TW202126700A - 一種融合蛋白及其應用 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及一種融合蛋白,其包括人TGFBRII或其片段以及特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。本申請還提供了上述融合蛋白在製備藥物中的應用,上述藥物用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
Description
本申請涉及生物醫藥領域,具體的涉及一種抗PD-L1和抗TGFB的融合蛋白及其應用。
程式性死亡受體配體1(PD-L1),也稱為分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7-H1),是一個40KDa的I型跨膜蛋白,一般在活化的T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及許多非造血細胞上表達。
PD-L1能與程式性死亡受體1(PD-1)結合。其中PD-L1/PD-1信號通路是免疫反應中非常重要的共抑制信號途徑,負調節T細胞免疫應答,抑制T細胞活性,減弱細胞因數的分泌。研究發現PD-L1能在許多腫瘤組織中表達,包括胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、肥大細胞性腫瘤以及惡性黑色素瘤等,以及在浸潤腫瘤微環境的骨髓細胞中表達,保護腫瘤細胞逃避免疫攻擊。轉化生長因數-B(TGFB)是對免疫系統有顯著影響的強效細胞因數,參與許多增殖性和非增殖性細胞過程,如細胞增殖和分化、胚胎發育、細胞外基質形成、骨骼發育、傷口癒合、造血作用以及免疫和炎症反應。現有治療技術手段無論是化學療法或是腫瘤靶向療法,影響其療效的一個重要瓶頸是腫瘤細胞產生免疫耐受。腫瘤細胞在腫瘤微環境中利用多種免疫抑制機制來逃避機體免疫系
統識別和攻擊,這些免疫抑制機制包括免疫抑制型的細胞因子(如TGFB)、調節性T細胞(Tregs)、共抑制信號通路分子、髓系抑制性細胞等等。
免疫抑制的多種機制可能會阻礙免疫治療具有有效性。在一些情況下,腫瘤對於單藥免疫治療來說是難治的並且只有一小部分的癌症有完全反應。因此,研發具備阻斷PD-L1/PD-1信號通路能力的藥物以及在抑制PD-1/PD-L1通路的基礎上靶向中和腫瘤微環境的免疫抑制型細胞因數TGFB,能為腫瘤及多種免疫系統相關疾病的治療帶來全新的解決方法。
本申請提供了一種融合蛋白,其包括人TGFBRII或其片段以及特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。本申請還提供了該融合蛋白在預防和治療腫瘤或癌症中的應用。
一方面,本申請提供了一種融合蛋白,其包含:a)人TGFBRII或其片段;以及b)特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段;其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,以及LCDR1,LCDR2和LCDR3;該HCDR1包含SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列,該HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列,該HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列,該LCDR1包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列,該LCDR2包含SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列,且該LCDR3包含SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列;該CDR序列使用Chothia定義規則來定義(見表1)。
在某些實施方式中,該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列,且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈,且該抗體重鏈與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成融合多肽。
在某些實施方式中,該抗體重鏈的C端與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
在某些實施方式中,該人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外結構域。
在某些實施方式中,該人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NO:56-57中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區,且該重鏈恆定區為人IgG1恆定區。
在某些實施方式中,該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段還包含輕鏈恆定區。
在某些實施方式中,該輕鏈恆定區包含人Ig κ恆定區。
在某些實施方式中,該融合蛋白包含第一多肽和第二多肽,其中該第一多肽包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列;且該第二多肽包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該融合蛋白包含兩條該第一多肽以及兩條該第二多肽。
另一方面,本申請還提供了分離的核酸分子,其包含編碼該融合蛋白或其功能性片段的多核苷酸。
另一方面,本申請還提供了藥物組合物,其包含該融合蛋白,或該核酸分子,以及任選地藥學上可接受的載體。
該融合蛋白,或該核酸分子用於製備藥物的用途,該藥物用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症包括結腸癌。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
另一方面,本申請還提供了該融合蛋白,或該核酸分子,其用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症包括結腸癌。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
另一方面,本申請還提供了治療受試者中的癌症、抑制受試者中腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖的方法,該方法包括向該受試者或該腫瘤細胞施用該融合蛋白,或該核酸分子。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症包括結腸癌。
在某些實施方式中,該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方
式。如本領域技術人員將認識到的,本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地,本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的,而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下:
圖1 顯示的是本申請的融合蛋白體外結合人源PD-L1;
圖2 顯示的是本申請的融合蛋白體外結合人源TGFB1;
圖3 顯示的是本申請的融合蛋白體外阻斷PD-L1和PD-1的結合;
圖4 顯示的是本申請的融合蛋白抑制TGFB/Smad信號通路的啟動;
圖5 顯示的是本申請的融合蛋白增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2;
圖6 顯示的是本申請的融合蛋白增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ;
圖7 顯示的是本申請的融合蛋白藥物代謝動力學結果;
圖8 顯示的是本申請的融合蛋白對CT26-人PD-1/PD-L1雙剔除小鼠的腫瘤抑制效果,A:腫瘤體積變化,B:小鼠體重變化。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式,熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中,術語“抗體或其抗原結合片段”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質,以及任選地允許結合抗原的部分採用促進抗體或其抗原結合片段與抗原結合的構象的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高變區,它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成,它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列:FR-1、CDR1、FR-2、CDR2、FR-3、CDR3和FR-4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體或其抗原結合片段的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab,Fab’,F(ab)2,Fv片段,F(ab’)2,scFv,di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等,只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中,術語“融合蛋白”通常是指由兩種或多種多肽構成的蛋白質,在天然狀態下通常不結合,但是各自的胺基和羧基末端可藉由直接或間接結合在一起以形成一個連續多肽。在某些情形中,提及本申請所述的融合蛋白時,術語“融合蛋白”可與“蛋白質”互換的使用。在某些情形中,提及本申請所述的融合蛋白時,術語“融合蛋白”可與“抗體”互換的使用。
在本申請中,術語“Fab”通常是指含有重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域的片段,並且還含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1);術語“Fab'''通常是指在重鏈CH1結構域的羧基端添加少量殘基(包括一個或多個
來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab的片段;術語“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚體,包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。術語“Fv”通常是指含有完整抗原識別與結合位點的最小抗體片段。在某些情形中,該片段可以由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區以緊密非共價結合的二聚體組成;術語“dsFv”通常是指二硫鍵穩定的Fv片段,其單個輕鏈可變區與單個重鏈可變區之間的鍵是二硫鍵。術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段。在本申請中,術語“scFv”通常是指抗體的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域藉由柔性肽連接子共價連接配對形成的單價分子;此類scFv分子可具有一般結構:NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
在本申請中,術語“可變”通常是指這樣的事實,即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈,它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而,變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段,被稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區(H-FR1,H-FR2,H-FR3,H-FR4,L-FR1,L-FR2,L-FR3,L-FR4),大部分採用β-折疊構型,藉由三個CDR結構環區連接。每條鏈中的CDRs藉由FR區緊密靠近在一起,並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點,恆定區不直接參與抗體與抗原的結合,但是它們表現出不同的效應功能,例如參與抗體依賴的細胞毒性。在本領域中,可以藉由多種方法來定義抗體的CDR,例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見,Kabat等人,免疫學的蛋白質序列,第五版,美國國立衛生研究院,貝塞斯達,馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見,A1-Lazikani等人,J Mol Biol 273:927-48,1997)。
在本申請中,還使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列和全長抗體序列中的胺基酸殘基,參見表1。
在本申請中,術語“分離的”蛋白質通常是指已經從其產生環境(例如,天然的或重組的)的組分中識別,分離和/或回收的蛋白質。其產生環境的污染組分通常是干擾其研究、診斷或治療用途的物質,可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的蛋白質或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
在本申請中,術語“特異性結合”通常是指抗體藉由其抗原結合域與表位結合,並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義,當抗體相比於其將結合隨機的、不相關的表位而言,更容易藉由其抗原結合域與表位結合時,抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗體結合的特定的原子基團(例如,糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中,術語“KD”、“K D ”可互換地使用,通常是指平衡解離常數,“KD”是解離速率常數(kdis,也稱為“解離率(off-rate)(koff)”或“kd”)與結合速率常數(kon,也稱為“結合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用結合速率常數(kon)、解離速率常數(kdis)和平衡解離常數(KD)表示抗體對抗原的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知,包括但不限於生物膜干涉技術(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等離子共振(SPR)、螢光共振能量遷移(FRET)、免疫共沉澱(Co-IP)以及蛋白質晶片技術。如果在不同的條件(例如鹽濃度、pH)下測量,則所測得的某種特定蛋白-蛋白相互作用的親和力可不同。
在本申請中,術語“PD-L1”通常是指程式性死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1),並且是由(人類中)CD274基因編碼的蛋白。PD-L1結合其受體,例如程式性死亡1(PD-1),該PD-1在活化的T細胞、B細胞和巨噬細胞中表達(Ishida et al.,1992 EMBO J,11:3887-3395;Okazaki et al.,Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice.Science,2001;291:319-22)。PD-L1和PD-1的絡合藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用(Freeman et al.,Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation,J.Exp.Med.2000,
192:1027-1034;Carter et al.,PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2.Eur.J.Immunol.2002,32:634-643)。術語“PD-L1”涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1,該任何脊椎動物來源包括哺乳動物,諸如靈長類(例如,人)和齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體,例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本結構包括4個結構域:胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。PD-L1序列是本領域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。又例如可在NCBI Gene ID No.60533下找到關於小鼠PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。又例如可在NCBI Gene ID No.102145573下找到關於食蟹猴PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的資訊。示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。示例性的全長小鼠PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_068693或Uniprot登錄號Q9EP73下找到。示例性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。
在本申請中,術語“PD-1”通常是指程式性死亡1受體(也稱為CD279)、其功能變體和/或其功能片段。PD-1通常在T細胞、B細胞、自然殺傷T細胞、活化的單核細胞和樹突細胞(DC)上表達。PD-1可以結合其配體PD-L1和PD-L2。在PD-1的定義之內還包括與天然存在的PD-1的胺基酸序列不同但保持特異性結合PD-L1的能力的變體。在PD-1的定義之內進一步包括增強PD-L1的生物活性的變體。PD-1序列是本領域已知的。例如,示例性的全長人PD-
1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_005009下找到,示例性的全長食蟹猴的PD-1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_001271065或Uniprot登錄號B0LAJ3下找到。
在本申請中,術語“TGFBRII”通常是指一種轉化生長因子β(TGFB)的受體II(也稱為TGFBR2)。細胞表面的TGFBR可以被轉化生長因子(TGFB)結合並啟動,藉由SMAD通路進行信號傳遞,具有調節生長,抗炎和免疫調節的活性。TGFBRII通常由C端蛋白激酶域和N端胞外域組成。完整的人TGFBRII序列可以在Uniprot登錄號P37173中找到。或者,完整的人TGFBRII序列可以如SEQ ID NO:53所示。
在本申請中,術語“表位”通常是指抗體特異性結合的抗原的某個區或區域。表位通常由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈分子的化學活性表面群組組成,且通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。表位元可為“線性表位元”或“構型表位”。在線性表位元中,蛋白質與相互作用的分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白質的一級胺基酸序列線性發生。在構型表位中,相互作用點於彼此分離的蛋白質上的胺基酸上交叉發生。給定抗體結合何種表位的方法(如,表位作圖(Epitope Mapping))是本領域所公知的,包括例如免疫印跡和免疫沉澱測定,例如,測試重疊或鄰接的肽(例如,來自PD-L1)與給定抗體的反應性。確定表位空間構象的方法包括本領域技術和本申請所述的那些技術,例如,X射線晶體學、二維核磁共振和HDX-MS。術語“不完全重疊”的表位通常是指在提及兩種或多種抗體時,各抗體結合不同的胺基酸殘基群,如藉由給定方法所測定的。用於確定本申請該抗體是否與參比抗體結合表位重疊的技術包括例如表位作圖方法,諸如,抗原:抗體複合物的晶體的x射線分析,其提供表位的原子解析度,和氫/氘交換質譜法(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段或
抗原的突變變化形式的結合,其中由於抗原序列內胺基酸殘基的修飾所致的結合損失經常被視為可指示表位組分(例如,丙胺酸掃描誘變-Cunningham及Wells(1985)Science 244:1081)。另外,亦可使用表位元定位的計算組合方法。本領域測定表位的方法包括但不限於合成肽法,免疫資訊學預測法,多肽活性測定,表位元肽掃描技術,蛋白質切割法,噬菌體展示技術,X射線衍射與核磁共振分析,以及利用電腦軟體進行表位元預測。在某些實施方式中,可以使用基於生物膜干涉法(BLI)Octet分子相互作用分析平臺進行兩種或多種抗體對抗原表位的競爭性結合。例如,將第一種抗體與抗原混合,再加入第二種抗體,利用ForteBio Octet測定第二種抗體對第一種抗體的競爭性抑制率,當競爭性抑制率低於85%時,可以說第一抗體與第二種抗體結合抗原的表位不同。
在本申請中,術語“受試者”通常是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如奶牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人和非人靈長類,諸如猴)、兔以及齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。
在本申請中,術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中,術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子,其將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體,以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能
夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常,藉由培養包含該載體的合適的宿主細胞,該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中,術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體,或者能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段的個體細胞、細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個宿主細胞的子代。由於天然的、意外的或故意的突變,子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同,但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌),也可以是真核細胞(例如酵母細胞,例如COS細胞,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,HeLa細胞,HEK293細胞,COS-1細胞,NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在某些情形中,該細胞可以是哺乳動物細胞。例如,該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中,術語“重組細胞”通常是指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組宿主細胞不僅包括某種特定的細胞,還包括這些細胞的後代。
在本申請中,術語“藥物組成物”通常是指這樣的製劑,其以允許活性成分的生物學活性有效的形式存在,並且不包含對將施用該組合物的物件具有不可接受的毒性的另外的成分。該組合物是無菌的。“無菌”組成物是滅菌的,或不含所有活的微生物及它們的孢子。
在本申請中,術語“治療”通常是指期望改變所治療個體的天然病程,且可為實現防治或在臨床病變過程中進行的臨床介入。合乎需要的治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發性、減輕症狀、減弱疾病的任何直接或間接病理學後果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態以及緩和或改善
預後。在一些情形中,抗體(例如,抗PD-L1抗體)可用來延遲疾病發展或減緩疾病進展。
在本申請中,術語“施用”通常是指向受試者(例如,患者)給予一定劑量的化合物(例如,抗癌治療劑)或藥物組合物(例如,包含抗癌治療劑的藥物組合物)的方法。施用可藉由任何合適的方式進行,包括腸胃外、肺內和鼻內,以及(如果局部治療需要)損傷內施用。胃腸外輸注包括例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。部分地根據施用是否為短暫的或長期的,給藥可藉由任何適合的途徑進行,例如藉由注射(諸如靜脈內或皮下注射)進行。本文涵蓋各種給藥過程,包括但不限於單次施用或各種時間點內的多次施用、推注施用和脈衝輸注。
在本申請中,術語“腫瘤”通常是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性還是良性)以及所有癌前和癌性細胞和組織。在本申請中,腫瘤可以包括結腸癌。
除了本文提到的特定序列的蛋白質和核苷酸之外,本申請還可包括其功能性變體、衍生物、類似物、同源物及其片段。
術語“功能性變體”指與天然存在序列具有基本上同一的胺基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列編碼並能夠具有天然存在序列的一種或多種活性的多肽。在本申請的上下文中,任何給定序列的變體是指其中殘基的特定序列(無論是胺基酸或核苷酸殘基)已經經過修飾而使得該多肽或多核苷酸基本上保留至少一種內源功能的序列。可以藉由天然存在的蛋白質和/或多核苷酸中存在的至少一個胺基酸殘基和/或核苷酸殘基的添加、缺失、取代、修飾、替換和/或變異來獲得變體序列,只要保持原來的功能活性即可。
在本申請中,術語“衍生物”通常是指本申請的多肽或多核苷酸而言包括自/對序列的一個(或多個)胺基酸殘基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失和/或添加,只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一種內源功能。
在本申請中,術語“類似物”通常對多肽或多核苷酸而言,包括多肽或多核苷酸的任何模擬物,即擁有該模擬物模擬的多肽或多核苷酸的至少一種內源功能的化學化合物。
通常,可以進行胺基酸取代,例如至少1個(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20個以上)胺基酸取代,只要經修飾的序列基本上保持需要的活性或能力。胺基酸取代可包括使用非天然存在的類似物。
用於本申請的蛋白質或多肽也可以具有胺基酸殘基的缺失、插入或取代,該胺基酸殘基產生沉默的變化並導致功能上等同的蛋白質。可以根據殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質的相似性進行有意的胺基酸取代,只要保留內源性功能即可。例如,帶負電荷的胺基酸包括天冬胺酸和谷胺酸;帶正電荷的胺基酸包括賴胺酸和精胺酸;並且含具有相似親水性值的不帶電極性頭基的胺基酸包括天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸。
在本申請中,術語“同源物”通常是指與野生型胺基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的胺基酸序列或核苷酸序列。術語“同源性”可以等同於序列“同一性”。同源序列可以包括可以與主題序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的胺基酸序列。通常,同源物將包含與主題胺基酸序列相同的活性位點等。同源性可以根據相似性(即具有相似化學性質/功能的胺基酸殘基)來考慮,也可以在序列同一性方面表達同源性。在本申請中,提及的胺基酸序列或核苷酸序列的SEQ
ID NO中的任一項具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整個長度上具有該百分比同一性的序列。
為了確定序列同一性,可進行序列比對,其可藉由本領域技術人員瞭解的各種方式進行,例如,使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)軟體等。本領域技術人員能夠確定用於比對的適當參數,包括在所比較的全長序列中實現最優比對所需要的任何演算法。
在本申請中,術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項的兩項。
在本申請中,術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下,也表示“為”、“由......組成”的含義。
在本申請中,術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動,例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
融合蛋白
另一方面,本申請提供了一種融合蛋白,其可包含:a)人TGFBRII或其片段;以及b)特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
本申請的融合蛋白的該人TGFBRII或其片段可包含人TGFBRII的胞外結構域。在某些情形中,該人TGFBRII或其片段可包含SEQ ID NO:56-57中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含HCDR1,且該HCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列:
GFTFSSY(SEQ ID NO:15)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含HCDR2,且該HCDR2可包含SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列:KQEGSE(SEQ ID NO:27)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含HCDR3,且該HCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列:DRAVAGAFDI(SEQ ID NO:8)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含LCDR1,且該LCDR1可包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列:RASQSIYIWLA(SEQ ID NO:41)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含LCDR2,且該LCDR2可包含SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列:KASSLET(SEQ ID NO:26)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含LCDR3,且該LCDR3可包含SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列:QQYYGSSRT(SEQ ID NO:31)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含重鏈可變區VH,且該重鏈可變區VH可包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列:
(SEQ ID NO:13)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈可變區VL,且該輕鏈可變區VL可包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列:DIQMTQSPSTLSASVGDRVTVTCRASQSIYIWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASSLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYYGSSRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:4)。例如,該序列可以是根據Chothia定義規則確定的序列。
在本申請中,該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈恆定區,且該重鏈恆定區可以包含人IgG恆定區或其突變體。在某些情形中,該人IgG恆定區可包含人IgG1恆定區或其突變體。例如,該融合蛋白的人IgG1恆定區或其突變體可包含SEQ ID NO:54所示的胺基酸序列。
該融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含抗體輕鏈恆定區,且該輕鏈恆定區可以包含人Igκ恆定區。該人Igκ恆定區包括天然和人工合成的Igκ恆定區或其突變體。例如,該融合蛋白的人Igκ恆定區或其突變體可包含SEQ ID NO:55所示的胺基酸序列。
本申請的融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈或其片段。例如,該抗體重鏈或其片段可包含下述所示的胺基酸序列或其一部分:SEQ ID NO:1。本申請的融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段可包含抗體輕鏈或其片段。例如,該抗體輕鏈或其片段可包含下述所示的胺基酸序列或其一部分:SEQ ID NO:5。該融合蛋白的該重鏈或其片段與該輕鏈或其片段組合後可形成特異性結合PD-L1的抗原結合部分。本申請的融合蛋白的特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段的該抗體重鏈或其片段與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成融合多肽。在某些情形中,該抗體重鏈或其片段的N端可以直接或間接與該人TGFBRII或其片段的C端連接。在某些情形中,該抗體重鏈或其片段的C端可以直接或間接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。例如,該抗體重鏈或其片段的C端可以直接與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
在本申請中,該融合蛋白可包含第一多肽和第二多肽。該第一多肽可包含該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈或其片段以及該人TGFBRII或其片段。在某些情形中,該第一多肽從N端至C端可以包括該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段的重鏈或其片段,以及該人TGFBRII或其片段。例如,該第一多肽可包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列。該第二多肽可包含該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段的輕鏈或其片段,例如,該第二多肽可包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。
在某些情形中,該融合蛋白的該第一多肽可包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列,且該第二多肽可包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。例如,該融合蛋白可包含與PR001902相同的第一多肽和第二多肽。
本申請的所述的融合蛋白可包含兩條該第一多肽以及兩條該第二多肽。
在本申請中,該融合蛋白或抗原結合片段的每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源,或者屬於特定的類別。例如,輕鏈和重鏈的可變區及恆定部分均來自一個動物物種(如人)的抗體的可變區及恆定區。
可藉由本領域已知的各種測定鑒別、篩選或表徵本申請的融合蛋白的物理/化學特性和/或生物活性。
在一個方面,例如可藉由已知方法諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡(例如,蛋白質印跡)、流式細胞術(例如,FACS)、免疫組織化學、免疫螢光等來測試本申請融合蛋白的抗原結合活性。
本申請中,該融合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自人的PD-L1和/或TGFB1。該融合蛋白對PD-L1和/或TGFB1的結合親和力可藉由本領域已知的任何方法測定。在某些情形中,結合親和力可藉由表面等離子共振法(SPR)、酶聯免疫法(ELISA)、結合抗原沉澱法、平衡透析法、生物膜干涉(BLI)測定。在某些情形中,該融合蛋白對PD-L1和/或TGFB1的結合親和力和KD值可藉由生物膜干涉(BLI)測定。例如,可使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀,來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
本申請中,該融合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自人的PD-L1。例如,該KD的值可以以約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M、
約5×10-10M、約1×10-10M或以下的值結合源自人的PD-L1,例如,使用使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
本申請中,該融合蛋白能夠以1×10-8M或更低的KD值結合源自人的TGFB1。例如,該KD的值可以以約1×10-8M或以下、約9×10-9M或以下、約8×10-9M或以下、約7×10-9M或以下、約6×10-9M或以下、約5×10-9M或以下、約4×10-9M或以下、約3×10-9M或以下、約2×10-9M或以下、約1×10-9M、約5×10-10M、約1×10-10M或以下的值結合源自人的TGFB1,例如,使用使用FortieBio Octet分子相互作用分析儀所檢測的。
在另一情形中,本申請的融合蛋白與PD-L1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。例如,在FACS檢測中,使用穩定表達人PD-L1的宿主細胞(如CHOK1細胞),該融合蛋白與PD-L1的EC50值可以在約0.0001nM至約100nM之間,例如,約0.001nM至約10nM之間,約0.01nM至約10nM之間,約0.05nM至約5nM之間,約0.05nM至約1nM之間,約0.05nM至約0.8nM之間,約0.1nM至約0.8nM之間。
在另一情形中,本申請的融合蛋白與TGFB1的結合活性可使用流式細胞術或酶聯免疫法測定進行檢測。例如,在ELISA中,使用人TGFB1蛋白,該融合蛋白與TGFB1的EC50值可以在約0.0001nM至約100nM之間,例如,約0.001nM至約10nM之間,約0.001nM至約5nM之間,約0.01nM至約5nM之間,約0.1nM至約3nM之間。
在另一個方面,本申請的的融合蛋白能夠阻斷PD-1與PD-L1的結合。在某些情形中,該融合蛋白阻斷PD-1與PD-L1的結合可藉由流式細胞技術FACS、酶聯免疫法ELISA測定。例如,首先將穩定表達PD-L1的宿主細胞
(如CHOK1細胞)與遞減量的未標記的該融合蛋白孵育,隨後用生物素標記的PD-1蛋白孵育。然後,使用FACS分析細胞,以證實該融合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合。又例如,首先將PD-L1抗原蛋白包被在板上,將遞減量的未標記的該融合蛋白和生物素標記的PD-1蛋白混合後,共同孵育。然後,使用ELISA分析細胞,以證實該融合蛋白可以阻斷PD-1和PD-L1的結合。
本申請的融合蛋白能夠啟動T細胞。在某些情形中,該融合蛋白能夠刺激免疫細胞中IFN-γ和/或IL2的分泌。該免疫細胞可包括淋巴細胞,例如B細胞、T細胞,天然殺傷細胞,髓樣細胞,例如單核細胞、巨噬細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞、嗜堿細胞和粒細胞。可用本領域任何技術人員已知的方法測定免疫細胞中細胞因子的分泌,例如,藉由酶聯免疫法(ELISA)定量測定免疫細胞(例如T細胞)增殖情況或由免疫細胞產生的細胞因子(例如由T細胞產生的IFN-γ或IL-2)。
核酸、載體、宿主細胞和製備方法
在另一個方面,本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。該一種或多種核酸分子可編碼本申請的的融合蛋白或抗原結合片段。例如,該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該融合蛋白或抗原結合片段,也可以編碼其中的一部分(例如,HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請的核酸分子可以為分離的。例如,其可以是藉由以下方法產生或合成的:(i)在體外擴增的,例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的,(ii)藉由選殖重組產生的,(iii)純化的,例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離,或者
(iv)合成的,例如藉由化學合成。在某些實施方式中,該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
在本申請中,可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體、其抗原結合片段的核酸,這些方法包括但不限於,採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR,具體操作可參見Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在另一個方面,本申請提供了一種或多種載體,其包含本申請的的一種或多種分離的核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外,該載體中還可包含其他基因,例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外,該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的,例如,可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中,該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化,但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如,5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區,啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中,適當的啟動子可包括,例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV),其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH,甘油醛-3-磷酸脫
氫酶)基因啟動子的某部分融合,其可包含或不包含另外的內含子。本申請的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括,例如質粒、粘粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如,該載體為表達載體。
在另一個方面,本申請提供了宿主細胞,該宿主細胞可包含本申請的一種或多種核酸分子和/或本申請的一種或多種載體。在某些實施方式中,每種或每個宿主細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中,每種或每個宿主細胞可包含多個(例如,2個或以上)或多種(例如,2種或以上)本申請所述的核酸分子或載體。例如,可將本申請所述的載體引入該宿主細胞中,例如真核細胞,如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請所述的載體引入該宿主細胞中,例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
在另一個方面,本申請提供了製備該融合蛋白和/或抗原結合片段的方法。該方法可包括,在使得該融合蛋白和/或抗原結合片段表達的條件下,培養本申請所述的細胞,以及任選地收穫所表達的該融合蛋白。例如,可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等,這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。
在某些情形中,該方法還可包括分離和/或純化該抗體或其抗原結合片段的步驟。例如,可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析,還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本申請所述的抗體或其抗原結合片段。
藥物組成物、方法、用途
在另一個方面,本申請提供了一種藥物組成物,其可包含本申請所述的融合蛋白和/或抗原結合片段,該核酸分子,該載體,該宿主細胞,以及任選地藥學上可接受的載體。
該藥學上可接受的載體在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒性,並且可包括緩衝劑,諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸;抗氧化劑,包括抗壞血酸和甲硫胺酸;防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)、氯化苯二甲羥銨(benzalkonium chloride)、氯化苄甲乙氧銨(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苄醇;對羥苯甲酸烷酯,諸如對羥苯甲酸甲酯或丙酯;兒茶酚;間苯二酚;環己醇;3-戊醇和間-甲酚);低分子量(小於約10個殘基)多肽;蛋白質,諸如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯基吡咯烷酮;胺基酸,諸如甘胺酸、穀醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸;單糖、雙糖以及其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑,諸如EDTA;糖,諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成鹽反離子,諸如鈉離子;金屬絡合物(例如,Zn-蛋白質絡合物);和/或非離子表面活性劑,諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本申請中的藥物組成物還可含有多於一種活性化合物,通常為不會不利地影響彼此的具有互補活性的那些活性化合物。此類藥物的類型和有效量取決於例如製劑中存在的拮抗劑的量和類型,以及受試者的臨床參數。
該藥物組成物可以用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。例如,本申請的藥物組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展,可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤),和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
本申請所述的藥物組成物可以包含預防和/或治療有效量的該融合蛋白或抗原結合片段。該預防和/或治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的疾病或病症和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面,本申請提供了該融合蛋白在製備藥物中的用途。該藥物可用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。在某些實施方式中,該腫瘤或癌症包含結直腸腫瘤或癌症。在某些實施方式中,該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。本申請還提供了以下描述的檢測生物樣品中PD-L1表達的方法。在某些情形中,該方法包括使生物樣品與本申請所述的融合蛋白在容許該融合蛋白結合PD-L1的條件下接觸,和檢測在該融合蛋白與PD-L1之間是否形成複合物。例如,該腫瘤或癌症為與非腫瘤或癌症樣品相比,PD-L1表達升高的腫瘤或癌症。此類方法可以是體外或體內方法。本申請所述融合蛋白可用於例如免疫測定中,該免疫測定包括例如免疫組織化學(IHC)、免疫螢光(IF)、免疫印跡(例如,蛋白質印跡)、流式細胞術(例如,FAGS)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)。在某些情形中,例如當PD-L1為用於選擇患者的生物標記時,該融合蛋白用來選擇適於用本申請所述融合蛋白進行的療法的受試者。本申請還提供了該融合蛋白在診斷患有病症(例如,癌症或免疫功能失調)的受試者的方法中的用途,該方法包括:藉由使樣品與本發明的所述融合蛋白接觸並檢測結合的該融合蛋白的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-L1的存在或表達水準。
在一些情況下,樣品是指生物樣品,可包括組織或細胞樣品。例如,生物樣品可包括來自正常或癌症患者的細胞或組織。在某些情況下,組織或細胞樣品的來源可為如來自新鮮、冷凍和/或防腐器官或組織樣品或活檢物或吸
出物的固體組織;血液或任何血液成分;體液,諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液;來自受試者妊娠或發育的任何時間的細胞。在另一些情形中,該生物樣品獲自體外組織或細胞培養物。本申請中的生物樣品的實例包括但不限於腫瘤活檢、迴圈腫瘤細胞、血清或血漿、迴圈血漿蛋白、腹水、來源於腫瘤的或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系,以及保存的腫瘤樣品,諸如福馬林固定石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。
本申請還提供了該融合蛋白在診斷患有腫瘤或癌症的受試者的方法中的用途,該方法包括:藉由使樣品與本申請的融合蛋白接觸並檢測結合的抗體的存在來確定獲自受試者的樣品中PD-L1的存在或表達水準。在一些情況下,該樣品可選自由以下述成的組:組織樣品、全血樣品、血清樣品和血漿樣品。在一些情況下,該組織樣品可以為腫瘤樣品。在一些情況下,該腫瘤樣品可包含腫瘤浸潤性免疫細胞、腫瘤細胞、基質細胞及其任何組合。
另一方面,本申請提供了治療受試者中的癌症、抑制受試者中腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖的方法,包括向有需要的受試者或該腫瘤細胞施用本申請所述的融合蛋白、該分子核酸、該載體、該宿主細胞和/或該藥物組成物。可藉由任何合適的方法來施用,該合適的方法包括例如:以靜脈內方式、以肌內方式、以皮下方式、以皮內方式、以經皮方式、以動脈內方式、以腹膜內方式、以損傷內方式、以顱內方式、以關節內方式、以前列腺內方式、以胸膜內方式、以氣管內方式、以鞘內方式、以鼻內方式、以陰道內方式、以直腸內方式、以局部方式、以腫瘤內方式、以腹膜方式、以結膜下方式、以囊內方式、以粘膜方式、以心包內方式、以臍內方式、以眼內方式、以眶內方式、以口服方式、以局部方式、以透皮方式、以玻璃體內方式(例如,藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼
劑、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接沐浴靶細胞的局部灌注、藉由導管、藉由灌洗、以乳膏形式或以脂質組成物形式。用於本文描述的方法中的組成物還可以全身方式或以局部方式施用。施用方法可以根據各種因素(例如,所施用的化合物或組成物以及所治療的病狀、疾病或病症的嚴重性)而變化。在某些實施方案中,以靜脈內方式、以肌內方式、以皮下方式、以局部方式、以口服方式、以透皮方式、以腹膜內方式、以眶內方式、藉由植入、藉由吸入、以鞘內方式、以心室內方式或以鼻內方式施用抗癌療法(例如,抗PD-L1抗體)。部分地根據施用是否為短暫的或長期的,給藥可藉由任何適合的途徑進行,例如藉由注射,諸如靜脈內或皮下注射。本文涵蓋各種給藥排程,包括但不限於單次施用或各種時間點內的多次施用、推注施用和脈衝輸注。
本文所述的融合蛋白或藥物組成物可以符合良好醫療實踐的方式配製、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、單個患者的臨床病狀、病症的病因、藥劑遞送部位、施用方法、施用排程和醫學從業者已知的其他因素。治療劑(例如,抗PD-L1抗體)無需但任選地與一種或多種當前用來預防或治療所考慮的病症的藥劑一起配製和/或同時施用。此類其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的治療劑(例如,抗PD-L1抗體)的量、病症或治療的類型以及以上論述的其他因素。這些藥劑通常可以憑經驗/臨床上確定為適當的任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑加以使用。劑量可作為單個劑量或作為多個劑量(例如2或3個劑量)施用,諸如輸注。與單個治療相比,可減少組合治療中施用的抗體的劑量。藉由常規技術易於監測此療法的進展。
試劑盒
另一方面,本申請提供了一種試劑盒,其可以包含本申請所述的融合蛋白,和/或本申請所述的藥物組成物。其可在單一常用容器中包括本申請所述的融合蛋白,和/或藥物組成物,也可任選地與一種或多種治療劑組合,視需要地一起配製於藥物組成物中。
在某些情形中,該試劑盒還可以包括施用本申請所述融合蛋白,或藥物組成物的裝置;例如,該裝置取決於內容物的施用方式。在某些情形中,該試劑盒可包括包裝插頁,其包括關於試劑盒中的融合蛋白、藥物組成物和劑型的資訊。通常,此類資訊說明患者和醫師有效且安全地使用封裝的抗原結合蛋白、藥物組成物和劑型。用於此類試劑盒中的容器通常可包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它適合容器,檢測和/或治療組成物中的一種或多種可置於其中。在還提供第二治療劑的情況下,試劑盒也可含有第二不同容器,其中可放置該第二檢測和/或治療組成物。或者,多種化合物可製備成單一藥物組成物,且可包裝在單一容器裝置諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其它適合單一容器中。
給藥裝置
另一方面,本申請提供了一種給藥裝置(例如塑膠或小瓶,例如空心銷或注射器圓筒),它可以用來施用本申請所述的融合蛋白或其藥物組成物。該設備可以藉由腸胃外途徑(例如肌肉內部,皮下或靜脈內)將一種物質引入患者體內。例如,注射設備可以是注射器(例如預先填充的具有本申請所述融合蛋白或其藥物組成物的注射器,例如自動注射器),其可以包括用於容納要注射的流體(例如本申請該抗原結合蛋白或其藥物組成物)的針筒和針(可以用於刺穿皮膚和/或血
管)。給藥方式可改變。給藥途徑可以包括口服,肌肉注射,皮下注射,經直腸給藥等。
不欲被任何理論所限,下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的融合蛋白、製備方法和用途等,而不用於限制本申請發明的範圍。
[實施例]
下面顯示的實施例意在說明本發明的具體實施方案,並且不意在以任何方式限制本說明書或權利要求書的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述,如那些用於構建載體和質粒的方法,將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法.這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的,並且在許多出版物中都有所描述,包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F,and Maniais,T.(1989)MolecuLar Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Press。
實施例1 融合蛋白質分子的製備
利用分子選殖技術,將TGFBRII胞外區截短序列(SEQ ID NO:56)構建到抗PD-L1抗體PR000265的重鏈C末端構建雙功能融合蛋白分子,將編碼多肽序列的質粒轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)。將HEK293細胞在FreeStyleTM F17 Expression Medium培養基(Thermo,A1383504)中擴培。暫態轉染開始之前,調節細胞濃度至6~8 x 105細胞/ml,於37℃ 8% CO2搖床中培養24小時,細胞濃度在1.2 x 106細胞/ml。準備30ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質粒和編碼抗體輕鏈的質粒以2:3的比例混合共計30μg質粒溶解於1.5ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo,31985088),並用0.22μm濾膜過濾除菌。再取1.5ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences,23966-2)120μl,靜置5分
鐘。把PEI緩慢加入質粒中,室溫孵育10分鐘,邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液,於37℃ 8% CO2搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物,以3300g轉速離心10分鐘後取上清;然後將上清高速離心去除雜質。用PBS(pH7.4)緩衝液平衡含有MabSelect TM(GE Healthcare Life Science,71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad,7311550),2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱;用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱,再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白,後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性,最後用超濾管(Millipore,UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液,得到純化的蛋白溶液。最後用NanoDrop(Thermo ScientificTM NanoDropTM One)測定濃度,分裝、存儲備用。得到本申請的融合蛋白PR001902,用於下述各實施例實驗中。另外,製備蛋白分子M7824(也稱為PR001599,其為bintrafusp alfa類似物),蛋白分子Hengrui融合蛋白9(也稱為PR002466,其序列來源於專利WO2018205985A1),以及TGFBRII Trap(也稱為PR002040,其利用抗雞溶菌酶的抗體選殖TEL16的序列與TGFBRII胞外區截短序列融合得到)作為實施例中的對照。上述融合蛋白的序列見表2,CDR劃分以Chothia定義規則為例。
實施例2 融合蛋白結合過表達人PD-L1的CHO-K1細胞
為了研究融合蛋白融合蛋白PR001902體外結合PD-L1的活性,採用過表達人PD-L1的CHO-K1細胞(CHO-K1/hPD-L1,南京金斯瑞,M00543),進行細胞水準上的抗體結合實驗。消化CHO-K1/hPD-L1細胞,並用F12K完全培養基重懸,將細胞密度調整為2x106/mL。以50μl細胞/孔接種於96孔U底板,隨後加入100μL/孔,5倍濃度梯度稀釋的待測抗體,其中抗體的最高終濃度為100nM。將細胞放置於4℃,避光孵育30分鐘。之後,加入100μl/孔預冷PBS漂洗細胞兩次,於500g,4℃下離心5分鐘,棄上清。再加入100μL/孔二抗AF488山羊抗人lgG(H+L)(Invitrogen,A11013,1:1000),4℃,避光孵育30分鐘。用100μl/孔預冷PBS漂洗細胞兩次,於500g,4℃下離心5分鐘,棄上清。最後,200μl/孔預冷PBS重懸細胞。使用流式細胞儀BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值,並用軟體FlowJo v10(FlowJo,LLC)處理和分析資料。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析,藉由四參數非線性擬合,得到結合曲線及EC50值等參數。
結果如圖1和表3顯示,PR001902與陽性對照相比,能夠有效地與CHO-K1/hPD-L1細胞結合,並且有藥物濃度劑量依賴效應。
實施例3 融合蛋白體外結合TGFB1
以1μg/ml濃度的人源TGFB1(Novoprotein,CA59)為抗原,按100μl/孔包被96孔板,4℃過夜。200μl/孔1×PBST洗滌3次,加入200μl/孔2%BSA,37℃封閉2小時。加入200μl/孔1xPBST洗滌3次,加入5倍濃度梯度稀釋的抗體,其中抗體的最高終濃度為100nM,37℃孵育1小時。200μl/孔1×PBST洗滌3次,每孔加入100μl/孔抗人FC-HRP二抗(Sigma-Aldrich,A0170,以1:4000稀釋),37℃孵育1小時。200μl/孔1×PBST洗滌3次,每孔再加入100μl/孔TMB,室溫孵育10分鐘後加入50μl/孔1M ELISA終止液停止反應。酶標儀上檢測450nm及570nm測吸收值。應用軟體GraphPad Prism 8進行資料處理和作圖分析,藉由四參數非線性擬合,得到結合曲線及EC50值等參數。
結果如圖2和表4所示,PR001902與陽性對照相比,能夠有效地與TGFB1結合,並且有藥物濃度劑量依賴效應。
實施例4 融合蛋白阻斷人PD-1與過表達人PD-L1的CHO-K1細胞的結合
為了進一步研究融合蛋白體外阻斷PD1/PDL1通路的活性,採用高表達人PD-L1的CHO-K1細胞(CHO-K1/hPD-L1,南京金斯瑞,M00543),進行細胞水準上的抗體阻斷實驗。消化CHO-K1/hPD-L1細胞,並用F12K完全培養基重懸,將細胞密度調整為2x106/mL。以50μl細胞/孔接種於96孔U底板,隨後加入100μL/孔,5倍濃度梯度稀釋的待測抗體,其中抗體的最高終濃度為100nM。將細胞放置於4℃,避光孵育30分鐘。之後,加入100μl/孔預冷PBS漂洗細胞,於500g,4℃下離心5分鐘,棄上清。加入50μl/孔1μg/mL Biotin-hPD-1(Acrobiosystems,PD1-H82F2),4℃,避光孵育30分鐘。用100μl/孔預冷PBS漂洗細胞,於500g,4℃下離心5分鐘,棄上清。再加入100μL/孔二抗PE Streptavidin(BD Pharmingen,554061,1:200稀釋),4℃,避光孵育30分鐘。用100μl/孔預冷PBS漂洗細胞,於500g,4℃下離心5分鐘,棄上清。最後,200μl/孔預冷PBS重懸細胞,使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光信號值。應用軟體GraphPad
Prism 8進行資料處理和作圖分析,藉由四參數非線性擬合,得到結合曲線及IC50值等參數。
結果如圖3和表5所示,PR001902與陽性對照均能夠有效地阻斷PD-1同CHO-K1/hPD-L1細胞結合,並且有藥物濃度劑量依賴效應。
實施例5 利用BLI測定融合蛋白與人PD-L1或人TGFB1的親和力的結果
藉由生物膜干涉(BLI)技術,使用Octet分子相互作用分析儀(ForteBio,型號Octet Red96e),來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
藉由Octet測定融合蛋白與人TGFB1蛋白的親和力。感測器架上放置兩列SA感測器,一列作為測試SA感測器,一列作為參照SA感測器。以0.02%吐溫的1×PBS為緩衝液,先將SA感測器在緩衝液中平衡10分鐘;測試SA感測器捕獲生物素化的人TGFB1蛋白(人TGFB1蛋白(NovoProtein,CA59)利用生物素化試劑盒(ThermoFisher,A39257,EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)進行生物素化),設置捕獲高度為0.3nm;參照SA感測器浸入緩衝液中30秒。兩列感測器再與梯度稀釋的待測融合蛋白(例如,待測融合蛋白濃度可以為6.25~0.39
nM的兩倍梯度稀釋以及0nM)相互作用,每根感測器對應一個濃度,在程式中設置結合、解離時間分別為180秒和600秒。
藉由Octet測定融合蛋白與人PD-L1蛋白(NovoProtein,C315)的親和力。感測器架上放置兩列AHC感測器,一列作為測試AHC感測器,一列作為參照AHC感測器。先將AHC感測器在緩衝液中平衡10分鐘;測試AHC感測器捕獲待測融合蛋白(濃度40nM)30秒,捕獲高度約為0.7nm;參照AHC感測器浸入緩衝液中30秒。兩列感測器再與梯度稀釋的人PD-L1蛋白(例如,PD-L1蛋白濃度可以為25~0.39nM的兩倍梯度稀釋以及0nM)相互作用,每根感測器對應一個濃度,在程式中設置結合、解離時間分別為300秒和900秒。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio,版本11.0)進行資料分析時,選擇雙扣除模式(double reference)扣除背景信號,選擇“1:1 Global fitting”方法進行資料擬合,計算出抗原(親和物件)與待測融合蛋白結合的動力學參數,得到kon(1/Ms)值、kdis(1/s)值和KD(M)值。
結果如表6所示,PR001902與陽性對照相比,對人TGFB1以及人PD-L1都具極高的親和力。
實施例6 利用BLI方法測定融合蛋白結合PD-L1的表位競爭
使用ForteBio Octet平臺對得到的融合蛋白和陽性對照M7824(即PR001599)進行表位競爭實驗。第一步,獲取抗體的100%信號:用SA感測器捕獲生物素化的人PD-L1蛋白(人PD-L1蛋白(NovoProtein,C315)利用生物素化試劑盒(ThermoFisher,A39257,EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)進行生物素化),捕獲高度為0.25nm。將感測器浸入抗體中(50nM),時間500秒,將該抗體與PD-L1結合的最終信號記錄為該抗體的100%信號。第二步,表位競爭實驗:用SA感測器捕獲生物素化的PD-L1蛋白,捕獲高度為0.25nm。將感測器浸入第一抗體中(50nM),時間500秒,再將SA感測器浸入第一抗體和第二抗體的混合物中(兩種抗體的終濃度均為50nM),時間500秒,將最終信號記錄為該第二抗體的信號。抑制率藉由下式計算,
抑制率(%)=(A-B)/A * 100
A:某抗體的100%信號(從第一步中獲得),B:該抗體作為第二抗體的信號(從第二步獲得)。
若得到的抑制率大於85(%),則意味著兩種抗體表位完全重疊;若抑制率小於85(%),則意味著兩種抗體的表位不完全重疊。
結果如表7所示,PR001902與對照分子PR001599的表位不完全重疊。
實施例7 融合蛋白對TGFB/Smad信號通路啟動的抑制作用
該實驗使用高表達人源TGFBRI及融合SEAP報告基因的Smad3/4基因的HEK-BlueTM TGF-β細胞(Invivogen,hkb-tgfb),在細胞水準上研究了融合蛋白對TGFB1誘導的Smad信號通路的啟動的抑制作用。加入10μl/孔,5倍濃度梯度稀釋的待測融合蛋白於96孔板中,最高終濃度為50nM。隨後,加入10μl/孔,終濃度為1ng/ml的人TGFB1蛋白(R&D Systems,240-B/F)於96孔板中。以抗TGFB1抗體(Biointron,B5484)為對照分子。將180μl,2.5×104細胞/孔接種於96孔板中,在二氧化碳培養箱中繼續孵育過夜。然後每孔移取20μl細胞上清入另一塊96孔板中,然後每孔加入180μl Quanti-Blue工作液(Invivogen,rep-qb1),37℃下孵育1小時。酶標儀上檢測655nm測吸收值。應用軟體GraphPad Prism
8進行資料處理和作圖分析,藉由四參數非線性擬合,得到結合曲線及IC50值等參數。
結果如圖4和表8所示,PR001902以劑量依賴性形式抑制TGFB1誘導的SEAP報告物的產生,且與陽性對照M7824具有相當的功效和IC50。另外,PR001902的抑制活性和IC50較陽性對照Hengrui融合蛋白9及TGFB1抗體強8倍。
實施例8 MLR法體外檢測融合蛋白對T細胞的啟動作用
為了研究融合蛋白對T細胞的協同啟動作用,收集和純化人外周血單核細胞(PBMC),分離單核細胞(Meltenyi,130-050-201),採用完全培養基(RPI1640含50ng/mL IL-4,100ng/mL GM-CSF)培養6天,再加入1μg/ml LPS誘導24h,生成成熟的DC細胞。收集上述培養的細胞離心,用含2%FBS的PBS洗4次,重懸至新鮮的培養基中,調整密度為2×105細胞/mL,100μl/孔接種至96孔細胞培養板。同時,自異體新鮮PBMC中分離Pan T細胞((Meltenyi,130-096-535)新鮮
培養基重懸,調整細胞密度為1×106細胞/ml,100μl/孔接種至96孔細胞培養板。將不同濃度的抗體50μl/孔,及終濃度為0.3ng/ml的人TGFB1蛋白(R&D Systems,240-B/F)以50μl/孔分別加入上述96孔細胞培養板的對應孔中,並將細胞培養板置於37℃,5% CO2培養箱孵育5天。分別收集72小時後和120小時後的上清液。採用IL2 ELISA試劑盒(Thermo,88-7025-88)檢測72小時後上清液中的IL-2的水準;採用IFN-γ ELISA試劑盒(Thermo,88-7316-88)檢測120小時後上清液中的IFN-γ的水準;具體操作參考試劑說明書。
結果如圖5和圖6所示,在外加TGFB1的條件下,PR001902能夠劑量依賴地增強啟動的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2(圖5)和IFN-γ(圖6),並且具有比陽性對照更強的啟動作用。
實施例9 融合蛋白的藥物代謝動力學研究
本實施例測試融合蛋白的藥物代謝動力學性能。其方法如下,選取體重18~22克的雌性C57BL/6小鼠3隻,靜脈注射給與PR001902,劑量9.53mg/kg。於給藥前以及給藥後0.5小時、24小時(第1天)、第2天、第4天、第7天、第10天和第14天採集全血,將全血靜置30分鐘使其凝固,隨後在4℃下以2,000rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一,即Fc端檢測方法,藉由包被於96孔板的山羊抗人Fc多株抗體來捕獲小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白,然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測;ELISA方法二,即TGFBRII端檢測方法,藉由包被於96孔板的人TGFB1蛋白來捕獲小鼠血清中的含有人TGFBRII結構域的融合蛋白,然後加入HRP標記的的山羊抗
人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體6.4版,選用非房室模型(NCA)對血藥濃度資料進行分析以評價其藥物代謝動力學。
結果如圖7和表9所示,PK分析結果表明,Fc端檢測方法下,PR001902在小鼠體內的半衰期約為11天;TGFBRII端檢測方法顯示,PR001902在小鼠體內的半衰期約為8.5天。
實施例10 融合蛋白對結腸癌CT26-人PD-1/PD-L1雙剔除小鼠的動物體內模型的抗腫瘤活性
評價測試藥物在小鼠結腸癌細胞CT26-人PDL1(tg)-小鼠PDL1(KO)(將小鼠結腸癌細胞CT26的內源性鼠PD-L1基因剔除並引入外源人PD-L1轉基因,集萃藥康生物科技)移植免疫檢查點人源化小鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1(將BALB/c小鼠同時引入外源人PD-1轉基因和人PD-L1轉基因,集萃藥康生物科技)中的抗腫瘤作用。接種對數生長期的CT26-人PDL1(tg)-mPDL1(KO)細胞於人源化小
鼠BALB/c-人PD-1/PD-L1腋右側背部皮下,當平均腫瘤體積達到80-120mm3時,去除腫瘤體積過大的小鼠個體後,小鼠根據腫瘤體積隨機分成3組,每組6隻。分組當天開始腹腔給藥,每三天給一次藥,共給藥6次(q3d×6)。開始給藥後,每週稱量體重及瘤體積兩次,瘤體積計算方式為:腫瘤體積(mm3)=0.5×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。實驗結束後將荷瘤小鼠安樂死並剝瘤稱重。計算各組動物的腫瘤體積、小鼠體重等實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。多組比較採用單因素方差分析(one way ANOVA)檢驗方法比較不同治療組與對照組相比有無顯著性差異。資料使用SPSS 18.0進行分析。P<0.05為具有顯著性差異。
結果如圖8顯示,PR001902與陽性對照相比,均能顯著抑制CT26人PD-1/PD-L1小鼠皮下移植瘤的生長;且在實驗過程中,各組動物體重均出現增長,表明動物對測試藥物耐受良好,未對動物產生明顯毒性作用,安全性較好。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的,並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的,且保留在所附申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
<110> 和鉑醫藥(蘇州)有限公司(Harbour BioMed(Suzhou)Co.,Ltd.)
<120> 一種融合蛋白及其應用
<130> 0113-PA-002TW
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> PR000265輕鏈可變區
PR001902輕鏈可變區
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> PR000265抗體輕鏈
PR001902抗體輕鏈
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<223> PR002466抗體輕鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> PR002040 HCDR1(Combined)
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<223> PR002466 HCDR1(Chothia)
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<223> PR002040輕鏈可變區
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<212> PRT
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<220>
<223> PR002040抗體輕鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599輕鏈可變區
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<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599抗體輕鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002466重鏈可變區
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<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002466抗體重鏈
<400> 37
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002040重鏈可變區
<400> 38
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<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002040抗體重鏈
<400> 39
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002466 LCDR1(Kabat)
PR002466 LCDR1(Chothia)
PR002466 LCDR1(Combined)
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<212> PRT
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<223> PR000265 LCDR1
PR001902 LCDR1
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<210> 42
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002466 HCDR2(Kabat)
PR002466 HCDR2(Combined)
<400> 42
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002040 LCDR1(Kabat)
PR002040 LCDR1(Chothia)
PR002040 LCDR1(Combined)
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599 HCDR2(Kabat)
PR001599 HCDR2(Combined)
<400> 44
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> PR001599 LCDR3(Kabat)
PR001599 LCDR3(Chothia)
PR001599 LCDR3(Combined)
<400> 45
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599 HCDR1(Kabat)
<400> 46
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> PR002466 HCDR1(Kabat)
<400> 47
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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PR001902 HCDR1(Kabat)
<400> 48
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599 LCDR1(Kabat)
PR001599 LCDR1(Chothia)
PR001599 LCDR1(Combined)
<400> 49
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002040 HCDR1(Kabat)
<400> 50
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR002040 HCDR2(Chothia)
<400> 51
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PR001599 HCDR2(Chothia)
<400> 52
<210> 53
<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TGFBRII全長參考序列
<400> 53
<210> 54
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1恆定區
<400> 54
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ig κ恆定區
<400> 55
<210> 56
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TGFBRII胞外區24-159位
<400> 56
<210> 57
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人TGFBRII胞外區23-159位
<400> 57
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ig λ恆定區
<400> 58
Claims (17)
- 一種融合蛋白,其包含:a)人TGFBRII或其片段;以及b)特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段;其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含HCDR1,HCDR2和HCDR3,以及LCDR1,LCDR2和LCDR3;該HCDR1包含SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列,該HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的胺基酸序列,該HCDR3包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列,該LCDR1包含SEQ ID NO:41所示的胺基酸序列,該LCDR2包含SEQ ID NO:26所示的胺基酸序列,且該LCDR3包含SEQ ID NO:31所示的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的融合蛋白,其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區,該重鏈可變區包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列,且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
- 如請求項1或2中任一項所述的融合蛋白,其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈,且該抗體重鏈與該人TGFBRII或其片段框內融合而形成融合多肽。
- 如請求項3所述的融合蛋白,其中該抗體重鏈的C端與該人TGFBRII或其片段的N端連接。
- 如請求項1至4中任一項所述的融合蛋白,其中該人TGFBRII或其片段包含人TGFBRII的胞外結構域。
- 如請求項1至5中任一項所述的融合蛋白,其中該人TGFBRII或其片段包含SEQ ID NO:56-57中任一項所示的胺基酸序列,較佳SEQ ID NO:56所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至6中任一項所述的融合蛋白,其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區,且該重鏈恆定區為人IgG1恆定區。
- 如請求項1至7中任一項所述的融合蛋白,其中該特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段還包含輕鏈恆定區,該輕鏈恆定區包含人Ig κ恆定區。
- 如請求項1至8中任一項所述的融合蛋白,其包含第一多肽和第二多肽,其中該第一多肽包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列;且該第二多肽包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。
- 如請求項1至9中任一項所述的融合蛋白,其包含兩條該第一多肽以及兩條該第二多肽。
- 一種分離的核酸分子,其包含編碼如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白或其功能性片段的多核苷酸。
- 一種藥物組成物,其包含如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白,或如請求項11所述的核酸分子,以及任選地藥學上可接受的載體。
- 一種如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白或如請求項11所述的核酸分子用於製備藥物的用途,該藥物用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
- 如請求項13所述的用途,其中該腫瘤或癌症包括結腸癌。
- 如請求項13或14中任一項所述的用途,其中該腫瘤或癌症為PD-L1表達異常的腫瘤或癌症。
- 如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白或請求項11所述的核酸分子,其用於治療癌症,抑制腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖。
- 一種治療受試者中的癌症、抑制受試者中腫瘤生長和/或抑制腫瘤細胞增殖的方法,該方法包括向該受試者或該腫瘤細胞施用如請求項1至10中任一項所述的融合蛋白,或如請求項11所述的核酸分子。
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