進展中至關重要。因此，在用BMP-6抗體抑制人類BMP-6時，針對BMP-7之交叉反應性可能並不合意。
當過度活化的發炎性細胞介素導致鐵穩態失調、紅血球生成減少及紅血球壽命縮短時，諸如癌症、腎病及自體免疫病症等某些慢性疾病可導致ACD。已將海帕西啶(Hepcidin)鑑別為參與鐵穩態之關鍵激素；高含量之海帕西啶與ACD中可見之鐵侷限性紅血球生成相關。已顯示BMP-6增加海帕西啶表現。
WO 2010/056981揭示在小鼠中投與針對人類BMP-6產生之小鼠抗體；使用可自R&D Systems購得之此小鼠抗體MAB507之三天方案 後，在一時間點下報告海帕西啶之減少及鐵之增加。亦揭示針對BMP之選擇性，且顯示投與某些劑量之BMP-6抗體MAB507會抑制BMP-7。然而，迄今為止，並無靶向BMP-6之抗體經批準用於治療應用。
業內仍需要提供替代性BMP-6抗體。具體而言，業內仍需要提供對BMP-6之選擇性高於對其他BMP家族成員(包含BMP-7)選擇性的有效BMP-6抗體。業內亦需要提供以下有效BMP-6抗體：對BMP-6之選擇性高於對其他BMP家族成員(包含BMP-7)之選擇性且產生延長的藥物效應動力學反應。業內亦需要提供以下有效BMP-6抗體：對BMP-6之選擇性高於對其他BMP家族成員(包含BMP-7)之選擇性以治療ACD。
因此，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR包括互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR包括CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1係多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，LCDR2係多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，LCDR3係多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，HCDR1係多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，HCDR2係多肽YINPYNDGTKYNENFKG(SEQ ID NO：6)或YINPYNRGTKYNENFKG(SEQ ID NO：7)，且HCDR3係多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR包括互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR包括CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1係多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，LCDR2係多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，LCDR3係多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，HCDR1係多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，HCDR2係多肽 YINPYNDGTKYNENFKG(SEQ ID NO：6)，且HCDR3係多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR包括互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR包括CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1係多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，LCDR2係多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，LCDR3係多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，HCDR1係多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，HCDR2係多肽YINPYNRGTKYNENFKG(SEQ ID NO：7)，且HCDR3係多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LCVR及HCVR之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。在又一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LCVR及HCVR之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：10。在另一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LCVR及HCVR之抗體或其抗原結合片段，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：11。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LCVR及HCVR之抗體，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。在又一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LCVR及HCVR之抗體，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：10。在另一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括 LCVR及HCVR之抗體，其中LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且HCVR係多肽SEQ ID NO：11。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)之抗體，其中LC係多肽SEQ ID NO：12，且HC係多肽SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。在又一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LC及HC之抗體，其中LC係多肽SEQ ID NO：12，且HC係多肽SEQ ID NO：13。在另一實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括LC及HC之抗體，其中LC係多肽SEQ ID NO：12，且HC係多肽SEQ ID NO：14。
在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，其中每一輕鏈係多肽SEQ ID NO：12，且每一重鏈係多肽SEQ ID NO：13。在實施例中，本發明提供結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)之包括兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，其中每一輕鏈係多肽SEQ ID NO：12，且每一重鏈係多肽SEQ ID NO：14。
本發明亦係關於編碼上文所闡述之本發明抗體或其抗原結合片段之多核苷酸，該等多核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式，該DNA包含cDNA及合成DNA。DNA可為雙鏈或單鏈。編碼本發明抗體或其抗原結合片段之編碼序列可因遺傳密碼之冗餘度或簡併性而變化。
在實施例中，本發明提供包括編碼重鏈多肽之多核苷酸序列之DNA分子，該重鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：13或胺基酸序列SEQ ID NO：14。在實施例中，本發明提供包括編碼輕鏈多肽之多核苷酸序列之DNA分子，該輕鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：12。
在實施例中，本發明提供包括以下序列之DNA分子：編碼重鏈多肽之多核苷酸序列，該重鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：13；及編碼輕鏈多肽之多核苷酸序列，該輕鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：12。在實施例中，本發明提供包括以下序列之DNA分子：編碼重鏈多肽之多核苷酸序列，該重鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：14，及編碼輕鏈多肽之多核苷酸序列，該輕鏈多肽具有胺基酸序列SEQ ID NO：12。
本發明之多核苷酸將在將序列可操作地連接至表現控制序列之後在宿主細胞中表現。表現載體通常可作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之組成部分而在宿主有機體中複製。通常，表現載體將含有選擇標記(例如四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶)，以容許檢測彼等經期望DNA序列轉化之細胞。
本發明之抗體或其抗原結合片段可容易地在以下細胞中產生：哺乳動物細胞，例如CHO、NS0、HEK293或COS細胞；細菌細胞，例如大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence)；或真菌或酵母細胞。該等宿主細胞係使用業內所熟知之技術來培養。
可藉由熟知之方法將含有所關注多核苷酸序列(例如抗體或其抗原結合片段之多肽及表現控制序列)之載體轉移至宿主細胞中，該等方法端視細胞宿主之類型而變化。例如，氯化鈣轉化通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。
在實施例中，本發明提供包括一或多個本發明DNA分子之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：13之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈的抗體。在實施例中，本發明提供包括本發明DNA分子之哺乳動物細胞，該細胞能夠表現包括具有胺基酸序列SEQ ID NO：14之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈的抗體。
在實施例中，本發明提供產生包括胺基酸序列SEQ ID NO：13之重鏈及胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈的本發明抗體之製程，該製 程包括在表現抗體之條件下培養本發明之哺乳動物細胞，及回收所表現之抗體。在實施例中，本發明提供產生包括胺基酸序列SEQ ID NO：14之重鏈及胺基酸序列SEQ ID NO：12之輕鏈的本發明抗體之製程，該製程包括在表現抗體之條件下培養本發明之哺乳動物細胞，及回收所表現之抗體。在又一實施例中，本發明提供藉由本發明製程產生之抗體。
在實施例中，本發明提供包括以下各項之醫藥組合物：本發明抗體或其抗原結合片段及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。更具體而言，本發明之組合物進一步包括一或多種其他治療劑。
在實施例中，本發明提供治療貧血之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在又一實施例中，本發明提供治療貧血之方法，該方法包括投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段，其中貧血為慢性疾病性貧血。在另一實施例中，本發明提供治療貧血之方法，該方法包括投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段，其中慢性疾病性貧血係選自由癌性貧血及慢性腎病性貧血組成之群。
在實施例中，本發明提供治療海帕西啶相關之鐵侷限性貧血之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在又一實施例中，本發明提供治療海帕西啶相關之鐵侷限性貧血之方法，該方法包括投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段，其中海帕西啶相關之鐵侷限性貧血係選自由癌性貧血及慢性腎病性貧血組成之群。
在實施例中，本發明提供治療鐵難治性缺鐵性貧血(IRIDA)之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在又一實施例中，本發明提供治療IRIDA之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段，其中 IRIDA係由TMPRSS6基因缺陷引起。
在實施例中，本發明提供治療休格倫氏症候群(Sjogren’s syndrome)之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，本發明提供增加血清鐵含量、網狀紅血球計數、紅血球計數、血紅素及/或血球比容之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供增加血清鐵含量之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供增加網狀紅血球計數之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供增加紅血球計數之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供增加血紅素之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供增加血球比容之方法，該方法包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體或其抗原結合片段。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於療法中。在又一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療貧血。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療慢性疾病性貧血。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療癌性貧血或慢性腎病性貧血。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療海帕西啶相關之鐵侷限性貧血。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療海帕西啶相關之鐵侷限性癌性貧血。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於 治療海帕西啶相關之鐵侷限性慢性腎病性貧血。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療IRIDA。在又一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療IRIDA，其中IRIDA係由TMPRSS6基因缺陷引起。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段用於治療休格倫氏症候群。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造藥劑。在又一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療貧血之藥劑。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療慢性疾病性貧血之藥劑。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療慢性腎病性貧血之藥劑。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療癌性貧血之藥劑。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療IRIDA之藥劑。在又一實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療IRIDA之藥劑，其中IRIDA係由TMPRSS6基因缺陷引起。
在實施例中，本發明提供本發明抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療休格倫氏症候群之藥劑。
「抗體」之一般結構為業內所熟知。對於IgG型抗體，存在四條經由鏈內及鏈間二硫鍵交聯之胺基酸鏈(兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈)。對於抗體，一條重鏈與一條輕鏈形成鏈間二硫鍵，且另一重鏈與另一輕鏈形成鏈間二硫鍵，且一條重鏈與另一重鏈形成兩個鏈間二硫鍵。抗原結合片段係抗體之片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈可變片段(scFv)或二-scFv。
當在某些生物系統中表現時，具有人類Fc序列之抗體在Fc區經糖基化。抗體亦可在其他位置處經糖基化。熟習此項技術者將瞭解，本發明之抗體可含有該糖基化。通常，糖基化發生在抗體Fc區中高度保守的N-糖基化位點處。N-聚糖通常附接至天冬醯胺。預測依序編號之天冬醯胺295係本發明抗體之糖基化位點。
本發明之抗體係已經設計具有與源自人類基因組序列之框架及恆定區一致或實質上一致之人類來源之框架、鉸鏈區及恆定區的經改造抗體。完整人類框架、鉸鏈區及恆定區係彼等人類種系序列以及具有天然體細胞突變之序列及/或彼等具有經改造突變者。本發明之抗體可包括源自完整人類框架、鉸鏈或恆定區之其中含有一或多個胺基酸取代、缺失或添加之框架、鉸鏈或恆定區。此外，本發明抗體在人類中實質上具有非免疫原性。
抗體I包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由多肽SEQ ID NO：12組成且每一重鏈係由多肽SEQ ID NO：13組成。抗體II包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由多肽SEQ ID NO：12組成且每一重鏈係由多肽SEQ ID NO：14組成。編碼抗體I之每一重鏈之具體DNA分子係SEQ ID NO：16，且編碼抗體I之每一輕鏈之具體DNA分子係SEQ ID NO：15。編碼抗體II之每一重鏈之具體DNA分子係SEQ ID NO：17，且編碼抗體II之每一輕鏈之具體DNA分子係SEQ ID NO：15。
本發明抗體或其抗原結合片段可使用業內所熟知之技術來產生，該等技術係例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合或業內易知之其他技術。用於產生並純化抗體之方法為業內所熟知且可參見例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，第5-8章及第15章，ISBN 0-87969-314-2。
CKD性貧血係一種為患有CKD之患者中之早期且常見併發症之貧血。癌性貧血係由血液惡性腫瘤及一些實體腫瘤引起之貧血；而化學療法引起之貧血係用化學治療劑治療癌症患者引起之貧血。CKD性貧血加重糖尿病性神經病變、心血管疾病及視網膜病變，以及其他病況。癌症相關性貧血與死亡之相對風險增加相關。癌症相關性貧血之當前治療選擇限於輸血，此乃因紅血球生成刺激劑僅適用於化學療法引起之貧血。
除非另有說明，否則如本文關於BMP-6抗體或其抗原結合片段對人類BMP-6之親和力所使用之「結合」欲指如藉由業內已知之常用方法所量測之KD小於約1×10-8M，較佳小於約1×10-9M，該等方法包含基本上如本文所闡述在37℃下使用表面電漿子共振(SPR)生物感測器來量測。本文關於本發明抗體使用之術語「選擇性」係指以下結合人類BMP-6之抗體：其KD係結合至少一個BMP家族成員(包含(但不限於)人類BMP-5或人類BMP-7)之抗體KD的約1/1000、1/500、1/200、1/100、1/50、1/10或約1/5，如在37℃下藉由表面電漿子共振所量測。此外或另一選擇為，在藉由本文下文實例2-3中所闡述之方法分析時，本發明之BMP-6選擇性抗體或其抗原結合片段結合人類BMP-6，但並不結合或僅最小程度地結合至至少一個人類BMP家族成員，包含(但不限於)人類BMP-5或人類BMP-7。
「有效量」意指將使組織、系統、動物、哺乳動物或人類發出研究者、醫師或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學反應或期望治療效應之本發明抗體或包括本發明抗體之醫藥組合物的量。抗體之治療有效量可根據諸如以下等因素而變化：個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及抗體使該個體發出期望反應之能力。有效量亦為治療有益效應勝過抗體之任何毒性或有害效應的量。
術語「治療(treatment、treat、treating」)及諸如此類意欲包含減 慢或逆轉病症之進展。該等術語亦包含緩解、改善、減弱、消除或減輕病症或病況之一或多種症狀，即使實際上並不消除病症或病況且即使並非其本身減慢或逆轉病症或病況之進展。患者係指患有將自抑制BMP-6活性受益之疾病、病症或病況之哺乳動物，較佳人類。
本發明抗體或其抗原結合片段或包括其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如，皮下、靜脈內、腹膜內、肌內或經皮)來投與。本發明抗體或其抗原結合片段可單獨或與醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑組合以單一或多劑量形式投與患者。本發明之醫藥組合物可藉由業內所熟知之方法來製備(例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A.Gennaro等人，Mack Publishing公司)，且如本文所揭示包括抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
實例1：抗體表現及純化
重鏈及輕鏈可變區之多肽、抗體I及抗體II之重鏈及輕鏈全胺基酸序列以及編碼其之核苷酸序列列示於下文標題為「胺基酸及核苦酸序列」之部分中。此外，輕鏈及重鏈CDR多肽顯示於表1中。
本發明抗體或其抗原結合片段(包含(但不限於)抗體I及抗體II)可基本上如下製造及純化。可使用最佳預定HC：LC載體比率或編碼HC及LC二者之單一載體系統用分泌抗體之表現系統瞬時或穩定轉染諸如HEK 293 EBNA或CHO等適宜宿主細胞。可使用許多常用技術中之任一者來純化其中分泌有抗體之澄清培養基。例如，可將培養基方便地施加至已經諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)等相容緩衝液平衡之針對Fab片段之MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare)。該等管柱可經洗滌以去除非特異性結合組份。可藉由例如pH梯度(例如20mM Tris緩衝液(pH 7)至10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)或磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)至100mM甘胺酸緩衝液(pH 3.0))來溶 析所結合抗體。可藉由例如SDS-PAGE檢測抗體部分，且然後可彙集。端視預期用途選擇進一步純化。可使用常用技術將抗體濃縮及/或無菌過濾。可藉由常用技術有效地去除可溶性聚集物及多聚物，該等技術包含尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換、多元或羥磷灰石層析。在該等層析步驟後抗體之純度大於95%。可將產物立即冷凍於-70℃下或可凍乾。
實例2：抗BMP6抗體之結合動力學、親和力及特異性
本發明抗體或其抗原結合片段對人類BMP-6以及人類BMP-5及人類BMP-7之結合動力學、親和力及選擇性可根據業內已知之方法藉由使用表面電漿子共振(SPR)生物感測器(例如BIAcore® 2000、BIAcore® 3000或BIAcore® T100(GE HealthCare))來測定。
人類BMP-5、人類BMP-6、人類BMP-7及MAB507可購自R&D Systems(Minneapolis,MN)。MAB507係聲稱對BMP-6具有特異性之商業抗體。食蟹猴BMP-6及大鼠BMP-6可使用標準程序來製造。可使用EDC/NHS胺偶合方法(BIAcore編號BR-1000-50)將配體固定在CM4晶片(BIAcore編號BR-1005-34)上。簡言之，可藉由以10μL/分鐘經7分鐘注射EDC/NHS之1：1混合物來活化所有四種流動細胞之表面。可將人類BMP-5、BMP-6及BMP-7於10mM乙酸鹽緩衝液(pH 4.5)中稀釋至1-2μg/mL，且將約200個共振單位(RU)固定至流速為10μL/分鐘之流動細胞(Fc)2、3或4上。可使Fc1為空白。可以10μL/分鐘經7分鐘注射乙醇胺來封阻未反應位點。可使用以30μL/分鐘經3×30秒注射甘胺酸(pH 1.5)來去除任何非共價締合蛋白。所有量測皆可在25℃及37℃下實施。運行緩衝液可為HBS-EP+(BIAcore編號BR-1006-69)。可使用BIAcore T100評估軟體2.0.3版來分析。
為測定抗體I及MAB 507在不同BMP家族成員之間之特異性，可於運行緩衝液HBS-EP+中製備以下最終濃度之抗體：1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001及0(空白)nM。每一循環可由以下步驟組成：以50μL/分鐘經300秒對所有流動細胞注射稀釋抗體，然後以50μL/分鐘經1200秒解離。可藉由以50μL/分鐘經60秒注射10mM甘胺酸(pH 1.5)並以30μL/分鐘經30秒注射HBS-EP緩衝液來使晶片表面再生。可收集減去參考之數據，且可在BIA評估分析軟體中使用1：1結合模型來評估每一配體之締合速率(k 締合 )及解離速率(k 解離 )。可根據關係KD=k 解離 /k 締合 自結合動力學計算親和力(KD)。
在基本上如此實例2中所闡述實施之實驗中，抗體I以0.020nM親和力結合至人類BMP-6。鑒於在37℃下無可檢測到之與人類BMP-5及人類BMP-7之結合，抗體I顯示對BMP-6之選擇性高於對與BMP-6具有最高序列同源性之該兩個BMP家族成員之選擇性。
R&D抗體MAB507以1nM親和力結合人類BMP-6，且與抗體I不同，MAB507對人類BMP-7具有23nM親和力(表2)。在37℃下MAB507不具有可檢測到之與人類BMP-5之結合(表2)。
抗體I及抗體II之Fab以在37℃下介於0.08-0.09nM之間之相似親和力結合至人類BMP-6(表3)。MAB507之Fab，Fab507以在37℃下12.2nM之親和力結合至人類BMP-6(表3)。
抗體I及抗體II Fab對人類BMP-6之親和力係MAB507之Fab對人類BMP-6親和力的135-150倍。抗體I對人類BMP-6之親和力係MAB507對人類BMP-6親和力的50倍。
抗體I之Fab以在37℃下介於79.6pM至88.0pM之間之相似親和力結合至人類、食蟹猴及大鼠BMP-6(表4)。抗體I對食蟹猴BMP-6及大鼠BMP-6之高親和力允許抗體I直接用於食蟹猴及大鼠動物模型中而無需採用替代抗體。
實例3：抗BMP6抗體抑制海帕西啶表現之BMP-6誘導
可在BMP-6誘導海帕西啶表現之基於細胞之分析中量測本發明抗體或其抗原結合片段對人類BMP-6活體外基於細胞之抑制。亦可使用基於細胞之活體外分析來評估BMP-6抗體針對其他BMP(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、BMP-9及BMP-10)對海帕西啶誘導之選擇性。在上述基於細胞之活體外分析中，BMP配體與海帕西啶啟動子上BMP反應元件之結合誘導HepProm_Luc細胞中螢光素酶報告子活性。該分析極其敏感，且因此並不適於顯示參與鐵穩態之BMP家族成員。但該分析有效地顯示抑制劑在細胞環境中對不同BMP家族成員之選擇性。
HepProm_Luc細胞系可藉由使用含有經選殖海帕西啶啟動子DNA序列(HepProm 0.3+1.0kb)之螢光素酶報告子載體穩定轉染 Hep3B2.1-7細胞(ATCC,Manassas,VA，編號HB-8064)來產生。可將HepProm_Luc細胞維持在DMEM/高葡萄糖完全培養基(Hyclone,Logan,UT，編號SH30243.01)加5%熱滅活FBS(Invitrogen,Grand Island,NY，編號10082-147)與1×MEM NEAA(Invitrogen,Carlsbad,CA)及200μg/ml G418磷酸鹽(Invitrogen,Grand Island,NY，編號30-234-CI)中。
為分析，可將HepProm_Luc細胞於不含抗生素之完全培養基中重懸至150,000個細胞/mL。可將0.1mL重懸HepProm_Luc細胞以15,000個細胞/孔添加至96孔微量滴定板(Corning,Lowell,MA，編號3917)中，且然後可在37℃下在5%(v/v)CO2下將細胞培育24小時。然後可去除培養基且在37℃下在5%(v/v)CO2下將細胞於含有0.1%(w/v)BSA(Invitrogen,Grand Island,NY，編號15260)之80μL OptiMEM I(Invitrogen,Grand Island,NY，編號31985)中饑餓5小時。
可將BMP6抗體(10×最終濃度)存於含有0.1%(w/v)BSA之OptiMEM I中之10μL添加至細胞中，使最終劑量範圍為0.2nM至20nM以供BMP-6誘導；使最終劑量範圍為7.8nM至1000nM以供BMP-5及BMP-7誘導，且使單點劑量最高為1000nM，以供BMP-2、BMP-4、BMP-9及BMP-10誘導。然後可添加10μL BMP配體(10×最終濃度)，使每一孔中之最終濃度為BMP-2(3.8nM)、BMP-4(3.8nM)、BMP-5(12.8nM)、BMP-6(3.4nM)、BMP-7(3.2nM)、BMP-9(0.8nM)或BMP-10(4.1nM)；可在37℃下在5%(v/v)CO2下將細胞培育22-24小時。可自細胞去除培養基，且可將50μL Glo溶解緩衝液(Promega,Madison,WI，編號E2661)添加至細胞中並在振盪2分鐘後於室溫下培育5分鐘。然後可將50μL Bright GloTM螢光素酶試劑(Promega,Madison,WI，編號E2620)添加至細胞中且在振盪30秒後於室溫下培育5分鐘。可在Wallac Victor儀器上經1秒/孔量測發光。
計算BMP-6抗體之抑制百分比時，可將不添加BMP-6抗體下BMP配體處理之平均發光設定為0%抑制，且可將不添加BMP-6抗體下無BMP配體處理之平均發光設定為100%抑制。可使用GraphPad Prism軟體(San Diego,CA)實施三或四參數曲線擬合分析。
在基本上如此實例3中所闡述實施之實驗中，抗體I及抗體II有效地抑制HepProm_Luc細胞之BMP-6誘導之海帕西啶啟動子螢光素酶活性(表5)；此抑制之有效性係MAB507的約22倍。
表6中之數據顯示，當在1000nM單點濃度下測試時與人類IgGPAA4對照相比，抗體I及抗體II不顯著抑制海帕西啶啟動子螢光素酶活性之BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、BMP-9及BMP-10誘導。抗體I及抗體II在此分析中顯示高於所測試BMP組之選擇性。然而，MAB507並不顯示針對BMP-6之選擇性，且與在1000nM(N=6)下抑制平均值為-1.7%之人類IgGPAA4對照相比，其在1000nM(N=2)下針對BMP-7之抑制平均值為54.2%。
實例4：在投與雄性食蟹猴單一靜脈內劑量後BMP-6抗體之藥物代謝動力學/藥物效應動力學研究
本發明抗體或其抗原結合片段之血清藥物代謝動力學/藥物效應動力學(PK/PD)可在投與正常雄性食蟹猴單一靜脈內劑量後來測試。可以1mL/kg之劑量體積向雄性食蟹猴注射抗體之單一靜脈內(IV)濃注劑量。自不同時間點下所採集之血清樣品，可量測血清鐵濃度、BMP-6抗體含量及海帕西啶含量。
對於藥物代謝動力學、血清海帕西啶及BMP-6量化，可在多個時間點自每一動物收集約1.5mL血液至不含抗凝劑之管中。可在離心獲得血清之前允許樣品在環境條件下凝塊；可於儲存在約-70℃下之前將樣品維持在濕冰上。對於臨床病理分析，可在多個時間點經由股靜脈自每一動物收集約0.5mL血液至不含抗凝劑之管中。可使用標準方法將該血液用於量測血清鐵、不飽和鐵結合能力、總鐵結合能力、鐵飽和%及標準血液學量測。海帕西啶濃度可如Murphy等人，Blood,110(3)：1048(2007)中所闡述來量測。
可使用人類總IgG ELISA來分析血清樣品之BMP-6抗體濃度。可將血清中之BMP-6抗體結合至96孔微量滴定板(Nunc Immobilizer Amino目錄編號436006)之抗人類κ輕鏈抗體包衣之孔且使用抗人類IgG4-HRP偶聯抗體(Southern Biotech，編號9200-05)來檢測。在分析中檢測上限及下限可分別為200ng/mL及10ng/mL。可使用4/5-參數演算法(StatLIA，3.2版)自大鼠血清中化合物之已知量製備之標準曲線來測定免疫反應性BMP-6抗體之濃度。藥物代謝動力學參數可使用Watson(7.4版生物分析LIMS)軟體包(Thermo Scientific)來計算。所計算之參數可包含曲線下面積(AUC0-∞)、表觀清除率(C1)及消除半衰期。
在基本上如此實例4中所闡述實施之實驗中，研究I作為單一靜脈內濃注投與0.3、1.0、3.0及10mg/kg劑量之抗體I。對照人類IgG4係以10mg/kg投用。研究I中之媒劑係磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)。投與抗體I 後量測每一動物投藥前(第-1天)及投藥後1、6、12、24、48、72、120、168、240、336、432、528及672小時以及研究日36、43、50及57時之藥物代謝動力學、血清鐵及血清海帕西啶反應之數據以量化藥物代謝動力學、血清海帕西啶及BMP-6。
在基本上如此實例4中所闡述實施之實驗中，研究II投與0.05、0.3及3.0mg/kg劑量之抗體I作為單一靜脈內濃注。對照人類IgG4係以3mg/kg投用。研究II中之媒劑係磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)加0.02%Tween80。投與抗體I後量測每一動物投藥前(第-1天)及投藥後1、6、12、24、48、72、120、168、240、336、432、528、672、840、1008、1176、1344、1512、1680及1848小時下之藥物代謝動力學、血清鐵及血清海帕西啶反應之數據。
在研究I及研究II中，在所檢驗之0.05mg/kg至10mg/kg範圍內，抗體I之最大血清濃度(C最大)以與劑量大致成比例的方式增加。在所檢驗之劑量範圍內，抗體I展示隨劑量增加清除率減小及消除半衰期增加之非線性藥物代謝動力學。在所檢驗之劑量範圍內，清除率自約0.57mL/hr/kg減小至約0.17mL/hr/kg。在所研究之時段及劑量範圍內，半衰期係介於約58小時至約295小時之間。
表8及表9中之藥物效應動力學數據顯示，抗體I之投與與血清鐵之初始立即增加相關，投藥後血清鐵之峰值出現在24小時時，然後在120-240小時時返回至接近基線(投藥前)的含量。在3mg/kg及10mg/kg劑量組中，血清鐵在240小時後以更大劑量依賴性方式再次增多；觀察到至研究結束時血清鐵持續增多。
抗體I投與亦與早在投藥後6小時至12小時即出現之食蟹猴血清海帕西啶之顯著減少相關。在研究II中，血清海帕西啶以劑量依賴性方式返回至基線，但海帕西啶返回至基線之此劑量依賴性在研究I中並不明顯。研究I中之人類IgG4對照抗體顯示血清海帕西啶減少，此在 研究II中並未重複出現。兩個研究亦顯示在抗體I存在下血清鐵含量之顯著變化，此與所觀察到之低血清海帕西啶含量不相關。
在投與雄性食蟹猴單一靜脈內劑量後HuA507之藥物代謝動力學/藥物 效應動力學研究
在基本上如此實例4中所闡述實施之實驗中，在投與正常雄性食蟹猴單一靜脈內劑量後測試HuA507之血清PK/PD。HuA507係由用人類IgG4PAA骨架替代來自R&D Systems之小鼠MAB507抗體恆定區製造之嵌合抗體。HuA507抗體或對照人類IgG4之單一靜脈內濃注10mg/kg劑量係以1mL/kg之體積給出。研究中之媒劑係磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)。收集投藥前(第1天)及投藥後1、6、12、24、48、72、96、168、264、336、432、528及624小時每一動物之血液以供分析。在10mg/kg劑量之HuA507抗體下，平均血清鐵濃度自投藥前之約150μg/ml增加至投藥後12小時時之約210μg/ml，但然後經48小時降至基線。與此實例4中所顯示之抗體I延長的藥物效應動力學效應不同，用HuA507治療僅顯示血清鐵濃度在48小時內之初始較短增加，但無使用抗體I可見之延長反應。
實例5：在大鼠ACD模型中之功效
可在大鼠ACD模型中量測本發明抗體或其抗原結合片段之功效。在8至10週齡雌性路易士大鼠(Lewis rat)中，可在第0天藉由革蘭氏陽性(gram-positive)細菌細胞壁提取物(Lee Labs，編號PG-PS 10S)之5mg/kg一次腹膜內劑量來誘導發炎。在無進一步處理下，可在用細胞壁提取物處理10天內在此模型中觀察到血紅素濃度降低。可在第8天藉助靜脈內投藥開始使用10mg/kg本發明抗體之治療且持續每週靜脈內投用該抗體。可量測血紅素、血清鐵及海帕西啶濃度且與使用HuIgG4對照治療可見之值比較。
對於臨床病理分析，可在多個時間點經由尾夾自每一動物收集約0.2mL血液至含有EDTA之管中。可使用標準方法將該血液用於量測血清鐵、不飽和鐵結合能力、總鐵結合能力、鐵飽和%及標準血液學量測。對於所有其他分析，可在多個時間點經由尾夾自每一動物收 集約0.75mL血液至不含抗凝劑之管中。
在基本上如此實例5中所闡述實施之實驗中，抗體I顯示延長的藥物效應動力學反應且在大部分天數至第60天研究結束時其血紅素及鐵在統計學上顯著高於hIgG4同種型對照。與對照相比，血紅素濃度增加約0.82-1.5g/dL。一旦開始抗體I治療，治療組中之紅血球之小紅血球性及低色素性即降低。基於紅血球特徵之變化，可推斷出，在研究中所觀察到之血紅素之增加係源自紅血球尺寸及細胞血紅素含量之正常化增加而非紅血球產生之增加。
胺基酸及核苷酸序列
SEQ ID NO：1 (人類BMP-6)
SEQ ID NO：2 (LCDR1-抗體I及抗體II)RSSENIYRNLA
SEQ ID NO：3 (LCDR2-抗體I及抗體II)AATNLAD
SEQ ID NO：4 (LCDR3-抗體I及抗體II)QGIWGTPLT
SEQ ID NO：5 (HCDR1-抗體I及抗體II)GYTFTSYAMH
SEQ ID NO：6 (HCDR2-抗體I)YINPYNDGTKYNENFKG
SEQ ID NO：7 (HCDR2-抗體II) YINPYNRGTKYNENFKG
SEQ ID NO：8 (HCDR3-抗體I及抗體II)RPFGNAMDI
SEQ ID NO：9 (LCVR-抗體I及抗體II)
SEQ ID NO：10 (HCVR-抗體I)
SEQ ID NO：11 (HCVR-抗體II)
SEQ ID NO：12 (LC-抗體I及抗體II)
SEQ ID NO：13 (HC-抗體I)
SEQ ID NO：14 (HC-抗體II)
SEQ ID NO：15 (LC DNA-抗體I及抗體II)
SEQ ID NO：16 (HC DNA-抗體I)
SEQ ID NO：17 (HC DNA-抗體II)
<110> 美國禮來大藥廠
<120> BMP-6抗體
<130> X19829
<150> 61/737,859
<151> 2012-12-17
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 490
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 4
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 6
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 7
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 12
<210> 13
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 13
<210> 14
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 14
<210> 15
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 15
<210> 16
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 16
<210> 17
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築物
<400> 17

Claims (16)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，其結合至人類BMP-6(SEQ ID NO：1)，其包括輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包括互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包括CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中該LCDR1係多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，該LCDR2係多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，該LCDR3係多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，該HCDR1係多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，該HCDR2係多肽YINPYNDGTKYNENFKG(SEQ ID NO：6)或YINPYNRGTKYNENFKG(SEQ ID NO：7)，且該HCDR3係多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該LCDR1係該多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，該LCDR2係該多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，該LCDR3係該多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，該HCDR1係該多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，該HCDR2係該多肽YINPYNDGTKYNENFKG(SEQ ID NO：6)，且該HCDR3係該多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
  3. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該LCDR1係該多肽RSSENIYRNLA(SEQ ID NO：2)，該LCDR2係該多肽AATNLAD(SEQ ID NO：3)，該LCDR3係該多肽QGIWGTPLT(SEQ ID NO：4)，該HCDR1係該多肽GYTFTSYAMH(SEQ ID NO：5)，該HCDR2係該多肽YINPYNRGTKYNENFKG(SEQ ID NO：7)，且該HCDR3係該多肽RPFGNAMDI(SEQ ID NO：8)。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包括LCVR及HCVR，其中該LCVR係多肽SEQ ID NO：9，且該HCVR係多肽SEQ ID NO： 10或SEQ ID NO：11。
  5. 如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中該LCVR係該多肽SEQ ID NO：9，且該HCVR係該多肽SEQ ID NO：10。
  6. 如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中該LCVR係該多肽SEQ ID NO：9，且該HCVR係該多肽SEQ ID NO：11。
  7. 如請求項1或4之抗體，其包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC係多肽SEQ ID NO：12，且該HC係多肽SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
  8. 如請求項7之抗體，其中該LC係該多肽SEQ ID NO：12，且該HC係該多肽SEQ ID NO：13。
  9. 如請求項7之抗體，其中該LC係該多肽SEQ ID NO：12，且該HC係該多肽SEQ ID NO：14。
  10. 如請求項1、4或7中任一項之抗體，其包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係該多肽SEQ ID NO：12，且每一重鏈係該多肽SEQ ID NO：13。
  11. 如請求項1、4或7中任一項之抗體，其包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係該多肽SEQ ID NO：12，且每一重鏈係該多肽SEQ ID NO：14。
  12. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  13. 一種如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造用來治療貧血之藥劑。
  14. 如請求項13之用途，其中該貧血為慢性疾病性貧血。
  15. 如請求項14之用途，其中該慢性疾病性貧血係選自由癌性貧血及慢性腎病性貧血組成之群。
  16. 一種如請求項1至11中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途， 其用於製造用來增加血清鐵含量、網狀紅血球計數、紅血球計數、血紅素及/或血球比容之藥劑。
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