KR20190128618A - 면역조정 융합 단백질 - Google Patents

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토니 레이드
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에피센트알엑스, 인코포레이티드
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Abstract

융합 단백질을 기능적으로 최적으로 허용해 주는, 예를 들어, 시토카인 수용체 융합 단백질의 시토카인 수용체 부분이 그의 표적 시토카인에 최적으로 결합할 수 있게 하는 신규 링커 서열을 수반한 융합 단백질, 예를 들어, 시토카인 수용체 융합 단백질, 예를 들어, TGFβ 트랩이 제공된다. 상기 융합 단백질, 또는 이러한 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터, 예를 들어, 종양용해성 아데노바이러스 발현 벡터는 특정 형태의 암 및 염증성 장애를 포함한, 세포 증식성 질환 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

면역조정 융합 단백질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 9월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/400,338, 및 2017년 4월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/484,841을 우선권 주장하며, 이들 가출원 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 분자 생물학, 구체적으로 면역학 및 융합 단백질, 예를 들어, 시토카인 수용체 융합 단백질이다.
시토카인은 작고 분비된 세포 신호전달 단백질로, 세포 성장 및 분화의 조절과 면역 기능의 조정을 포함한 광범위한 활성을 갖는다. 시토카인, 시토카인 수용체, 및 특정의 다른 면역조정 단백질이 각종 의학적 병태를 치료하기 위한 치료제로서 사용되어 왔다. 그러나, 예를 들어, 피하 또는 혈관 경로에 의한 이러한 단백질의 투여는 부적절한 세포성 및 세포외 국재화를 초래하여, 치료 활성을 제한하고/거나 독성의 위험을 증가시킬 수 있다.
전환 성장 인자-β (TGFβ)는 염증성 및 알레르기성 면역 반응의 제한 및 종결과 같은 면역조절 특성을 수반한 다면발현성 시토카인이다 (Taylor (2009) J. Leukoc. Biol. 85(1):29-33). TGFβ는 염증성, 악성, 감염성 및 자가면역 질환 뿐만 아니라 섬유증 및 골다공증, 예컨대 간경변 및 전신성 경화증에 연루되어 있다. 특히, 종양에서 지속적으로 높은 수준의 TGFβ는 면역 내성, 혈관형성, 전이, 및 증가된 종양 세포외 매트릭스 침착과 연관이 있으며, 이들 모두가 암의 진행 및 치료에 대한 내성을 구동시킬 수 있다.
TGFβ를 트래핑 또는 격리하고, 이에 따라서 TGFβ 활성을 저하시키거나 또는 조정하기 위한 몇 가지 치료제가 개발되어 있다. 그의 예는 TGFβ에 대항하여 유도된 모노클로날 항체, 예를 들어, 암 및 전신성 경화증의 치료를 위한 몇 가지 임상 시험에서 투여되어 왔던 프레솔리무맙을 포함한다 (Connolly et al. (2012) Int. J. Biol. Sci. 8(7): 964-78).
모노클로날 항체에 대한 대안적 접근법은 TGFβ 유형 II 수용체 (TβRII) 또는 TGFβ 유형 III 수용체 (TβRIII, 또는 베타글리칸)의 세포외 도메인의 가용성 부분을 함유하는 재조합 Fc-융합 단백질의 사용을 포함한다 (Connolly et al. (2012); 상기 참조). TGFβ 트랩으로서 공지된 이러한 분자는 전형적으로, 이량체성 TGFβ 수용체 복합체의 2개 쇄의 세포외 도메인을 함유한다. 가용성 TβRII-Fc 융합물의 발현은 종양용해성 아데노바이러스와 커플링되어 원발성 종양 성장 및 골 용해성 골 파괴의 상당한 저하를 초래하는 것으로 제시된 바 있다 (Hu et al. (2010) Hum. Gene Ther. 21(11): 1623-9).
지금까지의 노력에도 불구하고, 개선된 융합 단백질, 예를 들어, 시토카인 수용체 융합 단백질, 특히 TGFβ에 의해 매개된 인간 환자에서 장애를 치료하기 위해 인간 TGFβ의 생물학적 활성을 중화시키는 개선된 TGFβ 수용체 융합 단백질에 대한 필요성이 대두된다.
본 발명은 부분적으로, 융합 단백질, 예를 들어, 시토카인 수용체 융합 단백질, 예를 들어, TGFβ 유형 II (TβRII) 수용체 융합 단백질, 예를 들어, TGFβ 트랩의 기능을 개선시키는 링커 서열의 발견에 근거한다. 이러한 링커 서열은 융합 단백질의 리간드 결합 부분 (예를 들어, 시토카인 수용체)이 리간드 (예를 들어, 시토카인)와 최적으로 결합할 수 있게 하거나, 융합 단백질의 2종 이상의 구성성분 (예를 들어, 이량체성 시토카인의 2종의 서브유닛)의 시간적 및 공간적 공존을 제공할 수 있게 하거나, 발현 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)로부터의 발현을 최적화시킬 수 있게 하거나, 면역원성을 저하시킬 수 있게 하거나, 또는 융합 단백질의 구성성분의 방출을 허용하는 절단 부위를 제공할 수 있게 한다. 예를 들어, 링커 서열은 시토카인 수용체의 리간드 결합 도메인이 융합 단백질과 관련하여 천연 입체 형태를 채택하고 치료제로서 사용하기 위해 융합 단백질의 잠재적 면역원성을 최소화할 수 있도록 충분한 가요성을 제공할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 단리된 융합 단백질을 제공한다: 예를 들어, N-말단에서 C-말단 배향으로: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제1 부분; 아미노산 링커; 및 하기 중 적어도 하나: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제2 부분; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인. 특정 실시양태에서, 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단 배향으로: 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분; 아미노산 링커; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인을 포함하며; 여기서 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질을 제공한다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는, 예를 들어, 약 5 내지 약 15, 약 5 내지 약 20, 약 5 내지 약 30, 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 40, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 30, 또는 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 내인성 인간 단백질, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, 알부민, 또는 카세인으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 이뮤노글로불린 (Ig) CH1 도메인, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM CH1 도메인의 C-말단 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 IgG1 CH1 도메인의 C-말단 부분을 포함하고, 예를 들어, 아미노산 링커는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 시토카인, 신호전달 분자, 면역조정 단백질 또는 펩티드, 또는 생물학적으로 활성인 펩티드로부터 유래된 서열을 포함한다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 절단 부위, 예를 들어, 단백질분해적 절단 부위, 예를 들어, 진핵 세포의 내형질 세망 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 단백질분해적 절단 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 푸린 절단 부위, 예를 들어, 서열 RX1X2R (서열식별번호: 50) (여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 포함하는 푸린 절단 부위, 예를 들어, 서열 RAKR (서열식별번호: 51)을 포함하는 푸린 절단 부위이다. 전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 포유동물 또는 식물에서 단백질분해적으로 안정하다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은 인간 TβRII 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 23-159를 포함한다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 TGF-β, CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL-23A/p19, IL27A/p28, IL-27B/EBI3, CD154, CD86, CD137, CD137L, IFN-α, IFN-β, BORIS/CTCFL, FGF, ICAM, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 기능적 단편 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 융합 단백질은: CD80과 CD137L; IL-23A/p19와 IL-12B/p40; 또는 IL-27A/p28과 IL-27B/EBI3을 포함할 수 있다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, Ig 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM 힌지 영역으로부터 선택되고, Ig Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM Fc 도메인으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Ig 힌지 영역과 Fc 도메인은 함께 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Ig Fc, Ig 힌지 영역, 및 Ig CH1 도메인은 단일 이뮤노글로불린으로부터 유래된다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 융합 단백질 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 서열과의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 함께 공유적으로 연결된 전술한 융합 단백질 중 임의의 것 2개를 포함하는 이량체성 시토카인 결합 단백질을 제공하며, 여기서 각각의 융합 단백질은 시토카인 수용체의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 2개의 세포외 도메인은 함께, 시토카인에 대한 결합 부위를 규정한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 융합 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 핵산 중 임의의 것을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 발현 벡터는 종양용해성 바이러스일 수 있으며, 예를 들어, 바이러스는 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제될 수 있고/거나 융합 단백질을 과다증식성 세포에서 선택적으로 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 종양용해성 아데노바이러스, 예를 들어, 종양용해성 유형 2 또는 유형 5 아데노바이러스이다.
전술한 발현 벡터 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 E1b-19K의 출발 부위와 E1b-55K의 출발 부위 사이에 위치한 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입된다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위와 E1b-19K의 정지 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드, 예를 들어, 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 1714에 상응하는 뉴클레오티드와 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 53)와 TCACCAGG (서열식별번호: 54) 사이에 삽입되며, 예를 들어, 아데노바이러스는, 5'에서 3' 배향으로, CTGACCTC (서열식별번호: 53), 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 54)를 포함한다.
전술한 발현 벡터 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아데노바이러스는 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아데노바이러스는 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실, 또는 E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있고/거나 재조합 아데노바이러스는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 55)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 종양용해성 아데노바이러스는 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있고, E2F 결합 부위의 결실은 포함하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스는 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스는 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함할 수 있고, Pea3 결합 부위의 결실은 포함하지 않을 수 있다.
전술한 발현 벡터 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 아데노바이러스는 E3 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실 부위는 pVIII의 정지 부위와 Fiber의 출발 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실 부위는 E3-10.5K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 E3 결실 내로 삽입되며, 예를 들어, 상기 뉴클레오티드 서열은 CAGTATGA (서열식별번호: 56)와 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57) 사이에 삽입되고, 예를 들어, 아데노바이러스는, 5'에서 3' 배향으로, CAGTATGA (서열식별번호: 56), 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양용해성 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위와 E1b-55K의 출발 부위, 및/또는 변형된 E1a 조절 서열 사이에 위치하고, 여기서 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분은 결실된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 전술한 발현 벡터 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 융합 단백질을 발현하는 조건 하에 숙주 세포를 성장시키는 것 및 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는, 상기 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포를 전술한 발현 벡터 중 임의의 것의 유효량에 노출시키는 것을 포함하는, 상기 표적 세포에서 융합 단백질을 발현하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 번역후에 2개의 폴리펩티드 쇄로 절단된다.
또 다른 측면에서, 전술한 융합 단백질 또는 발현 벡터 중 임의의 것은, 예를 들어, 대상체에서 시토카인 활성을 저하시킴으로써, 시토카인, 예를 들어, TGFβ에 의해 매개되는 다양한 의학적 적응증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 전술한 융합 단백질 또는 발현 벡터 중 임의의 것은 시험관내 및/또는 생체 내에서 종양 세포의 증식을 억제하거나, 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제하거나, 또는 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 대상체는, 예를 들어, 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간, 예를 들어, 소아 인간일 수 있다. 예를 들어, 암에 걸린 인간 대상체에게 투여되는 경우에, 상기 융합 단백질 또는 발현 벡터는 이러한 대상체에서 종양 성장을 억제 또는 저하시키거나, 또는 종양 부하를 저하시킨다.
특정 실시양태에서, 암은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 및 중추 신경계 암, 갑상선암, 부갑상선암 (예를 들어, 부갑상선 암종), 자궁내막암, 신경내분비암, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨), 백혈병, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 다발성 골수종, 자궁암, 육종, 신장암, 안구암, 췌장암, 및 배세포암 (예를 들어, 난소 배세포암)으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 백혈병, 유방암, 폐암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 뇌암, 피부암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 및 백혈병으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질 또는 발현 벡터는 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스 요법으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 조합하여 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질 또는 발현 벡터는 림프구, 예를 들어, T-세포, 예를 들어, CAR T-세포와 조합하여 투여된다.
전술한 융합 단백질 또는 발현 벡터 중 임의의 것은 또한, 염증성 병태 또는 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 병태 또는 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위에 의해 예시된다.
본 발명은 하기 도면을 참조로 하여 더 완전히 이해될 수 있다.
도 1a는 세포 표면 상의 이량체성 시토카인 수용체 (좌측), 항체 (중앙), 및 표적 시토카인에 최적으로 결합하는 수용체-Fc 융합물 (우측)의 개략도를 도시한다. 도 1b는 표적 시토카인과의 최적의 결합을 입체적으로 제한하거나 (좌측), 또는 최적의 결합 입체 배치를 채택하는 (우측) 수용체-Fc 융합물, 예를 들어, 시토카인 트랩을 도시한다.
도 2는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM CH1 도메인 (상단) 및 CH2 도메인 (하단)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 도시한다.
도 3은 리포터 세포를 TGFβ 및/또는 표시된 바와 같은 TGFβ 유형 II 수용체 융합 단백질 hTGFβR-IgG-1 및 hTGFβR-Fc로 처리한 후 인산화된 Smad2에 대한 웨스턴 블롯을 도시한다. 전체 Smad2 및 Smad3이 부하 대조군으로서 사용되었다. TGFβ 활성은 hTGFβR-Fc와 비교 시 hTGFβR-IgG-1에 의해 현저하게 저하되었다.
도 4는 리포터 세포를 TGFβ 및/또는 표시된 바와 같은 TGFβ 유형 II 수용체 융합 단백질 hTGFβR-IgG1-1 (1), hTGFβR-IgG1-2 (2), hTGFβR-IgG1-3 (3), 및 hTGFβR-IgG1-4 (4)로 처리한 후 인산화된 Smad2에 대한 웨스턴 블롯을 도시한다. β-액틴이 부하 대조군으로서 사용되었다.
도 5a-5c는 표시된 바이러스로 처리한 후 마우스 내에서의 종양 부피를 도시한다. 각각의 선은 1마리 마우스의 종양 부피를 나타낸다.
도 6a-6b는 표시된 세포주를 TGFβ 및/또는 표시된 바이러스로 처리한 후 인산화된 Smad2에 대한 웨스턴 블롯을 도시한다. 전체 Smad2 및 Smad3이 부하 대조군으로서 사용되었다.
본 발명은 대상체에서 각종 의학적 병태를 치료하는데 있어서, 예를 들어, 종양 세포의 증식을 억제하거나, 종양 성장을 억제하거나, 암을 치료하거나, 염증성 병태를 치료하거나, 또는 감염을 치료하는데 있어서 사용하기 위한 단리된 융합 단백질을 제공한다. 예시적인 융합 단백질은 하기를 포함한다: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제1 부분; 아미노산 링커; 및 하기 중 적어도 하나: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제2 부분; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인. 특정 실시양태에서, 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 예시적인 융합 단백질은 시토카인 트랩을 포함한다.
시토카인 트랩, 예를 들어 TGFβ 트랩은 표적 시토카인에 결합하거나 또는 표적 시토카인을 달리 격리하도록 설계된 시토카인 수용체, 예를 들어, TGFβ 수용체, 예를 들어, TGFβ 유형 II 수용체 (TβRII)의 세포외 도메인의 가용성 부분을 함유하는 분자이다. 시토카인 트랩에서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인은, 예를 들어, 증가된 안정성, Fc 이펙터 기능 및/또는 다량체화, 예를 들어, 이량체화를 허용할 수 있는 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인과 융합될 수 있다. Ig 힌지 영역 및 Ig Fc 도메인과의 융합에 의해 부여된 이량체화는 세포성 표면 상에서 이량체성 수용체 복합체로서 존재하는 시토카인 수용체, 예컨대, 예를 들어, TβRII에 대해 특히 유리하다.
통상적인 시토카인 트랩, 예를 들어, TGFβ 트랩은 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 각각의 폴리펩티드 쇄는 Ig 힌지 영역 및 Ig Fc 도메인과 융합된 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분을 포함한다. 이러한 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은 전형적으로, 어떠한 개재 서열도 없이, Ig 힌지 영역과 직접적으로 융합된다. 상기 2개의 폴리펩티드 쇄는 각각의 Ig 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 간의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 각각의 폴리펩티드 쇄는 시토카인 수용체, 예를 들어, TβRII의 세포외 도메인의 가용성 부분을 제공하며, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 2개의 가용성 부분은 함께, 시토카인에 대한 결합 부위를 규정한다. 이량체성 시토카인 수용체, 이뮤노글로불린 (항체) 분자, 및 각각 Ig 힌지 영역 및 Ig Fc 도메인과 융합된 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분을 포함하는 2개의 공유적으로 연결된 융합 단백질을 포함하는 이량체성 단백질을 개략적으로 나타낸 것이 도 1a에 도시된다.
본 발명은 부분적으로, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분과 Ig 힌지 영역 및 Ig Fc 도메인의 융합 단백질을 포함하는 통상적인 시토카인 트랩, 예를 들어 TGFβ 트랩이 그의 표적 시토카인에 최적으로 결합하지 않는다는 발견에 근거한다. 예를 들어, 통상적인 TGFβ 트랩은 2개의 TβRII 리간드 결합 도메인이 TGFβ 결합 부위를 규정하기 위해 최적의 입체 배치로 합칠 수 있게 하는 2개의 TβRII 리간드 결합 도메인 간의 충분한 가요성을 제공하지 못한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 N-말단에서 C-말단 배향으로: 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분; 아미노산 링커; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인을 포함하며; 여기서 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질을 제공한다. 이러한 링커 서열은, 예를 들어, 시토카인 수용체의 세포외 도메인 내의 결합 도메인이 그의 표적 시토카인에 최적으로 결합할 수 있게 한다. 이는 시토카인 결합 단백질이 표적 시토카인에 결합하는 결합 부위를 함께 규정하는 전술한 융합 단백질 중 2개를 포함하는 이량체인 경우에 특히 중요하다. 링커를 사용하지 않으면, 상기 2개의 결합 도메인은 최적의 결합 부위를 형성하는 것이 입체적으로 제한될 수 있다 (도 1b). 본 발명의 다양한 특색 및 측면이 하기에 보다 상세히 논의된다.
I. 융합 단백질
예시적인 융합 단백질은 하기를 포함할 수 있다: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제1 부분; 아미노산 링커; 및 하기 중 적어도 하나: 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제2 부분; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인. 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제1 부분은 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제2 부분과 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 고려된다.
예를 들어, 개시된 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 배향으로: 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분; 아미노산 링커; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인을 포함할 수 있으며; 여기서 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.
예시적인 시토카인은 IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-4, IL-9, IL-13, IL-3, IL-5, IL-6, IL-11, G-CSF, LIF, OSM, IL-10, IL-20, IL-14, IL-16, IL-17, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, LT-β, TNF-β, 4-1BBL APRIL, CD153, CD178, LIGHT, TALL-1, TRAIL, TWEAK, TRANCE, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Epo, Tpo, Flt-3L, SCF, M-CSF, 및 MSP를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "면역조정" 단백질은 대상체의 면역 체계의 기능을 조정하는 단백질을 지칭한다. 면역조정 단백질은, 예를 들어, B-세포, T 세포의 기능 및/또는 항체의 생산을 조정할 수 있다. 예시적인 면역조정 단백질은 체크포인트 억제제를 포함한다. 예시적인 면역조정 단백질은, 예를 들어, PD-1, 또는 PD-L1을 포함할 수 있거나, 또는 그의 활성을 조정하는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 면역조정 단백질은 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분"은 표적 시토카인에 결합할 수 있는, 시토카인 수용체의 임의의 세포외 도메인 또는 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 단편을 지칭한다. 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은 또한, 단독으로 또는 제2 결합 도메인과 조합하여 (예를 들어, 이량체성 융합 단백질의 경우에), 표적 시토카인에 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인의 부분을 고려하는 것으로 이해된다.
예시적인 시토카인 수용체는 유형 I 시토카인 수용체 (예를 들어, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 유형 I IL 수용체, Epo 수용체, LIF 수용체, CNTF 수용체, 또는 TPO 수용체), 유형 II 시토카인 수용체 (예를 들어, IFN-알파 수용체 (예를 들어, IFNAR1 또는 IFNAR2), IFN-베타 수용체, IFN-감마 수용체 (예를 들어, IFNGR1 또는 IFNGR2)), 케모카인 수용체 (예를 들어, CC 케모카인 수용체, CXC 케모카인 수용체, CX3C 케모카인 수용체, 또는 XC 케모카인 수용체), 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 수용체 (TNFR; 예를 들어, TNFRSF5/CD40, TNFRSF8/CD30, TNFRSF7/CD27, TNFRSF1A/TNFR1/CD120a, 또는 TNFRSF1B/TNFR2/CD120b), TGFβ 슈퍼패밀리 수용체 (예를 들어, TGFβ 유형 I 수용체 또는 TGFβ 유형 II 수용체), 또는 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 수용체 (예를 들어, 인터류킨-1 수용체, CSF-1R, PDGFR (예를 들어, PDGFRA 또는 PDGFRB), 또는 SCFR)를 포함한다. 바람직한 시토카인 수용체는 이량체성 시토카인 수용체, 예를 들어, TGFβ 슈퍼패밀리 수용체, 예를 들어, 인간 TGFβ 유형 II 수용체 (TβRII)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은, 예를 들어, 서열식별번호: 12의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 12와의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는 TGFβ와 결합하는 결합 도메인을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 인간 TGFβ 유형 II 수용체 (TβRII)의 세포외 도메인의 가용성 부분이다.
시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분은 그의 천연 리간드와 결합할 수 있는 그의 능력을 보유하고 있다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인의 가용성 부분은 완전한 길이의 시토카인 수용체와 비교 시 그의 천연 리간드와의 결합 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 보유한다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은, 예를 들어, TβRII, TGF-β, CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL-23A/p19, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, CD154, CD86, CD137, CD137L, IFN-α, IFN-β, BORIS/CTCFL, FGF, ICAM, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 기능적 단편 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은: CD80과 CD137L; IL-23A/p19와 IL-12B/p40; 또는 IL-27A/p28과 IL-27B/EBI3을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 CH1 도메인과 CH2 도메인을 전형적으로 연결시켜 주는 아미노산 서열을 지칭한다. Ig 힌지 영역은, 예를 들어, 또 다른 단백질 쇄에서 시스테인 잔기와의 디술피드 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인"은 Fc 수용체와 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 단편을 지칭한다. Ig Fc 도메인은, 예를 들어, 이뮤노글로불린 (Ig) CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. Ig CH1, CH2, 및 CH3 도메인 간의 경계는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, PROSITE 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (월드 와이드 웹 prosite.expasy.org에서 이용가능함). 명확하게 하기 위해, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM CH1 및 CH2 도메인의 아미노산 서열의 정렬이 도 2에 제공된다.
특정 실시양태에서, Ig 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM 힌지 영역으로부터 선택되고, Ig Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM Fc 도메인으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, Ig 힌지 영역과 Fc 도메인은 함께 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Ig 힌지 영역과 Fc 도메인은 함께 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 21로부터 선택된 서열과의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산 링커는 융합 단백질의 리간드 결합 부분 (예를 들어, 시토카인 수용체)이 리간드 (예를 들어, 시토카인)와 최적으로 결합할 수 있게 하거나, 융합 단백질의 2종 이상의 구성성분 (예를 들어, 이량체성 시토카인의 2종의 서브유닛)의 시간적 및 공간적 공존을 제공할 수 있게 하거나, 발현 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)로부터의 발현을 최적화시킬 수 있거나, 면역원성을 저하시킬 수 있게 하거나, 또는 융합 단백질의 구성성분의 방출을 허용하는 절단 부위를 제공할 수 있게 한다.
아미노산 링커는, 예를 들어, 약 5 내지 약 15, 약 5 내지 약 20, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 10 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 약 10 내지 약 25, 약 10 내지 약 30, 약 10 내지 약 35, 약 10 내지 약 40, 약 15 내지 약 20, 약 15 내지 약 25, 약 15 내지 약 30, 약 15 내지 약 35, 또는 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커 내의 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 변형된 아미노산일 수 있다.
특정 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 내인성 인간 단백질, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM, 알부민, 또는 카세인으로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 이뮤노글로불린 (Ig) CH1 도메인, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM CH1 도메인의 C-말단 부분, 예를 들어, 약 5 내지 약 40개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열과의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드가 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 아미노산 서열의 전부 또는 상응하는 부분과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 경우에, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 참조 단백질 또는 폴리펩티드로부터 "유래된다". 특정 실시양태에서, 야생형 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래되는 단백질 또는 폴리펩티드는 이러한 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 야생형 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래되는 단백질 또는 폴리펩티드는 이러한 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와의 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 가질 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 야생형 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래되는 단백질 또는 폴리펩티드는 이러한 야생형 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보존적 치환"은 구조적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 하기 군 내에서의 치환을 포함할 수 있다: Ser 및 Cys; Leu, Ile, 및 Val; Glu 및 Asp; Lys 및 Arg; Phe, Tyr, 및 Trp; 및 Gln, Asn, Glu, Asp, 및 His. 보존적 치환은 또한, BLAST (기본 로컬 정렬 검색 도구) 알고리즘, BLOSUM 치환 매트릭스 (예를 들어, BLOSUM 62 매트릭스), 또는 PAM 치환:p 매트릭스 (예를 들어, PAM 250 매트릭스)에 의해 규정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 아미노산 링커 서열은 시토카인, 신호전달 분자, 면역조정 단백질 또는 펩티드, 또는 생물학적으로 활성인 펩티드로부터 유래된다.
추가로 고려되는 링커 서열은 글리신- 및 세린-풍부 링커, 예를 들어, (G4S)3 (서열식별번호: 49)을 포함한다. 부가의 예시적인 링커 서열이, 예를 들어, 문헌 [George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879] 및 미국 특허 번호 5,482,858 및 5,525,491에 개시된다.
특정 실시양태에서, 아미노산 링커는 절단 부위, 예를 들어, 단백질분해적 또는 비-단백질분해적 절단 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 특이적 조직, 세포 소기관 또는 세포내 구획에 존재하는 프로테아제에 의해 절단된다. 특정 실시양태에서, 링커는 단백질분해적 절단 후 디술피드 연결을 초래하는 2개의 시스테인 잔기 및 단백질분해적 절단 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 푸린, PC1, PC2, PC3, 카텝신 B, 프로테이나제 3, 및 카스파제 3으로부터 선택된 프로테아제에 의해 절단된다. 특정 실시양태에서, 절단 부위는 진핵 세포의 내형질 세망 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 단백질분해적 절단 부위이다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 푸린 절단 부위이다. 푸린은 유비쿼터스하게 발현되고 골지에 국재되는 프로테아제이며, 여기서 이는 컨센서스 서열 RX1X2R (서열식별번호: 50) (여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 인식하고, 최종 Arg 다음을 절단한다. 푸린은 골지를 통하여 트래피킹되는 단백질의 프로펩티드를 절단하는데 있어서 생물학적 역할을 한다. 따라서, 특정 실시양태에서 단백질분해적 절단 부위는 서열 RX1X2R (서열식별번호: 50) (여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 포함하는 푸린 절단 부위, 예를 들어, 서열 RAKR (서열식별번호: 51)을 포함하는 푸린 절단 부위이다.
특정 실시양태에서, Ig Fc, Ig 힌지 영역, 및 Ig CH1 도메인은 단일 이뮤노글로불린으로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 개시된 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 서열과의 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 동일성은, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 관련 기술분야에서의 기술 수준 내에 있는 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx (문헌 [Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 참조로 포함됨)에 의해 이용된 알고리즘을 사용하는 BLAST (기본 로컬 정렬 검색 도구) 분석은 서열 유사성 검색에 맞춰져있다. 서열 데이터베이스 검색에 있어서의 기본 쟁점에 관한 논의에 대해서는, 문헌 [Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129; 참조로 완전히 포함됨]을 참조할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 완전한 길이의 서열 전반에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하는데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 히스토그램, 설명, 정렬, 기대 (즉, 데이터베이스 서열에 대항한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의성 한계치), 컷오프, 매트릭스 및 필터에 대한 검색 파라미터가 디폴트 설정 하에 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 사용된 디폴트 스코어링 매트릭는 BLOSUM62 매트릭스이다 (Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; 완전히 참조로 포함됨). 4가지 blastn 파라미터는 다음과 같이 조정될 수 있다: Q=10 (갭 생성 패널티); R=10 (갭 연장 패널티); wink=1 (쿼리를 따라 모든 wink.sup.th 위치에서 단어 히트를 생성함); 및 gapw=16 (간격이 지정된 정렬이 생성되는 창 폭을 설정함). 등가의 Blastp 파라미터 설정은 Q=9; R=2; wink=1; 및 gapw=32일 수 있다. 검색은 또한, NCBI (미국 국립 생명공학 정보 센터) BLAST 어드밴스드 옵션 파라미터를 사용하여 시행될 수 있다 (예를 들어: -G, 갭을 개봉하기 위한 비용 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우에 5/ 단백질의 경우에 11; -E, 갭을 연장하기 위한 비용 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우에 2/ 단백질의 경우에 1; -q, 뉴클레오티드 미스매치에 대한 패널티 [정수]: 디폴트 = -3; -r, 뉴클레오티드 매치에 대한 보상 [정수]: 디폴트 = 1; -e, 기대 값 [실수]: 디폴트 = 10; -W, 단어 크기 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우에 11/ 메가blast의 경우에 28/ 단백질의 경우에 3; -y, 비트 단위의 blast 연장에 대한 감산 (X): 디폴트 = blastn의 경우에 20/ 다른 것의 경우에 7; -X, 간격이 지정된 정렬에 대한 X 감산 값 (비트): 디폴트 = blastn에 적용가능하지 않는, 모든 프로그램의 경우에 15; 및 -Z, 간격이 지정된 정렬에 대한 최종 X 감산 값 (비트): blastn의 경우에 50, 다른 것의 경우에 25). 쌍을 이룬 단백질 정렬을 위한 클러스탈(Clustal)W가 또한 사용될 수 있다 (디폴트 파라미터는, 예를 들어, Blosum62 매트릭스 및 갭 개방 패널티 = 10 및 갭 연장 패널티 = 0.1을 포함할 수 있음). GCG 패키지 버전 10.0으로 이용가능한, 서열 간의 Bestfit 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 패널티) 및 LEN=3 (갭 연장 패널티)을 사용하며, 단백질 비교에 있어서의 등가 설정은 GAP=8 및 LEN=2이다.
한 측면에서 본 발명은 2개의 융합 단백질을 포함하는 시토카인 결합 단백질을 제공하며, 여기서 각각의 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단 배향으로: 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분; 아미노산 링커; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인을 포함하고; 여기서 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 2개의 융합 단백질은 함께 공유적으로 연결되고, 여기서 2개의 세포외 도메인은 함께, 시토카인에 대한 결합 부위를 규정한다.
시토카인 결합 단백질은 함께 공유적으로 연결된 전술한 융합 단백질 중 2개를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 융합 단백질은 시토카인 수용체의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 2개의 세포외 도메인은 함께, 시토카인에 대한 결합 부위를 규정한다. 융합 단백질은, 예를 들어, 각각의 융합 단백질의 Ig 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 간의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단량체성 또는 다량체성 (예를 들어, 이량체성) 중 하나인 융합 단백질은 천연의 완전한 길이의 시토카인 수용체와 비교 시 표적 리간드의 결합 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 보유한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 시토카인 결합 단백질은 200 nM, 100 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 50 pM, 25 pM 또는 그 미만의 KD로 시토카인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 시토카인 결합 단백질은 200 nM 내지 100 nM, 200 nM 내지 20 nM, 200 nM 내지 10 nM, 200 nM 내지 5 nM, 200 nM 내지 1 nM, 200 nM 내지 50 pM, 200 nM 내지 25 pM, 100 nM 내지 20 nM, 100 nM 내지 10 nM, 100 nM 내지 5 nM, 100 nM 내지 1 nM, 100 nM 내지 50 pM, 100 nM 내지 25 pM, 20 nM 내지 10 nM, 20 nM 내지 5 nM, 20 nM 내지 1 nM, 20 nM 내지 50 pM, 20 nM 내지 25 pM, 10 nM 내지 5 nM, 10 nM 내지 1 nM, 10 nM 내지 50 pM, 10 nM 내지 25 pM, 5 nM 내지 1 nM, 5 nM 내지 50 pM, 5 nM 내지 25 pM, 1 nM 내지 50 pM, 1 nM 내지 25 pM, 또는 50 pM 내지 25 pM의 KD로 시토카인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 시토카인 결합 단백질은 200 nM, 100 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 50 pM, 25 pM 또는 그 미만의 KD로 TGFβ와 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 시토카인 결합 단백질은 200 nM 내지 100 nM, 200 nM 내지 20 nM, 200 nM 내지 10 nM, 200 nM 내지 5 nM, 200 nM 내지 1 nM, 200 nM 내지 50 pM, 200 nM 내지 25 pM, 100 nM 내지 20 nM, 100 nM 내지 10 nM, 100 nM 내지 5 nM, 100 nM 내지 1 nM, 100 nM 내지 50 pM, 100 nM 내지 25 pM, 20 nM 내지 10 nM, 20 nM 내지 5 nM, 20 nM 내지 1 nM, 20 nM 내지 50 pM, 20 nM 내지 25 pM, 10 nM 내지 5 nM, 10 nM 내지 1 nM, 10 nM 내지 50 pM, 10 nM 내지 25 pM, 5 nM 내지 1 nM, 5 nM 내지 50 pM, 5 nM 내지 25 pM, 1 nM 내지 50 pM, 1 nM 내지 25 pM, 또는 50 pM 내지 25 pM의 KD로 TGFβ와 결합한다. KD 값은 표면 플라스몬 공명 또는 바이오 층 간섭계 방법을 포함한, 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 예시적인 융합 단백질은 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 명확하게 하기 위해, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분, 아미노산 링커, Ig 힌지 영역, 및 Ig Fc 도메인을 포함한, 이들 단백질의 개별 요소의 서열, 및 그로부터 개별 요소의 서열이 유래되는 단백질이 표 1에 제시된다.
표 1
Figure pct00001
표 2
Figure pct00002
II. 융합 단백질 생산
본 발명의 융합 단백질을 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 개시된 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 합성 DNA 분자는, 예를 들어, 발현 제어 서열을 포함한 다른 적절한 뉴클레오티드 서열과 라이게이션하여, 원하는 융합 단백질을 코딩하는 통상적인 유전자 발현 구축물을 생산할 수 있다. 규정된 유전자 구축물의 생산은 관련 기술분야의 일상적인 기술 수준 이내이다. 서열식별번호: 22-32의 융합 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 서열 서열식별번호: 37-47은 표 2에서 찾을 수 있다.
원하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 발현 벡터 내로 혼입 (라이게이션)될 수 있고, 이는 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예시적인 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 골수종 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 이러한 숙주 세포가 원하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있게 하는 조건 하에 성장시킬 수 있다.
특이적 발현 및 정제 조건은 이용된 발현 시스템에 따라서 다양할 것이다. 예를 들어, 유전자가 이. 콜라이에서 발현되어야 하는 경우에, 이는 먼저, 적합한 박테리아 프로모터, 예를 들어, Trp 또는 Tac, 및 원핵 신호 서열로부터 하류에 상기 조작된 유전자를 위치시킴으로써 발현 벡터 내로 클로닝된다. 이와 같이 발현된 분비된 단백질은 굴절 소체 또는 봉입체에 축적되며, 프렌치 프레스 또는 초음파처리에 의해 세포가 파괴된 후 수거될 수 있다. 이어서, 굴절 소체를 가용화시키고, 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 단백질을 리폴딩 및 절단한다.
조작된 유전자가 진핵 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 발현되어야 하는 경우에, 이는 먼저, 적합한 진핵 프로모터, 분비 신호, 폴리 A 서열, 및 정지 코돈을 함유하는 발현 벡터 내로 삽입되며, 이는 임의로, 인핸서 및 다양한 인트론을 함유할 수 있다. 유전자 구축물은 통상적인 기술을 사용하여 진핵 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
개시된 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에, 상기 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 성장 (배양)시킴으로써 생산될 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어, 친화성 태그, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 히스티딘 태그를 사용하여 수거하고 정제 또는 단리될 수 있다.
III. 바이러스 벡터
특정 실시양태에서, 개시된 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 용어 "바이러스 벡터" 및 "바이러스"는 단백질 합성 또는 에너지 생성 메카니즘을 갖지 않는 절대적인 세포내 기생충 중 임의의 것을 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 바이러스 게놈은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스는, 바람직하게 바쿨로비리디아에(baculoviridiae), 파보비리디아에(parvoviridiae), 피코르노비리디아에(picornoviridiae), 헤르페스비리디아에(herpesviridiae), 폭시이리다에(poxyiridae), 또는 아데노비리디아에(adenoviridiae)로부터 선택된, 재조합 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 바이러스는 외인성 트랜스진의 발현을 포함하도록 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있으며, 복제 결핍성이거나, 조건부로 복제되거나, 또는 복제 적격하도록 조작될 수 있다. 각각의 모 벡터 특성의 유리한 요소를 활용하는 키메라 바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌 [Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870] 참조)가 또한, 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 치료하고자 하는 종으로부터의 바이러스를 이용하는 것이 일반적으로 선호되지만, 일부 경우에는 바람직한 병원성 특색을 보유하는 상이한 종으로부터 유래된 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자 요법을 위한 말 헤르페스 바이러스 벡터가 PCT 공개 번호 WO 98/27216에 기재되어 있다. 이러한 벡터는 말 바이러스가 인간에게 병원성이 아니기 때문에 인간의 치료에 유용한 것으로서 기재되어 있다. 유사하게, 양 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 벡터에 대항한 항체를 피하는 것으로 주장되고 있기 때문에 인간 유전자 요법에 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 PCT 공개 번호 WO 97/06826에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 종양용해성 바이러스, 예를 들어, 종양 선택적 복제 및/또는 바이러스 매개된 용해를 나타내는 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 개시된 융합 단백질의 선택적 발현을 허용하며, 예를 들어, 상기 바이러스는 신생물 세포에서의 융합 단백질의 발현은 허용하지만, 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 세포에서의 융합 단백질의 발현은 과다증식성 세포에서의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스는 비-과다증식성 세포에서의 융합 단백질의 검출가능한 발현을 나타내지 않는다. 융합 단백질 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 과다증식성 세포는 암 세포, 예를 들어, 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 폐암, 위장관 암, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 갑상선암, 중피종, 간암, 신장암, 피부암, 두경부암, 또는 뇌암 세포일 수 있다.
바람직하게, 바이러스 벡터는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기 (90-100 nm)의 비-외피보유 (네이키드) 20면체 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유동물 세포의 핵에서 복제된다. 용어 "아데노바이러스"는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린, 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아데노비리디아에 속의 임의의 바이러스를 지칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 A-F 아속 뿐만 아니라 그의 개별 혈청형을 포함하며, 이러한 개별 혈청형 및 A-F 아속은 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a 및 Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 및 91을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인간 아데노바이러스 유형 2 및 5로부터 유래된 벡터가 바람직하다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 아데노바이러스 유형 5 뉴클레오티드 수는 NCBI 참조 서열 AC_000008.1 (이는 본원에 서열식별번호: 52로 제시됨)에 비례한다.
아데노바이러스 복제 주기는 2가지 단계를 갖는다: 4개의 전사 단위 (E1, E2, E3 및 E4)가 발현되는 초기 단계, 및 바이러스 DNA 합성의 개시 이후에 발생하고 후기 전사체가 주요 후기 프로모터 (MLP)로부터 주로 발현되는 후기 단계. 후기 메시지는 대부분의 바이러스의 구조 단백질을 코딩한다. E1, E2 및 E4의 유전자 산물은 전사 활성화, 세포 형질전환, 바이러스 DNA 복제 뿐만 아니라 다른 바이러스 기능에 대해 책임이 있고, 바이러스 성장에 필요하다.
용어 "작동적으로 연결된"이란 기능적 관계에 있는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산 서열이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓여질 때 이러한 핵산 서열은 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우에, 이러한 프로모터 또는 인핸서는 상기 유전자와 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 연속된다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 수 킬로염기만큼 프로모터로부터 분리될 때 기능하고 인트론성 서열은 다양한 길이일 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동적으로 연결될 수 있지만, 직접적으로 플랭킹되지 않고, 심지어 상이한 대립 유전자 또는 염색체로부터 트랜스로 기능할 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이러스는 조절 서열 또는 프로모터에 대한 하나 이상의 변형을 갖는다. 조절 서열 또는 프로모터에 대한 변형은 이러한 조절 서열 또는 프로모터의 야생형 서열과 비교 시 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 변형은, 예를 들어, 전사 인자의 부분을 결실시킴으로써 또는 단일 점 돌연변이를 전사 인자 결합 부위 내로 삽입함으로써, 전사 인자에 대한 친화성을 저하시키기 위한 전사 인자 결합 부위의 서열의 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 부가의 변형된 조절 서열은 신생물성 세포에서의 발현을 증강시키지만, 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다.
특정 실시양태에서, 상기 변형된 조절 서열은 단백질을 코딩하는 서열과 작동적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자 (코딩 영역) 중 적어도 하나는 변형된 조절 서열과 작동적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, E1a 유전자는 상기 변형된 조절 서열과 작동적으로 연결된다.
E1a 조절 서열은 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및 Pea3 V로 지명된, 전사 인자 Pea3에 대한 5개의 결합 부위를 함유하며, 여기서 Pea3 I은 E1a 출발 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이고, Pea3 V은 가장 원위이다. E1a 조절 서열은 또한, 전사 인자 E2F에 대한 결합 부위를 함유하며, 이로써 E2F I 및 E2F II로 지명되고, 여기서 E2F I은 E1a 출발 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F II는 가장 원위이다. E1a 출발 부위로부터, 상기 결합 부위는 다음과 같이 배열된다: Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV, 및 Pea3 V.
특정 실시양태에서, 이들 7개의 결합 부위 중 적어도 하나, 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. "기능적 부분"은 결실될 때, 그의 각각의 전사 인자 (Pea3 또는 E2F)에 대한 결합 부위의 기능성, 예를 들어 결합 친화성을, 완전한 서열과 비교하여, 예를 들어, 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%만큼 감소시키거나 또는 심지어 제거하는 결합 부위의 부분이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 전체 결합 부위가 결실된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 결합 부위의 기능적 부분이 결실된다. "결실된 결합 부위"는 전체 결합 부위의 결실과 그의 기능적 부분의 결실 둘 다를 포괄한다. 2개 이상의 결합 부위가 결실되는 경우에, 전체 결합 부위 결실과 기능적 부분 결실의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. 이와 같이 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 상기 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 상기 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및/또는 Pea3 III이다. 특정 실시양태에서, 상기 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II와 Pea3 III 둘 다이다. 특정 실시양태에서, Pea3 I 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분이 보유된다.
특정 실시양태에서, 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분이 결실된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 E2F 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분이 보유된다. 특정 실시양태에서, 이와 같이 보유된 E2F 결합 부위는 E2F I 및/또는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 상기 보유된 E2F 결합 부위는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 전체 결실은 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V 중 하나 이상, 또는 그의 기능적 부분으로 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 바이러스는, 예를 들어, Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 195-244에 상응하는, E1a 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 위치한 50개 염기쌍 영역의 결실을 가지며, 이는 TAV-255 결실로서 후술된다. 특정 실시양태에서, 이러한 TAV-255 결실은 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 55)를 포함하는 E1a 프로모터를 초래한다.
아데노바이러스 E1b-19k 유전자는 주로 항아폽토시스 유전자로서 기능하며, 세포성 항아폽토시스 유전자인 BCL-2의 상동체이다. 자손 바이러스 입자의 성숙 이전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한할 것이기 때문에, E1b-19k는 조기 세포 사멸을 방지하여 감염을 진행시키고 성숙한 비리온을 산출하도록 El 카세트의 일부로서 발현된다. 따라서, 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위를 포함하는 재조합 바이러스가 제공되며, 예를 들어, 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입된 개시된 융합 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는, E1b-19k의 출발 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-55K의 출발 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 2019-2021에 상응하는, E1b-55k의 출발 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 본 발명의 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 2개 부위 사이의 삽입, 예를 들어, (i) 제1 유전자 (예를 들어, E1b-19k)의 출발 부위와 제2 유전자 (예를 들어, E1b-55K)의 출발 부위 사이의 삽입, (ii) 제1 유전자의 출발 부위와 제2 유전자의 정지 부위 사이의 삽입, (iii) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 출발 부위 사이의 삽입, 또는 (iv) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 정지 부위 사이의 삽입은 이러한 삽입을 둘러싸고 있는 소정의 출발 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 부분이 최종 바이러스에 존재 또는 부재할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 유사하게, 2개의 뉴클레오티드 사이의 삽입은 이러한 삽입을 둘러싸고 있는 뉴클레오티드가 최종 바이러스에 존재 또는 부재할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는, E1b-19k의 출발 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-19K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 2242-2244에 상응하는, E1b-19k의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드, 예를 들어, 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 외인성 뉴클레오티드 서열는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 1714에 상응하는 뉴클레오티드와 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 53)와 TCACCAGG (서열식별번호: 54) 사이에 삽입되며, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스는, 5'에서 3' 배향으로, CTGACCTC (서열식별번호: 53), 외인성 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 54)를 포함한다. CTGACCTC (서열식별번호: 53) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 54)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52) 내의 E1b-19K 삽입 부위에 대한 특유한 경계 서열을 규정한다. 본 발명의 상세한 설명과 청구범위 전반에 걸쳐, 특정 부위에 인접한 결실, 예를 들어, 특정 유전자의 출발 부위에 인접한 결실 또는 특정 유전자의 정지 부위에 인접한 결실은, 이러한 결실이 소정의 출발 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 부분의 결실을 포함할 수 있거나 또는 상기 뉴클레오티드 중 어떠한 것의 결실도 포함하지 않을 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
특정 실시양태에서 재조합 아데노바이러스는 E3 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 결실은 pVIII의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 27855-27857에 상응하는, pVIII의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)와 Fiber의 출발 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 31042-31044에 상응하는, Fiber의 출발 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 29770-29772에 상응하는, E3-10.5K의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 29770-29772에 상응하는, E3-10.5K의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 29215-29217에 상응하는, E3-gp19K의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1824개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예를 들어, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E3 삽입 부위를 포함하며, 예를 들어, 아데노바이러스는 E3 결실 내로 삽입된 개시된 융합 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 29773에 상응하는 뉴클레오티드와 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 CAGTATGA (서열식별번호: 56)와 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57) 사이에 삽입되며, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스는, 5'에서 3' 배향으로, CAGTATGA (서열식별번호: 56), 외인성 뉴클레오티드 서열, 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57)를 포함한다. CAGTATGA (서열식별번호: 56) 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52) 내의 E3 삽입 부위에 대한 특유한 경계 서열을 규정한다.
특정 실시양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 29218에 상응하는 뉴클레오티드와 30839에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 TGCCTTAA (서열식별번호: 58)와 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 59) 사이에 삽입되며, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스는, 5'에서 3' 배향으로, TGCCTTAA (서열식별번호: 58), 외인성 뉴클레오티드 서열, 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 59)를 포함한다. TGCCTTAA (서열식별번호: 58) 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 59)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52) 내의 E3 삽입 부위에 대한 특유한 경계 서열을 규정한다.
이러한 본 발명의 측면의 실시에 유용한 부가의 예시적인 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 번호 9,073,980에 기재되어 있다.
IV. 융합 단백질 변형
치료제로서 사용되는 경우에, 융합 단백질은 친화성 및/또는 특이성을 포함한 생화학적 특징을 개선시키고/거나, 응집, 안정성, 침전 및/또는 비-특이적 상호 작용을 포함한 생물 물리학적 특성을 개선시키고/거나, 면역원성을 저하시키기 위해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 친화성 성숙될 수 있음). 친화성-성숙 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술 수준 내에 있다. 예를 들어, DNA 셔플링, 쇄 셔플링, CDR 셔플링, 무작위 돌연변이 유발 및/또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 개시된 융합 단백질 내로 다양성을 도입할 수 있다.
일반적으로, 최적화된 융합 단백질은, 이것이 유래되는 비-최적화된 (또는 모) 융합 단백질과 적어도 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 리간드에 대한 친화도를 갖는다. 바람직하게, 최적화된 융합 단백질은 모 융합 단백질과 비교 시 리간드에 대한 더 높은 친화도를 갖는다.
융합 단백질 (예를 들어, 모 및 최적화된 변이체)은 명시된 이펙터 기능 (예를 들어, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC))을 수반한 특정의 불변 (즉, Fc) 영역을 함유하도록 조작될 수 있다. 인간 불변 영역은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
더욱이, 융합 단백질이 치료제로서 사용하는 경우에, 이는 표준 시험관내 접합 화학을 사용하여 이펙터 인자, 예컨대 작은 분자 독소 또는 방사성핵종과 접합시킬 수 있다. 이펙터 인자가 폴리펩티드인 경우에, 항체는 이펙터와 화학적으로 접합될 수 있거나 또는 융합 단백질로서 이펙터와 연결될 수 있다. 융합 단백질의 구축은 관련 기술분야의 통상의 기술 수준 내에 있다.
V. 치료 방법
전술한 융합 단백질 또는 발현 벡터는 다양한 의학적 적응증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전술한 융합 단백질 또는 발현 벡터는 시토카인, 예를 들어 TGFβ에 의해 매개되는 의학적 적응증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 융합 단백질 및 발현 벡터는 다양한 암 또는 염증성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에서의 질환의 치료를 의미한다. 이는: (a) 상기 질환을 억제하는 것, 즉 그의 발달을 저지하는 것; 및 (b) 상기 질환을 경감시키는 것, 즉 그 질환 상태의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게, 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 보다 바람직하게 인간을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질 및 발현 벡터는 다양한 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암 세포는 이러한 암 세포의 증식을 억제 또는 저하하도록 치료상 유효량의 융합 단백질 또는 발현 벡터에 노출시킨다. 특정 실시양태에서, 치료상 유효량의 융합 단백질 또는 발현 벡터를 암 세포에 투여하면, 이러한 세포 내의 TGFβ가 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 저하된다. TGFβ 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯에 의해 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 융합 단백질 또는 발현 벡터는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체로서 지칭되기도 하는 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 유효량의 융합 단백질 또는 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유효량의 융합 단백질 또는 발현 벡터를 대상체에게 투여하면, 그러한 대상체 내에서의 종양 부하가 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%만큼 저하된다.
암의 예는 고형 종양, 연질 조직 종양, 조혈 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 조혈 종양의 예는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어, 형질전환된 CLL, 미만성 거대 B세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)을 포함한다. 고형 종양의 예는 다양한 기관 시스템의 악성 종양, 예컨대 두경부 (인두 포함), 갑상선, 폐 (소세포 또는 비소세포 폐암종 (NSCLC)), 유방, 림프계, 위장 (예를 들어, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식관 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로 상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예를 들어, 신경 또는 신경교 세포, 예를 들어, 신경모세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예를 들어, 흑색종)에 침범하는 악성 종양, 예를 들어, 육종, 선암종, 및 암종을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 및 중추 신경계 암, 갑상선암, 부갑상선암 (예를 들어, 부갑상선 암종), 자궁내막암, 신경내분비암, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨), 백혈병, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 다발성 골수종, 자궁암, 육종, 신장암, 안구암, 췌장암, 및 배세포암 (예를 들어, 난소 배세포암)으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 암은 백혈병, 유방암, 폐암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 뇌암, 피부암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 및 백혈병으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 백혈병, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 위암, 두경부암, 자궁내막암 및 난소암으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질 또는 발현 벡터는 하나 이상의 시토카인의 수준의 감소를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 염증성 병태가 있는 대상체)에서 하나 이상의 시토카인의 수준을 감소시키기 위해 투여된다. 특정 실시양태에서, 개시된 융합 단백질 또는 발현 벡터는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 염증성 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 유효량의 상기 융합 단백질 또는 발현 벡터를 상기 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 염증성 병태는 전체적으로 또는 부분적으로, 환자에서의 염증 또는 염증성 반응을 특징으로 하는 질환 또는 병태이다. 본 발명의 융합 단백질 또는 발현 벡터를 사용하여 치료될 수 있는 염증성 병태는, 예를 들어, 병에 걸린 원발성 조직, 병태의 기초가 되는 작용 메카니즘, 또는 이상조절되거나 또는 과다활성인 면역 체계의 부분에 근거하여 그 특징이 규명될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료될 수 있는 염증성 병태의 예는 폐의 염증 (예를 들어, 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 기관지염, 폐 염증, 폐 섬유증, 및 낭포성 섬유증), 관절의 염증 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 류마티스 척추염, 유년기 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 관절염 및 다른 관절염 병태), 결합 조직의 염증, 눈의 염증 (예를 들어, 포도막염 (홍채염 포함), 결막염, 공막염, 및 건성 각막결막염), 코의 염증, 장의 염증 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 염증성 장 질환, 염증성 장 증후군, 및 원위 직장염), 신장의 염증 (예를 들어, 사구체신염, 간질성 신염, 루푸스 신염, 베게너병에 이차성인 신염, 급성 신염에 이차성인 급성 신부전증, 굿패스쳐 증후군, 폐색 후 증후군 및 관상 허혈), 간의 염증 (예를 들어, 간염 (바이러스 감염, 자가면역 반응, 약물 치료, 독소, 환경 인자로부터 발생하거나 또는 일차 장애의 이차 결과로서 발생함), 비만, 담도 폐쇄증, 원발성 담즙 간경변 및 원발성 경화성 담관염), 피부의 염증 (예를 들어, 건선, 습진, 및 피부염, 예를 들어, 습진성 피부염, 국소 및 지루성 피부염, 알레르기성 또는 자극성 접촉성 피부염, 균열 습진, 광알레르기성 피부염, 광독성 피부염, 식물광선피부염, 방사선 피부염, 및 정체 피부염), 중추 신경계의 염증 (예를 들어, 다발성 경화증 및 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 HIV 감염과 연관된 치매), 혈관계의 염증 (예를 들어, 관상동맥 경색 손상, 말초 혈관 질환, 심근염, 혈관염, 협착의 혈관재생, 아테롬성 경화증, 및 제II형 당뇨병과 연관된 혈관 질환), 내분비계의 염증 (예를 들어, 자가면역성 갑상선염 (하시모토병), 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병과 연관된 간 및 지방 조직에서의 염증, 및 부신 피질의 급성 및 만성 염증), 심장의 염증, 또는 지방 조직의 염증을 포함한다. 본 개시내용은 일부 염증성 병태가 다발성 조직에서의 염증을 수반한다는 것을 고려한다. 더욱이, 본 개시내용은 일부 염증성 병태가 여러 범주로 분류될 수 있다는 것을 고려한다. 특정 실시양태에서, 염증성 병태는 자가면역 질환이다. 예시적인 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 건선 (플라크 건선 포함), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 결장염, 다발성 경화증, 루푸스, 탈모증, 자가면역성 췌장염, 셀리악병, 베체트병, 쿠싱 증후군, 및 그레이브스병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 염증성 병태는 류마티스성 장애이다. 예시적인 류마티스성 장애는 류마티스성 관절염, 유년기 관절염, 활액낭염, 척추염, 통풍, 경피증, 스틸병, 및 혈관염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 범주의 병태가 중복된다는 것에 주의해야 한다. 예를 들어, 류마티스성 관절염은 염증성 류마티스성 장애, 염증성 관절 장애, 및 자가면역 장애이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 가져다 주기에 충분한 활성 구성성분의 양 (예를 들어, 본 발명의 융합 단백질 또는 발현 벡터의 양)을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특별한 제형 또는 투여 경로로 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질의 치료상 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위, 예를 들어, 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 10 mg/kg, 7.5 mg/kg, 5 mg/kg, 또는 2.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스의 치료상 유효량은 102 내지 1015 플라크 형성 단위 (pfu)의 범위, 예를 들어, 102 내지 1010, 102 내지 105, 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015 플라크 형성 단위이다. 투여되는 양은 치료하고자 하는 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태, 융합 단백질 또는 발현 벡터의 생체내 효력, 제약 제형, 및 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 것이다. 초기 투여량은 원하는 혈액 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상위 수준 이상으로 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최적보다 적을 수 있고, 치료 과정 동안 1일 투여량이 점차적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은, 예를 들어, 0.5 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 실행되도록 설계된 통상적인 I상 용량 단계적 상승 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 항체의 혈청 반감기, 및 치료되는 질환과 같은 요인에 따라서 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일 1회, 1주에 1회, 및 2주마다 1회이다. 바람직한 투여 경로는 비경구, 예를 들어, 정맥내 주입이다. 융합 단백질- 또는 발현 벡터-기반 약물의 제형화는 관련 기술분야의 통상의 기술 수준 내에 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 또는 발현 벡터는 동결건조시킨 다음, 투여시 완충 염수에서 재구성된다.
치료용으로 사용하는 경우에, 융합 단백질 또는 발현 벡터는 바람직하게, 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 본원에 사용된 바와 같은, "제약상 허용되는 담체"는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미하고, 합리적인 유익/유해 비율에 비례한다. 상기 담체(들)는 제형의 다른 성분과 상용성이며 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 제약상 허용되는 담체는 제약 투여와 상용성인 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약상 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제를 사용하는 것은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 개시된 융합 단백질 또는 발현 벡터를 함유하는 제약 조성물은 투여 단위 형태로 제시될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도한 투여 경로와 상용성이도록 제형화되어야 한다. 투여 경로의 예는 정맥내 (IV), 피내, 흡입, 안내, 비내, 경피, 국소, 경점막, 및 직장 투여이다.
융합 단백질에 대한 바람직한 투여 경로는 IV 주입이다. 유용한 제형은 제약 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)] 참조. 비경구 투여에 적합한 제형 구성성분은 멸균성 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염; 및 등장성을 조정하기 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함한다.
정맥내 투여의 경우에 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) ELTM (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파르시파니) 또는 인산염 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 담체는 제작 및 저장 조건 하에 안정적이어야 하고, 미생물에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
제약 제형은 바람직하게 멸균성이다. 멸균은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 멸균성 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우에, 동결건조 및 재구성에 앞서 또는 그 후에 필터 멸균을 시행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 전달 비히클 (예를 들어, 재조합 바이러스) 및/또는 치료제는 체크포인트 억제제, 예를 들어, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 조합하여 투여된다. 예시적인 항-PD-1 항체는, 예를 들어, 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®, 브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co.)), 펨브롤리주맙 (케이트루다(Keytruda)®, 머크 샤프 앤 돔 코포레이션(Merck Sharp & Dohme Corp.)), PDR001 (노바티스 파마슈티칼스(Novartis Pharmaceuticals)), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어 테크(Cure Tech))을 포함한다. 예시적인 항-PD-L1 항체는, 예를 들어, 아테졸리주맙 (테센트리크(Tecentriq)®, 제넨테크(Genentech)), 두발루맙 (아스트라제네카(AstraZeneca)), MEDI4736, 아벨루맙 (바벤시오(Bavencio)®, EMD 세로노(Serono)), 및 BMS 936559 (브리스톨 마이어스 스큅 캄파니)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조합하여" 투여한다는 것은 장애를 동반한 환자의 고통의 과정에서 2가지 (또는 그 초과) 상이한 치료가 대상체에게 전달되어, 대상체에 대한 치료의 효과가 어느 시점에서 중복되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 두 번째의 전달이 시작될 때 여전히 일어나고 있으므로, 투여의 관점에서 중복이 있다. 이는 종종, "동시" 또는 "공동 전달"로서 본원에 지칭된다. 다른 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 어느 한 경우의 일부 실시양태에서, 치료는 조합 투여로 인해 더 유효하다. 예를 들어, 두 번째 치료는, 이러한 두 번째 치료가 첫 번째 치료의 부재 하에 투여된 경우에 관찰될 수 있는 것보다 더 유효한데, 예를 들어, 더 적은 양의 두 번째 치료로도 동등한 효과가 관찰되거나, 또는 두 번째 치료가 증상을 더 큰 정도로 저하시키거나, 또는 유사한 상황이 첫 번째 치료를 이용한 경우에도 관찰된다. 특정 실시양태에서, 증상의 저하 또는 장애와 관련된 다른 파라미터가, 다른 것의 부재시 전달되는 한 가지 치료로 관찰되는 것보다 더 크도록 전달된다. 2가지 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 또는 부가적인 것보다 더 클 수 있다. 전달된 첫 번째 치료의 효과가, 두 번째 치료가 전달될 때에도 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다.
상세한 설명 전반에 걸쳐, 조성물, 장치 및 시스템이 특이적 구성성분을 갖거나, 수반하거나 또는 포함하는 것으로서 기재되는 경우에, 또는 프로세스 및 방법이 특이적 단계를 갖는 것으로서 또는 특이적 단계를 포함하는 것으로서 기재되는 경우에, 부가적으로, 본 발명의 조성물, 장치 및 시스템은 상기 나열된 구성성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지고, 본 발명의 프로세스 및 방법은 상기 나열된 프로세싱 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지는 것으로 고려된다.
요소 또는 구성성분이 나열된 요소 또는 구성성분의 목록에 포함되고/거나 이러한 목록으로부터 선택되는 것으로 언급되는 적용에서는, 이러한 요소 또는 구성성분이 상기 나열된 요소 또는 구성성분 중 어느 하나일 수 있거나, 상기 요소 또는 구성성분이 나열된 요소 또는 구성성분 중 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것으로 이해해야 한다.
추가로, 본원에 명시적이든 아니면 암시적이든 간에, 본원에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특색은 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 특별한 바이러스에 대해 언급되는 경우에, 문맥상 달리 이해되지 않는 한, 그러한 바이러스가 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태 및/또는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 달리 말하면, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 출원이 기록되고 도출될 수 있도록 하는 방식으로 기재되고 묘사되었지만, 실시양태는 본 발명의 교시 및 발명(들)으로부터 분리하지 않고 다양하게 조합되거나 또는 분리될 수 있는 것으로 의도되고 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재되고 묘사된 모든 특색은 본원에 기재되고 묘사된 발명(들)의 모든 측면에 적용가능할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
표현 "적어도 하나"는 문맥상 달리 이해되고 사용되지 않는 한, 나열된 대상 중 2개의 표현 및 다양한 조합 다음에 나열된 대상 각각을 개별적으로 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 3개 이상의 나열된 대상과 연계해서 표현 "및/또는"은 문맥상 달리 이해되지 않는 한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "포함하다", "포함한다", "포함한", "갖다", "갖는다", "갖는", "함유하다", "함유한다" 또는 "함유하는"의 사용은 그의 문법적 등가물을 포함하여, 일반적으로 제약을 두지 않고 비제한적인 것으로서, 예를 들어, 문맥상 달리 구체적으로 언급 또는 이해되지 않는 한, 부가의 나열되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것으로서 이해되어야 한다.
용어 "약"의 사용이 정량적 값 앞에 있는 경우에, 본 발명은 또한, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 그러한 구체적인 정량적 값 자체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 달리 표시되거나 추론되지 않는 한, 공칭 값으로부터 ±10% 변동을 지칭한다.
본 발명이 작동가능하게 유지되는 한, 단계의 순서, 또는 특정의 조치를 수행하기 위한 순서는 중요하지 않다는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 2가지 이상의 단계 또는 조치가 동시에 시행될 수 있다.
본원에서의 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어, 예를 들어, "예컨대" 또는 "포함한"의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하기 위한 것이며, 청구되지 않는 한 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서내에서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 청구되지 않은 요소를 표시하는 것으로 해석되서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적이며, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하지는 않는다.
실시예 1: TGFβR 융합 단백질 플라스미드 및 아데노바이러스 구축
본 실시예는 TGFβR 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 및 바이러스 발현 벡터의 생산을 기재한다.
마우스 TGFβR-IgG1 융합 단백질 (mTGFβR-IgG1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 구축하기 위해, 플라스미드 pORF9-mIL10RA, pUNO1-mTGFBR2, 및 pFUSEss-CHIg-mG1을 인비보겐(Invivogen)으로부터 구입하였다. pUNO1-mTGFBR2 플라스미드를 KasI 및 NheI로 절단하여 마우스 TGFβ 유형 2 수용체의 코딩 영역을 수반한 1.7 kb 단편을 방출시켰다. pORF9-mIL10RA 플라스미드를 KasI 및 NheI로 절단하여 벡터 백본을 함유하는 3 kb 단편을 방출시켰다. 이들 2개의 단편을 라이게이션하여 플라스미드 pORF9-TGFBR2를 생성시켰다.
플라스미드 pORF9-TGFBR2는, 상기 코딩 영역의 5'에 있는 KasI 부위를 플랭킹하는 프라이머; 및 세포외 도메인만을 생산하기 위한, 세포외 도메인의 3' 단부 다음의 NheI 부위에 상응하는 프라이머, 또는 융합 유전자의 5' 절반을 생산하기 위한, 세포외 도메인의 3' 단부 다음의 마우스 IgG1 (mIgG1) CH1 도메인의 부분에 상응하는 프라이머 중 하나를 이용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pFUSEss-CHIg-mG1은 mIgG1 유전자의 3' 단부 다음의 NheI 부위에 상응하는 프라이머, 및 mTGFβR의 세포외 도메인의 3' 단부 다음의 mIgG1 CH1 도메인의 부분에 상응하는 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 융합 유전자는 이들 PCR 산물을 제2 라운드 PCR 반응에서 조합함으로써 생성시켰다. 이어서, PCR 산물을 KasI 및 NheI로 절단시키고, 동일한 효소로 절단시킨 pORF9 백본과 라이게이션하여 상기 세포외 도메인 또는 mIgG1 융합 유전자 중 하나를 보유하는 pORF9 플라스미드를 생성시켰다. 이로써 생성된 뉴클레오티드 서열은 mTGFβR 서열의 잔기 1-159 (TSSPD로 종결됨) 바로 다음에 mIgG1 서열의 잔기 90-324를 포함한 융합 단백질 (mTGFβR-IgG, 서열식별번호: 33)을 코딩하였고, 이는 제2 이뮤노글로불린 폴드의 최종 β 가닥의 처음부터 다시 시작한다 (STKVD로 시작함).
인간 TGFβR-IgG1 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 구축하기 위해, 인간 IgG1의 cDNA (hIgG1; pCMV-SPORT6 내에서의 수탁 BC072419) 및 인간 TGFβ 수용체 유형 2 (pBluescriptR 내에서의 수탁 BC040499)를 보유하는 플라스미드를 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터 구입하였다. SalI 부위를 보유하는 5' 프라이머, XhoI 부위를 보유하는 3' 프라이머, 및 hTGFβR의 3' 단부 및 hIgG1의 5' 단부로부터의 서열을 보유하는 연결 프라이머를 사용하는 PCR 증폭을, 마우스 유전자에 관하여 기재된 바와 같이 수행하였다.
일련의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성하였다. 제1 융합 단백질인 hTGFβR-IgG1-1 (서열식별번호: 22)은 hTGFβR의 잔기 1-159 (TSNPD로 종결됨) 바로 다음에 hIgG1의 잔기 88-330을 포함하였고, 이는 제2 이뮤노글로불린 폴드의 최종 β 가닥의 처음부터 다시 시작한다 (KPSNT에서 시작함). 제2 융합 단백질인 hTGFβR-IgG1-2 (서열식별번호: 62)는 hTGFβR의 잔기 1-159 (TSNPD로 종결됨) 바로 다음에 hIgG1의 잔기 90-330을 포함하였다 (SNTKV에서 시작함). 제3 융합 단백질인 hTGFβR-IgG1-3 (서열식별번호: 63)은 hTGFβR의 잔기 1-159 (TSNPD로 종결됨) 바로 다음에 hIgG1의 잔기 92-330을 포함하였다 (TKVDK에서 시작함). 제4 융합 단백질인 hTGFβR-IgG1-4는 hTGFβR의 잔기 1-159 (TSNPD로 종결됨) 바로 다음에 hIgG1의 잔기 94-330을 포함하였다 (VDKRV에서 시작함). 제5 융합 단백질인 hTGFβR-Fc (서열식별번호: 48)는 TGFβR의 잔기 1-159 (TSNPD로 종결됨) 바로 다음에 hIgG1의 잔기 100-330을 포함하였다 (PKSCD에서 시작함). 제5 융합 단백질은 hTGFβR-Fc로서 지칭되었으며, 이는 hIgG1로부터의 6개 내지 12개의 부가의 아미노산을 포함한 hTGFβR-IgG-1, hTGFβR-IgG-2, hTGFβR-IgG-3, 및 hTGFβR-IgG-4와는 반대로, 이뮤노글로불린의 Fc 도메인 및 힌지 영역만을 포함하였기 때문이다. 융합 단백질의 세부 사항이 표 3에 제시된다.
표 3
Figure pct00003
융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 적절히 하류 적용을 위해 플라스미드 내로 클로닝하였다. 아데노바이러스 구축을 위해, 뉴클레오티드 서열을 E1B-19k 영역의 출발 부위에서의 SalI 부위 및 이러한 SalI 부위의 3'에 있는 XhoI 부위 200개 염기쌍을 보유하도록 변형된, pXC1 (아데노바이러스 게놈의 5' 부분을 보유함)의 유도체 내로 클로닝하였다. 표시된 경우에, pXC1을 E1A 프로모터 영역에서 추가로 변형시켜 플라스미드 pXC1-TAV-255를 생산하였으며, 이는 E1A 발현 암-선택적이 된다 (미국 특허 번호 9,073,980에 이전에 기재된 바와 같음). PCR 산물을 제조업자의 지시에 따라서 인퓨전(InFusion) (클론테크(Clontech))을 사용하여 pXC1 (또는 pXC1-TAV) 백본 내로 클로닝하였다.
표시된 경우에, pXC1 플라스미드를 HEK-293A 세포에서 플라스미드 pJM17로 공동 형질감염시켜 재조합 바이러스를 구제하기 위한 상동 재조합을 허용하였다. 바이러스를 수집하고, 2 라운드의 플라크 정제 및 서열 분석을 수행하여 융합 유전자의 존재를 확인하고 필요에 따라 TAV-255 결실의 존재에 관하여 시험하였다. 마우스 이소형을 보유한 바이러스는 293 세포에서 성장되었고, 인간 이소형을 보유한 바이러스는 플라크 정제하고, 293 세포에서 초기 바이러스 구제 후 A549 세포에서만 성장되었다. 동물 실험에 사용될 바이러스는 패스트-트랩(Fast-Trap) 아데노바이러스 정제 키트 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 정제하고, 바이러스 저장 완충액 (25 mM NaCl, 10 mM 트리스 pH 8, 5% 글리세롤)으로 투석하며, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 시험된 바이러스의 세부 사항이 표 4에 제시된다.
표 4
Figure pct00004
실시예 2: TGFβ 신호전달의 억제
본 실시예는 개시된 hTGFβR-IgG1 융합 단백질과 통상적인 hTGFβR-IgG1 융합 단백질 간의 비교를 기재한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, 일련의 인간 TGFβ 트랩 융합 단백질: hTGFβR-IgG1-1, hTGFβR-IgG1-2, hTGFβR-IgG1-3, hTGFβR-IgG1-4, 및 hTGFβR-Fc를 코딩하는 플라스미드를 생성시켰다.
hTGFβR-Fc (서열식별번호: 48)는 인간 TGFβ 유형 II 수용체의 아미노산 Thr23 내지 Asp159 및 인간 IgG1의 아미노산 Pro100 내지 Lys330을 함유한다. 이러한 서열은 상업적으로 이용가능한 TGFβ 트랩 융합 단백질 (알앤디 시스템즈(R&D Systems))에 사용된 것과 동일하다.
통상적인 TGFβ 트랩 융합 단백질과는 반대로, hTGFβR-IgG1-1 (서열식별번호: 22), hTGFβR-IgG-2 (서열식별번호: 54), hTGFβR-IgG-3 (서열식별번호: 55), 및 hTGFβR-IgG-4는 TGFβ 유형 II 수용체와 IgG1의 힌지 및 Fc 영역 간의 가요성의 비-면역원성 링커로서 제공되는 IgG1의 CH1 도메인으로부터의 각각 12개, 10개, 8개 또는 6개의 아미노산을 함유한다.
HEK-293 세포를 hTGFβR-IgG1-1, hTGFβR-IgG1-2, hTGFβR-IgG1-3, hTGFβR-IgG1-4, 또는 hTGFβR-Fc 유전자를 보유하는 pXC1 플라스미드로 형질감염시키거나, 또는 비-형질감염된 대조군으로서 유지시키고, 5일 동안 인큐베이션하여 단백질 발현 및 배지 내로의 분비를 허용하였다. 조건화 배지를 수집하고, TGFβ를 표시된 경우에 500 pg/ml로 배지에 부가한 다음, 배지를 신선한 리포터 세포 상에 중첩시키고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 유리 TGFβ가 리포터 세포에서 Smad2 인산화를 유도시킬 것이지만, TGFβ 트랩 융합 단백질이 TGFβ를 차단하면, Smad2 인산화가 일어나지 않을 것이다. 리포터 세포의 단백질 추출물을 인산화된 Smad2에 대한 웨스턴 블롯으로 조사하였다. β-액틴을 부하 대조군으로서 사용하거나, 또는 연속해서 블롯을 스트립핑하고 전체 Smad2 및 Smad3이 부하 대조군으로서 제공되는지에 관하여 재조사하였다.
hTGFβR-IgG1-1과 hTGFβR-Fc 간의 비교가 도 3에 제시된다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 통상적인 hTGFβR-Fc 융합 유전자로 형질감염된 세포로부터의 조건화 배지는 TGFβ를 보통 수준으로 억제한 반면, hTGFβR-IgG-1은 TGFβ 신호전달을 보다 유효하게 차단시켰다. 웨스턴 블롯의 세기의 정량화는, 대조군과 비교 시, hTGFβR-Fc가 TGFβ 활성을 21% 저하시켰고, hTGFβR-IgG가 TGFβ 활성을 92% 저하시킨 것으로 제시한다.
hTGFβR-IgG1-1, hTGFβR-IgG1-2, hTGFβR-IgG1-3, 및 hTGFβR-IgG1-4 간의 비교가 도 4에 제시된다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, hTGFβR-IgG1-1 및 hTGFβR-IgG1-2 융합 유전자로 형질감염된 세포로부터의 조건화 배지가 TGFβ 신호전달을 유효하게 차단시켰다.
취합하면, 이들 결과는 TGFβ 활성이 통상적인 hTGFβR-IgG1 융합 단백질, 예를 들어, hTGFβR-Fc와 비교 시, 개시된 hTGFβR-IgG1 융합 단백질, 예를 들어, hTGFβR-IgG1-1 및 hTGFβR-IgG1-2에 의해 현저하게 저하되었다는 사실을 입증시켜 준다.
실시예 3: 종양 성장의 억제
인간 TGFβR 이소형에 대항한 뮤린 항체의 원하지 않는 유도를 방지하기 위해, mTGFβR-IgG1 융합 유전자를 보유하는 바이러스인 Ad-mTGFβR-IgG1을 사용하여 마우스에서의 실험을 시행하였다. 트랜스진을 운반하기 위해 사용된 E1B-19k 부위를 결실시킨 대조군 바이러스인 Ad-대조군을 또한 시험하였다. Ad-mTGFβR-IgG1 및 Ad-대조군 바이러스는 50 bp TAV-255 결실을 보유하지 않으며, 이는 정상 세포에서의 바이러스 복제를 저하시키기 위한 약화 메카니즘으로서 제공된다. 상기 바이러스는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되었고, 이러한 바이러스의 중요한 특색이 상기 표 4에 개략적으로 제시된다.
많은 마우스 세포가 바이러스 유전자 발현 정도에 따라 인간 아데노바이러스에 감염될 수 있지만, 대부분의 마우스 세포주는 인간 아데노바이러스 유형 5 복제를 허용하지 않는다. ADS-12는 인간 세포와 거의 동등한 수준에서 인간 아데노바이러스의 복제를 지원하는 최초로 (현재는 유일한) 확인된 마우스 암 세포주로서 최근에 기재된 마우스 폐암 세포주이며, 따라서 모델 시스템으로서 선택되었다 (Zhang et al. (2015) Cancer Gene Ther. 22(1):17-22).
피하 ADS-12 종양을 보유한 마우스를, 비히클, Ad-대조군, 또는 Ad-mTGFβR-IgG1의 총 3회 용량을 109 PFU/용량으로 4일마다 종양내 주사하여 처리하였다.
도 5a-5c에 제시된 바와 같이, 완충제만을 종양내 주사하여 처리한 모든 종양이 진행되었다. "비무장" Ad-대조군 바이러스로 처리된 10개의 종양 중 4개는 완전히 퇴행되었으며, 이는 종양 특이적 TGFβ 트랩 트랜스진 발현의 부재 하에서의 종양용해성 활성을 표시한다. 대조적으로, Ad-mTGFβR-IgG1로 처리된 10개 종양 중 8개가 완전히 퇴행되었으며, 이는 트랜스진을 이용한 종양 사멸의 개선을 입증시켜 준다.
요약하면, 본원에 개시된 신규 TGFβ 트랩을 발현하는 종양용해성 바이러스가 상당히 증강된 항종양 효과를 제시하였다.
실시예 4: 암 세포주에서의 TGFβ 신호전달의 억제
TGFβ 억제에 관한 검정은 Ad-hTGFβR-IgG1-1, Ad-mTGFβR-IgG1, 및 Ad-대조군 바이러스를 사용하여 인간 세포주에서 수행되었다. 상기 바이러스는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되었고, 이러한 바이러스의 중요한 특색이 상기 표 4에 개략적으로 제시된다. 바이러스의 효과는 정상 (WI-38 및 MRC5) 및 암성 (ADS-12, A549 및 MCF7) 세포에서 시험하였다. 표시된 바이러스에 감염된 세포로부터의 조건화 배지를 신선한 리포터 세포 상에 중첩시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 TGFβ를 부가하였다. 도 6a-6b에서 알 수 있는 바와 같이, Smad2 인산화의 TGFβ 유도는 Ad-hTGFβR-IgG1-1로 감염된 모든 세포주로부터의 조건화 배지에서 약화되었다. 요약하면, Ad-hTGFβR-IgG1-1은 암성 세포에서 TGFβ의 강력한 차단을 유도시켰고, 심지어는 감염된 정상 세포에서 TGFβ 활성을 둔화시켰다.
참조로 포함
본원에 언급된 각각의 특허 문서 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않고서도 다른 구체적 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 전술한 실시양태는 본원에 기재된 본 발명을 제한하는 것이 아니라 모든 면에서 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서 보다는 첨부된 청구범위에 의해 표시되며, 청구범위의 의미 및 균등 범위 내에서의 모든 변화가 그 안에 포함되는 것으로 의도된다.
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attatgacac gcatactcgg agctatgcta accagcgtag 34920 ccccgatgta agcttgttgc atgggcggcg atataaaatg caaggtgctg ctcaaaaaat 34980 caggcaaagc ctcgcgcaaa aaagaaagca catcgtagtc atgctcatgc agataaaggc 35040 aggtaagctc cggaaccacc acagaaaaag acaccatttt tctctcaaac atgtctgcgg 35100 gtttctgcat aaacacaaaa taaaataaca aaaaaacatt taaacattag aagcctgtct 35160 tacaacagga aaaacaaccc ttataagcat aagacggact acggccatgc cggcgtgacc 35220 gtaaaaaaac tggtcaccgt gattaaaaag caccaccgac agctcctcgg tcatgtccgg 35280 agtcataatg taagactcgg taaacacatc aggttgattc acatcggtca gtgctaaaaa 35340 gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac ccgcaggcgt agagacaaca ttacagcccc 35400 cataggaggt ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca taaacacctg aaaaaccctc 35460 ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc 35520 agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac 35580 acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat 35640 aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg 35700 aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt cctcaaatcg tcacttccgt 35760 tttcccacgt tacgtaactt cccattttaa gaaaactaca attcccaaca catacaagtt 35820 actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac 35880 tccaccccct cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat tgatgatg 35938 <210> 53 <211> 8 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 53 ctgacctc 8 <210> 54 <211> 8 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 54 tcaccagg 8 <210> 55 <211> 10 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 55 ggtgttttgg 10 <210> 56 <211> 8 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 56 cagtatga 8 <210> 57 <211> 10 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 57 taataaaaaa 10 <210> 58 <211> 8 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 58 tgccttaa 8 <210> 59 <211> 11 <212> DNA <213> Adenovirus type 5 <400> 59 taaaaaaaaa t 11 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 1 5 10 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 1 5 <210> 62 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 165 170 175 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 180 185 190 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 195 200 205 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 210 215 220 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 225 230 235 240 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 245 250 255 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 260 265 270 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 275 280 285 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 290 295 300 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 305 310 315 320 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 325 330 335 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 340 345 350 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 355 360 365 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 370 375 380 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 400 <210> 63 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Thr 145 150 155 160 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 165 170 175 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 180 185 190 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 195 200 205 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 210 215 220 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 225 230 235 240 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 245 250 255 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 260 265 270 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 275 280 285 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 290 295 300 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 305 310 315 320 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 325 330 335 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 340 345 350 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 355 360 365 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 370 375 380 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395

Claims (107)

  1. 하기를 포함하는, 단리된 융합 단백질:
    (i) 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제1 부분;
    (ii) 아미노산 링커; 및 하기 중 적어도 하나:
    (iii) 시토카인, 시토카인 수용체, 또는 면역조정 단백질의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 또는 세포내 도메인의 제2 부분;
    (iv) 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및
    (v) 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  3. N-말단에서 C-말단 배향으로:
    (i) 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분;
    (ii) 아미노산 링커;
    (iii) 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및
    (iv) 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인
    을 포함하며;
    여기서 링커는 약 5 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인
    단리된 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 5 내지 약 15개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 약 10 내지 약 15개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 내인성 인간 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 이뮤노글로불린 (Ig) CH1 도메인의 C-말단 부분을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, Ig CH1 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM CH1 도메인으로부터 선택되는 것인 단리된 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  15. 제13항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 및 서열식별번호: 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, Ig CH1 도메인이 IgG1 CH1 도메인인 단리된 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 60, 및 서열식별번호: 61로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 알부민 및 카세인으로부터 선택된 인간 단백질로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 링커가 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 11로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 시토카인, 신호전달 분자, 면역조정 단백질 또는 펩티드로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 절단 부위를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 절단 부위가 단백질분해적 절단 부위인 단리된 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 단백질분해적 절단 부위가 진핵 세포의 내형질 세망 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 것인 단리된 융합 단백질.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 단백질분해적 절단 부위가 푸린 절단 부위인 단리된 융합 단백질.
  26. 제25항에 있어서, 푸린 절단 부위가 RX1X2R (서열식별번호: 50)을 포함하며, 여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg인 단리된 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 푸린 절단 부위가 RAKR (서열식별번호: 51)을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 포유동물 또는 식물에서 단백질분해적으로 안정한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 시토카인 수용체가 인간 TGFβ 유형 II 수용체인 단리된 융합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분이 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  31. 제29항에 있어서, 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분이 서열식별번호: 12의 아미노산 잔기 23-159를 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 TGF-β, CD80, CD19, CD20, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12B/p40, IL-23A/p19, IL27A/p28, IL-27B/EBI3, CD154, CD86, CD137, CD137L, IFN-α, IFN-β, BORIS/CTCFL, FGF, ICAM, IL-24, MAGE, NY-ESO-1, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, 인터페론-감마, DKK1/Wnt, p53, 티미딘 키나제, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 및 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 기능적 단편 중 하나 이상을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Ig Fc 도메인 및 힌지 영역이 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM Fc 도메인 및 힌지 영역으로부터 선택되는 것인 단리된 융합 단백질.
  34. 제33항에 있어서, Ig Fc 도메인 및 힌지 영역이 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 21로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  35. 제34항에 있어서, Ig Fc 도메인 및 힌지 영역이 인간 IgG1 Fc 도메인 및 힌지 영역인 단리된 융합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, Ig Fc 도메인 및 힌지 영역이 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Ig Fc, Ig 힌지 영역, 및 Ig CH1 도메인이 단일 이뮤노글로불린으로부터 유래되는 것인 단리된 융합 단백질.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 및 서열식별번호: 33으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 62, 및 서열식별번호: 63으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 융합 단백질이 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 융합 단백질.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 2개의 융합 단백질을 포함하는 시토카인 결합 단백질로서, 여기서 각각의 융합 단백질은 시토카인 수용체의 세포외 도메인을 포함하고, 여기서 2개의 융합 단백질은 함께 공유적으로 연결되고, 여기서 2개의 세포외 도메인은 함께, 시토카인에 결합하기 위한 결합 부위를 규정하는 것인 시토카인 결합 단백질.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  44. 제43항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 발현 벡터가 종양용해성 바이러스인 발현 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 종양용해성 바이러스가 아데노바이러스인 발현 벡터.
  47. 제46항에 있어서, 아데노바이러스가 유형 2 또는 5 아데노바이러스인 발현 벡터.
  48. 제47항에 있어서, 아데노바이러스가 유형 5 아데노바이러스인 발현 벡터.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 E1b-19K의 출발 부위와 E1b-55K의 출발 부위 사이에 위치한 E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입되는 것인 발현 벡터.
  50. 제49항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 출발 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 출발 부위에 인접한 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 1714에 상응하는 뉴클레오티드와 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입되는 것인 발현 벡터.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CTGACCTC (서열식별번호: 53)와 TCACCAGG (서열식별번호: 54) 사이에 삽입되는 것인 발현 벡터.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가, 5'에서 3' 배향으로, CTGACCTC (서열식별번호: 53), 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 54)를 포함하는 것인 발현 벡터.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 단편의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  57. 제56항에 있어서, 아데노바이러스가 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 아데노바이러스가 E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 55)를 포함하는 것인 발현 벡터.
  61. 제46항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 E3 결실을 포함하며, 여기서 E3 결실은 pVIII의 정지 부위와 Fiber의 출발 부위 사이에 위치하는 것인 발현 벡터.
  62. 제61항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치하는 것인 발현 벡터.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, E3 결실이 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 E3 결실 내로 삽입되는 것인 발현 벡터.
  70. 제69항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 52)의 29773에 상응하는 뉴클레오티드와 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입되는 것인 발현 벡터.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 CAGTATGA (서열식별번호: 56)와 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57) 사이에 삽입되는 것인 발현 벡터.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가, 5'에서 3' 배향으로, CAGTATGA (서열식별번호: 56), 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 57)를 포함하는 것인 발현 벡터.
  73. 제46항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 기능적 E2F 결합 부위의 결실을 포함하지 않는 것인 발현 벡터.
  74. 제46항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 기능적 E2F 결합 부위의 결실을 포함하는 것인 발현 벡터.
  75. 제46항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스가 하기를 포함하는 것인 발현 벡터:
    (i) E1b-19K 및 E1b-55K 출발 부위;
    (ii) E1b-19K 삽입 부위 내로 삽입된 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 삽입 부위는 E1b-19K의 출발 부위와 E1b-55K의 출발 부위 사이에 위치하는 것인 뉴클레오티드 서열; 및
    (iii) 적어도 하나의 Pea3 결합 부위, 또는 그의 기능적 부분이 결실된 것인 변형된 E1a 조절 서열.
  76. 제45항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해성 바이러스가 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제되는 것인 발현 벡터.
  77. 제45항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해성 바이러스가 과다증식성 세포에서 융합 단백질을 선택적으로 발현하는 것인 발현 벡터.
  78. 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  79. 하기를 포함하는, 융합 단백질을 생산하는 방법:
    (a) 융합 단백질을 발현하는 조건 하에 제78항의 숙주 세포를 성장시키는 것; 및
    (b) 융합 단백질을 정제하는 것.
  80. (i) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터; 및 (ii) 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  81. 표적 세포를 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량에 노출시켜 융합 단백질을 발현하는 것을 포함하는, 표적 세포에서 융합 단백질을 발현하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 융합 단백질이 번역후에 2개의 폴리펩티드 쇄로 절단되는 것인 방법.
  83. 종양 세포를 제42항의 이량체성 융합 단백질의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
  84. 종양 세포를 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
  85. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 제42항의 이량체성 융합 단백질의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  86. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  87. 제42항의 이량체성 융합 단백질의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  88. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  89. 세포를 제42항의 이량체성 융합 단백질의 유효량에 노출시켜 TGFβ 활성을 저하시키는 것을 포함하는, 세포에서 TGFβ 활성을 저하시키는 방법.
  90. 세포를 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량에 노출시켜 TGFβ 활성을 저하시키는 것을 포함하는, 세포에서 TGFβ 활성을 저하시키는 방법.
  91. 제42항의 이량체성 융합 단백질의 유효량을 염증성 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법.
  92. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 유효량을 염증성 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법.
  93. 종양 세포를 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
  94. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  95. 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  96. 세포를 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량에 노출시켜 TGFβ 활성을 저하시키는 것을 포함하는, 세포에서 TGFβ 활성을 저하시키는 방법.
  97. 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량을 염증성 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 염증성 병태를 치료하는 방법.
  98. 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항의 발현 벡터의 유효량을 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 감염을 치료하는 방법.
  99. 제87항, 제88항 및 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 및 중추 신경계 암, 갑상선암, 부갑상선암 (예를 들어, 부갑상선 암종), 자궁내막암, 신경내분비암, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨), 백혈병, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 다발성 골수종, 자궁암, 육종, 신장암, 안구암, 췌장암, 및 배세포암 (예를 들어, 난소 배세포암)으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 제87항, 제88항 및 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 백혈병, 유방암, 폐암, 췌장암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 뇌암, 피부암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 및 백혈병으로부터 선택되는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 암이 피부암, 두경부암, 및 폐암으로부터 선택되는 것인 방법.
  102. 제85항 내지 제88항, 제91항, 제92항, 제94항, 제95항 및 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스 요법으로부터 선택된 하나 이상의 요법과 조합하여 투여되는 것인 방법.
  103. 제85항 내지 제88항, 제91항, 제92항, 제94항, 제95항 및 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 림프구, 예를 들어, T-세포, 예를 들어, CAR T-세포와 조합하여 투여되는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 림프구가 T-세포인 방법.
  105. 제104항에 있어서, T-세포가 CAR T-세포인 방법.
  106. 제85항 내지 제88항, 제91항, 제92항, 제94항, 제95항 및 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 또는 동물인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 대상체가 소아 인간인 방법.
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