TWI551610B - Ａｎｇ２抗體 - Google Patents

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Description

ANG2抗體
本發明係關於醫學領域。更特定而言，本發明係關於結合人類血管生成素-2(Ang2)之抗體，且可用於治療癌症、尤其腫瘤轉移，且與人類血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)抑制劑組合用於由VEGFR2及Ang2驅動之實體腫瘤，包含胃癌、肝細胞癌瘤、卵巢癌、結腸直腸癌及乳癌。
癌症之標誌係持續的新血管形成，稱為血管生成。血管生成素-1(Ang1)及Ang2係調控血管生成之關鍵路徑之成員；Ang1及Ang2係結合內皮細胞特異性受體酪胺酸激酶Tie2之分泌因子。Ang1由外周細胞組成型分泌且經由Tie2受體穩定血管完整性。Ang2僅因應於刺激(例如傷口癒合、腫瘤生長)自內皮細胞釋放且促進血管出芽並經由Tie2信號傳導抑制外周細胞-內皮細胞相互作用。研究表明，抑制Ang2較Ang1對於抑制血管發生更為重要，但在某些其他研究中，Ang2及Ang1之抑制已展示益處(Cascone等人，J Clin Onc(2012)30(4)：441)。
在與VEGF阻斷劑阿柏西普(aflibercept)組合投用時，抵抗人類Ang2之抗體已展示在小鼠異種移植物腫瘤模型中抑制腫瘤生長且降低腫瘤血管分佈(Daly等人，Cancer Res(2013)73(1)：108)中之REGN910及WO2011014469中之H1H685P)。在Brown等人(Mol Cancer Ther(2010)9(1)：145)中，mAb 3.19.3(人類Ang2抗體)據報導以小於Ang2至少500倍之親和力結合Ang1，而在WO2006068953之實例4及9 中，申請者揭示3.19.3對Ang1具有強交叉反應性，其中對Ang2之KD大約為5pM且對Ang1之KD大約為30pM。在SW620異種移植物研究中，組合投用3.19.3與DC101(結合鼠類VEGFR2之單株抗體)。
仍需要提供藉由以高親和力結合人類Ang2且中和人類Ang2來抑制Ang/Tie2血管發生路徑之替代抗體。特定而言，仍需要提供以高親和力結合人類Ang2且中和人類Ang2但並不以高親和力結合或中和人類Ang1之抗體。
因此，本發明之一實施例提供包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)之抗體，其中輕鏈包括輕鏈可變區(LCVR)且重鏈包括重鏈可變區(HCVR)，其中LCVR具有在SEQ ID NO：3中給出之胺基酸序列，且HCVR具有在SEQ ID NO：1中給出之胺基酸序列。
本發明之某些抗體以大於業內已知人類Ang2抗體之高親和力結合人類Ang-2。另外，本發明之某些抗體在腫瘤異種移植物模型(例如用於三陰性乳癌之EL 1997、用於卵巢癌之SKOV3x.1及用於前列腺癌之PC3)中顯示正性反應，從而指示其可作為癌症治療劑。另外，本發明之某些抗體較人類Ang-1選擇性結合人類Ang-2，且避免對人類Ang1之潛在脫靶責任。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體，其中LC具有在SEQ ID NO：4中給出之胺基酸序列，且HC具有在SEQ ID NO：2中給出之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供包括兩條輕鏈及兩條重鏈之抗體，其中每一輕鏈具有在SEQ ID NO：4中給出之胺基酸序列，且每一重鏈具有在SEQ ID NO：2中給出之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體，其中該等重鏈中之一者與該等輕鏈中之一者形成鏈間二硫鍵，且另一重鏈與另一輕鏈形成鏈間二硫鍵，且該等重鏈中之一者與另一重鏈形成兩個鏈間二硫鍵。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體，其中該抗體經糖基化。
在一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中輕鏈包括分別由胺基酸序列KASQDVYIAVA(SEQ ID NO：8)、YWASTRDT(SEQ ID NO：9)及HQYSSYPPT(SEQ ID NO：10)組成之輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中重鏈包括分別由胺基酸序列GYSFTDYNMV(SEQ ID NO：11)、YIDPYNGGTGYNQKFEG(SEQ ID NO：12)及ARTRDRYDVWYFDV(SEQ ID NO：13)組成之重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中輕鏈包括輕鏈可變區(LCVR)且重鏈包括重鏈可變區(HCVR)，其中LCVR具有在SEQ ID NO：3中給出之胺基酸序列，且HCVR具有在SEQ ID NO：1中給出之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其中LC具有在SEQ ID NO：4中給出之胺基酸序列，且HC具有在SEQ ID NO：2中給出之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈具有在SEQ ID NO：4中給出之胺基酸序列，且每一重鏈具有在SEQ ID NO：2中給出之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其中該等重鏈中之一者與該等輕鏈中之一者形成鏈間二硫鍵，且另一重鏈與另一輕鏈形成鏈間二硫鍵，且該等重鏈中之一者與另一重鏈形成兩個鏈間二硫鍵。
在另一實施例中，本發明提供結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其中該抗體經糖基化。
在另一實施例中，本發明提供對人類Ang2之解離平衡常數KD小於約150pM之本發明抗體。本發明抗體之特徵進一步在於人類Ang2之k締合速率約為1×106M-1sec-1。本發明抗體之特徵進一步在於人類Ang2之k解離速率約為0.7×10-4sec-1。藉由在37℃下之結合動力學如分析部分中之「結合動力學、親和力及選擇性」中所闡述來確立KD、k締合及k解離值。
本發明抗體以高親和力結合人類Ang2。出於本揭示內容目的，術語「高親和力」係指人類Ang2之KD小於約150pM。藉由37℃下之結合動力學如分析部分中之「結合動力學、親和力及選擇性」中所闡述來確立KD值。
在一實施例中，本發明提供包括DNA分子之哺乳動物細胞，該DNA分子包括：編碼具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之多肽之聚核苷酸序列；及編碼具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之多肽之聚核苷酸序列，其中該細胞能夠表現包括具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈的抗體。
在一實施例中，本發明提供產生包括具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈之抗體的製程，其包括在表現抗體之條件下培養本發明之哺乳動物細胞，且回收所表現抗體。
在一實施例中，本發明提供藉由本發明製程產生之抗體。
在一實施例中，本發明提供包括本發明抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。
在一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，本發明提供治療 癌症之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌瘤。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、脂質體多柔比星(doxorubicin)、多西他賽(docetaxel)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及多柔比星、諾維本(navelbine)、艾日布林(eribulin)、用於可注射懸浮液之紫杉醇(paclitaxel)蛋白結合顆粒、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他濱(capecitabine)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、FOLFOX(甲醯四氫葉酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及依立替康(irinotecan))及西土西單抗(cetuximab)。
在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明複合物且同時、單獨或依序組合投與一或多種選自由以下組成之群之免疫腫瘤學藥劑：尼沃魯單抗(nivolumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、皮裡株單抗(pidilizumab)、皮落株單抗(pembrolizumab)及杜瓦盧單抗(durvalumab)。
在一實施例中，本發明提供治療乳癌之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、多西他賽、環磷醯胺及多柔比星、諾維本、艾日布林、用於可注射懸浮液之紫杉醇蛋白結合顆粒、伊沙匹隆及卡培他濱。
在一實施例中，本發明提供治療卵巢癌之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與一或多種選自 由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、順鉑、卡鉑及脂質體多柔比星。
在一實施例中，本發明提供治療胃癌之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與雷莫蘆單抗。
在一實施例中，本發明提供治療肝細胞癌瘤之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與雷莫蘆單抗。
在一實施例中，本發明提供治療結腸直腸癌之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之本發明抗體。在另一實施例中，該等方法包括投與有效量之本發明抗體且同時、單獨或依序組合投與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及依立替康)及西土西單抗。
在一實施例中，本發明提供用於療法中之本發明抗體。在一實施例中，本發明提供用於治療癌症之本發明抗體。在另一實施例中，本發明提供用於治療癌症之本發明抗體，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌瘤。在另一實施例中，為用於治療癌症，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑、脂質體多柔比星、多西他賽、環磷醯胺及多柔比星、諾維本、艾日布林、用於可注射懸浮液之紫杉醇蛋白結合顆粒、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及依立替康)及西土西單抗。
在另一實施例中，為用於治療癌症，同時、單獨或依序組合投 與本發明複合物與一或多種選自由以下組成之群之免疫腫瘤學藥劑：尼沃魯單抗、伊匹單抗、皮裡株單抗、皮落株單抗及杜瓦盧單抗。
在一實施例中，本發明提供用於治療乳癌之本發明抗體。在另一實施例中，為用於使用治療乳癌，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、多西他賽、環磷醯胺及多柔比星、諾維本、艾日布林、用於可注射懸浮液之紫杉醇蛋白結合顆粒、伊沙匹隆及卡培他濱。
在一實施例中，本發明提供用於治療卵巢癌之本發明抗體。在另一實施例中，為用於治療卵巢癌，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、順鉑、卡鉑及脂質體多柔比星。
在一實施例中，本發明提供用於治療胃癌之本發明抗體。在另一實施例中，為用於治療胃癌，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與雷莫蘆單抗。
在一實施例中，本發明提供用於治療肝細胞癌瘤之本發明抗體。在另一實施例中，為用於治療肝細胞癌瘤，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與雷莫蘆單抗。
在一實施例中，本發明提供用於治療結腸直腸癌之本發明抗體。在另一實施例中，為用於治療結腸直腸癌，同時、單獨或依序組合投與本發明抗體與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑：雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及依立替康)及西土西單抗。
在另一實施例中，本發明提供本發明抗體用以製造用於治療癌症之醫藥之用途。在另一實施例中，本發明提供本發明抗體用以製造用於治療癌症之醫藥之用途，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌瘤。
在另一實施例中，本發明提供本發明抗體與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑同時、單獨或依序組合之用途：順鉑、卡鉑、脂質體多柔比星、多西他賽、環磷醯胺及多柔比星、諾維本、艾日布林、用於可注射懸浮液之紫杉醇蛋白結合顆粒、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及依立替康)及西土西單抗，其用以製造用於治療癌症之醫藥。
本發明抗體係經改造天然多肽複合物。本發明之DNA分子係天然DNA分子，其包括編碼具有本發明抗體中一種多肽之胺基酸序列之多肽之聚核苷酸序列。
本發明抗體經設計以具有經改造CDR且具有人類來源抗體(框架、鉸鏈區及恆定區之全部或一部分)中與源自人類基因組序列之框架及恆定區相同或實質上相同(實質上人類)之一些部分。全人類框架、鉸鏈區及恆定區係彼等人類種系序列以及具有天然體細胞突變之序列及彼等具有經改造突變者。本發明抗體可包括源自含有一或多種胺基酸取代、缺失或添加之全人類框架、鉸鏈或恆定區之框架、鉸鏈或恆定區。另外，本發明抗體較佳地在人類中係實質上非免疫原性。
本發明抗體係IgG型抗體且具有4個經由鏈內及鏈間二硫鍵交聯之胺基酸鏈(兩個「重」鏈及兩個「輕」鏈)。每一重鏈包括N末端HCVR及重鏈恆定區(「HCCR」)。每一輕鏈包括LCVR及輕鏈恆定區(「LCCR」)。在表現於某些生物系統中時，具有原始人類Fc序列之抗體在Fc區中發生糖基化。通常，糖基化發生於抗體之Fc區中之高度保守N-糖基化位點處。N-聚糖通常附接至天門冬醯胺。抗體亦可在其他位置處發生糖基化。
視情況，本發明抗體含有源自人類IgG4 Fc區之Fc部分，此乃因其參與Fc受體介導之發炎性機制或活化補體之能力降低，而使得效應物功能降低。
另外，某些本發明抗體含有IgG4-PAA Fc部分。IgG4-PAA Fc部分在229位處具有絲胺酸至脯胺酸突變，在235位處具有苯基丙胺酸至丙胺酸突變，且在236位處具有白胺酸至丙胺酸突變。S229P突變係防止形成半抗體(IgG4抗體中之半分子之動態交換現象)之鉸鏈突變。F235A及L236A突變另外減小先前低人類IgG4同種型之效應物功能。
HCVR及LCVR區可進一步細分成散佈有較保守區(稱為框架區(「FR」))之超變區(稱為互補決定區(「CDR」))。每一HCVR及LCVR係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端以下列順序配置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有大部分與抗原形成特異性相互作用之殘基。當前存在三種用於序列描述之抗體CDR指配系統。Kabat CDR定義(Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))係基於抗體序列可變性。Chothia CDR定義(Chothia等人，「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987)；Al-Lazikani等人，「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))係基於抗體之三維結構及CDR環之拓撲學。除HCDR1及HCDR2外，Chothia CDR定義與Kabat CDR定義相同。North CDR定義(North等人，「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))係 基於使用大量晶體結構之親和力傳播聚類。
出於本發明目的，使用三種方法之組合來定義CDRs。在輕鏈CDRs之情形，使用North CDR定義。在HCDR1之情形，使用Kabat及Chothia CDR定義之混合。HCDR1之Kabat定義始於重鏈之第一半胱胺酸之後的第九殘基且通常長度為5至7個殘基，而HCDR1之Chothia定義始於此半胱胺酸之後之第四殘基且通常長度為7至9個殘基。藉由Chothia起始位置及Kabat末端位置來定義本發明抗體之HCDR1。在HCDR2之情形，使用Kabat CDR定義。在HCDR3之情形，使用North、Kabat及Chothia CDR定義之混合。HCDR3之Kabat定義包括重鏈(本發明抗體之SEQ ID NO：2)之殘基99-110且通常始於半胱胺酸之後的三個殘基。HCDR3之Chothia定義與Kabat定義相同。HCDR3之North定義包括重鏈(本發明抗體之SEQ ID NO：2)之殘基97-110且通常始於緊鄰半胱胺酸殘基之後。藉由North起始位置及Kabat/Chothia/North末端位置來定義本發明抗體之HCDR3。
可藉由使編碼HCVR之DNA可操作地連接至另一編碼重鏈恆定區之DNA分子來將編碼HCVR區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。業內已知人類以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因之序列。可例如藉由標準PCR擴增獲得涵蓋該等區之DNA片段。
可藉由使編碼LCVR之DNA可操作地連接至另一編碼輕鏈恆定區之DNA分子來將編碼LCVR區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因。業內已知人類以及其他哺乳動物輕鏈恆定區基因之序列。可藉由標準PCR擴增獲得涵蓋該等區之DNA片段。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
本發明之多核苷酸將在將序列可操作地連接至表現控制序列之後在宿主細胞中表現。表現載體通常可在宿主生物體中作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之整合部分複製。通常，表現載體會含有選擇標記物(例如四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還 原酶)以使得可檢測彼等經期望DNA序列轉變之細胞。
本發明抗體可易於在哺乳動物細胞(例如CHO、NS0、HEK293或COS細胞)中產生。使用業內熟知之技術培養宿主細胞。
可藉由熟知方法將含有所關注多核苷酸序列(例如編碼抗體之多肽之多核苷酸及表現控制序列)之載體轉移至宿主細胞中，該等方法端視細胞宿主之類型而有所變化。
可採用各種蛋白質純化方法，且該等方法已為業內所知，且闡述於(例如)Deutscher,Methods in Enzymology 182：83-89(1990)及Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第3版，Springer，NY(1994)中。
在本發明之另一實施例中，以分離形式提供抗體或編碼其之核酸。如本文中所使用，術語「分離」係指不含或實質上不含發現於細胞環境中之任一其他大分子物質之蛋白質、肽或核酸。本文所用之「實質上不含」意指所關注蛋白質、肽或核酸包括大於80%(以莫耳計)、較佳地大於90%及更佳地大於95%之所存在大分子物質。
本發明抗體或包括其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑(例如皮下及靜脈內途徑)投與。可單獨將本發明抗體與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑以單一或多個劑量投與患者。本發明之醫藥組合物可藉由業內熟知之方法製得(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A.Gennaro等人，Mack Publishing公司)且包括如本文所揭示之抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
術語「治療(treating或treat或treatment)」係指減緩、中斷、阻止、緩解、停止、減輕或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度。
除非另外指示，否則本文提及抗體對人類Ang2之親和力所使用 之「結合」欲指小於約1×10-8M、較佳地小於約1×10-9M之KD，如基本上如本文所闡述藉由業內已知之常用方法(包含藉由使用表面電漿共振(SPR)生物感測器)在25℃或37℃下所測定。本文提及本發明複合物所使用之術語「選擇性(selective或selectivity)」係指複合物以低於複合物結合其他蛋白質(包含靶家族之成員，例如人類Ang1)約1000-、500-、200-、100-、50-或約10倍之KD結合靶(例如人類Ang2)，如藉由表面電漿共振在25℃或37℃下所量測。另外或另一選擇為，在藉由下文實例中所闡述之方法分析時，本發明之Ang2選擇性抗體結合人類Ang2，但並不結合或僅最小程度地結合人類Ang1。
「有效量」意指本發明抗體或包括本發明抗體之醫藥組合物針對組織、系統、動物、哺乳動物或人類誘發研究者、醫師或其他臨床醫師所尋求之生物或醫學反應或期望治療效應之量。抗體之有效量可根據諸如以下等因素而有所變化：疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及抗體於該個體內誘發期望反應之能力。有效量亦為治療有益效應勝過抗體之任何毒性或有害效應之量。
藉由下列非限制性實例來進一步闡釋本發明。
實例1：抗體表現及純化
重鏈及輕鏈之可變區之多肽、抗體A之完整重鏈及輕鏈胺基酸序列及編碼其之核苷酸序列列示於下文標題為「胺基酸及核苷酸序列」之部分中。此外，抗體A之輕鏈、重鏈、輕鏈可變區及重鏈可變區之SEQ ID NO展示於表1中。
可基本上如下所述製備本發明抗體(包含但不限於抗體A)並純化。可利用用於分泌抗體之表現系統使用最佳預定HC：LC載體比率(例如1：3或1：2)或編碼HC及LC之單一載體系統瞬時或穩定轉染適當宿主細胞(例如HEK 293或CHO)。可使用許多常用技術中之任一者純化分泌抗體之經淨化培養基。舉例而言，可將培養基便利地施加至經相 容緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4))平衡之MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare，用於Fab片段)。可洗滌管柱以去除非特異性結合組份。可(例如)藉由pH梯度(例如20mM pH 7 Tris緩衝液至10mM pH 3.0檸檬酸鈉緩衝液或pH 7.4磷酸鹽緩衝鹽水至100mM pH 3.0甘胺酸緩衝液)洗脫結合抗體。可(例如)藉由SDS-PAGE檢測抗體部分，且然後可彙集。端視預期用途，視情況進行其他純化。可使用常用技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可藉由常用技術(包含尺寸排除、疏水性相互作用、離子交換、多態或羥基磷灰石層析)有效去除可溶性聚集物及多聚體。抗體在該等層析步驟之後之純度大於95%。可立即在-70℃下冷凍產物或可凍乾。
分析 結合動力學、親和力及選擇性
可在25℃或37℃下藉由使用面電漿共振(SPR)生物感測器(例如BIAcore® 2000、BIAcore® 3000或BIAcore® T100(GE Healthcare))根據業內已知方法測定本發明抗體對可溶性Ang2之多種物種(例如人類、食蟹猴、小鼠、兔及狗)之結合動力學、親和力及選擇性。
可自R&D Systems購買Human Ang2。可使用下列方法製備用於捕獲抗體之蛋白質A表面。可使用EDC/NHS胺偶合方法(Biacore編號：BR-1000-50)將可溶性蛋白質A(Calbiochem，編號：539202)固定於CM4(Biacore編號：BR-1005-34)或CM5(Biacore編號：BR-1000- 99)上。簡言之，可藉由以5μl/min或10μL/min注入EDC/NHS之1：1混合物7分鐘來活化所有4個流通池之表面。然後，可將可溶性蛋白質A在10mM pH 4.5乙酸鹽緩衝液中稀釋，且以5μl/min或10μL/min之流速在流通池(Fc)2、3或4上固定7分鐘。可藉由以5μl/min或10μL/min注入乙醇胺7分鐘來阻斷仍保留於晶片表面上之未反應位點。運行緩衝液可為HBS-EP+(Biacore編號：BR-1006-69)。可以1μg/mL或2μg/mL藉由稀釋至運行緩衝液中來製備抗體試樣。可使用兩倍連續稀釋在運行緩衝液中製備介於200nM至3.1nM之間之分散濃度之Ang2配體。每一分析循環可由以下5個單獨步驟之系列組成：(1)將抗體捕獲於單獨流通池(Fc2、Fc3及Fc4)上，(2)以50μL/min將250μL(300分鐘表面接觸時間)分散濃度之Ang2注入(使用kinject)所有Fc上，(3)返回緩衝流20分鐘以監測解離相，(4)使用10mM pH 1.5甘胺酸之10μL(30分鐘接觸時間)注入再生晶片表面，(5)使用HBS-EP+運行緩衝液之15μL(45分鐘接觸時間)注入平衡晶片表面。可使用標準雙重參照處理所得數據且使用Biacore 2000評估軟體4.1版擬合至1：1結合模型以測定締合速率(k締合，單位為M-1s-1)、解離速率(k解離，單位為s-1)。可自下列關係KD=k解離/k締合來計算平衡解離常數(KD)，且以莫耳單位形式呈現。
H1H685P-293HEK係表現於293HEK細胞中之人類IgG1 Ang2抗體，其利用HCVR序列(來自WO2011014469之SEQ ID NO：18)及LCVR序列(來自WO2011014469之SEQ ID NO：20)。3.19.3-293HEK係表現於293HEK細胞中之人類IgG1抗體，其結合Ang2且利用3.19.3 HCVR序列(來自WO2009097325之SEQ ID NO：2)及MEDI1 LCVR序列(來自WO2009097325之SEQ ID NO：3)。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，抗體A以分別大約低於H1H685P-293HEK及3.19.3-293HEK4倍及8倍之KD結合人類Ang2 (表2)。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，抗體A分別以80、107、109、210及140pM之親和力結合人類、食蟹猴、小鼠、兔及狗Ang2(表3)。
使用Kinexa之親和力量測
可使用KinExA 3200儀器(Sapidyne Inst.公司)量測結合動力學。簡言之，可使人類Ang2共價偶合至瓊脂糖珠粒且可在KinExA 3200上檢測自由Mab與珠粒之結合。為量測KD，可將含有Mab(1pM、2pM或5pM)且具有降低濃度之連續稀釋人類Ang2之個別管在25℃下於含有1mg/ml BSA之PBS中培育數天。在培育之後，可測定每一平衡試樣中之自由Mab。可使用N-曲線分析利用KinExA軟體測定Kd值。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，抗體A以低於 H1H685P-293HEK約8倍之KD結合人類Ang2(表4)。
抗體A經由固相ELISA分析抑制人類Ang2與人類Tie2之相互作用
可在固相活體外ELISA分析中量測本發明抗體對人類Ang2與其受體人類Tie 2之結合之阻斷。
對於分析而言，可在室溫下使用4μg/ml(100μl)重組人類Tie2-Fc(R&D Systems編號：313-TI)過夜塗覆高結合96孔ELISA板(Costar編號：2592)。可使用TBST(Tris緩衝鹽水，含有0.05% Tween 20)將板洗滌3次且然後可使用300μl/孔阻斷緩衝液(0.5% BSA/D-PBS)(BSA：Jackson ImmunoResearch編號：001-000-162；無IgG，無蛋白酶)在室溫下於軌道振盪器上阻斷1-2小時。在阻斷步驟期間，在單獨聚丙烯多孔板中，可添加75μl 2X測試抗體(以1：3連續稀釋於阻斷緩衝液中)以及75μl 2X生物素化人類Ang2(R&D Systems：BT623)(亦稀釋於阻斷緩衝液中)。然後可將抗體/生物素化Ang2混合物在37℃下培育1小時(最終生物素化Ang2濃度為100ng/ml)。可自Tie2-Fc塗覆之ELISA板去除阻斷溶液，然後可添加50μl/孔抗體/生物素化Ang2混合物(在多個孔中)。然後可將板在軌道振盪器上於室溫下培育2小時，使用板密封器覆蓋。然後可將板洗滌3次，隨後可添加100μl/孔鏈黴抗生物素-HRP(R&D Systems編號：DY998，可以1：200稀釋於阻斷緩衝液中)。然後可將板在軌道振盪器上於室溫下培育45分鐘，使用板密封器覆蓋。然後可將板再次洗滌3次。
然後可藉由添加100μl/孔單組份TMB受質(可升溫至室溫)(Surmodics/BioFX Labs編號：TMBW-1000-01)來使板顯色。可使染色 在室溫下進行10分鐘(可使用鋁箔覆蓋板)。可使用100μl/孔酸終止溶液(TMB終止溶液，Surmodics/BioFX Labs編號：LSTP-1000-01)終止顯色。可在軌道振盪器上混合板，然後可在450nm下於ELISA讀取儀(Molecular Devices SpectraMax 190)上使用SOFTmax PRO 5.4.1軟體(Molecular Devices公司)進行讀數。A450值反映了保留結合Tie-2-Fc之生物素化Ang2之量。A450值之減小反映了生物素Ang2與Tie-2-Fc之結合之阻斷。
可利用GraphPad Prism 6使用Log轉變之X值計算Ang2結合Tie-2之抑制之IC50值。可對log轉變數據實施非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應，可變斜率)以獲得IC50值。若實施實驗一次以上，則可計算實驗之間之幾何平均IC50值(及95%置信區間)。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，抗體A以劑量依賴性方式特異性阻斷Ang2與Tie-2之結合，從而得到0.027nM之幾何平均IC50值(n=2)(95%置信區間0.00089-0.8029nM)。抗體A及H1H685P-293HEK具有相當之中和IC50值。
Ang2誘導之Tie-2磷酸化而非Ang1調介之磷酸化之中和。
可在基於細胞之分析中量測本發明抗體對人類Tie-2之基於細胞之活體外抑制，其中Ang1及Ang2以劑量依賴性方式結合人類Tie-2且誘導人類Tie-2磷酸化。可使用基於細胞之活體外分析評估抗體A以劑量依賴性方式選擇性中和Ang2而非Ang1調介之Tie-2受體磷酸化的能力。可分別包含Ang2抗體、Ang1/2交叉反應性抗體及對照人類IgG4PAA同種型抗體作為陽性及陰性對照。
可藉由穩定轉染全長人類Tie-2受體(使用C末端處之3X FLAG標籤)來生成CHO-Tie-2細胞系。可在Hams F-12(CellGro/Mediatech編號：10-080-CV)、10%熱失活FBS(Life Technologies/Invitrogen編號：10082-147)、1X抗生素抗真菌劑(Life Technologies/Invitrogen編號： 15240-062)、1.25mg/ml G418(Corning Cellgro編號：30-234-CI)、10μg/ml嘌呤黴素(Calbiochem編號：540411)及0.078%碳酸氫鈉(Thermo Hyclone編號：SH30033.01)之完整培養基中維持CHO-Tie-2細胞。
對於分析，可將CHO-Tie-2細胞以10,000個細胞/孔(在100ul生長培養基中)再懸浮至聚離胺酸塗覆之96孔板(BD Biocoat編號356640)之60個內部孔中。可將200μl D-PBS置於邊緣孔中以減小蒸發。可將細胞在37℃、95% RH、5% CO2下培育過夜。第二天，可將細胞洗一次且可用100μl含有0.1% BSA之無血清生長培養基(Sigma編號A7979，低內毒素)替換培養基。然後可使細胞在37℃、95% RH、5% CO2下於無血清培養基中饑餓7.5至24小時。在饑餓時段期間，可將抗體(以6×最終濃度)以1：2連續稀釋於聚丙烯板中含有0.1% BSA之無血清生長培養基中。亦可將人類Ang2(R&D Systems編號623-AN，重構於D-PBS/0.1% BSA中)及人類Ang1(R&D Systems編號923-AN，重構於D-PBS/0.1% BSA中)在含有0.1% BSA之無血清生長培養基中稀釋至6×最終濃度。然後可將抗體及Ang2或Ang1配體以1：1比率混合於聚丙烯板中且可在37℃培育1小時。然後可將抗體/配體混合物以50μl/孔添加至細胞中(每一處理三個孔)且可在37℃、95% RH、5% CO2下培育13分鐘至21小時。抗體之最終濃度範圍可為0.0625-283nM，且人類Ang2及Ang1之最終濃度分別可為0.3μg/ml(約6nM)及0.5μg/ml(約8.9nM)。在培育時間之後，可迅速且完全自細胞去除培養基，且可在60μl/孔冷1X Tris溶解緩衝液(Meso Scale Discovery編號R60TX；150mM NaCl、20mM Tris pH 7.5、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100)中溶解細胞，該緩衝液可含有新添加之蛋白酶及磷酸酶抑制劑(1X蛋白酶抑制劑混合製劑，Sigma編號P8340；1X磷酸酶抑制劑混合製劑2，Sigma編號P5726；1X磷酸酶抑制劑混合製劑3，Sigma編號P0044；1mM最終活化原釩酸鈉(EMD Chemicals編號567540))。 然後可將板置於冰上10分鐘，隨後可將其在4℃置於低速軌道振盪器上25分鐘。然後可密封板且在-80℃冷凍。
在分析磷酸-Tie-2(使用來自R&D Systems之人類磷酸-Tie-2 DuoSet ELISA套組，編號DYC2720)前一天，可在4℃使用於1X ELISA塗覆緩衝液(Surmodics/BioFX Labs編號COAT-1000-01)中之4μg/ml小鼠抗人類總Tie-2捕獲抗體塗覆高結合之ELISA板(Greiner BioOne，編號655081)過夜。
在量測磷酸-Tie-2當天，可將含有溶解物之板在冰上解凍。可使用洗滌緩衝液(1X TBST，含有0.05% Tween 20)洗滌經塗覆ELISA板且使用300μl/孔阻斷緩衝液(1% BSA(Jackson ImmunoResearch編號：001-000-162；無IgG，無蛋白酶)、0.01%疊氮化鈉)在室溫下於軌道振盪器上阻斷最少1小時(同時使用板密封器覆蓋)。在阻斷期間，可將溶解物以1：5或1：10稀釋於聚丙烯板中含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之冷溶解緩衝液中。可阻斷ELISA板且洗滌4次，且可添加100μl/孔稀釋溶解物(或磷酸-Tie-2 ELISA標準)並在室溫下於軌道振盪器上培育2小時，使用密封器覆蓋。可將板洗滌4次且可添加100μl/孔HRP偶聯小鼠抗磷酸酪胺酸(如所推薦稀釋於小瓶中之TBST/0.1% BSA中)。然後可使用密封器覆蓋板，且在室溫下於軌道振盪器上培育2小時。然後可將板洗滌6次且可確保自孔去除液體。然後可藉由添加100μl/孔單組份TMB受質(Surmodics/BioFX Labs編號：TMBW-1000-01)來使板顯色。可使板在室溫下顯色20或30分鐘，使用鋁箔覆蓋。可使用100μl/孔酸終止溶液(TMB終止溶液，Surmodics/BioFX Labs編號：LSTP-1000-01)終止顯色。然後可在軌道振盪器上混合板。可在450nm下於ELISA讀取儀(Molecular Devices SpectraMax 190)上使用SOFTmax PRO 5.4.1軟體(Molecular Devices公司)讀取ELISA板。可自標準曲線(4參數邏輯擬合)獲得試樣之磷酸-Tie-2值，且乘以稀釋因子5或10。 可藉由下式來計算抑制百分比：(處理pTie2值-單獨Ang2處理之平均pTie2值)/(平均單獨培養基pTie2值-Ang2單獨處理之平均pTie2值)*100。
可利用GraphPad Prism 4使用Log轉變之X值計算Ang2誘導之磷酸-Tie-2之抑制之IC50值。可對log轉變數據實施非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應，可變斜率)以獲得IC50值。若實施實驗一次以上，則可計算實驗之間之幾何平均IC50值(及95%置信區間)。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，抗體A以0.773nM之IC50(95%置信區間0.412-1.45nM)劑量依賴性地中和CHO-Tie-2細胞中之人類Ang2誘導之磷酸-Tie-2(n=3)。另外，在與抗Ang1/2交叉反應性抗體3.19.3-293HEK相比時，抗體A並不中和CHO-Tie-2細胞中之人類Ang1誘導之磷酸-Tie-2。抗體A及H1H685P-293HEK具有相當之Ang2中和IC50值。
Ang2誘導之血管發育之抑制。
可在小鼠視網膜之血管發育模型中量測Ang2抗體對生理學血管生成之活體內抑制。可使用上述分析研究本發明抗體抑制小鼠視網膜中之生理學血管生成之能力。
對於此分析而言，可將懷孕雌性之小鼠幼崽分娩之日標記為P0(出生後第0天)。在分娩後，在第二天及第四天(P2及P4)，可向幼崽注入媒劑對照(PBS)或10mg/kg抗體A。在P5，可將小鼠處死且可收穫眼睛，且可固定於福爾馬林(formalin)中5小時並可使用PBS洗滌。
然後可解剖視網膜，且可使用以1：200稀釋之抗CD31(BD Pharmingen；純系MEC 13.3；目錄編號：553370)及以1：200稀釋之抗SMA-FTIC(Sigma；Clone1A4，目錄編號：F3777)染色。對於抗CD31處理之視網膜而言，可使用以1：400稀釋之抗Rat Alexa-647(Jackson Immuno Research；目錄編號：712-606-153)作為二級抗體。可藉由使 用Nikon Ti來獲取視網膜，且可藉由使用FIJI軟體來量化血管進展、根尖細胞數及重塑叢之血管密度。可使用共聚焦Nikon A1獲取高放大率影像。
在基本上如此分析中所闡述實施之實驗中，在與PBS對照組相比時，在3mg/kg、10mg/kg及30mg/kg下類似地，抗體A抑制血管進展，減小內皮尖端細胞數及血管密度，以及增加外周細胞覆蓋度。在與PBS對照組相比時，對於所有治療組而言，此數據具有統計學顯著性且p<0.0001(表5)。
抗體A在PC3前列腺癌異種移植物模型中之活體內抗血管生成效應
可在PC3前列腺癌異種移植物模型中評估Ang2抗體及Ang2抗體與VEGFR2抗體之組合之抗血管生成效應。
可使用對照IgG1、DC101(抗VEGFR2鼠類抗體)、抗體A、DC101+抗體A經6天(2QW；20mg/kg)治療具有體積大約為250mm3之PC3異種移植物腫瘤之小鼠(以10隻小鼠/組隨機化)。在6天之後，可收集腫瘤，固定且切分。可對所切分腫瘤之CD105進行染色且可測定總血管面積。
在基本上如所闡述實施之實驗中，在與對照IgG1組相比時，總血管面積在DC101治療組中減小65%，在抗體A治療組中減小69%，且在組合治療組中減小84%。在與IgG1對照組相比時，對於所有治療組而言，該等結果具有統計學顯著性且p<0.0001。
抗體A及抗VEGFR2抗體抑制活體內腫瘤生長
可經由活體內異種移植物模型量測本發明抗體之效能。可在皮下三陰性患者源乳癌模型(EL1997)及皮下卵巢異種移植物模型(SKOV3x.1)中評價DC101(抗VEGFR2鼠類抗體)、抗體A及其組合之 抗腫瘤效能。可使用稀釋於PBS中之抗體每週兩次經由腹膜腔內注射治療具有腫瘤之小鼠。可藉由在治療過程期間每週兩次進行腫瘤體積之三維卡尺量測來測定腫瘤生長。
EL1997三陰性乳房患者源異種移植物：可使用媒劑對照、DC101單一療法(以20mg/kg)、抗體A單一療法(以20mg/kg)、環磷醯胺及多柔比星組合(分別以100mg/kg及10mg/kg)、DC101及抗體A組合或環磷醯胺、多柔比星、DC101及抗體A組合(以各別單一療法濃度投用)治療具有體積大約為350mm3之EL1997三陰性乳房患者源異種移植物(TNBC PDX)之免疫缺陷小鼠(以n=7隻小鼠/組隨機化)。可每週兩次投與治療並連續進行4週。
在基本上如所闡述實施之實驗中，DC101及抗體A單一療法治療組展現分別35.2%及56.7%之T/C%(腫瘤體積變化)。兩條抗體DC101及抗體A之組合得到19.9%之T/C%。另外，環磷醯胺、多柔比星、DC101及抗體A之組合得到0.4%之T/C%，且腫瘤體積在與DC101及抗體A之組合相比時具有統計學顯著性(p=0.0019)減小。單獨化學治療劑環磷醯胺及多柔比星之組合治療得到32%之TC%。該等結果指示，使用DC101或抗體A之單一療法治療較為高效，且其組合可能具有更大效能；添加化學治療劑會進一步增強效能。
SKOV3x.1卵巢異種移植物：可使用媒劑對照、抗體A單一療法(以3、10或30mg/kg)、紫杉醇單一療法(以25mg/kg)或紫杉醇及抗體A之組合(分別以25mg/kg及10mg/kg)治療具有體積大約為350mm3之SKOV3x.1卵巢異種移植物之免疫缺陷小鼠(以n=10隻小鼠/組隨機化)。可每週兩次投與治療並持續4週。
在基本上如所闡述實施之實驗中，結果展示3、10及30mg/kg劑量之抗體A之T/C%值分別為39.1、32.5及27.3且25mg/kg紫杉醇單一療法的T/C%為20.3，其中與對照相比p值<0.001。在與媒劑對照組相 比時，25mg/kg紫杉醇及10mg/kg抗體A之組合增強兩條單一療法之效能，且展示T/C%為7.1%。
SKOV3x.1卵巢異種移植物：可使用媒劑對照、DC101單一療法(以20mg/kg)、紫杉醇單一療法(以25mg/kg)、DC101及抗體A組合(各自25mg/kg)或紫杉醇DC101及抗體A組合(以各別單一療法濃度投用)治療具有體積大約為250mm3之SKOV3x.1卵巢異種移植物之免疫缺陷小鼠(以n=10隻小鼠/組隨機化)。可每週兩次投與治療並持續4週。
在基本上如所闡述實施之實驗中，DC101之單一療法治療得到9.6%之T/C%，而兩種抗體DC101及抗體A之組合在與媒劑對照組相比時得到0.1%之改良T/C%。與紫杉醇單一療法之17.8%之T/C%相比，紫杉醇DC101及抗體A之組合得到約-33%之腫瘤消退。該等結果指示，在異種移植物模型中，使用DC101之VEGFR2抑制在與抗體A組合時可能具有更大效能。此組合之益處在添加化學治療劑下得到進一步增強，從而使得腫瘤體積發生統計學顯著性消退。
胺基酸及核苷酸序列
SEQ ID NO：1(抗體A之HCVR)
SEQ ID NO：2(抗體A之HC)
SEQ ID NO：3(抗體A之LCVR)
SEQ ID NO：4(抗體A之LC)
SEQ ID NO：5(抗體A之LC之DNA)
SEQ ID NO：6(抗體A之HC之DNA)
SEQ ID NO：7(人類Ang2)
SEQ ID NO：8(抗體A之LCDR1)KASQDVYIAVA
SEQ ID NO：9(抗體A之LCDR2)YWASTRDT
SEQ ID NO：10(抗體A之LCDR3) HQYSSYPPT
SEQ ID NO：11(抗體A之HCDR1)GYSFTDYNMV
SEQ ID NO：12(抗體A之HCDR2)YIDPYNGGTGYNQKFEG
SEQ ID NO：13(抗體A之HCDR3)
<110> 美國禮來大藥廠
<120> ANG2抗體
<130> X20280
<150> 62/000,253
<151> 2014-05-19
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成構築體
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13

Claims (18)

  1. 一種結合人類Ang2(SEQ ID NO：7)之抗體，其包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該輕鏈包括分別由胺基酸序列KASQDVYIAVA(SEQ ID NO：8)、YWASTRDT(SEQ ID NO：9)及HQYSSYPPT(SEQ ID NO：10)組成之輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，且其中該重鏈包括分別由胺基酸序列GYSFTDYNMV(SEQ ID NO：11)、YIDPYNGGTGYNQKFEG(SEQ ID NO：12)及ARTRDRYDVWYFDV(SEQ ID NO：13)組成之重鏈互補決定區HCDRI、HCDR2及HCDR3。
  2. 一種抗體，其包括輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該輕鏈包括輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包括重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR具有示於SEQ ID NO：3中之胺基酸序列，且該HCVR具有示於SEQ ID NO：1中之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2中任一項之抗體，其中該LC具有示於SEQ ID NO：4中之胺基酸序列，且該HC具有示於SEQ ID NO：2中之胺基酸序列。
  4. 如請求項2之抗體，其包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈具有示於SEQ ID NO：4中之胺基酸序列，且各重鏈具有示於SEQ ID NO：2中之胺基酸序列。
  5. 如請求項2之抗體，其中該等重鏈中之一者與該等輕鏈中之一者形成鏈間二硫鍵，且另一重鏈與另一輕鏈形成鏈間二硫鍵，且該等重鏈中之一者與另一重鏈形成兩個鏈間二硫鍵。
  6. 如請求項2之抗體，其中該抗體經糖基化。
  7. 如請求項1或2之抗體，其用於療法中。
  8. 如請求項1或2之抗體，其用於治療癌症。
  9. 如請求項8之抗體，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。
  10. 如請求項1或2之抗體，其與雷莫蘆單抗同時、各別或依序組合用於治療癌症。
  11. 如請求項10之抗體，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。
  12. 一種包括DNA分子之哺乳動物細胞，該DNA分子包括編碼具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之多肽之聚核苷酸序列及編碼具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之多肽之聚核苷酸序列，其中該細胞能夠表現包括具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈的抗體。
  13. 一種產生包括具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列之輕鏈及具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈之抗體的方法，其包括使如請求項12之哺乳動物細胞在表現該抗體之條件下培養，及回收該表現之抗體。
  14. 一種抗體，其係藉由如請求項13之方法產生。
  15. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至6或14中任一項之抗體及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  16. 一種如請求項1至6或14中任一項之抗體之用途，其用以製造用於治療癌症之醫藥。
  17. 如請求項16之用途，其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。
  18. 如請求項16或17之用途，其中該醫藥擬與有效量之雷莫蘆單抗(ramucirumah)同時、各別或依序投與。
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