KR20120034604A - Ｂｍｐ-ａｌｋ3 길항제 및 골 성장을 촉진시키는 사용되는 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

특정 측면에서, 본 발명은 뼈 성장을 촉진시키고, 골밀도 및 강도를 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 ALK3-Fc 융합 단백질을 포함하는 ALK3 폴리펩티드를 제공한다.

Description

ＢＭＰ-ＡＬＫ3 길항제 및 골 성장을 촉진시키는 사용되는 이의 용도{BMP-ALK3 ANTAGONISTS AND USES FOR PROMOTING BONE GROWTH}
관련 출원들
본 출원은 2009년 3월 30일자로 제출된 미국 가출원 61/211,557, 2010년 2월 19일자로 제출된 61/306,331, 그리고 2010년 3월 16일자로 제출된 61/314,556의 이점을 청구한다. 상기 언급된 출원의 모든 교시는 전문이 참고문헌에 통합된다.
골다공증에서부터 골절에 이르기 까지 뼈 질환은 일련의 병리학적 상태를 나타내는데, 유효한 약제가 거의 없다. 대신 치료는 고정(immobilization), 운동 및 식이요법의 변화를 포함하는 물리적 그리고 거동적 중재에 초점을 두고 있다. 다양한 뼈 질환을 치료하는 목적으로 뼈 성장을 촉진시키고, 그리고 골밀도를 증가시키는 치료제를 가지는 것이 유익할 것이다.
뼈 성장 및 광화작용(mineralization)은 연골세포(chondrocytes) 및 맥관구조의 세포들 또한 이들 공정의 주요 측면에 참여하지만, 두 가지 세포 유형 즉, 파골세포(osteoclasts) 및 골아세포(osteoblasts)의 활성에 따라 달라진다. 발생학적으로, 뼈 형성은 연골속골화(endochondral ossification)와 막속골화(intramembranous ossification)의 두 가지 기전을 통하여 발생하고, 연골속골화는 세로 뼈 형성을 담당하고, 막속골화는 두개골 뼈와 같은 위상적으로 평평한 뼈의 형성을 담당한다. 연골속뼈화는 성장판에서 연골성 구조의 순차적 형성 및 분해를 요구하는데, 이는 골아세포, 파골세포, 맥관구조의 형성 및 후속 광화작용의 주형으로 작용한다. 막속골화 동안, 결합 조직에서 뼈는 바로 형성된다. 이들 두 가지 공정 모두 골아세포의 침투 및 후속 매트릭스 침착을 요구한다.
골절 및 뼈의 다른 구조적 파괴는 이 과정을 통하여 치료되는데, 적어도 피상적으로 연골성 조직 형성 및 후속 광화작용을 포함하는 골형성의 발생학적 일련의 사건들을 닮는다. 골절 치유(healing) 과정은 두 가지 방식으로 일어날 수 있다. 직접적 또는 1차 뼈 치유는 가골(callus) 형성 없이 일어난다. 간접적 또는 2차 뼈 치유는 가골 전조 단계와 함께 일어난다. 골절의 1차 치유는 밀접한 설정(closely-set) 붕괴를 넘어 기계적 연속성의 재형성과 관련있다. 적합한 조건하에서, 붕괴 주변 뼈를 재흡수하는 세포들은 터널식(tunnelling) 재흡수성 반응을 보이고, 혈관의 관통 및 후속 치유를 위한 통로를 제공한다. 뼈의 2차 치유는 염증 과정, 연질 가골 형성, 가골 광화작용 및 가골 개형(remodeling)을 따른다. 염증 단계에서, 혈종 및 출혈 형성은 손상 부위에서 골막(periosteal) 및 골내막(뼈표면) 혈관의 붕괴로 인한 것이다. 염증 세포는 이 부위를 침투한다. 연질 가골 형성 단계에서, 세포는 새로운 맥관, 섬유아세포, 세포내 물질 및 지지 세포를 만들고, 골절 단편 사이 공간내 육아 조직(granulation tissue)을 형성한다. 섬유성 또는 연골성 조직 (연질 가골)에 의해 붕괴부위를 가로질러 임상적 연합이 확립된다. 골아세포가 형성되고, 연질 가골의 광화작용을 중재하고, 이는 층판골(lamellar bone)에 의해 대체되어, 정상적인 개형(remodeling) 공정을 거친다.
골절 및 뼈 구조의 기타 물리적 붕괴에 추가하여, 광범위한 다양한 조건에 의해 뼈 미네랄 함량 및 골량이 상실될 수 있고, 심각한 의학적 문제를 초래할 수 있다. 골량의 변화는 개인 삶에 있어서 상대적으로 예측가능하게 일어난다. 대략 30세까지 연골내 성장판의 선형 성장 및 방사형 성장을 통하여 남녀 모두 뼈가 최대량으로 성장한다. 약 30세 이후(지주골(trabecular bone), 가령, 척추 및 골반과 같은 평평한 뼈의 경우) 그리고 약 40 세이후 (피질골(cortical bone), 가령, 사지에서 볼 수 있는 긴 뼈의 경우), 남녀 모두 골 상실이 서서히 일어난다. 여성의 경우, 폐경후 에스트로겐 결핍으로 인하여 실질적인 최종 상태의 골 상실이 발생한다. 이 상태 동안, 여성들은 피질골에서 골량의 추가 10% 그리고 지주골 격실로부터 25% 추가 골량을 상실할 수도 있다. 점진적 골 상실이 골다공증과 같은 병리적 상태를 초래하는 지에 대해서는 개인의 초기 골량에 대체로 의존적이며, 악화 상태가 있는지에 따라 달라진다.
골 상실은 일부 경우 정상적인 뼈 개형 과정의 불균형으로 특징화된다. 건강한 뼈는 지속적으로 재구성된다. 개형은 파골세포에 의한 뼈의 재흡수로 시작한다. 재흡수된 뼈는 새로운 뼈 조직에 의해 대체되며, 이는 골아세포에 의한 콜라겐 형성과 후속 석회화(calcification)에 의해 특징화된다. 건강한 개체에서, 재흡수 및 형성율은 균형을 이룬다. 골다공증은 만성적, 진행성 질환으로, 재흡수 쪽으로 이동이 두드러지고, 골량 및 뼈 광화작용이 전반적으로 감소되는 결과를 초래한다. 인간에서 골다공증은 임상적 골감소증 (뼈 미네랄 밀도는 젊은 성인 뼈의 경우 1 표준 편차 이상 그러나 2.5 표준 편차 미만)에 선행한다. 전세계적으로, 대략 7천5백만 사람이 골다공증 위험에 처해있다.
따라서, 파골세포 및 골아세포 활성간의 균형을 조절하는 방법은 골절 및 뼈에 기타 손상의 치유를 촉진시키고, 그리고 골량의 상실 및 뼈 광화작용과 연관된 골다공증과 같은 질환 치료에 유용할 것이다.
골다공증에 있어서, 에스트로겐, 칼시토닌, 오스테오칼신 및 비타민 K, 또는고약량의 규정식 칼슘 모두 치료 중재로 이용한다. 골다공증에 대한 기타 치요 방법은 비스포스포네이트, 부갑상선 호르몬, 칼슘모방제, 스타틴, 동화성 스테로이드, 란탄 및 스트론튬 염, 및 플루오르화 나트륨을 포함한다. 그러나, 이러한 치료제는 흔히 바람직하지 못한 부작용과 연관된다.
골 상실은 또한 많은 암의 유의적 합병증이며, 뼈로 종양 전이 및 파골 세포의 활성화 또는 화학 치료제의 치료 영향에 의해 일어날 수도 있다. 특히, 유방암 치료에 광범위하게 이용되는 항-에스트로겐 요법은 심각한 골 상실을 야기할 수 있다.
기타 뼈 질환, 가령, 불완전골생성증(oestogenesis imperfecta)은 유전적, 발생적, 기타 질환 및 결핍의 영양학적 원인으로 인한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 뼈 성장 및 광화작용을 촉진하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
부분적으로, 본 명세서는 ALK3 또는 BMP 길항제 활성 (“ALK3 길항제”및 “BMP 길항제”)을 가지는 분자sms 골밀도를 증가시키고, 뼈 성장을 촉진시키고, 및/또는 골강도를 증가시키는데 이용할 수 있다는 것을 설명한다. 이러한 관찰은 문헌 및 임상적 경험에서 많은 BMPs, 및 특히 BMP2, BMP4 및 BMP7는 뼈 형성의 강력한 자극제로 나타난다는 것은 놀라운 사실이다. 본 내용에서 가용성 형태의 ALK3은 BMP-ALK3 신호생성의 억제제로 작용하며, 생체내에서 골밀도, 뼈 성장, 및 골강도 증가를 촉진시킨다는 것을 설명한다. 임의의 특정 이론에 결부되는 것을 원하지 않지만, 가용성 형태의 ALK3은 BMP2 및/또는 BMP4, 및 ALK3를 통하여 신호를 전달하는 아마도 기타 리간드들을 억제함으로써 이러한 효과를 얻는다. 따라서, 본 내용은 BMP-ALK3 신호생성 경로의 길항제는 골밀도를 증가시키고 그리고 뼈 성장을 촉진시키는데 이용할 수 있다는 것을 입증한다. 가용성 ALK3은 BMP 길항작용이외의 기전, 또는 BMP 길항작용에 추가하여 다른 기전을 통하여 뼈에 영향을 줄 수 있지만, 본 내용은 그럼에도 불구하고 BMP-ALK3 길항제 활성에 기초하여 바람직한 치료제를 선택할 수 있다고 설명한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 본 내용은 낮은 골밀도 또는 낮은 골강도와 관련된 질환들을 치료하기 위하여, 또는 뼈 골절 환자와 같이 뼈 성장을 촉진시킬 필요가 있는 환자들에서 뼈 성장을 촉진시키기 위하여, 예를 들면, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드, 항-BMP 항체, 항-ALK3 항체, BMP- 또는 ALK3-표적으로 하는 소분자들 및 아파타머(aptamers), 그리고 BMP 및 ALK3의 발현을 감소시키는 핵산들을 포함하는 BMP-ALK3 길항제를 이용하는 방법을 제공한다. 추가 구체예들에서, 본 내용은 적절한 BMP2 또는 BMP4 결합을 유지하는 유익한 성질들을 가지는 절두형 ALK3 폴리펩티드 (가령, ALK3-Fc 폴리펩티드)를 확인한다.
특정 측면에서, 본 내용은 BMP2 및/또는 BMP4에 결합하는 가용성 ALK3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 가용성 ALK3 폴리펩티드는 추가 리간드에 결합할 수 있다. ALK3 폴리펩티드는 BMP-결합 ALK3 폴리펩티드 및 약제학적으로 수용되는 운반체를 포함하는 약제학적 조제물로 조제될 수 있다. 바람직하게는, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 1 마이크로몰 미만의 KD 또는 100, 10 또는 1 나노몰 미만의 KD로 BMP2 및/또는 BMP4에 결합한다. 바람직하게는, 조성물은 크기 압출 크로마토그래피에 의해 평가하였을 때 다른 폴리펩티드에 대해 조성물은 최소한 95% 순수이며, 더 바람직하게는, 조성물은 최소한 98% 순수하다. 이러한 조제물에 사용하기 위한 BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 여기에서 설명되는 임의의 것일 수 있는데, 예를 들면, 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호:3에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산이 N- 및/또는 C-말단 절두된 것과, 임의로 링커에 의해 또는 링커없이 Fc 융합 단백질에 융합된 것을 포함하는, 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드다. 특히, 본 내용은 ALK3 ECD 일부 N-말단에서 0 내지 7개의 아미노산이 절두된, 그리고 ALK3 ECD 일부의 C-말단에서 0 내지 12개의 아미노산이 절두되어, 따라서 서열 번호:3의 아미노산 8 내지 117에 상응하는 일부 기능을 설명하는 ALK3 폴리펩티드를 제공하고, 그리고 서열 번호:3의 아미노산 8 내지 11의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 설명한다. 특히, 인간 ALK3 및 뮤린 ALK3은 세포외 도메인에서 아미노산 서열 수준에서 97 내지 98% 동일성을 가지고, 그리고 인간 또는 마우스 단백질의 이러한 도메인을 포함하는 단백질들은 시험관 및 생체내에서 유사한 활성을 나타낸다. BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 천연 ALK3 폴리펩티드의 기능적 단편, 가령, 서열 번호: 1 또는 3으로부터 선택한 서열의 최소한 10, 20 또는 30개 아미노산을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 여기에서 설명되는 것과 같이, ALK3 세포외 도메인의 C-말단 부분에서 아미노산들의 결손을 포함하는 ALK3 단백질은 BMP2 및 BMP4에 대항하는 활성을 유지하지만, 기타 리간드들(가령, BMP6 및 BMP7)에 대항하는 활성은 감소하여, 따라서 리간드 선택성이 개선되는데, 임상적 개발 또는 상업화에서 예상치 않은 목표로 하지 않는 효과를 감소시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 변이는 서열 번호:3의 C-말단의 단지 6개 또는 7개, 12개 또는 24개 아미노산 결손을 포함할 수 있다. 임의로, C-말단이 절두된 형태는 N-말단에서 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 아미노산에 의해 절두될 수 있다. 상기에서 언급한 ALK3 단백질의 변이체는 ALK3-Fc 융합 단백질을 포함할 수 있는데, 이 단백질은 GGG 또는 TGGG 또는 SGGG 서열을 가지는 링커를 포함한, 여기에서 공개하는 임의의 링커(또는 전혀 링커를 포함하지 않을 수 있음)와 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 기타 포유동물 면역글로블린으로부터 유도된 Fc 일부를 포함할 수 있다.
가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 자연 발생적 ALK3 폴리펩티드와 비교하여, 아미노산 서열(가령, 리간드-결합 도메인에서)에서 1개, 2개, 5개 이상의 변경을 포함할 수 있다. 아미노산 서열에서 이러한 변경은 예를 들면, 포유동물, 곤충 또는 기타 진핵 세포에서 만들어질 때 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키거나 또는 자연 발생적 ALK3 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드의 단백질 절단을 변경시킬 수 있다.
BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 한 개 도메인으로, ALK3 폴리펩티드 (가령, ALK3의 리간드-결합 부분)과 바람직한 성질들, 가령, 개선된 약물동력학, 더 용이한 정제, 특정 조직에 표적화와 같은 성질들을 제공하는 하나 이상의 추가 도메인을 가지는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 도메인은 하나 이상의 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다량체화, 및/또는 정제를 강화시킬 수 있다. BMP-결합 ALK3 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인 (야생형 또는 돌연변이) 또는 혈청 알부민 또는 개선된 약물동력학, 개선된 용해도 또는 개선된 안전성과 같은 바람직한 성질을 제공하는 기타 폴리펩티드 부분을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, ALK3-Fc 융합은 Fc 도메인과 세포외 ALK3 도메인 사이에 위치한 상대적으로 일정한 구조가 없는(unstructured) 링커를 포함한다. 이러한 일정한 구조가 없는 링커는 ALK3의 세포외 도메인의 C-말단 단부에 상응할 수 있거나, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 인위적인 서열이거나 또는 2차적 구조가 상대적으로 없는 5 내지 15, 20, 30, 50개 이상의 아미노산 길이이거나 또는 이들 두 가지의 혼합물일 수 있다. 링커는 글리신 및 프롤린 잔기들이 많을 수 있고, 그리고 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열을 포함하거나 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다(가령, GGG, GGGG, TG4, SG4, TG3, 또는 SG3 단일체 또는 반복체). 융합 단백질은 정제 하위서열, 가령, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, 및 GST 융합을 포함할 수 있다. 임의로, 가용성 ALK3 폴리펩티드는 당화된 아미노산, PEGylated 아미노산, 파르네실화된(farnesylated) 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도화물질에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들을 포함한다. 약제학적 조제물은 또한 골 질환을 치료하는데 이용되는 화합물과 같은 하나 이상의 추가 화합물들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약제학적 조제물은 실질적으로 발열물질이 없다. 일반적으로, 환자에서 원치않는 면역 반응 가능성을 감소시키기 위하여 ALK3 단백질의 적합한 천연 당화를 중재하는 포유동물 세포계에서 ALK3 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다. 인간 및 CHO 세포계가 성공적으로 이용되어 왔으며, 그리고 기타 통상적인 포유동물 발현 시스템이 유용할 것으로 예상한다.
특정 측면에서, 본 내용은 가용성 BMP-결합 ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 상기에서 설명하는 것과 같이, 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단리된 핵산은 ALK3의 세포외 도메인 (가령, 리간드-결합 도메인)의 코딩 서열, 그리고 ALK3의 막통과 도메인 및/또는 세포질 도메인 일부 또는 전부를 코드하는 서열, 막통과 도메인내에 위치한 또는 세포질 도메인내에 위치한, 또는 세포외 도메인과 막통과 도메인 또는 세포질 도메인 사이에 위치한 중지 코돈의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오티드는 전장의 ALK3 폴리뉴클레오티드 서열, 가령, 서열 번호: 2 또는 4, 또는 부분적으로 절두된 형태를 포함할 수 있고, 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는 3’-말단 전, 최소한 600개 뉴클레오티드에서 전사 종료 코돈을 더 포함하거나 또는 폴리뉴클레오티드의 절두가 전장 ALK3의 절두된 부분에 임의의 융합된 세포외 도메인을 야기하는 위치에 전사 종료 코돈을 포함할 수 있다. 바람직한 핵산 서열은 서열 번호: 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37, 그리고 스크린젼트 혼성화 조건하에 이러한 핵산 또는 이의 보체에 하이브리드되는 핵산들이다. 여기에서 설명되는 핵산들은 발현을 위하여 프로모터에 작용가능하도록 연결될 수 있으며, 본 내용은 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질변환된 세포를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포다.
특정 측면에서, 본 내용은 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드를 만드는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 적절한 세포, 가령, Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 여기에서 설명하는 임의의 핵산(가령, 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37)을 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 가용성 ALK3 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 세포를 배양하고, 이때 세포는 가용성 ALK3 발현 구조체로 형질변환되고; 그리고 b) 발현된 가용성 ALK3 폴리펩티드를 회수한다. 가용성 ALK3 폴리펩티드는 미정제된, 부분적으로 정제된 또는 고순도로 정제된 분취물로 회수될 수 있다. 정제는 일련의 정제 단계, 예를 들면, 임의의 순서로 다음중 하나, 둘, 또는 셋 이상을 포함하는 단계에 의해 이루어질 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 (가령, Q 세파로즈), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (가령, 페닐세파로즈), 크기 압출 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피.
특정 측면에서, 여기에서 설명되는 BMP-ALK3 길항제, 가령, 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 개체에서 뼈 성장을 촉진시키기 위한 또는 골밀도를 증가시키기 위한 방법에 이용할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 내용은 낮은 골밀도와 관련된 질환의 치료, 또는 뼈 성장 촉진이 필요한 개체에서 뼈 성장을 촉진시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 BMP-ALK3 길항제의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본 내용은 여기에서 설명되는 질환 또는 상태를 치료하는 약물의 제조에 BMP-ALK3 길항제의 용도를 제공한다.
특정 측면에서, 본 내용은 뼈 성장을 촉진시키는, 또는 뼈의 광화작용을 증가시키는 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) BMPs 또는 ALK3 폴리펩티드의 리간드-결합 도메인에 결합하는 테스트 물질을 확인하고; 그리고 b) 뼈 성장 또는 뼈 광화작용에 대한 물질의 효과를 평가하는 것을 포함한다.
도 1은 인간 ALK3 전구물질의 고유 아미노산 서열(서열 번호: 1)을 나타낸다. ALK3 세포외 도메인 (잔기들 24-152)은 밑줄로 표시한다.
도 2는 인간 ALK3 전구물질을 인코드하는 고유 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 2)을 나타낸다. ALK3 세포외 도메인 (뉴클레오티드70-456)을 인코드하는 서열은 밑줄로 표시한다.
도 3은 인간 ALK3의 세포외 도메인의 고유 아미노산 서열(서열 번호: 3)을 나타낸다.
도 4는 인간 ALK3의 세포외 도메인을 인코드하는 고유 뉴클레오티드 서열(서열 번호:4)을 나타낸다.
도 5는 인간 IgG1 Fc 도메인의 고유 아미노산 서열(서열 번호: 5)을 나타낸다.
도 6은 인간 IgG1 Fc 도메인을 인코드하는 고유 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 6)을 나타낸다.
도 7은 리더가없는(leaderless) hALK3(24-152)-hFc (서열 번호: 7)의 아미노산 서열을 나타낸다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 3)은 밑줄로 표시하고, TGGG 링커 서열은 굵게 표시한다.
도 8은 TPA 리더와 전장의 hALK3(24-152)-hFc 아미노산 서열(서열 번호: 11)을 나타낸다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 3)은 밑줄로 표시하고, TGGG 링커 서열은 굵게 표시한다.
도 9는 TPA 리더가 있는 hALK3(24-152)-hFc를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 번호: 12는 코딩 스트랜드에 대응하며, 서열 번호: 13은 항-코딩 스트랜드에 대응한다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 4)을 인코드하는 서열은 밑줄로 표시한다.
도 10은 TPA 리더가 있는 전장의 hALK3(24-152)-mFc 아미노산 서열(서열 번호: 14)을 나타낸다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 3)은 밑줄로 표시하고, TGGG 링커 서열은 굵게 표시한다.
도 11은 TPA 리더가 있는 hALK3(24-152)-mFc를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 번호: 12는 코딩 스트랜드에 대응하며, 서열 번호: 13은 항-코딩 스트랜드에 대응한다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 4)을 인코드하는 서열은 밑줄로 표시한다. 서열 번호: 15는 코딩 스트랜드에 대응하며, 서열 번호: 16은 항-코딩 스트랜드에 대응한다. 인간 ALK3 세포외 도메인 (서열 번호: 4)을 인코드하는 서열은 밑줄로 표시한다.
도 12는 암컷 마우스의 전신 뼈 미네랄 밀도에서 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. 측정은 듀얼 에너지 x-ray 흡광광(absorptiometry) (DEXA)으로 실시하였다. 데이터는 평균(그룹당 n = 8) ± SEM이다. *, P < 0.05 vs. 비이클, unpaired t-test. hALK3(24-152)-mFc는 치료 31 및 42일 후에 전신 골밀도를 상당히 증가시켰다.
도 13는 암컷 마우스의 척추 골 미네랄 밀도에서 hALK3(24-152)-mFc 치료의 효과를 나타낸다. 4번 및 5번 요척추 (L4, L5)를 포함하는 부위 측정은 DEXA으로 실시하였다. 데이터는 평균(그룹당 n = 8) ± SEM 이다. **, P < 0.005 vs. 비이클, unpaired t-test. hALK3(24-152)-mFc는 치료 31 및 42일 후에 척추 골밀도를 상당히 증가시켰다.
도 14는 암컷 마우스의 피질골 두께에서 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. 우측 근위 경골의 측정은 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-CT)으로 실시하였다. 데이터는 평균 (그룹당 n = 8)이며, 에러막대는 ± 2배 SEM를 나타낸다 **, P < 0.005 vs. 비이클, unpaired t-test. hALK3(24-152)-mFc는 치료 6주 후 피질골 두께를 상당히 증가시켰다.
도 15는 암컷 마우스의 지주골 체적에 대해 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 우측 근위 경골 측정은 micro-CT로 실행하였다. 데이타는 평균 (그룹당 n = 8)이며, 에러막대는 ± 2배 SEM를 나타낸다. ***, P < 0.001 vs. 사전처리 기준 또는 비이클, unpaired t-test. hALK3(24-152)-mFc는 치료 4주후 지주골 비율을 이배이상으로 만들었다.
도 16은 암컷 마우스의 평균 해면 뼈(trabecular) 두께에 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 우측 근위 경골 측정은 micro-CT으로 이루어졌다. 데이터는 그룹 평균 (그룹당 n = 8)이며, 에러막대는 ± 2배 SEM을 나타낸다. ***, P < 0.001 vs. 사전처리 기준 또는 비이클, unpaired t-test. hALK3(24-152)-mFc는 치료 4주 후 해면 뼈 두께를 상당히 증가시켰다.
도 17은 암컷 마우스의 지주골 미소구조에서 4주간 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. 근위 경골에서 지주골의 대표적인 3차원 영상은 micro-CT로 만들었다. Scale bars = 300 ㎛.
도 18은 뼈 형성을 촉진시키기 위한 목적으로 BMP-ALK3 신호생성 축에 의한 신호생성을 간섭하기 위하여 여기에서 설명하는 3가지 방법을 예로 나타낸다. A: ALK3-Fc. B: 선택된 BMP 리간드에 대한 항체. C. ALK3 세포외 도메인의 리간드 결합 부분에 대항하는 항체. “BMP2”는 BMP가 BMP2, BMP4 또는 ALK3의 또다른 높은 친화력 리간드일 수 있다는 것을 설명하는데 이용한다.
도 19는 암컷 마우스의 최대 골 적하(load)에서 6주간 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 대퇴골의 일방적 분석은 Instron 기계 테스트 장치로 생체외에서 실행하였다. 데이터(Newton)은 평균 (그룹당 n = 8) ± SEM 이다. **, P < 0.01 vs. 비이클. hALK3(24-152)-mFc는 최대 뼈 적하를 30% 증가시켰다.
도 20은 암컷 마우스의 뼈 단단함에 대해 6주간 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 대퇴골의 일방적 분석은 Instron 기계 테스트 장치로 생체외에서 실행하였다. 데이터(㎜당 Newton)은 평균 (그룹당 n = 8) ± SEM 이다. *, P < 0.05 vs. 비이클. hALK3(24-152)-mFc는 뼈 강도를 14% 증가시켰다.
도 21은 암컷 마우스의 골 실패(failure) 에너지에 대한 6주간 hALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. 대퇴골의 일방적 분석은 Instron 기계 테스트 장치로 생체외에서 실행하였다. 데이타(mJ)은 평균 (그룹당 n = 8) ± SEM 이다. *, P < 0.05 vs. 비이클. hALK3(24-152)-mFc는 실패에 대한 에너지를 32% 증가시켰다.
도 22는 OVX 마우스의 정착된 골감소증 모델에서 지주골 체적에 대한 mALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. 근위 경골 측정은 micro-CT로 실시하였다. 데이타는 평균 (그룹당 n = 7-8)이며, 에러막대는 ± 2 SEM을 나타낸다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. 투약전, OVX 마우스는 가짜 수술을 받은 마우스와 비교하여 지주골 체적이 줄었다. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료 28일과 56일 째 뼈 체적을 상당히 증가시켰다.
도 23는 OVX 마우스의 골감소증 모델에서 피질골 두께에 대해 mALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 피질골 측정은 micro-CT로 이루어졌다. 데이타는 평균 (그룹 당 n = 7-8)이며, 에러막대는 ± 2 SEM을 나타낸다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료 56일째 피질골 두께를 상당히 증가시켰다.
도 24는 OVX 마우스의 감소증 모델에서 뼈표면(endosteal) 둘레에 대한 mALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 나타낸다. 경골 축 측정은 micro-CT로 실시하였다. 데이타는 평균 (그룹 당 n = 7-8)이며, 에러막대는 ± 2 SEM을 나타낸다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료 56일째 뼈표면 둘레를 상당히 감소시켜, 피질골 성장의 추가적인 증거를 제공한다.
도 25는 OVX 마우스의 골감소증 모델에서 DEXA로 측정하였을 때 전신 뼈 미네랄 밀도에 대한 mALK3(24-152)-mFc의 치료 효과를 보여준다. 데이타는 평균 (그룹 당 n = 7-8) ± SEM이다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료후 14일, 28일, 42일, 및 56일에 전신 골밀도를 상당히 증가시켰다.
도 26은 OVX 마우스의 골감소증 모델의 척추 뼈 미네랄 밀도에서 mALK3(24-152)-mFc 치료 효과를 보여준다. DEXA에 의해 요추(척추 L1-L6) 분석을 하였다. 데이타는 평균 (그룹 당 n = 7-8) ± SEM이다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료후 14일, 28일, 42일, 및 56일에 척추 골밀도를 상당히 증가시켰다.
도 27은 OVX 마우스의 골감소증 모델에서, DEXA로 측정하였을 때 대퇴골-경골의 뼈 미네랄 밀도에 대한 mALK3-mFc의 치료 효과를 보여준다. 전체 대퇴골 및 근위 경골 분석은 DEXA로 실시하였다. 데이타는 평균 (그룹 당 n = 7-8) ± SEM이다. *, P < 0.05 vs. OVX + 비이클. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc는 치료후 28일, 42일, 및 56일에 대퇴골-경골 골밀도를 상당히 증가시켰다.
도 28은 OVX 마우스의 골감소증 모델의 척추 뼈 미세구조에서 56일간의 mALK3(24-152)-mFc 효과를 보여준다. 요추 (L5)에서 지주골의 대표적인 3차원 영상은 micro-CT로 생체외에서 만들었다. Scale bar = 300 ㎛.
도 29는 조직형태계측법(histomophometry)에 의해 말단 대퇴골에서 평가하였을 때 암컷 마우스의 뼈 체적에 대해 mALK3(24-152)-mFc의 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. **, 대응하는 각 시점에서 P < 0.01 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 모든 시간대에서 뼈 체적을 상당히 증가시켰다.
도 30은 조직형태계측법(histomophometry)에 의해 말단 대퇴골에서 평가하였을 때 암컷 마우스의 뼈 형성율에 대해 mALK3(24-152)-mFc의 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. ***, 대응하는 각 시점에서 P < 0.01 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 치료 28일에 뼈 형성율을 상당히 증가시켰고, 따라서 동화성 뼈 형성 증거를 제공한다.
도 31은 조직형태계측법(histomophometry)에 의해 말단 대퇴골에서 평가하였을 때 암컷 마우스의 뼈 광화 표면에 대해 mALK3(24-152)-mFc의 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. 대응하는 각 시점에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 치료 14일 및 28일에 광화 표면을 상당히 증가시켰고, 따라서 동화성 뼈 형성 증거를 제공한다.
도 32는 조직형태계측법(histomophometry)에 의해 말단 대퇴골에서 평가하였을 때 암컷 마우스의 파골세포 표면에 대해 mALK3(24-152)-mFc의 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. 대응하는 각 시점에서 **, P < 0.01 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 치료 28일에 파골세포 표면을 상당히 감소시켰고, 따라서 항재흡수성 뼈 형성 증거를 제공한다.
도 33은 Luminex xMAP？ 분석으로 측정하였을 때, 암컷 마우스의 RANKL(핵인자 κB 리간드의 수용체 활성물질)의 혈청 수준에 대한 mALK3(24-152)-mFc 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. 대응하는 각 시점에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 모든 시점에서 순환 RANKL 수준을 상당히 감소시켰다.
도 34는 Luminex xMAP？ 분석으로 측정하였을 때, 암컷 마우스의 혈청 오스테오프로테그린(OPG)에 대한 mALK3(24-152)-mFc 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 단위 시점당 그룹당 n = 6. 대응하는 각 시점에서 **, P < 0.01; *, P < 0.05 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 처리 28일 및 42일에 순환 OPG 수준을 상당히 증가시켰다.
도 35는 실시간 중합효소 쇄 반응(RT-PCR)에 의해 측정하였을 때, 암컷 마우스의 대퇴골 및 경골에서 스켈로스틴(sclerostin) mRNA 수준에 대한 mALK3(24-152)-mFc의 효과를 보여준다. 데이타는 평균 ± SEM이다. 모든 대응하는 시점에서 ***, P < 0.001; *, P < 0.05 vs. 비이클. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 치료 2, 7, 및 28일째에 스켈로스틴 mRNA 수준을 상당히 감소시켰다.
도 36은 암컷 마우스에서 뼈 체적에 대한 hALK3(24-152)-hFc의 효과를 보여준다. 뼈 체적은 0일(기준)과 42일(생체외)에 micro-CT를 이용하여 근위 경골에서 평가하였다. 데이타는 평균 ± SEM이다; 그룹당 n = 6. ***, P < 0.001 vs. 비이클. 실험 과정에서, 비이클-처리된 대조군에서 뼈 체적이 거의 20% 감소하였지만, hALK3(24-152)-hFc 처리된 군에서는 80% 이상 증가하였다.
1. 개요
부분적으로, 본 내용은 BMP-ALK3 신호생성 경로의 억제제 가령 ALK3-Fc 단백질은 동물에서 뼈 형성을 촉진시킨다는 놀라운 결과를 설명한다. ALK3은 형질변환 성장 인자-베타 (TGF-베타)/뼈 형성 단백질 (BMP) 슈퍼패밀리의 구성원에 대한 수용체다. TGF-베타/BMP 슈퍼패밀리는 다양한 성장 인자들을 포함하는데, 이들은 공통적인 서열 요소들 및 구조적 모티프를 공유한다. 이들 단백질들은 척추동물 및 무척추동물 모두에서 매우 다양한 유형의 세포에 생물학적 영향을 발휘하는 것으로 알려져있다. 슈퍼패밀리 구성원들은 패턴 형성 및 조직 설계에서 배발생동안 중요한 기능을 수행하고, 그리고 지방세포분화(adipogenesis), 근육형성(myogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 심장형성(cardiogenesis), 혈액생성(hematopoiesis), 신경발생(neurogenesis), 및 상피세포 분화를 포함하는 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. TGF-베타 패밀리의 구성원의 활성을 조절함으로써, 유기체내에서 유의적인 생리적 변화를 일으키는 것이 가능하다. 예를 들면, Piedmontese 및 Belgian Blue 소 품종은 근육량의 상당한 증가를 야기하는 GDF8 (또는 미오스타틴이라고 부름) 유전자에 기능-상실 돌연변이를 가진다. Grobet et al., Nat genet. 1997, 17(1):71-4. 더욱이, 인간에서, GDF8의 비활성 대립유전자는 증가된 근육량과 연관이 있으며, 예외적 강도라고 보고한다. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
TGF-β 신호들은 타입 I 및 타입 II 세린/ 트레오닌 키나제 수용체들의 이종 복합체에 의해 중재되고, 리간드 자극 시에 하류 Smad 단백질을 포스포릴화시키고, 활성화시킨다(Massagu, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178). 이들 타입 I 및 타입 II 수용체들은 시스테인이 많은 부분을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막통과 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 특이성을 가진 세포질 도메인으로 구성된, 막통과 단백질이다. 타입 I 수용체들은 신호생성에 필수적이며; 그리고 타입 II 수용체들은 리간드의 결합과 타입 I 수용체들의 발현에 요구된다. 타입 I 및 II 악티빈 수용체들은 리간드 결합 후에 안정적인 복합체를 형성하여, 타입 II 수용체들에 의한 타입 I 수용체들의 포스포릴화를 초래한다.
악티빈 수용체-유사 키나제-3 (ALK3)은 BMP 패밀리내에 다중 리간드의 효과를 중제하는 타입 I 수용체이며, 그리고 뼈 형성 단백질 수용체, 타입 IA (BMPR1A), 또는 악티빈 A 수용체, 타입 II-유사 키나제 (ACVRLK)로도 공지되어 있다. 편재된 조직 발현을 하는 몇 가지 타입 I 수용체들과는 달리, ALK3는 좀더 특화된 기능성과 일치하게 제한된 발현 패턴을 나타낸다(ten Dijke, 1993, Oncogene 8:2879-2887). ALK3은 일반적으로 BMP2, BMP4, BMP7 및 BMP 패밀리의 기타 구성요소에 대해 높은 친화력 수용체로 인지된다. BMP2 및 BMP7은 골아세포성 분화의 강력한 자극제이며, 척추 융합 및 특정 불유합(non-union) 골절에서 뼈 형성을 임상적으로 유도하는데 현재 이용한다. ALK3은 골아세포에서 BMP2 및 BMP4 신호생성을 중재하는데 주요 수용체로 간주한다(Lavery et al., 2008, J. Biol. Chem. 283:20948-20958). 동형(homozygous) ALK3 녹아웃 마우스는 배발생 (9.5 일 시점) 초기에 죽지만, 골아세포에서 ALK3의 조건적 붕괴를 가지고 있는 성쥐는 비록 새로 형성된 뼈는 분열(disorganization) 증거를 보였지만, 골량이 증가된 것으로 최근에 보고되었다(Kamiya, 2008, J. 뼈 Miner. Res. 23:2007-2017; Kamiya, 2008, Development 135:3801-3811). 이러한 발견은 임상적 용도에서 뼈 구축제로써 BMP2와 BMP7(ALK3의 리간드)의 효과와는 상당히 놀라울 정도로 대조적이다.
여기에서 설명된 것과 같이, BMP2 및 BMP4에 결합에 실질적인 선호를 보인 가용성 ALK3 폴리펩티드(ALK3-Fc)는 생체내에서 뼈 성장을 촉진시키고, 골밀도를 증가시키는데 유효하다. 임의의 특정 기전에 결부되는 것을 원하지는 않지만, ALK3의 효과는 본 연구에서 이용된 특정 가용성 ALK3 구조체에 의해 나타난 매우 강력한 BMP2 및 BMP4 결합 (피코몰 해리 상수)이 제공된다면, 주로 BMP 길항체에 의한 것이다. 기전과 무관하게, BMP-ALK3 길항제는 정상 마우스에서 골밀도를 증가시킨다고 여기에서 제공된 데이터로부터 자명하다. 놀라운 것은, ALK3-Fc의 치료에 의해 생성된 뼈는 ALK3 조건 녹아웃 마우스에서 관찰된 분열 유형의 증거는 나타내지 않는다. 뼈는 성장 또는 수축하고, 그리고 뼈를 만들고, 광화작용을 자극하는 인자(주로 골아세포)와 뼈를 파괴하고, 탈광화시키는 인자(주로 파골세포)들의 균형에 따라 밀도가 증가 또는 감소되는 동적인 조직이라는 것이다. 뼈 성장 및 광화작용은 생산 인자에 의해 증가되거나, 파괴 인자에 의해 파괴되거나, 또는 이둘 모두에 의해 증가 또는 감소될 수 있다. “뼈 성장을 촉진시키고” 그리고“뼈 광화작용을 증가시키는”용어는 뼈에서 관찰할 수 있는 물리적 변화를 지칭하며, 뼈에서 일어나는 변화 기전에 중립적인 의도이다.
여기에서 설명하는 연구에서 이용되는 뼈 성장/밀도에 대한 마우스 모델은 인간에서 효과를 아주 잘 예측할 수 있는 것으로 간주되며, 따라서, 본 내용은 인간에서 뼈 성장을 촉진시키고, 골밀도를 증가시키기 위하여 ALK3 폴리펩티드와 기타 BMP-ALK3 길항제를 이용하는 방법을 제공한다. BMP-ALK3 길항제는 예를 들면, BMP-결합 가용성 ALK3 폴리펩티드, BMP에 결합하여 ALK3 결합을 파괴하는 항체, ALK3에 결합하여 BMP 결합을 파괴하는 항체, BMP 또는 ALK3 결합에 대해 선택된 비-항체 단백질(가령, 이러한 단백질의 예시 및 이를 고안하고 선별하는 방법에 대한 기술 WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939, 및 US 2005/0238646), Fc 도메인에 흔히 부착된, BMp 또는 ALK3 결합에 대해 선택된 랜덤화된 펩티드를 포함한다. BMP 또는 ALK3 결합 활성을 가지는 두 가지 상이한 단백질(또는 기타 모이어티), 특히, 타입 I (가령, 가용성 타입 I 악티빈 수용체) 및 타입 II (가령, 가용성 타입 II 악티빈 수용체) 결합 부위를 차단하는 BMP 결합물질은 서로 연결되어, 이가기능성 결합 분자를 만들 수 있다. BMP-ALK3 신호생성 축을 억제하는 핵산 아파타머, 소분자들 및 기타 물질도 고려한다. 추가적으로, BMPs를 억제하는 또는 특히, ALK3 발현을 억제하는 안티센스 분자, siRNAs 또는 리보자입과 같흔 핵산을 BMP-ALK3 길항제로 이용할 수 있다.
명세서에서 이용된 용어는 당업계, 그리고 본 내용 및 명세서내에서 이들 용어가 이용된 단락내에서 공지되어 있는 통상의 의미를 가진다. 특정 용어는 명세서 곳곳에서 논의되어 당업자에게 본 발명의 조성물 및 방법을 설명함에 있어서 추가 지침을 제공하며, 이들을 어떻게 만들고 이용하는지를 설명한다. 임의의 용어의 사용 범위 또는 의미는 용어가 이용된 특정 단락으로부터 자명할 것이다.
“약” 및 “대략”은 임의의 측정 성질 또는 정밀성에서 제공된 양의 일반적으로 수용되는 오차 범위를 의미한다. 일반적으로 오차 범위의 예는 주어진 값의 또는 값 범위의 20 (%), 바람직하게는 10% 이내, 그리고 더 바람직하게는 5%이내가 된다.
대안으로, 그리고 특정 생물학적 시스템내에서, 용어“약”및 “대략”은 주어진 값의 크기 범위의 10배, 바람직하게는 5-배 그리고 더 바람직하게는 2배가 된다. 여기에서 제공되는 수치 량은 다른 언급이 없는 한, 근사값이며, 용어“약” 또는 “대략”은 명시적으로 언급되지 않을 경우 추론될 수 있다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 돌연변이 (서열 변이체)에 대한 야생형 서열을 포함하는 서열을 서로 비교하는 단계들을 포함할 수 있다. 이러한 비교는 일반적으로 폴리머 서열의 배열로을 포함하는데, 가령, 당업계에 공지되어 있는 서열 정렬 프로그램 및/또는 알고리즘(예를 들면, BLAST, FASTA 및 MEGALIGN, 및 그 외 몇가지)을 포함한다. 당업자는 이러한 정렬에서 돌연변이는 잔기 삽입 또는 결손을 포함하는 이러한 정렬에서, 서열 정렬은 삽입된 또는 결손된 잔기를 포함하지 않는 폴리머 서열에 “갭” (일반적으로 - 또는 “A”로 나타냄)을 도입시킨다는 것을 인지할 수 있다.
모든 문법적 형태와 철자의 변이성에서“상동성(Homologous)”은 동일한 유기체 종의 슈퍼패밀리의 단백질을 포함한 “공통의 진화 기원”을 보유한 단백질과 상이한 유기체 종의 상동성 단백질의 두 단백질 사이에 상관 관계를 지칭한다. 이러한 단백질 (및 이를 인코드하는 핵산)은 서열 상동성을 가지는데, 동일성 비율 또는 특정 잔기 또는 모티프의 존재 및 보존된 위치들에 의해 서열 유사성이 반영된다.
모든 문법적 형태에서“서열 유사성(similarity)”은 공통의 진화 기원을 공유하는 또는 공유하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 또는 일치 정도를 지칭한다.
그러나, 공통의 용도 및 본 출원에서, “매우”와 같은 부사에 의해 수식될 때, “상동성”은 서열 유사성을 지칭하며, 공통의 서열 기원과 관련되거나 관련되지 않을 수 있다.
2. ALK3 폴리펩티드
특정 측면에서, 본 발명은 ALK3 폴리펩티드에 관한 것이다. 여기에서 이용된 것과 같이, “ALK3”은 임의의 종 및 돌연변이 또는 기타 변형에 의해 ALK3로부터 유도된 변이체의 악티빈 수용체-유사 키나제-3 (ALK3)[뼈 형성 단백질 수용체, 타입 IA (BMPR1A), 또는 악티빈 A 수용체, 타입 II-유사 키나제 (ACVRLK)이라고도 함] 단백질의 패밀리 종을 지칭한다. 여기에서 ALK3로 언급하는 것은 현재 확인된 임의의 형태를 말하는 것으로 이해한다. ALK3 패밀리의 구성원들은 일반적으로, 시스테인이 많은 부분을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막통과 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 키나제 활성을 가진 세포질 도메인을 포함하는 막통과 단백질이다.
“ALK3 폴리펩티드”는 ALK3 패밀리의 임의의 자연 발생적 폴리펩티드와 유용한 활성을 보유하는 임의의 이의 변이체(돌연변이, 단편들, 융합, 및 펩티드모방체 형태를 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일성, 바람직하게는 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 임의의 공지의 ALK3 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 ALK3 폴리펩티드는 ALK3 단백질 및/또는 BMPs에 결합하고, 이의 기능을 억제할 수 있다. 바람직하게는, ALK3 폴리펩티드는 뼈 성장 및 뼈 광화작용을 촉진한다. ALK3 폴리펩티드의 예는 인간 ALK3 전조 폴리펩티드 (서열 번호: 1) 및 가용성 인간 ALK3 폴리펩티드 (가령, 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41)를 포함한다.
인간 ALK3 전구 단백질 서열 (서열 번호: 1)은 도 1에 나타내며, 그리고 인간 ALK3 전구 단백질을 인코드하는 핵산 서열(서열 번호: 2; Genbank entry NM_004329의 뉴클레오티드 549-2144)은 도 2에 나타낸다. 인간 ALK3 가용성 (세포외), 프로세스된 폴리펩티드 서열 (서열 번호: 3)은 도 3에 나타내고, 그리고 인간 ALK3 세포외 도메인을 인코드하는 핵산(서열 번호: 4; Genbank entry NM_004329의 뉴클레오티드 618-1004)은 도 4에 나타낸다.
특정 구체예에서, 본 발명은 가용성 ALK3 폴리펩티드에 관계한다. 여기에서 설명하는 것과 같이, “가용성 ALK3 폴리펩티드”는 일반적으로 ALK3 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. “가용성 ALK3 폴리펩티드”는여기에서 이용된 것과 같이, ALK3 단백질의 임의의 자연 발생석 세포외 도메인과 이의 변이체(돌연변이, 단편들 및 펩티드모방체 형태를 포함)를 포함한다. BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 BMPs, 특히 BMP2 및 BMP4에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드다. 바람직하게는, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드는 1 nM 이하의 해리 상수(dissociation constant)로 BMP에 결합할 것이다. 인간 ALK3 전구 단백질의 아미노산 서열은 도 1에 제공한다. ALK3 단백질의 세포외 도메인은 BMP에 결합하고, 일반적으로 가용성이며, 따라서 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드라고 칭할 수 있다. 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드의 예는 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41에서 설명된 가용성 폴리펩티드를 포함한다. 서열 번호:7은 ALK3(24-152)-hFc라고 하며, 실시예들에서 추가 설명된다. 가용성, BMP-결합 ALK3 폴리펩티드의 기타 예는 ALK3 단백질의 세포외 도메인에 추가하여, 신호 서열, 예를 들면, 고유의 ALK3 리더 서열 (서열 번호: 8), 조직 플라스미노겐 활성물질 (TPA) 리더 (서열 번호: 9) 또는 꿀벌 멜리틴 리더 (서열 번호: 10)를 포함한다. 서열 번호: 11에 설명된 ALK3-hFc 폴리펩티드는 TPA 리더를 이용한다.
ALK3 폴리펩티드의 기능적 활성 단편들은 ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 핵산의 대응 단편으로부터 재조합으로 만들어진 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 추가로, 단편들은 전형적인 Merrifield 고체 상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. ALK3 단백질 또는 BMP에 의해 중개되는 신호생성의 길항제(억제제)로 기능을 할 수 있는 이들 펩티드 단편들을 확인하기 위하여 단편들을 만들고(재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해), 그리고 테스트한다.
ALK3 폴리펩티드의 기능적으로 활성 변이체는 ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 이에 대응하는 돌연변이된 핵산으로부터 재조합에 의해 생산된 변형된 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. ALK3 단백질 또는 BMP에 의해 중개되는 신호생성의 길항제(억제제)로 기능을 할 수 있는 것들을 확인하기 위하여 변이체를 만들고, 그리고 테스트한다. 특정 구체예들에서, ALK3 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 경우들에서, 기능적 변이체는 서열 번호: 3, 7, 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 또는 41로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
기능적 변이체는 치료 효과, 또는 안전성을 강화시키는 것과 같은 목적 (가령, 생체외 반감기 및 생체내 단백질 분해에 대한 저항성)으로 ALK3 폴리펩티드의 구조를 변형시킴으로써 만들 수 있다. BMP 결합을 보유하는 것에 대해 선택된 이러한 변형된 ALK3 폴리펩티드는 자연적으로 생성되는 ALK3 폴리펩티드에 대해 기능적 등가로 간주한다. 변형된 ALK3 폴리펩티드는 가령, 아미노산 치환, 결손, 또는 추가에 의해서도 만들 수 있다. 예를 들면, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산 (가령, 보존 돌연변이)에 의한 유사 대체는 생성 분자의 생물학적 활성에 크게 영향을 주지 않을 것으로 기대한다. 보존성 대체는 이들의 측쇄에 관련된 아미노산 패밀리내에서 일어나는 것들이다. ALK3 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변화가 기능적 상동체로 만들어지는 지는 야생형 ALK3 폴리펩티드에 유사한 방식으로 세포에서 반응을 만들어내는 변이체 ALK3 폴리펩티드의 능력을 평가하면 바로 결정할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시키기 위하여 ALK3 폴리펩티드의 특정 돌연변이를 고려한다. 하나 이상의 글리코실화 부위, 예를 들면, O-링크된 또는 N-링크된 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하기 위하여 이러한 돌연변이를 선택할 수 있다. 아스파라긴-링크된 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포의 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인지되는, 삼펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 (또는 아스파라긴-X-세린) (여기서 “X”는 임의의 아미노산임)를 포함한다. 야생형 ALK3 폴리펩티드 (O-링크된 글리코실화 부위를 위하여)의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들을 추가 또는 치환시켜 변형을 또한 만들 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제 1 또는 제3 위치중 하나 또는 둘다에서 다양한 아미노산 치환 또는 결손(및/또는 제 2 위치에서 아미노산 결손)에 의해 변형된 삼펩티드 서열에서 비-글리코실화를 초래한다. ALK3 폴리펩티드상에 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 또 다른 수단은 ALK3 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링(coupling)이다. 사용된 커플링에 따라, 당(sugar)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유카르복실 기; (c) 시스테인의 것과 같은 자유 설프히드릴 기; (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 자유 하이드록실 기; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기들; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이러한 방법들은 WO 87/05330 (Sep. 11, 1987 공개됨), 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에서 설명하고 있으며, 전문이 참고문헌에 통합된다. ALK3 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 이루어질 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 예를 들면, ALK3 폴리펩티드를 화합물 트리플로오르메탄술폰산, 또는 등가의 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 처리로 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고, 대부분 또는 모든 슈가는 절단되며, 아미노산 서열은 고유한 상태로 남게 된다. 화학적 탈글리코실화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에서 추가 설명된다. ALK3 폴리펩티드상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에서 설명하는 것과 같이 다양한 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제를 이용하여 이루어질 수 있다. ALK3 폴리펩티드의 서열은 이용되는 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있는데, 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포는 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴들을 도입시킬 수 있기 때문이다. 일반적으로, 인간에서 사용하기 위한 ALK3 단백질은 HEK293 또는 CHO 세포계와 같은 적절한 글리코실화를 제공하는 포유류 세포계에서 발현될 수 있지만, 기타 포유류 발현 세포계, 조작된 글리코실화 효소를 가지는 효모 세포계 및 곤충 세포들도 또한 유용할 것으로 기대한다.
본 내용은 또한 돌연변이의 생성, 특히 ALK3 폴리펩티드의 복합 돌연변이 세트, 그리고 절두 돌연변이 방법을 추가 고려하고; 복합 돌연변이 풀(pool)은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 이러한 복합 라이브러리의 스크리닝 목적은 예를 들면, 항진제 또는 길항제로 작용할 수 있는 ALK3 폴리펩티드 변이체를 만들거나, 또는 대안으로, 전적으로 신규한 활성을 보유하는 변이체를 만들기 위함일 수도 있다. 다양한 스크리닝 방법은 하기에서 제공하며, 그리고 이러한 분석들을 이용하여 변이체를 평가할 수 있다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드 변이체는 ALK3 리간드에 결합하는 능력, ALK3 리간드가 ALK3 폴리펩티드에 결합을 방해 또는 ALK3 리간드에 의한 신호생성을 간섭하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
ALK3 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성은 세포-기반의 또는 생체 검사에서 또한 테스트할 수 있다. 예를 들면, 뼈 생산 또는 뼈 파괴에 관련된 유전자의 발현에서 ALK3 폴리펩티드 변이체의 효과를 평가할 수 있다. 필요하다면, 이 평가는 하나 이상의 재조합 ALK3 리간드 단백질 (가령, BMP2 또는 BMP4) 존재하에 실행할 수 있고, 그리고 ALK3 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체, 그리고 임의의 ALK3 리간드를 만들기 위하여 세포에 형질감염시킬 수 있다. 마찬가지로, ALK3 폴리펩티드를 마우스 또는 기타 동물에 투여할 수 있고, 하나 이상의 뼈 성질들, 가령, 밀도 또는 체적을 평가할 수 있다. 뼈 골절에 때한 치유률도 평가할 수 있다. 듀얼-에너지 x-ray 흡광광 (DEXA)은 인간에게서 골밀도를 평가하기 위한 잘-확립된, 비-침투성, 정량적 기술이다. 인간에서, 중앙 DEXA 시스템을 이용하여 척추 및 골반에서 골밀도를 평가할 수 있다. 이들은 전반적인 골밀도의 최상의 예측자다. 말초 말초 DEXA 시스템을 이용하여 말초 뼈, 예를 들면, 손, 손목, 발목 및 발의 뼈를 포함하는 말초 뼈에서 골밀도를 평가할 수 있다. CAT 스캔을 포함하는 전통적인 x-ray 영상 시스템을 이용하여 뼈 성장 및 골절 치유를 평가할 수 있다. 뼈의 기계적 강도 또한 평가할 수 있다.
복합적으로 유도된 변이체는 자연 발생적 ALK3 폴리펩티드에 대해 선택적 또는 일반적으로 증가된 강도를 가지도록 만들 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이에 의해 대응하는 야생형 ALK3 폴리펩티드와는 상당히 다른 세포내 반감기를 가지는 변이체를 만들 수 있다. 예를 들면, 변경된 단백질은 고유의 ALK3 폴리펩티드를 파괴 또는 그렇지 않으면 비활성화시킬 수 있는 단백질 분해 또는 기타 세포 공정에 더 안정적인 또는 덜 안정적일 수 있다. 이러한 변이체, 및 이를 인코드하는 유전자들을 이용하여 ALK3 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ALK3 폴리펩티드 수준을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 짧은 반감기는 더 일과적인 생물학적 효과를 야기할 수 있고, 그리고 환자내에서 재조합 ALK3 폴리펩티드 수준의 더 엄격한 조절을 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 단백질의 반감기를 변경시키기 위하여 링커(있다면) 및/또는 Fc 부분에 돌연변이를 만들 수 있다.
복합 라이브러리는 잠재적인 ALK3 폴리펩티드 서열의 최소한 일부를 각각 포함하도록 폴리펩티드 라이브러리를 인코드하는 축퇴 라이브러리에 의해 만들 수 있다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 결찰시켜 잠재적 ALK3 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트는 개별 폴리펩티드로 발현가능하며, 또는 대안으로, 더 큰 융합 단백질 (가령, 파이지 디스플레이용)의 세트로 발현될 수 있다.
축퇴(degenerate) 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 상동체를 만들 수 있는 많은 방법들이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 실시할 수 있고, 그 다음 합성 유전자는 발현을 위하여 적절한 벡터에 결찰된다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) 핵산 Res. 11:477). 이러한 기술들은 기타 단백질의 유도된 진화에 이용하여왔다(see, 예를 들면, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 그리고 U.S. Patent Nos: 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815).
대안으로, 복합 라이브러리를 만들기 위하여 다른 형태의 돌연변이 생성을 이용할 수 있다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드 변이체를 만들고, 그리고 예를 들면, 알라닌 스캐닐 돌연변이생성 및 이와 유사한 것에 의해(Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), 링커 스캐닝 돌연변이생성에 의해(Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); 포화(saturation) 돌연변이생성에 의해(Meyers et al., (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이 생성에 의해(Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 또는 화학적 돌연변이 생성을 포함한 랜덤 돌연변이 생성에 의해(Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)을 이용하여 스크리닝함으로써 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 특히 복합 세팅에서, 링커 스캐닝 돌연변이생성은 절두된 (생활성)의 ALK3 폴리펩티드를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 절두에 의해 만들어진 복합 라이브러리의 유전자 산물들을 스크리닝하기 위한 다양한 범위의 기술들이 당분야에 공지되어 있고, 특정 성질을 가진 유전자 산물들에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술들도 당분야에 공지되어 있다. 이러한 기술들은 ALK3 폴리펩티드의 복합 돌연변이 생성에 의해 만들어진 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 일반적으로 적용할 수 있을 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 가장 광범위하게 이용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터내에 클로닝시키고, 형질변환 적절한 세포를 생성된 벡터 라이브러리로 형질변환시키고, 그리고 원하는 활성 탐지에 의해 산물이 탐지되는 유전자를 인코드하는 벡터를 상대적으로 용이하게 분리시키는 조건하에 복합 유효량를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 분석들은 BMP 결합 분석들 및 BMP-중재된 세포 신호생성 분석들을 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 ALK3 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드에 원래 존재하는 임의의 것에 추가하여, 해독후 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 포스포릴화, 지질화, 그리고 아실화를 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 그 결과, 변형된 ALK3 폴리펩티드는 비-아미노산 요소들, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리사카라이드 또는 모노사카라이드, 및 포스페이트를 포함할 수 있다. ALK3 폴리펩티드의 기능에서 이러한 비-아미노산 요소들의 효과는 기타 ALK3 폴리펩티드 변이체에 대해 여기에서 설명하는 것과 같이 테스트될 수 있다. ALK3 폴리펩티드가 ALK3 폴리펩티드의 고유 형태를 절단함으로써 세포에서 만들어질 때, 해독후 프로세싱 또한 정확한 폴딩및/또는 단백질의 기능에 중요할 것이다. 상이한 세포들(가령, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)은 이러한 해독후 활성에 대한 특정 세포 조직 및 특정 기전을 가지며, ALK3 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱을 담보하기 위하여 선택할 수 있다.
특정 측면에서, ALK3 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ALK3 폴리펩티드의 최소한 일부분 및 하나 이상의 융합 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 전이효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로블린 중쇄 불변 부분 (Fc), 말토즈 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 융합 도메인은 원하는 성질을 부여하기 위하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 융합 도메인은 친화력 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 분리에 특히 유용하다. 친화력 정제를 목적으로, 친화력 크로마토그래피용 관련 매트릭스, 가령 글루타티온-, 아밀라제-, 및 니켈 또는 코발트-콘쥬게이트된 수지를 이용한다. 이러한 많은 매트릭스는 “키트”형태로 이용하능하며, 가령 Pharmacia GST 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너에 유용한 QIAexpress™ 시스템 (Qiagen)이 있다. 또다른 예로서, ALK3 폴리펩티드의 용이한 탐지를 위하여 융합 도메인을 선택할 수 있다. 이러한 탐지 도메인의 예는 다양한 형광 단백질 (가령, GFP)과 “에피토프 태그”를 포함하는데, 이들은 특정 항체를 이용할 수 있는 통상 짧은 펩티드 서열이다. 특정 단클론 항체에 대한 잘 공지된, 바로 이용가능한 에피토프 테그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 그리고 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우, 융합 도메인은 가령 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이들은 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 절단하여, 이로부터 재조합 단백질을 자유롭게 한다. 유리된 단백질은 그다음 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 바람직한 구체예들에서, ALK3 폴리펩티드는 생체내에서 ALK3 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인과 용합된다(“안정화” 도메인). “안정화(stabilizing)”는 감소된 파괴, 신장에 의한 제거의 감소 또는 약물동력학 효과에 의한 제거의 감소 때문인지에 관계없이, 혈청 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 면역글로블린의 Fc 일부분과의 융합은 광범위한 단백질에서 바람직한 약물동력학 성질들을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 융합은 원하는 성질을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 도메인 및 기능적 도메인(추가 생물학적 기능, 가령 원하는 바와 같이, 뼈 성장 또는 근육 성장의 추가 자극을 부여하는)의 다중화(가령, 이량제화, 사량체화)를 포함한다.
특정 예로서, 본 발명은 Fc 도메인(가령, 도 5의 서열 번호: 5)에 융합된 ALK3의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. Fc 도메인의 예는 다음과 같다:
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
임의로, Fc 도메인은 특정 잔기들, 가령 Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434에서 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 특정 경우들에서, 하나 이상의 이러한 돌연변이 (가령, Asp-265 돌연변이)를 가지는 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비교하여 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 감소된다. 다른 경우들에서, 하나 이상의 이러한 돌연변이 (가령, Asn-434 돌연변이)를 가지는 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비교하여 MHC class I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 결합하는 능력이 증가된다.
융합 단백질의 상이한 요소들은 원하는 기능과 일치하도록 배열될 수 있다고 이해한다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드는 이종(heterologous) 도메인의 C-말단에 위치할 수 있고, 또는, 대안으로, 이종 도메인이 ALK3 폴리펩티드의 C-말단에 위치할 수 있다. ALK3 폴리펩티드 도메인 및 이종 도메인은 융합 단백질에 인접할 필요는 없고, 그리고 추가 도메인 또는 아미노산 서열이 이들 도메인의 C- 또는 N-말단에 포함되거나 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 ALK3 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들면, 이러한 변형은 ALK3 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 강화시키고, ALK3 폴리펩티드의 순환 반감기를 강화시키고, 또는 ALK3 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형은 융합 단백질 (예를 들면, ALK3 폴리펩티드 및 안정화 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 글리코실화 부위의 변형(예를 들면, ALK3 폴리펩티드에 글리코실화 부위 추가를 포함), 그리고 탄수화물 모이어티의 변형(예를 들면, ALK3 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 포함)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 융합 단백질의 경우, ALK3 폴리펩티드는 안정화 도메인 가령, IgG 분자 (가령, Fc 도메인)에 융합된다. 여기에서 이용된 것과 같이, “안정화 도메인”은 융합 단백질의 경우 융합 도메인 (가령, Fc)을 지칭할 뿐만 아니라, 가령, 탄수화물 모이어티, 또는 비-단백질성 폴리머, 가령 폴리에틸렌 글리콜와 같은 비-단백질성 변형을 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 이용가능한 단리된 및/또는 정제된 형태의 ALK3 폴리펩티드를 만들고, 이들은 단리된 형태 또는 그렇지 않으면 실질적으로 다른 단백질이 없는 형태다. ALK3 폴리펩티드는 재조합 핵산으로부터 유전적으로 만들 수 있다.
3. ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 핵산
특정 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 ALK3 폴리펩티드 단편들, 기능적 변이체 및 융합 단백질을 포함하는 임의의 ALK3 폴리펩티드 (가령, 가용성 ALK3 폴리펩티드)를 인코드하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들면, 서열 번호: 2는 자연 발생적 인간 ALK3 선조 폴리펩티드를 인코드하고, 서열 번호: 4는 ALK3의 프로세스된 세포외 도메인을 인코드한다. 대상 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은예를 들면, ALK3 폴리펩티드를 만드는 방법에 이용되거나 또는 직접적 치료제(가령, 유전자 치료 방법에서)로 이용될 수 있다.
특정 측면에서, ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 해당 핵산은 서열 번호: 2 또는 4의 변이체인 핵산을 포함할 수 있는 것으로 더 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결손, 가령, 대립형질 변이체에 의해 상이한 서열들을 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 당업계에 숙련자는 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37에 상보적인 핵산 서열과 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37의 변이체 또한 본 발명의 범위내에 있음을 인지할 것이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 단리된, 재조합, 및/또는 이종 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, DNA 라이브러리내에 있다.
기타 구체예들에서, 본 발명의 핵산은 매우 엄격한(stringent) 조건하에서 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37의 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37의 보체 서열, 또는 이의 단편들에 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 당업자는 DNA 하이브리드화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건은 변화될 수 있다는 것을 바로 인지할 것이다. 당업자는 DNA 하이브리드화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건은 변화될 수 있다는 것을 바로 인지할 것이다. 예를 들면, 약 45℃에서 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 하이브리드화를 실행하고, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하여 실행할 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성에서부터 50℃에서 0.2 x SSC의 높은 엄격성까지의 범위에서 선택될 수 있다. 추가로, 세척 단계의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격성 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염은 모두 변화될 수 있고, 또는 온도 또는 염 농도를 일정하게 유지하고, 다른 변수들을 변화시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격성 조건하에 하이브리드되는 핵산을 제공하고, 실온에서 2 x SSC에서 세척한다.
서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37에서 제시한 핵산과 유전자 코드의 축퇴로 인하여 상이한 단리된 핵산들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들면, 다수의 아미노산이 한 개 이상의 3중 코드에 할당된다. 동일한 또는 유사한 아미노산을 명시하는 코돈(예를 들면, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대해 동의적이다)은 “침묵” 돌연변이를 초래하여 단백질의 아미노산 서열에는 영향을 주지 않는다. 그러나, 해당 단백질의 아미노산 서열에 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포에 존재할 것으로 예상한다. 당업자는 특정 단백질을 인코드하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(최대 뉴클레오티드의 약 3-5%까지)에 이러한 변이는 천연 대립형질 변이로 인하여 주어진 종의 개체들간에 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 임의의 그리고 이러한 모든 뉴클레오티드 변이 및 생성된 아미노산 다형성(polymorphisms)은 본 발명의 범위에 속한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체내에 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작용가능하도록 링크된다. 조절 뉴클레오티드 서열은 발현에 이용되는 숙주 세포에 일반적으로 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대해 다양한 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열들이 공지되어 있다. 일반적으로, 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 시작 및 종료서열, 해독 시작 및 종료 서열, 그리고 헨서 또는 활성물질 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당분야에 공지된 구성 또는 유도성 프로모터도 본 발명에 의해 고려된다. 프로모터는 자연 발생적 프로모터, 또는 한 개 이상의 프로모터의 요소들이 복합된 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포내 에피좀 상에, 가령, 플라스미드로 존재할 수 있고, 발현 구조체는 염색체에 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 형질변환된 숙주 세포의 선별을 허용하는 선택가능한 표식 유전자를 포함한다. 선택가능한 표식 유전자는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이용된 숙주세포에 따라 다양할 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, ALK3 폴리펩티드를 인코드하고, 최소한 하나의 조절 서열에 작용가능하도록 링크된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 해당 핵산이 발현 벡터에 제공된다. 조절 서열은 당업계에 공지되어 있고, ALK3 폴리펩티드의 직접적인 발현에 대해 선택된다. 따라서, 조절 서열은 프로모터, 인헨서, 및 기타 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적인 조절 서열들은 Goeddel; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명된다. 예를 들면, DNA 서열에 작용가능하도록 연결되었을 때, DNA 서열의 발현을 조절하는 다양한 발현 조절 서열중 임의의 것을 ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 발현시키기 위하여 이들 벡터에 이용할 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들면, SV40의 초기 및 후기(early and late) 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터(이의 발현은 T7 RNA 폴리머제에 의해 지시받음), 람다 파아지의 주요 오퍼레이트 및 프로모터 부분, fd 코트 단백질의 조절 부분, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분야 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제, 가령, Pho5의 프로모터, 효모 α-메이팅(mating) 인자의 프로모터, 베큘로바이러스 시스템의 폴리헤드론 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 서열, 그리고 이들의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질변환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시킬 원하는 단백질의 유형과 같은 인자들에 따라 달라진다는 것을 인지해야 한다. 더욱이, 벡터의 카피 수, 카피수를 조절하는 능력, 벡터에 의해 인코드된 가령, 항생제의 표식과 같은 임의의 기타 단백질의 발현도 또한 고려해야만 한다.
본 발명의 재조합 핵산은 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 진핵세포, 원핵세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 이들 모두에 적합한 벡터에 결찰시켜 만들 수 있다. 재조합 ALK3 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비이클은 플라스미드 및 기타 벡터를 포함한다. 예를 들면, 적합한 벡터는 원핵세포, 가령, 대장균에서 발현을 위한 다음과 같은 유형의 플라스미드를 포함한다: pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드 그리고 pUC-유도된 플라스미드.
일부 포유류 발현 벡터는 세균에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열과 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예들이다. 이들 벡터중 일부는 세균성 플라스미드, 가령 pBR322의 서열로 변형되어, 원핵 및 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 저항성 선별을 용이하게 한다. 대안으로, 바이러스의 유도체 가령, 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유도된 및 p205)를 진핵 세포에서 단백질의 일과적 발현에 이용할 수 있다. 아래 유전자 요법 전달 시스템 설명에서 기타 바이러스(레트로바이러스 포함)의 예를 찾아볼 수 있다. 플라스미드의 조제물 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용된 다양한 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포용 기타 적합한 발현 시스템과 일반적인 재조합 과정은 Molecular CloningLaboratory, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)을 참고한다. 일부 경우에서, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 베큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유도된 벡터 (가령 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도된 벡터 (가령 pAcUW1), 및 pBlueBac-유도된 벡터 (가령 ß-gal을 포함하는 pBlueBac III)를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 벡터는 CHO 세포에서 해당 ALK3 폴리펩티드를 생산하도록 기획할 수 있는데, 가령, Pcmv-Script 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wisc.)가 될 수 있다. 자명한 것은, 해당 유전자 구조체를 이용하여 배양물에서 증식된 세포내에서 해당 ALK3 폴리펩티드를 발현시켜 정제를 위한 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 포함하는 단백질을 생산할 수 있다.
본 내용은 또한 하나 이상의 해당 ALK3 폴리펩티드의 코딩 서열(가령, 서열 번호: 2, 4, 12, 13, 15, 16, 19, 21, 24, 27, 32 또는 37)을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 ALK3 폴리펩티드는 대장균과 같은 세균성 세포, 곤충 세포(가령, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용한), 효모, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포들은 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 대상 ALK3 폴리펩티드를 생산하는 방법을 더 포함한다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ALK3 폴리펩티드의 발현이 일어나는 것을 허용하는 적합한 조건하에 배양할 수 있다. ALK3 폴리펩티드를 포함하는 세포와 배지의 혼합물로부터 ALK3 폴리펩티드는 분비되고, 그리고 단리시킬 수 있다. 대안으로, ALK3 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분취물 및 수거된, 용해된 세포 및 단리된 단백질에 남아있을 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 기타 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있다. 대상 ALK3 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ALK3 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체로 면역친화력 정제 및 ALK3 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 물질로 친화력 정제(가령, 단백질 A 컬럼을 이용하여 ALK3-Fc 융합을 정제할 수 있다)을 포함하는 단백질을 정제하기 위하여 당업계에 공지되어 있는 기술을 이용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 이둘로부터 단리할 수 있다. 바람직한 구체예에서, ALK3 폴리펩티드는 이의 정제를 용이하게 하는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직한 구체예에서, 정제는 예를 들면, 임의의 순서로 다음중 3가지 이상을 포함하는 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 이루어진다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, ALK3-hFc 단백질은 크기 압출 크로마토그래피로 측정하였을 때 >98% 그리고 SDS PAGE로 측정하였을 때, >95%의 순도로 정제되었다. 이러한 순도 수준은 마우스의 뼈에 바람직한 효과와 마우스, 쥐 그리고 인간이 아닌 영장류에서 수용되는 안전성 프로파일을 얻는데 충분하였다.
또다른 구체예에서, 정제 리더 서열, 가령 재조합 ALK3 폴리펩티드의 원하는 일부의 N-말단에서 poly-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2 + 금속 수지를 이용하여 친화력 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 그 다음 정제 리더 서열은 엔테로키나제로 처리하여 제거함으로써 정제된 ALK3 폴리펩티드를 제공할 수 있다(가령, Hochuli et al., (1987) J.411:177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참고).
융합 유전자를 만드는 기술들은 잘 공지되어 있다. 기본적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편들의 결합은 결찰용 블런트-단부 도는 스태거-단부를 이용하고, 적절한 말단을 제공하기 위하여 제한효소 절단하고, 원하지 않는 결합을 피하기 위하여 적절한, 알칼리 포스파타제 처리로 코헤시브 엔드를 메우고, 그리고 효소적 결찰과 같은 전형적인 기술에 따라 시행된다. 대안으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은 2개 연속 유전자 단편들 사이에 상보적인 오버행을 만들기 위하여 엥커 프라이머를 이용하여 실행하고, 오버행은 후속적으로 어닐링되어, 키메라 유전자 서열을 만들 수 있다(예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. 대안적 BMP 및 ALK3 길항제
여기에서 제시하는 데이타는 BMP-ALK3 신호생성의 길항제를 이용하여 뼈 성장을 촉진시키고 그리고 뼈 광화작용을 촉진시킬 수 있다. 가용성 ALK3 폴리펩티드, 특히 ALK3-Fc는 바람직한 길항제이지만, 그리고 이러한 길항제가 BMP 길항작용이외의 다른 기전을 통하여 뼈에 영향을 줄 수 있지만(가령, BMP 억제는 해당 물질이 TGF-베타 슈퍼패밀리의 기타 구성요소들을 포함한 분자 스펙트럼의 활성을 억제하는 경향의 지표일 수 있고, 이러한 집합적 억제가 뼈에서 원하는 효과를 유도할 수 있다), 항-BMP (가령, BMP2 또는 BMP4) 항체, 항-ALK3 항체, 안티센스, ALK3, BMP2 또는 BMP4의 생산을 억제하는 RNAi 또는 리보자임 핵산 그리고 특히 BMP-ALK3 결합을 파괴하는 BMP 또는 ALK3의 기타 억제제를 포함한 다른 유형의 BMP-ALK3 길항제들이 유용할 것으로 기대된다.
ALK3 폴리펩티드 (가령, 가용성 ALK3 폴리펩티드)와 특이적으로 반응하고, 그리고 ALK3 폴리펩티드를 가진 리간드에 경쟁적으로 결합하거나 또는 ALK3-중재된 신호생성을 억제하는 항체는 ALK3 폴리펩티드 활성의 길항제로 이용할 수 있다. 마찬가지로, BMP 폴리펩티드와 특이적으로 반응하고, 그리고 ALK3 결합을 파괴하는 항체를 길항제로 이용할 수 있다.
ALK3 폴리펩티드 또는 BMP 폴리펩티드로부터 유도된 이뮤노겐을 이용함으로써, 표준 프로토콜에 따라 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단클론 항체를 만들 수 있다(예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). 포유동물, 가령, 마우스, 헴스터 또는 토끼를 ALK3 폴리펩티드의 면역원 형, 항체 반응, 또는 융합 단백질을 유도할 수 있는 항원 단편으로 면역주사할 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 당업계에 공지되어 있는 운반체에 콘쥬게이션 또는 다른 기술을 포함한다. ALK3 또는 BMP 폴리펩티드의 면역원성 부분은 어쥬번트 존재하에 투여할 수 있다. 면역 과정은 혈장 또는 혈청중 항체 역가를 탐지함으로써 모니터할 수 있다. 항체 수준을 평가하기 위하여 항원으로 이뮤노겐과 함께 표준 ELISA 또는 다른 면역 분석을 이용할 수 있다.
ALK3 폴리펩티드의 항원 조제물로 동물을 면역주사하고, 항혈청을 수득할 수 있고, 원하는 경우 다클론 항체를 혈청으로부터 단리시킬 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체를 생산하는 세포(림프구)를 면역주사를 맞은 동물로부터 수거하고, 표준 체세포 융합 과정에 의해 하이브리도마 세포를 생산하는 골수종 세포와 같은 불사화 세포와 융합시킬 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 그리고 예를 들면, 하이브리도마 기술(Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497에 의해 독창적으로 개발된), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), 그리고 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and 암 Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)를 포함한다. 하이브리도마 세포들은 ALK3 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체의 생산 및 이러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양물로부터 단리된 단클론 항체를 생산하기 위하여 면역화학적으로 스크리닝할 수 있다.
“항체”는 여기에서 이용된 것과 같이, 대상 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 단편을 포함한다. 항체는 전형적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 이들 단편들은 전체 항체에 대해 상기에서 설명된 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, F(ab)2 단편들은 항체를 펩신으로 처리하여 만들 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편은 이황화 다리를 환원시키기 위하여 처리하면 Fab 단편들을 만들 수 있다. 본 발명의 항체는 이중특이적, 단일-쇄, 키메라, 인간화된 그리고 항체의 최소한 하나의 CDR 부분에 의해 부여되는 ALK3 또는 BMP 폴리펩티드에 대한 친화력을 가지는 전체 인간 분자를 더 포함한다. 항체는 항체에 부착된 라벨을 더 포함하여 탐지될 수 있다(가령, 라벨은 방사능동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 공-인자일 수 있다).
특정 구체예들에서, 항체는 재조합 항체인데, 이 용어는 CDR-접목된 또는 키메라 항체, 라이브러리-선택된 항체 도메인으로부터 어셈블리된 인간 또는 기타 항체, 단일 쇄 항체 및 단일 도메인 항체 (가령, 인간 VH 단백질 또는 camelid VHH 단백질)를 포함하는 분자 생물학 기술에 의해 일부 생산되는 임의의 항체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 항체는 단클론 항체이며, 특정 구체예들에서, 본 발명은 신규한 항체를 만들기 위한 이용할 수 있는 방법들을 만든다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드 또는 BMP 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 만드는 방법은 탐지가능한 면역 반응을 자극하는데 유효한 항원 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에게 투여하고, 마우스로부터 항체를 생산하는 세포(가령, 비장 세포)를 얻고, 그리고 항체를 생산하는 세포에 골수종 세포를 융합시켜, 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻고, 그리고 항체를 생산하는 하이브리도마를 테스트하여 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 수득되면, 하이브리도마는 세포 배양물, 임의로 하이브리도마-유도된 세포가 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 배양 조건에서 증식시킬 수 있다. 단클론 항체를 세포 배양물로부터 정제할 수도 있다.
항체와 관련하여 사용된 부사구 “~와 특이적으로 반응하는”의 의미는 당분야에서 일반적으로 인지되는 바와 같이, 항체는 특정 유형의 생물학적 시료중 관심 항원의 존재를 탐지함에 있어서 관심 항원(가령, ALK3 폴리펩티드)과 항체가 이용하지 않는 관심 대상이 아닌 항원 사이에 충분한 선택성이 있는 항체를 의미한다. 항체를 이용하는 특정 방법들에서, 가령 치료 용도에서, 결합에 있어서 더 높은 수준의 특이성이 바람직할 수 있다. 단클론 항체는 일반적으로 원하는 항원과 교차-반응성 폴리펩티드를 효과적으로 구별할 수 있는 경향이 더 크다(다클론 항체와 비교하였을 때). 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 주는 한 가지 특징은 항원에 대한 항체의 친화력이다. 바람직한 특이성은 광범위한 상이한 친화력을 가질 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 이하의 친화력(해리상수)를 가질 수 있다. BMPs와 ALK3 사이에 놀라운 단단한 결합이 제공된다면, 항-BMP 또는 항-ALK3 중화항체는 일반적으로 10-9 이하의 해리상수를 가질 수 있는 것으로 예상한다.
또한, 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체를 스크리닝하는데 이용하는 기술들은 수득된 항체의 성질에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 항체를 용액중 항원을 결합하는데 이용한다면, 용액 결합을 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체와 항원 사이의 상호작용을 테스트하는데 다양한 여러 기술들을 이용할 수 있다. 이러한 기술들은 ELISAs, 표면 플라스몬 공명 결합 분석들(가령, BiacoreTM 결합 분석, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 분석들(가령, 상자성 비드 시스템, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), 웨스턴 블랏, 면역침강 분석, 및 면역조직화학을 포함한다.
BMP 또는 ALK3 길항제인 핵산 화합물은 안티센스 핵산, RNAi 구조체 및촉매성 핵산 구조체를 포함한다. 핵산 화합물은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 화합물은 오버행 또는 비-상보성 부분을 또한 포함할 수 있는데, 이때 가닥중 하나 또는 다른 하나는 단일 가닥이다. 단일 가닥 화합물은 자가-상보성 부분을 포함하는데, 이는 화합물이 소위 이중 나선 구조 일부를 가진 “헤어핀” 또는 “스템-루프” 구조를 형성한다는 의미다. 핵산 화합물은 전장 ALK3 핵산 서열 또는 BMP 핵산 서열의 겨우 1000개, 겨우 500개, 겨우 250개, 겨우 100개 또는 겨우 50개, 35개, 30개, 25개, 22개, 20개 또는 18개 뉴클레오티드로 구성된 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상보성 부분은 바람직하게는 최소한 8개 뉴클레오티드, 그리고 임의로 최소한 10개 또는 최소한 15개 뉴클레오티드, 그리고 임의로 15개 내지 25개 뉴클레오티드일 수 있다. 상보성 부분은 가령 인트론, 코딩 서열 또는 표적 전사체, 가령 코딩 서열 일부의 넌-코딩 서열에 포함될 수 있다. 일반적으로, 핵산 화합물은 길이가 약 8 내지 약 500개 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 가질 수 있고, 임의로 길이는 약 14개 내지 약 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 핵산은 DNA (특히 안티센스로 이용하기 위한), RNA 또는 RNA:DNA 하이브리드일 수 있다. 임의의 한 가닥은 RNA 및 DNA 혼합물과 DNA 또는 RNA로 바로 분류할 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 화합물은 DNA:DNA, DNA:RNA 또는 RNA:RNA일 수 있고, 임의의 한 가닥은 DNA 및 RNA의 혼합물, 그리고 DNA 또는 RNA로 바로 분류할 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 핵산 화합물은 기본 골격(인터 뉴클레오티드 링키지를 포함한, 천연 핵산중 슈가-포스페이트 부분) 또는 염기 부분(천연 핵산의 퓨린 또는 피리미딘 부분)을 포함한 다양한 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 핵산 화합물은 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있고, 혈청, 세포 또는 화합물이 운반될 수 있는 위치, 가령, 경구로 운반된 화합물의 경우, 그리고 흡입된 화합물의 경우 폐에서 안전성과 같은 성질을 개선시키기 위하여 하나 이상의 변형을 흔히 포함할 수 있다. RNAi 구조체의 경우, 표적 전사체에 상보적인 가닥은 일반적으로 RNA 또는 이의 변형일 수 있다. 다른 가닥은 RNA, DNA 또는 임의의 기타 변형일 수 있다. 이중 가닥의 듀플렉스 부분 또는 단일 가닥의 “헤어핀”RNAi 구조체는 바람직하게는 18 내지 40개 길이의 뉴클레오티드를 가지고, Dicer 기질로 작용하는 한, 임의로 약 21개 내지 23개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 촉매성 또는 효소적 핵산은 리보자임 또는 DNA 효소일 수 있고, 또한 변형된 형태를 포함할 수 있다. 핵산 화합물은 생리학적 조건하에 그리고 넌센스 또는 센스 기준이 거의 효과를 가지지 않는 농도에서 세포와 접촉시켰을 때 약 50%, 75%, 90% 이상 표적의 발현을 억제시킬 수 있다. 핵산 화합물의 효과를 테스트하기 위한 바람직한 농도는 1, 5 및 10 마이크로몰이다. 예를 들면, 뼈 성장 및 광화작용에서 효과에 대해서도 핵산 화합물을 또한 테스트할 수 있다.
5. 스크리닝 분석
특정 측면에서, 본 발명은 BMP-ALK3 신호생성 경로의 항진제 또는 길항제인 화합물(물질)을 확인하기 위하여 ALK3 폴리펩티드 (가령, 가용성 ALK3 폴리펩티드) 및 BMP 폴리펩티드를 사용하는 용도에 관한 것이다. 이러한 스크리닝을 통하여 확인된 화합물들은 시험관에서 뼈 성장 또는 광화작용을 조절하는 화합물의 능력을 평가하기 위하여 테스트할 수 있다. 임의로, 이들 화합물들은 생체내에서 조직 성장을 조절하는 화합물의 능력을 평가하기 위하여 동물 모델에서 추가 테스트할 수 있다.
BMPs 및 ALK3 폴리펩티드를 표적으로 함으로써 조직 성장을 조절하는 치료제를 스크리닝하는 많은 방법들이 있다. 특정 구체예들에서, 화합물의 고처리량 스크리닝은 뼈에서 BMP 또는 ALK3 중재된 효과를 교란하는 물질을 확인하기 위하여 실행할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 분석은 BMPs에 ALK3 폴리펩티드의 결합을 특이적으로 억제 또는 감소시키는 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위하여 실행한다. 대안으로, BMPs에 ALK3 폴리펩티드의 결합을 강화시키는 화합물을 확인하기 위하여 이 분석을 이용할 수 있다. 추가 구체예에서, 화합물이 BMP 또는 ALK3 폴리펩티드와 상호작용하는 능력에 의해 화합물을 확인할 수 있다.
다양한 분석 포맷이 충족시킬 것이지만, 본 내용에 근거하여, 여기에서 명시적으로 설명되지 않은 분석들도 당업계에 숙련자에 의해 인지될 수 있을 것이다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 본 발명의 테스트 화합물(물질)은 임의의 복합적 화학 방법에 의해 만들어질 수 있다. 대안으로, 대상 화합물은 생체 또는 시험관에서 합성된 자연 발생적 생물분자일 수 있다. 조직 성장의 조절자로 작용하는 화합물(물질)의 능력에 대해 테스트를 받는 화합물(물질)은 예를 들면, 세균, 효모, 식물 또는 기타 유기체에 의해 만들어지거나(가령, 천연 산물), 화학적으로 생산된(가령, 펩티드모방체를 포함하는 소분자들), 또는 재조합으로 생산될 수 있다. 본 발명에서 테스트 화합물은 비-펩티드 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 슈가, 호르몬, 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 테스트 물질은 약 2,000 daltons 미만의 분자량을 가진 작은 유기 분자다.
본 발명의 테스트 화합물은 단일, 분리된 엔터티로 제공되거나 또는 복합 화학에 의해 만들어진 더 복잡한 라이브러리로 제공될 수 있다. 이러한 라이브러리들은 예를 들면, 알코올, 알킬 할로겐화물, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 테스트 시스템에 테스트 화합물은 단리된 형태 또는 화합물의 혼합물의 형태로 특히 초기 스크리닝 단계로 제공될 수 있다. 화합물은 다른 화합물로 임의로 유도화될 수 있으며, 이 화합물의 분리를 용이하게 하기 위한 유도화 기를 가질 수 있다. 유도화기의 비-제한적 기는 바이오틴, 플루오레신, 디옥시게닌, 그린 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타티온 S 전이효소 (GST), 광활성가능한 교차링커 또는 이의 임의의 복합물을 포함한다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 테스트하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간내에 조사할 화합물의 수를 최대화하기 위하여 고처리량(high throughput) 분석들이 바람직할 수 있다. 무-세포 시스템, 가령, 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 무-세포 시스템에서 실행되는 분석들은 테스트 화합물에 의해 중재된 분자 표적에서의 변화의 신속한 전개(rapid development) 및 상대적으로 용이한 탐지를 허용하기 위하여 만들어 질 수 있는 “1차” 스크린으로 흔히 바람직하다. 더욱이, 테스트 화합물의 세포 독성 또는 생체이용성의 효과는 시험관 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있고, 대신, 이 분석은 ALK3 폴리펩티드 및 BMPs 사이의 결합 친화력의 변화가 명백히 나타날 수 있기 때문에 표적 분자에서 약물의 효과에 주로 집중한다.
단순히 설명하기 위하여, 본 발명의 예시적인 스크리닝 분석에서, 관심 화합물은 BMPs에 일반적으로 결합할 수 있는 단리된 그리고 정제된 ALK3 폴리펩티드와 접촉한다. 그 다음 화합물 및 ALK3 폴리펩티드의 혼합물에 ALK3 리간드를 포함하는 조성물을 첨가한다. ALK3/BMP 복합체의 탐지 및 정량화는 ALK3 폴리펩티드 및BMPs 사이에 복합체 형성을 억제(또는 강화)함에 있어서 화합물의 효과를 판단하기 위한 평균을 제공한다. 화합물의 효과는 테스트 화합물의 다양한 농도를 이용하여 수득한 데이터로부터 약량 반응 곡선을 만들어서 평가할 수 있다. 더욱이, 대조군 분석은 조성물에 대한 기준을 제공하기 위하여 또한 실행할 수 있다. 예를 들면, 대조군 분석에서, 단리된 그리고 정제된 BMP를 ALK3 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 추가하고, ALK3/BMP 복합체의 형성은 테스트 화합물 없이 정량화한다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 가변적일 수 있고, 동시에 혼합될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 정제된 단백질을 대신하여, 세포의 추출물 및 용해물을 이용하여 적합한 무-세포 분석 시스템을 제공할 수 있다.
ALK3 폴리펩티드 및 BMPs 사이에 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 탐지할 수 있다. 예를 들면, 복합체 형성의 조절은 면역 분석 또는 크로마토그래피 탐지에 의해 예를 들면, 탐지가능한 라벨된 단백질 가령 방사능라벨된 (가령, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광 라벨된 (가령, FITC), 또는 효소적으로 라벨된 ALK3 폴리펩티드 또는 BMPs를 이용하여 정량화할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 ALK3 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 상호작용 수준을 직접 또는 간접적으로 측정함에 있어서 형광 편광 분석물과 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석의 사용을 고려한다. 더욱이, 다른 양식의 탐지, 가령, 광도 파로(PCT Publication WO 96/26432 및 U.S. Pat. No. 5,677,196), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 표면 하전 센서, 그리고 표면 포스 센스와 같은 것들은 본 발명의 많은 구체예에 허용된다.
더욱이, 본 발명은 ALK3 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 상호작용을 파괴 또는 강화시키는 물질을 확인하기 위하여“2개 하이브리드 분석”이라고도 알려진 상호작용 트랩 분석의 사용을 고려한다, 예를 들면, U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696)을 참고한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 ALK3 폴리펩티드 및 이의 결합 단백질 사이에 상호작용을 끊어놓는 화합물(가령, 소분자들 또는 펩티드)를 확인하기 위한 역 두 개 하이브리드(reverse two hybrid) 시스템의 사용을 고려한다. 예를 들면, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 및 U.S. Pat. Nos. 5,525,490; 5,955,280; 및 5,965,368을 참고.
특정 구체예들에서, 대상 화합물들은 본 발명의 ALK3 또는 BMP 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물의 능력으로 확인된다. 화합물과 ALK3 또는 BMP 폴리펩티드 사이의 상호작용은 공유 또는 비-공유적일 수 있다. 예를 들면, 이러한 상호작용은 광-교차결합, 방사능라벨된 리간드 결합, 및 친화력 크로마토그래피를 포함하는 시험관 생물화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 확인할 수 있다(Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). 특정 경우들에서, 화합물들은 BMP 또는 ALK3 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 탐지하기 위한 분석에 근거한 기전에서 스크리닝할 수 있다. 이는 고체 상 또는 유체 상 결합 과정을 포함할 수 있다. 대안으로, BMP 또는 ALK3 폴리펩티드를 인코드하는 유전자는 리포터 시스템 (가령, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 또는 그린 형광 단백질)과 함께 세포내에 형질감염시키고, 그리고 바람직하게는 고처리량 스크리닝으로 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있고, 또는 라이브러리의 개별 구성요소로 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 자유 에너지에서 변화를 탐지하는 결합 분석과 같은 결합 분석들에 근거한 다른 기전들을 이용할 수 있다. 결합 분석들은 웰, 비드 또는 칩에 고정된 표적 또는 고정된 항체에 의해 포획된 또는 모세관 전기영동에 의해 분해된 표적으로 실행할 수 있다. 결합된 화합물은 비색(colorimetric) 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 통상적으로 탐지할 수 있다.
특정 측면에서,본 발명은 뼈 형성을 조절(자극 또는 억제)하는 그리고 골량을 증가시키는 방법 및 물질을 제공한다. 따라서, 확인된 임의의 화합물은 시험관 또는 생체에서 전체 세포 또는 조직에서 테스트하여 뼈 성장 또는 광화작용을 조절하는 화합물의 능력을 확인할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이 목적에 이용할 수 있다.
예를 들면, 뼈 또는 연골 성장에서 ALK3 또는 BMP 폴리펩티드 또는 테스트 화합물의 효과는 세포 기준 분석들에서 Msx2의 유도 또는 골조상세포의 골아세포로의 분화를 측정함으로써 결정할 수 있다(가령, Daluiski et al., Nat Genet. 2001, 27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9 참고). 세포-기반 분석들의 또다른 예는 간엽(mesenchymal) 선조세포 및 골아세포에서 대상 ALK3 또는 BMP 폴리펩티드 및 테스트 화합물의 골형성 활성을 분석하는 것을 포함한다. 설명을 위하여, 전능(pluripotent) 간엽 선조세포 C3H10T1/2 세포, 전골아세포성 C2C12 세포, 및 골아세포성 TE-85 세포를 감염시키기 위하여 BMP 또는 ALK3 폴리펩티드를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 작제할 수 있다. 그 다음 골형성 활성은 알칼리 포스파타제, 오스테오칼신, 및 매트릭스 광화작용의 유도를 측정함으로써 결정한다(가령, Cheng et al., J Bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8):1544-52 참고).
본 발명은 뼈 또는 연골 성장을 측정하기 위한 생체내 분석도 고려한다. 예를 들면, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001)은 골절 연구 후 초기 동안 뼈가 복구되는 쥐 골다공증 모델을 설명한다. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999)는 또한 골절을 연구한 후 늦은 기간 동안 뼈가 복구되는 쥐 골다공증 모델을 설명한다. Andersson et al., J. Endocrinol. 170:529-537는 마우스의 난소를 제거하여 지주골의 뼈 미네랄 밀도의 약 50%를 상실하고, 실질적인 뼈 미네랄 함량 및 뼈 미네랄 밀도를 감소시킨 마우스 골 다공증 모델을 설명한다. 가령, 부갑상선 호르몬과 같은 인자의 투여에 의해 난소가 제거된 마우스에서 골밀도를 증가시킬 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 당업계에 공지되어 있는 골절 치유 분석들을 이용한다. 이러한 분석들은 골절 기술, 조직 분석 및 생물기계적 분석을 포함하는데, 이들은 예를 들면, U.S. Pat. No. 6,521,750에서 설명하고 있으며, 골절의 원인 및 정도를 측정하는 실험 프로토콜과 이의 복구 과정을 설명하는 전문이 참고문헌에 통합된다.
6. 예시적인 치료 용도
특정 구체예들에서, 본 발명의 BMP-ALK3 길항제 (가령, ALK3 폴리펩티드)는 파손, 상실 또는 탈광화작용을 통하여 뼈 손실과 관련된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 이용할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 BMP-ALK3 길항제, 특히 ALK3 폴리펩티드의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여함으로써, 개체에서 뼈 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 뼈 재흡수 및 형성의 이중 효과에 대한 잠재력이 주어진다면, 이러한 화합물들은 동화성(가령, 부갑상선 호르몬 및 이의 유도체들) 또는 항-재흡수제(가령, 비스포스포네이트)로 현재 치료하는 광범위한 범위의 질환에 유용할 것이다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 BMP-ALK3 길항제, 특히 ALK3 폴리펩티드의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여함으로써, 개체에서 뼈 성장 또는 광화작용을 촉진시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 동물, 그리고 더욱 바람직하게는, 인간의 치료 및 예방을 목적으로 한다. 특정 구체예들에서, 본 내용은 낮은 골밀도 또는 감소된 골강도와 연관된 질환 치료를 위하여 BMP-ALK3 길항제 (특히 가용성 ALK3 폴리펩티드 및 BMPs 또는 ALK3를 표적으로 하는 중화 항체)의 용도를 제공한다.
여기에서 이용된 것과 같이, 질환 또는 이상을 “예방하는(prevent)”치료제는 통계적 시료에서 처리안된 대조군 시료와 비교하여 처리된 시료에서 질병 또는 이상의 발생을 감소시키거나, 또는 처리안된 대조군 시료와 비교하여 하나 이상의 질병 또는 이상의 증상의 심각성을 지연 또는 감소시키는 화합물을 지칭한다. “치료(treating)”는 언급된 이상의 예방 또는 일단 정착된 이상의 개선 또는 제거를 포함한다. 어떤 경우이건, 예방 또는 치료는 의사가 제공하는 진단 및 치료제의 투여로 인한 의도된 결과에 의해 구별할 수 있다.
본 내용은 뼈 및/또는 연골 형성을 유도하는 방법, 골 상실을 예방하는 방법, 뼈 광화작용을 증가시키는 방법 또는 뼈의 탈광화작용을 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 대상 BMP-ALK3 길항제는 인간 및 다른 동물들의 골 상실 질환, 가령, 골다공증의 치료 및 뼈 골절의 치유 그리고 연골 결함 또는 기타 뼈 결함, 손상 및 질환의 치료에 용도를 가진다. ALK3 또는 BMP 폴리펩티드는 준임상적 낮은 골밀도로 진단을 받은 환자에게서 골다공증 발생에 대한 보호 수단으로서 유용할 수 있다.
한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 인간 및 기타 동물의 뼈 골절 및 연골 결함의 치유에 의학적으로 유용성을 발견할 것이다. 대상 방법 및 조성물들은 폐쇄 및 개방 골절 감소 및 인공 관절의 개선된 고정에 예방적 용도를 또한 가질 수 있다. 골형성 물질에 의해 유도된 새로운 뼈 형성은 선천적, 외상에 의해 유도된 또는 종양 절단에 의해 유도된 두개안면(craniofacial) 결함의 복구에 기여하고, 그리고 또한 미용 성형 수술에 유용하다. 특정 경우들에서, 대상 BMP-ALK3 길항제는 뼈-형성 세포를 유인하고, 뼈-형성 세포의 성장을 촉진시키고 또는 뼈-형성 세포의 선조세포의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 본 발명의 BMP-ALK3 길항제는 또한 골다공증의 치료에 유용할 수 있다.
Rosen et al. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral 대사, 7th ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C. (incorporated herein by reference)은 ALK3-BMP 길항제로 치료를 받게될 수 있는 골 질환의 광범위한 논의를 제공한다. 일부 목록을 여기에서 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물을 본 발명은 골 상실에 의한 또는 골 상실을 야기하는 이상, 가령, 골다공증 (2차 골다공증 포함), 부갑상선기능항진증, 만성 신장 질환 미네랄 골 질환, 성 호르몬 빈곤 또는 제거 (가령 안드로겐 및/또는 에스트로겐), 글루코코르티코이드 치료, 류마티스 관절염, 중증 화상, 부갑상선기능항진증, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 저인산혈증, 골연화증 (종양-유도된 골연화증 포함), 고인산혈증, 비타민 D 결핍, 부갑상선기능항진증 (가족성 부갑상선기능항진증 포함) 및 허위부갑상선항진증, 뼈로 전이된 종양, 종양 또는 화학 요법의 결과로 골 상실, 뼈 및 골수 종량(가령, 다발성 골수종), 허혈성 골 질환, 치주 질환 및 경구 골 상실, Cushing 질환, Paget 질환, 그레이브즈병(thyrotoxicosis), 만성 설사 상태 또는 흡수불량, 신세뇨관 산증, 또는 거식증을 특징으로 하는 또는 이를 야기하는 이상에 적용할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 비유합성 골절, 치료가 느린 골절, 태아 및 신생아 뼈 형성장애 (가령, 저칼슘혈증, 고칼슘혈증, 칼슘 수용체 결함 및 비타민 D 결핍), 뼈 괴사 (턱 뼈 괴사 포함) 및 불완전골생성증을 포함한, 뼈 형성 또는 치유를 실패한 것을 특징으로 하는 이상에 사용할 수 있다. 추가로, 동화성 효과는 이러한 길항제가 뼈 손상 또는 부식과 관련된 뼈 통증을 감소시키게 할 것이다. 항-재흡수성 효과의 결과로서, 이러한 길항제는 비정상적인 뼈 형성 질환, 가령 골아세포성 종양 전이 (가령, 원반성 전립선 또는 유방암과 연관된), 골형성 골육종, 골화석증, 진행골간형성이상, 뼈표면 골비대증, 골반문증, 및 유선상 과골증의 치료에 유용할 것이다. 치료할 수 있는 기타 질환은 섬유성 형성장애 및 연골형성장애를 포함한다.
상기 논의에 추가하여, 다음의 임의의 프로파일을 가진 사람은 ALK3 길항제를 이용한 치료에 후보자가 될 수 있다: 폐경기 여성 및 에스트로겐 또는 기타 호르몬 대체 요법을 받지 않는 자; 엉덩이 골절 또는 흡연을 한 개인적 또는 모계 경력을 가진 자; 키가 크고(5 feet 7 inches 이상(170㎝)) 또는 마른(125 파운드(56㎏) 미만)의 폐경기 여성; 골 상실과 관련된 임상적 이상을 가진 남성; 코르티코스테로이드 가령, 프레드니손™을 포함하는 골 상실의 원인으로 알려진 약물, 가령 Dilantin™ 및 특정 바르비투르산염과 같은 다양한 항-발작제 약물, 또는 고약량의 갑상선 대체 약물을 복용한 자; 타입 1 당뇨병, 간질환, 신장질환, 골다공증의 가족력을 가진 자; 높은 뼈 회전율(turnover)(가령, 소변 시료에서 과도한 콜라겐)을 가진 자; 갑상선 이상, 가령 갑상선항진증을 가진 자; 약한 외상후에도 골절을 경험한 자; 척추 골절 또는 기타 골다공증 징후가 x-선 사진에 나타난 자.
골다공증 (일반적으로 말하자면, 낮은 골밀도 또는 낮은 강도의 상태를 의미하는)은 다양한 인자들에 의한 또는 이러한 인자들과 관련될 수 있다. 여성, 특히 체중이 적게 나가고 주로 앉아서 일을 하는 폐경기 여성은 골다공증에 대한 모든 위험 인자 (뼈 미네랄 밀도의 손실로 골절 위험으로 이어지는).
골다공증은 또다른 질병과 연관된 또는 특정 약물의 사용으로 인한 결과일 수도 있다. 약물 또는 또다른 의학 이상으로 인한 골다공증은 2차 골다공증이라고 한다. Cushing 질환으로 알려진 이상에서, 체내에서 생산된 과도한 양의 코르티솔은 골다공증 및 골절을 야기한다. 2차 골다공증과 연관된 가장 흔한 약물은 부신에 의해 자연적으로 생산되는 호르몬인 코르티솔과 유사한 작용을 하는 약물 종료인 코르티코스테로이드이다. 골격 발달에 적정 수준의 갑상선 호르몬(갑상선샘에서 생산되는)이 필요하지만, 과도한 갑상선 호르몬은 시간을 두고 골량을 감소시킬 수 있다. 알루미늄을 포함하는 제산제는 신장에 문제가 있는 사람들, 특히 투석을 하는 사람들이 고약량을 섭취하였을 때 골 상실을 유도할 수 있다. 2차 골다공증을 야기할 수 있는 기타 약물은 발작을 예방하는데 사용되는 페니토인 (Dilantin) 및바르비투르산염; 메토트렉세이트 (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), 일부 형태의 관절염, 암 및 면역 질환에 대한 약물; 사이클로스포린 (Sandimmune, Neoral), 자가면역 질환을 치료하고, 장기 이식 환자에서 면역 시스템을 억제하는데 이용되는 약물; 전립선 암 및 자궁내막염의 치료에 이용되는 황체형성 호르몬-방출 호르몬 항진제(Lupron, Zoladex); 헤파린 (Calciparine, Liquaemin), 응고방지 약물; 그리고 고콜레스테롤 치료에 이용된 콜레스티라민 (Questran) 및 콜레스티폴 (Colestid)을 포함한다. 암 요법으로 인한 골 상실은 광범위하게 인지되고 있고, 암 요법에 의해 유도된 골 상실 (CTIBL)이라고 명한다. 뼈 전이는 뼈에 구멍을 만들 수 있고, BMP-ALK3 길항제를 이용한 치료에 의해 교정될 수 있다.
임의로, BMP-ALK3 길항제, 특히 여기에서 공개된 가용성 ALK3은 암 환자에 이용할 수 있다. 특정 종양 (가령, 전립선, 유방, 다발성 골수종 또는 부갑상선기능항진증을 야기하는 임의의 종양)을 가진 환자들은 종양에 의해 유도된 골 상실 뿐만 아니라 뼈 전이 및 치료제로 인한 골상실로 인하여 골 상실의 위험에 있다. 이러한 환자들은 골 상실 또는 뼈 전이의 증거 없이도 BMP-ALK3 길항제로 치료를 할 수 있다. 골 상실 또는 뼈 전이 증거에 대해 환자들을 또한 모니터하고, 위험이 증가되었다고 지표가 제안하는 경우 BMP-ALK3 길항제로 치료할 수 있다. 일반적으로, DEXA 스캔을 이용하여 골밀도의 변화를 평가하고, 뼈 재구성의 지표를 이용하여 뼈 전이 가능성을 평가할 수 있다. 혈청 표식을 모니터할 수 있다. 뼈 특이적 알칼리 포스파타제 (BSAP)는 골아세포에 존재하는 효소다. BSAP의 혈액 수준은 뼈 전이 및 뼈 재구성을 증가시키는 기타 이상을 가진 환자에서 증가한다. 오스테오칼신 및 프로콜라겐 펩티드는 또한 뼈 형성 및 뼈 전이와 또한 관련있다. 전립선암으로 인한 뼈전이 환자에게서 BSAP가 증가되었음이 탐지되었고, 다소 정도는 약하지만 유방암으로부터 뼈 전이된 환자에서도 BSAP가 증가되었음이 탐지되었다. 뼈 형성 단백질-7 (BMP-7) 수준은 뼈로 전이된 전립선 암에서 높지만, 방광, 피부, 간 또는 폐암으로 인한 뼈 전이에서는 높지 않다. 타입 I 카르복시-말단 텔로펩티드 (ICTP)는 뼈의 재흡수 동안 형성된 콜라겐에서 발견되는 교차링크(crosslink)다. 뼈는 끊임없이 분해되고, 재형성되기 때문에, ICTP는 신체 어느 부위에서도 발견할 수 있다. 그러나, 뼈 전이 부위는 정상 뼈 부위보다 더 높은 수준일 것이다. ICTP는 전립선, 폐 및 유방암으로 인한 뼈 전이에서 높은 수준임을 발견하였다. 또다른 콜라겐 교차링크, 타입 I N-말단 텔로펩티드 (NTx)는 뼈 회전(turnover) 동안 ICTP와 함께 생성된다. NTx의 양은 폐암, 전립선암, 및 유방암을 포함하는 상이한 많은 유형으로 인한 뼈 전이에서 증가된다. 또한, NTx 수준은 뼈 전이의 진행과 함께 증가한다. 따라서, 이러한 표식을 이용하여 전이를 탐지하고 질환의 정도를 측정할 수 있다. 재흡수의 다른 표식은 피리디노린(pyridinoline) 및 데옥시피리디노린을 포함한다. 재흡수 표식 또는 뼈 전이 표식에서 임의의 증가는 환자에서 BMP-ALK3 길항제 요법이 필요하다는 것을 나타낸다.
또다른 구체예에서, BMP-ALK3 길항제는 만성 신장 질환 미네랄 골 질환 (CKD-MBD), 서로 관련된 골격의 광범위한 증후군, 심혈관, 및 신장질환으로 발생된 미네랄-대사 질환을 가진 환자에 이용할 수 있다. CKD-MBD는 BMP-ALK3 길항제로 치료하는 바람직한 구체예가 되는 신성골이영양증 (ROD)이라고 불리는 다양한 골근 질환을 포함한다. 상이한 병인적 인자의 상대적인 기여도에 따라, ROD는 뼈 재구성의 다양한 병인 패턴으로 나타난다(Hruska et al., 2008, 만성 신장 질환 미네랄 골 질환 (CKD-MBD); in Rosen et al. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral 대사, 7th ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C., pp 343-349). 스펙트럼의 한 단부는 소수의 활성 재구성 부위, 심각하게 억제된 뼈 형성, 및 낮은 뼈 재흡수를 특징으로 하는, 낮은 뼈 회전율과 혈뇨성 골이영양증을 가진 ROD이다. 다른 단부는 부갑상선기능항진증, 높은 뼈 회전율, 및 골염(osteitis fibrosa)을 가진 ROD이다. BMP-ALK3 길항제는 동화성 및 항재흡수성 효과를 나타낸다면, 이러한 물질은 ROD 병리 스펙트럼에 걸쳐있는 환자들에게 유용할 것이다.
BMP-ALK3 길항제는 다른 약제학적 물질과 공동으로 투여할 수 있다. 공동 투여는 단일 공동-제형, 동시 투여 또는 분리된 시간에 투여에 의해 이루어질 수 있다. BMP-ALK3 길항제는 다른 뼈-활성 물질과 투여한다면 특히 유익할 수 있다. 환자는 BMP-ALK3 길항제와 칼슘 보충제, 비타민 D, 적절한 운동 및/또는, 일부 경우 다른 약물을 함께 제공받음으로써 이익을 얻을 수 있다. 기타 약물의 예는 비스포스포네이트 (알렌드로네이트, 이반드로네이트 및 리세드로네이트), 칼시토닌, 에스트로겐s, 부갑상선 호르몬 및 랄옥시펜을 포함한다. 비스포스포네이트 (알렌드로네이트, 이반드로네이트 및 리세드로네이트), 칼시토닌, 에스트로겐 및 랄옥시펜은 뼈 재구성 주기에 영향을 주고, 그리고 항-재흡수성 약물로 분류된다. 뼈 재구성은 두 가지 별개 단계로 구성된다: 뼈 재흡수 및 뼈 형성. 항-재흡수성 약제는 뼈-재구성 주기의 뼈 재흡수 부분을 지연 또는 중단시키지만, 주기의 뼈 형성 부분을 지연시키지는 않는다. 그 결과, 새로운 형성은 뼈 재흡수보다 더 빠른 속도로 지속되고, 그리고 골밀도는 시간이 경과함에 따라 증가할 수 있다. 부갑상선 호르몬 형태인 테리파라티드는 뼈 재구성 주기에서 뼈 형성 속도를 증가시킨다. 알렌드로네이트(Alendronate)는 폐경후 골다공증의 예방(1주에 1회 일일 5 ㎎ 또는 35 ㎎) 및 치료 (1주일에 1회, 일일 10 ㎎ 또는 70 ㎎)용으로 승인을 받았다. 알렌드로네이트는 골 상실을 감소시키고, 골밀도를 증가시키고, 척추, 손목, 엉덩이 골절 위험을 감소시킨다. 알렌드로네이트는 글루코코르티코이드 약제(가령, 프레드니손 및 코르티손)의 장기 사용 결과로 남녀에서 글루코코르티코이드 유도된 골다공증의 치료 및 남성의 골다공증 치료에 승인받았다. 알렌드로네이트와 비타민 D는 폐경기 여성에서 골다공증의 치료(일주일에 1회 70 ㎎+ 비타민 D)와 골다공증을 가진 남성에서 골량을 개선시키기 위한 치료에 승인을 받았다. 이반드로네이트(Ibandronate)는 폐경후 골다공증의 예방 및 치료용으로 승인되었다. 한 달에 한 알(150 ㎎)을 복용할 경우, 이반드로네이트는 매월 동일한 날짜에 복용해야만 한다. 이반드로네이트는 골 상실을 감소시키고, 골밀도를 증가시키고, 척추 골절 위험을 감소시킨다. 리센드로네이트(Risedronate)는 폐경후 골다공증의 예방 및 치료용으로 승인되었다. 매일(5 ㎎ 1회분 투여량) 또는 매주(35 ㎎ 1회분 투여량 또는 35 ㎎ 1회분 투여량+ 칼슘)을 복용한다면, 리센드로네이트는 골 상실을 지연시키고, 골밀도를 증가시키고 그리고 척추 및 비-척추 골절 위험을 감소시킨다. 리센드로네이트는 또한 글루코코르티코이드 약제 (가령, 프레드니손 또는 코르티손)의 장기 복용으로 인한 글루코코르티코이드-유도된 골다공증의 예방 및/또는 치료용으로 남녀에 사용 승인받았다. 칼시토닌은 칼슘 조절 및 뼈 대사에 관련된 자연 발생 호르몬이다. 5년 이상 생리가 중단된 여성의 경우, 칼시토닌은 골 상실을 지연시키고, 척추 골밀도를 증가시키고, 그리고 뼈 골절과 관련된 통증을 완화시킬 수 있다. 칼시토닌은 척추 골절 위험을 감소시킨다. 칼시토닌은 주사(일일 50-100 IU) 또는 비강 스프레이(일일 200 IU)로 이용가능하다. 에스트로겐 요법 (ET)/호르몬 요법 (HT)은 골다공증 예방에 승인을 받았다. ET는 척추 및 엉덩이 모두에서 골 상실을 감소시키고, 골밀도를 증가시키고, 그리고 폐경 여성의 엉덩이 및 척추 골절 위험을 감소시킨다. ET는 낮은 1회분 투여량인 대략 0.3 ㎎의 일일 투여량 또는 일일 대략 0.625 ㎎의 표준 1회분 투여량을 제공하는 알약 또는 피부 패취의 형태로 흔히 대부분 투여되며, 70세 이후에도 효과가 있다. 에스트로겐만을 복용할 경우, 자궁 내면의 암 발생(자궁내막암) 위험을 증가시킬 수 있다. 이러한 위험을 감소시키기 위하여, 의료 제공자는 자궁이 온전한 여성들에게 호르몬 프로게스틴을 에스트로겐 (호르몬 대체 요법 또는 HT)과 복합하여 처방한다. ET/HT는 폐경 증후를 완화시키고, 뼈 건강에 유익한 영향을 주는 것으로 나타났다. 부작용은 질 출혈, 유방 유연함, 변덕 및 담당 질환을 포함할 수 있다. 일일 60㎎의 랄옥시펜(Raloxifene)은 폐경 골다공증의 예방 및 치료로 승인되었다. 랄옥시펜은 잠재적 단점없이 에스트로겐의 유익한 효과를 제공하기 위해 개발된 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERMs)로 불리는 약물 부류다. 랄옥시펜은 골량을 증가시키고 척추 골절 위험을 감소시킨다. 랄옥시펜이 엉덩이 및 다른 비-척추 골절의 위험을 감소시킬 수 있다고 설명할 만한 데이터는 없다. 부갑상선 호르몬 형태인 테리파라티드(Teriparatide)는 폐경 여성의 골다공증 및 골절 위험이 있는 남성의 골다공증 치료에 승인되었다. 이 약물은 새로운 뼈 형성을 자극하고 그리고 뼈 미네랄 밀도를 상당히 증가시킨다. 폐경 여성의 척추, 엉덩이, 발, 늑골 및 손목에서 골절 감소가 기록되었다. 남성의 경우, 척추의 골절 감소가 기록되었지만, 다른 부위에서 골절 감소를 평가할 충분한 데이터가 없었다. 테리파라티드는 최대 24시간 동안 매일 주사에 의해 자가-투여한다.
7. 약제학적 조성물
특정 구체예들에서, 본 발명의 BMP-ALK3 길항제 (가령, ALK3 폴리펩티드)는 약제학적으로 수용되는 운반체와 함께 조제한다. 예를 들면, ALK3 폴리펩티드는 단독으로 투여할 수 있거나 또는 약제학적 조제물(치료 조성물)의 성분으로 투여할 수 있다. 대상 화합물은 인간 또는 동물 약물에 이용하기 위한 임의의 통상적인 방식으로 투여하도록 조제될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 치료 방법은 조성물을 전신으로 투여하거나 또는 이식물 또는 장치에 의해 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여하였을 때, 본 발명에 이용되는 치료 조성물은 물론 발열물질-없는, 생리학적으로 수용되는 형태다. 상기에서 설명한 것과 같이, 조성물에 임의로 또한 포함시킬 수 있는 ALK3 길항제 이외의 치료상 유용한 물질은 본 발명의 방법에서 대상 화합물(가령, ALK3 폴리펩티드)과 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다.
전형적으로, ALK3 길항제는 장관외로 투여할 것이다. 장관외 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 ALK3 폴리펩티드와 하나 이상의 약제학적으로 수용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유상액, 또는 사용직전 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성시킬 수 있는 멸균 분말을 포함할 수 있고, 항산화제, 완충액, 세균발육억제제, 예정 수용자의 혈액과 제형이 등장성이 되도록 만드는 용질, 또는 현탁 또는 농후제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있는 예시적인 적합한 수성 및 비수성 운반체는 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 이와 유사한 것들), 및 이의 적합한 혼합물들, 식물성 오일, 가령, 올리브 오일, 그리고주사용 유기 에스테르, 가령, 에틸 올레이트를 포함한다. 예를 들면, 가령 레시틴과 같은 피복 물질을 이용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다.
더욱이, 조성물은 표적 조직 부위 (가령, 뼈)로 전달하기 위하여 포집 또는 주사될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 조성물은 표적 조직 부위 (가령, 뼈)에 하나 이상의 치료 화합물(가령 ALK3 폴리펩티드)을 운반할 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있는데, 매트릭스는 조직을 발달시키고, 신체로 재흡수될 수 있는 키구조를 제공한다. 예를 들면, 매트릭스는 ALK3 폴리펩티드의 지연 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 기타 이식된 의료 용도에 현재 사용하는 물질의 형태일 수 있다.
매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생체분해성, 기계적 성질, 미용적 외양 및 접촉(interface) 성질에 근거한다. 해당 조성물의 특정 용도는 적절한 제형을 한정시킬 것이다. 조성물용 잠재적 매트릭스는 생분해가능하고, 화학적으로 정의된 황산 칼슘염, 삼인산칼슘염, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드리드이다. 기타 잠재적 물질은 생분해가능한 그리고 생물학적으로 잘 정의된 가령 뼈 또는 피부 콜라겐이다. 추가 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분들을 포함한다. 기타 잠재적 매트릭스는 생분해불가능한, 그리고 화학적으로 한정된, 가령 소결 하이드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루민산염, 또는 기타 세라믹이다. 매트릭스는 상기 언급된 유형의 임의의 물질의 조합물을 포함할 수 있는데, 가령 폴리락트산 및 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 삼인산칼슘염을 포함할 수 있다. 바이오세라믹은 가령 칼슘-알루민산염-인산염의 조성물로 변경될 수 있고, 포어 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성을 변경시키도록 처리될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 가령, 캡슐, 교갑, 알약, 정제, 마름모꼴 알약(향이 나는 베이스, 통상 슈크로즈 및 아카시아 또는 트라가탄을 이용), 분말, 과립형태의 또는 수성 또는 비-수성 액체의 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 유상액, 또는 엘륵시르 또는 시럽 또는 향이 든 정제(가령 잴러탄 및 글리세린 또는 슈크로즈 및 아카시아와 같은 비활성 베이스를 이용), 및/또는 구강 세척제 및 이와 유사한 형태로 경구로 투여할 수 있으며, 각각은 활성 성분으로 에정된 양을 포함한다. 물질은 큰 환약(bolus), 연약(electuary) 또는 페스트(paste)로 투여할 수도 있다.
경구 투여 (캡슐, 정제, 알약, 당과, 분말, 과립 및 이와 유사한 것)용 고형 투약형의 경우, 본 발명의 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 수용되는 운반체, 가령 구연산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 다음중 임의의 것과 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 가령 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 가령, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오즈, 알긴산, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로즈, 및/또는 아카시아; (3) 흡습제, 가령 글리세롤; (4) 붕해제, 가령 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨; (5) 용액 지체제, 가령 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 가령 4가 암모니움 화합물; (7) 습윤제, 가령, 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 가령 카올린 및 벤토나이트 클레이; (9) 윤활제, 가령, 활석, 스테아레이트 칼슘, 스테아레이트 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 설페이트 나트륨, 및 이의 혼합물; 그리고 (10) 발색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물은 락토즈 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것을 부형제를 이용하여 연질 및 경질 충진된 젤라틴 캡슐의 충전제로 이용할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투약형은 약제학적으로 수용되는 유상액, 미소유상액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘륵시르를 포함한다. 활성 성분에 추가로, 액상 투약형은 당업계 통상적으로 이용되는 비활성 희석제, 가령, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 가령, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조네이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배, 올리브, 카스터 및 참깨유), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 비활성 희석제에 추가하여, 경구 조성물은 어쥬번트, 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 풍미, 향료, 발색제, 및 보존제를 포함할 수 있다.
활성 화합물에 추가하여, 현탁액은 현탁제 가령, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미소결정 셀룰로오즈, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가탄 그리고 이의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 어쥬번트, 가령, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라젠, 클로로부탄올, 페놀 소르브산, 및 이와 유사한 것을 포함시켜 미생물 작용 억제를 담보할 수 있다. 등장 물질, 가령, 슈가, 염화나트륨, 및 이와 유사한 것을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제형의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 가령 모노스테아레이트 알루미늄 및 젤라틴을 포함시켜 야기시킬 수 있다.
투약 섭생은 본 발명의 대상 화합물(가령, ALK3 폴리펩티드)의 작용을 변형시키는 다양한 인자들을 고려하여 담당 의사가 결정할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 다양한 인자는 형성되는 바람직한 뼈의 양, 상실된 골밀도 수준, 뼈 손상 부위, 손상된 뼈의 상태, 환자의 나이, 성별 및 식이, 골 상실에 기여할 수 있는 임의 질환의 중증도, 투여 시간 및, 기타 임상적 인자들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 임의로, 투약은 재구성에 이용된 매트릭스 유형 및 조성물내 화합물의 유형에 따라 달라질 것이다. 최종 조성물에 기타 공지의 성장 인자를 추가하면 투약에 영향을 줄 수 있다. 진행은 뼈 성장 및/또는 복구의 주기적 평가, 예를 들면, X-rays (DEXA 포함), 조직형태학적 판단 및 테트라사이클린 라벨링에 의해 모니터할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 ALK3 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 또한 제공한다. 이러한 요법은 상기 언급한 질환을 가진 세포 또는 조직으로 ALK3 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시킴으로써 이의 치료 효과를 달성할 수 있다. ALK3 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 재조합 발현 벡터 가령, 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다. ALK3 폴리뉴클레오티드 서열의 치료요법적 전달에 바람직한 것은 표적화된 리포좀의 이용이다.
여기에서 교시하는 것과 같이, 유전자 요법으로 이용할 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아, 또는, 바람직하게는, RNA 바이러스 가령, 레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도물이다. 단일 외부 유효량를 삽입할 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), Harvey 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 및 라우스 육종 바이러스 (RSV)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적인 많은 레트로바이러스 벡터는 다중 유전자를 통합할 수 있다. 이들 모든 벡터는 선택가능한 표식에 대한 유전자를 운반 또는 통합할 수 있어, 형질전환된 세포를 확인 및 생성할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들면, 슈가, 당지질 또는 단백질을 부착함으로써 표적-특이적으로 만들 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용하여 실시한다. 당업자는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 레트로바이러스 게놈으로 삽입하거나 바이러스 외피에 부착시켜, ALK3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 허용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 뼈 또는 연골을 표적으로 한다.
대안으로, 조직 배양 세포에 전형적인 인산칼슘염 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조적 유전자 gag, pol 및 env를 인코드하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염시킬 수 있다. 그 다음 이들 세포들은 관심 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 생성 세포는 배양 배지로 레트로바이러스 벡터를 방출한다.
ALK3 폴리뉴클레오티드의 또다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드성 분산 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 수중유 유상액, 혼합된 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관 및 생체에서 전달 비이클로 유용한 인공 막 소포다. RNA, DNA 및 고유 비리온은 수성 내부안에 포집되어, 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(가령, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981 참고). 리포좀 비이클을 이용하여 효과적으로 유전자를 전달하는 당법은 당업계에 공지되어 있고, 가령, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988을 참고한다. 리포좀 조성물은 인지질과 통상적으로 스테로이드, 특히 콜레스트롤과 복합물이다. 기타 인지질 또는 기타 지질을 이용할 수도 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 이가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
리포좀 생산에 유용한 예시적인 지질은 포스파티딜 화합물, 가령 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고리피드, 세레브로시드, 및 강글리오시드를 포함한다. 실례가 되는 인지질은 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포좀의 표적화는 예를 들면, 장기-특이성, 세포-특이성, 및 기관-특이성에 기초하여 가능하며, 당업계에 공지되어 있다.
구체예
본 발명은 지금 일반적으로 설명하며, 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 목적으로 포함된 다음의 실시예들을 참고하여, 더 용이하게 이해할 수 있지만, 본 발명을 이에 한정시키지는 않는다.
실시예 1. ALK3 - Fc 융합 단백질의 생성
고유의 인간 ALK3의 아미노산 서열 및 대응 뉴클레오티드 서열은 도 1과 2에 제공한다. 출원인은 인간 ALK3의 세포외 도메인 (고유의 잔기들 24-152)(도 3, 4)을 최소 링커(아미노산 잔기들 TGGG를 포함)를 통하여 인간 Fc 도메인 (도 5, 6)에 융합시켜, 도 7의 단백질을 만들도록 ALK3-hFc 융합 단백질을 기획하였다. 다음의 3가지 리더 서열을 고려하였다:
(i) 고유의: MPQLYIYIRLLGAYLFIISRVQG (서열 번호: 8)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성물질 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP
(서열 번호: 9)
(iii) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 10)
hALK3(24-152)-hFc (서열 번호: 11)의 선택된 형태는 TPA 리더를 이용하고, 도 8의 가공안된 아미노산 서열을 가진다. 이러한 융합 단백질을 인코드하는 센스 뉴클레오티드 서열과 대응하는 안티센스 서열을 도 9에 나타낸다. 하기에 나타낸 것은 hALK3(24-152)-hFc를 인코드하는 대체 센스 뉴클레오티드 서열이며, 아미노산 서열을 변경시키지 않는 위치 1137(밑줄)에서 C→T 치환을 포함한다.
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC
41 TGTGTGGAGC AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCCAGAATCT
81 GGATAGTATG CTTCATGGCA CTGGGATGAA ATCAGACTCC
121 GACCAGAAAA AGTCAGAAAA TGGAGTAACC TTAGCACCAG
161 AGGATACCTT GCCTTTTTTA AAGTGCTATT GCTCAGGGCA
201 CTGTCCAGAT GATGCTATTA ATAACACATG CATAACTAAT
241 GGACATTGCT TTGCCATCAT AGAAGAAGAT GACCAGGGAG
281 AAACCACATT AGCTTCAGGG TGTATGAAAT ATGAAGGATC
321 TGATTTTCAG TGCAAAGATT CTCCAAAAGC CCAGCTACGC
361 CGGACAATAG AATGTTGTCG GACCAATTTA TGTAACCAGT
401 ATTTGCAACC CACACTGCCC CCTGTTGTCA TAGGTCCGTT
441 TTTTGATGGC AGCATTCGAA CCGGTGGTGG AACTCACACA
481 TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
521 CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
561 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
601 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
641 TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
681 GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
721 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
761 ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
801 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
841 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
881 CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
921 CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
961 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
1001 ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
1041 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
1081 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
1121 AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
TPA 리더를 가지며, 인간 Fc 대신 뮤린 Fc로 대체된 hALK3(24-152)-Fc의 변이체는 도 10에 나타낸다. 이러한 변이체를 인코드하는 센스 뉴클레오티드 서열과 이의 대응하는 안티센스 서열은 도 11에 나타낸다. 출원인은 위치 71에 아스파라긴을 가지는 hALK3(24-152)-mFc 형(고유의 ALK3 ECD 서열에서는 위치 70임)을 만들었다. 이 단백질은 CHO 세포계에서 발현되었고, N-말단 서열화로 N-말단 블록과 함께 1차 종이 나타났는데, 고유의 글루타민 (Q) 잔기에서 시작하며, 서열 번호:7의 단백질과 일치하며, 그리고 단일 소수 서열 GAQNLDSMLHGTGMK (서열 번호: 17)이 있다. 출원인은 고유의 ALK3 서열을 가지는 hALK3(24-152)-hFc 단백질을 추가로 만들었다. 뮤린 ALK3 세포외 도메인 (뮤린 전구물질에서 고유의 잔기들 24-152)과 뮤린 Fc 도메인을 포함하는 또 다른 ALK3-Fc 변이체도 유사한 방법으로 만들었다. 이러한 변이체, mALK3(24-152)-mFc의 아미노산 서열은 하기 밑줄친 ALK3 도메인과 함께 나타낸다:
1MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAQNLDSM LHGTGMKSDL DQKKPENGVT
51LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN GHCFAIIEED DQGETTLTSG
101CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG
151SIRTGGGEPR VPITQNPCPP LKECPPCAAP DLLGGPSVFI FPPKIKDVLM
201ISLSPMVTCV VVDVSEDDPD VQISWFVNNV EVHTAQTQTH REDYNSTLRV
251VSALPIQHQD WMSGKEFKCK VNNRALPSPI EKTISKPRGP VRAPQVYVLP
301PPAEEMTKKE FSLTCMITGF LPAEIAVDWT SNGRTEQNYK NTATVLDSDG
351SYFMYSKLRV QKSTWERGSL FACSVVHEGL HNHLTTKTIS RSLGK
(서열 번호: 18)
실시예 2. ALK3 - Fc 에 리간드 결합
Biacore™ 방법을 이용하여 BMP/GDF 패밀리의 15개 구성요소에 대해 ALK3-Fc 융합 단백질의 결합 친화력을 결정하였다. HEK 293 세포로부터 유도된 mALK3-mFc는 hBMP2 및 hBMP4에 대해 높은 결합 친화력을 나타내었고(차례로 KD = 2.43 × 10-9 및 9.47 × 10-10), hBMP6 및 hBMP7을 포함하는 몇 가지 기타 리간드에는 중간정도의 결합 친화력을 나타내었다. hALK3(24-152)-hFc는 유사한 결합 프로파일을 나타내었다. 특히, HEK 293세포로부터 유도된 hALK3(24-152)-hFc는 hBMP2 및 hBMP4에 차례로 6.53×10-10 및 1.02×10-9의 KD로 결합하였고, CHO 세포로부터 유도된 hALK3(24-152)-hFc는 hBMP2 및 hBMP4에 차례로 4.53×10-10 및 7.03×10-10의 KD로 결합하였다. mALK3(24-152)-mFc와 유사하게, 이들 두 가지 세포 유형으로부터 유도된 hALK3(24-152)-hFc는 다른 리간드중에서 유도된 hBMP6 및 hBMP7에 중간정도의 결합 친화력을 나타내었다.
BMP2 및 BMP4에 대한 ALK3-Fc의 전반적인 선택성은 주목할 만하다. 임의의 특정 이론에 결부되지 않고, 출원인은 BMP2 및 BMP4에 결합하여, 이들 리간드에 의한 신호 생성을 억제함으로써 주로 생체내에서 이의 효과를 발휘한다고 가정한다. 따라서, BMP2 및/또는 BMP4에 대항한 항체는 또한 뼈 형성을 자극할 수 있다고 기대한다. 대안으로, ALK3 리간드-결합 도메인에 대항하는 항체는 더 광범위하게 ALK3-중재된 신호생성을 억제할 것으로 기대한다. 도 18은 BMP2, BMP4 및 뼈 형성을 촉진하기 위한 목적의 추가 리간드에 의한 신호 생성을 간섭하기 위하여 제안된 3가지 방법의 예를 도면으로 나타낸다.
인간 ALK3 세포외 도메인 (ECD)의 절두된 변이체를 포함한 일련의 ALK3-Fc 단백질을 만들었고, 이들 리간드 결합 친화력에 대해 hALK3(24-152)-hFc 와 비교하였다. 6개, 12개, 27개, 또는 31개 아미노산의 N-말단 결손과, 6개 또는 12개 아미노산의 C-말단 결손 및 이중-절두을 가진 ALK3 ECD 변이체들을 HEK 293 세포에서 발현시키고 Mab 크로마토그래피 (단백질 A 컬럼)으로 정제하였다. Biacore™ 방법을 이용하여 이들 변이체에 결합에 대해 BMP/GDF/TGFβ 리간드 슈퍼패밀리의 구성원들을 스크리닝하였다.
Figure pct00001
상기에서 나타낸 것과 같이, 평가된 C-말단 절두는 전장 ALK3 ECD와 비교하여 BMP2/BMP4에 대해 유사한 또는 증가된 결합 친화력을 나타내는데, BMP6/BMP7에 대해 일반적으로 감소된 결합을 나타내지만, ALK3C12는 전장 ALK3 ECD와 유사한 친화력으로 BMP7에 결합을 유지한다. 대조적으로, N-말단 절두는 BMP2에 대한 결합을 감소시키고, BMP4에 대한 결합은 파괴하고, 그리고 BMP6/BMP7에 대한 결합에는 다양한 효과를 나타낸다. 흥미롭게도, 이중-절두된 변이체 ALK3N6C6는 전장 ALK3 ECD과 비교하여, BMP2/BMP4에 대해 증가된 친화력을 나타내며 BMP6/BMP7에 대해 탐지가능한 결합은 없다. 원하는 표적, BMP2 및 BMP4에 대해 더 큰 선택성을 가진 분자들은 이들이 환자에서 더 적은 “오프 타겟” 효과를 가질 것이기 때문에 유용할 것이다. N-말단 서열화는 N-말단에서 6개 아미노산 절두를 인코드하는 핵산이 세포 배양물에서 발현되면, 6개 아미노산 절두된 폴리펩티드와 7개 아미노산 절도된 폴리펩티드 집단을 만들었다는 것을 설명하였다. 이와 함께, N-말단에서 최대 7개 아미노산 절두와, C-말단에서 최대 12개 아미노산 절두를 포함하는 hALK3-hFc 폴리펩티드는 유용한 활성을 유지하며, 오프-타겟 리간드에 대한 결합이 감소됨을 설명한다. 따라서, 서열 번호:3의 최소한 아미노산 8 내지 117을 포함하는 ALK3 폴리펩티드는 여기에서 설명되는 목적에 이용할 수 있다.
리간드 결합 성질을 이용하여 CHO 세포로부터 유도된 hALK3(24-152)-hFc 단백질의 질을 HEK 293 세포로부터 유도된 단백질과 비교하였다. Biacore™ 방법에 의해 측정하였을 때, hALK3(24-152)-hFc에 대한 BMP2의 친화력(Kd)은 융합 단백질의 원천에 따라 달라지지 않았지만; 그러나, CHO 세포에 의해 생성된 활성 단백질의 비율은 각 Rmax 값에 근거하여 HEK 293 세포에서의 비율보다 더 높았다. Rmax는 (MWA/MWL)× RL× SM인 단백질로 나타내는 단백질 질의 척도이며, 이 식에서 MWA는 분석물의 분자량이며, MWL는 리간드의 분자량이며, RL은 반응 단위에서 고정 수준이며, SM는 몰 화학량론(molar stoichiometry)을 나타낸다. BMP4 결합의 대응 분석에서 CHO 세포로부터 유도된 단백질은 HEK 293 세포로부터 유도된 것보다 BMP4에 대해 더 높은 친화력을 나타낸다는 것이 밝혀졌고(각각 KD 314 pM 및 1020 pM), CHO 세포에 의해 생성된 단백질의 Rmax 값은 HEK 293 세포의 단백질의 값보다 3배 크며, 이는 활성 단백질의 비율이 더 높다는 것을 다시 한번 나타내는 것이다. 따라서, hALK3(24-152)-hFc 단백질의 원천으로서 CHO 세포의 예상치 못한 이점은 BMP4에 대한 훨씬 더 큰 결합 친화력과 이러한 더 우수한 단백질 품질로 인하여 예상되는 더 큰 생체이용성((Rmax 값)을 포함한다.
실시예 3. 마우스에서 hALK3 - mFc 는 뼈 상태를 개선시킨다 .
출원인은 마우스에서 ALK3-mFc 이형(version)이 뼈 상태를 개선시키는 능력을 조사하였다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스(그룹당 n = 8)를hALK3(24-152)-mFc, 10 ㎎/kg, 또는 비이클 (트리스-완충염)로 총 6주 동안 주당 2회 복막내 주사를 통하여 처리하였다. 비이클과 비교하였을 때, hALK3(24-152)-mFc는 듀얼 에너지 x-ray 흡광광 (DEXA)으로 측정한 결과, 31일 시점에서 전신 골밀도를 상당히 증가시켰고, 42일 시점의 연구 종료시까지 이 효과를 지속시켰다(도 12). 골 밀도에서 hALK3(24-152)-mFc 치료의 유사한 효과는 동일한 시점에서 DEXA에 의해 요추의 국소화 분석에서 관찰하였다(도 13). 또한, 경골 축과 근위 경골의 고해상 측정은 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 통하여 실시하여 피질골 및 지주골에서 hALK3(24-152)-mFc의 각 효과를 측정하였다. 비이클과 비교하였을 때, hALK3(24-152)-mFc 치료는 i) 6주 시점에서 피질골의 두께를 상당히 증가시켰고, ii) 4주 시점에서 지주골의 체적을 상당히 증가시켰고(도 15), 그리고 iii) 4주 시점에서 평균 지주골 두께를 상당히 증가시켰다(도 16). 근위 경골 (도 17)을 통하여 micro-CT에 의해 생성된 단편의 대표 3차원 재구성은 지주골 미소구조 양식에서 hALK(24-152)-mFc 치료 (4 주)의 강력한 자극 효과를 강조한다. 중요한 것은, hALK(24-152)-mFc 치료는 연구 과정에서 근육량(lean tissue mass), 지방량(fat mass), 또는 적혈구 세포량에는 심각한 변화를 야기시키지 않았다.
이와 함께, 상기 데이타는 뼈 미네랄 밀도의 증가 및 피질 및 지주골의 총 형성 증가를 통하여 뼈 상태를 선택적으로 개선시키기 위하여 생체에서 hALK3(24-152)-mFc를 이용할 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 4. hALK3 - mFc 는 마우스에서 골강도를 증가시킨다
실시예 3에서 설명한 실험에서, 출원인은 hALK3(24-152)-mFc의 골강도를 증가시키는 능력을 또한 조사하였다. 투여 6주 후, 대퇴골을 수거하여 -20℃에 냉동보관하였다. 나중에 뼈를 실온으로 냉각시켰고, Instron 기계 테스트 기구 (Instron 4465는 5500로 재개발됨)로 좌측 대퇴골 중축에서 파괴성 4점 벤드 테스트를 실행하였다. 고정된 서포트 사이에 거리는 7 mm였고, 적재용 두 점 사이의 거리는 2.5 mm이었다. 뼈가 부서질 때까지 3 mm/min의 정변위속도(constant displacement rate)에서 하중을 제공하였고, 최대 하중, 단단함 및 에너지 흡수 데이터는 Bluehill v 2.5 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 비이클과 비교하였을 때, hALK3(24-152)-mFc는 최대 뼈 하중을 30% 상당히 증가시켰고(도 19), 뼈 단단함은 14% 증가시켰고(도 20), 그리고 뼈 실패에 대한 에너지는 32% 증가시켰다(도 21). 이러한 발견들은 골강도의 증가는 hALK3(24-152)-mFc 치료 (실시예 3)에서 관찰된 뼈 조성물의 개선을 수반한다는 것을 설명한다.
실시예 5. 골감소증의 OVX 마우스 모델의 뼈에 mALK3 - mFc 의 효과
폐경 여성의 에스트로겐 결핍은 골 상실, 특히 지주골 상실을 촉진시킨다. 따라서, 출원인은 난소가 제거된(OVX) 그리고 골 상실이 확립된 골감소증 마우스 모델에서 뼈 상태를 개선시키는 mALK3(24-152)-mFc의 능력을 조사하였다. 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스는 양측 OVX 또는 허위 수술을 받았고, 8주간 치료를 받지 않는 상태로 두었다. 8주 종료 시점에서, micro-CT 및 DEXA의 대조군 측정에서 허위 치료를 받은 마우스와 비교하여 OVX 마우스에서 상당한 골 상실이 확인되었다. 근위 경골에서 micro-CT로 측정하였을 때(도 22, Day 0 time point) 지주골 체적이 43% 감소된 것이 가장 눈에 띈다. mALK3(24-152)-mFc, 10 ㎎/kg, 또는 비이클 (트리스-완충 염)으로 8주간 주당 2회 ip 주사로 마우스를 치료하였다.
mALK3(24-152)-mFc으로 치료하면 에스트로겐 결핍은 지속되지만 지주골 및 피질골 모두에서 개선이 있었다. 56일 시점의 연구 종료까지, mALK3(24-152)-mFc으로 치료를 받은 OVX 마우스의 근위 경골의 지주골 체적은 OVX 대조군과 비교하였을 때 거의 250% 증가되었고, 허위 대조군과 비교하였을 때 80% 이상 증가되었다(도 22). mALK3(24-152)-mFc 치료는 또한 OVX 대조군과 비교하여, 피질 두께가 증가되고(도 23), 그리고 경골 축에서 뼈 표면 둘레가 감소된 것과 같이(도 24), 피질골을 성장시켰다. 이러한 개선은 뼈 미네랄 밀도 증가에 수반되었다. OVX 대조군과 비교하여, mALK3(24-152)-mFc 치료는 14일 시점에서 전신 뼈 미네랄 밀도 (as determined by DEXA으로 측정하였을 때)를 상당히 증가시켰고, 그리고 연구가 종료될 때까지 이러한 개선이 유지되었다(도 25). 요척추 (도 26) 및 대퇴골-경골 (도 27)에서도 mALK3(24-152)-mFc 치료의 유사한 효과들이 관찰되었다. micro-CT 분석으로부터 유도된 척추 지주골의 3차원 영성(도 28)은 에스트로겐 결핍이 지속되었지만, mALK3(24-152)-mFc 치료와 관련된 뼈 상태의 강력한 개선을 강조한다. 이러한 발견은 mALK3(24-152)-mFc가 골감소증의 마우스 모델에서 에스트로겐 회수와 관련된 지주골을 포함한 뼈의 퇴보를 역전시킬 수 있다는 것을 설명한다. 뼈 손실 이상(osteopenic condition)으로부터 생식선-고유의 대조군의 뼈의 질을 능가하고(도 22-24, 28) 그리고 이러한 뼈의 질과 일치되도록(도 25-27) 뼈를 변환시키는 mALK3(24-152)-mFc의 능력은 이 물질이 항-재흡수성 뿐만 아니라 동화성(anabolic) 효과를 발휘한다는 증거다.
실시예 6. 마우스에서 뼈 조직 및 혈청 생체 표식에서 mALK3 - mFc 의 효과
별도의 연구로, 출원인은 조직 형태(histomorphometry) 및 혈청 생체표식으로 평가하였을 때 마우스에서 뼈 상태를 개선시키는 mALK3-mFc의 능력을 조사하였다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 주당 2회 복막 주사로 mALK3(24-152)-mFc, 10 ㎎/kg, 또는 비이클 (트리스-완충염)로 치료하였다. 뼈 및 혈청을 수거하기 위하여 치료후 12, 28, 42일에 쥐들을 검시하였다. 형광 화합물 칼세닌(20 ㎎/㎏) 및 데메클로사이틀린(20 ㎎/㎏)을 뼈 역학적 조직형태 분석을 위하여 부검전 9일과 2일에 각각 복막을 통하여 쥐에 투여하고,
조직형태분석을 위하여 다음과 같이 뼈를 준비하였다. 부검시에, 우측 대퇴골을 분리시키고, 대퇴골의 말단 1/4은 탈수, 메틸메타아크릴레이트에 침윤, 메틸메타아크릴레이트에 임베딩시키는 것으로 구성된 조직학적 준비를 하였다. 회전 마이크로톰을 이용하여 4㎛와 8㎛ 두께의 정두 단편을 얻었다. 더 얇은 단편들은 Goldner 3색으로 착색하였고, 정적 변수 분석에 이용하였으며, 더 두꺼운 단편들은 착색없이 동적 변수들의 분석에 이용하였다. 조직형태분석은 OsteoMeasure 영상 분석 소프트웨어를 구동시키는 비디오 서브시스템에 연결된 Nikon Eclipse E4000 광/형광 현미경으로 처리-블라인드 방식으로 실행하였다.
말단 대퇴골의 조직형태 분석에서 ALK3-Fc의 동화성 및 항재흡수 효과 모두 밝혀졌다. 비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc는 3가지 모든 시점에서 최대 90%까지 뼈 밀도를 상당히 증가시켰다(도 29). 중요한 것은, mALK3(24-152)-mFc는 뼈 형성율을 최대 120% 증가시켰고(도 30), 뼈 광화 표면은 최대 115%까지 증가시켰다(도 31). 이들 후자 변수들은 동화성 뼈 성장의 지표로 간주되지만, 동화성 효과의 추가 표식- 골아세포 표면 및 뼈 모양의 표면은 좀더 완만한 또는 무시할 수준의 증가를 나타내었다. 조직형태학적 분석은 일시적 항재흡수 효과의 증거 또한 제공하는데, mALK3(24-152)-mFc는 파골세포 표면을 28일에만 유의적으로 감소시켰고(도 32), 그리고 부식된 표면에서도 유사한 효과가 관찰되었기 때문이다.
뼈 상태의 혈청 생체 표식에서 mALK3(24-152)-mFc 치료의 효과 또한 조사하였다. RANKL (핵 인자-κB 리간드의 수용체 활성물질)는 골아세포에 의해 만들어지고, 파골세포 분화의 주요 활성물질이지만, 오스테오프로테그린 (OPG)은 RANKL 신호생성의 내생성 억제제다. 따라서, RANKL/OPG 비율은 파골세포 활성, 골량, 및 뼈 우량질의 주요 결정인자다(Boyce et al., 2008, Arch Biochem Biophys 473:139-146). 본 실험에서, RANKL 및 OPG의 혈청 수준은 Luminex xMAP？기술이 통합된 Millipore 산물(MBN2A-41K 및 MBN-41K-1OPG)으로 측정하였다. mALK3(24-152)-mFc 치료는 3가지 모든 시점에서 혈청 RANKL 수준을 상당히 감소시켰고(도 33), 비이클과 비교하였을 때(도 34), 28일 및 42일 시점에 혈청 OPG 수준이 상당이 증가하였다. 이러한 결과는 mALK3(24-152)-mFc 치료가 항재흡수 작용을 통하여 부분적으로 뼈 형성을 자극한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 마우스에서 스켈로스틴 유전자 발현에 대한 mALK3 - mFc 의 효과
스켈로스틴 단백질은 뼈 형성의 주요 음성적 조절물질이며, 스켈로스틴 신호생성의 간섭은 생체내에서 뼈의 동화성 효과를 발휘한다고 보고되었다(Li et al., 2009, J Bone Miner Res 24:578-588). 따라서 출원인은 생체에서 mALK3(24-152)-mFc 치료가 뼈에서 스켈로스틴 유전자 발현을 변경시키는지, 그리고 스켈로스틴 수준의 감소가 ALK3-Fc의 뼈 재건 효과의 일부를 잠재적으로 중개하는지를 조사하였다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 주당 2회 복막 주사를 통하여 mALK3(24-152)-mFc 또는 비이클 (PBS)로 처리하였다. 양쪽 대퇴골 및 경골을 수거하기 위하여 치료 2일, 7일, 14일 및 28일 후 마우스들을 부검하였고, 부검에서 임의 잔류 근육 또는 결합 조직을 분리시키고 제거하였다.
스켈로스틴 유전자 발현은 다음과 같이 분석하였다. 뼈를 정리하여 안쪽 골수 축이 노출되도록 하고, 골수 세포는 3-mL 주사기에 연결된 21-가우지 바늘을 이용하여 멸균 염수로 세척하였다. 각 마우스의 대퇴골 및 경골을 함께 분쇄하였고, 생성 분말로부터 제조업자의 지시에 따라 Ribopure 키트(Ambion)를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA integrity in 뼈 시료의 RNA 보전성은 제조업자의 지시에 따라 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer에서 작동되는 RNA Nano Chips (Agilent Technologies)으로 확인하였다. RNA는 TaqMan RT 시약(Applied Biosystem)을 이용하여 역전사하였고, 그리고 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)은 스켈로스틴 프로브/프라이머와 진핵 18S rRNA 내생성 기준(둘다 Applied Biosystem)으로 실행하였다. 증폭은 Applied Biosystem 7300 시스템으로 실행하였고, 2-△△ Ct 방법을 이용하여 결과를 분석하였다.
비이클과 비교하였을 때, mALK3(24-152)-mFc으로 치료하면 조사한 4개 시점중 3개 시점에서 스켈로스틴 mRNA의 뼈 수준이 상당히 감소하였다(도 35). 이러한 발견은 스켈로스틴의 감소된 발현이 뼈에서 mALK3(24-152)-mFc의 동화성 및/또는 항재흡수성 효과에 기여할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 마우스의 뼈 상태에 hALK3 - hFc 의 영향
출원인은 마우스의 뼈 상태에서 인간 구조체 hALK3(24-152)-hFc의 효과를 조사하였다. 12주령 암컷 C57BL/6 마우스(그룹 당 n = 6)를 총 6주간 주당 2회 복막 주사에 의해 hALK3(24-152)-hFc, 10 ㎎/㎏, 또는 비이클 (Tris-완충염수)로 처리하였다. 실험 과정에 걸쳐, 근위 경골 (도 36)의 micro-CT 분석으로 측정하였을 때, 비이클-처리된 대조군에서 지주골 체적이 거의 20% 감소되었지만, hALK3(24-152)-hFc 치료를 받은 경우 80% 이상 증가하였다. 연구 결론에 의하면, hALK3(24-152)-hFc로 처리된 경우 기준으로부터 지주골 수(34%) 및 지주골 두께(20%) 또한 상당히 증가하였지만, 비이클에서는 증가되지 않았다. 연구 결론에서 DEXA에 의해 측정하였을 때, 비이클과 비교하여 hALK3(24-152)-hFc는 전신 뼈 미네랄 밀도를 상당히 증가시켰다. DEXA에 의하면 요추 (L1-L6)의 국소화 분석에서 비이클과 비교하였을 때, 연구 결론으로 뼈 미네랄 밀도에 있어서 hALK3(24-152)-hFc의 유의적인 자극 효과(21% 증가) 또한 나타났다.
이러한 결과들은 인간 구조체 hALK3(24-152)-hFc는 마우스에서 뼈 상태를 개선시킬 수 있지만, 설치류에서 이의 효과 정도는 면역 반응에 의해 둔감해질 수 있다고 설명한다. 결론적으로 상기 발견들은 ALK3-Fc 구조체가 1) 항재흡수 및 동화성 작용을 통하여 축 골격 및 부속 골격 모두에서 뼈 형성을 촉진시키고, 2) 뼈의 기계적 강도를 개선시키고, 그리고 3) 정착된 골감소증이 있는 마우스 모델에서 에스트로겐 결핍에 의해 유도된 골 상실을 역전시킨다는 것을 설명한다.
실시예 9. 예시적인 hALK3 - hFc 핵산 및 단백질
본 실시예는 여기에서 제공된 방법들에 따라 CHO 세포에서 ALK3 구조체를 발현시키는데 이용된 핵산 구조체를 요약하고, 그리고 세포 배양물로부터 단리된 성숙 단백질을 제공한다.
A. 서열 번호:19의 핵산은 CHO 세포에서 발현되었고, 다음의 ALK3-Fc 종들이 단리되었다:
(1) 글루타민(Edman 분해에 의해 N-afkeks 서열화를 위하여 차단되는 경향이 있다)으로 시작되는 서열 번호:7의 hALK3(24-152)-hFc 서열.
(2) 하기에 나타낸 hALK3(GA,24-152)-hFc 서열(서열 번호: 20), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GAQNLDSM LHGTGMKSDS
DQKKSENGVT LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN
GHCFAIIEED DQGETTLASG CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR
RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG SIRTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK*
(서열 번호:20)
B. 하기 나타낸 hALK3(24-146)-hFc을 인코드하는 핵산(서열 번호: 21)은 CHO 세포에서 발현되었다:
AT GGATGCAATG AAGAGAGGGC
TCTGCTGTGT GCTGCTGCTG TGTGGAGCAG TCTTCGTTTC
GCCCGGCGCC CAGAATCTGG ATAGTATGCT TCATGGCACT
GGGATGAAAT CAGACTCCGA CCAGAAAAAG TCAGAAAATG
GAGTAACCTT AGCACCAGAG GATACCTTGC CTTTTTTAAA
GTGCTATTGC TCAGGGCACT GTCCAGATGA TGCTATTAAT
AACACATGCA TAACTAATGG ACATTGCTTT GCCATCATAG
AAGAAGATGA CCAGGGAGAA ACCACATTAG CTTCAGGGTG
TATGAAATAT GAAGGATCTG ATTTTCAGTG CAAAGATTCT
CCAAAAGCCC AGCTACGCCG GACAATAGAA TGTTGTCGGA
CCAATTTATG TAACCAGTAT TTGCAACCCA CACTGCCCCC
TGTTGTCATA GGTCCGTTTA CCGGTGGTGG AACTCACACA
TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
(서열 번호:21)
다음의 단백질 종들이 단리되었다:
(1) 글루타민(Edman 분해에 의해 N-말단 서열화를 위하여 차단되는 경향이 있다)으로 시작되는 서열 번호:22의 hALK3(24-146)-hFc 서열.
QNLDSMLHGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:22)
(2) 하기에 나타낸 hALK3(GA,24-146)-hFc 서열(서열 번호: 23), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GA QNLDSMLHGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:23)
C. 하기에 나타낸 hALK3(24-140)-hFc을 인코드하는 핵산(서열 번호: 24)은 CHO 세포에서 발현되었다:
ATGG
ATGCAATGAA GAGAGGGCTC TGCTGTGTGC TGCTGCTGTG
TGGAGCAGTC TTCGTTTCGC CCGGCGCCCA GAATCTGGAT
AGTATGCTTC ATGGCACTGG GATGAAATCA GACTCCGACC
AGAAAAAGTC AGAAAATGGA GTAACCTTAG CACCAGAGGA
TACCTTGCCT TTTTTAAAGT GCTATTGCTC AGGGCACTGT
CCAGATGATG CTATTAATAA CACATGCATA ACTAATGGAC
ATTGCTTTGC CATCATAGAA GAAGATGACC AGGGAGAAAC
CACATTAGCT TCAGGGTGTA TGAAATATGA AGGATCTGAT
TTTCAGTGCA AAGATTCTCC AAAAGCCCAG CTACGCCGGA
CAATAGAATG TTGTCGGACC AATTTATGTA ACCAGTATTT
GCAACCCACA CTGCCCCCTA CCGGTGGTGG AACTCACACA
TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
(서열 번호:24)
다음의 단백질 종들이 단리되었다:
(1) 글루타민(Edman 분해에 의해 N-말단 서열화를 위하여 차단되는 경향이 있다)으로 시작되는 서열 번호:25의 hALK3(24-140)-hFc 서열.
QNLD
SMLHGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:25)
(2) 하기에 나타낸 hALK3(GA,24-140)-hFc 서열(서열 번호: 26), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GAQNLD
SMLHGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:26)
D. 하기에 나타낸 hALK3(30-152)-hFc을 인코드하는 핵산(서열 번호: 27)은 CHO 세포에서 발현되었다:
AT GGATGCAATG AAGAGAGGGC
TCTGCTGTGT GCTGCTGCTG TGTGGAGCAG TCTTCGTTTC
GCCCGGCGCC CTTCATGGCA CTGGGATGAA ATCAGACTCC
GACCAGAAAA AGTCAGAAAA TGGAGTAACC TTAGCACCAG
AGGATACCTT GCCTTTTTTA AAGTGCTATT GCTCAGGGCA
CTGTCCAGAT GATGCTATTA ATAACACATG CATAACTAAT
GGACATTGCT TTGCCATCAT AGAAGAAGAT GACCAGGGAG
AAACCACATT AGCTTCAGGG TGTATGAAAT ATGAAGGATC
TGATTTTCAG TGCAAAGATT CTCCAAAAGC CCAGCTACGC
CGGACAATAG AATGTTGTCG GACCAATTTA TGTAACCAGT
ATTTGCAACC CACACTGCCC CCTGTTGTCA TAGGTCCGTT
TTTTGATGGC AGCATTCGAA CCGGTGGTGG AACTCACACA
TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
(서열 번호:27)
다음의 단백질 종들이 단리되었다:
(1) 하기에 나타낸 hALK3(GA,30-152)-hFc 서열(서열 번호: 28), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GA LHGTGMKSDS
DQKKSENGVT LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN
GHCFAIIEED DQGETTLASG CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR
RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG SIRTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:28)
(2) 하기에 나타낸 hALK3(A,30-152)-hFc 서열(서열 번호: 29), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
A LHGTGMKSDS
DQKKSENGVT LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN
GHCFAIIEED DQGETTLASG CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR
RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG SIRTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:29)
(3) 하기에서 나타낸 hALK3(31-152)-hFc 서열(서열 번호: 30), 이 서열에서 리더 및 처음 류신은 제거되고, 초기 히스티딘은 남아있다 (실제로 N7).
HGTGMKSDS
DQKKSENGVT LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN
GHCFAIIEED DQGETTLASG CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR
RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG SIRTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:30)
(4) 다음에 나타낸 추가 종hALK3(30-152)-hFc(서열 번호:31)을 예상하였지만, N-말단 서열화에 의해 확인되지 않았다.
LHGTGMKSDS
DQKKSENGVT LAPEDTLPFL KCYCSGHCPD DAINNTCITN
GHCFAIIEED DQGETTLASG CMKYEGSDFQ CKDSPKAQLR
RTIECCRTNL CNQYLQPTLP PVVIGPFFDG SIRTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:31)
E. 하기에 나타낸 것과 같이 hALK3(30-146)-hFc을 인코드하는 핵산(서열 번호: 32)은 CHO 세포에서 발현되었다:
ATGG
ATGCAATGAA GAGAGGGCTC TGCTGTGTGC TGCTGCTGTG
TGGAGCAGTC TTCGTTTCGC CCGGCGCCCT TCATGGCACT
GGGATGAAAT CAGACTCCGA CCAGAAAAAG TCAGAAAATG
GAGTAACCTT AGCACCAGAG GATACCTTGC CTTTTTTAAA
GTGCTATTGC TCAGGGCACT GTCCAGATGA TGCTATTAAT
AACACATGCA TAACTAATGG ACATTGCTTT GCCATCATAG
AAGAAGATGA CCAGGGAGAA ACCACATTAG CTTCAGGGTG
TATGAAATAT GAAGGATCTG ATTTTCAGTG CAAAGATTCT
CCAAAAGCCC AGCTACGCCG GACAATAGAA TGTTGTCGGA
CCAATTTATG TAACCAGTAT TTGCAACCCA CACTGCCCCC
TGTTGTCATA GGTCCGTTTA CCGGTGGTGG AACTCACACA
TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
(서열 번호:32)
다음의 단백질 종들이 단리되었다:
(1) 하기에 나타낸 hALK3(GA,30-146)-hFc 서열(서열 번호: 33), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GALHGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:33)
(2) 하기에 나타낸 hALK3(A,30-146) 서열(서열 번호: 34), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 알라닌을 보유한다.
ALHGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:34)
(3) 하기에서 나타낸 hALK3(31-146)-hFc 서열(서열 번호: 35), 이 서열에서 리더 및 처음 류신은 제거되고, 초기 히스티딘은 남아있다 (실제로 N7C6).
HGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:35)
(4) 다음에 나타낸 추가 종 hALK3(30-146)-hFc(서열 번호:36)을 예상하였지만, N-말단 서열화에 의해 확인되지 않았다.
LHGT
GMKSDSDQKK SENGVTLAPE DTLPFLKCYC SGHCPDDAIN
NTCITNGHCF AIIEEDDQGE TTLASGCMKY EGSDFQCKDS
PKAQLRRTIE CCRTNLCNQY LQPTLPPVVI GPFTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:36)
F. 하기에 나타낸 것과 같이 hALK3(30-140)-hFc을 인코드하는 핵산(서열 번호: 37)은 CHO 세포에서 발현되었다:
ATGGAT GCAATGAAGA GAGGGCTCTG
CTGTGTGCTG CTGCTGTGTG GAGCAGTCTT CGTTTCGCCC
GGCGCCCTTC ATGGCACTGG GATGAAATCA GACTCCGACC
AGAAAAAGTC AGAAAATGGA GTAACCTTAG CACCAGAGGA
TACCTTGCCT TTTTTAAAGT GCTATTGCTC AGGGCACTGT
CCAGATGATG CTATTAATAA CACATGCATA ACTAATGGAC
ATTGCTTTGC CATCATAGAA GAAGATGACC AGGGAGAAAC
CACATTAGCT TCAGGGTGTA TGAAATATGA AGGATCTGAT
TTTCAGTGCA AAGATTCTCC AAAAGCCCAG CTACGCCGGA
CAATAGAATG TTGTCGGACC AATTTATGTA ACCAGTATTT
GCAACCCACA CTGCCCCCTA CCGGTGGTGG AACTCACACA
TGCCCACCGT GCCCAGCACC TGAACTCCTG GGGGGACCGT
CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT
GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC
GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG
TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG
GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC
CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT
ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT
CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA
CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GAGGAGATGA
CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT
CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG
CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG
ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTATAGCA AGCTCACCGT
GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC
TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA
AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATGA
(서열 번호:37)
다음의 단백질 종들이 단리되었다:
(1) 하기에 나타낸 hALK3(GA,30-140)-hFc 서열(서열 번호: 38), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 글리신-알라닌을 보유한다.
GALHGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:38)
(2) 하기에 나타낸 hALK3(A,30-140)-hFc 서열(서열 번호: 39), 이 서열은 리더 서열로부터 초기 알라닌을 보유한다.
ALHGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:39)
(3) 하기에서 나타낸 hALK3(31-140)-hFc 서열(서열 번호: 40), 이 서열에서 리더 및 처음 류신은 제거되고, 초기 히스티딘은 남아있다 (실제로 N7C12).
HGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:40)
(4) 추가 종 hALK3(30-140)-hFc(서열 번호:41).
LHGTGMKS DSDQKKSENG VTLAPEDTLP FLKCYCSGHC
PDDAINNTCI TNGHCFAIIE EDDQGETTLA SGCMKYEGSD
FQCKDSPKAQ LRRTIECCRT NLCNQYLQPT LPPTGGGTHT
CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG
QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK* (서열 번호:41)
참고문헌
여기에서 언급한 모든 공고 및 특허는 각 개별 공고 또는 특허가 전문이 참고문헌에 명시적으로 그리고 특별히 언급된 것처럼 이들의 전문이 참고문헌에 통합된다.
주제의 특정 구체예들이 논의되고, 상기 명세서에서 설명하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서 및 하기 청구범위에 의거하여 당업계에 공지되어 숙련자에게는 많은 변이들이 자명할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 청구범위 및 이에 등가의 범위, 명세서 및 이러한 명세서의 변이를 참고하여 결정되어야만 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> BMP-ALK3 ANTAGONISTS AND USES FOR PROMOTING BONE GROWTH <130> PHPH-047-WO1 <140> PCT/US2010/029282 <141> 2010-03-30 <150> 61/314,556 <151> 2010-03-16 <150> 61/306,331 <151> 2010-02-19 <150> 61/211,557 <151> 2009-03-30 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 532 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Gln Leu Tyr Ile Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Tyr Leu Phe 1 5 10 15 Ile Ile Ser Arg Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly 20 25 30 Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly Val 35 40 45 Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser 50 55 60 Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly 65 70 75 80 His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu 85 90 95 Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp 100 105 110 Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn 115 120 125 Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly 130 135 140 Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Leu Leu Ile Ser Met 145 150 155 160 Ala Val Cys Ile Ile Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe Cys Tyr 165 170 175 Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Arg Arg Tyr Asn Arg Asp 180 185 190 Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu Lys Asp 195 200 205 Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu 210 215 220 Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg Gln Val 225 230 235 240 Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly Glu 245 250 255 Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser Trp Phe 260 265 270 Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu Asn Ile 275 280 285 Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp Thr Gln 290 295 300 Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Phe 305 310 315 320 Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu Ala Tyr 325 330 335 Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr Gly Thr 340 345 350 Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile 355 360 365 Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala 370 375 380 Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Val Pro Leu Asn Thr 385 390 395 400 Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser 405 410 415 Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile Tyr Ser 420 425 430 Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr Gly Gly 435 440 445 Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro Ser Asp 450 455 460 Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg Leu Arg 465 470 475 480 Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg Ala Val 485 490 495 Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser Arg Leu 500 505 510 Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu Ser Gln 515 520 525 Asp Val Lys Ile 530 <210> 2 <211> 1596 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcctcagc tatacattta catcagatta ttgggagcct atttgttcat catttctcgt 60 gttcaaggac agaatctgga tagtatgctt catggcactg ggatgaaatc agactccgac 120 cagaaaaagt cagaaaatgg agtaacctta gcaccagagg ataccttgcc ttttttaaag 180 tgctattgct cagggcactg tccagatgat gctattaata acacatgcat aactaatgga 240 cattgctttg ccatcataga agaagatgac cagggagaaa ccacattagc ttcagggtgt 300 atgaaatatg aaggatctga ttttcagtgc aaagattctc caaaagccca gctacgccgg 360 acaatagaat gttgtcggac caatttatgt aaccagtatt tgcaacccac actgccccct 420 gttgtcatag gtccgttttt tgatggcagc attcgatggc tggttttgct catttctatg 480 gctgtctgca taattgctat gatcatcttc tccagctgct tttgttacaa acattattgc 540 aagagcatct caagcagacg tcgttacaat cgtgatttgg aacaggatga agcatttatt 600 ccagttggag aatcactaaa agaccttatt gaccagtcac aaagttctgg tagtgggtct 660 ggactacctt tattggttca gcgaactatt gccaaacaga ttcagatggt ccggcaagtt 720 ggtaaaggcc gatatggaga agtatggatg ggcaaatggc gtggcgaaaa agtggcggtg 780 aaagtattct ttaccactga agaagccagc tggtttcgag aaacagaaat ctaccaaact 840 gtgctaatgc gccatgaaaa catacttggt ttcatagcgg cagacattaa aggtacaggt 900 tcctggactc agctctattt gattactgat taccatgaaa atggatctct ctatgacttc 960 ctgaaatgtg ctacactgga caccagagcc ctgcttaaat tggcttattc agctgcctgt 1020 ggtctgtgcc acctgcacac agaaatttat ggcacccaag gaaagcccgc aattgctcat 1080 cgagacctaa agagcaaaaa catcctcatc aagaaaaatg ggagttgctg cattgctgac 1140 ctgggccttg ctgttaaatt caacagtgac acaaatgaag ttgatgtgcc cttgaatacc 1200 agggtgggca ccaaacgcta catggctccc gaagtgctgg acgaaagcct gaacaaaaac 1260 cacttccagc cctacatcat ggctgacatc tacagcttcg gcctaatcat ttgggagatg 1320 gctcgtcgtt gtatcacagg agggatcgtg gaagaatacc aattgccata ttacaacatg 1380 gtaccgagtg atccgtcata cgaagatatg cgtgaggttg tgtgtgtcaa acgtttgcgg 1440 ccaattgtgt ctaatcggtg gaacagtgat gaatgtctac gagcagtttt gaagctaatg 1500 tcagaatgct gggcccacaa tccagcctcc agactcacag cattgagaat taagaagacg 1560 cttgccaaga tggttgaatc ccaagatgta aaaatc 1596 <210> 3 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala 35 40 45 Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu 50 55 60 Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln 100 105 110 Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile 115 120 125 Arg <210> 4 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cagaatctgg atagtatgct tcatggcact gggatgaaat cagactccga ccagaaaaag 60 tcagaaaatg gagtaacctt agcaccagag gataccttgc cttttttaaa gtgctattgc 120 tcagggcact gtccagatga tgctattaat aacacatgca taactaatgg acattgcttt 180 gccatcatag aagaagatga ccagggagaa accacattag cttcagggtg tatgaaatat 240 gaaggatctg attttcagtg caaagattct ccaaaagccc agctacgccg gacaatagaa 300 tgttgtcgga ccaatttatg taaccagtat ttgcaaccca cactgccccc tgttgtcata 360 ggtccgtttt ttgatggcag cattcga 387 <210> 5 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 6 <211> 678 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 60 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 120 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 180 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 240 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 300 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 360 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 420 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 480 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 540 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 600 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 660 ctgtccccgg gtaaatga 678 <210> 7 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala 35 40 45 Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu 50 55 60 Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln 100 105 110 Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile 115 120 125 Arg Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 165 170 175 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 180 185 190 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 195 200 205 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 210 215 220 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 245 250 255 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 260 265 270 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 275 280 285 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 290 295 300 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 305 310 315 320 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 325 330 335 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Native leader sequence <400> 8 Met Pro Gln Leu Tyr Ile Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Tyr Leu Phe 1 5 10 15 Ile Ile Ser Arg Val Gln Gly 20 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Tissue plasminogen activator leader sequence <400> 9 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro 20 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Apis sp. <400> 10 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 11 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His 20 25 30 Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly 35 40 45 Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys 50 55 60 Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn 65 70 75 80 Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys 100 105 110 Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr 115 120 125 Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val Ile 130 135 140 Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr His Thr 145 150 155 160 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 165 170 175 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 180 185 190 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 195 200 205 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 225 230 235 240 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 245 250 255 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 260 265 270 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 275 280 285 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 290 295 300 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 305 310 315 320 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 325 330 335 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 340 345 350 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 355 360 365 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 12 <211> 1146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cccagaatct ggatagtatg cttcatggca ctgggatgaa atcagactcc 120 gaccagaaaa agtcagaaaa tggagtaacc ttagcaccag aggatacctt gcctttttta 180 aagtgctatt gctcagggca ctgtccagat gatgctatta ataacacatg cataactaat 240 ggacattgct ttgccatcat agaagaagat gaccagggag aaaccacatt agcttcaggg 300 tgtatgaaat atgaaggatc tgattttcag tgcaaagatt ctccaaaagc ccagctacgc 360 cggacaatag aatgttgtcg gaccaattta tgtaaccagt atttgcaacc cacactgccc 420 cctgttgtca taggtccgtt ttttgatggc agcattcgaa ccggtggggg tactcacaca 480 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 540 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 600 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 660 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 720 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 780 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 840 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 900 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 960 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1020 ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1080 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg 1140 ggtaaa 1146 <210> 13 <211> 1146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 tttacccggg gacagggaga ggctcttctg cgtgtagtgg ttgtgcagag cctcatgcat 60 cacggagcat gagaagacgt tcccctgctg ccacctgctc ttgtccacgg tgagcttgct 120 atagaggaag aaggagccgt cggagtccag cacgggaggc gtggtcttgt agttgttctc 180 cggctgccca ttgctctccc actccacggc gatgtcgctg ggatagaagc ctttgaccag 240 gcaggtcagg ctgacctggt tcttggtcat ctcctcccgg gatgggggca gggtgtacac 300 ctgtggttct cggggctgcc ctttggcttt ggagatggtt ttctcgatgg gggctgggag 360 ggctttgttg gagaccttgc acttgtactc cttgccattc agccagtcct ggtgcaggac 420 ggtgaggacg ctgaccacac ggtacgtgct gttgtactgc tcctcccgcg gctttgtctt 480 ggcattatgc acctccacgc cgtccacgta ccagttgaac ttgacctcag ggtcttcgtg 540 gctcacgtcc accaccacgc atgtgacctc aggggtccgg gagatcatga gggtgtcctt 600 gggttttggg gggaagagga agactgacgg tccccccagg agttcaggtg ctgggcacgg 660 tgggcatgtg tgagtacccc caccggttcg aatgctgcca tcaaaaaacg gacctatgac 720 aacagggggc agtgtgggtt gcaaatactg gttacataaa ttggtccgac aacattctat 780 tgtccggcgt agctgggctt ttggagaatc tttgcactga aaatcagatc cttcatattt 840 catacaccct gaagctaatg tggtttctcc ctggtcatct tcttctatga tggcaaagca 900 atgtccatta gttatgcatg tgttattaat agcatcatct ggacagtgcc ctgagcaata 960 gcactttaaa aaaggcaagg tatcctctgg tgctaaggtt actccatttt ctgacttttt 1020 ctggtcggag tctgatttca tcccagtgcc atgaagcata ctatccagat tctgggcgcc 1080 gggcgaaacg aagactgctc cacacagcag cagcacacag cagagccctc tcttcattgc 1140 atccat 1146 <210> 14 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His 20 25 30 Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly 35 40 45 Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys 50 55 60 Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn 65 70 75 80 Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys 100 105 110 Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu 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tgagcccaga 480 gtgcccataa cacagaaccc ctgtcctcca ctcaaagagt gtcccccatg cgcagctcca 540 gacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 600 atctccctga gccccatggt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagac 660 gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 720 agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 780 tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca gagccctccc atcccccatc 840 gagaaaacca tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 900 ccaccagcag aagagatgac taagaaagag ttcagtctga cctgcatgat cacaggcttc 960 ttacctgccg aaattgctgt ggactggacc agcaatgggc gtacagagca aaactacaag 1020 aacaccgcaa cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctcagagta 1080 caaaagagca cttgggaaag aggaagtctt ttcgcctgct cagtggtcca cgagggtctg 1140 cacaatcacc ttacgactaa gaccatctcc cggtctctgg gtaaa 1185 <210> 16 <211> 1185 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 tttacccaga gaccgggaga tggtcttagt cgtaaggtga ttgtgcagac cctcgtggac 60 cactgagcag gcgaaaagac ttcctctttc ccaagtgctc ttttgtactc tgagcttgct 120 gtacatgaag taagaaccat cagagtccag gactgttgcg gtgttcttgt agttttgctc 180 tgtacgccca ttgctggtcc agtccacagc aatttcggca ggtaagaagc ctgtgatcat 240 gcaggtcaga ctgaactctt tcttagtcat ctcttctgct ggtggaggca agacatatac 300 ctgtggagct cttactggcc ctctgggttt tgagatggtt ttctcgatgg gggatgggag 360 ggctctgttg ttgaccttgc atttgaactc cttgccactc atccagtcct ggtgctggat 420 ggggagggca ctgaccaccc ggagagtact gttgtaatcc tctctatggg tttgtgtctg 480 agctgtgtgt acttccacgt tgttcacaaa ccagctgatc tggacgtctg ggtcatcctc 540 gctcacatcc accaccacac atgtgaccat ggggctcagg gagatcatga gtacatcctt 600 gatctttgga gggaagatga agacggatgg tccacccaag aggtctggag ctgcgcatgg 660 gggacactct ttgagtggag gacaggggtt ctgtgttatg ggcactctgg gctcaccccc 720 accggttcga atgctgccat caaaaaacgg acctatgaca acagggggca gtgtgggttg 780 caaatactgg ttacataaat tggtccgaca acattctatt gtccggcgta gctgggcttt 840 tggagaatct ttgcactgaa aatcagatcc ttcatatttc atacaccctg aagctaatgt 900 ggtttctccc tggtcatctt cttctatgat ggcaaagcaa tgtccattag ttatgcatgt 960 gttattaata gcatcatctg gacagtgccc tgagcaatag cactttaaaa aaggcaaggt 1020 atcctctggt gctaaggtta ctccattttc tgactttttc tggtcggagt ctgatttcat 1080 cccagtgcca tgaagcatac tatccagatt ctgggcgccg ggcgaaacga agactgctcc 1140 acacagcagc agcacacagc agagccctct cttcattgca tccat 1185 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gly Ala Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly Met Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 395 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His 20 25 30 Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Leu Asp Gln Lys Lys Pro Glu Asn Gly 35 40 45 Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys 50 55 60 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cccagaatct ggatagtatg cttcatggca ctgggatgaa atcagactcc 120 gaccagaaaa agtcagaaaa tggagtaacc ttagcaccag aggatacctt gcctttttta 180 aagtgctatt gctcagggca ctgtccagat gatgctatta ataacacatg cataactaat 240 ggacattgct ttgccatcat agaagaagat gaccagggag aaaccacatt agcttcaggg 300 tgtatgaaat atgaaggatc tgattttcag tgcaaagatt ctccaaaagc ccagctacgc 360 cggacaatag aatgttgtcg gaccaattta tgtaaccagt atttgcaacc cacactgccc 420 cctaccggtg gtggaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 480 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 540 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 600 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 660 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 720 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 780 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 840 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 900 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 960 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1020 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1080 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1113 <210> 22 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala 35 40 45 Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu 50 55 60 Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cccttcatgg cactgggatg aaatcagact ccgaccagaa aaagtcagaa 120 aatggagtaa ccttagcacc agaggatacc ttgccttttt taaagtgcta ttgctcaggg 180 cactgtccag atgatgctat taataacaca tgcataacta atggacattg ctttgccatc 240 atagaagaag atgaccaggg agaaaccaca ttagcttcag ggtgtatgaa atatgaagga 300 tctgattttc agtgcaaaga ttctccaaaa gcccagctac gccggacaat agaatgttgt 360 cggaccaatt tatgtaacca gtatttgcaa cccacactgc cccctgttgt cataggtccg 420 ttttttgatg gcagcattcg aaccggtggt ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca 480 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 540 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 600 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 660 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 720 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 780 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 840 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 900 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 960 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1020 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1080 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1131 <210> 25 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr 20 25 30 Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala 35 40 45 Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu 50 55 60 Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg 85 90 95 Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cccttcatgg cactgggatg aaatcagact ccgaccagaa aaagtcagaa 120 aatggagtaa ccttagcacc agaggatacc ttgccttttt taaagtgcta ttgctcaggg 180 cactgtccag atgatgctat taataacaca tgcataacta atggacattg ctttgccatc 240 atagaagaag atgaccaggg agaaaccaca ttagcttcag ggtgtatgaa atatgaagga 300 tctgattttc agtgcaaaga ttctccaaaa gcccagctac gccggacaat agaatgttgt 360 cggaccaatt tatgtaacca gtatttgcaa cccacactgc cccctgttgt cataggtccg 420 ttttttgatg gcagcattcg aaccggtggt ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca 480 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 540 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 600 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 660 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 720 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 780 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 840 cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 900 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 960 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1020 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1080 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1131 <210> 28 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Gly Ala Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys 1 5 10 15 Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu 20 25 30 Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr 35 40 45 Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln 50 55 60 Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp 65 70 75 80 Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu 85 90 95 Cys Cys 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cactgtccag atgatgctat taataacaca tgcataacta atggacattg ctttgccatc 240 atagaagaag atgaccaggg agaaaccaca ttagcttcag ggtgtatgaa atatgaagga 300 tctgattttc agtgcaaaga ttctccaaaa gcccagctac gccggacaat agaatgttgt 360 cggaccaatt tatgtaacca gtatttgcaa cccacactgc cccctgttgt cataggtccg 420 tttaccggtg gtggaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 480 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 540 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 600 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 660 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 720 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 780 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 840 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 900 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 960 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1020 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1080 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1113 <210> 33 <211> 348 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gly Ala Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys 1 5 10 15 Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu 20 25 30 Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr 35 40 45 Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln 50 55 60 Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp 65 70 75 80 Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu 85 90 95 Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro 100 105 110 Pro Val Val Ile Gly Pro Phe Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro 115 120 125 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 130 135 140 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 145 150 155 160 Thr Cys Val 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polypeptide <400> 34 Ala Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys 20 25 30 Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys 35 40 45 Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly 50 55 60 Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe 65 70 75 80 Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys 85 90 95 Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro 100 105 110 Val Val Ile Gly Pro Phe Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro 115 120 125 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 130 135 140 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 145 150 155 160 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 165 170 175 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 180 185 190 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 195 200 205 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Cys Cys 85 90 95 Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val 100 105 110 Val Ile Gly Pro Phe Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 245 250 255 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 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gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 600 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 660 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 720 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 780 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 840 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 900 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 960 ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1020 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1080 tctccgggta aatga 1095 <210> 38 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Gly Ala Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys 1 5 10 15 Ser Glu Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu 20 25 30 Lys Cys Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr 35 40 45 Cys Ile Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln 50 55 60 Gly Glu Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp 65 70 75 80 Phe Gln Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu 85 90 95 Cys Cys Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 115 120 125 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 130 135 140 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 145 150 155 160 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 165 170 175 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 180 185 190 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 195 200 205 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 210 215 220 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 225 230 235 240 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 245 250 255 Gln Val Ser 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Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro 100 105 110 Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 115 120 125 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 130 135 140 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 145 150 155 160 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 165 170 175 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 180 185 190 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 195 200 205 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 210 215 220 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 225 230 235 240 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 245 250 255 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 260 265 270 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 275 280 285 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 290 295 300 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 305 310 315 320 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 325 330 335 Leu Ser Pro Gly Lys 340 <210> 40 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr 20 25 30 Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr 35 40 45 Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr 50 55 60 Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys 65 70 75 80 Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg 85 90 95 Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Thr Gly 100 105 110 Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 130 135 140 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 145 150 155 160 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 165 170 175 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 180 185 190 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 195 200 205 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 210 215 220 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 245 250 255 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 260 265 270 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 275 280 285 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 290 295 300 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 305 310 315 320 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 325 330 335 Pro Gly Lys <210> 41 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Leu His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu 1 5 10 15 Asn Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys 20 25 30 Tyr Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile 35 40 45 Thr Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu 50 55 60 Thr Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln 65 70 75 80 Cys Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys 85 90 95 Arg Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Thr 100 105 110 Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 130 135 140 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 145 150 155 160 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 165 170 175 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 180 185 190 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 195 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Thr Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 47 His His His His His His 1 5 <210> 48 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(100) <223> Lys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (212)..(212) <223> Asn or Ala <400> 48 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr 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Claims (76)

  1. 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정하였을 때 단백질 불순물에 대해 최소한 95% 순도의 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 10-8 M 미만의 BMP2 또는 BMP4에 대한 해리상수를 나타내는 폴리펩티드.
  4. 서열 번호: 7의 아미노산 서열에 최소한 95% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 당화된 폴리펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, 동물에서 뼈 형성을 촉진 또는 뼈 미네랄 밀도를 증가시키는 폴리펩티드.
  7. 청구항 1에 있어서, CHO 세포에서 발현에 의해 만들어지는 폴리펩티드.
  8. 청구항 1의 두 개 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체(homodimer).
  9. 청구항 1의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조제물.
  10. 청구항 9에 있어서, 실질적으로 발열물질 없는 약제학적 조제물.
  11. 청구항 1의 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 청구항 11에 있어서, 서열 번호: 12의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 11의 폴리뉴클레오티드에 작용가능하도록 링크된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  14. 청구항 11의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질변환된 세포.
  15. 청구항 14에 있어서, 포유류 세포인 형질변환된 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, CHO 세포 또는 인간 세포인 형질변환된 세포.
  17. a) 청구항 11의 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질변환된 세포를 가용성 ALK 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 세포를 배양하고; 그리고
    b) 발현된 BMP-결합 ALK3 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, ALK3 폴리펩티드를 만드는 방법.
  18. 뼈 성장을 촉진시키고, 골밀도를 증가시키고 또는 or increasing 골강도를 증가시키는 방법으로서, 다음에서 선택된 BMP 또는 ALK3 길항제의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법:
    a) 서열 번호: 3에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 서열 번호: 3으로부터 선택된 최소한 50개 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    c) BMP2에 결합하고, BMP2 및 ALK3 사이에 상호작용을 억제하는 항체;
    d) BMP4에 결합하고, BMP4 및 ALK3 사이에 상호작용을 억제하는 항체;
    e) ALK3에 결합하고, ALK3 및 하나 이상의 ALK3 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 항체.
  19. 청구항 18에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 다음중 하나 이상의 특징을 가지는 방법:
    i) 최소한 10-7 M의 KD로 ALK3 리간드에 결합함; 그리고
    ii) 세포에서 ALK3 신호생성을 억제함.
  20. 청구항 19에 있어서, 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드 도메인에 추가하여, 생체내 안전성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 및/또는 정제중 하나 이상을 강화시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인 및 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 부분을 포함하는, 방법.
  22. 청구항 18에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 당화된 아미노산, PEGylated 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도화된 물질에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들을 포함하는, 방법.
  23. BMP 또는 ALK3 길항제의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 뼈-관련 질환 치료 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, BMP 또는 ALK3 길항제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법:
    a) 서열 번호: 3에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 서열 번호: 3으로부터 선택된 최소한 50개 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    c) BMP2에 결합하고, BMP2 및 ALK3 사이에 상호작용을 억제하는 항체;
    d) BMP4에 결합하고, BMP4 및 ALK3 사이에 상호작용을 억제하는 항체;
    e) ALK3에 결합하고, ALK3 및 하나 이상의 ALK3 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 항체.
  25. 청구항 24에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 다음중 하나 이상의 특징을 가지는 방법:
    i) 최소한 10-7 M의 KD로 ALK3 리간드에 결합함; 그리고
    ii) 세포에서 ALK3 신호생성을 억제함.
  26. 청구항 25에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드 도메인에 추가하여, 생체내 안전성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 및/또는 정제중 하나 이상을 강화시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인 및 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 부분을 포함하는, 방법.
  28. 청구항 23에 있어서, (a) 또는 (b)의 폴리펩티드는 당화된 아미노산, PEGylated 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도화된 물질에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들을 포함하는, 방법.
  29. 청구항 23에 있어서, 뼈 관련 질환은 1차 골다공증 및 2차 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  30. 청구항 23에 있어서, 뼈-관련된 질환은 폐경후 골다공증, 성선기능저하(hypogonadal) 골 상실, 종양에 의해 유도된 골 상실, 암 요법에 의해 유도된 골 상실, 골질 전이, 다발성 골수종 및 Paget 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  31. 청구항 23에 있어서, 제 2 뼈-활성제의 투여를 더 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 뼈-활성제는 비스포스포네이트, 에스트로겐, 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 칼슘 보충제 및 비타민 D 보충제로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  33. 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  34. 청구항 33에 있어서, 아미노산은 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 97% 동일한, 폴리펩티드.
  35. 청구항 33에 있어서, 아미노산은 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 98% 동일한, 폴리펩티드.
  36. 청구항 33에 있어서, 아미노산은 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일한, 폴리펩티드.
  37. 청구항 33에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열인, 폴리펩티드.
  38. 청구항 33에 있어서, 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열로 구성된, 폴리펩티드.
  39. 청구항 33에 있어서, 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 97% 동일한 아미노산 서열로 구성된, 폴리펩티드.
  40. 청구항 33에 있어서, 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 98% 동일한 아미노산 서열로 구성된, 폴리펩티드.
  41. 청구항 33에 있어서, 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일한 아미노산 서열로 구성된, 폴리펩티드.
  42. 청구항 33에 있어서, 서열 번호: 11, 14, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40 및 41로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된, 폴리펩티드.
  43. 청구항 33에 있어서, 당화된 폴리펩티드.
  44. 청구항 33에 있어서, 동물에서 뼈 형성을 촉진시키거나 또는 뼈 미네랄 밀도의 증가를 촉진하는, 폴리펩티드.
  45. 청구항 33에 있어서, CHO 세포에서 발현에 의해 만들어지는, 폴리펩티드.
  46. 청구항 33의 2개 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체.
  47. 청구항 33의 폴리펩티드 또는 청구항 46의 동종이량체 및 약제학적으로 수용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조제물.
  48. 청구항 47에 있어서, 실질적으로 발열물질이 없는 약제학적 조제물.
  49. 서열 번호: 12, 15, 19, 21, 24, 27, 32 및 37의 임의의 핵산의 보체에 스트린젼트(stringent) 조건하에 하이브리드되는 단리된 핵산.
  50. 청구항 49의 단리된 핵산 서열을 포함하는 세포.
  51. 청구항 50에 있어서, 세포는 CHO 세포.
  52. 서열 번호:1의 위치 25 내지 31중 임의의 위치에서 시작하고, 그리고 서열 번호:1의 위치 140 내지 152중 임의의 위치에서 끝나는 인간 ALK3의 세포외 도메인의 제 1 아미노산 서열과 이종 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  53. 청구항 52에 있어서, 이종 아미노산 서열은 항체의 불변 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  54. 청구항 52에 있어서, 이종 아미노산 서열은 IgG의 Fc 도메인을 포함하는, 폴리펩티드.
  55. 청구항 54에 있어서, IgG는 인간 IgG1인, 폴리펩티드.
  56. 서열 번호:3의 아미노산 8 내지 117의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것으로 포함하는, 뼈 성장을 촉진시키고, 골밀도를 증가시키고 또는 골강도를 증가시키는 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 폴리펩티드는 다음중 하나 이상의 특징을 가지는 방법:
    i) 최소한 10-7 M의 KD로 ALK3 리간드에 결합함; 그리고
    ii) 세포에서 ALK3 신호생성을 억제함.
  58. 청구항 56에 있어서, 폴리펩티드는 인간 BMP6에 실질적으로 결합하지 않는, 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 폴리펩티드는 인간 BMP7에 실질적으로 결합하지 않는, 방법.
  60. 청구항 56에 있어서, 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드 도메인에 추가하여, 생체내 안전성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 및/또는 정제중 하나 이상을 강화시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인 및 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 부분을 포함하는, 방법.
  62. 청구항 56에 있어서, 폴리펩티드는 당화된 아미노산, PEGylated 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도화된 물질에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들을 포함하는, 방법.
  63. 서열 번호:3의 아미노산 8 내지 117의 아미노산 서열에 최소한 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 것으로 포함하는, 뼈-관련 질환을 치료하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 폴리펩티드는 다음중 하나 이상의 특징을 가지는 방법:
    i) 최소한 10-7 M의 KD로 ALK3 리간드에 결합함; 그리고
    ii) 세포에서 ALK3 신호생성을 억제함.
  65. 청구항 63에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:3의 아미노산 8 내지 117의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  66. 청구항 63에 있어서, 폴리펩티드는 ALK3 폴리펩티드 도메인에 추가하여, 생체내 안전성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 및/또는 정제중 하나 이상을 강화시키는 하나 이상의 폴리펩티드 부분을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인 및 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 부분을 포함하는, 방법.
  68. 청구항 63에 있어서, 폴리펩티드는 당화된 아미노산, PEGylated 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도화된 물질에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들을 포함하는, 방법.
  69. 청구항 63에 있어서, 뼈 관련 질환은 1차 골다공증 및 2차 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  70. 청구항 63에 있어서, 뼈-관련된 질환은 폐경후 골다공증, 성선기능저하 골 상실, 종양에 의해 유도된 골 상실, 암 요법에 의해 유도된 골 상실, 골질 전이, 다발성 골수종 및 Paget 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  71. 청구항 63에 있어서, 제 2 뼈-활성제의 투여를 더 포함하는, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 뼈-활성제는 비스포스포네이트, 에스트로겐, 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 칼슘 보충제 및 비타민 D 보충제로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  73. (a) a BMP 또는 ALK3 길항제; 그리고
    (b) 제 2 뼈 활성제를 포함하는 약제학적 조제물.
  74. a) BMP 또는 ALK3 길항제 폴리펩티드와 경쟁적으로 ALK3 폴리펩티드의 리간드-결합 도메인에 결합하는 테스트 물질을 확인하고; 그리고
    b) 조직 성장에 이 물질의 효과를 평가하는 것을 포함하는 방법으로 뼈 성장을 촉진 또는 골밀도를 증가시키는 물질을 확인하는 방법.
  75. 뼈 관련 질환 치료용 약물 제조에 BMP 또는 ALK3 길항제 폴리펩티드의 용도.
  76. BMP 또는 ALK3 길항제의 유효량을 개체에게 투여하는 것으로 포함하는, 뼈-관련 질환을 치료하는 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101805201B1 (ko) 2009-03-30 2017-12-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 Ｂｍｐ-ａｌｋ3 길항제 및 골 성장을 촉진시키는 사용되는 이의 용도
US9932386B2 (en) 2011-04-20 2018-04-03 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin polypeptides and uses thereof
KR101421171B1 (ko) 2011-08-31 2014-07-22 재단법인 제이씨비 공동생물과학연구소 인간 골형성 단백질 수용체 1ａ의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
WO2013032248A2 (ko) * 2011-08-31 2013-03-07 재단법인 제이씨비 공동생물과학연구소 인간 골형성 단백질 수용체 1ａ의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
EP2844668A1 (en) 2012-05-03 2015-03-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and pharmaceutical composition for use in the treatment and diagnotic of anemia of inflammation
CN105658672A (zh) * 2013-08-22 2016-06-08 阿塞勒隆制药公司 TGF-β受体II型变体及其用途
AU2014339898B2 (en) * 2013-10-25 2020-07-23 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin peptides to treat fibrotic diseases
EP3268025B1 (en) 2015-03-10 2020-05-06 University of Massachusetts Targeting gdf6 and bmp signaling for anti-melanoma therapy
EP3280435B1 (en) 2015-04-06 2021-06-02 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
EP3865505A1 (en) 2015-04-06 2021-08-18 Acceleron Pharma Inc. Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof
JP2016204292A (ja) * 2015-04-21 2016-12-08 国立大学法人 熊本大学 Ｂｍｐ７変異体とアルブミンとの融合体、及び該融合体を含む腎疾患治療剤
CN105254764A (zh) * 2015-08-27 2016-01-20 上海康岱生物医药技术有限公司 ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途
BR112019000790A2 (pt) 2016-07-15 2019-07-02 Acceleron Pharma Inc composições e métodos para tratar hipertensão pulmonar
CN109996817A (zh) 2016-09-15 2019-07-09 艾科赛扬制药股份有限公司 扭转原肠胚形成多肽及其用途
WO2018067874A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Variant actriib proteins and uses thereof
EP3875117A4 (en) 2018-10-31 2022-11-09 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. INHIBITOR OF RETINAL GANGLIONE CELL DEATH
KR20230066044A (ko) * 2020-09-10 2023-05-12 샨시 마이콧 테크놀로지 컴퍼니 리미티드 이중특이적 융합 폴리펩타이드 화합물
WO2022240948A1 (en) * 2021-05-11 2022-11-17 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using alk2 and alk3 antibodies

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
JP3362151B2 (ja) 1992-11-17 2003-01-07 ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ アクチビンレセプター状キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする単離核酸分子、及び、これを用いた発現ベクタ、組み換え細胞、単離タンパク質、単離抗体
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US6291206B1 (en) 1993-09-17 2001-09-18 Genetics Institute, Inc. BMP receptor proteins
US6248554B1 (en) * 1993-11-24 2001-06-19 The Procter & Gamble Company DNA sequence coding for a BMP receptor
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5863738A (en) * 1994-04-29 1999-01-26 Creative Biomolecules, Inc. Methods of antagonizing OP-1 binding to a cell surface receptor utilizing ALK polypeptides
JPH07313169A (ja) 1994-05-26 1995-12-05 Nippon Ham Kk 骨形成因子受容体改変体の遺伝子
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
DE69636866D1 (en) 1995-04-11 2007-03-15 Gen Hospital Corp Reverse "two-hybrid"-systeme
GB9526131D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
CA2297489A1 (en) 1997-07-30 1999-02-11 Emory University Novel bone mineralization proteins, dna, vectors, expression systems
US6696260B1 (en) 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
AU6059099A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
WO2001053455A2 (en) 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US6630304B1 (en) * 2000-09-14 2003-10-07 Decode Genetics Ehf. Human osteoporosis gene
EP2141243A3 (en) 2000-10-16 2010-01-27 Brystol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
SI2116259T1 (sl) * 2001-05-24 2012-11-30 Zymogenetics Inc Taci imunoglobulin fuzijski proteini
KR20050083635A (ko) 2002-08-16 2005-08-26 와이어쓰 Ｂｍｐ-2 에스트로겐 반응 요소 및 이의 사용 방법
WO2005014650A2 (en) * 2003-06-16 2005-02-17 Celltech R & D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods for increasing bone mineralization
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
MX2007005884A (es) 2004-11-16 2008-02-12 Amgen Mountain View Inc Andamios de proteina y usos de los mismos.
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
ES2353117T3 (es) * 2005-09-28 2011-02-25 Zymogenetics, Inc. Antagonistas de il-17a e il-17f y métodos de uso de los mismos antagonistas de il-17a e il-17f y métodos de uso de los mismos.
KR20080056241A (ko) * 2005-09-28 2008-06-20 지모제넥틱스, 인코포레이티드 Ｉｌ-17ａ 및 ｉｌ-17ｆ 길항제 및 그것의 사용 방법
UA98447C2 (ru) * 2005-11-23 2012-05-25 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА- ActRIIa И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СОДЕЙСТВИЯ РОСТУ КОСТЕЙ
KR20150115961A (ko) 2005-11-23 2015-10-14 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
JP5632582B2 (ja) * 2006-12-14 2014-11-26 中外製薬株式会社 抗Ｃｌａｕｄｉｎ３モノクローナル抗体およびそれを用いる癌の治療および診断
WO2009025651A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
KR101805201B1 (ko) 2009-03-30 2017-12-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 Ｂｍｐ-ａｌｋ3 길항제 및 골 성장을 촉진시키는 사용되는 이의 용도

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