KR20170088836A

KR20170088836A - Actrii 리간드 트랩을 사용한 심혈관계 질환의 치료

Info

Publication number: KR20170088836A
Application number: KR1020177012406A
Authority: KR
Inventors: 키이스 흐루스카; 이푸 팽; 윌리엄 스미스; 니안항 첸
Original assignee: 셀진 코포레이션; 워싱턴 유니버시티
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2015-10-08
Publication date: 2017-08-02
Also published as: MA41052A; AU2021203571A1; EP3204118B1; CA2964129A1; IL251649B; EP3204118A1; CN107206255A; TW201625288A; US11813308B2; EP3204118A4; AU2015339786A1; HK1244741A1; WO2016069234A1; US20170304397A1; IL251649A0; RU2017115720A; RU2017115720A3; MX2017004675A; TW202300170A; JP2017533191A

Abstract

본 발명은 바이오마커(biomarker), 상세하게는, 스네일 상동체 I(snail homolog I)(Snai1), 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질(urinary protein), dickkopf 상동체 I(Dkk1), 콜라겐 1형 알파 1(col1a1), 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 런트(runt) 관련 전사인자 2(Runx2), 알칼리 포스파타제(Alp), 골 특이적 알칼리 포스파타제(bone-specific alkaline phosphatase)(BSAP), 오스테릭스, Klotho(Klotho), 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)(알파-SMA), 미오카르딘(myocardin)(JVIYOC), 액티빈 수용체 2A형 (AtRIIA), 축 억제 단백질 2(axis inhibition protein 2)(Axin2), 및/또는 평활근 단백질 22-알파(Sm22-알파)의 수준 을 치료에 대한 대상체의 반응, 치료의 효능, 또는 액티빈 II형 수용체(ActRII) 신호전달 억제제를 사용한 치료를 위한 적절한 투여량의 표지(들)로서 사용함으로써, 대상체에서 혈관 석회화 및/또는 심혈관 질환 및/또는 골흡수와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

ACTRII 리간드 트랩을 사용한 심혈관계 질환의 치료 {Treatment of Cardiovascular Disease Using ACTRII Ligand Traps}

1. 관련 출원에 대한 상호 참조

본 발명은 2014년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/062,021호; 2014년 11월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/078,321호; 2015년 1월 14일에 출원된 미국 가출원 제62/103,515호; 2015년 5월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/167,052호; 및 2015년 6월 2일에 출원된 미국 가출원 제62/170,015호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용 전체가 본 명세서에 참고로서, 모든 목적을 위해 포함된다.

2. 정부의 실시권

본 발명은 미국 국립보건원이 부여한 교부금 번호 DK070790 및 DK089137에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유하고 있다.

3. 서열목록

본 출원은 2015년 10월 6일 제작된 208 킬로바이트 크기의 파일명 12827_934_228_SeqListing.txt로 제출된 서열 목록과 함께 제출되었다. 상기 서열목록은 그 내용 전체가 본 명세서에 참고로서, 모든 목적을 위해 포함된다.

4. 분야

본원에는 액티빈 II형 수용체 (activin type II receptor) 신호전달 억제제 (ActRII signaling inhibitor, 예를 들어, 액티빈 리간드 트랩(activin ligand trap))를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 보다 상세하게는, 본원에는 치료에 대한 대상체의 반응, 치료의 효능, 또는 액티빈 II형 수용체(ActRII) 신호전달 억제제를 사용한 치료에 대한 적절한 투여량의 표지(들)로서, 하나 이상의 바이오마커(biomarker), 상세하게는, 스네일 상동체 1(snail homolog 1)(Snai1), 포스포스마드(phosphomad)2, 포스포스마드3, 요단백질(urinary protein), dickkopf 상동체 1(Dkk1), 콜라겐 1형 알파 1(col1a1), 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 런트(runt) 관련 전사인자 2(Runx2), 알칼리 포스파타제(Alp), 골 특이적 알칼리 포스파타제(bone-specific alkaline phosphatase)(BSAP), 오스테릭스, C-말단 1형 콜라겐 텔로펩티드(CTX), 클로토(Klotho), 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)(알파-SMA), 미오카르딘(myocardin)(MYOCD), 축 억제 단백질 2(axis inhibition protein 2)(Axin2), 및/또는 평활근 단백질 22-알파(Sm22-알파)의 수준 및/또는 활성을 사용함으로써, 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 증가된 수준의 동맥 경직도, 좌심실비대, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환, 좌심실비대와 관련되거나 및/또는 좌심실비대에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환의 치료를 위한 대상체를 선택하는 선택하는 방법이 제공된다. 본원에는 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 골흡수(bone resorption)를 감소시키는 방법이 제공된다. 보다 상세하게는, 본원에는 하나 이상의 바이오마커, 상세하게는, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈 (예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, 오스테릭스, CTX, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 치료에 대한 대상체의 반응, 치료의 효능, 또는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료를 위한 적절한 투여량의 지표(들)로서 사용함으로써, 골흡수의 감소를 위한 대상체를 선택하는 방법이 제공된다.

5. 배경기술

빈혈을 포함한 신장병의 일반적인 합병증은, 많은 경우 심혈관계 질환을 초래하는 혈관 석회화이다. 신장 환자에서, 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 이에 따른 심혈관계 질환은 신장병 자체와 관련된 사망률 이외에 상당한 사망률을 초래할 수 있다. 이와 같이, 신장 환자의 심혈관계 질환을 위한 신규한 약물과 치료 법 및/또는 예방 방법의 발견 및 개발에 대한 필요성이 지속되고 있다. 추가적으로, 신장 환자는 빈혈로 자주 고통받기 때문에, 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)과 같은 현재 사용되는 적혈구 생성 자극제(ESA)가 보유하지 않는 단일 요법으로 빈혈 및 이에 수반되는 심혈관계 질환을 치료하는 것이 유익할 것이다.

2개의 관련 II형 수용체인 ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈에 대한 II형 수용체로서 확인되었다(Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈 외에, BMP7, Nodal, GDF8, 및 GDF11을 포함한 여러 상이한 TGF-베타 계열 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다(Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4는 액티빈, 상세하게는 액티빈 A에 대한 주요한 I형 수용체이고, ALK-7은 액티빈, 상세하게는 액티빈 B에 대한 수용체로서 작용할 수 있다.

액티빈 수용체 IIA형(ActRIIA)의 세포외 도메인(domain) 및 인간 IgG1 Fc으로 구성된 인간화 융합 단백질(humanized fusion-protein)로 이루어진 액티빈 리간드 트랩 (본원에서는 ActRIIA-hFc 또는 "소타터셉트(Sotatercept)"로 지칭됨; 서열 7 (SEQ ID NO:7))은 말기 신장병(ESRD)과 관련된 빈혈 및 뼈 장애 환자뿐 아니라, 베타-지중해빈혈(thalassemia) 환자의 치료를 위해 II상 임상 시험에서 현재 평가되고 있다. 건강한 폐경후의 여성에서, ActRIIA-hFc는 헤마토크리트(hematocrit)(Hct) 및 헤모글로빈(Hgb)뿐 아니라 골밀도(bone mineral density)를 상당히 증가시키는 것으로 나타났다.

6. 요약

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 액티빈 수용체 2A형(ActRIIA)의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다. 예를 들어, 기준 집단의 설명에 대해서는 8.6 부분 참조.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 포함하고, 상기 심혈관계 질환은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한다.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 포함하고, 상기 심혈관계 질환은 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한다.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 골흡수를 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 동맥 경직을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다.

본 발명은 약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 좌심실비대를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 대상체는 (a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2; (b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp; (c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1; (d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; (e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1; (f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1; (g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈); (h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP; (i) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스; (j) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX; (k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho; (l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA; (m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD; (n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파; (o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3; (p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는 (q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 15 mg, 약 30 mg, 약 45 mg, 약 60 mg, 약 75 mg, 약 90 mg, 또는 약 1 g, 또는 약 0.1 mg/kg, 약 0.13 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.26 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 또는 약 1.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 0.1 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 0.3 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 0.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 0.7 mg/kg이다.

특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 (i) 28일에 한번; 또는 (ii) 42일에 한번 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 14일에 한번 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 21일에 한번 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 지속적 및/또는 무기한적으로 투여된다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크다.

특정 실시양태에서, 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

특정 실시양태에서, 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 상기 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 심혈관계 질환은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 심혈관계 질환은 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 골흡수를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 골흡수는 8.6 부분에 기재된 바와 같이 평가된다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 동맥 경직을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 동맥 경직은 8.6 부분에 기재된 바와 같이 평가된다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

본 발명은 (a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계; (b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및 (d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 좌심실비대를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 투여량은 8.3.4 부분에 기재된 바와 같이 조절된다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 15 mg, 약 30 mg, 약 45 mg, 약 60 mg, 약 75 mg, 약 90 mg, 또는 약 1 g 또는 약 0.1 mg/kg, 약 0.13 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.26 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 또는 약 1.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 0.1 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 0.3 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 0.5 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 0.7 mg/kg이다.

특정 실시양태에서, 상기 초기 투여량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 상기 초기 투여량은 (i) 28일에 한번; (ii) 42일에 한번 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 상기 초기 투여량은 14일에 한번 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 상기 초기 투여량은 21일에 한번 투여된다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량은, (a) Runx2의 수준이 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가; (b) Alp의 수준이 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가; (c) Snai1의 수준이 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가; (d) 포스포스마드2의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가; (e) Dkk1의 수준이 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가; (f) col1a1의 수준이 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가; (g) 액티빈의 수준이 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가; (h) BSAP의 수준이 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가; (i) CTX의 수준이 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가; (j) 오스테릭스의 수준이 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가; (k) Klotho의 수준이 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소; (l) 알파-SMA의 수진이 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소; (m) MYOCD의 수준이 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소; (n) Sm22-알파의 수준이 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소; (o) 포스포스마드3의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가; (p) 요단백질의 수준이 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가; (q) ActRIIA의 수준이 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소; 및/또는 (r) Axin2의 수준이 기준 집단에서 Axin2의 수준에 비해 감소된 경우에 초기 투여량에 비해 많다.

특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 많거나, 초기 투여량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 많다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 더 자주 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 또는 40일 마다 투여된다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량은, (a) Runx2의 수준이 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 감소; (b) Alp의 수준이 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 감소; (c) BSAP의 수준이 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 감소; (d) Snai1의 수준이 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 감소; (e) 포스포스마드2의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 감소; (f) Dkk1의 수준이 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 감소; (g) col1a1의 수준이 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 감소; (h) 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준이 기준 집단에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준에 비해 감소; (i) CTX의 수준이 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 감소; (j) 오스테릭스의 수준이 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 감소; (k) Klotho의 수준이 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 증가; (l) 알파-SMA의 수진이 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 증가; (m) MYOCD의 수준이 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 증가; (n) Sm22-알파의 수준이 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 증가; (o) 포스포스마드3의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 감소; (p) 요단백질의 수준이 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 감소; (q) ActRIIA의 수준이 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 증가; 및/또는 (r) Axin2의 수준이 기준 집단에서 Axin2의 수준에 비해 증가된 경우에 초기 투여량에 비해 적다.

특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 적거나, 초기 투여량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 적다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 덜 자주 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 또는 90일 마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 조절된 투여량은 지속적 및/또는 무기한적으로 투여된다.

특정 실시양태에서, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시된다. 특정 실시양태에서, 상기 1차 측정은 치료의 개시 직후에 실시되거나, 치료 개시한 지 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시된다. 특정 실시양태에서, 상기 2차 측정은 치료의 개시 직후에 실시되거나, 치료 개시한 지 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 내에 실시된다.

특정 실시양태에서, (a) 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고; 및/또는 (b) 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

특정 실시양태에서, (a) 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고; 및/또는 (b) 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

특정 실시양태에서, (a) 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고; 및/또는 (b) 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

특정 실시양태에서, (a) 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고; 및/또는 (b) 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준이다. 특정 실시양태에서, 상기 단백질 수준은 효소결합 면역흡착 에세이(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 ELISA는 (a) Runx2 수준을 측정하기 위한 Runx2 특이 항체 SC-390715(Santa Cruz)); (b) Alp 수준을 측정하기 위한 Alp 특이 항체 SC-98652(Santa Cruz); (c) Snai1 수준을 측정하기 위한 Snai1 특이 항체 sc-393172(Santa Cruz); (d) 포스포스마드2 수준을 측정하기 위한 포스포스마드2 특이 항체 sc-101801(Santa Cruz); (e) Dkk1 수준을 측정하기 위한 Dkk1 특이 항체 sc-374574(Santa Cruz); (f) col1a1 수준을 측정하기 위한 col1a1 특이 항체 sc-8784(Santa Cruz); (g) 액티빈 수준을 측정하기 위한 액티빈 특이 항체 A1594(Sigma Aldrich); (h) BSAP 수준을 측정하기 위한 BSAP 특이 항체 SC-98652(Santa Cruz); (i) CTX 수준을 측정하기 위한 CTX 특이 항체 ABIN1173415 (Antibodies Online); (j) 오스테릭스 수준을 측정하기 위한 오스테릭스 특이 항체 SC-22538(Santa Cruz); (k) Klotho 수준을 측정하기 위한 Klotho 특이 항체 SC-22218(Santa Cruz); (l) 알파-SMA 수준을 측정하기 위한 알파-SMA 특이 항체 SC-53142(Santa Cruz); (m) MYOCD 수준을 측정하기 위한 MYOCD 특이 항체 SC-21561(Santa Cruz); (n) Sm22-알파 수준을 측정하기 위한 Sm22-알파 특이 항체 SC-271719(Santa Cruz); (o) 포스포스마드3 수준을 측정하기 위한 포스포스마드3 특이 항체 sc-11769(Santa Cruz); 및/또는 (p) ActRIIA 수준을 측정하기 위한 ActRIIA 특이 항체 ab 135634(Abcam)를 사용하여 수행된다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준이다. 특정 실시양태에서, 상기 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)(qRT-PCR)에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 qRT-PCR은 (a) Runx2 수준을 측정하기 위한 Runx2 특이 프라이머(서열 48 및 49); (b) Alp 수준을 측정하기 위한 Alp 특이 프라이머(서열 50 및 51); (c) Snai1 수준을 측정하기 위한 Snai1 특이 프라이머(서열 78 및 79); (d) Dkk1 수준을 측정하기 위한 Dkk1 특이 프라이머(서열 80 및 81); (e) col1a1 수준을 측정하기 위한 col1a1 특이 프라이머(서열 82 및 83); (f) 액티빈 수준을 측정하기 위한 액티빈 특이 프라이머(서열 84 및 85); (g) 오스테릭스 수준을 측정하기 위한 오스테릭스 특이 프라이머(서열 52 및 53); (h) Klotho 수준을 측정하기 위한 Klotho 특이 프라이머(서열 54 및 55); 및/또는 (i) Sm22-알파 수준을 측정하기 위한 Sm22-알파 특이 프라이머(서열 56 및 57)를 사용하여 수행된다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈 (예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포스포스마드3, 요단백질, 포스포스마드2, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 액티빈 수준은 혈청에 존재한다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈 (예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 대동맥에 존재한다.

특정 실시양태에서, 혈관 석회화는 석회화성 죽상동맥경화증(calcific atherosclerosis), 석회화성 중막 혈관병증(calcific medial vasculopathy)(또한, 뫼케베르그 중막 석회화성 경화증(Monckeberg's medial calcific sclerosis)으로 공지), 중막 석회화, 탄력섬유증(elastocalcinosis), 석회화 요독성 세동맥병증(calcific uremic arteriolopathy), 석회화성 대동맥 판막 협착증(calcific aortic valvular stenosis), 또는 간문맥 석회화이다.

특정 실시양태에서, 상기 심혈관계 질환은 죽상동맥경화증, 고지혈증, 골다공증, 고혈압, 염증, 2형 당뇨병, 말기 신장병, 필수 절단(required amputation), 탄력 섬유성 가황색종(pseudoxanthoma elasticum), 선천성 이엽성 판막(congenital bicuspid valve), 류마티스성 심장질환, 문맥압 항진증, 또는 간질환과 같은 혈관 석회화와 관련된 질병이다.

특정 실시양태에서, 상기 심혈관계 질환은 만성 신장병에 대해 부수적이다. 특정 실시양태에서, 상기 만성 신장병은 3, 4, 또는 5 단계의 만성 신장병이다. 특정 실시양태에서, 상기 만성 신장병은 만성 신장병 미네랄 뼈 질환이다.

특정 실시양태에서, 대상체는 고-교체 뼈 질환(high turnover bone disease), 예를 들어 고-교체 신성 골이영양증(renal osteodystrophy)(ROD)을 갖는다.

또한, 본원에는 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 고-교체 뼈 질환, 예를 들어 고-교체 ROD를 치료하는 방법이 제공된다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는, (a) 서열 2와 90% 동일; (b) 서열 2와 95% 동일; (c) 서열 2와 98% 동일; (d) 서열 2; (e) 서열 3과 90% 동일; (f) 서열 3과 95% 동일; (g) 서열 3과 98% 동일; (h) 서열 3; (i) 서열 6과 90% 동일; (j) 서열 6과 95% 동일; (k) 서열 6과 98% 동일; (l) 서열 6; (m) 서열 7과 90% 동일; (n) 서열 7과 95% 동일; (o) 서열 7과 98% 동일; (p) 서열 7; (q) 서열 12와 90% 동일; (r) 서열 12와 95% 동일; (s) 서열 12와 98% 동일; (t) 서열 12; (u) 서열 17과 90% 동일; (v) 서열 17과 95% 동일; (w) 서열 17과 98% 동일; (x) 서열 17; (y) 서열 20과 90% 동일; (z) 서열 20과 95% 동일; (aa) 서열 20과 98% 동일; (bb) 서열 20; (cc) 서열 21과 90% 동일; (dd) 서열 21과 95% 동일; (ee) 서열 21과 98% 동일; 및 (ff) 서열 21로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 ActRII의 세포외 도메인 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질이다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 소타터셉트(서열 7; 예를 들어, 9 부분 참조)이다. 소타터셉트는 본원에 기재된 방법에 유용한 액티빈 리간드 트랩이다(8 부분 참조).

특정 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다.

7. 도면의 간단한 설명
도 1a는 야생형 및 모의(sham) 모델에 비해 신장병의 간질섬유증 모델(CKD-3)에서 증가된 액티빈-A 수준(pg/ml)을 도시한다. 도 1b는 야생형(WT)에 비해 신장병의 알포트(Alport) 모델(AIport200d)에서 증가된 액티빈-A 수준 및 BMP-7으로 치료시 증가된 액티빈-A 수준을 도시한다.
도 2는 모의 모델에 비해 신장 및 CKD-3 모델의 대동맥(CKD-3 V)에서 증가된 액티빈 A(인히빈(inhibin) 베타) mRNA의 수준을 도시한다. mActRIIA-Fc를 사용한 치료는 CKD-3 모델(mActRIIA-Fc)에서 액티빈 A mRNA를 감소시킨다.
도 3a는 야생형 마우스 대동맥의 ACTRII의 수준을 도시한다. 도 3b는 모의치료된 마우스 대동맥의 ACTRII의 수준을 도시한다. 도 3c는 도 3a 및/또는 도 3b에 비해 CKD-3 모델의 마우스 대동맥에서 증가된 ACTRII의 수준을 도시한다. 도 3d는 도 3c에 비교할 때 mActRIIA-Fc 치료된 CKD-3 모델의 마우스 대동맥에서 감소된 ACTRII의 수준을 도시한다.
도 4a는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료의 존재(CKD3+ActRII-Fc) 및 부재(CKD3+v)시 만성 신장병의 마우스 모델에서 Runx2의 mRNA 수준을 도시한다. 도 4b는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료의 존재(CKD3+ActRII-Fc) 및 부재(CKD3+v)시 만성 신장병의 마우스 모델에서 Alp의 mRNA 수준을 도시한다. 도 4c는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료의 존재(CKD3+ActRII-Fc) 및 부재(CKD3+v)시 만성 신장병의 마우스 모델에서 Klotho의 mRNA 수준을 도시한다. 도 4d는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료의 존재(CKD3+ActRII-Fc) 및 부재(CKD3+v)시 만성 신장병의 마우스 모델에서 미오카르딘(MYOCD)의 mRNA 수준을 도시한다. 도 4e는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료의 존재(CKD3+ActRII-Fc) 및 부재(CKD3+v)시 만성 신장병의 마우스 모델에서 Sm22-알파(SM22α)의 mRNA 수준을 도시한다.
도 4f는 비히클(vehicle) 단독(CKD3+비히클) 치료된 CKD3 또는 모의치료된 CDK3에 비해 ActRII 신호전달 억제제(CKD3+ActRII-Fc)로 치료된 CKD-3의 모델에서 액틴 알파-평활근, Runx2, Klotho, MYOCD, 및 알파-튜불린(tubulin)의 단백질 수준을 도시한다.
도 5a는 비히클로 치료(veh. Rx)시 CKD-3 유도된 혈관 석회화를 도시한다. 도 5b는 ActRII 신호전달 억제제로 치료(mActRIIA-Fc Rx)시 CKD-3 유도된 혈관 석회화 감소를 도시한다.
도 6a는 야생형(wt), 모의처리(sham), 비히클로 처리된 CKD-3 모델(CKD-3 Veh)과 비교해 칼슘 수준에서의 CKD-3 유발된 증가(CKD-3 22 wk)를 도시한다. mActRIIA-Fc를 사용한 치료는 CKD-3 유발된 칼슘 축적을 감소시킨다. 도 6b는 야생형 마우스(wt), 모의치료된 마우스(sham), CKD-3의 마우스 모델(CKD-3), 또는 ActRII 신호전달 억제제로 치료된 CKD-3의 마우스 모델(mActRIIA-Fc)의 골 체적(bone volume)을 도시한다. 도 6c는 야생형 마우스(wt), 모의치료된 마우스(sham), CKD-3의 마우스 모델(CKD-3), 또는 ActRII 신호전달 억제제로 치료된 CKD-3의 마우스 모델(mActRIIA-Fc)의 파골세포(osteoclast) 수를 도시한다. 도 6d는 야생형 마우스(wt), 모의치료된 마우스(sham), CKD-3의 마우스 모델(CKD-3), 또는 ActRII 신호전달 억제제로 치료된 CKD-3의 마우스 모델(mActRIIA-Fc)의 파골세포 표면을 도시한다.
도 7a는 내피 특이적 Tie2-Cre(또한, "Tek-Cre"로도 지칭됨) 마우스에 교배된 GNZ 마우스(Stoller et al, Genesis, 2008)에서 실시된 바와 같은 세포 혈통 추적(lineage tracing)을 위한 계획을 도시한다. 도 7b는 모의 마우스의 내피 세포 혈통 추적을 도시한다. 도 7c는 CKD 마우스의 내피 세포 혈통 추적을 도시한다. 도 7d는 CKD 마우스의 내피 세포 혈통 추적을 도시한다.
도 8은 대상체 배치를 나타낸 것이다. 주의: "·"은 기준치 및 225일째에서 양측(paired) QCT 측정된 대상체들을 나타낸다. "*"은 위약을 투여받은 대상체가 증가된 혈청 에리쓰로포이에틴 수준을 가지며, 비-프로토콜 에리쓰로포이에틴 투여를 제안함을 나타낸다. "†"는 프로토콜 위반을 나타낸다. "‡"는 대상체가 29일째에 증가된 혈압에 대한 종결 규칙 기준을 충족하였으며, 연구 치료가 중단되고, 지속적인 추적 연구(follow-up)와 함께, 구조 요법이 36일째에 수행되었음을 나타낸다. 대상체는 기저선에서 불완전한 평가를 기본으로 하여, 비자격 혈압으로 인한 오차에 있어서 무작위로 나누었다.
도 9a는 각각의 치료 범주에서 대퇴 경부 피질골의 증가가 2%를 초과하는 대상체의 퍼센트(%)를 도시한다. 도 9b는 각각의 치료 그룹에서 요추의 지주골(trabecular bone) 골 중량의 임의의 증가 또는 감소를 갖는 대상체의 퍼센트(%)를 도시한다.
도 10a는 각각의 치료 범주에서 총 아가츠톤 점수(Agatston score)의 변화에 대한 대상체의 퍼센트(%)를 도시한다. 도 10b는 각각의 치료 범주에서 제곱근 변환된 총 체적 점수의 변화에 대한 대상체의 퍼센트(%)를 도시한다.
도 11은 위약(PBO), 또는 0.3 mg/kg(0.3) 또는 0.5 mg/kg(0.5)의 투여량의 ActRII 신호전달 억제제로 치료된 대상체에 대한 골흡수 바이오마커 CTX의 퍼센트 변화를 도시한다.
도 12a는 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 일주일에 2회 피하 투여되어 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)가 이눌린 클리어런스(inulin clearance)에 영향이 없었음을 나타낸다. 도 12b는 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 일주일에 2회 피하 투여되어 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)는 BUN에 영향이 없었음을 나타낸다. 도 12a 및 도 12b는 9.4.1.1 부분에 기재된 바와 같은 절제성(ablative) CKD를 이용한 혈관 석회화 모델을 이용하며, 이는 WT C57B6 마우스(WT)에 비해 이눌린 클리어런스 및 BUN으로 추정된 GFR의 70% 감소를 갖는 CKD-3(비히클 처리의 경우 CKD-3 V)으로 지칭되는 인간 CKD 3단계와 유사한 감소된 신장 기능을 생성하기 위해 사용되었다. 도 12c는 200일령의 Col4α5 결핍 마우스(알포트)가 인간 CKD 3-4단계와 동등한 이눌린 클리어런스의 감소를 갖는다는 것을 나타낸다. *p<0.05이다. 도 12d는 200일령의 Col4α5 결핍 마우스(알포트)가 인간 CKD 3-4단계와 동등한 BUN의 증가를 갖는다는 것을 나타낸다. *p<0.05이다.
도 13은 CKD가 순환계와 신장 및 대동맥 ActRIIA 발현에서 액티빈을 증가시킨다는 것을 나타낸다. "WT"=야생형이고; "sham"=모의 치료된 마우스이며; "CKD-3 V"=비히클로 치료된 마우스이고; "CKD-3 R"=mActRIIA-Fc로 치료된 마우스이다. 도 13a는 9.4.1.1 부분에 개시된 바와 같이 ldlr -/- 고 지방식 섭취 CKD-3 마우스 모델에서 CKD에 의한 순환 액티빈-A의 유도를 도시한다. 도 13b는 9.4.1.1 부분에 개시된 바와 같이 알포트 증후군 마우스에서 CKD에 의한 순환 액티빈-A의 유도를 도시한다. 도 13c는 마우스 신장 및 대동맥에서의 인히빈 베타A 발현을 나타낸다(액티빈-A는 인히빈 베타A 유전자의 동종이량체로 구성된다). 도 13d는 신장 균질물(homogenate)에서의 인히빈 베타A에 대한 단백질 수준을 나타낸다. 1, 2, 및 3은 개별 샘플을 의미한다. 도 13e는 대동맥 ActRIIA의 면역조직화학을 도시한다. ActRIIA 발현은 야생형(WT) 및 모의수술된 ldlr -/- 고 지방식 섭취 마우스(sham)의 대동맥에서 검출되었으며, 이는 비히클로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 V) 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 mActRIIA-Fc)에서 활성화되었다. 축적 바(bar)는 20 ㎛이다. 도 13f는 WT 및 모의 마우스에 비해 CKD-3 마우스(비히클로 치료된 CKD-3 V, 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 R)에서 순환 폴리스타틴(follistatin) 수준의 변화가 없음을 나타낸다. *p<0.05이고, ***p<0.005이다. 도 13g는 WT 및 모의 마우스에 비해 CKD-3 마우스(비히클로 치료된 CKD-3 V, 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 R)에서 순환 폴리스타틴 유사 3(Fstl3) 수준의 변화가 없다는 것을 나타낸다. *p<0.05이고, ***p<0.005이다.
도 14는 CKD가 내피 간엽 전환(endothelial to mesenchymal transition)을 활성화시켰음을 나타낸다. 도 14a는 마우스 사육 계획의 다이아그램을 도시한다. ROSA26GNZ 녹인(knock-in) 마우스(GNZ 마우스)는 핵 국부성 GFP-LacZ 리포터(reporter)의 발현을 예방하는 종결 코돈이 있는 서열을 갖는다. 내피 세포에서 Cre 리콤비나제(recombinase)(Cre)를 발현하는 Tek-Cre와 교배하는 경우, Cre 리콤비나제(Cre)는 loxP의 측면에 배치된 서열을 제거하며, 내피 기원의 모든 세포는 GNZ 리포터 단백질을 생성한다. 도 14b 내지 도 14d는 DAPI 핵 염색을 이용한 내피 세포 마커(marker)인 CD31 및 GFP에 대한 Tek-Cre/GNZ 마우스 대동맥의 이중 면역염색을 나타낸 것이다. 화살표들은 이중 염색된 내피 세포들을 가리킨다. 모의수술된 마우스(도 14b)에서는, 내피 세포들만이 핵 및 세포질 GFP 염색을 나타낸다. CKD3 마우스(도 14c 및 도 14d)에서는, 내피 세포에 더해, 대동맥 중막(media) 및 외막의 세포들이 GFP 염색을 나타낸다(화살표 촉). 축적 바는 20 ㎛이다. 도 14e는 EnMT(Medici, D., et al., 2008. Molecular Biology of the Cell 19:4875-4887)와 관련된 전사인자인 Snai 1의 대동맥 mRNA 수준이 야생형(WT) 마우스에 비해 75일령 알포트 마우스에서 증가함을 도시한다. 알파 튜불린은 로딩 대조군(loading control)으로서 이용되었다. 1 및 2는 개별 샘플들을 의미한다.
도 15는 CKD-3을 가진 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스에서 혈관 석회화에 대한 mActRIIA-Fc의 영향을 도시한다. 도 15a는 비히클(CKD-3 V) 및 mActRIIA-Fc(CKD-3 mActRIIA-Fc) 치료된 CKD-3 마우스로부터 근위 대동맥 죽상 동맥 경화증 플라크의 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색된 부분을 도시한다. 도 15b는 야생형(wt); 모의수술된 ldlr -/- 고 지방식 섭취한(sham); 치료 개시 시기인 22주에서 CKD-3 안락사(CKD-3); 22주부터 28주까지 비히클로 치료된 CKD-3(CKD-3 V); 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 22주부터 28주까지 일주일에 2회 피하 투여되어 치료된 CKD-3(CKD-3 R)의 마우스 그룹들의 대동맥 칼슘 수준을 도시한다. 박스는 중앙값(박스 내 선) 및 25 내지 75 퍼센타일의 사분범위(interquartile range)를 나타낸다. 오차 바는 사분범위의 1.5배를 나타낸다. p<0.05를 유의미한 차이에 대한 수준으로 하여, 다중 비교를 위해 아노바 홀름-시닥(ANOVA Holm-Sidak) 방법을 사용해 그룹을 비교하였다. * p<0.02이고, 각각의 그룹에 대한 n은 8 - 12이다.
도 16은 CKD 자극된 심장질환에 대한 ActRIIA 신호전달 감소의 효과를 나타낸다. 도 16a는 ldlr -/- 고 지방식 섭취 마우스의 CKD-3이 심장 무게를 모의치료된 마우스에 비해 증가시켰고, 이는 mActRIIA-Fc 처리 그룹에서 반전되었음을 나타낸다. CKD-3-L은 탄산란탄(lanthanum carbonate)으로 치료된 CKD-3 마우스를 의미한다. 도 16b는 CKD-3이 모의 마우스(좌측)에 비해 심장, 주로 좌심실 비대를 형성(중앙)하였고, 이는 mActRIIA-Fc 처리 그룹(우측)에서 예방됨을 나타낸다. 트리크롬 염색, 축적 바는 1mm이다. 도 16c는 보다 높은 배율에서 좌심실 근세포의 트리크롬 염색을 도시하며, 이는 심장 섬유증의 증거가 없음을 도시한다. 축적 바는 20 ㎛이다.
도 17은 ldlr -/- 고 지방식 섭취 CKD-3 마우스에서 동맥 경직에 대한 CKD-3 효과, 및 Dkk1 중화 효과의 부재를 나타낸다. 도 17a는 이전에 보고(Wagenseil, J.E., et al., 2009. Circulation Research 104:1217-1224; Wagenseil, J.E., et al., 2005. AJP - Heart and Circulatory Physiology 289:H1209-H1217.)된 좌측 총 경동맥과 같이 수행된 압력-직경 관계를 도시한다. 도 17b는 야생형(WT-28주), 모의수술(sham-28주), CKD-3(28주), 및 Dkk1 단일클론항체로 치료된 CKD-3(Dkk1 mab-28주) 마우스로부터의 상향대동맥을 도시한다. 도 17에 대해, 검정색은 WT 또는 모의수술된 마우스를 나타내는 동시에, 개방 또는 회색은 CKD-3 마우스를 나타낸다. 값들은 평균 ± 표준 편차로 표현된다. N = 경동맥에 대해 5-6마리의 마우스, 상향대동맥에 대해 3-6마리이다.
도 18은 신장 및 대동맥에서 ActRIIA 신호전달을 나타낸다. 도 18a는 모의, CKD-3 비히클(CKD-3 V) 및 mActRIIA-Fc(CKD-3 R) 치료된 마우스로부터 신장(좌측) 및 대동맥(우측) 균질물의 웨스턴(western)에 의해 측정된 액티빈 신호전달을 도시한다. 액티빈 수준은 신장 균질물에서 증가하였으나, 대동맥 균질물에서는 증가하지 않았으며, Alk4 (AcvR1B) 및 Alk2 (AcvR1) 1형 수용체는 신장 균질물에 존재하였으나, CKD-3는 Alk4 인산화반응을 증가시키지 않았다. Alk4 및 Alk1 (AcvRL1)은 대동맥 균질물에 존재하였다. CKD-3은 신장에서 smad2/3 인산화반응을 증가시켰으나, 대동맥에서는 증가시키지 않았으며, 신장 Col1A1 수준을 증가시켰다. mActRIIA-Fc 치료는 신장 포스포스마드2/3 및 Col1A1 수준을 감소시켰다. 대동맥에서는, 포스포스마드2/3 수준에 대한 CKD-3의 효과가 없었을 뿐 아니라, phosphoErk 1/2 수준에 대해서도 효과가 없었다. Runx2 수준은 CKD-3에 의해 증가되었으며, mActRIIA-Fc에 의해 정상화되었다. 도 18b는 CKD-3 마우스의 신장에서 Klotho mRNA 발현의 감소 및 mActRIIA-Fc 치료에 의한 이의 보정을 도시한다. 도 18c는 모의, CKD-3 비히클 및 mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 및 대동맥 균질물의 웨스턴에서 Dkk1 단백질 발현으로 표시된 바와 같은 Wnt 신호전달(좌측), 및 혈장 Dkk1 수준에 대한 CKD-3 및 mActRIIA-Fc의 효과(우측)를 도시한다.
도 19는 건강한 공여자(n=10)에 비해 3단계 CKD를 가진 환자들(n=30)의 혈장 액티빈-A 수준을 도시한다. 데이터는 시판되는 ELISA 키트(R&D systems, Minneapolis, MN)를 사용해 이중으로 샘플들을 측정함으로써 생성되었다. 변동 계수는 에세이에 대해 2.7%였다. *** p<0.002 스투덴트(student) t 시험.
도 20은 야생형 마우스(WT), 모의치료된 마우스(sham), CKD-3 마우스(CKD-3 V), 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)의 FGF-23의 수준을 도시한다.
도 21a는 야생형 마우스(WT), 모의수술된 마우스(sham), 비히클로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 V), 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)의 순환 액티빈 A의 수준을 도시한다. *은 p<0.005를 나타낸다. 도 21b는 모의수술된 마우스(sham), 비히클로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 V), 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)에 대한 조골세포 수/뼈 둘레(perimeter) 수/100 mm를 도시한다. CKD-3 V vs. CKD-3에 대해 p<0.05이다. 도 21c는 모의수술된 마우스(sham), 비히클로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 V), 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)에 대한 조골세포 표면/뼈 표면의 퍼센트를 도시한다. CKD-3 V vs. CKD-3에 대해 p<0.05이다. 도 21d는 모의수술된 마우스(sham), 비히클로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 V), 또는 mActRIIA-Fc로 치료된 CKD-3 마우스(CKD-3 R)에 대한 골형성 속도/조골세포를 도시한다. CKD-3 V vs. CKD-3에 대해 p<0.05이다.
도 22a는 표시된 투여량의 위약 또는 mActRIIA-Fc으로 치료시 연구의 과정을 통한 대상체 배치를 도시한다. y-축 상의 각각의 숫자는 개별 대상체를 나타낸다. 도 22b는 표시된 투여량의 위약 또는 mActRIIA-Fc으로 치료시 복부 대동맥 총 아가츠톤 점수로 <15% 진행을 갖는 대상체의 비율을 도시한다. 도 22c는 표시된 투여량의 위약 또는 mActRIIA-Fc으로 치료시 대퇴 경부 피질 BMD로 >2% 증가를 갖는 대상체의 비율을 도시한다.
도 23a는 ActRII의 세포외 도메인 및 IgG1의 Fc 도메인의 마우스 융합 단백질(mActRIIA-Fc)의 개략적인 다이아그램을 도시한다. 도 23b는 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스의 CKD-MBD에 대한 mActRIIA-Fc 효과의 실험 설계를 도시한다. 4개 그룹의 마우스들에게는 12주령에에서부터 고 지방 식을 섭취시켰다. 12주령에 모의수술(SO) 또는 전기소작 피질 손상(electrocautery cortical injury)(EC)을 수행하였다. 14주령에 SO 또는 대측성 신장절제술(contralateral nephrectomy)(NX)을 수행하였다. 22주령에, 비히클 치료 또는 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 일주일에 2회 피하 투여를 시작하였다. WT는 정상 참조 수준을 위한 정상식을 섭취한 야생형 마우스이다. sham은 모의수술된 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스이고; CKD-3은 치료의 시작시 혈관 칼슘의 수준을 수립하기 위해 22주령에 연구된 CKD-3 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스이며; CKD-3 V는 비히클 치료된 CKD-3 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스이고; CKD-3 R은 mActRIIA-Fc 치료된 CKD-3 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스이며; WT, sham, CKD-3 V 및 CKD-3 R 마우스들은 28주령에 안락사되었다.
도 24a는 대동맥 균질물의 ActRIIA에 대해 웨스턴에 의해 측정된 마우스 대동맥에서 ActRIIA의 발현을 도시한다. 도 24b는 도 24A의 면역블럿 정량(immunoblot quantitation)을 도시한다. 정량에 대해, n=4이고, **p<0.0l이다. 도 24c는 모의 마우스의 대동맥에서 ActRIIA의 면역형광 검출을 도시한다. 도 24d는 CKD-3 마우스의 대동맥에서 ActRIIA의 면역형광 검출을 도시한다. ActRIIA는 대동맥 VSMC에서 발현되었으나, 내피 세포에서 검출되지 않았다. VSMC ActRIIA 수준은 모의에 비해 CKD 검출 가능하도록 유지되었다. CD31(화살표)은 내피 세포 마커로 사용되었다. 핵은 DAPI에 의해 염색되었다. 축적 바는 20 ㎛이다.
도 25a는 CKD-3이 조골세포 단백질(Runx2 및 알칼리 포스파타제(Alpl))의 증가된 mRNA 발현, 및 감소된 수준의 대동맥 평활근 세포22α(Tagln)를 야기하고, 이는 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해 모두 반전되었음을 도시한다. 대동맥 미오카르딘(Myocd) 수준은 CKD에 의해 감소되었으나, mActRIIA-Fc에 의해서는 영향을 받지 않았다. 도 25b는 대동맥 균질물의 단백질에 대한 웨스턴을 도시한다. 도 25c는 도 25b의 웨스턴의 면역블럿 정량을 도시한다. CKD는 대동맥 α-평활근 세포 액틴 단백질의 감소된 수준 및 조골세포 Runx2의 증가된 수준을 야기하며, 이는 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해 반전되지만, 미오카르딘 수준은 변경되지 않았다. 정량에 대해, n=4이고, **p<0.01이다.
도 26a는 비히클로부터의 알리자린 레드를 이용한 근위 대동맥 죽상 대동맥 경화증 플라크의 염색된 부분을 보여주는, CKD-3을 갖는 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스에서 대동맥 석회화에 대한 CKD 및 ActRIIA 리간드 트랩의 효과를 도시한다. 도 26b는 CKD-3을 가지며, 알리자린 레드로 염색된 근위 대동맥 죽상 경화증 플라크에 의해 나타낸 바와 같이 mActRIIA-Fc로 치료된 ldlr-/- 고 지방식 섭취 마우스에서 대동맥 석회화에 대한 CKD 및 ActRIIA 리간드 트랩의 효과를 도시한다. 화살표 촉은 내막 (i) 및 m-중막에서 칼슘 축적을 가리킨다. 축적 바는 100 ㎛이다. 도 26c는 야생형(WT); 모의수술된 ldlr-/- 고 지방식 섭취(sham); 치료 개시 시기인 22주에서 CKD-3 안락사(CKD-3); 22주부터 28주까지 비히클로 치료된 CKD-3(CKD-3 V); 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 22주부터 28주까지 일주일에 2회 피하 투여되어 치료된 CKD-3(CKD-3 R)의 마우스 그룹들의 대동맥 칼슘 수준을 도시한다. 박스는 중앙값(박스 내 선) 및 25 내지 75 퍼센타일의 사분범위를 나타낸다. 오차 바는 사분범위의 1.5배를 나타낸다. p<0.05를 유의미한 차이에 대한 수준으로 하여, 다중 비교를 위해 아노바 홀름-시닥 방법을 사용해 그룹을 비교하였다. * p<0.02이고, 각각의 그룹에 대한 n은 8 - 12이다.
도 27a는 모의치료, CKD-3 비히클 치료 및 mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 대동맥 균질물의 웨스턴에 의한 ActRIIA 신호전달 에세이을 도시한다. 각 그룹의 동물들의 2개의 대동맥으로부터의 균질물의 면역블럿. CKD-3 마우스로부터의 대동맥 균질물에서 ActRIIA 및 액티빈(인히빈 β-A) 수준은 감소되었다. Alk4(AcvR1B) 및 Alk1(AcvRL1) 1형 수용체는 대동맥 균질물에 존재하였다. CKD-3은 mActRIIA-Fc 치료에 의해 증가되었던 대동맥의 smad2/3 인산화반응을 감소시켰다. CKD-3은 phospho-Erk 1/2 수준을 감소시켰다. Runx2 수준은 CKD-3에 의해 증가되었으며, mActRIIA-Fc 치료에 의해 정상화되었다. 도 27b는 p-Smad2/3 면역블럿 정량을 도시하며, n=4이고, **p<0.01이다.
도 28a는 야생형 마우스의 대동맥에서 베타-카테닌 발현의 면역형광 현미경 검사를 도시한다. 도 28b는 CKD 마우스의 대동맥에서 베타-카테닌 발현의 면역형광 현미경 검사를 도시한다. 혈관 평활근 세포의 베타-카테닌에 대한 면역형광은 없었다. CKD 마우스로부터의 대동맥의 내피에서 베타-카테닌 발현이 있었다. 화살표 촉은 내피 세포의 베타-카테닌 및 CD31 공국재화(colocalization)를 가리킨다. 축적 바는 20 ㎛이다. 도 28c는 대동맥 Axin2 mRNA 발현 수준을 도시한다. 도 28d는 모의 치료, CKD-3 V 및 CKD-3 R 치료된 마우스로부터의 대동맥 균질물의 웨스턴에서 Dkk1 단백질 발현 및 n=4인 면역블럿 정량에 의해 표시된 바와 같은 Wnt 신호전달의 에세이을 도시한다. 도 28e는 혈장 Dkk1 수준에 대한 CKD-3V 및 mActRIIA-Fc의 효과를 도시한다. *p<0.05이고, **p<0.01이다.
도 29a는 신장 Klotho mRNA 수준에 대한 mActRIIA-Fc 치료의 효과를 도시하며, CKD-3이 신장 균질물에서 Klotho 유전자 발현 수준을 감소시키고, mActRIIA-Fc 치료가 CKD- 3V에 비해 이를 상당히 증가시켰음을 나타낸다. *p<0.05이고, **p<0.01이며, ***p<0.005이다. 도 29b는 모의 치료, CKD-3 비히클 치료, 및 mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 균질물의 웨스턴에 의한 ActRIIA 신호전달의 에세이을 도시한다. 모든 면역블럿은 3개 또는 4개의 신장으로부터의 균질물을 대표한다. ActRIIA 수준은 CKD-3 또는 mActRIIA-Fc에 의해 영향을 받지 않았다. 액티빈 A(인히빈 β-A) 수준은 CKD-3 마우스의 신장 균질물에서 증가되었으며(정량은 도 30A-B에 나타내었다), mActRIIA-Fc에 의해 감소되었다. Alk4 (AcvR1B) 및 Alk2 (AcvR1) 1형 수용체는 신장 균질물의 단백질에 존재하였으나, CKD-3 V 또는 CKD-3 R은 Alk4 인산화반응에 상당한 영향을 주지는 않았다. CKD-3은 신장 smad2/3 인산화반응을 증가시켰으며, mActRIIA-Fc 치료는 신장 포스포스마드2/3을 감소시켰다. 도 29c는 *p<0.01인 도 29B의 면역블럿 정량을 도시한다.
도 30a는 CKD-3V mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 부분의 트리크롬 염색을 도시한다. 도 30b는 CKD-3V mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 부분의 트리크롬 염색을 도시한다. 도 30c는 CKD-3V mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 부분의 트리크롬 염색을 도시한다. 도 30d는 CKD-3 mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터의 신장 부분의 트리크롬 염색을 도시한다. 간질섬유증 영역은 화살표 촉으로 표시되었다. CKD-3 mActRIIA-Fc 치료된 마우스의 신장은 감소된 간질섬유증을 가졌다. 축적 바는 50 μm이다. 현미경 사진이 쵤영된 부위에 관한 모든 신장 관상 단면의 표시에 대해 도 35 참조. 도 30e는 요단백질에 대한 mActRIIA-Fc의 효과를 도시한다. CKD-3V 마우스에는 상당한 단백뇨가 있었으며, mActRIIA-Fc 치료에 의해 감소되었고, *p<0.05이다.
도 31a는 동맥 경화 ldlr-/- 고 지방식 섭취 CKD-3 마우스에서 CKD에 의한 순환 액티빈-A의 유도를 도시한다. 도 31b는 본원에 기재된 바와 같은 알포트 증후군 마우스에서 CKD에 의한 순환 액티빈-A의 유도를 도시한다. 도 31c는 마우스 신장에서 인히빈 베타A(Inhba) mRNA 발현을 도시한다(액티빈-A는 인히빈 베타A의 동종이량체로 구성된다). 도 31d는 신장 균질물의 인히빈 β-A에 대한 웨스턴을 도시한다. 도 31e는 면역블럿 정량에 대해 n=6인 도 31D의 면역블럿 정량을 도시한다; *p<0.05이고, **p<0.01이며, ***p<0.005이다.
도 32a는 모의 마우스에서 신장 InhbA 면역염색을 도시한다. 도 32b는 CKD-3 비히클 마우스의 신장 InhbA 면역염색을 도시한다. 모의 마우스에서는, 간헐적인 관주위 사이질 세포(peritubular interstitial cell)가 액티빈-A를 발현시키지만, CKD-3 마우스에서는 더욱 많은 관주위 사이질 세포가, 다양한 수준의 강도에서, 액티빈-A에 대해 양성적이다. 축적 바는 50 ㎛이다.
도 33a 및 도 33b는 인간 3단계 신장병과 유사한 마우스의 만성 신장병을 도시한다. CKD는 인간 CKD의 단계화와 유사한 방법으로 마우스 모델에서 단계화되었다. 방법 항목(9.10.1 부분)에 기재된 바와 같이 절제성 CKD를 이용한 혈관 석회화 모델은 WT C57B6 마우스(WT)에 비해 이눌린 클리어런스 및 BUN으로 추정된 GFR의 70% 감소를 갖는 CKD-3(비히클 처리의 경우 CKD-3 V)으로 지칭되는 인간 CKD 3단계와 유사한 감소된 신장 기능을 생성하기 위해 사용되었다. 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc로 일주일에 2회 피하 투여된 CKD-3 마우스의 치료는 이눌린 클리어런스 또는 BUN에 효과가 없었다.
도 34는 Tsuchida et al (Cell Comm. and Signaling, 2009)의 ActRIIA 신호전달의 다이아그램도를 도시한다. 액티빈, 마이오스타틴(Myostatin), 및 II형 수용체에 결합하는 GDF11, ActRIIA(액티빈에 대해 주요) 및 ActRIIB(마이오스타틴 및 GDF11에 대해 주요)은 smad 2,3을 통한 정규 경로를 포함해 신호 형질도입 경로를 활성화한다.
도 35a 및 도 35b는 CKD-3 비히클 치료된 마우스의 신장(신장 트리크롬 염색)을 도시한다. 도 35c 및 도 35d는 CKD- 3 mActRIIA-Fc 치료된 마우스의 신장(신장 트리크롬 염색)을 도시한다. 축적 바는 1mm이다. 전기소작 손상으로부터의 피질 표면 흉터는 화살표 촉으로 표시되었다. 화살표는 도 36에서 고출력 현미경 사진이 촬영된 지점을 가리킨다. 축적 바는 1mm이다.
도 36a는 WT 및 모의 마우스와 비교해 CKD-3 마우스에서 순환 폴리스타틴 수준의 변화의 부재를 도시한다. 도 36b는 WT 및 모의 마우스와 비교해 CKD-3 마우스에서 순환 폴리스타틴 유사 3(Fstl3) 수준의 변화의 부재를 도시한다.
도 37은 CKD-3 마우스의 조직에서 액티빈 수용체 상호작용 단백질 (Arip1 및 Arip2)의 수준을 도시한다. Arip1은 CKD-3 마우스의 잔여 신장에서 강하게 발현되며, Arip2 발현에 비해 2배 이상 크다. Arip1은 CKD-3 마우스의 대동맥에서 낮은 수준으로 발현되는 반면에, 대동맥에서 Arip2 발현은 Arip1의 2배이다.

8. 상세한 설명

8.1 개요

하나의 양태에서, 본 발명은 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환, 증가된 수준의 동맥 경직도 및/또는 LVH(left venticular hypertrophy)와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환을 비롯한 증가된 수준의 동맥 경직도(예를 들어, 감소된 혈관 순응(vascular compliance)에 의해 표시), 및/또는 좌심실비대(LVH)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법이 제공하며, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 치료 및/또는 예방이 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 신장 환자이다. 상기 ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달 억제제일 수 있다.

상세하게는, 본 발명은 환자 집단의 지표, ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료 및/또는 예방에 대한 대상체의 감응성의 지표, ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료 효능의 지표, 또는 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료에 적절한 투여량의 지표로서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 사용해, 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 신장병, 증가된 수준의 동맥 경직도, 및/또는 좌심실비대(LVH)와 관련되거나 및/또는 신장병, 증가된 수준의 동맥 경직도, 및/또는 좌심실비대(LVH)에 기인한 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 ActRII 신호전달 억제제를 사용한 치료 및/또는 예방을 위해 질환 및/또는 상태를 식별하기 위해 이용될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서 사용되는 ActRII 신호전달 억제제는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 억제제 중 임의의 것과 같은, ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달 억제제일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRII의 세포외 도메인 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질("ActRIIA-Fc," 예를 들어, 서열 7)이다.

본원에서 제공된 방법은 야생형 마우스와 비교해 만성 신장병 유도된 혈관 석회화의 마우스 모델에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및 오스테릭스의 수준은 증가하고, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및 Sm22-알파의 수준은 감소한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 또한, 이론에 구애됨 없이, mActRIIA-Fc에 의한 리간드 트랩핑은 만성 신장 질환 마우스 모델(ldlr-/- 마우스, 고 지방 식이)의 혈관 석회화를 감소시킨다. 본원에 개시된 실시예들에 개시된 바와 같이(9 부분 참조), mActRIIA-Fc를 사용한 만성 신장 질환의 치료는 혈관 석회화, 대동맥 칼슘 수준, 포스포스마드3 수준, 요단백질 수준, 포스포스마드2 수준, Dkk1 수준, Runx2 수준, Alp 수준, BSAP 수준, CTX 수준, 및 오스테릭스 수준을 감소시켰으며, Klotho 수준, 알파-SMA 수준, Axin2 수준 및 Sm22-알파 수준을 증가시켰다. 또한, 본원에서 제공된 방법은 mActRIIA-Fc를 사용한 치료시 만성 신장병 마우스의 혈관 석회화 질환은 Dkk1, 포스포스마드2, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스 수준의 감소, 및 Klotho, 알파-SMA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파 수준의 증가와 관련되어 있다는 발견에 부분적으로 기초한다(9 부분 실시예 참조). 이를 종합하면, 본원에 개시된 데이터는 어떠한 대상체가 ActRIIA-Fc에 반응할 수 있는지, 및/또는 어떠한 대상체가 ActRII 신호전달 억제제에 대한 임상 반응을 추적 관찰하고/하거나 대상 환자 집단을 선택하기 위해 사용될 수 있는지를 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파 수준으로 식별할 수 있음을 나타낸다. 또한, 본원에 개시된 데이터는 만성 신장 질환과 관련된 혈관 석회화를 치료하는데 ActRIIA-Fc(예를 들어, mActRIIA-Fc, 또는 서열 7과 같은 ActRIIA-hFc)가 유용하다는 것을 나타낸다. 추가적으로, 본원에 개시된 데이터는 또한, 증가된 수준의 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스와 관련된 질환, 또는 감소된 수준의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파와 관련된 질환을 치료하는데 ActRIIA-Fc(예를 들어, mActRIIA-Fc, 또는 서열 7과 같은 hActRIIA-hFc)가 유용하다는 것을 나타낸다. 최종적으로, 본원에 개시된 데이터는 또한, 대동맥 죽종에서 칼슘 축적을 감소시켜, 대동맥 칼슘 수준을 감소시키며, CKD 유도된 심장 중량 증가를 반전시키고, 신장 섬유증을 감소시키는데 유용하며, 이에 따라 심혈관계 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다.

실시예들(9 부분 참조)에 예시된 바와 같은 본원에 기재된 발견은 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성의 검출이 (i) 대상체에서 혈관 석회화 정도의 마커(예를 들어, 혈청 바이오마커), (ii) ActRII 신호전달 억제제(ActRIIA-Fc와 같은)에 대한 대상체의 반응을 측정하거나, (iii) 치료후 대상체에서 ActRII 신호전달 억제제(ActRIIA-Fc와 같은)의 약물학적 효과를 평가하기 위한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 나타내며, 여기서 상기 대상체는 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 가진 환자이다. 따라서, 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, Axin2, 및/또는 Sm22-알파는 ActRIIA-Fc(예를 들어, 서열 7과 같은 ActRIIA-hFc)의 효능의 지표 및/또는 ActRIIA-Fc(예를 들어, 서열 7과 같은 ActRIIA-hFc)를 이용한 치료에 대한 반응의 부재의 지표로서 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같이, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파는 ActRIIA-Fc(예를 들어, 서열 7과 같은 ActRIIA-hFc)의 시간 경과 치료 효능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 분자 마커로서 사용될 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, 본원에는 혈액 내의 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 검출(예를 들어, 혈관 평활근 세포 기능 장애와 관련된 질환의 비정상적 발현 검출)하는 단계, 및 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 투여량 의존적으로 ActRIIA-Fc와 같은 ActRII 신호전달 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 소타터셉트(서열 7; 9 부분 참조)이다. 소타터셉트는 본원에 기재된 방법에 유용한 액티빈 리간드 트랩이다(8 부분 참조).

8.2 약어

본원에서 사용된 "Snai 1" 또는 "Snai1"은 스네일 상동체 1을 의미한다. 예를 들어 Twigg and Wilkie, 1999, Hum Genet 105(4):320-326 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_005985.3은 예시적인 인간 Snai1 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NM_005976.2는 예시적인 인간 Snai1 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "포스포스마드3(phosphosmad3)"은 데카펜타플레직(decapentaplegic) 상동체 3에 대한 인산화된 모체를 의미한다. 예를 들어, Matsuzaki, 2013, Cytokine Growth Factor Rev, 24(4):385-399 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_005902.3은 예시적인 인간 포스포스마드3 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_005893.1은 예시적인 인간 포스포스마드3 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "포스포스마드2"는 데카펜타플레직 상동체 2에 대한 인산화된 모체를 의미한다. 예를 들어, Matsuzaki, 2013, Cytokine Growth Factor Rev, 24(4):385-399 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001003652.3은 예시적인 인간 포스포스마드2 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001003652.1은 예시적인 인간 포스포스마드2 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Dkk1"은 dickkopf 관련 단백질 1을 의미한다. 예를 들어, Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_012242.2는 예시적인 인간 Dkk1 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_036374.1은 예시적인 인간 Dkk1 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "col1a1"은 콜라겐 1형, 알파 1을 의미한다. 예를 들어, Korkko et al., 1998, Am. J. Hum. Genet., 62:98-110 참조. GenBank^TM 등록번호 XM_005257059.2는 예시적인 인간 col1a1 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 XP_005257116.2는 예시적인 인간 col1a1 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Runx2"는 런트(runt) 관련 전사인자 2를 의미한다. 예를 들어, Komori, 2010, Adv Exp Med Biol, 658:43-49 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001145920.2는 예시적인 인간 Runx2 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001139392.1은 예시적인 인간 Runx2 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Alp" 또는 "Alpl"은 알칼리 포스파타제를 의미한다. 본원에 사용된 "BSAP"는 골 특이적 알칼리 포스파타제를 의미한다. 예를 들어, Martins et al., 2013, Bone, 56(2):390-397 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_000478.4는 예시적인 인간 Alp 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_000469.3은 예시적인 인간 Alp 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "CTX"는 C-말단 텔로펩티드 1형 콜라겐을 의미한다. 예를 들어, Rosen et al, 2000, Calcif Tissue Int. 66(2): 100-103 참조.

본원에 사용된 "오스테릭스"는 Sp7 전사인자로도 공지된 오스테릭스를 의미한다. 예를 들어, Cao et al., 2005, Cancer Res. 65(4):1124-1128 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001173467.2는 예시적인 인간 오스테릭스 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001166938.1은 예시적인 인간 오스테릭스 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Klotho"는 클로토(Klotho)를 의미한다. 예를 들어, Matsumura et al. 1998, Biochem Biophys Res Commun, 242:626-630 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_004795.3은 예시적인 인간 Klotho 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_004786.2는 예시적인 인간 Klotho 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "알파-SMA" 또는 "αSMA" 또는 "α-SMA"는 알파 평활근 액틴을 의미한다. 예를 들어, Nowak et al., 1999, Nat. Genet. 23:208-212 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001100.3은 예시적인 인간 알파-SMA 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001091.1은 예시적인 인간 알파-SMA 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "MYOCD"는 미오카르딘을 의미한다. 예를 들어, Imamura et al., 2010, Gene, 464:1-10 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001146312.2는 예시적인 인간 MYOCD 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001139784.1은 예시적인 인간 MYOCD 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Sm22-알파" 또는 "Sm22α" 또는 "Sm22-α"는 "트랜스젤린(transgelin)", "Tagln", 또는 "Tagln1"로도 공지된 평활근 단백질 22 알파를 의미한다. 예를 들어, Camoretti-Mercado, 1998, Genomics, 49:452-457 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001001522.1은 예시적인 인간 Sm22-알파 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001001522.1은 예시적인 인간 Sm22-알파 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "ActRII"는 액티빈 수용체 II형을 의미한다. 본원에 사용된 "ActRIIA"는 액티빈 수용체 IIA형을 의미한다. 예를 들어, Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001278579.1은 예시적인 인간 ActRIIA 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001265508.1은 예시적인 인간 ActRIIA 아미노산 서열을 제공한다. 본원에 사용된 "ActRIIB"는 액티빈 수용체 IIB형을 의미한다. 예를 들어, Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108 참조. GenBank^TM 등록번호 NM_001106.3은 예시적인 인간 ActRIIB 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_001097.2는 예시적인 인간 ActRIIB 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "Axin2"는 축 억제제(axis inhibitor) 2를 의미한다. GenBank^TM 등록번호 NM_004655.3은 예시적인 인간 Axin2 핵산 서열을 제공한다. GenBank^TM 등록번호 NP_004646.3은 예시적인 인간 Axin2 아미노산 서열을 제공한다.

본원에 사용된 "mActRIIA-Fc" 또는 "ActRIIA-mFc"는 마우스 액티빈 IIA형 수용체-IgG1 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 미국특허 제8,173,601호 참조. 본원에 사용된 "mActRIIB-Fc" 또는 "ActRIIB-mFc"는 마우스 액티빈 IIB형 수용체-IgG1 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 미국특허 제8,173,601호 참조. 본원에 사용된 "hActRIIA-Fc" 또는 "ActRIIA-hFc"는 인간 액티빈 IIA형 수용체-IgG1 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 미국특허 제8,173,601호 참조. 본원에 사용된 "hActRIIB-Fc" 또는 "ActRIIB-hFc"는 인간 액티빈 IIB형 수용체-IgG1 융합 단백질을 의미한다. 예를 들어, 미국특허 제8,173,601호 참조.

본원에 사용된 "LVH"는 좌심실비대를 의미한다.

8.3 치료 및/또는 예방 방법

8.3.1 심혈관계 질환 및/또는 혈관 석회화

특정 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환, 증가된 수준의 동맥 경직도, 좌심실비대, 좌심실비대와 관련되거나 및/또는 좌심실비대에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 신장 환자이다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 만성 신장병 미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 만성 신장병 미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다.

특정 실시양태에서, 상기 대상체는 기준 집단에서 Runx2의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Runx2, 기준 집단에서 Alp의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Alp, 기준 집단에서 Snai1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Snai1, 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드2, 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드3, 기준 집단에서 요단백질의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 요단백질, 기준 집단에서 Dkk1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Dkk1, 기준 집단에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 기준 집단에서 col1a1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 col1a1, 기준 집단에서 BSAP의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 BSAP, 기준 집단에서 CTX의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 CTX, 기준 집단에서 오스테릭스의 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 오스테릭스, 기준 집단에서 Klotho의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Klotho, 기준 집단에서 알파-SMA의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 알파-SMA, 기준 집단에서 MYOCD의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 MYOCD, 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Sm22-알파; 및/또는 기준 집단에서 ActRIIA의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준의 ActRIIA를 갖는다.

특정 실시양태에서, 상기 대상체는 대상체에서 Runx2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Runx2, 대상체에서 Alp의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Alp, 대상체에서 Snai1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Snai1, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드2, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드3, 대상체에서 요단백질의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 요단백질, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Dkk1, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 대상체에서 col1a1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 col1a1, 대상체에서 BSAP의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 BSAP, 대상체에서 CTX의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 CTX, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 오스테릭스, 대상체에서 Klotho의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Klotho, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 알파-SMA, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 MYOCD, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준의 ActRIIA, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Sm22-알파를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체에서 Runx2의 이전 수준, 대상체에서 Alp의 이전 수준, 대상체에서 Snai1의 이전 수준, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준, 대상체에서 요단백질의 이전 수준, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준, 대상체에서 col1a1의 이전 수준, 대상체에서 BSAP의 이전 수준, 대상체에서 CTX의 이전 수준, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준, 대상체에서 Klotho의 이전 수준, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준은 (i) 심혈관계 질환; (ii) 혈관 석회화; (iii) 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환; (iv) 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환; (v) 증가된 수준의 동맥 경직도; 및/또는 좌심실비대(LVH)의 증상 또는 진단 개시의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 또는 48개월 이전의 각각의 수준이다.

특정 실시양태에서, 상기 대상체는 8.3.4 부분에 기재된 방법에 따라 치료된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 혈관 석회화는 8.6 부분에 기재된 아가츠톤 점수를 측정함으로써 에세이된다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법으로 치료되어야 할 대상체는 8.6 부분에 기재된 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 갖는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 (i) 8.6 부분에 기재된 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 기본으로 대상체를 선택하는 단계; 및 (ii) 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 혈관 석회화를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 상기 대상체는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 대상체는 신장병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 만성 신장병 미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 만성 신장병 미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다. 특정 실시양태에서, 대상체의 혈관 석회화는 8.6 부분에 기재된 아가츠톤 점수를 측정함으로써 에세이된다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 증가된 수준의 동맥 경직도로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 LVH로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다.

특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같이 측정된다. 특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 및/또는 ActRIIA, Axin2, 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 상기 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, 액티빈의 수준은 기준 집단에 비해 대상체에서 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 폴리스타틴의 수준은 기준 집단에서 폴리스타틴의 수준과 거의 동일하다.

특정 실시양태에서, 상기 기준 집단은 8.6 부분에 기재된 집단이다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 8.4 부분에 기재된 대상체이다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 8.5 부분에 기재된 ActRII 신호전달 억제제이다.

특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 기재된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 초기 투여량이다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 개시된 바와 같이 투여된다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 8.8 부분에 기재된 바와 같이 제 2 약제학적 활성제와 조합되어 이용된다.

특정 실시양태에서, 심혈관계 질환 또는 만성 신장병의 문맥에서 "치료(treat)," "치료(treatment)," 또는 "치료(treating),"는 각각 심혈관계 질환 또는 만성 신장병의 적어도 하나의 증상의 개선을 포함한다.

당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 하나 이상의 Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질의 수준 및/또는 활성은 각각 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 1개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 2개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 3개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 3개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 4개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 5개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 6개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 7개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 8개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 9개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 10개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 11개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 12개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 13개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 14개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 15개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 16개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 중 17개의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다. 특정 실시양태에서, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, Sm22-알파, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2, 및 요단백질 각각의 수준 및/또는 활성은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성과 비교된다.

8.3.2 SNAI1 , 포스포스마드2 , DKK1 , COL1A1 , 액티빈 (예를 들어, 자유 액티빈 ), RUNX2 , ALP, BSAP , CTX , 오스테릭스 , Klotho , 알파- SMA , MYOCD , 포스포스마드3 , 요단백질, ACTRIIA , AXIN2 , 및/또는 SM22-알파와 관련된 질환

특정 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파와 관련된 하나 이상의 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 상기 대상체는 8.4 부분에 기재된 대상체이다.

특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 8.5 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다.

특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 기재된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 초기 투여량이다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 개시된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 약제학적 투여량은 본원에 기재된 특정 바이오마커의 수준 및/또는 활성에 따라 조절된다.

8.3.3 만성 신장병-미네랄/뼈 질환

특정 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩(trap))를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 골흡수를 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 혈관 석회화를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 신장 대상체이다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다.

특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에서 Runx2의 수준 및/또는 활성에 비해 Runx2의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 Alp의 수준 및/또는 활성에 비해 Alp의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 Snai1의 수준 및/또는 활성에 비해 Snai1의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성에 비해 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성에 비해 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 요단백질의 수준 및/또는 활성에 비해 요단백질의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 Dkk1의 수준 및/또는 활성에 비해 Dkk1의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 col1a1의 수준 및/또는 활성에 비해 col1a1의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성에 비해 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 BSAP의 수준 및/또는 활성에 비해 BSAP의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 CTX의 수준 및/또는 활성에 비해 CTX의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 오스테릭스(Osterix)의 수준 및/또는 활성에 비해 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 Klotho의 수준 및/또는 활성에 비해 Klotho의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 알파-SMA의 수준 및/또는 활성에 비해 알파-SMA의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 MYOCD의 수준 및/또는 활성에 비해 MYOCD의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 ActRIIA의 수준 및/또는 활성에 비해 ActRIIA의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 및/또는 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비해 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 감소된다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 및/또는 ActRIIA 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질 및 col1a1, 및/또는 ActRIIA 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 알파-SMA 수준은 대동맥에 존재한다.

특정 실시양태에서, 대상체는 대상체에서 Runx2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Runx2, 대상체에서 Alp의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Alp, 대상체에서 Snai1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Snai1, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드2, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드3, 대상체에서 요단백질의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 요단백질, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Dkk1, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 대상체에서 col1a1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 col1a1, 대상체에서 BSAP의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 BSAP, 대상체에서 CTX의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 CTX, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 오스테릭스, 대상체에서 Klotho의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Klotho, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 알파-SMA, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 MYOCD, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준의 ActRIIA, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Sm22-알파를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 Runx2의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Alp의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Snai1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 요단백질의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 col1a1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 BSAP의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 CTX의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Klotho의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준 및/또는 활성은 CKD-MBD의 증상 개시 또는 진단 개시의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 또는 48 개월의 이전의 각각의 수준이다.

특정 실시양태에서, 대상체는 8.3.4 부분 방법에 따라 치료된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서의 혈관 석회화는 8.6 부분에 개시된 아가츠톤 점수를 측정함으로써 에세이된다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법으로 치료될 대상체는 8.6 부분에 개시된 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 갖는다. 따라서, 특정 구체적인 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 (i) 8.6 부분에 개시된 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 기본으로 하여 대상체를 선택하고; (ii) ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)의 약제학적 유효 투여량을 투여하는 단계를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 심혈관계 질환을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 혈관 석회화를 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 신장병을 갖는다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 동맥 경직도의 수준이 증가된다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 LVH를 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다.

특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 개시된 대로 결정된다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Kloth+o, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, ActRIIA, Axin2, 및 MYOCD 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, 액티빈의 수준은 기준 집단에 대하여 대상체에서 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 폴리스타틴의 수준은 기준 집단에서 폴리스타틴의 수준과 대략 동일하다.

특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 집단이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.4 부분에 개시된 대상체이다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 번호 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 8.5 부분에 개시된 ActRII 신호전달 억제제이다.

특정 실시양태에서, 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 개시된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효 투여량은 초기 투여량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 개시된 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효 투여량은 8.7 부분에 개시된 대로 투여된다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 방법은 8.8 부분에 개시된 대로, 제2 약제학적 활성 제제와 조합되어 이용된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)의 약제학적 유효 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병을 치료하는 방법을 제공한다. 소정의 실시양태에서, 본 발명은 14일에 한번씩의 간격으로 0.13 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)를 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 14일에 한번씩의 간격으로 0.26 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 28일에 한 번씩의 간격으로 0.3 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 28일에 한 번씩의 간격으로 0.5 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 28일에 한 번씩의 간격으로 0.7 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 14일에 한 번씩의 간격으로 0.1 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 14일에 한 번씩의 간격으로 0.2 mg/kg의 ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)을 대상체에게 피하 투여하는 단계를 포함하며 대상체는 혈액투석을 받으며 대상체는 이전에 에리트로포이에틴-자극 제제가 투여되었던, 대상체에서 말기 신장병의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(서열 7)이다.

8.3.4 조절된 투약

특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 추가로 (i) ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)으로 치료될 후보이거나 치료중인 대상체를 위한 적절한 투약을 평가하기 위하여; (ii) 치료 동안 ActRII 신호전달 억제제의 투여량을 조절할지 여부를 평가하기 위하여; 및/또는 (iii) ActRII 신호전달 억제제의 적절한 유지 투여량을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 만일 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 수준 및/또는 활성보다 크거나 작다면, 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 따라 ActRII 신호전달 억제제의 투약이 개시되거나, 증가되거나, 감소되거나, 지연되거나 종결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환, CKD-MBD, 증가된 수준의 동맥 경직도, LVH, 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 대상체에 투여하는 단계; (ii) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 1차 측정하는 단계; (iii) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 2차 측정하는 단계; 및 (iv) ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 8.5 부분에 개시된 ActRII 신호전달 억제제이다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈관 석회화는 8.6.6 부분에 개시된 대로 아가츠톤 점수를 측정함으로써 에세이된다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이의 검출된 변화에 기초한다.

특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 개시된 대로 결정된다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 각각 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준 및/또는 활성이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 또는 Axin2 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, 액티빈의 수준은 기준 집단에 대하여 대상체에서 증가된다. 특정 실시양태에서, 폴리스타틴의 수준은 기준 집단에 대하여 대상체에서 정상이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈관 석회화는 8.6 부분에 개시된 대로 아가츠톤 점수를 측정함으로써 에세이된다.

특정 실시양태에서, 초기 투여량은 8.7 부분에 개시된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 8.7 부분에 개시된 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 8.7 부분에 개시된 대로 투여된다.

특정 실시양태에서, 1차 측정 및/또는 2차 측정은 8.6 부분에 개시된 대로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 1차 측정은 치료의 개시 전에 이루어진다. 특정 실시양태에서, 1차 측정은 치료의 개시 후에 또는 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주, 2주, 3주, 4주 또는 2개월 이내에 이루어진다. 특정 실시양태에서, 2차 측정은 치료의 개시 직후에 또는 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 이내에 이루어진다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량은 Runx2의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Runx2의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, Alp의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Alp의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, Snai1의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Snai1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, 요단백질의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 요단백질의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, Dkk1의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Dkk1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, col1a1의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 col1a1의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, BSAP의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 BSAP의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, CTX의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 CTX의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 오스테릭스의 수준 및/또는 활성에 비해 증가, Klotho의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Klotho의 수준 및/또는 활성에 비해 감소, 알파-SMA의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 알파-SMA의 수준 및/또는 활성에 비해 감소, MYOCD의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 MYOCD의 수준 및/또는 활성에 비해 감소, ActRIIA의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 ActRIIA의 수준 및/또는 활성에 비해 감소, Axin2의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Axin2의 수준 및/또는 활성에 비해 감소, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 경우에 초기 투여량에 비해 많다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, ALP, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, ActRIIA, Axin2, 및 MYOCD 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다.

특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 대로 투여된다.

특정 실시양태에서, 대상체는 대상체에서 Runx2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Runx2, 대상체에서 Alp의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Alp, 대상체에서 Snai1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Snai1, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드2, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 포스포스마드3, 대상체에서 요단백질의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 요단백질, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 Dkk1, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), 대상체에서 col1a1의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 col1a1, 대상체에서 BSAP의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 BSAP, 대상체에서 CTX의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 CTX, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 증가된 수준 및/또는 활성의 오스테릭스, 대상체에서 Klotho의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Klotho, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 알파-SMA, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 MYOCD, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준의 ActRIIA, 대상체에서 Axin2의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준의 Axin2, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준 및/또는 활성에 비해 감소된 수준 및/또는 활성의 Sm22-알파를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 Runx2의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Alp의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Snai1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 포스포스마드2의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 포스포스마드3의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 요단백질의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Dkk1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 col1a1의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 BSAP의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 CTX의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 오스테릭스의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Klotho의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 알파-SMA의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 MYOCD의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 ActRIIA의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Axin2의 이전 수준 및/또는 활성, 대상체에서 Axin2의 이전 수준 및/또는 활성, 및/또는 대상체에서 Sm22-알파의 이전 수준 및/또는 활성은 (i) 심혈관계 질환; (ii) 혈관 석회화; (iii) 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환; (iv) 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환; (v) CKD-MBD; (vi) 증가된 수준의 동맥 경직도; (vii) LVH; (viii) 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 혈관 질병; 및/또는 (ix) LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환의 증상의 개시 또는 진단 개시의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 또는 48 개월 이전의 각각의 수준이다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제(예를 들어, 액티빈 리간드 트랩)의 조절된 투여량은 만일 기준 집단에서 Runx2의 수준 및/또는 활성에 비해 Runx2의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 Alp의 수준 및/또는 활성에 비해 Alp의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 Snai1의 수준 및/또는 활성에 비해 Snai1의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성에 비해 포스포스마드2의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성에 비해 포스포스마드3의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 요단백질의 수준 및/또는 활성에 비해 요단백질의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 Dkk1의 수준 및/또는 활성에 비해 Dkk1의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 col1a1의 수준 및/또는 활성에 비해 col1a1의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성에 비해 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 BSAP의 수준 및/또는 활성에 비해 BSAP의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 CTX의 수준 및/또는 활성에 비해 CTX의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 오스테릭스의 수준 및/또는 활성에 비해 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 감소되고, 기준 집단에서 Klotho의 수준 및/또는 활성에 비해 Klotho의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 알파-SMA의 수준 및/또는 활성에 비해 알파-SMA의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 MYOCD의 수준 및/또는 활성에 비해 MYOCD의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 ActRIIA의 수준 및/또는 활성에 비해 ActRIIA의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 기준 집단에서 Axin2의 수준 및/또는 활성에 비해 Axin2의 수준 및/또는 활성이 증가되고, 및/또는 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비해 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 증가되면, 초기 투여량 보다 작다. 특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 조직에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, ActRIIA, Axin2, 및 MYOCD 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, Sm22-알파, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 알파-SMA 수준은 대동맥에 존재한다.

특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 집단이다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 8.7 부분에 개시된 대로 투여된다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 8.8 부분에 개시된 제2 약제학적 활성 제제와 조합되어 이용된다.

당업자에 의해 인식될 것처럼, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 8.3.1 부분에서 상기한 것과 같은, 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 독립적으로 그리고 각각 비교될 수 있다.

8.4 환자 집단

본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유류일 수 있으며, 바람직한 실시양태에서는, 인간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환, 고-교체(high-turnover) ROD, 증가된 동맥 경직도, 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환, LVH 및/또는 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환을 치료하기 위하여; 또는 혈관 석회화, 동맥(예를 들어, 혈관) 경직, LVH, 대동맥 칼슘 수준, 내피세포에서 간엽세포로의 전환, 및/또는 뼈 형성을 모니터하고/하거나 감소시키기 위하여, 및/또는 뼈 미네랄 밀도 및/또는 혈관 평활근 세포 기능을 증가시키기 위하여, 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유류에서 그리고 바람직한 실시양태에서, 인간 대상체에서, 이용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 액티빈 수준에 비해 액티빈 수준이 증가된다. 특정 실시양태에서, 액티빈 수준은 신장, 혈장 또는 대동맥 액티빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 액티빈은 액티빈 A이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴의 수준에 비해 대략 동일한 수준의 폴리스타틴을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴의 수준에 비해 증가된 수준의 폴리스타틴을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴의 수준에 비해 감소된 수준의 폴리스타틴을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴-유사 3의 수준에 비해 대략 동일한 수준의 폴리스타틴-유사 3을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴-유사 3의 수준에 비해 증가된 수준의 폴리스타틴-유사 3을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 폴리스타틴-유사 3의 수준에 비해 감소된 수준의 폴리스타틴-유사 3을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 인히빈(inhibin)의 수준에 비해 대략 동일한 수준의 인히빈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 인히빈의 수준에 비해 증가된 수준의 인히빈을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 인히빈의 수준에 비해 감소된 수준의 인히빈을 가지지 않는다. 특정 실시양태에서, 대상체에서의 자유 액티빈의 수준은 액티빈 수준에 대한 인히빈, 폴리스타틴 및 폴리스타틴-유사 3 수준의 화학양론에 의해 결정된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 자유 액티빈 수준이 증가된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 대로 기준 집단에 비해 phosphoerk 1/2이 증가되지 않는다. 특정 실시양태에서, phosphoerk 1/2은 대동맥 phosphoerk 1/2이다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 내피세포에서 간엽세포로의 전환(EnMT)에 비해 EnMT가 증가된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 예를 들어, Snai1과 같은, EnMT와 관련된 전사 인자 발현이 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 EnMT는 기준 집단에서 골아세포 전이에 비해 대상체에서 골아세포 전이 증가를 야기한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 EnMT는 기준 집단에서 혈관 경직에 비해 대상체에서 혈관 경직 증가를 야기한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 EnMT는 기준 집단에서 혈관 석회화에 비해 대상체에서 혈관 석회화 증가를 야기한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 EnMT는 기준 집단에서 혈관 평활근 기능에 비해 대상체에서 혈관 평활근 기능 감소를 야기한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 증가된 EnMT는 기준 집단에서 LVH에 비해 대상체에서 LVH 증가를 야기한다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 신장 섬유증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 사구체경화증을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 각각의 수준에 비해, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 포스포스마드3, 요단백질, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 증가되거나, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 감소된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 혈관 석회화; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 심혈관계 질환; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) CKD-MBD; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 증가된 수준의 동맥 경직도; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 심혈관계 질환; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) LVH; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환; 및 (ii) 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준에 비해, 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 심혈관계 질환; (ii) 혈관 석회화; (iii) 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환; (iv) 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환; (v) CKD-MBD; (vi) 증가된 수준의 동맥 경직도; (vii) LVH; (viii) 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한 혈관 질병; 및/또는 (ix) LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환의 증상의 개시 또는 진단 개시의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 또는 48 개월 이전의 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 이전 수준에 비해, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성, 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준 및/또는 활성을 갖는다.

일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되었다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병-미네랄 뼈 질환을 가진 것으로 진단되지 않았다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 집단이다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다. 특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 8.6 부분에 개시된 대로이다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 Snai1 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 포스포스마드2 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 포스포스마드3 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 요단백질 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 Dkk1 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 Col1a1 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 Runx2 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 Alp 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 BSAP 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 CTX 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 오스테릭스 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 증가된 ActRIIA 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 감소된 Klotho 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 감소된 알파-SMA 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 감소된 MYOCD 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 감소된 Sm22-알파의 수준과 관련된 질병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 감소된 ActRIIA 수준과 관련된 질병을 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈관 석회화를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 혈관 석회화는 8.6 부분에 개시된 대로 결정된다. 특정 실시양태에서, 혈관 석회화는 아가츠톤 점수에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 혈관 석회화는 석회화성 죽상동맥경화증, 석회화성 중막 혈관병증(뫼케베르그 중막 석회화성 경화증으로도 알려짐), 중막 석회화, 탄력섬유증, 석회화 요독성 세동맥병증, 석회화성 대동맥 판막 협착증, 및/또는 간문맥 석회화이다. 특정 실시양태에서, 석회화성 죽상동맥경화증과 관련된 질병은 죽상동맥경화증, 고지혈증, 골다공증, 고혈압, 염증, 2형 당뇨병, 말기 신장병, 필수 절단, 탄력섬유성 가황색종, 말기 신장병, 고지혈증, 선천성 이엽성 판막, 류마티스성 심장질환, 및/또는 간질환이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 CKD-유도 심장 중량 증가를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 심장 비대를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 근세포 비대를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 동맥 및/또는 혈관 경직이 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 LVH를 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단에 비해, 바람직하지 않게 높은 수준의 대동맥 칼슘, 혈관 석회화, 증가된 수준의 동맥 경직도 및/또는 조골세포 수를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단에 비해, 만성 신장병을 가진 대상체처럼, 바람직하지 않게 높은 수준의 대동맥 칼슘, 혈관 석회화, 증가된 수준의 동맥 경직도 및/또는 조골세포 수를 가질 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단에 비해, 대동맥 죽종에서 칼슘 축적을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단에 비해, 대동맥 경직 형태의 증가된 수준의 동맥 경직도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단에 비해, 고혈압을 증가시키는 증가된 수준의 동맥 경직도를 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 신장병은 만성 신장병이다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 만성 신장병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 만성 신장병에 부차적인 심혈관계 질환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 만성 신장병은 3 단계, 4 단계, 5 단계 또는 5D 단계에 도달했다. 구체적인 실시양태에서, 신장병은 말기 신장병이다. 구체적인 실시양태에서, 대상체는 성인에서는 60 ml/min/1.73m² 미만 또는 소아 대상체에서는 89 ml/min/1.73m² 미만의 사구체 여과율을 갖는다. Moe et al., 2006, Kidney International 69:1945-1953를 참고한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 성인이며, 대상체는 50 ml/min/1.73m², 40 ml/min/1.73m², 30 ml/min/1.73m², 20 ml/min/1.73m² 미만, 또는 10 ml/min/1.73m²미만의 사구체 여과율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 소아 대상체이며, 소아 대상체는 80 ml/min/1.73m², 70 ml/min/1.73m², 60 ml/min/1.73m², 50 ml/min/1.73m², 40 ml/min/1.73m², 30 ml/min/1.73m², 20 ml/min/1.73m² 미만 또는 10 ml/min/1.73m²미만의 사구체 여과율을 갖는다. 이론에 구애됨 없이, 성인 대상체에서 60 ml/min/1.73m² 미만 그리고 소아 대상체에서 89 ml/min/1.73m² 미만의 사구체 여과율은 칼슘 수준, 인 수준, PTH 수준 및 비타민 D 대사에서 검출가능한 비정상을 야기하고; 이들 마커의 비정상 수준은 뼈 질환을 야기한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에 비해 이눌린 클리어런스가 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에 비해 혈액 우레아 질소 수준이 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 고인산혈증이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 신장 섬유증을 갖는다.

특정 실시양태에서, 대상체는 알포트 증후군(Alport's syndrome)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 알포트 증후군과 관련된 COL4A5 유전자에서 하나 이상의 체세포 돌연변이를 갖는다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 만성 신장병과 관련된 뼈 병적측면, 즉, CKD-미네랄/뼈 질환(CKD-MBD)을 갖는다. Moe et al., 2006, Kidney International 69:1945-1953을 참고한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 지주골(trabecular bone) 체적에 비해 지주골 체적이 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 골소주(trabecular) 두께에 비해 골소주 두께가 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 침식면 대 뼈 표면 비에 비해 침식면 대 뼈 표면 비가 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 파골세포 수준에 비해 파골세포 수준이 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 조골세포 표면 대 뼈 표면 비에 비해 조골세포 표면 대 뼈 표면 비가 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 조골세포 수준에 비해 조골세포 수준이 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 8.6 부분에 개시된 기준 집단과 같은 기준 집단에서 뼈 형성 속도에 비해 뼈 형성 속도가 감소된다. 특정 실시양태에서, CKD-MBD는 신성 골이영양증 및 혈관 석회화로 이루어진다. 특정 실시양태에서, CKD-MBD는 신성 골이영양증으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, CKD-MBD는 저-교체 CKD-MBD이다. 특정 실시양태에서, CKD-MBD는 증가된 수준의 동맥 경직도 및/또는 LVH로 이루어진다. 저-교체 CKD-MBD는 하기 표 1에 개시된 조직학적 특징에 의해 진단될 수 있다. 미국 국립 신장 재단의 웹사이트의 국립 신장 재단, 신장병 관리 가이드라인(National Kidney Foundation, Kidney Disease Outcomes Quality Initiative Guidelines)을 참고한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 고-교체 ROD를 갖는다.

표 1: 저-교체 CKD-MBD의 조직학적 특징

특정 실시양태에서, 대상체는 혈액투석을 진행중이다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 말기 신장병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 투석을 진행한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 기준 집단에서 골흡수에 비해 골흡수가 증가된다. 특정 실시양태에서, 골흡수 증가는 CTX 수준에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, CTX의 수준은 8.6 부분에 개시된 대로 결정된다. 특정 실시양태에서, 골흡수는 8.6 부분에 개시된 대로 평가된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 연령일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18세 미만이다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 13세 미만이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 12세 미만, 11세 미만, 10세 미만, 9세 미만, 8세 미만, 7세 미만, 6세 미만 또는 5세 미만이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1-3세, 3-5세, 5-7세, 7-9세, 9-11세, 11-13세, 13-15세, 15-20세, 20-25세, 25-30세, 또는 30세 초과이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 30-35세, 35-40세, 40-45세, 45-50세, 50-55세, 55-60세, 또는 60세 초과이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체는 60-65세, 65-70세, 70-75세, 75-80세, 또는 80세 초과이다.

특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 말기 신장병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈액투석을 받는다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 이전에 에리쓰로포이에틴-자극 제제가 투여되었다. 특정 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈액투석을 받으며, 이전에 에리쓰로포이에틴-자극 제제가 투여되었다.

당업자에게 인식될 것처럼, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 8.3.1 부분에 개시된 것과 같은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 독립적으로 그리고 각각 비교될 수 있다.

8.5 ACTRII 신호전달의 억제제

본 부분에서 개시되고 본 기술분야에 알려진 ActRII 신호전달 억제제가 본 발명에서 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 부분에서 개시된 ActRII 신호전달 억제제는 본 발명에서 제공되는 방법에서 사용될 수 있다(8.3 부분 참고).

본 발명에서 포함되는 ActRII 신호전달 수용체의 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제 및 ActRIIB 신호전달 억제제를 포함한다(하기 참고). 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달에 특이적이다. 다른 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달에 특이적이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 우선적으로 ActRIIA 신호전달을 억제한다. 다른 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 우선적으로 ActRIIB 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 및 ActRIIB 신호전달 둘 모두를 억제한다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달의 억제제는 ActRII의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 그러한 액티빈-결합 도메인 포함 폴리펩티드는 액티빈을 격리시켜서 액티빈 신호전달을 방지한다. 이들 액티빈-결합 도메인 포함 폴리펩티드는 ActRII의 세포외 도메인의 전부 또는 일부(즉, ActRIIA의 세포외 도메인의 전부 또는 일부 또는 ActRIIB의 세포외 도메인의 전부 또는 일부)를 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, ActRII의 세포외 도메인은 가용성이다.

특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인 포함 폴리펩티드는 항체의 Fc 부분에 연결된다(예를 들어, ActRII 수용체의 액티빈-결합 도메인 포함 폴리펩티드 및 항체의 Fc 부분을 포함하는 접합체가 생성된다). 이론에 구애됨 없이, 항체 부분은 접합체에 증가된 안정성을 부여한다. 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인은 링커, 예를 들어, 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다.

본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRII 신호전달의 억제제는 직접 또는 간접적으로, 세포외에서 또는 세포내에서, ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달을 억제하는 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 수용체(들) 자체와의 상호작용을 통해 ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달을 억제한다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드, 예를 들어, 액티빈과의 상호작용을 통해 ActRIIA 신호전달 및/또는 ActRIIB 신호전달을 억제한다.

8.5.1 ACTRIIA 신호전달의 억제제

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 IIA형 (ActRIIA) 단백질 패밀리 및 그러한 ActRIIA 단백질로부터 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 유도된 변이체를 말한다. 본원에서 ActRIIA의 언급은 현재 확인된 형태 중 임의의 하나를 말하는 것으로 이해된다. ActRIIA 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 경막 도메인 및 예상된 세린/트레오닌 키나제 활성을 가진 세포질 도메인으로 이루어진 경막 단백질이다.

본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 제한없이, 액티빈-결합 가용성 ActRIIA 폴리펩티드; 액티빈(특히 β_A 또는 β_B로도 불리는 액티빈 A 또는 B 서브유닛)에 결합하고 ActRIIA 결합을 파괴하는 항체; ActRIIA에 결합하고 액티빈 결합을 파괴하는 항체; 액티빈 또는 ActRIIA 결합에 대해 선택된 비-항체 단백질(예를 들어, WO/2002/088171호, WO/2006/055689호, WO/2002/032925호, WO/2005/037989호, US 2003/0133939호, 및 US 2005/0238646호를 참고하며 그 각각은 전체가 참고로 본원에 통합되며, 예를 들어, 그러한 단백질과 그의 설계 및 선택 방법은 참고로 본원에 통합됨); 및 Fc 도메인에 접합될 수 있는, 액티빈 또는 ActRIIA 결합을 위해 선택된 무작위화 펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 액티빈 또는 ActRIIA 결합 활성을 가진 둘 이상의 상이한 단백질(또는 다른 모이어티), 특히 각각 I형(예를 들어, 가용성 I형 액티빈 수용체) 및 II형(예를 들어, 가용성 II형 액티빈 수용체) 결합 부위를 차단하는 액티빈 결합제는 함께 연결되어, ActRIIA 신호전달을 억제하고 따라서 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 수 있는 2기능성 또는 다기능성 결합 분자를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달을 억제하는 액티빈-ActRIIA 신호전달 축 길항제는 핵산 앱타머, 소분자 및 본원에 개시된 조성물과 방법에 사용되는 다른 제제를 포함한다.

8.5.1.1 ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA 신호전달 억제제

용어 "ActRIIA 폴리펩티드"는 ActRIIA 패밀리 구성원의 임의의 자연 발생 폴리펩티드 및 유용한 활성을 보유한 그의 임의의 변이체(돌연변이, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드의 서열에 적어도 약 80% 동일한, 그리고 선택적으로 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성의 서열을 가진, 임의의 공지의 ActRIIA의 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 단백질 및/또는 액티빈에 결합하고 그 기능을 억제할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 뼈 성장과 뼈 무기질화를 촉진하는 그의 능력에 대해 선택될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드(서열 1) 및 가용성 인간 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 서열 2, 3, 7 및 12)를 포함한다. 그 아미노산 서열이 서열 1에 개시된 ActRIIA 전구체 폴리펩티드와 관련하여, 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드의 시그널 펩티드는 아미노산 위치 1 내지 20에 위치되며; 세포외 도메인은 아미노산 위치 21 내지 135에 위치되며 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드(서열 1)의 N-결합 당화 부위는 서열 1의 아미노산 위치 43 및 56에 위치된다. 서열 1의 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 4(Genbank entry NM_001616의 뉴클레오티드 164-1705)로서 개시된다. 서열 2의 가용성 인간 ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 5로서 개시된다. 서열의 설명을 위해서는 표 21을 참고한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드는 가용성 ActRIIA 폴리펩티드이다. ActRIIA 단백질의 세포외 도메인은 액티빈에 결합할 수 있으며 일반적으로 가용성이며, 따라서 가용성 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드로 부를 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가용성 ActRIIA 폴리펩티드"는 일반적으로 ActRIIA 단백질의 임의의 자연 발생 세포외 도메인 및 임의의 그 변이체(돌연변이, 단편 및 펩티드모방체 형태 포함)를 비롯한 ActRIIA 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 가용성 ActRIIA 폴리펩티드는 액티빈에 결합할 수 있지만; 야생형 ActRIIA 단백질은 GDF8/11에 비해 액티빈에 결합함에 있어서 유의한 선택성을 나타내지 않는다. 천연 또는 변형 ActRIIA 단백질은 그들을 제2의 액티빈-선택적 결합 제제와 커플링시킴으로써 액티빈에 대한 선택성이 부가될 수 있다. 가용성의 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드의 예는 서열 2, 3, 7, 12 및 13에 예시된 가용성 폴리펩티드를 포함한다. 가용성의 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드의 다른 예는 ActRIIA 단백질의 세포외 도메인에 더하여 시그널 서열, 예를 들어, 꿀벌 멜리틴 리더 서열(서열 8), 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA) 리더(서열 9) 또는 천연 ActRIIA 리더(서열 10)를 포함한다. 서열 13에 예시된 ActRIIA-hFc 폴리펩티드는 TPA 리더를 이용한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달의 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된 ActRIIA의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 접합체/융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인은 링커, 예를 들어, 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다. 선택적으로, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이(예를 들어, Asp-265 돌연변이)를 가진 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 감소된다. 다른 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이(예를 들어, Asn-434 돌연변이)를 가진 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC 클래스 I-관련 Fc-수용체(FcRN)에 결합하는 능력이 증가된다. Fc 도메인에 융합된 ActRIIA의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 융합 단백질은 서열 6, 7, 12, 및 13에 개시된다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된, ActRIIA의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하며, 상기 ActRIIA 신호전달 억제제는 서열 6, 7, 12 및 13으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된, ActRIIA의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하며, 상기 ActRIIA 신호전달 억제제는 서열 6, 7, 12 및 13으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달의 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인의 절단된 형태를 포함한다. 절단은 ActRIIA 폴리펩티드의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 아미노산 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIA 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 N-말단 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIA 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 C-말단 아미노산일 수 있다. 예를 들어, ActRIIA의 절단된 형태는 아미노산 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 및 25-131을 가진 폴리펩티드를 포함하며, 이때 아미노산 위치는 서열 1에서의 아미노산 위치를 말한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달의 억제제는 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 ActRIIA의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 신호전달의 억제제는 아미노산 치환을 또한 보유한 ActRIIA 세포외 도메인의 절단된 형태를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이며, 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한다.

ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 또한, 단편은 종래의 메리필드(Merrifield) 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 단편은 (재조합적으로 또는 화학 합성에 의해) 생산될 수 있으며 ActRIIA 단백질 또는 액티빈에 의해 매개된 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 펩티드 단편을 확인하기 위해 시험될 수 있다.

또한, ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 활성 변이체는 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 상응하는 돌연변이유발된 핵산으로부터 재조합적으로 생산된 변형 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 변이체는 생산되고 ActRIIA 단백질 또는 액티빈에 의해 매개된 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 것들을 확인하기 위해 시험될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 2 또는 3으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, 기능적 변이체는 서열 2 또는 3으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

기능적 변이체는 예를 들어, 치료 효능 또는 안정성(예를 들어, 엑스 비보 반감기 및 생체내(in vivo)에서 단백질분해에 대한 저항성) 향상과 같은 목적을 위해 ActRIIA 폴리펩티드의 구조를 변형시켜 생성될 수 있다. 액티빈 결합을 보유하도록 선택될 경우 그러한 변형된 ActRIIA 폴리펩티드는 자연 발생 ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 등가물로 간주될 수 있다. 변형된 ActRIIA 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이소루이신 또는 발린으로 루이신의 분리된 교체, 글루타메이트로 아스파테이트의 교체, 세린으로 트레오닌의 교체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 교체(예를 들어, 보존적 돌연변이)는 생성되는 분자의 생물 활성에 별 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 보존적 교체는 그들의 측쇄에서 관련되는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 교체이다. ActRIIA 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 변화가 기능적 상동체를 생성하는지 여부는 변이체 ActRIIA 폴리펩티드가 야생형 ActRIIA 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 생성하는 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 폴리펩티드의 당화를 변경할 수 있는 하나 이상의 특이적 돌연변이를 가진 ActRIIA 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이는 O-결합 또는 N-결합 당화 부위와 같은, 하나 이상의 당화 부위를 도입하거나 제거할 수 있다. 아스파라긴-결합 당화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌(또는 아스파라긴-X-세린)(이때 "X"는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 변경은 또한 (O-결합 당화 부위를 위한)야생형 ActRIIA 폴리펩티드의 서열에의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 당화 인식 부위의 첫번째 또는 세번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서의 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두번째 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비당화를 야기한다. ActRIIA 폴리펩티드상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 ActRIIA 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실기; (c) 시스테인의 설프히드릴기와 같은 자유 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 하이드록실기와 같은 자유 하이드록실기; (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기와 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일에 공개된 WO 87/05330호 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 개시되며, 참고로 본원에 통합된다. ActRIIA 폴리펩티드상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 이루어질 수 있다. 화학적 탈당화는 예를 들어, 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가의 화합물에 ActRIIA 폴리펩티드를 노출하는 것에 관련될 수 있다. 이 처리는 결합 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 야기하는 한편, 아미노산 서열을 그대로 둔다. 화학적 탈당화는 추가로 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 의해 개시된다. ActRIIA 폴리펩티드의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 개시된 대로 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입할 수 있으므로, ActRIIA 폴리펩티드의 서열은 사용되는 발현 시스템의 타입에 따라 적절히 조절될 수 있다. 일반적으로, 인간에서의 사용을 위한 ActRIIA 단백질은 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포주에서 발현될 수 있으나, 다른 포유류 발현 세포주, 조작된 당화 효소를 가진 효모 세포주 및 곤충 세포와 같은 다른 발현 시스템 또한 유용할 것으로 예상된다.

돌연변이, 특히 ActRIIA 폴리펩티드의 조합 돌연변이 세트, 및 절단 돌연변이를 생성하는 방법이 추가로 본 발명에서 제공되며; 조합 돌연변이 풀(pool)은 특히 기능적 변이체 서열을 확인하는데 유용하다. 그러한 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들어, 아고니스트 또는 길항제로서 작용할 수 있는 또는 대안적으로는 모두 함께 새로운 활성을 보유하는 ActRIIA 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것일 수 있다. 다양한 스크리닝 에세이은 하기에 제공되며, 그러한 에세이은 변이체를 평가하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 변이체는 ActRIIA 리간드에 결합하거나, ActRIIA 폴리펩티드에의 ActRIIA 리간드의 결합을 방지하거나 ActRIIA 리간드에 의해 야기된 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.

자연 발생 ActRIIA 폴리펩티드에 비해 선택적인 또는 일반적으로 증가된 효능을 가진 조합적으로-유도된 변이체가 생성될 수 있다. 유사하게, 돌연변이유발은 상응하는 야생형 ActRIIA 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 가진 변이체를 야기할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질 분해 또는 천연 ActRIIA 폴리펩티드의 파괴 또는 다르게는 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 더 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 그러한 변이체 및 이들을 인코딩하는 유전자는 ActRIIA 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ActRIIA 폴리펩티드 수준을 변경시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 야기할 수 있고 대상체 내에서 재조합 ActRIIA 폴리펩티드 수준의 더 엄격한 제어를 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 단백질의 반감기를 변경시키기 위하여 (만일 있다면) 링커에서 및/또는 Fc 부분에서 이루어질 수 있다.

조합 라이브러리는 각각이 잠재적인 ActRIIA 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 포함하는, 폴리펩티드의 라이브러리를 인코딩하는 유전자들의 축퇴 라이브러리에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 ActRIIA 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서 또는 대안적으로 (예를 들어, 파아지 디스플레이를 위한) 더 큰 융합 단백질의 세트로서 발현가능하도록, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물이 유전자 서열로 효소적으로 결찰될 수 있다.

잠재적인 상동체의 라이브러리가 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있는 많은 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이어서 합성 유전자는 발현을 위한 적절한 벡터내로 결찰될 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참고). 그러한 기술은 다른 단백질의 지시된 진화에서 이용되었다(예를 들어, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 및 미국 특허 제5,223,409호, 5,198,346호 및 제5,096,815호 참고).

대안적으로, 조합 라이브러리를 생성하기 위하여 다른 형태의 돌연변이유발이 이용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 변이체는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 이용한 스크리닝에 의해(Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), 링커 스캐닝 돌연변이유발에 의해(Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); 포화 돌연변이유발에 의해(Meyers et al., (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이유발에 의해(Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 또는 화학적 돌연변이유발 등을 비롯한 무작위 돌연변이유발에 의해(Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34) 생성되고 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 특히 조합 세팅에서, 링커 스캐닝 돌연변이유발은 ActRIIA 폴리펩티드의 절단된(생활성) 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.

점 돌연변이 및 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해 그리고 그에 대해서라면, 소정의 특성을 가진 유전자 산물을 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 많은 다양한 기술이 본 기술분야에 알려져 있다. 그러한 기술은 일반적으로 ActRIIA 폴리펩티드의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적응가능할 것이다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 원하는 활성의 검출이 그 생성물이 검출된 유전자를 인코딩하는 벡터의 상대적으로 용이한 분리를 촉진하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 에세이은 액티빈 결합 에세이 및 액티빈-매개 세포 신호전달 에세이을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물의 억제제에서 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 것에 더하여 추가로 번역후 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그 결과, 변형된 ActRIIA 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리- 또는 모노-당류 및 포스페이트와 같은 비아미노산 요소를 함유할 수 있다. 그러한 비아미노산 요소의 ActRIIA 폴리펩티드의 기능성에 대한 영향은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 시험될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드가 ActRIIA 폴리펩티드의 천연 형태의 절단에 의해 세포에서 생산될 경우, 번역 후 프로세싱은 또한 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 세포(예를 들어, CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293)는 그러한 번역후 활성을 위해 특이적인 세포 기계 및 특징적인 기전을 가지며 ActRIIA 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 선택될 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물의 억제제에서 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ActRIIA 폴리펩티드의 적어도 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 가진 융합 단백질을 포함한다. 그러한 융합 도메인의 잘 알려진 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP) 또는 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 특히 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 분리를 위해 유용하다. 친화성 정제의 목적을 위하여, 글루타치온-, 아밀라제-, 및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지와 같은 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스가 사용된다. 많은 그러한 매트릭스가 (HIS₆) 융합 파트너에서 유용한, 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 퀴아익스프레스(QIAexpress).TM. 시스템(퀴아젠((Qiagen))과 같은, "키트" 형태로 이용가능하다. 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRIIA 폴리펩티드의 검출을 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 다양한 형광 단백질(예를 들어, GFP) 및 특이적 항체가 그를 위해 이용가능한 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 그를 위한 특이적 단클론 항체가 쉽게 이용가능한 잘 알려진 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자(Factor) Xa 또는 트롬빈을 위한 것과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이들은 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 분해하여 그로부터 재조합 단백질을 방출하도록 한다. 방출된 단백질은 이어서 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 생체내에서 ActRIIA 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인("안정화제" 도메인)과 융합된다. "안정화"는 파괴 감소, 신장에 의한 클리어런스 감소 또는 다른 약동학적 효과 중 무엇 때문이든지 관계없이, 혈청 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량체화(예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (필요하면, 뼈 성장 또는 근육 성장의 추가 자극과 같은 추가의 생물학적 기능을 부여하는)기능성 도메인을 포함한다.

융합 단백질의 상이한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 이종성 도메인에 C-말단으로 배치되거나 또는 대안적으로 이종성 도메인이 ActRIIA 폴리펩티드에 C-말단으로 배치될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드 도메인 및 이종성 도메인은 융합 단백질에서 인접할 필요는 없으며, 추가의 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 도메인에 C- 또는 N-말단으로 포함되거나 도메인 사이에 포함될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물의 억제제에서 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 그러한 변형은 ActRIIA 폴리펩티드의 시험관내(in vitro) 반감기를 향상시키거나, ActRIIA 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상시키거나 ActRIIA 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킬 수 있다. 그러한 안정화 변형은 (예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 및 안정화제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 비롯한) 융합 단백질, (예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드에 당화 부위의 부가를 비롯한) 당화 부위의 변형, 및 (예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 비롯한) 탄수화물 모이어티의 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 융합 단백질의 경우에, ActRIIA 폴리펩티드는 IgG 분자와 같은 안정화제 도메인(예를 들어, Fc 도메인)에 융합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정화제 도메인"은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인(예를 들어, Fc)뿐만 아니라 탄수화물 모이어티 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비단백질성 중합체와 같은 비단백질성 변형을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 분리된 및/또는 정제된 ActRIIA 폴리펩티드를 사용하며, 다시 말해, 다른 단백질로부터 분리된 또는 다르게는 다른 단백질이 실질적으로 없는 분리된 및/또는 정제된 형태의 ActRIIA 폴리펩티드가 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 생산될 수 있다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드는 본원에 개시된 단편, 기능성 변이체 및 융합 단백질을 비롯한, 임의의 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드)를 인코딩하는 분리된 및/또는 재조합 핵산을 이용하여 생성된다. 예를 들어, 서열 4는 자연 발생 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드를 인코딩하는 한편, 서열 5는 ActRIIA의 프로세싱된 세포외 도메인을 인코딩한다. 그러한 핵산은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 그러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드의 제조 방법에서 또는 (예를 들어, 유전자 치료법에서) 직접적인 치료제로서 사용될 수 있다.

일부 양태에서, ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 서열 4 또는 5의 변이체인 핵산을 포함할 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체와 같은, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 또는 재조합 핵산 서열은 서열 4 또는 5와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는100% 동일할 수 있다. 당업자는 서열 4 또는 5에 상보적인 핵산 서열 및 서열 4 또는 5의 변이체가 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 추가 실시양태에서, 그러한 핵산 서열은 분리되거나, 재조합성이거나 및/또는 이종성 뉴클레오티드 서열에 융합되거나, DNA 라이브러리로부터 유래될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산에서 사용되는 핵산은 매우 엄격한 조건하에서 서열 4 또는 5에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 4 또는 5의 상보 서열, 또는 그 단편에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 DNA 하이브리드화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0배 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 하이브리드화를 수행하고, 이어서 50℃에서 2.0배 SSC의 세척을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0배 SSC의 낮은 엄격도에서 50℃에서 약 0.2배의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격도 조건에서 약 65℃의 높은 엄격도 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염 둘 모두가 변화될 수 있거나, 다른 변수가 변화되는 한편 온도 또는 염 농도가 일정하게 유지될 수 있다. 일 실시양태에서, 실온에서 6배 SSC의 낮은 엄격도 조건하에서 하이브리드화한 후 실온에서 2배 SSC에서 세척되는 핵산이 본원에 개시된 방법과 조성물에서 이용될 수 있다.

유전자 코드에서의 축퇴성으로 인해 서열 4 또는 5에 개시된 핵산과 상이한 분리된 핵산이 또한 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 많은 아미노산이 하나보다 많은 트리플렛(triplet)에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 특정하는 코돈, 즉 동의어(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘을 위한 동의어임)는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 "침묵" 돌연변이를 야기할 수 있다. 하지만, 대상 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포 중에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)에서의 이들 변이가 자연적인 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 대상체중에 존재할 수 있음을 이해할 것이다.

특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 발현 구조체 내의 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 적절할 것이다. 많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 본 기술분야에 알려져 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 시그널 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 기술분야에 알려진 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 발명에서 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터이거나 하나보다 많은 프로모터의 요소를 조합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포에서 플라스미드와 같은 에피좀상에 존재할 수 있거나, 발현 구조체는 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 선별 마커 유전자를 함유한다. 선별 마커 유전자는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 사용되는 숙주 세포에 따라 변할 것이다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산에서 사용되는 핵산은 ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하며 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 제공될 수 있다. 조절 서열은 본 기술분야에 알려져 있으며 ActRIIA 폴리펩티드의 발현을 지시하기 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 개시된다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 다양한 발현 조절 서열 중 임의의 것이 ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들어, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 그 발현이 T7 RNA 폴리머라제에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질을 위한 조절 영역, 3-포스포글리서레이트 키나제 또는 다른 해당 효소를 위한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모.알파.-메이팅(mating) 인자의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 타입과 같은 인자에 의존할 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 벡터의 복제수, 항생제 마커와 같은 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질의 발현과 복제수를 조절하는 능력 또한 고려되어야 한다.

본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산에 사용되는 재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 둘 모두에서의 발현에 적합한 벡터 내로 결찰시켜 생산될 수 있다. 재조합 ActRIIA 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322-유도 플라스미드, pEMBL-유도 플라스미드, pEX-유도 플라스미드, pBTac-유도 플라스미드 및 pUC-유도 플라스미드 타입의 플라스미드를 포함한다.

일부 포유류 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 촉진하기 위한 원핵 서열 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위 둘 모두를 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도 벡터는 진핵 세포의 형질감염을 위해 적합한 포유류 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에서 복제 및 약물 내성 선별을 촉진하기 위하여 pBR322와 같은 박테리아 플라스미드로부터의 서열로 변형된다. 대안적으로, 소 파필로마 바이러스(BPV-1), 또는 엡스타인-바 바이러스(pHEBo, pREP-유도 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포에서의 단백질의 일시 발현을 위해 사용될 수 있다. (레트로바이러스를 비롯한) 다른 바이러스 발현 시스템의 예는 하기에서 유전자 치료 전달 시스템의 설명에서 찾을 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에서 이용되는 다양한 방법이 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 위한 다른 적합한 발현 시스템 및 일반적인 재조합 절차를 위해, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)를 참고한다. 일부 경우에, 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 배큘로바이러스 발현 시스템의 예는 pVL-유도 벡터(예를 들어, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도 벡터(예를 들어, pAcUW1), 및 pBlueBac-유도 벡터(예를 들어, .베타.-gal 함유 pBlueBac III)를 포함한다.

벡터는 Pcmv-Script 벡터(스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라욜라), pcDNA4 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드) 및 pCI-neo 벡터(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)와 같이, CHO 세포에서의 대상 ActRIIA 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 수 있다. 명백할 것처럼, 대상 유전자 구조체는 예를 들어, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 정제를 위하여 생산하기 위하여, 배양에서 증식된 세포에서 대상 ActRIIA 폴리펩티드의 발현을 야기하기 위해 사용될 수 있다.

하나 이상의 대상 ActRIIA 폴리펩티드를 위한 코딩 서열(예를 들어, 서열 4 또는 5)을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포는 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIA 폴리펩티드의 생산에서 사용될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 ActRIIA 폴리펩티드는 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 시스템 이용), 효모 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 ActRIIA 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRIIA 폴리펩티드의 발현이 일어나도록 하는 적절한 조건하에서 배양될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드는 분비되고 ActRIIA 폴리펩티드를 함유한 세포와 배지 혼합물로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, ActRIIA 폴리펩티드는 세포질내에 또는 막 분획에 보유될 수 있으며 세포가 수집되고 용해되고 단백질이 분리될 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 적합한 세포 배양 배지는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 대상 ActRIIA 폴리펩티드는 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 모두로부터, 이온-교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRIIA 폴리펩티드의 특정 에피토프에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제 및 ActRIIA 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 제제를 이용한 친화성 정제(예를 들어, ActRIIA-Fc 융합체를 정제하기 위하여 단백질 A 컬럼을 이용할 수 있음)를 비롯한, 단백질 정제를 위해 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 그의 정제를 촉진하는 도메인을 함유한 융합 단백질이다. 일 실시양태에서, 정제는 예를 들어, 하기 중 셋 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 이루어진다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 버퍼 교환으로 완결될 수 있다. 본원에서 입증되는 바처럼, ActRIIA-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정할 때 98% 초과의 순도 그리고 SDS PAGE에 의해 결정할 때 95% 초과의 순도로 정제되었다. 이 수준의 순도는 마우스에서 뼈에 대한 원하는 효과 및 마우스, 래트 및 비인간 영장류에서 허용가능한 안전성 프로파일을 이루기에 충분하였다.

다른 실시양태에서, 재조합 ActRIIA 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서의 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni² ⁺ 금속 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이어서 정제 리더 서열은 후속하여 엔테로키나제의 처리에 의해 제거되어 정제된 ActRIIA 폴리펩티드를 제공할 수 있다(예를 들어, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참고).

융합 유전자의 제조 기술은 잘 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위한 블런트-단부(blunt-ended) 말단 또는 스태거-단부(stagger-ended) 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 코헤시브 단부(cohesive end)의 충전(filling-in), 바람직하지 못한 연결을 피하기 위한 알카라인 포스파타제 처리 및 효소적 결찰을 이용하는 종래의 기술에 따라 수행된다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 비롯한 종래 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 후속하여 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두 개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 야기하는 앵커 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참고).

ActRIIA-Fc 융합 단백질은 서열 9의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 이용하여, 안정하게 형질감염된 CHO-DUKX Bl 1 세포에서 pAID4 벡터(SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 발현될 수 있다. Fc 부분은 서열 7에 나타난 대로, 인간 IgG1 Fc 서열이다. 특정 실시양태에서, 발현 시에, 함유된 단백질은 ActRIIA-Fc 융합 단백질 분자 당 약 1.5 내지 2.5몰 시알산을 평균적으로 갖는다.

특정 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합체의 긴 혈청 반감기는 인간 대상에서 25-32일일 수 있다. 추가적으로, CHO 세포 발현 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것보다 더 높은 액티빈 B 리간드에 대한 친화성을 가질 수 있다(del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35). 추가적으로, 이론에 구애됨 없이, TPA 리더 서열의 이용은 다른 리더 서열보다 더 많은 생산을 제공하였으며, 천연 리더를 가지고 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 고도로 순수한 N-말단 서열을 제공할 수 있다. 천연 리더 서열의 이용은 각각 상이한 N-말단 서열을 가진 두 가지의 주요 종의 ActRIIA-Fc를 생성할 수 있다.

8.5.2 ACTRIIB 신호전달의 억제제

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ActRIIB"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB) 단백질 패밀리 및 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 그러한 ActRIIB 단백질로부터 유도된 변이체를 말한다. 본원에서 ActRIIB의 언급은 현재 확인된 수용체 형태의 임의의 하나를 언급하는 것으로 이해된다. ActRIIB 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인-풍부 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 경막 도메인 및 예상된 세린/트레오닌 키나제 활성을 가진 세포질 도메인으로 이루어진 경막 단백질이다.

본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 제한없이, 액티빈-결합 가용성 ActRIIB 폴리펩티드; 액티빈(특히 β_A 또는 β_B로도 불리는 액티빈 A 또는 B 서브유닛)에 결합하고 ActRIIB 결합을 파괴하는 항체; ActRIIB에 결합하고 액티빈 결합을 파괴하는 항체; 액티빈 또는 ActRIIB 결합에 대해 선택된 비-항체 단백질; 및 Fc 도메인에 접합될 수 있는, 액티빈 또는 ActRIIB 결합을 위해 선택된 무작위화 펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 액티빈 또는 ActRIIB 결합 활성을 가진 둘 이상의 상이한 단백질(또는 다른 모이어티), 특히 각각 I형(예를 들어, 가용성 I형 액티빈 수용체) 및 II형(예를 들어, 가용성 II형 액티빈 수용체) 결합 부위를 차단하는 액티빈 결합제는 함께 연결되어, ActRIIB를 억제하고 따라서 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 수 있는 2기능성 또는 다기능성 결합 분자를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIB를 억제하는 액티빈-ActRIIB 신호전달 축 길항제는 핵산 앱타머, 소분자 및 본원에 개시된 조성물과 방법에 사용되는 다른 제제를 포함한다.

8.5.2.1 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB 신호전달 억제제

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 패밀리 구성원의 임의의 자연 발생 폴리펩티드 및 유용한 활성을 보유한 그의 임의의 변이체(돌연변이, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 서열에 적어도 약 80% 동일한, 그리고 선택적으로 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성의 서열을 가진 임의의 공지의 ActRIIB 수용체의 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 단백질 및/또는 액티빈에 결합하고 그 기능을 억제할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드(서열 16 또는 서열 28)을 포함한다. 그 아미노산 서열이 서열 16 또는 서열 28에 개시된 ActRIIB 전구체 폴리펩티드(즉, 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드)와 관련하여, ActRIIB 전구체 폴리펩티드의 시그널 펩티드는 아미노산 1 내지 18에 위치되며; 세포외 도메인은 아미노산 19 내지 134에 위치되며 잠재적인 N-결합 당화 부위는 아미노산 위치 42 내지 65에 위치된다. 서열 16의 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 서열 19로서 개시된다(서열 19는 아미노산 위치 64에 해당하는 코돈에서 알라닌을 제공하지만, 대신 아미노산 위치 64에 해당하는 코돈에서 아르기닌을 제공하기 위해 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 당업자에 의해 쉽게 변형될 수 있다). 서열의 설명을 위해서는 표 21을 참고한다.

본원에 개시된 모든 ActRIIB-관련 폴리펩티드를 위한 아미노산의 넘버링은 달리 구체적으로 지정되지 않으면, 서열 16 및 서열 28(위치 64에서 발현된 아미노산에서만 상이함)을 위한 아미노산 넘버링에 기초한다. 예를 들어, 만일 ActRIIB 폴리펩티드가 아미노산 위치 79에서 치환/돌연변이를 갖는 것으로 개시되면, 위치 79는 ActRIIB 폴리펩티드가 유래되는 서열 16 또는 서열 28에서 79^th 아미노산을 말하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 만일 ActRIIB 폴리펩티드가 아미노산 위치 64에서 알라닌 또는 아르기닌을 갖는 것으로 개시되면, 위치 64는 ActRIIB 폴리펩티드가 유래되는 서열 16 또는 서열 28에서 64^th 아미노산을 말하는 것으로 이해되어야 한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 ActRIIB의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, ActRIIB의 액티빈-결합 도메인은 ActRIIB의 세포외 도메인 또는 그 일부를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIB의 세포외 도메인 또는 그 일부는 가용성이다. ActRIIB 폴리펩티드의 예시적인 변형된 형태는 미국 특허 출원 공개 제20100068215호에 개시되며, 그 내용은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드이다. 용어 "가용성 ActRIIB 폴리펩티드"는 일반적으로 ActRIIB 단백질의 자연 발생 세포외 도메인 및 임의의 그 변이체(돌연변이, 단편 및 펩티드모방체 형태 포함)를 비롯한 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 액티빈에 결합할 수 있지만; 야생형 ActRIIB 단백질은 GDF8/11에 비해 액티빈에 결합함에 있어서 유의한 선택성을 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 상이한 결합 특성을 가진 변형된 형태의 ActRIIB가 본 발명에서 제공된 방법에 사용될 수 있다. 그러한 변형된 형태는 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/012627호 및 WO 2010/019261호에 개시되며 그 내용은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다. 천연 또는 변형 ActRIIB 단백질은 그들을 제2의 액티빈-선택적 결합 제제와 커플링시킴으로써 액티빈에 대한 선택성이 부가될 수 있다. 가용성의 ActRIIB 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43)을 포함한다.

ActRIIB 전구체 아미노산 서열, 즉 서열 번호 16의 아미노산 64에 상응하는 위치에서 알라닌을 가진(본원에서 "A64"로 불림), 힐덴 등(Hilden et al.)(Blood, 1994, 83(8):2163-70)에 의해 개시된 ActRIIB 세포외 서열을 가진 Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF-11에 대해 상대적으로 낮은 친화성을 보유하는 것으로 입증되었다. 대조적으로, ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 위치 64에서 아르기닌을 가진(본원에서 "R64"로 불림) Fc 융합 단백질은 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위에서 액티빈 및 GDF-11에 대해 친화성을 갖는다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제20100068215호를 참고하며 그 내용은 그 전체가 참고로 본원에 통합됨). 위치 64에서 아르기닌을 가진 ActRIIB 전구체 아미노산 서열은 서열 28에 제시된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 (i) ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 아미노산 64에 상응하는 위치에서 알라닌, 즉, 서열 16; 또는 (ii) ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 위치 64에서 아르기닌, 즉, 서열 28을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 아미노산 64에 상응하는 위치에서 알라닌 또는 아르기닌, 즉, 서열 16 또는 서열 28이 아닌, 아미노산을 포함할 수 있다.

ActRIIB의 세포외 도메인의 C-말단에서 프롤린 노트(knot)의 결실이 액티빈에 대한 수용체의 친화성을 감소시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Attisano et al., Cell, 1992, 68(1):97-108 참고). 서열 28의 아미노산 20-119(즉, 서열 32)를 함유한 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-119)-Fc"는 서열 28의 아미노산 20-134(즉, 서열 31)을 함유한 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-134)-Fc" - 프롤린 노트 영역 및 완전한 막인접 도메인(juxtamembrane domain)을 포함-에 비해 GDF-11 및 액티빈에의 결합이 감소되었다. 그러나, 서열 28의 아미노산 20-129를 함유한 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-129)-Fc"는 프롤린 노트 영역이 파괴되었지만, ActRIIB의 비절단 세포외 도메인에 비해 유사하지만 다소 감소된 활성을 갖는다. 따라서, 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129에서 중지하는 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드는 모두 활성일 것으로 예상되지만, 아미노산 134 또는 133에서 중지하는 구조체가 가장 활성일 수 있다. 유사하게, 잔기 129-134 중 임의의 잔기에서의 돌연변이는, 서열 28의 P129 및 P130의 돌연변이가 리간드 결합을 실질적으로 감소시키지 않는다는 사실에 의해 나타난 것처럼, 큰 차이로 리간드 결합 친화성을 변경할 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 방법과 조성물에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 109(즉, 마지막 시스테인)에서만큼 초기에 종결할 수 있지만, 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 위치 109와 119 사이에서 종결되는 형태는 감소된 리간드 결합 능력을 가질 것으로 예상된다.

서열 16 및 서열 28의 아미노산 29는 ActRIIB 전구체 서열에서 최초 시스테인을 나타낸다. 서열 16 또는 서열 28의 N-말단의 아미노산 29에서 시작하거나 이들 아미노산 위치 전에 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 리간드 결합 활성을 보유할 것으로 예상된다. 서열 16 또는 서열 28의 위치 24에서 알라닌에서 아스파라긴으로의 돌연변이는 리간드 결합에 실질적으로 영향을 주지 않고 N-결합 당화 서열을 도입한다. 이것은 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29에 상응하는, 시그널 절단 펩티드 및 시스테인 가교 영역 사이의 영역에서의 돌연변이가 잘 용인됨을 확인한다. 구체적으로, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 20, 21, 22, 23 및 24에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 활성을 보유할 것이며, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 25, 26, 27, 28 및 29에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드 또한 활성을 보유할 것으로 예상된다. 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 22, 23, 24 또는 25에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 최대 활성을 가질 것이다.

함께 고려할 때, 본원에 개시된 방법과 조성물에 따라 사용될 ActRIIB 전구체 단백질(즉, 서열 16 또는 서열 28)의 활성 부분(즉, ActRIIB 폴리펩티드)은 일반적으로 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109를 포함할 것이며, 그러한 ActRIIB 폴리펩티드는 예를 들어, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 19-29 중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-134 중 임의의 하나에 상응하는 잔기에서 끝난다. 본 발명에 포함되는 ActRIIB 폴리펩티드의 구체적인 예는 서열 16 또는 서열 28의 19-29, 20-29 또는 21-29로부터의 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 119-134, 119-133 또는 129-134, 129-133로부터의 아미노산 위치에서 끝나는 것들을 포함한다. 본 발명에 포함되는 ActRIIB 폴리펩티드의 다른 구체적인 예는 서열 16 또는 서열 28의 20-24(또는 21-24, 또는 22-25)로부터의 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 109-134(또는 109-133), 119-134(또는 119-133) 또는 129-134(또는 129-133)로부터의 아미노산 위치에서 끝나는 것들을 포함한다. 이들 범위 내에 속하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드 또한 고려되며, 특히 서열 16 또는 서열 28의 상응하는 부분에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 서열 상동성을 가진 것들이 고려된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 ActRIIB의 세포외 도메인의 절단된 형태를 포함한다. 절단은 ActRIIB 폴리펩티드의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에서 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 N-말단 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 C-말단 아미노산일 수 있다. 예를 들어, ActRIIB의 절단된 형태는 아미노산 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 및 25-131을 가진 폴리펩티드를 포함하며, 이때 아미노산 위치는 서열 16 또는 서열 28 내의 아미노산 위치를 말한다.

ActRIIB의 추가의 예시적인 절단된 형태는 (i) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 어느 아미노산에서 시작하고(선택적으로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-134 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (ii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 어느 아미노산에서 시작하고(선택적으로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (iii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 어느 아미노산에서 시작하고(선택적으로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (iv) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-24 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-134 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (v) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드 ; (vi) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-24 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-134 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (vii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (viii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (ix) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-134 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (x) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; (xi) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-134 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드; 및 (xii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 어느 아미노산에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 어느 아미노산에서 끝나는 폴리펩티드를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 25에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 131에서 끝나는 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나 이루어진다. 다른 구체적인 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 또는 43의 아미노산 서열로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.

본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 임의의 ActRIIB 폴리펩티드는 동종이량체로서 생산될 수 있다. 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 임의의 ActRIIB 폴리펩티드는 Fc 도메인과 같은 IgG 중쇄로부터의 불변 영역을 포함하는 이종성 부분을 가진 융합 단백질로서 제제화될 수 있다. 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 임의의 ActRIIB 폴리펩티드는 선택적으로 서열 16 또는 서열 28에 비해 하나 이상의 추가의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입과 조합되어, 서열 16 또는 서열 28의 위치 79에 상응하는 위치에서 산성 아미노산을 포함할 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 하나 이상의 아미노산 치환/돌연변이를 가진 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함한다. 그러한 아미노산 치환/돌연변이는 예를 들어, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 79에서의 루이신으로부터 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 아미노산으로의 교환일 수 있다. 예를 들어, 서열 16 또는 서열 28의 위치 L79는 변경된 액티빈-미오스타틴(GDF-11) 결합 특성을 부여하기 위하여 ActRIIB 세포외 도메인 폴리펩티드에서 변경될 수 있다. L79A 및 L79P 돌연변이는 액티빈 결합보다 더 큰 정도로 GDF-11 결합을 감소시킨다. L79E 및 L79D 돌연변이는 크게 감소된 액티빈 결합을 나타내는 한편, GDF-11 결합을 보유한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 역시 아미노산 치환, 예를 들어, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 79에서의 루이신으로부터 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 아미노산으로의 교환을 보유하는 ActRIIB 세포외 도메인의 절단된 형태를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 아미노산 치환을 또한 보유하는 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인의 절단된 형태는 서열 23이다. 절단되고/되거나 하나 이상의 아미노산 치환을 보유하는 ActRIIB 형태는 상술한 대로 항체의 Fc 도메인에 결합될 수 있다.

ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 또한, 단편은 종래의 메리필드 고체상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 당업자가 인식할 것처럼, 예를 들어 펩티드 합성을 위한 다양한 수지 및 용액상 시스템을 비롯한 다른 기술이 본원에 개시된 펩티드 단편을 합성하기 위해 사용될 수 있다. 단편은 (재조합적으로 또는 화학 합성에 의해) 생산될 수 있으며 ActRIIB 단백질 또는 액티빈에 의해 매개된 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 펩티드 단편을 확인하기 위해 시험될 수 있다.

또한, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 활성 변이체는 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 상응하는 돌연변이유발된 핵산으로부터 재조합적으로 생산된 변형된 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 변이체는 생산되어 ActRIIB 단백질 또는 액티빈에 의해 매개된 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 것들을 확인하기 위해 시험될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 변이체는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

기능적 변이체는 예를 들어, 치료 효능 또는 안정성(예를 들어, 엑스 비보 반감기 및 생체내에서 단백질분해에 대한 저항성) 향상과 같은 목적을 위해 ActRIIB 폴리펩티드의 구조를 변형시켜 생성될 수 있다. 액티빈 결합을 보유하도록 선택될 경우 그러한 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 자연 발생 ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 등가물로 간주된다. 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이소루이신 또는 발린으로 루이신의 분리된 교체, 글루타메이트로 아스파테이트의 교체, 세린으로 트레오닌의 교체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 교체(예를 들어, 보존적 돌연변이)는 생성되는 분자의 생물 활성에 별 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 보존적 교체는 그들의 측쇄에서 관련되는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 교체이다. ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 변화가 기능적 상동체를 생성하는지 여부는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드가 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 생성하는 능력을 평가함으로써 쉽게 결정될 수 있다.

ActRIIB 폴리펩티드 돌연변이, 특히 ActRIIB 폴리펩티드의 조합 돌연변이 세트, 및 절단 돌연변이; 조합 돌연변이 풀은 특히 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용될 수 있는 기능적 변이체 서열을 확인하는데 유용하다. 그러한 조합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들어, 아고니스트 또는 길항제로서 작용할 수 있는 또는 대안적으로는 모두 함께 새로운 활성을 보유하는 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 생성하는 것일 수 있다.

ActRIIB의 리간드 결합 포켓은 서열 16 또는 서열 28의 잔기 Y31, N33, N35, L38 내지 T41, E47, E50, Q53 내지 K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, A92, 및 E94 내지 F101에 의해 정의되는 것으로 입증되었다. 이들 위치에서, R40A, K55A, F82A 및 위치 L79에서의 돌연변이처럼, K74A 돌연변이가 잘-용인되지만, 보존적 돌연변이가 용인될 것으로 예상된다. R40은 손톱개구리속(Xenopus)에서 K여서, 이 위치에서 염기성 아미노산이 용인될 것임을 나타낸다. Q53은 소 ActRIIB에서는 R이고 손톱개구리속 ActRIIB에서는 K이며, 따라서, R, K, Q, N 및 H를 포함하는 아미노산이 이 위치에서 용인될 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기 위한 ActRIIB 폴리펩티드를 위한 일반식은 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109를 포함하지만 선택적으로 서열 16 또는 서열 28의 20-24 또는 22-25 범위의 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 129-134 범위의 아미노산 위치에서 끝나며, 리간드 결합 포켓에서 1, 2, 5, 또는 15 이하의 보존적 아미노산 변화 및 리간드 결합 포켓에서 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0, 1 또는 그보다 많은 비보존적 변경을 포함하는 것이다. 그러한 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109의 서열에 80%, 90%, 95% 또는 99% 초과 서열 동일성 또는 서열 상동성을 보유할 수 있다. 가변성이 특히 잘 용인될 수 있는, 결합 포켓 밖의 부위는 ActRIIB의 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 및 위치 42-46 및 65-73을 포함한다. 서열 16 또는 서열 28의 위치 65에서 아스파라긴에서 알라닌으로의 변경(N65A)은 사실상 A64 배경에서 리간드 결합을 개선하며, 따라서 R64 배경에서 리간드 결합에 해로운 영향을 갖지 않을 것으로 예상된다. 이 변화는 아마도 A64 배경에서 N65에서의 당화를 제거하여, 이 영역에서의 유의한 변화가 용인되기 쉬울 것임을 입증한다. R64A 변화는 잘 용인되지 않는 한편, R64K는 잘-용인되며, 따라서 H와 같은 다른 염기성 잔기가 위치 64에서 용인될 수 있다.

리간드 결합 도메인에서 돌연변이를 가진 ActRIIB 폴리펩티드의 구체적인 예로서, ActRIIB의 리간드-결합 도메인의 양으로 하전된 아미노산 잔기 Asp(D80)은 변이체 ActRIIB 폴리펩티드가 우선적으로 GDF8에 결합하지만 액티빈에는 결합하지 않도록 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, D80 잔기는 비하전 아미노산 잔기, 음성 아미노산 잔기 및 소수성 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변화된다. 추가의 구체적인 예로서, 소수성 잔기 L79는 GDF11 결합을 유지하는 한편 액티빈 결합을 크게 감소시키기 위하여 산성 아미노산 아스파르트산 또는 글루탐산으로 변경될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 것처럼, 대부분의 개시된 돌연변이, 변이체 또는 변형은 핵산 수준에서 만들어질 수 있거나, 일부 경우에는 번역 후 변형 또는 화학 합성에 의해 만들어질 수 있다. 그러한 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달의 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인(예를 들어, 액티빈-결합 도메인)을 포함하는 접합체/융합 단백질을 포함한다. 그러한 접합체/융합 단백질은 본원에 개시된 임의의 ActRIIB 폴리펩티드(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 또는 43중 임의의 것), 본 기술분야에 알려진 임의의 ActRIIB 폴리펩티드, 또는 본 기술분야에 알려지거나 본 발명에서 제공되는 방법을 이용하여 생성된 임의의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포외 도메인은 링커, 예를 들어, 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다. 예시적인 링커는 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 아미노산 잔기(예를 들어, 글리신 잔기)와 같은 짧은 폴리펩티드 서열, 예를 들어, Gly-Gly-Gly 링커를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly(GGG)을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 Thr-Gly-Gly-Gly (TGGG)를 포함한다. 선택적으로, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이(예를 들어, Asp-265 돌연변이)를 가진 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 감소된다. 다른 경우에, 하나 이상의 이들 돌연변이 (예를 들어, Asn-434 돌연변이)를 가진 돌연변이 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC 클래스 I-관련 Fc-수용체(FcRN)에 결합하는 능력이 증가된다. Fc 도메인에 융합된 ActRIIB의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 융합 단백질은 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47에 개시된다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된, ActRIIB의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하며, 상기 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRIIB 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된, ActRIIB의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하며, 상기 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이며, 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인은 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 79에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 보유한다. 일 실시양태에서, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 79에 상응하는 아미노산 위치에서 아미노산 치환은 아스파르트산을 위한 루이신의 치환(즉, L79D 돌연변이)이다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 24 또는 25이며, 이들은 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질을 나타내며, 상기 ActRIIB 세포외 도메인은 L79D 돌연변이를 가진 서열 28의 아미노산 25-131을 포함한다. 서열 24의 ActRIIB-Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열 45에 제시된다.

다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 34 또는 35이며, 이들은 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질을 나타내며, 상기 ActRIIB 세포외 도메인은 L79D 돌연변이를 가진 서열 16의 아미노산 25-131을 포함한다.

아스파라긴-결합 당화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌(또는 아스파라긴-X-세린)(여기서 "X"는 임의의 아미노산임)을 포함한다. 변경은 또한 (O-결합 당화 부위를 위한) 야생형 ActRIIB 폴리펩티드의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환에 의해 만들어질 수 있다. 당화 인식 부위의 첫번째 또는 세번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두번째 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비당화를 야기한다. ActRIIB 폴리펩티드상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 ActRIIB 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실기; (c) 시스테인의 설프히드릴기와 같은 자유 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 하이드록실기와 같은 자유 하이드록실기; (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기와 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일에 공개된 국제 특허 출원 WO 87/05330호 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 개시되며, 참고로 본원에 통합된다. ActRIIB 폴리펩티드상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 이루어질 수 있다. 화학적 탈당화는 예를 들어, 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가의 화합물에 ActRIIB 폴리펩티드를 노출하는 것에 관련될 수 있다. 이 처리는 결합 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 야기하는 한편, 아미노산 서열을 그대로 둔다. 화학적 탈당화는 추가로 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 의해 개시된다. ActRIIB 폴리펩티드의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 개시된 대로 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입할 수 있으므로, ActRIIB 폴리펩티드의 서열은 사용되는 발현 시스템의 타입에 따라 적절히 조절될 수 있다. 일반적으로, 인간에서의 사용을 위한 ActRIIB 단백질은 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포주에서 발현될 것이지만, 다른 포유류 발현 세포주, 조작된 당화 효소를 가진 효모 세포주 및 곤충 세포와 같은 다른 발현 시스템 또한 유용할 것으로 예상된다.

구체적인 실시양태에서, ActRIIB(R64)-Fc 형태에 비해, ActRIIB-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 추가의 N-결합 당화 부위(N-X-S/T)의 부가를 포함하는 돌연변이된 ActRIIB 폴리펩티드는 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 서열 16 또는 서열 28의 위치 24에서 아스파라긴의 도입(A24N)은 더 긴 반감기를 부여하는 NXT 서열의 생성을 야기한다. 다른 NX(T/S) 서열은 42-44(NQS) 및 65-67(NSS)에서 발견될 수 있으나, 후자는 위치 64에서 R로(즉, R64 폴리펩티드에서) 효율적으로 당화되지 않을 수 있다. N-X-S/T 서열은 일반적으로 상기에서 설명된 ActRIIB의 리간드 결합 포켓 밖의 위치에서 도입될 수 있다. 비내인성 N-X-S/T 서열의 도입을 위해 특히 적합한 부위는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134를 포함한다. N-X-S/T 서열은 또한 ActRIIB 서열과 Fc 또는 다른 융합 성분 사이의 링커 내로 도입될 수 있다. 그러한 부위는 기존의 S 또는 T에 대하여 정확한 위치에서 N을 도입함으로써, 또는 기존의 N에 상응하는 위치에서 S 또는 T를 도입함으로써, 최소의 노력으로 도입될 수 있다. 따라서, N-결합 당화 부위를 생성하는 바람직한 변경은 A24N, R64N, S67N(가능하게는 N65A 변경과 조합됨), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T이다(모든 아미노산 위치는 그들이 서열 16 또는 서열 28에서 발견될 수 있는 위치에 상응함). 당화될 것으로 예측되는 임의의 S는 당화에 의해 제공되는 보호 때문에, 면역원 부위의 생성없이 T로 변경될 수 있다. 유사하게, 당화될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서, 변경 S67T 및 S44T는 본 발명에서 포함된다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변경이 이용될 수 있다. 따라서, ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 비내인성 N-결합 당화 컨센서스 서열을 포함할 수 있다.

다양한 스크리닝 에세이은 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 평가하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 변이체는 ActRIIB 리간드에 결합하거나, ActRIIB 폴리펩티드에의 ActRIIB 리간드의 결합을 방지하거나 ActRIIB 리간드에 의해 야기된 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드 또는 그의 변이체의 활성은 또한 세포-기반 또는 생체내 에세이에서 시험될 수 있다.

자연 발생 ActRIIB 폴리펩티드에 비해 선택적인 또는 일반적으로 증가된 효능을 가진 조합적으로-유도된 변이체가 생성될 수 있다. 유사하게, 돌연변이유발은 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 가진 변이체를 야기할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질 분해 또는 천연 ActRIIB 폴리펩티드의 파괴 또는 다르게는 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 더 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 그러한 변이체 및 이들을 인코딩하는 유전자는 ActRIIB 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ActRIIB 폴리펩티드 수준을 변경시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 야기할 수 있고 대상체 내에서 재조합 ActRIIB 폴리펩티드 수준의 더 엄격한 제어를 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 단백질의 반감기를 변경시키기 위하여 (만일 있다면) 링커에서 및/또는 Fc 부분에서 이루어질 수 있다.

조합 라이브러리는 각각이 잠재적인 ActRIIB 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 인코딩하는 유전자들의 축퇴 라이브러리에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 ActRIIB 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서 또는 대안적으로 (예를 들어, 파아지 디스플레이를 위한) 더 큰 융합 단백질의 세트로서 발현가능하도록, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물이 유전자 서열로 효소적으로 결찰될 수 있다.

잠재적인 상동체의 라이브러리가 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있는 많은 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이어서 합성 유전자는 발현을 위한 적절한 벡터내로 결찰될 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참고). 그러한 기술은 다른 단백질의 지시된 진화에서 이용되었다(예를 들어, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 및 미국 특허 5,223,409호, 5,198,346호 및 5,096,815호 참고).

대안적으로, 조합 라이브러리를 생성하기 위하여 다른 형태의 돌연변이유발이 이용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 변이체는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 이용한 스크리닝에 의해(Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), 링커 스캐닝 돌연변이유발에 의해(Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); 포화 돌연변이유발에 의해(Meyers et al., (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이유발에 의해(Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 또는 화학적 돌연변이유발 등을 비롯한 무작위 돌연변이유발에 의해(Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34) 생성되고 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 특히 조합 세팅에서, 링커 스캐닝 돌연변이유발은 ActRIIB 폴리펩티드의 절단된(생활성) 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.

점 돌연변이 및 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하기 위해 그리고 그에 대해서라면, 소정의 특성을 가진 유전자 산물을 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 많은 다양한 기술이 본 기술분야에 알려져 있다. 그러한 기술은 일반적으로 ActRIIB 폴리펩티드의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적응가능할 것이다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키고, 원하는 활성의 검출이 그 생성물이 검출된 유전자를 인코딩하는 벡터의 상대적으로 용이한 분리를 촉진하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 에세이은 액티빈 결합 에세이 및 액티빈-매개 세포 신호전달 에세이을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 추가로 ActRIIB 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 것에 더하여 번역후 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그 결과, 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리- 또는 모노-당류 및 포스페이트와 같은 비아미노산 요소를 함유할 수 있다. 그러한 비아미노산 요소의 ActRIIB 폴리펩티드의 기능성에 대한 영향은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 시험될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드가 ActRIIB 폴리펩티드의 천연 형태의 절단에 의해 세포에서 생산될 경우, 번역 후 프로세싱은 또한 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 세포(예를 들어, CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293)는 그러한 번역후 활성을 위해 특이적인 세포 기계 및 특징적인 기전을 가지며 ActRIIB 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 선택될 수 있다.

일부 경우에, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ActRIIB 폴리펩티드의 적어도 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 가진 융합 단백질을 포함한다. 그러한 융합 도메인의 잘 알려진 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토스 결합 단백질 (MBP) 또는 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 특히 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 분리를 위해 유용하다. 친화성 정제의 목적을 위하여, 글루타치온-, 아밀라제-, 및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지와 같은 친화성 크로마토그래피를 위한 관련 매트릭스가 사용된다. 많은 그러한 매트릭스가 (HIS₆) 융합 파트너에서 유용한, 파마시아 GST 정제 시스템 및 퀴아익스프레스TM 시스템(퀴아젠)과 같은, "키트" 형태로 이용가능하다. 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRIIB 폴리펩티드의 검출을 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 다양한 형광 단백질(예를 들어, GFP) 및 그를 위한 특이적 항체가 이용가능한 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 그를 위한 특이적 단클론 항체가 쉽게 이용가능한 잘 알려진 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자(Factor) Xa 또는 트롬빈을 위한 것과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이들은 관련 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 분해하여 그로부터 재조합 단백질을 방출하도록 한다. 방출된 단백질은 이어서 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 생체내에서 ActRIIB 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인("안정화제" 도메인)과 융합된다. "안정화"는 파괴 감소, 신장에 의한 클리어런스 감소 또는 다른 약동학적 효과 중 무엇 때문이든지 관계없이, 혈청 반감기를 증가시키는 임의의 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량체화(예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (필요하면, 뼈 성장 또는 근육 성장의 추가 자극과 같은 추가의 생물학적 기능을 부여하는)기능성 도메인을 포함한다.

융합 단백질의 상이한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 이종성 도메인에 C-말단으로 배치되거나 또는 대안적으로 이종성 도메인이 ActRIIB 폴리펩티드에 C-말단으로 배치될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드 도메인 및 이종성 도메인은 융합 단백질에서 인접할 필요는 없으며, 추가의 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 도메인에 C- 또는 N-말단으로 포함되거나 도메인 사이에 포함될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, 그러한 변형은 ActRIIB 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 향상시키거나, ActRIIB 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상시키거나 ActRIIB 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킬 수 있다. 그러한 안정화 변형은 (예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 및 안정화제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 비롯한) 융합 단백질, (예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드에 당화 부위의 부가를 비롯한) 당화 부위의 변형, 및 (예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 비롯한) 탄수화물 모이어티의 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 융합 단백질의 경우에, ActRIIB 폴리펩티드는 IgG 분자와 같은 안정화제 도메인(예를 들어, Fc 도메인)에 융합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정화제 도메인"은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인(예를 들어, Fc)을 언급할 뿐만 아니라, 탄수화물 모이어티 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비단백질성 중합체와 같은 비단백질성 변형을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물은 다른 단백질로부터 분리된 또는 다르게는 다른 단백질이 실질적으로 없는 분리된 또는 정제된 ActRIIB 폴리펩티드를 사용한다. ActRIIB 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 생산될 것이다.

특정 양태에서, 본원에 개시된 단편, 기능성 변이체 및 융합 단백질을 비롯한, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 분리된 및/또는 재조합 핵산에 의해 인코딩된다. 예를 들어, 서열 19는 자연 발생 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 인코딩한다. 대상 핵산은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 그러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드의 제조 방법에서 또는 (예를 들어, 유전자 치료법에서) 직접적인 치료제로서 사용될 수 있다.

특정 양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 핵산은 추가로 서열 19의 변이체인 핵산 및 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 이들 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산)의 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립유전자 변이체와 같은, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실만큼 상이한 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 분리된 또는 재조합 핵산 서열은 서열 19와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이다(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산 서열). 당업자는 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산), 및 서열 19 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산)의 변이체에 상보적인 핵산 서열이 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 추가 실시양태에서, 핵산 서열은 분리되거나, 재조합성이거나 및/또는 이종성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, 또는 DNA 라이브러리내에 있을 수 있다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 핵산은 매우 엄격한 조건하에서 서열 19에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산), 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산)의 상보 서열, 또는 그 단편에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업자는 DNA 하이브리드화를 촉진하는 적절한 엄격도 조건이 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 약 45℃에서 6.0배 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서 하이브리드화를 수행하고, 이어서 50℃에서 2.0배 SSC의 세척을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 약 2.0배 SSC의 낮은 엄격도에서 50℃에서 약 0.2배의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격도 조건에서 약 65℃의 높은 엄격도 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염 둘 모두가 변화될 수 있거나, 다른 변수가 변화되는 한편 온도 또는 염 농도가 일정하게 유지될 수 있다. 일 실시양태에서, 실온에서 6배 SSC의 낮은 엄격도 조건하에서 하이브리드화한 후 실온에서 2배 SSC에서 세척되는 핵산이 본원에 개시된 방법과 조성물에서 이용될 수 있다.

유전자 코드에서의 축퇴성으로 인해 서열 19에 개시된 핵산 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산)과 상이한 분리된 핵산이 또한 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드의 생산에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 많은 아미노산이 하나보다 많은 트리플렛에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 특정하는 코돈, 즉 동의어(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘을 위한 동의어임)는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 "침묵" 돌연변이를 야기할 수 있다. 하지만, 대상 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포 중에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)에서의 이들 변이가 자연적인 대립유전자 변이로 인해 주어진 종의 대상체중에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 그리고 모든 그러한 뉴클레오티드 변이 및 생성되는 아미노산 다형성이 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 재조합 핵산은 발현 구조체 내의 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 적절할 것이다. 많은 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 본 기술분야에 알려져 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 시그널 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 기술분야에 알려진 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 발명에 개시된 방법과 조성물에서 사용될 수 있다. 프로모터는 자연 발생 프로모터이거나 하나보다 많은 프로모터의 요소를 조합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포에서 플라스미드와 같은 에피좀상에 존재할 수 있거나, 발현 구조체는 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 선별 마커 유전자를 함유한다. 선별 마커 유전자는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 사용되는 숙주 세포에 따라 변할 것이다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있는 핵산은 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하며 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 제공될 수 있다. 조절 서열은 본 기술분야에 알려져 있으며 ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 지시하기 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 개시된다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 다양한 발현 조절 서열 중 임의의 것이 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 그러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들어, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 급초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 그 발현이 T7 RNA 폴리머라제에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질을 위한 조절 영역, 3-포스포글리서레이트 키나제 또는 다른 해당 효소를 위한 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모.알파.-메이팅 인자의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 그들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열, 및 그의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현시키고자 하는 단백질의 타입과 같은 인자에 의존할 수 있음이 이해되어야 한다. 더욱이, 벡터의 복제수, 항생제 마커와 같은 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질의 발현과 복제수를 조절하는 능력 또한 고려되어야 한다.

재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 둘 모두에서의 발현에 적합한 벡터 내로 결찰시켜 생산될 수 있다. 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 이. 콜라이와 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pBR322-유도 플라스미드, pEMBL-유도 플라스미드, pEX-유도 플라스미드, pBTac-유도 플라스미드 및 pUC-유도 플라스미드 타입의 플라스미드를 포함한다.

일 실시양태에서, 벡터는 Pcmv-Script 벡터(스트라타진, 캘리포니아주 라욜라), pcDNA4 벡터(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드) 및 pCI-neo 벡터(프로메가, 위스콘신주 매디슨)와 같이, CHO 세포에서의 본원에 개시된 방법과 조성물에 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 수 있다. 명백할 것처럼, 대상 유전자 구조체는 예를 들어, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 정제를 위하여 생산하기 위하여, 배양에서 증식된 세포에서 대상 ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 야기하기 위해 사용될 수 있다.

하나 이상의 대상 ActRIIB 폴리펩티드를 위한 코딩 서열(예를 들어, 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 인코딩하는 핵산))을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포는 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용하기에 적합한 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현 시스템 이용), 효모 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다.

따라서, 본 발명은 본원에 개시된 방법과 조성물에서 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드의 생산 방법을 제공한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRIIB 폴리펩티드의 발현이 일어나도록 하는 적절한 조건하에서 배양될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 분비되고 ActRIIB 폴리펩티드를 함유한 세포와 배지 혼합물로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, ActRIIB 폴리펩티드는 세포질내에 또는 막 분획에 보유될 수 있으며 세포가 수집되고 용해되고 단백질이 분리될 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 적합한 세포 배양 배지는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 대상 ActRIIB 폴리펩티드는 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 모두로부터, 이온-교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRIIB 폴리펩티드의 특정 에피토프에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제 및 ActRIIB 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 제제를 이용한 친화성 정제(예를 들어, ActRIIB-Fc 융합체를 정제하기 위하여 단백질 A 컬럼을 이용할 수 있음)를 비롯한, 단백질 정제를 위해 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 그의 정제를 촉진하는 도메인을 함유한 융합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 정제는 예를 들어, 하기 중 셋 이상을 임의의 순서로 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 이루어진다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 버퍼 교환으로 완결될 수 있다. 본원에서 입증되는 바처럼, ActRIIB-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정할 때 98% 초과의 순도 그리고 SDS PAGE에 의해 결정할 때 95% 초과의 순도로 정제되었다. 이 수준의 순도는 마우스에서 뼈에 대한 원하는 효과 및 마우스, 래트 및 비인간 영장류에서 허용가능한 안전성 프로파일을 이루기에 충분하였다.

다른 실시양태에서, 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서의 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni² ⁺ 금속 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이어서 정제 리더 서열은 후속하여 엔테로키나제의 처리에 의해 제거되어 정제된 ActRIIB 폴리펩티드를 제공할 수 있다(예를 들어, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참고).

융합 유전자의 제조 기술은 잘 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위해 블런트-단부 말단 또는 스태거-단부 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 적절한 코헤시브 단부의 충전, 바람직하지 못한 연결을 피하기 위한 알카라인 포스파타제 처리 및 효소적 결찰을 이용하는 종래의 기술에 따라 수행된다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 비롯한 종래 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 후속하여 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두 개의 연속적인 유전자 단편 사이의 상보적 오버행을 야기하는 앵커 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참고).

ActRIIB-Fc 융합 단백질은 서열 8의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 이용하여, 안정하게 형질감염된 CHO-DUKX Bl 1 세포에서 pAID4 벡터(SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 발현될 수 있다. Fc 부분은 서열 7에 나타난 대로, 인간 IgG1 Fc 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현 시에, 함유된 단백질은 ActRIIB-Fc 융합 단백질 분자 당 약 1.5 내지 2.5몰 시알산을 평균적으로 갖는다.

특정 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합체의 긴 혈청 반감기는 인간 대상체에서 25-32일일 수 있다. 추가적으로, CHO 세포 발현 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIB-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것보다 더 높은 액티빈 B 리간드에 대한 친화성을 가질 수 있다(del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35). 추가적으로, 이론에 구애됨 없이, TPA 리더 서열의 이용은 다른 리더 서열보다 더 많은 생산을 제공하였으며, 천연 리더를 가지고 발현된 ActRIIB-Fc와 달리, 고도로 순수한 N-말단 서열을 제공할 수 있다. 천연 리더 서열의 이용은 각각 상이한 N-말단 서열을 가진 두 가지의 주요 종의 ActRIIB-Fc를 생성할 수 있다.

8.5.3 다른 ActRII 수용체 신호전달 억제제

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRII 신호전달의 억제제는 핵산 화합물이다.

ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물 카테고리의 예는 안티센스 핵산, siRNA 또는 RNAi 구조체 및 촉매 핵산 구조체를 포함한다. 핵산 화합물은 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 이중쇄 화합물은 또한 오버행 또는 비상보성 영역을 포함할 수 있으며, 이때 쇄 중 하나 또는 다른 하나는 단일쇄이다. 단일쇄 화합물은 자기-상보성 영역을 포함할 수 있어서, 그 화합물이 이중 헬릭스 구조 영역을 가진, 소위 "헤어핀" 또는 "스템-루프" 구조를 형성할 수 있음을 의미한다.

특정 실시양태에서, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 전길이 ActRII 수용체 핵산 서열 또는 액티빈 핵산 서열(예를 들어, β_A 또는 β_B로도 불리는 액티빈 A 또는 액티빈 B 서브유닛의 핵산 서열)의 1000 이하, 500 이하, 250 이하, 100 이하 또는 50, 35, 30, 25, 22, 20 또는 18 뉴클레오티드 이하로 이루어지는 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 상보성 영역은 적어도 8 뉴클레오티드, 그리고 선택적으로는 적어도 10 또는 적어도 15 뉴클레오티드 그리고 선택적으로는 15 내지 25 뉴클레오티드일 것이다. 상보성 영역은 표적 전사물의 인트론, 코딩 서열 또는 비코딩 서열, 예를 들어, 코딩 서열 부분에 속할 수 있다. 일반적으로, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 약 8 내지 약 500 뉴클레오티드 또는 염기쌍 길이를 가질 것이며, 선택적으로 길이는 약 14 내지 약 50 뉴클레오티드일 것이다. ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 DNA(특히 안티센스로서 사용을 위해), RNA, 또는 RNA:DNA 하이브리드일 수 있다. 임의의 일 쇄는 DNA와 RNA의 혼합물 및 DNA 또는 RNA로 쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중쇄 핵산 화합물은 DNA:DNA, DNA:RNA, 또는 RNA:RNA일 수 있으며, 임의의 일 쇄는 또한 DNA와 RNA의 혼합물 및 DNA 또는 RNA로 쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다.

ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 백본(뉴클레오티드간 결합을 비롯한, 천연 핵산 내의 당-포스페이트 부분) 또는 염기 부분(천연 핵산의 퓨린 또는 피리미딘 부분)에 대한 하나 이상의 변형을 비롯한 임의의 다양한 변형을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 핵산 화합물은 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 길이를 가질 것이며 종종 혈청에서의 안정성, 세포에서의 안정성 또는 예를 들어, 경구 전달 화합물의 경우에는 위 및 흡입 화합물을 위한 폐와 같은 화합물이 전달될 가능성이 높은 위치에서의 안정성과 같은 소정의 특징을 개선하기 위하여 하나 이상의 변형을 함유할 것이다. RNAi 구조체의 경우, 표적 전사물에 상보적인 쇄는 일반적으로 RNA 또는 그의 변형일 것이다. 다른 쇄는 RNA, DNA, 또는 임의의 다른 변이체일 것이다. 이중쇄 또는 단일쇄 "헤어핀" RNAi 구조체의 듀플렉스 부분은 그것이 다이서(Dicer) 기질로서 작용하는 한, 특정 실시양태에서, 18 내지 40 뉴클레오티드 길이일 수 있으며 선택적으로 약 21 내지 23 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 촉매 또는 효소 핵산은 라이보자임 또는 DNA 효소일 수 있으며 또한 변형된 형태를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 생리학적 조건하에서 그리고 넌센스 또는 센스 대조군이 영향이 거의 또는 전혀 없는 농도에서 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그보다 많이 그들의 표적의 발현을 억제할 수 있다. 핵산 화합물의 효과를 시험하기 위한 농도는 1, 5, 10 마이크로몰 이상을 포함한다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRII 신호전달의 억제제는 항체이다. 그러한 항체는 액티빈(특히 β_A 또는 β_B로도 불리는 액티빈 A 또는 B 서브유닛)에 결합하여 ActRII 수용체 결합을 파괴하는 항체; 및 ActRII 수용체 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)에 결합하고 액티빈 결합을 파괴하는 항체를 포함한다.

ActRII 수용체 폴리펩티드 또는 액티빈 폴리펩티드로부터 유도된 면역원을 이용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단클론 항체가 표준 프로토콜에 의해 만들어질 수 있다(예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press:1988) 참고). 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유류는 ActRII 수용체 폴리펩티드의 면역원 형태, 항체 반응을 유발할 수 있는 항원 단편 또는 융합 단백질로 면역될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 담체에의 접합 또는 본 기술분야에 잘 알려진 다른 기술을 포함한다. ActRII 수용체 또는 액티빈 폴리펩티드의 면역원성 부분은 아쥬반트의 존재하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가 검출에 의해 모니터할 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역에세이이 항체의 수준을 평가하기 위하여 항원으로서 면역원을 이용하여 사용될 수 있다.

ActRII 수용체 폴리펩티드의 항원성 제제로 동물을 면역시킨 후, 항혈청을 수득하고, 원하면, 혈청으로부터 다클론 항체를 분리할 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체-생산 세포(림프구)를 면역된 동물로부터 수집하고 표준 체세포 융합 절차에 의해 골수종 세포와 같은 불멸화 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성할 수 있다. 그러한 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 하이브리도마 기술(원래 Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497에 의해 개발됨), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), 및 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96)을 포함한다. 하이브리도마 세포는 ActRII 수용체 폴리펩티드와 특이적으로 반응성인 항체의 생산에 대해 면역학적으로 스크리닝될 수 있으며 그러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양물로부터 단클론 항체가 분리된다.

본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 대상 폴리펩티드와 역시 특이적으로 반응성인 그 단편을 포함하고자 하는 것이다. 항체는 종래 기술을 이용하여 단편화될 수 있으며 단편은 전체 항체를 위해 상기에 개시된 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 생성되는 F(ab)2 단편은 Fab 단편을 생산하기 위하여 이황화 가교를 환원시키기 위해 처리될 수 있다. 항체는 추가로 항체의 적어도 하나의 CDR 영역에 의해 부여된 ActRII 수용체 또는 액티빈 폴리펩티드에 대한 친화성을 가진, 이특이적, 단일쇄, 키메라, 인간화 및 완전한 인간 분자를 포함하고자 하는 것이다. 항체는 추가로 거기에 부착되고 검출될 수 있는 라벨을 포함할 수 있다(예를 들어, 라벨은 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조-인자일 수 있다).

특정 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이며, 이 용어는 CDR-이식된 또는 키메라 항체, 라이브러리-선택된 항체 도메인으로부터 조립된 인간 또는 다른 항체, 단일쇄 항체 및 단일 도메인 항체(예를 들어, 인간 V_H 단백질 또는 낙타 V_HH 단백질)을 비롯한, 분자생물학 기술에 의해 부분적으로 생성된 임의의 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 단클론 항체일 수 있으며, 특정 실시양태에서. 예를 들어, ActRII 수용체 폴리펩티드 또는 액티빈 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생성하는 방법은 검출가능한 면역 반응을 자극하는데 효과적인 항원 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 소정량을 마우스에게 투여하고, 마우스로부터 항체-생산 세포(예를 들어, 비장으로부터의 세포)를 수득하고, 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 항체-생산 하이브리도마를 수득하고, 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하기 위하여 항체-생산 하이브리도마를 시험하는 것을 포함할 수 있다. 수득되면, 하이브리도마는 선택적으로 하이브리도마-유도 세포가 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 배양 조건하에서, 세포 배양에서 증식될 수 있다. 단클론 항체는 세포 배양물로부터 정제될 수 있다.

항체와 관련하여 사용되는 부사 "특이적으로 반응성인"은 본 기술분야에서 일반적으로 이해되는 바처럼, 항체가 관심 항원(예를 들어, ActRII 수용체 폴리펩티드)와 관심이 없는 다른 항원 사이에서 충분히 선택적이어서 항체가 적어도 특정 유형의 생물학적 샘플에서 항원의 존재를 검출하는데 유용함을 의미한다. 치료 응용과 같은, 항체를 이용하는 일부 방법에서, 결합에서의 고도의 특이성이 바람직할 수 있다. 단클론 항체는 일반적으로 원하는 항원과 교차-반응하는 폴리펩티드 사이에서 효과적으로 구별하는 경향이 (다클론 항체에 비해) 더 크다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 주는 한 가지 특징은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 원하는 특이성이 상이한 친화성 범위에서 도달할 수 있지만, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 또는 그 미만의 친화성(해리 상수)을 가질 것이다. 액티빈과 ActRII 수용체 사이의 매우 단단한 결합을 고려할 때, 중화 항-액티빈 또는 항-ActRII 수용체 항체는 일반적으로 10^-10 이하의 해리 상수를 가질 것이다.

또한, 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체를 스크리닝하기 위해 사용되는 기술은 수득된 항체의 특성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 항체가 용액 중의 항원에 결합하기 위해 사용된다면, 용액 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 다양한 상이한 기술이 특히 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체와 항원 사이의 상호작용을 시험하는데 이용가능하다. 그러한 기술은 ELISA, 표면 플라스몬 공명 결합 에세이(예를 들어, 비아코어(Biacore).TM. 결합 에세이, 비아코어 에이비(Biacore AB), 스웨덴 웁살라), 샌드위치 에세이(예를 들어, 메릴랜드주 게이터스버그의 아이젠 인터내셔널, 인크(IGEN International, Inc.)의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯, 면역침전 에세이 및 면역조직화학을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRII 신호전달 억제제는 액티빈의 대안적 형태를 포함하며, 특히 I형 수용체 결합 도메인에서 변화를 가진 것들은 II형 수용체에 결합할 수 있으며 활성 3원 복합체를 형성하지 못한다. 특정 실시양태에서, 액티빈 A, B, C 또는 E, 또는 특히, ActRII 수용체 발현을 억제하는 안티센스 분자, siRNA 또는 라이보자임과 같은 핵산은 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서,본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRII 신호전달 억제제는 다른 TGF-베타 패밀리의 구성원, 특히 GDF8 및 액티빈에 비해 GDF11-매개 신호전달 억제에 대해 선택성을 나타낸다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용되는 ActRII 신호전달의 억제제는 ActRII 수용체 길항체 활성을 가진 비항체 단백질이며, 인히빈(즉, 인히빈 알파 서브유닛), 폴리스타틴(예를 들어, 폴리스타틴-288 및 폴리스타틴-315), 세르베루스(Cerberus), 폴리스타틴 관련 단백질("FSRP"), 엔도그린(endoglin), 액티빈 C, 알파(2)-마크로글로불린(macroglobulin) 및 M108A(위치 108에서 메티오닌에서 알라닌으로의 변화) 돌연변이 액티빈 A를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRII 신호전달 억제제는 액티빈 생물활성을 길항하고 및/또는 액티빈에 결합하는 폴리스타틴 폴리펩티드이다. 용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 폴리스타틴의 임의의 자연 발생 폴리펩티드 및 유용한 활성을 보유한 그의 임의의 변이체(돌연변이, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 추가로 폴리스타틴의 임의의 기능적 단량체 또는 다량체를 포함한다. 액티빈 결합 특성을 보유한 폴리스타틴 폴리펩티드의 변이체는 폴리스타틴 및 액티빈 상호작용에 관련된 이전의 연구에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 WO2008/030367호는 액티빈 결합을 위해 중요한 것으로 나타난 특이적 폴리스타틴 도메인("FSD")을 개시한다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열에 적어도 약 80% 동일하며 선택적으로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성을 가진 서열을 가진 임의의 공지의 폴리스타틴의 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 예는 성숙한 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 짧은 아이소형태(isoform) 또는 예를 들어 그 전체가 본원에 참고로 통합되는 WO2005/025601호에 개시된 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드의 다른 변이체를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 ActRII 신호전달 억제제는 액티빈 생물활성을 길항하고 및/또는 액티빈에 결합하는 폴리스타틴-유사 관련 유전자(FLRG)이다. 용어 "FLRG 폴리펩티드"는 FLRG의 임의의 자연 발생 폴리펩티드 및 유용한 활성을 보유한 그의 임의의 변이체(돌연변이, 단편, 융합체 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 액티빈 결합 특성을 보유한 FLRG 폴리펩티드의 변이체는 FLRG 및 액티빈 상호작용을 에세이하기 위한 일상적인 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 제6,537,966호를 참고한다. FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열에 적어도 약 80% 동일하며 선택적으로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성을 가진 서열을 가진 임의의 공지의 FLRG의 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 폴리스타틴 폴리펩티드 및 FLRG 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 FLRG 폴리펩티드의 적어도 일부 및 예를 들어, 폴리펩티드의 분리, 검출, 안정화 또는 다량체화를 촉진하는 도메인과 같은 하나 이상의 융합 도메인을 가진 융합 단백질을 포함한다. 적합한 융합 도메인은 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드와 관련하여 상기에서 상세히 개시된다. 일 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 Fc 도메인에 융합된 폴리스타틴 폴리펩티드의 액티빈 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 Fc 도메인에 융합된 FLRG 폴리펩티드의 액티빈 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다.

8.6 에세이

다양한 ActRII 폴리펩티드 변이체 또는 가용성 ActRII 폴리펩티드 변이체는 그들이 ActRII를 억제하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 또한, 화합물은 그들이 ActRII를 억제하는 능력에 대해 시험될 수 있다. ActRII 신호전달 활성의 억제제가 확인되면, 이들 화합물은 본 발명에서 제공되는 방법에서 이용될 수 있다. ActRII는 ActRIIA 또는 ActRIIB일 수 있다. 하기의 에세이은 ActRIIA에 대해 개시되지만 ActRIIB를 위해 유사하게 수행될 수 있다.

8.6.1 SNAI1 , 포스포스마드2 , 포스포스마드3 , 요단백질 , DKK1 , COL1A1 , 액티빈 (예를 들어, 자유 액티빈 ), RUNX2 , ALP, BSAP , CTX , 오스테릭스 , Klotho , 알파-SMA, MYOCD , ACTRIIA , AXIN2 , 및/또는 SM22-알파의 수준 및/또는 활성의 평가

Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본 기술분야에 알려지거나 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플에서 Snai1, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 예를 들어, 노덧 블롯팅, PCR 에세이, 실시간 PCR 에세이 또는 본 기술분야에 알려지거나 본원에 개시된 임의의 다른 기술을 이용하여, 샘플에서 각각 Snai1, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, 오스테릭스, Alp, BSAP, CTX, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 전사된 RNA를 평가(예를 들어, 정량)함으로써 결정될 수 있다. Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성이 독립적으로 그리고 각각 상기 8.3.1 부분에 개시된 것과 같은, 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 비교될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 일 실시양태에서, 조직 샘플 내의 Snai1, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 샘플 내의 Snai1, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA를 평가(예를 들어, 정량)함으로써 결정될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, Snai1, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준은 정량적 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 결정된다. 구체적인 실시양태에서, Runx2 mRNA의 핵산 서열은 서열 58의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Alp mRNA의 핵산 서열은 서열 59의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Snai1 mRNA의 핵산 서열은 서열 74의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Dkk1 mRNA의 핵산 서열은 서열 75의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, col1a1 mRNA의 핵산 서열은 서열 76의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 액티빈 mRNA의 핵산 서열은 서열 77의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 오스테릭스 mRNA의 핵산 서열은 서열 60의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Klotho mRNA의 핵산 서열은 서열 61의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 알파-SMA mRNA의 핵산 서열은 서열 70의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, MYOCD mRNA의 핵산 서열은 서열 71의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Sm22-알파 mRNA의 핵산 서열은 서열 62의 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Runx2 수준을 결정하기 위하여 Runx2-특이적 프라이머(서열 48 및 49)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Alp 수준을 결정하기 위하여 Alp-특이적 프라이머(서열 50 및 51)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Snai1 수준을 결정하기 위하여 Snai1-특이적 프라이머(서열 78 및 79)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Dkk1 수준을 결정하기 위하여 Dkk1-특이적 프라이머(서열 80 및 81)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 col1a1 수준을 결정하기 위하여 col1a1-특이적 프라이머(서열 82 및 83)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 액티빈 수준을 결정하기 위하여 액티빈-특이적 프라이머(서열 84 및 85)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 오스테릭스 수준을 결정하기 위하여 오스테릭스-특이적 프라이머(서열 52 및 53)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Klotho 수준을 결정하기 위하여 Klotho-특이적 프라이머(서열 54 및 55)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, qRT-PCR은 Sm22-알파의 수준을 결정하기 위하여 Sm22-알파-특이적 프라이머(서열 56 및 57)로 수행된다.

조직 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 또한 예를 들어, 면역조직화학 에세이, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침전, 유세포에세이 또는 본 기술분야에 알려지거나 본원에 개시된 임의의 다른 기술을 이용하여, 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 발현 수준을 각각 평가(예를 들어, 정량)함으로써 결정될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, Runx2 단백질의 아미노산 서열은 서열 63의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Alp 단백질의 아미노산 서열은 서열 64의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Snai1 단백질의 아미노산 서열은 서열 86의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Dkk1 단백질의 아미노산 서열은 서열 87의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, col1a1 단백질의 아미노산 서열은 서열 88의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈) 단백질의 아미노산 서열은 서열 89의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, BSAP 단백질의 아미노산 서열은 서열 72의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 오스테릭스 단백질의 아미노산 서열은 서열 65의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Klotho 단백질의 아미노산 서열은 서열 66의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 알파-SMA 단백질의 아미노산 서열은 서열 68의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, MYOCD의 아미노산 서열은 서열 69의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Sm22-알파 단백질의 아미노산 서열은 서열 67의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIA 단백질의 아미노산 서열은 서열 1의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIA 단백질의 아미노산 서열은 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIA 단백질의 아미노산 서열은 서열 3의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIA 단백질의 아미노산 서열은 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ActRIIA 단백질의 아미노산 서열은 서열 5의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Axin2 단백질의 아미노산 서열은 서열 87의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 웨스턴 블롯에 의해 결정된다. 구체적인 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 활성은 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 또는 SM22-알파에 의해 조절되는 단백질의 웨스턴 블롯 에세이에 의해 결정된다. 구체적인 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 대상체의 조직 샘플(예를 들어, 인간 혈청)에 존재하는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 양을 정량할 수 있는, 및/또는 ActRII 신호전달 억제제로 처리 후 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준의 교정을 검출할 수 있는 방법에 의해 결정된다. 일 실시양태에서, 조직 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 ELISA를 이용하여 샘플에서 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 발현을 평가(예를 들어, 정량)함으로써 결정된다. 예를 들어, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파는 ELISA 방법을 이용하여 인간 혈청에서 확인되고 정량될 수 있다. 조직 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 결정하는데 사용하기 위한 ELISA 방법은 ELISA 플레이트를 조직 샘플(예를 들어, 인간 혈청)로 코팅하고, 각각 Snai1-, 포스포스마드2-, 포스포스마드3-, 요단백질-, Dkk1-, col1a1-, 액티빈- (예를 들어, 자유 액티빈), Runx2-, Alp-, BSAP-, CTX-, 오스테릭스-, Klotho-, 알파-SMA-, MYOCD-, ActRIIA-, Axin2-, 및/또는 Sm22-알파-특이적 항체에 결합하는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파를 조직 샘플(예를 들어, 인간 혈청)에서 각각 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성을 결정하는데 사용하기 위한 방법은(예를 들어, ELISA) 100 pg/ml부터의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파를 검출할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Runx2 수준을 결정하기 위하여 Runx2-특이적 항체 SC-390715(산타 크루즈(Santa Cruz))로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Alp 수준을 결정하기 위하여 Alp-특이적 항체 SC-98652(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Snai1 수준을 결정하기 위하여 Snai1-특이적 항체 sc-393172(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 포스포스마드2 수준을 결정하기 위하여 포스포스마드2-특이적 항체 sc-101801(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 포스포스마드2 수준을 결정하기 위하여 포스포스마드3-특이적 항체 sc-130218(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Dkk1 수준을 결정하기 위하여 Dkk1-특이적 항체 sc-374574 (산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 col1a1 수준을 결정하기 위하여 col1a1-특이적 항체 sc-8784(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 액티빈 수준을 결정하기 위하여 액티빈-특이적 항체 A1594(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 CTX 수준을 결정하기 위하여 BSAP-특이적 항체 SC-98652(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 CTX 수준을 결정하기 위하여 CTX-특이적 항체 ABIN1173415 (안티바디즈 온라인(Antibodies Online))로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 오스테릭스 수준을 결정하기 위하여 오스테릭스-특이적 항체 SC-22538(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Klotho 수준을 결정하기 위하여 Klotho-특이적 항체 SC-22218(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 알파-SMA 수준을 결정하기 위하여 알파-SMA-특이적 항체 SC-53142(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 MYOCD 수준을 결정하기 위하여 MYOCD-특이적 항체 SC-21561(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 Sm22-알파의 수준을 결정하기 위하여 Sm22-알파-특이적 항체 SC-271719(산타 크루즈)로 수행된다. 구체적인 실시양태에서, ELISA는 ActRIIA 수준을 결정하기 위하여 ActRIIA-특이적 항체 ab 135634 (앱캠(Abcam))로 수행된다.

본원에 개시된 ELISA 에세이에서 개시된 Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 수준은 독립적으로 그리고 각각 8.3.1 부분에 상술한 것과 같은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 비교될 수 있다.

샘플 내(예를 들어, 조직 샘플 내, 예를 들어, 대동맥, 혈액, 혈청, 혈장, 간, 비장 및/또는 골수)의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 측정하는 에세이에서 사용하기 위한 항체는 본 기술분야에 알려져 있거나 당업자에게 알려진 방법을 이용하여 쉽게 개발될 수 있다. 샘플 내의 Runx2의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.(LifeSpan Biosciences Inc.)로부터의 카탈로그 번호 LS-B4293, LS-B4294, LS-B4296의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-390715의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨(Sigma-Aldrich Co. LLC)로부터 이용가능한 제품 번호 WH0000860M1의 항체를 포함한다. 샘플 내의 Alp의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-B2877, LS-B1844, LS-C169212의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-98652의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB1405449의 항체를 포함한다. 샘플 내의 Snai1의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C161335, LS-C198229, 및 LS-C169298의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-393172의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB1404386의 항체를 포함한다. 샘플 내의 포스포스마드2의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-101801의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB4200251 및 SAB4300252의 항체를 포함한다. 샘플 내의 포스포스마드3의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-130218의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB4300253 및 SAB4504210의 항체를 포함한다. 샘플 내의 Dkk1의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C108793, LS-C105116, 및 LS-C105117의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-374574의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 WH0022943M1의 항체를 포함한다. 샘플 내의 col1a1의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-B5932의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-8784의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 C2456의 항체를 포함한다. 샘플 내의 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈)의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C308491의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 A1719의 항체를 포함한다. 샘플 내의 BSAP의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-B2877, LS-B1844, LS-C169212의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-98652의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB1405449의 항체를 포함한다. 샘플 내의 CTX의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 ABIN1173415(안티바디즈 온라인)을 포함한다. 샘플 내의 오스테릭스의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C139215, LS-C132610, LS-B6531의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-133871의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 WH0121340M1의 항체를 포함한다. 샘플 내의 Klotho의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C165587, LS-C145689, LS-C8376의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-22218의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB1306662의 항체를 포함한다. 샘플 내의 알파-SMA의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-B6000, LS-B5966, LS-B2161의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 SC-21561의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 A5228의 항체를 포함한다. 샘플 내의 MYOCD의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-C37407, LS-C153495, LS-c137255의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 SC-53142의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 M8948의 항체를 포함한다. 샘플 내의 Sm22-알파의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 워싱턴주 시애틀의 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.로부터의 카탈로그 번호 LS-B2563, LS-C139114, LS-C210979의 항체; 캘리포니아주 산타 크루즈의 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.로부터 이용가능한 카탈로그 번호 sc-271719의 항체; 및 시그마-알드리치 코. 엘엘씨로부터 이용가능한 제품 번호 SAB2501014의 항체를 포함한다. 샘플 내의 ActRIIA의 수준을 측정하는 에세이에서 사용될 수 있는 단클론 항체의 예는 앱캠으로부터의 제품 코드 ab135634의 항체를 포함한다.

Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 활성은 리포터 유전자 에세이(예를 들어, Snai1-, 포스포스마드2-, 포스포스마드3-, 요단백질-, Dkk1-, col1a1-, 액티빈-, Runx2-, Alp-, BSAP-, CTX-, 오스테릭스-, Klotho-, 알파-SMA-, MYOCD-, ActRIIA-, Axin2-, 또는 Sm22-알파-반응성 리포터 유전자 구조체를 각각 함유) 또는 임의의 다른 생물활성 에세이을 제한없이 포함하는 본 기술분야에 알려진 임의의 에세이에 의해 측정될 수 있다.

Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체로부터 수득된 임의의 조직 샘플에서 평가될 수 있다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체의 대동맥, 혈청, 간, 비장 또는 골수로부터 수득된 샘플에서 평가된다. 일 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체의 혈청으로부터 수득된 샘플에서 평가된다. 다른 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체의 대동맥, 비장으로부터 수득된 샘플에서 평가된다. 또 다른 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 본원에 개시된 방법에 따라 치료되는 대상체의 골수로부터 수득된 샘플에서 평가된다.

본 기술분야에 알려지고 본원에 개시된 에세이을 이용하여 결정된 Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 활성은 8.3.1 부분에서 상술한 것과 같은 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 각각 비교될 수 있다.

특정 실시양태에서, 대상체의 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 개시된 기준 집단의 조직 샘플(예를 들어, 동일한 조직으로부터의 샘플)에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 각각 비교된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 더 빠른 시점(예를 들어, 질병의 개시 전, 치료 개시 전 또는 치료 동안)에서 대상체의 조직 샘플(예를 들어, 동일한 조직으로부터의 샘플)에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비교된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 조직 샘플(예를 들어, 대동맥, 혈청, 비장, 간 또는 골수)에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 대상체의 다른 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 각각 비교된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 대상체의 조직 샘플에서 다른 유전자 생성물(예를 들어, b-액틴, 액티빈 A, 액티빈 B)의 수준 및/또는 활성에 비교된다.

특정 실시양태에서, 대상체의 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 기준 집단의 조직 샘플에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 각각 비교된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비교하여 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준 및/또는 활성의 검출은 액티빈 수용체 신호전달 억제제(예를 들어, 본원에 개시된 하나 이상의 액티빈 수용체 신호전달 억제제)의 투여가 이어진다. 특정 실시양태에서, 액티빈 수용체 신호전달 억제제(예를 들어, 본원에 개시된 하나 이상의 액티빈 수용체 신호전달 억제제)의 투여는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성의 모니터링, 및 선택적으로 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 대한 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성의 비교가 이어진다. 특정 실시양태에서, 제1 투여량의 ActRII 신호전달 억제제 (예를 들어, 서열 7과 같은 ActRIIA-hFc)의 투여 후 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성의 결정이 이어지며, 만일 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 각각 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성에 비교하여 증가되면, 및/또는 만일 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 각각 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비교하여 감소되면, 제1 투여량보다 높은(예를 들어, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배 높은) 제2 투여량의 ActRII 신호전달 억제제 투여가 이어지며, 만일 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성에 비해 각각 감소되면, 및/또는 만일 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 비해 각각 증가되면, 제1 투여량보다 낮은 (예를 들어, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 배 낮은) 제2 투여량의 ActRII 신호전달 억제제의 투여가 이어진다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 집단이다.

특정 실시양태에서, 치료되는 대상체의 조직 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 한명 이상의 건강한 대상체의 동일한 조직으로부터의 샘플 내의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성에 각각 비교된다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 평가되는 조직은 대동맥, 혈액 혈청, 골수, 간 또는 비장이다. 일 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성이 평가되는 조직은 혈청이다.

특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성은 기준 집단에서 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크며; 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 각각 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 또는 100% 적다. 특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준 및/또는 활성은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스 각각의 수준 및/또는 활성과 동일하거나 이보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 200%, 또는 500% 며; 및/또는 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파 각각의 수준 및/또는 활성과 동일하거나 이보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 대로이다.

특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준 및/또는 활성은 각각 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크며; 및/또는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준 및/또는 활성은 각각 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 또는 100% 작다. 특정 실시양태에서, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준 및/또는 활성은 기준 집단에서 각각 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성과 동일하거나 이보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크며; 및/또는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준 및/또는 활성은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준 및/또는 활성과 동일하거나 이보다 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 적다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.6 부분에 개시된 대로이다.

특정 실시양태에서, 액티빈의 수준은 예를 들어, 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 3 또는 인히빈과 연합되지 않은 액티빈과 같은 자유 액티빈의 수준이다. 액티빈의 수준은 예를 들어, (i) 샘플 내, 예를 들어, 혈장 내의, 액티빈의 농도를 정량하고; (ii) 예를 들어, 샘플 내의 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 3 또는 인히빈과 같은 액티빈과 연합하는 단백질의 농도를 정량하고; (iii) 액티빈 농도 대 액티빈-연합 단백질의 농도의 화학양론 비를 계산함으로써 결정될 수 있다.

본원에 개시된 에세이은 또한 예를 들어, FGF23, 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 3, 인히빈, 내피의 간엽세포로의 전환에 관련된 단백질 및/또는 전사물과 같은 다른 단백질 및/또는 전사물의 수준 및/또는 활성을 결정하기 위하여 이용될 수 있다.

특정 실시양태에서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 자유 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준 및/또는 활성은 조직(예를 들어, 조직 샘플)에 존재한다. 특정 실시양태에서, 조직은 대동맥이다. 특정 실시양태에서, 조직은 신장이다. 특정 실시양태에서, 조직은 뼈이다. 특정 실시양태에서, 조직은 혈청이다. 바람직한 실시양태에서, Runx2, Dkk1, Alp, 오스테릭스, sm22-알파, Klotho, 알파-SMA, ActRIIA, Axin2, 및 MYOCD 수준 및/또는 활성은 대동맥에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, ActRIIA, Axin2, 및 col1a1 수준 및/또는 활성은 신장에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 혈청에 존재한다. 특정 실시양태에서, 증가된 액티빈 수준은 세관주위 근섬유아세포에 존재한다. 특정 실시양태에서, 증가된 액티빈 수준은 신장 상피에서가 아니다. 특정 실시양태에서, 증가된 액티빈 수준은 세관주위 근섬유아세포에서이며, 증가된 액티빈 수준은 신장 상피에서가 아니다.

Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, Sm22-알파, 포스포스마드3, 및 요단백질 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성이 8.3.1 부분에서 상술한 것과 같은, 대응 기준 집단에서 수준 및/또는 활성에 독립적으로 그리고 각각 비교될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.

8.6.2 기준 집단

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 기준 집단으로부터 수득된 데이터(예를 들어, 바이오마커 수준 또는 임상 증상)는 본원에 제공된 방법에 따라 치료되거나 치료될 대상체로부터 수득된 유사 데이터가 병리학적으로 높은지(예를 들어, 증가) 또는 낮은지(예를 들어, 감소)를 결정하는 데 이용된다.

특정 실시양태에서, 기준 집단의 크기는 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 400, 500 또는 1000 개체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 무작위 지원자로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 건강한 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 8.4 부분에서 기술된 바와 같이 환자 집단과 동일한 연령, 체중 및/또는 성별의 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 심혈관계 질환이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈관 석회화가 없는 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 심혈관계 질환이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환이 없는 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 신장병이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 만성 신장병이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 병리학적으로 상승된 동맥 경직도 수준을 갖지 않는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 동맥 경직도의 증가된 수준과 관련되거나 및/또는 동맥 경직도의 증가된 수준에 기인한 심혈관계 질환이 없는 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 LVH가 없는 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH로 인한 심혈관계 질환이 없는 사람들로 구성된다.

특정 실시양태에서, 기준 집단은 심혈관계 질환의 하나 이상의 증상의 발병 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈관 석회화의 하나 이상의 증상의 발병 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 만성 신장병의 하나 이상의 증상의 발병 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 동맥 경직도의 증가된 수준의 하나 이상의 증상의 발병 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 LVH의 하나 이상의 증상의 발병 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 심혈관계 질환을 진단받기 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈관 석회화를 진단받기 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 만성 신장병을 진단받기 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 1단계 만성 신장병의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 2단계 만성 신장병의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 3단계 만성 신장병의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 4단계 만성 신장병의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 5단계 만성 신장병의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 동맥 경직도의 상승된 수준의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 LVH의 진단 전에 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 본원에 제공된 방법에 따라 치료받거나 또는 본원에 기술된 질환으로 진단받기 전에 동맥 경직도의 증가를 나타내는 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 본원에 제공된 방법에 따라 치료받기 전에 요약 부분(6 부분 참조)에 인용된 마커 중 하나의 상승 경향을 나타내거나 본원에 기재된 질환으로 진단받은 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 본원에 제공된 방법에 따라 치료받기 전에 Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 포스포스마드3 및/또는 요단백의 증가된 수준을 나타내거나 본원에 제공된 질병으로 진단받은 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 본원에 제공된 방법에 따라 치료받기 전에 요약 부분(6 부분 참조)에 인용된 마커 중 하나의 하향 경향을 나타내거나 본원에 기재된 질환으로 진단받은 사람들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 본원에 제공된 방법에 따라 치료하기 전에 α-SMA, MYOCD, Sm22-α 또는 ActRIIA의 감소된 수준을 나타내거나 또는 본원에 기재된 질환으로 진단받은 사람들로 구성된다.

8.6.3 내피- 간엽 전환(ENDOTHELIAL- MESENCHYMAL TRANSITION)

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상체에서의 EnMT는 세포 집단의 운명을 결정하기 위해 혈통 추적 에세이를 통해 모니터링될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 치료받은 대상의 EnMT는, 예를 들어, Snai1과 같은 EnMT와 관련된 하나 이상의 단백질 또는 전사체의 수준 및/또는 활성을 정량화함으로써 모니터링될 수 있다.

8.6. 4 골 교체(BONE TURNOVER)

골 교체의 다양한 순환 마커가 골 교체 저하와 같은 골장애를 진단하는 데 사용될 수 있다. 골 교체의 순환 마커는 골 특이적 알칼리 포스파타제(bAP), 오스테오칼신, 프로콜라겐 I형 C-말단 프로펩티드(PICP) 및 인슐린 유사 성장 인자-1(IG, 그 중 일부는 피리디놀린, 데옥시피리디놀린, 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP), TRAP형 5b, 피리디놀린, 데옥시피리디놀린 및 프로콜라겐 I형 C-말단 텔로펩티드(ICTP), 혈청 또는 뇨 콜라겐 크로스-링커(N-텔로펩티드 또는 C-텔로펩티드), 및 25 히드록시비타민 D와 같은 골 흡수 마커이다. 전체 부갑상선 호르몬(PTH) 분자를 측정하는 에세이도 이용할 수 있다. 숙련된 기술자는 골 미네랄 밀도(BMD), 골체적, 지주골 체적 및 골소주 두께의 평가를 가능하게 하는 영상화법을 알고 있다. 참조, 예를 들어, Tilman B. Drueke와 Sharon M. Moe, 만성 신장병에서의 골 및 미네랄 대사 장애: 진단 및 치료를 개선하기 위한 국제적 시도, Nephrol Dial Transplant (2004) 19 : 534-536; Okuno S, Inaba M., 골 교체의 생화학적 마커. 새로운 국면. 투석 및 골대사 마커, Clin Calcium. 2009 Aug; 19 (8) : 1084-91; Herberth J, Monier-Faugere MC, Mawad HW, Branscum AJ, Herberth Z, Wang G, Cantor T, Malluche HH, 5가지 가장 보편적으로 사용되는 부갑상선 호르몬 에세이는 CKD-5 대상체에서 골 교체 이상을 진단하는 데는 유용하나 진단하는 데는 유용하지 않음, Clin Nephrol. 2009 Jul; 72 (1) : 5-14; Lehmann G, Ott U, Kaemmerer D, Schuetze J, Wolf G., 만성 신장병 3-5 단계를 앓고 있는 대상체에서의 골 교체의 골 조직형태계측 및 생화학 마커, Clin Nephrol. 2008 Oct; 70 (4) : 296-305; Drueke TB., 부갑상선 호르몬 측정이 신장 골질환의 진단에 유용한가?, Kidney Int. 2008 Mar; 73 (6) : 674-6; Yamada S, Inaba M, Kurajoh M, Shidara K, Imanishi Y, Ishimura E, Nishizawa Y., 만성 신장병을 앓고 있는 대상체에서의 골흡수 마커로서의 타르타르산 내성 산 포스파타제(TRACP5b)의 유용성: 신장 기능 부전으로부터의 독립, Clin Endocrinol (Oxf). 2008 Aug; 69 (2) : 189-96. Epub 2008 Jan 23 참조. 또한 Paul D. Miller, 만성 신장병에서의 골다공증의 진단 및 치료, 2009.

경미한 신장 기능 장애를 갖는 CKD 대상체에서 골흡수를 모니터링하기 위한 또 다른 마커는 I형 콜라겐 N-텔로펩티드(S-NTX)의 혈청 농도이다. 참조, 예를 들어, Hamano T, Fujii N, Nagasawa Y, Isaka Y, Moriyama T, Okada N, Imai E, Horio M, Ito T., 혈청 NTX는 만성 신장병을 앓고 있는 글루코코르티코이드 치료를 받은 대상체의 흡수 방지 요법을 평가하기 위한 실질적 마커임, Bone. 2006 Nov; 39 (5) : 1067-72. Epub 2006 Jun 16.

정량적 전산화 단층 촬영(QCT)은 또한 골 교체를 결정하는 데 사용될 수 있다.

예를 들어, Runx2 및 Alp와 같은 마커는 대상체에서 조골세포 전이를 모니터링하기 위해 평가될 수 있다. 예를 들어 Sm22-α와 같은 마커는 혈관 평활근 기능 및 분화된 혈관 평활근 세포의 수준을 모니터링하기 위해 평가될 수 있다.

8.6. 5 칼슘 수준

칼슘 수준은 예를 들어, 칼슘 이온 선택성 전극과 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 에세이될 수 있다. 특정 실시양태에서, 총 칼슘 수준은 혈청, 혈액, 대동맥 또는 소변에서 측정된다.

8.6. 6 혈관 석회화

관상동맥 석회화(CAC) 정도를 영상화하기 위한 비 조영 전산화 단층 촬영 (CT)및 비침습적(noninvasive) 관상동맥 조영술(CTA)용 조영 CT는 일반적으로 폐색성 관상동맥 질환을 진단하는 데 사용하기 위해 개발된 것이다. 진단 및 예후적 심장 평가를 위한 방사성 핵종(radionuclide) 스트레스 검사, 관상동맥 칼슘 스캐닝 및 비침습적 관상동맥 조영술을 사용할 수도 있다. 참조, Berman DS, Shaw LJ, Hachamovitch R, Friedman JD, Polk DM, Hayes SW, Thomson LE, Germano G, Wong ND, Kang X, Rozanski A., 진단 및 예후적 심장 평가를 위한 방사성 핵종 스트레스 테스트, 관상동맥 칼슘 스캐닝 및 비침습적 관상동맥 조영술의 대조적 사용, Semin Nucl Med. 2007 Jan; 37 (1) : 2-16.

무증상 대상체로부터의 관상동맥 칼슘 스크리닝 결과가 비교예로서 사용될 수 있다. 예를 들어 신장병이 발병하기 전에 얻은 칼슘 검사 결과는 혈관 석회화가 신장병과 관련이 있는 경우의 비교예로서 사용될 수 있다.

관상동맥 석회화(CAC)를 검출 및 정량화하는 가능한 방법은 엑스레이 전산화 단층 촬영 및 심근 관류 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영(SPECT)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 참조, Moser KW, O'Keefe JH Jr, Bateman TM, McGhie IA., 위험 인자 수정 및 스트레스 심근 관류 영상화의 가이드로서 무증상 대상체에서의 관상동맥 칼슘 스크리닝, J Nucl Cardiol. 2003년 11월-12월; 10 (6) : 590-8. 초고속 초정밀 입체영상 진단기 (Multi-detector computed tomography; MDCT)는 또한 혈관 석회화를 검출하는 데 사용될 수 있다(참조, 예를 들면, Burrill et al., 2007, Postgrad. Med. J. 83 (985) : 698-704).

혈관 석회화를 진단하는 또 다른 진단 방법은 양전자 방출 단층촬영(PET)/전산화 단층촬영(CT) 복합기에서 흉부 대동맥 벽에서의 불소 18 플루오로데옥시글루코스(FDG)의 섭취이다. 참조, Tatsumi M, Cohade C, Nakamoto Y, Wahl RL., PET/CT에서 대동맥 벽에서의 플루오로데옥시글루코스 섭취 : 활성 죽상동맥경화증의 발견 가능성, Radiology. 2003 Dec; 229 (3) : 831-7. Epub 2003년 10월 30일.

또 다른 실시양태에서, 초고속 CT는 죽상동맥경화성 관상 동맥 질환의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 참조, 예를 들어, Breen JF, Sheedy PF 2, Schwartz RS, Stanson AW, Kaufmann RB, Moll PP, Rumberger JA, 관상 동맥 질환의 지표로서의 초고속 CT로 검출된 관상 동맥 석회화, Radiology. 1992 Nov, 185 (2) : 435-9.

전자-빔 전산화 단층 촬영 스캐닝은 또한 관상 동맥 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. 참조, Schmermund A, Baumgart D, Sack S, Mohlenkamp S, Gronemeyer D, Seibel R, Erbel R., 정상, 비정상 또는 불분명한 운동 스트레스 테스트를 시행한 증상이 있는 대상체에서 전자-빔 전산화 단층 촬영에 의해 관상 동맥 석회화 평가, Eur Heart J. 2000년 10월, 21 (20) : 1674-82.

혈관 석회화에 대한 또 다른 시험은 혈소판 생성 및 혈전 색전증 폐고혈압에서의 플라크 조성에 관한 것이다. 만성 혈전 색전증성 폐고혈압은 글리코포린이 풍부한 수질모양의 코어를 가진 죽상동맥경화성 플라크와 관련이 있으며, 폐렴성 고혈압은 섬유상 플라크와 관련이 있다. 혈전 색전증 물질은 수질모양의 코어를 형성하는 데 결정적인 역할을 하며, 그 중 적혈구막 유도 글리코포린이 주성분이다. 이에 따라 만성 혈전 색전증 및 폐렴성 고혈압(일차 및 이차성 (아이젠멩거 증후군))이 연구된다. 참조, Arbustini E, Morbini P, D' Armini AM, Repetto A, Minzioni G, Piovella F, Vigano M, Tavazzi L, 혈소판 생성 및 혈전 색전증성 폐고혈압에서의 플라크 조성: 수질모양 코어 형성에서의 혈전성 물질의 중요한 역할. 2002 Aug; 88 (2) : 177-82.

축적된 칼슘 플라크의 밀도 측정에 기초한 칼슘 스코어링 시스템인 아가츠톤 점수는 혈관 석회화를 정량화하는 데 사용될 수 있다. 이 시스템에서 혈관 석회화 수준은 다중 검출기 전산화 단층 촬영 (MDCT)으로 측정할 수 있으며, 아가츠톤 점수로 진행 속도의 감쇠를 평가할 수 있다(참고: 예를 들어, Sharma et al., 2010, Vasc. Health Risk Manag.6 : 603-611).

또한, 혈관 석회화는 Adragao et al., 2004, Nephrol. Dial. Transplant 19 : 1480-1488에 기재되어 있는 방법을 사용하여 평가될 수 있다.

대상체에서 혈관 석회화를 정량화하는 데 사용하기 위한 또 다른 에세이는 관상 동맥 석회화에 대한 CT 검사로부터 유래된 칼슘 측정법을 포함하는 병변 특이적 칼슘 점수이다. 이 방법은 예를 들어, Akram and Voros, 2008, Int. J. cardiovac. Imaging 14 : 743-749에 기재되어 있다.

8.6.7 심장 크기 및 심장 비대

심장 크기 및 심장 비대는 예를 들어 자기 공명 영상, 심전도, 심초음파 및 비대비 증강(noncontrast-enhanced) 심장 전산화 단층 촬영과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.

8.6.8. 동맥 경직도

동맥 경직도의 수준은 예를 들어, 초음파 도플러 검사, 자기 공명 동맥 조영술을 포함하는 자기 공명 영상화, CT 혈관 조영술을 포함하는 전산화 단층 촬영(CT) 및 당업계에 공지된 다른 형태의 혈관 조영술과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.

8.6.9 신장병

사구체 여과율, 이눌린 클리어런스, 과인산혈증 및 BUN 수준은 신장병을 결정하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 신장 섬유증 및/또는 사구체 경화증은 예를 들어 신장 조직의 생검 및 흉터에 대한 조직 검사와 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 진단 및/또는 모니터링될 수 있다. 신장 섬유증 및/또는 사구체 경화증은 또한 예를 들어 사구체 여과율을 측정하고, 및/또는 신장 초음파를 수행하여 진단 및/또는 모니터할 수 있다. 참조, National Kidney Foundation 웹 사이트.

8.6.10 동물 모델

죽상동맥경화성 저밀도 지단백질 수용체 결핍 (ldlr-/-) 웅성 마우스(C57Bl/6J 배경)는 잭슨 라보라토리스로부터 구입하여 12주령부터 고지방식(지방에서 42% 칼로리)(Teklad #)을 섭취할 수 있다. 마우스는 22주령에서 비만, 인슐린 저항성이고, 28 주령에서 당뇨병 및 고콜레스테롤 혈증이다.

이전에 기술했던 바와 같이(Davies, MR, et al., 2003. J Am Soc Nephrol 14 : 1559-1567, Davies, MR, et al., 2005. J Am Soc Nephrol 16 : 917-928), 2 단계 과정을 이용하여 만성 신장병을 유발할 수 있다. 출생 12주 후 2cm 옆구리 절개를 통해 우측 신장에 전기소작을 시행하고, 14주령에 좌측 총 신장절제술을 시행할 수 있다. 소작의 강도는 20주령에 이눌린 클리어런스에 의해 확인할 때 중등도(CKD-3) 신장 손상을 일으키도록 변화시킨다. 대조군 마우스인, 야생형 C57Bl/6J 마우스에게 규칙적인 일반식을 공급하며, 이것은 정상적인 대조값을 위해 사용된 정상적인 신장 기능 및 식이 그룹이다. 제2 그룹은 고 지방식을 섭취하고 모의 수술된, 신장 기능이 정상인 ldlr-/- 마우스로서, 신장병의 영향을 결정하는 대조군으로서 제공한다. 제3 그룹은 고 지방식을 섭취하고 GFR이 인간 CKD 3 단계(CKD-3)와 동등하고 22주에 안락사된 ldlr-/- 마우스로, 기저선 혈관 석회화 그룹(CKD-3)이다. 제4 그룹은 22주에 시작해서 28주에 안락사될 때까지 주 2회 비히클을 피하 주사받은 CKD-3의 ldlr -/- 마우스(CKD-3 V)이다. 제5 그룹은 22주에 시작해서 28주에 안락사될 때까지 주 2회 mActRIIA-Fc(Celgene, Summit, NJ) 10mg/kg의 피하 주사를 받은 CKD-3의 ldlr -/- 마우스(CKD-3 mActRIIA-Fc)이다. 사용된 투여량은 이전에 PK/PD 연구에서 골형성의 자극을 위한 효과적인 투여량으로 나타났다(Lotinun, S., et al., 2010. Bone 46 : 1082-1088).

사용된 CKD의 제2 모델은 IV형 콜라겐의 α5 사슬인 COL4A5의 유전자 결핍인 X-결합 알포트 증후군의 마우스 상동체이다(Rheault, MN, et al., 2004. Journal of American Society of Nephrology 15 : 1466-1474). 이것은 자연적 신장병의 모델이다. 번식 쌍은 잭슨 라보라토리스에서 구입하여 실험용으로 번식시킬 수 있다. 반접합체 웅성 마우스는 출생 후 200일에 인간 CKD 3~4 단계에 필적하는 신장병이 자연적으로 발병한다.

CKD의 제3 모델은 세포 계통 추적에 사용된 트랜스제닉(transgenic) 마우스 라인에서 ldlr -/- 프로토콜과 유사한 신장 절제 GNZ 마우스이다. GNZ 리포터 자성 마우스(Stoller, JZ, et al., 2008. Genesis (New York, NY 2000) 46 : 200-204)와 Tek-Cre 트랜스제닉 웅성 마우스(Koni, PA, et al., 2001. The Journal Experimental Medicine 193 : 741-754.)는 잭슨 라보라토리스로부터 구입하여 실험용 GNZ/Tek-Cre+ 마우스를 생산하도록 번식시킬 수 있다. GNZ/Tek-Cre- 한배 새끼를 네가티브 대조군으로 제공한다. 마우스 유전형질 에세이는 제조업자가 GNZ 및 Tek-Cre 마우스 종류에 대해 권장하는 특정 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다.

8.6.11 전사 반응 에세이

특정 실시양태에서, 전사 반응 에세이는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 유리 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-alpha의 ActRII 신호전달 억제제 또는 활성을 시험하는 데 사용될 수 있다. ActRII, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 유리 액티빈), Runx2, 오스테릭스, Alp, BSAP, CTX, 클로토, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-alpha의 신호전달 시에, 특정 유전자의 전사가 상향 또는 하향 조절된다. 사용된 세포 배양 시스템 및 전사 반응은 (예를 들어, RT-PCR에 의해) 측정될 수 있다. 전사 반응에 대한 작용제의 효과는 그것의 효과 또는 활성의 척도이다. 특정 실시양태에서, ActRII, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예, 유리 액티빈), Runx2, 오스테릭스, Alp, BSAP, CTX, 클로토, ActRIIA, Axin2 및/또는 Sm22-α 신호전달에 반응하는 것으로 알려진 프로모터 부위는 리포터 유전자의 상류에 클로닝될 수 있다. 이러한 방식으로, 에세이는 리포터 유전자의 활성만을 에세이할 필요가 있도록 단순화될 수 있다.

8.6.12 스크리닝 에세이

다양한 ActRII 폴리펩티드 변이체 또는 가용성 ActRII 폴리펩티드 변이체에 대해 ActRII를 억제하는 능력을 시험할 수 있다. 또한, 화합물들에 대해 ActRII를 억제하는 능력을 시험할 수 있다. 일단 ActRII 신호전달 활성의 억제제가 확인되면, 이들 화합물은 본원에 제공된 방법으로 사용될 수 있다. ActRII는 ActRIIA 또는 ActRIIB일 수 있다. 아래의 에세이는 ActRIIA에 대해 설명하지만 ActRIIB에 대해서도 유사하게 수행할 수 있다.

예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 변이체의 골생성 또는 골용해에 관여하는 유전자의 발현에 대한 영향을 평가할 수 있다. 이것은 필요에 따라 하나 이상의 재조합 ActRIIA 리간드 단백질(예를 들어, 액티빈)의 존재하에 수행될 수 있고, 세포는 ActRIIA 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 및 임의로 ActRIIA 리간드를 생성하도록 형질감염될 수 있다. 마찬가지로, ActRIIA 폴리펩티드는 마우스 또는 다른 동물에게 투여될 수 있고, 밀도 또는 부피와 같은 하나 이상의 뼈의 성질이 평가될 수 있다. 뼈 골절의 치유율도 평가될 수 있다. 이중 에너지 X선 흡수 계측법(DEXA)은 동물의 골밀도를 평가하기 위한 잘 정립된 비침습적 정량 기법이다. 인간의 경우, 중앙 DEXA 시스템을 사용하여 척추와 골반의 골밀도를 평가할 수 있다. 이들은 전체적인 골밀도를 예측하는 가장 좋은 지표이다. 주변 DEXA 시스템은 예를 들어 손, 손목, 발목 및 발의 뼈를 비롯한 말초 뼈의 골밀도를 평가하는 데 사용될 수 있다. CAT 스캔을 포함한 전통적인 X선 영상 시스템은 뼈 성장 및 골절 치유를 평가하는 데 사용될 수 있다. 또한 골밀도는 정량적 전산화 단층 촬영(qCT)을 사용하여 측정할 수 있다. 뼈의 기계적 강도도 평가할 수 있다.

특정 양태에서, 본원에서 제공되는 것은 액티빈-ActRIIA 신호전달 경로의 작용제 또는 길항제인 화합물(물질)을 동정하기 위한 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드) 및 액티빈 폴리펩티드의 용도이다. 이 스크리닝을 통해 확인된 화합물은 체외에서 뼈의 성장 또는 무기질화를 조절하는 능력을 평가하기 위해 시험될 수 있다. 임의로, 이들 화합물은 생체내에서 조직 성장을 조절하는 능력을 평가하기 위해 동물 모델에서 추가로 시험될 수 있다.

액티빈 및 ActRIIA 폴리펩티드를 표적화함으로써 조직 성장을 조절하기 위한 치료제를 스크리닝하는 수많은 방법이 있다. 특정 실시양태에서, 화합물의 고-처리량 스크리닝은 뼈에 대한 액티빈 또는 ActRIIA 매개 효과를 교란시키는 물질(agent)을 동정하기 위해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 에세이는 ActRIIA 폴리펩티드의 액티빈에 대한 결합을 특이적으로 억제하거나 감소시키는 화합물을 스크리닝 및 동정하기 위해 수행된다. 다르게는, 상기 에세이는 ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈의 결합을 향상시키는 화합물을 동정하는 데 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 화합물은 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드와 상호 작용하는 능력에 의해 동정 될 수 있다.

다양한 에세이 포맷이 충분할 것이며, 본원에 비추어 본원에서 명백하게 기술되지 않은 것들도 당업자에 의해 이해될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에서 사용된 시험 화합물(물질)은 임의의 조합 화학 방법에 의해 생성될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 합성된 천연 산출 생체 분자일 수 있다. 조직 성장의 조절자로서 작용하는 능력을 시험할 화합물(물질)은 예를 들어, 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체에 의해 생성되거나(예를 들어, 천연 생성물), 화학적으로 생성되거나(예를 들어, 펩티드 모방체(peptidomimetics)를 비롯한 소 분자), 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 본원에서 고려되는 시험 화합물은 비펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 시험 물질은 약 2,000달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 분자이다.

시험 화합물은 단일의 별개의 실체로서 제공되거나, 조합 화학에 의해 제조 된 것과 같이 더 복잡한 라이브러리로 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예를 들어 알콜, 알킬할라이드, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 시험 화합물의 시험 시스템으로의 제공은 분리된 형태 또는 화합물들의 혼합물로서, 특히 초기 스크리닝 단계에서 이루어질 수 있다. 임의로, 화합물은 다른 화합물에 의해 유도체화되어 화합물의 분리를 촉진하는 유도체 형성기(derivatizing group)를 가질 수 있다.

유도체 형성기의 비제한적인 예는 비오틴, 플루오레세인, 디옥시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위 원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타티온 S 전이효소(GST), 광활성 가교제 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다.

화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간 내에 조사된 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 고-처리량의 에세이가 바람직하다. 정제되거나 반정제된 단백질로 유도될 수 있는 것과 같은, 세포가 없는 시스템에서 수행되는 에세이는 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서 신속한 진행 및 상대적으로 용이한 검출이 가능하도록 생성될 수 있는 점에서 종종 "1차" 스크린으로서 선호된다. 더욱이, 시험 화합물의 세포 독성 또는 생체 이용률의 영향은 일반적으로 시험관내 시스템에서 무시될 수 있는데, 대신에 그 에세이는 ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈 간의 결합 친화성의 변화를 분명히 나타낼 수 있기 때문에 주로 분자 표적에 대한 약물의 효과에 초점을 맞추고 있다.

단지 설명을 목적으로, 예시적인 스크리닝 에세이에서, 관심 화합물을 통상적으로 액티빈에 결합될 수 있는 분리 및 정제된 ActRIIA 폴리펩티드와 접촉시킨다. 화합물과 ActRIIA 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIA 리간드를 함유하는 조성물을 첨가한다. ActRIIA/액티빈 복합체의 검출 및 정량화는 ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈 사이의 복합체 형성을 억제(또는 강화)하는 화합물의 효능을 결정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 시험 화합물의 다양한 농도를 사용하여 얻은 데이터로부터 투여량 반응 곡선을 생성함으로써 평가할 수 있다. 더욱이, 비교를 위한 기준을 제공하기 위해 대조 에세이도 수행될 수 있다. 예를 들어, 대조 에세이에서, 분리 및 정제된 액티빈을 ActRIIA 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가하고, ActRIIA/액티빈 복합체의 형성을 시험 화합물의 부재하에 정량한다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물 및 용해물을 사용하여 적절한 무세포 에세이 시스템을 만들 수 있다.

ActRIIA 폴리펩티드와 액틴빈 간의 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출 될 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지된(예를 들어, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광 표지된(예를 들어, FITC) 또는 효소적으로 표지된 ActRIIA 폴리펩티드 또는 액티빈과 같은 검출 가능하게 표지된 단백질을 사용하거나, 면역에세이, 또는 크로마토 그래피 검출에 의해 복합체의 형성의 조절을 정량할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서는 ActRIIA 폴리펩티드 및 그의 결합 단백질 간의 상호 작용의 정도를 직접 또는 간접적으로 측정하는 형광 편광 에세이 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 에세이의 용도가 고려된다. 또한, 광학 도파관(PCT 공보 WO 96/26432 및 US 5,677,196), 표면 플라스몬 공명(SPR), 표면 전하 센서 및 표면 힘 센서에 기초한 것과 같은 다른 검출 방식이 본 명세서에 기술된 많은 실시양태들과 양립성이다.

또한, "2 하이브리드 에세이"로도 알려진 상호 작용 트랩 에세이는 ActRIIA 폴리 펩티드와 그의 결합 단백질 사이의 상호 작용을 분열시키거나 강화시키는 작용제를 동정하는 데 사용될 수 있다. 참조, 예를 들어, U.S. 특허 제5,283,317호; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; 및 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696). 특정 실시양태에서, 본원에서는 ActRIIA 폴리펩티드와 그의 결합 단백질 사이의 상호 작용을 해리하는 화합물(예, 소분자 또는 펩티드)을 동정하기 위한 역 2 하이브리드 시스템의 용도가 고려된다. 참고: 예를 들어, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27 : 919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17 : 374-81; 및 U.S. 특허 제5,525,490호; 제5,955,280호; 및 제5,965,368호.

특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드와 상호 작용하는 그들의 능력에 의해 동정된다. 상기 화합물과 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 간의 상호 작용은 공유결합이거나 비공유결합일 수 있다. 예를 들어, 그러한 상호 작용은 광가교, 방사성 표지된 리간드 결합 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 시험관내(in vitro) 생화학적 방법을 사용하여 단백질 수준으로 동정될 수 있다(Jakoby W B et al., 1974, Methods in Enzymology 46 : 1). 특정 경우에, 화합물은 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 검출하는 에세이와 같은 메카니즘 기반의 에세이로 스크리닝될 수 있다. 이것은 고체상 또는 유체상 결합 단계를 포함할 수 있다. 다르게는, 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 리포터 시스템(예를 들어, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 또는 녹색 형광 단백질)에 의해 세포 내로 형질감염될 수 있고, 바람직하게는 고-처리량 스크리닝에 의해 또는 라이브러리의 개별 요소들에 의해 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있다. 다른 메카니즘에 기초한 결합 에세이, 예를 들어 자유 에너지의 변화를 검출하는 결합 에세이를 사용할 수 있다. 결합 에세이는 웰(well), 비드 또는 칩에 고정되거나, 고정화 항체에 의해 포착되거나 모세관 전기 영동에 의해 분해된(resolved) 표적에 의해 수행될 수 있다. 결합된 화합물은 일반적으로 비색계 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 dl용하여 검출될 수 있다.

특정 양태에서, 본원은 골형성을 조절(자극 또는 억제)하고 뼈 중량을 증가시키기 위한 방법 및 물질(agent)을 제공한다. 따라서 동정된 모든 화합물은 시험관내 또는 생체내에서 전체 세포 또는 조직에서 시험하여 뼈의 성장 또는 무기질화를 조절하는 능력을 확인할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 방법이 이 목적을 위해 사용 될 수 있다. 특히, 화합물은 골 교체를 증가시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.

예를 들어, ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 또는 시험 화합물이 뼈 또는 연골 성장에 미치는 영향은 세포 기반 에세이에서 Msx2의 유도 또는 골전구세포에서 조골 세포로의 분화를 측정하여 결정할 수 있다(참고: 예를 들어, Daluiski et al. , Nat Genet., 2001, 27 (1) : 84-8, Hino et al., Front Biosci. 2004, 9 : 1520-9). 세포-기반 에세이의 또 다른 예는 간엽 전구세포 및 조골 세포에서 본 발명의 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 및 시험 화합물의 골 형성 활성을 에세이하는 것을 포함한다. 예를 들어, 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 다능성 간엽 C3H10T1/2 전구세포, C2Cl2 전-조골 세포 및 TE-85 조골세포를 감염시키도록 구성될 수 있다. 골 형성 활성은 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 및 매트릭스 무기질화 작용의 유도를 측정함으로써 결정된다(참조, Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A (8) : 1544-52).

본원은 또한 뼈 또는 연골 성장을 측정하기 위한 생체내 에세이법을 제공한다. 예를 들어, Namkung-Matthai 등, Bone, 28 : 80-86 (2001)은 골절 후 초반의 뼈 회복이 연구된 래트(rat) 골다공증 모델을 개시한다. Kubo 등, Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68 : 197-202 (1999)는 또한 골절 후 후반의 뼈 회복이 연구된 래트 골다공증 모델을 개시한다. Andersson 등, J. Endocrinol. 170 : 529-537은 마우스가 난소 절제술을 받은 마우스 골다공증 모델을 기술하는데, 난소 절제술은 마우스가 실질적인 골밀도 및 뼈의 무기질 함량을 잃고, 지주골이 골 무기질 밀도의 약 50%를 잃어 버리게 되는 원인이 된다. 골밀도는 부갑상선 호르몬과 같은 인자를 투여함으로써 난소 절제술을 한 마우스에서 증가될 수 있다. 특정 양태에서, 당업계에 공지된 골절 치유 에세이가 사용될 수 있다. 이러한 에세이는 골절 기술, 조직학 에세이 및 생체 역학 에세이를 포함하는데, 이는 예를 들어 U.S. 특허 제6,521,750호에 개시되어 있으며, 골절의 원인과 골절 정도 측정을 위한 실험적 프로토콜과 회복 과정에 대한 개시 내용 전체가 참고로 포함된다.

8.7 액티빈 수용체 II형 신호 억제제의 투여량

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 8.5.1 부분에 기재된 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 다른 실시양태에서, ActRII 억제제는 8.5.2 부분에 기재된 바와 같은 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제 및 ActRIIB 신호전달 억제제의 조합물이다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 0.2㎍/㎏ 이상의 혈청 농도를 달성하기에 충분한 간격 및 양으로 투여되고, 골밀도 및 골강도에 중대한 영향을 성취하기 위해서 1㎍/㎏ 또는 2㎍/㎏ 이상의 혈청 수준이 바람직하다. 투약 처방은 0.2 내지 15㎍/kg, 임의로 1 내지 5㎍/kg의 혈청 농도에 도달하도록 설계될 수 있다. 사람의 경우, 0.1mg/kg 이상의 단일 투여량으로 0.2μg/kg의 혈청 수준을 달성할 수 있으며, 0.3mg/kg이상의 단일 투여량으로 1μg/kg의 혈청 수준을 달성할 수 있다. 관찰된 분자의 혈청 반감기는 약 20 내지 30일이며, 대부분의 Fc 융합 단백질보다 실질적으로 길기 때문에, 예를 들어, 0.2-0.4mg/kg을 매주 또는 격주로 투여하여 지속적인 유효 혈청 수준을 성취하거나, 투여 간격을 길게 하여 더 높은 투여량을 사용할 수 있다. 예를 들어, 1~3mg/kg의 투여량을 매월 또는 2개월 단위로 사용할 수 있으며, 뼈에 대한 효과는 3, 4, 5, 6, 9, 12개월 또는 그 이상마다 1 회만 투여하면 충분할 정도로 지속성이 있다. ActRII 신호전달 억제제의 혈청 수준은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, ActRII 신호전달 억제제에 대한 항체는 예를 들어 ELISA를 사용하여 ActRII 신호전달 억제제의 혈청 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 0.01 내지 3.0mg/kg 정맥내 또는 0.03 내지 0.1mg/kg 피하 범위이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 약 0.01mg/kg, 약 0.1mg/kg, 약 0.13mg/kg, 약 0.2mg/kg, 약 0.26mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9mg/kg, 약 1.0mg/kg, 약 1.5mg/kg, 약 2.0mg/kg 약 2.5mg/kg, 약 3.0mg/kg, 약 3.5mg/kg, 약 4.0mg/kg, 약 4.5mg/kg 또는 약 5.0mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 약 10.0mg/kg, 약 15.0mg/kg, 약 20.0mg/kg, 약 25.0mg/kg 또는 약 30.0mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 0.01mg/kg 내지 0.1mg/kg, 0.1mg/kg 내지 0.3mg/kg, 0.3mg/kg 내지 0.5mg/kg, 0.3mg/kg 및 0.8mg/kg, 0.5mg/kg 내지 1.0mg/kg, 1.0mg/kg 내지 2.0mg/kg, 1.0mg/kg 내지 3.0mg/kg, 2.0mg/kg 내지 3.0mg/kg 3.0mg/kg 내지 5.0mg/kg, 5.0mg/kg 내지 10.0mg/kg, 10.0mg/kg 내지 15.0mg/kg, 10.0mg/kg 내지 20.0mg/kg, 15.0mg/kg 내지 20.0mg/kg, 또는 20.0mg/kg 내지 30.0mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 15mg, 약 30mg, 약 45mg, 약 60mg, 약 75mg, 약 90mg 또는 약 1g이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 0.1mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 0.3mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 0.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 약 0.7mg/kg이다.

특정 실시양태에서, 투여량은 약제학적 유효량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 15mg, 약 30mg, 약 45mg, 약 60mg, 약 75mg, 약 90mg 또는 약 1 g, 또는 약 0.1mg/kg, 약 0.13mg/kg 약 0.2mg/kg, 약 0.26mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9mg/kg, 약 1.0mg/kg, 약 1.1mg/kg, 약 1.2mg/kg, 약 1.3mg/kg, 약 1.4mg/kg 또는 약 1.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 0.1mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 0.3mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 0.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 0.7mg/kg이다.

특정 실시양태에서, 투여량은 초기 투여량이다. 특정 양태에서, 초기 투여량은 약 15mg, 약 30mg, 약 45mg, 약 60mg, 약 75mg, 약 90mg 또는 약 1 g, 또는 약 0.1mg/kg, 약 0.13mg/kg, 약 0.2mg/kg, 약 0.26mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9 약 1.0mg/kg, 약 1.1mg/kg, 약 1.2mg/kg, 약 1.3mg/kg, 약 1.4mg/kg 또는 약 1.5mg/kg의 투여량을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 약 0.1mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.3mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.5mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.7mg/kg이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 (i) 28일마다 1회; 또는 (ii) 42일마다 1회이다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 14일마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 21일마다 1회 투여된다.

특정 실시양태에서, 초기 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.1mg/kg, 약 0.13mg/kg, 약 0.2mg/kg, 약 0.26mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9mg/kg, 약 1.0mg/kg, 약 1.1mg/kg, 약 1.2mg/kg, 약 1.3mg/kg, 약 1.4mg/kg 또는 약 1.5mg/kg이며, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.3 내지 약 0.8mg/kg이고, 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.1mg/kg, 약 0.13mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9mg/kg, 약 1.0mg/kg, 약 1.1mg/kg, 약 1.2mg/kg, 약 1.3mg/kg, 약 1.4mg/kg 또는 약 1.5mg/kg이며, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.3mg/kg, 약 0.4mg/kg, 약 0.5mg/kg, 약 0.6mg/kg, 약 0.7mg/kg, 약 0.8mg/kg, 약 0.9mg/kg, 약 1.1mg/kg, 약 1.2mg/kg, 약 1.3mg/kg, 약 1.4mg/kg 또는 약 1.5mg/kg이며, 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.3mg/kg이며, 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.5mg/kg이며, 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.7mg/kg이며, 2주마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 투여량은 약 0.8mg/kg이며, 2주마다 1회 투여된다.

특정 실시양태에서, 투여량은 조절된 투여량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 크다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 약 2.5mg, 약 5mg, 약 10mg, 약 15mg, 약 20mg 또는 약 35mg 많거나, 또는 초기 투여량보다 약 0.05mg/kg, 약 0.1mg/kg, 약 0.15mg/kg, 약 0.25mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.35mg/kg, 약 0.4mg/kg 또는 약 0.5mg/kg 많을 수 있다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 더 빈번하게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35 또는 40일마다 투여된다.

특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 적다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 약 2.5mg, 약 5mg, 약 10mg, 약 15mg, 약 20mg 또는 약 35mg 적거나, 또는 초기 투여량보다 약 0.05mg/kg, 약 0.1mg/kg 약 0.15mg/kg, 약 0.25mg/kg, 약 0.3mg/kg, 약 0.35mg/kg, 약 0.4mg/kg 또는 약 0.5mg/kg 적다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 초기 투여량보다 덜 빈번하게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 투여량은 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80 또는 90일마다 투여된다.

특정 실시양태에서, 투여량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여량은 28일마다 1회 또는 42일마다 1회 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여량은 연속적으로 및/또는 무기한 투여된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에게 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 액티빈 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 액티빈 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 액티빈은 유리 액티빈, 예를 들어 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 3 또는 인히빈과 관련되지 않은 액티빈이다. 특정 실시양태에서, 액티빈은 액티빈 A이다. 특정 실시양태에서, 액티빈 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기술된 에세이법에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의의 Smad-의존적 신호전달을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Smad-의존적 신호전달에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Smad-의존적 신호전달은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의의 Runx2 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Runx2 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Runx2 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 Alp 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Alp 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Alp 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 Snai1 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Snai1 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Snai1 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 포스포스마드2 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 포스포스마드2 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 포스포스마드2 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 포스포스마드3 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 포스포스마드3 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 포스포스마드3 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 요단백질 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 요단백질 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 요단백질 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 Dkk1 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Dkk1 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Dkk1 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 col1a1 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 col1a1 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, col1a1 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상의 BSAP 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 BSAP 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, BSAP 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 CTX 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 CTX 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, CTX 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 오스테릭스(Osterix) 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 오스테릭스 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 오스테릭스 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 ActRIIA 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 ActRIIA 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 클로토(Klotho) 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 클로토 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서 클로토 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기술된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 α-SMA 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 α-SMA 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15% , 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서 α-SMA 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기술된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 MYOCD 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 MYOCD 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, MYOCD 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 Axin2 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Axin2 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Axin2 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 혈관 평활근 단백질 수준, 예를 들어 Sm22-α를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 혈관 평활근 단백질 수준에 비해 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 혈관 평활근 단백질 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 Sm22-α 수준 및/또는 활성을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 Sm22-α 수준 및/또는 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, Sm22-α 수준 및/또는 활성은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 골체적을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 골체적에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 골체적은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 파골세포 피트(pit) 표면을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 파골세포 피트 표면에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 파골세포 피트 표면은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 골 형성 속도를 유지하거나, 또는 대상체의 골 형성 속도를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 골 형성 속도에 비해 예를 들어 최대 1%, 2.5%, 5%, 10%, 또는 15% 만큼 최소한으로 증가 또는 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 뼈 형성 속도는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 조골 세포 표면을 유지하거나, 또는 대상체의 조골 세포 표면을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 조골 세포 표면에 비해 예를 들어 최대 1%, 2.5%, 5%, 10%, 또는 15% 만큼 최소한으로 증가 또는 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 조골 세포 표면은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 대동맥 조골 세포 전이를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 대동맥 조골 세포 전이에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는, 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다 특정 실시양태에서, 대동맥 조골 세포 전이는 8.6 부분에 기술된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 조골 세포 수를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 조골 세포 수에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 조골 세포 수는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 조골 세포 표면 대 골 표면 비를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 조골 세포 표면 대 골 표면 비에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 조골 세포 표면 대 골 표면 비율은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 파골세포 수를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 파골세포 수에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 파골세포 수는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 파골세포 표면 대 골 표면 비율을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 파골세포 표면 대 골 표면 비에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 파골세포 표면 대 골 표면 비율은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 지주골 체적을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 지주골 체적에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 지주골 체적은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 골소주 두께를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 골소주 두께에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 골소주 두께는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 혈관 평활근 기능을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 혈관 평활근 기능에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 혈관 평활근 기능은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 혈관 석회화를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 혈관 석회화에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 혈관 석회화는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 혈관 칼슘 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 혈관 칼슘 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 혈관 칼슘 수준은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 대동맥 칼슘 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 대동맥 칼슘 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 대동맥 칼슘 수준은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 대동맥 죽종에서의 칼슘 축적을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 대동맥 죽종에서의 칼슘 축적에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 대동맥 죽종에서의 칼슘 축적은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 CKD-유도 내피-간엽 전환(EnMT)을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 EnMT에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, EnMT는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 심장 크기(예를 들어, 심장 무게)를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 심장 크기(예를 들어, 심장 무게)에 비해 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 적어도 10% 만큼, 또는 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 최대 10% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 심장 크기는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 분화된 혈관 평활근 세포의 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 분화된 혈관 평활근 세포의 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 적어도 500% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 또는 최대 500% 만큼 증가시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 분화된 혈관 평활근 세포의 수준은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 상승된 동맥 경직도 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 동맥 경직도에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 동맥 경직도는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 상승된 동맥 경직도 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 동맥 경직도에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 동맥 경직도는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 무기질 침착 속도를 유지하거나, 대상체의 무기질 침착 속도를 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 무기질 침착 속도에 비해 예를 들어 최대 1%, 2.5%, 5%, 10% 또는 15% 만큼 최소로 증가시키거나 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 무기질 침착 속도는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 과인산혈증을 유지하거나, 대상체의 과인산혈증을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 과인산혈증에 비해 예를 들어 최대 1%, 2.5%, 5%, 10% 또는 15% 만큼 최소로 증가시키거나 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 과인산혈증은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 FGF23의 수준을 유지하거나, 대상체의 FGF23의 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 FGF23의 수준에 비해 예를 들어 최대 1%, 2.5%, 5%, 10% 또는 15% 만큼 최소로 증가시키거나 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, FGF 수준은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 환자에게 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 환자의 신장 섬유증을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 신장 섬유증에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 신장 섬유증은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 사구체경화증을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 사구체 경화증에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100% 만큼, 또는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 만큼 감소시키는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 사구체경화증은 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 본원에 제공된 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, colla1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, 요단백질 및/또는 ActRIIA)의 수준을 정상화하는 데 충분하다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 본원에 제공된 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, colla1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, 요단백질 및/또는 ActRIIA)의 수준을 기준 집단(예를 들어, 8.6 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단)의 각 바이오마커의 수준으로 증가 또는 감소시키는 데 충분하다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 심장 비대를 치료 및/또는 예방하는 데 충분하다. 특정 실시양태에서, 심장 비대는 8.6 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 투여량은 대상체의 LVH를 치료 및/또는 예방하는 데 충분하다.

본원에 제공된 투여량(예를 들어, ActRII 신호전달 억제제의 투여량 또는 제2 활성제의 투여량)과 관련하여 사용될 때, 용어 "약"은 지시된 숫자의 약 1, 5 또는 10% 내의 임의의 숫자를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제는 본원에 제공된 방법에 따라 대상체에 피하 또는 정맥내로 투여된다.

특정 실시양태에서, 0.13mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 번호 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 14일에 1회 간격으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 0.26mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 14일에 1회 간격으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 0.1mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 14일에 1회 간격으로 정맥내 투여된다. 특정 실시양태에서, 0.2mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 14일에 1회 간격으로 정맥내 투여된다. 특정 실시양태에서, 0.3mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 28일에 1회 간격으로 피하 투여한다. 특정 실시양태에서, 0.5mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 치료된 대상체에 28일에 1회 간격으로 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 0.7mg/kg의 ActRIIA-hFc(서열 7)는 제공된 방법에 따라 처리된 대상체에 28일에 1회 간격으로 피하 투여한다.

8.8 병용 요법

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 제2 약학적 활성제와 병용하여 수행된다. 이러한 병용 요법은 개별 치료 성분들을 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법의 성분으로서 투여되는 경우, ActRII 신호전달 억제제 및 제2 약학적 활성제는 상승작용성일 수 있어서, 단독 요법으로 통상적으로 투여되는 각 성분의 투여량에 비해 성분 중 하나 또는 둘 모두의 1일 투여량을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 그러한 병용 요법의 성분으로서 투여될 때, 본원에 제공된 ActRII 신호전달 억제제 및 제2 약학적 활성제는 부가적일 수 있어서, 각 성분의 1일 투여량은 단독 요법으로 통상적으로 투여되는 각 성분의 투여량과 유사하거나 동일하다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 ActRII 신호전달 억제제는 제2 약학 적 활성제와 같은 날에 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 제2 약학적 활성제를 투여하기 1, 2, 3일 또는 그 이상 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 제2 약학적 활성제를 투여하고 1, 2, 3일 또는 그 이상 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 제2 약학적 활성제를 투여한 지 1, 2, 3 또는 4주 이내에 투여된다.

특정 실시양태에서, 제2 약학적 활성제는 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈(예를 들어, 유리 액티빈), Runx2, Alp, BSAP, CTX 및/또는 오스테릭스의 길항제, 예를 들어 항체 또는 그의 단편, 소분자 신호전달 억제제, 안티센스 핵산, 작은 간섭 핵산, 도미넌트 네거티브(dominant negative) 단백질 또는 그의 단편이다. 특정 실시양태에서, 제2 약학적 활성제는 클로토, α-SMA, MYOCD, Axin2 및/또는 Sm22-α의 작용제, 예를 들어 항체 또는 그의 단편 또는 소분자이다.

특정 실시양태에서, 제2 약학적 활성제는 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 치료하는 데 사용된 활성제, 예를 들어 알도스테론 신경전달 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 콜레스테롤 저하 약물, 디곡신, 이뇨제, 변비 치료제, 칼륨 또는 마그네슘, 혈관 확장제, 및/또는 와파린이다.

특정 실시양태에서, 제2 약학적 활성제는 만성 신장병을 치료하는 데 사용된 활성제, 예를 들어 안지오텐신 II 수용체 차단제, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 직접 레닌 신호전달 억제제, 이뇨제, 혈관 확장제, 에리쓰로포이에틴 요법, 철분 대체 요법 및/또는 비타민 D이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 및/또는 신장병 및/또는 만성 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병 및/또는 만성 신장병에 기인한 심혈관계 질환을 치료하거나 완화시키는 방법과 병용하여 수행된다.

8.9 약제학적 조성물

특정 실시양태에서, 액티빈-ActRII 길항제 (예컨대, ActRII 폴리펩티드)는 본원에 기재된 방법과 사용하기 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체와 제형화된다. 예를 들어, ActRII 폴리펩티드는 단독으로 투여되거나 약제 제제 (치료용 조성물)의 성분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 인간 또는 수의과 약물에 사용하기 위해 통상의 방식으로 투여되도록 제형화될 수 있다. ActRII는 ActRIIA 또는 ActRIIB일 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 방법은 조성물 (ActRII 신호전달 억제제를 포함하는)을 임플란트 또는 장치로서 전신적으로 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 본원에 제공된 용도에 사용하기 위한 치료용 조성물은 발열물질이 없는(pyrogen-free), 생리학적으로 허용가능한 형태이다. 상기 기재한 바와 같이 조성물에 경우에 따라 포함될 수도 있는 ActRII 길항제 이외의 치료적으로 유용한 물질은 본 발명의 화합물 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드와 같은 ActRII 폴리펩티드 (참조, 8.5 부분))과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

전형적으로, ActRII 길항제는 비경구적으로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀전, 또는 사용하기 직전에 멸균 스캐닝액 또는 분사액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 산화방지제, 완충액, 세균발육억제제, 제형을 의도하는 수령자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 농후화제를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 적용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은), 및 적합한 그의 혼합물, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한(injectable) 유기 에스테르를 포함한다. 적합한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하는 것에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하는 것에 의해, 및 계면활성제를 사용하는 것에 의해 유지할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 표적 조직 부위 (예컨대, 뼈)에 전달하기 위한 형태로 캡슐화(encapsulated)되거나 주입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 조성물은 하나 이상의 치료용 화합물 (예컨대, ActRIIA 폴리펩티드)을 표적 조직 부위 (예컨대, 뼈)에 전달하여서 발달 조직에 대한 구조를 제공하고 경우에 따라 체내에 다시 흡수될 수 있는 매트릭스(matrix)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 ActRIIA 폴리펩티드의 서방(slow release)을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 다른 이식매립된 의료 설비에 현재 사용되는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용상 외관 및 계면 특성을 기초로 한다. 본 발명의 조성물의 특정 용도는 적절한 제형을 규정할 것이다. 상기 조성물용의 가능한 매트릭스는 생분해성 및 화학적으로 규정된 황산칼슘, 트리칼슘포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 가능한 재료는 뼈 또는 진피 콜라겐과 같이 생분해성이고 생물학적으로 잘 규정된 것이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진다. 다른 가능한 매트릭스는 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트, 또는 기타 세라믹과 같이 비-생분해성이고 화학적으로 규정된 것이다. 매트릭스는 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트와 같은, 상술한 유형의 물질의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서와 같이 조성물에서 변형될 수 있고 기공 크기, 입자 크기, 입자 형상 및 생분해성을 변경하도록 가공될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 조성물 (ActRII 신호전달 억제제를 포함하는)은 경구적으로, 예컨대, 캡슐, 카쉐(cachets), 환제, 정제, 로젠지 (향이 가미된 베이스를 사용, 흔히 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트 사용), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로, 또는 물속오일(oil-in-water) 또는 오일속물(water-in-oil) 액체 에멀전으로, 또는 엘릭서(elixir) 또는 시럽으로, 또는 원형 드롭스 (젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 불활성 베이스 사용)로 및/또는 구강세정제 등의 형태로 투여될 수 있고, 이들 형태는 각각 소정 양의 약물을 활성 성분으로 함유한다. 약물은 또한 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트로 투여될 수 있다.

경구 투여용 고체 투여 형태(캡슐, 정제, 환제, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 본원에 기재된 하나 이상의 치료용 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 및/또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 다음 중 임의의 것과 혼합될 수 있다: (1) 전분, 락토오스, 수크로스, 글루코오스, 만니톨 및/또는 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 결합제, 예를 들어 카르복시 메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로즈 및/또는 아카시아; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천-한천, 칼슘카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨과 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 지연제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; (9) 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액체 투여 형태는 물 또는 다른 용매와 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질 알콜, 벤질벤조에이트, 프로필글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 오일(특히 목화씨, 땅콩, 옥수수, 씨눈, 올리브, 피마자 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르와 같은 가용화제 및 유화제, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 외에도, 경구 조성물은 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 향료, 착색제, 향료 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물 이외에, 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.

본원에 기재된 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 조성물에 설탕, 염화나트륨 등의 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 약제학적 형태의 장기 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약제를 포함시킴으로써 유도할 수 있다.

투여 요법은 본원에 기재된 화합물(예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드와 같은 ActRII 폴리펩티드(참조, 8.5 부분))의 작용을 조절하는 다양한 인자를 고려하는 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다. 다양한 인자는 형성되기를 원하는 뼈 무게의 양, 골 밀도 손실의 정도, 뼈 손상 부위, 손상된 뼈의 상태, 대상체의 나이, 성별 및 식이, 골 손실에 영향을 줄 수 있는 임의의 질병의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상적 요인을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 임의로, 투여량은 재구성에 사용된 매트릭스의 유형 및 조성물 중의 화합물의 유형에 따라 달라질 수 있다. 다른 공지된 성장 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것은 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 경과는 뼈의 성장 및/또는 회복에 대한 주기적 평가, 예를 들어 X-선(DEXA 포함), 조직형태측정 및 테트라시클린 라벨링을 통해 모니터링 할 수 있다.

특정 실시양태에서, ActRII 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 유전자 요법이 본원에 제공된다. 이러한 요법은 위에 열거된 장애를 갖는 세포 또는 조직에 ActRII 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입함으로써 그의 치료 효과를 달성할 것이다. ActRII 폴리뉴클레오타이드 서열의 전달은 키메라 바이러스 또는 콜로이드 분산 시스템과 같은 재조합 발현 벡터를 사용하여 달성될 수 있다. ActRII 폴리 뉴클레오타이드 서열의 치료학적 전달에 바람직한 것은 표적화된 리포좀의 사용이다. ActRII 폴리펩티드는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드일 수 있다 (8.5 부분 참조).

본원에서 교시된 바와 같이 유전자 요법을 위해 사용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 또는 바람직하게는 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 마우스 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 하나의 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예에는 모로니(Moloney) 마우스 백혈병 바이러스(MoMuLV), 하비(Harvey) 마우스 육종 바이러스(HaMuSV), 마우스 유방암 바이러스 (MuMTV) 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV)가 포함된다. 다수의 추가 레트로바이러스 벡터가 다수의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 모든 벡터는 형질도입된 세포를 동정하고 생성할 수 있도록 선별 마커용 유전자를 전달하거나 포함시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 설탕, 당지질 또는 단백질을 부착하여 표적 특이적으로 만들 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 사용함으로써 달성된다. 당업자는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열이 레트로바이러스 게놈에 삽입되거나 바이러스 엔벨로프(envelope)에 부착되어 ActRII 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 전달을 가능하게 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 뼈 또는 연골을 표적으로 한다.

다르게는, 조직 배양 세포는 전통적인 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드로 직접 형질감염될 수 있다. 그 후 이들 세포를 관심 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염시킨다. 생성된 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지로 방출한다.

ActRII 폴리뉴클레오티드에 대한 또 다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 거대 분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어(microsphere), 비드 및 물속오일 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 바람직한 콜로이드 계는 리포좀이다. 리포좀은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공 멤브레인 소포이다. RNA, DNA 및 손상되지 않은 비리온(intact virion)은 수성 내부에 캡슐화되어 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(참조, 예를 들어, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6 : 77, 1981). 리포좀 비히클을 이용한 효율적인 유전자 전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Mannino, et al., Biotechniques, 6 : 682, 1988을 참조할 수 있다. 리포좀의 조성물은 통상적으로 인지질의 조합물, 통상 스테로이드, 특히 콜레스테롤의 조합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질도 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다.

리포좀 생산에 유용한 지질의 예로는 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드와 같은 포스파티딜 화합물이 포함된다. 예시적인 인지질은 난(egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포좀의 표적화는 예를 들어 기관 특이성, 세포 특이성 및 세포 소기관 특이성에 기초하여 가능하며, 당업계에 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 약제학적 조성물에서 실질적으로 순수하다. 구체적으로, 약제학적 조성물 중의 화합물의 최대 20%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.1% 또는 최대 0.05%는 ActRII 신호전달 억제제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 이외의 화합물이다.

8.10 키트

본원은 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스,클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질)의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 하나의 바이오마커(예를 들어 Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD , Sm22- α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질)의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약(reagent)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Runx2의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Alp 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Snai1의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 포스포스마드2의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Dkk1 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 col1a1의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 액티빈의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된된 대상체로부터 얻은 샘플에서 BSAP 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 CTX 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 오스테릭스의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 클로토의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 α-SMA의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 MYOCD의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Sm22-α의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 포스포스마드-3의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 요단백질의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서의 ActRIIA 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 Axin2의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다.

특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 2가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 3가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 3가지 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 4가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 4가지 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 5가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 5가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 6가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 6가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 7가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 7가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 8가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 8가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 9가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 9가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 10가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 10가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 11가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 11가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 12가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 12가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 13가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 13가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 14가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 14가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 15가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 15가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 16가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 16가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 17가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 17가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 대상체로부터 얻은 샘플에서 본원에 기재된 18가지 바이오마커(예를 들어, Runx2, Alp, Snai1, 포스포스마드2, Dkk1, col1a1, 액티빈, BSAP, CTX, 오스테릭스, 클로토, α-SMA, MYOCD, Sm22-α, 포스포스마드3, ActRIIA, Axin2 및 요단백질으로 이루어진 군으로부터 선택된 18가지 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 하나 이상의 시약은 8.6.1 부분에서 설명된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 키트는 ActRIIA-hFc(서열 7)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 ActRIIA-hFc(서열 7)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함한다.

9. 실시예

본원에 제시된 실시예는 특정 형태의 만성 신장병에서 Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및 오스테릭스 mRNA 수준은 증가하고 또 클로토, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및 Sm22-알파 mRNA 수준은 감소될 수 있음을 나타낸다. 이들 실시예는 또한 액티빈 리간드 트랩을 사용한 치료가 Runx2, Alp, CTX, ActRIIA, 및/또는 오스테릭스 mRNA 수준을 감소시키고 클로토, 알파-SMA, MYOCD, Axin2, 및/또는 Sm22-알파 mRNA 수준은 증가시킴을 나타내는데, 이는 혈관 석회화 감소와 관련된다. 따라서, 본원에 제공된 실시예는 Runx2, Alp, CTX, 오스테릭스, 클로토, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파가 심혈관계 질환, 혈관 석회화, 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한 심혈관계 질환, 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한 심혈관계 질환, 동맥 경직도 수준 증가, 동맥 경직도 수준 증가와 관련되거나 및/또는 동맥 경직도 수준 증가에 기인한 심혈관계 질환, LVH, 및/또는 LVH와 관련되거나 및/또는 LVH에 기인한 심혈관계 질환을 치료하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

9.1 실시예 1. 액티빈 수용체 2A형에 대한 리간드 트랩을 사용한 CKD- MBD 의 치료

CKD-MBD는 혈관 석회화, 골이영양증, 및 시작때부터 골격 골세포 FGF23 분비의 자극, 및 고인산혈증과 혈관 석회화를 더 자극하는 과정에서 추후 징후를 포함할 수 있다. 이 실시예는 CKD에 의해 유도된 액티빈 IIA형 수용체 (ActRIIA)를 통한 TGFβ 수퍼패밀리 신호전달의 구성원인 ActRIIA 신호전달의 억제가 혈관 석회화를 억제하고 심장비대를 예방함을 나타낸다.

9.1. 1 방법

혈관 석회화의 고 지방식을 섭취시킨 모델인 14주령(14 weeks)의 2형 당뇨병 ldlr-/- 마우스에서 고인산혈증을 갖고 GFR에서 60% 감소를 보인 CKD (CKD-3)를 유도하였다. 일부 CKD 마우스를 22주령에 시작하여 IP 주사된 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc로 처리하고, 28주에 연구하였다. 대동맥 Ca² ⁺ 수준, 골아세포 혈관 평활근 단백질의 발현, 골격 조직형태계측 및 마이크로CT 이미징, 혈청 화학 및 FGF23과 PTH 수준을 측정하였다. 액티빈, 폴리스타틴(Follistatin) 및 인히빈(Inhibin) 수준을 LISA, RT-PCR 및 웨스턴 블럿에 의해 측정하였다.

9.1. 2 결과

2개의 상이한 신장병 모델인 간질성 섬유증 및 X-결합된 AIports에서는 순환 액티빈 수준이 감소되었다(도 1a 및 도 1b). 또한, CKD 모델의 대동맥 및 신장에서 액티빈 A mRNA 수준은 증가하였다(도 2). 액티빈 수준은 폴리스타틴에서 변화 없이 혈관계 및 순환계에서 증가하였다(도 2a, 도 2b, 및 도 2c). CKD는혈관 석회화를 자극하였고, 이는 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩(mActRIIA-Fc; 참조, 예컨대, 그 전체 내용이 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 제8,173,601호)을 사용한 치료에 의해 22주 수준 아래로 감소되었고(도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 5a, 및 도 5b), 심장비대가 예방되었다. CKD는 대동맥 Runx2, 오스테릭스, 및 Alp 메시지 및 단백질의 발현을 유도하였고, 또 이들은 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해 반전되었다(Runx2 및 Alp mRNA의 경우 각각 도 4a 및 도 4b; Runx2 단백질의 경우 도 4f). CKD는 클로토 및 Sm22-알파 메시지 및 단백질을 감소시켰고, 또한 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료는 클로토 및 Sm22-알파 발현을 정상화시켰다(클로토 and Sm22-알파 mRNA의 경우 각각 도 4c 및 도 4e; 단백질의 경우 도 4f). 또한, CKD는 MYOCD 메시지를 감소시켰다(도 4d). 또한, CKD는 알파-평활근 액틴 (액틴 알파-평활근) 단백질을 감소시켰다(도 4f). 또한, CKD는 칼슘의 수준 증가를 자극하였고, 이는 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해 감소되었다(도 6a). 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해 뼈 체적이 증가되었고, 파골세포 피트(osteoclast pit) 표면은 감소되었지만, 뼈 형성률 및 골아세포 표면은 영향을 받지 않았다(도 6b, 도 6c, 및 도 6d). 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료에 의해서 고인산혈증 및 FGF23 수준은 변하지 않았다.

액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료는 뼈 재흡수를 억제하였고 뼈 체적을 증가시켰다. 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 mActRIIA-Fc를 사용한 치료는 Smad 의존적 신호전달을 억제시키고, 대동맥 골아세포 전이를 차단하며, 혈관 평활근 단백질 수준을 증가시키고 CKD 자극된 혈관 석회화 및 심장비대를 감소시켰다.

9.2 실시예 2. 만성 신장병(CKD)은 혈관 석회화를 초래하는 대동맥 내피간엽전환 (Endothelial to Mesenchymal transition: EnMT )을 유도하고 액티빈 리간드 트랩에 의해 억제된다

만성 신장병에서 혈관 석회화에 대한 기본적인 분자 메카니즘은 완전히 이해되지 않고 있다. 그러나, CKD-자극된 혈관 석회화에서 액티빈 수준은 증가한다. CKD-자극된 혈관 석회화에서 액티빈의 역할을 평가하기 위하여, 다수의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드를 결합하는 재조합 융합 단백질을 죽상동맥경화증 및 2형 당뇨병 모델 중의 만성 신장병의 마우스 모델에 사용하였다. ActRIIA-Fc 융합 단백질은 면역글로불린 1 (IgG1) Fc 도메인에 결합된 액티빈 수용체 IIA (ActRIIA)의 세포외 도메인으로 구성되며, 상기 단백질은 액티빈 A, 액티빈 B, 성장 분화 인자-11 (GDF11) 및 뼈 형태형성(morphogenetic) 단백질-10 (BMP-10)과 같이 TGF-베타 패밀리 구성원용 리간드 트랩으로 작용한다.

신장병은 신장 회복 동안 전신적 Wnt 억제를 생성하는 것에 의해 혈관 석회화를 초래하는 것으로 이전에 알려져 있었다. 이 실시예는 CKD 자극된 Wnt 억제의 혈관 효과가 Smad 의존적 EnMT의 유도뿐만 아니라 혈관 액티빈의 자극이라는 것과 액티빈 수용체 리간드 트랩이 EnMT 및 혈관 석회화를 억제함을 나타낸다.

9.2. 1 방법

계통 추적 및 혈관 석회화에 대한 마우스 모델에서 Wnt 억제제 상승을 갖는 CKD를 유도하였다. ELISA, RT PCR 및 웨스턴 블럿에 의해 액티빈, 폴리스타틴 및 인히빈 수준을 측정하였다. 내피 특이적 Tie2-Cre 마우스에 교배된 GNZ 마우스 (Stoller et al, Genesis, 2008)에서 세포 계통 추적을 실시하였다. GNZ의 녹-인(knock in: 삽입)을 보유하는 마우스는 Cre-매개 재조합 이후 핵 GFP 및 lacZ를 발현한다.

9.2. 2 결과

액티빈 수준은, 신장병 및 CKD 자극된 혈관 석회화의 마우스 모델에서 폴리스타틴 수준에서의 변화없이, 혈관계 및 순환계에서 상승하였다. CKD는 GNZ; GNZ과 대비한 Tie2-Cre CKD 마우스; 정상 신장 기능을 갖는 Tie2-Cre 마우스의 외막 및 중막의 세포에서 GFP 및 lacZ의 발현을 유도하였고, 상기 GFP 및 lacZ는 대동맥 내피에 한정되었다. Tie2는 내피 계통 특이적 수용체이고, 이는 CKD가 대동맥 EnMT를 유도함을 나타낸다(도 7a, 도 7b, 도 7c, 및 도 7d). CKD 자극된 대동맥 EnMT는 감소된 혈관 평활근 기능, 골아세포 전이 및 석회화를 생성하였다. 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩 (mActRIIA-Fc; 참조, 예컨대, 그의 전체 내용이 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 제8,173,601호)을 사용한 치료는 Smad 의존적 신호전달을 억제하고, 대동맥 골아세포 전이를 차단하며, 혈관 평활근 기능을 증가시키고 또 CKD 자극된 혈관 석회화를 감소시켰다. 따라서, CKD는 혈관 액티빈 및 EnMT를 유도하였고, 액티빈 수용체 2A형 (mActRIIA) 리간드 트랩을 사용한 치료는 액티빈 신호전달을 감소시켜, 혈관 탈분화, 골아세포 전이 및 혈관 석회화를 억제하였다.

9.3 실시예 3. 골 중량에 대한 초기 신호-추적 정량적 전산화 단층촬영(quatitative computed tomography : QCT ) 결과 및 투여량 증가로 치료된 혈액투석 대상체에서 혈관 석회화

고-교체 신성 골이영양증 (renal osteodystrophy: ROD)은 피질 골다공율 상승, 더 높은 지주골 중량, 및 골절 위험 증가를 특징으로 한다. 혈액투석 (HD) 대상체에서 빈혈을 치료하는 연구에서 액티빈 A RIIA-IgG1 융합 단백질 리간드 트랩인 ActRIIA-Fc는 액티빈 A 신호전달을 차단하고, 파골세포형성(osteoclastogenesis)을 감소시킬 수 있으며, 또한 뼈에서 골아세포 성숙을 증진시킨다. HD 대상체에서 현재의 에세이는 QCT를 이용하여 골밀도(BMD) 및 혈관 석회화에 대한 ActRIIA-Fc의 효과를 평가하였다.

9.3. 1 방법

ActRIIA 신호전달 억제제로 치료된, 에리쓰로포이에틴 자극제(ESA) 반응성인 혈액투석 대상체는 헤모글로빈(Hb)이 <10 g/dL 일 때까지 ESA 효과를 워시아웃(washed out)시킨 다음 무작위로 투여량 0.3 mg/kg (n=9), 0.5 mg/kg (n=8), 0.7 mg/kg (n=6), 또는 위약(PBO; n=7)으로 매 28일 마다 8 이하의 투여 주기로 피하적으로 ActRIIA 신호전달 억제제로 처리시켰다. Hb, 골밀도(BMD), 및 뼈 교체의 바이오마커의 효과에 대해 대상체를 평가하였다. 치료 실패(Hb <9 g/dL)는 ESA 및/또는 적혈구 세포 수혈에 의해 구제되었다. 둔부 및 요추의 QCT는 기저선 및 225-일 치료 상 이후에 얻었다. 바이오마커, BSAP 및 CTX는 기저선 및 3, 5, 및 7 투여 주기 이후에 측정하였다.

둔부, 요추, 및 복부 대동맥의 QCT는 기저선 및 225-일 치료 상 이후에 얻었다. 대상체를 마인드웨이스 캘리브레이션 팬텀(Mindways calibration phantom) (모델 3; Mindways Software, Inc., Austin, TX) 위에 반듯이 눕게 했다. 표준 연조직 커널(kernel)을 이용하여 2.5 mm의 절편 두께 및 512 x 512 매트릭스를 재구성하였다. 마인드웨이스 에세이 소프트웨어(버젼 5.0.3)를 사용하여 체적 BMD(vBMD)를 평가하였다. 골소주 vBMD (mg/cm3)는 L1-4 (전형적으로 L1-2) 내의 2개 척추골에서 측정하였다. 좌측 고관절을 전체 둔부, 대퇴 경부, 및 전자 영역(trochanteric regions)의 피질, 에 기인한, 및 적분 골 구획의 vBMD에 대해 에세이하였다.

L1의 상부로부터 L4의 저부에 인접하는 영역 내의 석회화 영역 및 체적을 반자동적으로 나누는 소프트웨어를 이용하여 복부 대동맥의 혈관 석회화를 평가하였다. 대상체당 방문시 마다 절편의 개수와 위치를 유지시켰다. 아가츠톤 및 제곱근 전환 체적 점수는 Agatston et al., J Am Coll Cardiol . 1990; 15:827-832 및 Hokanson et al., AJR AM J Roentgenol. 2004;182:1327-1332 에 기재된 바와 같이 결정하였다. 낮은 총 아가츠톤 및 제곱근 변환 총 체적 점수 (mm3)는 혈관 석회화(VC)의 수준이 낮음을 나타낸다.

PAREXEL 이미징 (PAREXEL International Corp. Waltham, MA)에 의해 전체 이미지 품질 대조 및 블라인드 에세이를 중심적으로 실시하였다.

기저선 및 1, 3, 5, 7회 투여 주기 이후에 뼈-특이적 알칼리성 포스파타제(BSAP), 프로-콜라겐 1형 N-말단 프로펩티드(P1NP), 및 C-말단 1형 콜라겐 텔로펩티드(CTX)를 비롯한 바이오마커를 측정하였다.

9.3. 2 결과

총 31명의 대상체를 무작위로 나누고 연구 약물을 1 투여량 이상 공급하였다.

		ActRIIA - Fc
대상체 , n	위약	0.3 mg/kg	0.5 mg/kg	0.7 mg/kg
무작위로 나누고 연구 약물을 ≥1 투여량 공급	8	9	8	6
기저선 및 225일에 QCT 측정	3	6	5	2

표 2. 무작위로 나눈 대상체 및 QCT 에세이 서브세트(subset)

기저선 및 225일에서 양측(paired) QCT 측정을 실시한 대상체를 비롯한 대상체 분포를 도 8에 도시한다.

대부분의 대상체는 구조가 필요한 (일반적으로 Hb <9 g/dL로 인하여) 치료 실패 이후 연구 치료를 중단하였다; 어떤 대상체도 부작용보고(adverse event: AE)로 인하여 치료 중단을 하지 않았다.

양측 QCT 측정을 한 16명의 대상체 중, 9명은 치료 상 동안 구조를 필요로 하였고, 그 중의 8명은 첫 3회의 투여 주기 이내에 구조를 필요로 하였다.

양측 QCT 측정을 한 대상체 중, 기저선 인구통계적 및 임상적 특징은 치료군 전반에서 일반적으로 유사하였다(표 3); 그러나, 가장 젊은 그룹이기도한 위약군에서는 투석시 상당히 긴 시간이 소요되었다. 기저선 바이오마커 및 아가츠톤 점수에서 그룹간 차이가 있었다(표 4).

표 3. 양측 QCT 측정을 한 대상체의 기저선 인구통계적 및 임상 특징

표 4. 양측 QCT 측정을 한 대상체의 평균 기저선 바이오마커, 면적 BMD, 및 아가츠톤 점수

표 5는 둔부 적분, 대퇴 경부 피질, 둔부 피질, 및 요추 면적 BMD 측정에서 기저선으로부터 변화 %를 제공한다.

표 5. 둔부 적분, 대퇴 경부 피질, 및 요추 면적 BMD에서 기저선 및 기저선으로부터의 변화 %

피질골에서 2% 증가는 골절 위험을 줄일 수 있다. ACTRIIA 신호전달 억제제 치료는 대퇴 경부 피질골에서 2% 이상의 증가를 갖는 대상체와 비례하여 투여량-의존적 증가와 관련되었다(표 5 및 도 9a).

고-교체 ROD, 지주골 중량 증가 (즉, 불량 골질)는, 일반 집단과 비교하여 ESKD에서 척추 골절율 감소없이, 요추 BMD에 의해 측정하였다. ACTRIIA를 사용한 치료는 요추에서 지주골 중량 증가를 방지하였다 (표 5 및 도 9b).

복부 대동맥 총 아가츠톤 점수에서 기저선으로부터의 변화는 표 6에 제공한다. 총 아가츠톤 점수에서의 변화 및 제곱근 변환 총 체적 점수 카테고리는 도 9 및 표 7에 나타낸다.

표 6. 기저선 복부 대동맥 총 아가츠톤 점수 및 제곱근 변환 총 체적 점수 및 그로부터의 변화

11명의 대상체는 10 내지 10,000 사이에 분포된 기저선 아가츠톤 점수를 가졌다. 5명의 대상체는 기저선에서 이상치를 갖는 것으로 간주될 수 있다(저 이상치: 0.0, 1.1, 및 1.4 아가츠톤 점수; 고 이상치: 21,033 및 44,356 아가츠톤 점수). 따라서, 아가츠톤 점수를 이상치 없이 에세이하였다(표 7 및 도 10).

표 7. 5개의 이상치를 배제한, 기저선 총 아가츠톤 및 그의 변화

ActRIIA 신호전달 억제제에 노출되는 동안 대상체를 에세이하였다. 다음 노출 상태에 의해 대상체를 에세이하였다: 투여량 수준에 관계없이 3회 투여받은 ActRIIA-Fc 대상체(n=6), 및 투여량 수준에 관계없이 >3 투여받은 ActRIIA-Fc 대상체(n=7)에 의해 대상체를 에세이하였다. 위약 그룹(n=3)은 변경하지 하였다. 성별 및 아가츠톤 점수 이외에, 핵심 기저선 특징은 ActRIIA-Fc를 ≤3 투여받은 그룹 및 > 3 투여받은 그룹 사이에 일반적으로 유사하였다(표 8). 이상치를 배제할 때(표 10)뿐만 아니라 모든 ActRIIA-Fc 대상체(표 9)에서 VC에 대한 노출 효과는 그대로 유지되었다.

표 8. ActRIIA-Fc 노출에 의한 대상체의 기준 인구통계적 및 임상 특징

표 9. ActRIIA-Fc 노출에 의한 기저선 총 아가츠톤 점수 및 제곱근 변환 총 체적 점수 및 그로부터의 변화*

표 10. ActRIIA-Fc 노출에 의한, 5개의 이상치를 배제한, 기저선 총 아가츠톤 점수 및 그로부터 변화*

뼈 교체 바이오마커를 평가하였다. 위약 그룹은 기저선에서 최고 PTH, BSAP, P1NP, 및 CTX 수준을 나타내었다(표 4). 위약 그룹의 기저선 모든 지점에서 PTH가 낮았던(-15.2 내지 -100.7 ng/L) 것을 제외하고는 인, PTH, FGF-23, 또는 스클레로스틴 수준에서 기저선으로부터 어떠한 일치되는 변화가 관찰되지 않았다. 뼈 바이오마커의 경우, 형성 마커 BSAP 및 P1NP에서의 퍼센트 변화에서 어떠한 분명한 변화도 보이지 않았다; 재흡수 마커 CTX에서의 퍼센트 변화는 도 11에 도시한다. 0.5 mg/kg의 ACTRIIA 신호전달 억제제를 투여받은 많은 대상체들은 재흡수 마커 CTX에서 유의미하고 지속적인 감소를 가졌다.

9.3. 3 결론

30명의 무작위 대상체 중에서, 13명은 양측 QCT 평가(PBO, 0.3 mg/kg, 및 0.5 mg/kg에 대해 각각 n=3, 6, 및 4)를 받았다. PBO, 0.3 mg/kg, 및 0.5 mg/kg에 대한 기저선으로부터의 상대적 BMD 변화는 대퇴 경부 피질의 -0.9%, -1.4%, 및 +1.9% 이었고, 요추의 +12.6%, +8.0%, 및 -1.9%이었다. 0.5 mg/kg의 바이오마커 변화는 유익한 재흡수방지 효과를 제시한다.

이들 데이터는 ActRIIA-Fc 0.5 mg/kg에 의한 투여 효과 부상을 나타내며, 이는 피질 및 해면골(cancellous bone)에 대한 고-교체 효과를 반전시키는 것으로 보인다. PBO 결과는 예상된 바와 같다.

9.4 실시예 4. 신장병 생성된 순환성 신장 회복인자는 심혈관계 질환을 유발한다

신장병은 극히 높은 치사율과 관련되며, 이는 심혈관계 질환의 발생과 관련된다(Sarnak, M.J. et al., 2003. Circulation 108:2154-2169.). 현재 진행중인 REGARDS 프로젝트의 보조 연구는 지속적인 관상동맥 병례(허혈성 심질환 또는 비치명적 심근경색)를 갖는 환자에서 평균 4년의 추적에 걸쳐 제2 심혈관 병례의 발생이 고 위험군 (흡연자, 당뇨병, 고콜레스테롤혈증)에서 19%과 비교하여 신장병을 갖는 환자에서 35%이었고, 또 고 위험군에서 전 원인 사망의 발생이 만성 신장병(CKD) 그룹의 전 원인 사망의 절반임을 나타내었다 (Baber, U., et al., 2013. Am Heart J 166:373-380.). 신장병과 관련된 심혈관 위험 증가의 원인은 2006년에 명명된 증후군인 만성 신장병 미네랄 뼈 장애(CKD-MBD)에 존재한다 (Moe, S., et al., 2006. Kidney Int 69:1945-1953.). CKD-MBD에서, 3개의 새로운 심혈관 위험 인자가 발견되었고(Block, G.A., et al., 1998. Am J Kidney Dis 31:607-617; Blacher, J., et al., 2001. Hypertension 38:938-942; Gutierrez, O.M., et al., 2008. New Engl J Med 359:584-592.), 이들 위험 인자 상태는 일반 집단에서 확인되었다(Dhingra, R., et al., 2007. Arch Intern Med 167:879-885; Matsushita, K., et al., 2014. Journal of the American Society of Nephrology; Dalal, M., et al., 2011. European Journal of Endocrinology 165:797-803.). 이들은 고인산혈증, 혈관 석회화, 및 섬유아세포 성장인자 23 (FGF23) 수준 증가이다. CKD-MBD는 혈관 탈분화/석회화, 골이영양증, 클로토 손실 및 FGF23 분비 증가 (Fang, Y., et al., 2014. Kidney Int 85:142-150.)로 구성된 CKD의 초기 단계 (2 단계)(Fang, Y., et al., 2014. Kidney Int 85:142-150; Pereira, R.C., et al., 2009. Bone 45:1161-1168; Fang, Y., et al., 2009. J Am Soc Nephrol 20:36A; Hu, M.C., et al., 2011. J Am Soc Nephrol 22:124-136.)에서 시작하되, 초기 신부전에서 CKD-MBD의 원인으로 진행(Hu, M.C., et al., 2011. J Am Soc Nephrol 22:124-136; Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763; de Oliveira, R.B., et al., 2013. Nephrology Dialysis Transplantation 28:2510-2517; Sabbagh, Y. 2012. J. 뼈 Miner. Res. 27:1757-1772.)하는 동안 시작되며, 이들은 대부분은 알려져 있지 않다.

신장병은 질병 자극된 신장 회복동안 신장기능완성(nephrogenesis)에 관련된 발달 프로그램을 재활성화시키는 것이 알려져 있다 (Surendran, K., et al., 2002. Am J Physiol Renal Physiol 282:F431-F441; Surendran, K., et al., 2005. J Am Soc Nephrol 16:2373-2384; Maeshima, A., et al., 2001. Cytokine & Growth Factor Reviews 12:289-298; Terada, Y., et al., 2003. Journal of the American Society of Nephrology 14:1223-1233; Kawakami, T., et al., 2013. J Pathol 229:221-231.). 신장 회복에서 재활성화된 신장기능완성 인자 중, Wnt (portmanteau of Wingless and Integrated) 패밀리는 관상 상피 재구성에 중요하다 (Terada, Y., et al., 2003. Journal of the American Society of Nephrology 14:1223-1233; Kawakami, T., et al., 2013. J Pathol 229:221-231; Rinkevich, Y., et al., 2014. Cell Reports 7:1270-1283.). Wnt 기능의 제어에서, 정규 (canonical) 신호전달은 자가분비 또는 주변분비 인자에 대한 Wnt 자극 거리를 제한하는 역할을 하는 분비 단백질인 Wnt 억제 단백질 패밀리의 발현을 전사적으로 유도한다 (Niida, A., et al., 2004. Oncogene 23:8520-8526; Niehrs, C. 2006. Oncogene 25:7469-7481; Reya, T., et al., 2003. Nature 423:409-414; Chamorro, M.N., et al., 2004. The EMBO Journal 24:73-84; Gonzalez-Sancho, J.M., 2004. Oncogene 24:1098-1103.). Wnt 억제제는 순환 인자이며, Wnt 억제제 패밀리는 Dickkopfs (Dkk), 분비된 프리즐 관련 단백질(secreted freezled related proteins: Sfrps), 스클레로스틴, sostDoc 1, crescent, Wnt 억제제 인자 1 (Wif1) 및 Icat를 포함한다(Niehrs, C. 2006. Oncogene 25:7469-7481). 다양한 형태의 신장병은 Wnt 억제제의 신장 발현을 증가시키고 순환계에서 이들의 수준을 증가시킨다(Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763; Surendran, K., et al., 2005. J Am Soc Nephrol 16:2373-2384.).

CKD에서의 순환에서 증가된 핵심 Wnt 억제제인 Dkk1의 중화는 CKD 유도된 혈관 탈분화, 혈관 석회화, 및 신장 골이영양증을 억제한다(Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763.). 이러한 효과는 혈관 평활근에서의 Wnt 신호전달이 골아세포 전이 및 혈관 석회화 자극에 연루되기 때문에 놀라운 것이다 (Al-Aly, Z., et al., 2007. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 27:2589-2596; Shao, J.S., et al., 2005. Journal of Clinical Investigation 115:1210-1220.). 그러나, 최근의 연구는 대동맥 Wnt7b의 Dkk1 매개된 억제가 smad-매개된 대동맥 내피간엽전환(EnMT) 및 혈관 석회화를 자극함을 나타낸다 (Cheng, S.-L., et al., 2013. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 33:1679-1689.). EnMT는 심장판막, 심장 중격 및 대동맥 기부의 발달에 관여된 발달상 생리학적 과정(Eisenberg, L.M., and Markwald, R.R. 1995. Circulation Research 77:1-6; Camenisch, T.D., et al., 2002. Developmental Biology 248:170-181.)이며, 다양한 성인 질환 상태에서 심장 섬유화에 기여할 수 있거나(Zeisberg, E.M., et al., 2007. Nat Med 13:952-961.) 또는 기여하지 않을 수 있다(Moore-Morris, T., et al., 2014. The Journal of Clinical Investigation 124:2921-2934.). 이러한 인자는 신장병 동안 시도된 신장 회복에 관련된 다른 인자가 TGFβ 수퍼패밀리로부터 유도되는지 여부를 조사하며 CKD 동안 순환계에서 증가한다.

9.4. 1 방법

9.4. 1.1 동물 모델의 생성

죽상동맥경화성 저밀도 지단백질 수용체 결핍 (low density lipoprotein receptor-deficient: ldlr -/-) 웅성 (C57Bl/6J 백그라운드) 마우스를 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하고 12주령에서부터 고 지방식(지방으로부터 42% 칼로리)을 섭취시켰다(Teklad #). 이들 마우스는 비만이고, 22주령에서는 인슐린 내성이며, 28주령에서는 당뇨병을 나타내고, 고콜레스테롤혈증이다.

앞서 기재한 바와 같이 2단계 과정을 이용하여 만성 신장병이 생기게 하였다(Davies, M.R., et al., 2003. J Am Soc Nephrol 14:1559-1567; Davies, M.R., et al., 2005. J Am Soc Nephrol 16:917-928.). 생후 12주령에 2 cm 옆구리 절개를 통하여 우측 신장에 전기소작법을 인가한 다음, 14주령에 좌측 전체 신장절제술을 실시하였다. 소작법의 강도를 달리해서 중간 정도의 (CKD-3) 신장 손상을 생성하며, 이는 20주령에서 이눌린 클리어런스에 의해 확인하였다(도 12a). 대조군 동물은 모의수술(sham operation)을 받았는데, 적절한 신장을 노출시켜 고정화하지만 다른 방법으로는 처리되지 않았다. 이 연구에는 5 그룹의 마우스를 사용하였다 (도 15b). 제1 그룹은 규칙적으로 정상 음식을 섭취한 야생형 C57Bl/6J 마우스였다(WT). 이 그룹은 정상 신장 기능이고 규범적인 대조치를 위해 이용된 식이 그룹이었다. 제2 그룹은 고 지방식을 섭취하고 모의 수술받은 ldlr -/- 마우스였다. 이 그룹은 정상적인 신장 기능을 가졌고, 신장병의 효과를 결정하기 위한 대조군으로 작용하였다. 제3 그룹은 고 지방식을 섭취한 인간 CKD 3 단계(CKD-3)과 동등하게 감소된 GFR을 갖고 22주령에 안락사된 ldlr -/- 마우스, 즉 기저선 혈관 석회화 그룹(CKD-3)이었다. 제4 그룹은 22주령에 시작해서 28주에 안락사되기 까지 1주에 2회 비히클을 피하 주사를 받는 CKD-3을 갖는 ldlr -/- 마우스 (CKD-3 V)였다. 제5 그룹은 22주령에서 시작해서 28주령에 안락사될 때까지 1주에 2회 10 mg/kg의 mActRIIA-Fc (Celgene, Summit, NJ)를 피하 주사받은 CKD-3을 갖는 ldlr -/- 마우스 (CKD-3 mActRIIA-Fc)였다.

사용된 CKD의 제2 모델은 IV형 콜라겐의 α5 사슬용 유전자 COL4A5에서 결핍인 X-결합된 알포트 증후군의 마우스 상동체였다(Rheault, M.N., et al., 2004. Journal of the American Society of Nephrology 15:1466-1474.). 이는 자연적 신장병 모델이며, 신장 절제 유도 CKD의 효과를 확인하기 위하여 결과 전반에 사용되었다. 번식용 동물쌍은 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하였고 실험을 위해 번식시켰다. 반접합체 웅성은 생후 200일에 인간 CKD 3-4 단계에 필적하는 신장병을 자연스럽게 발병하였다.

사용된 CKD의 제3 모델은 세포 계통 추적을 위해 사용된 트랜스제닉(transgenic) 마우스 계통인 GNZ 마우스에서 ldlr-/- 프로토콜과 유사한 신장 제거 마우스였다(도 14). GNZ 리포터 자성 마우스 (Stoller, J.Z., et al., 2008. Genesis (New York, N.Y. 2000) 46:200-204.) 및 Tek-Cre 트랜스제닉 웅성 마우스 (Koni, P.A., et al., 2001. The Journal of Experimental Medicine 193:741-754.)를 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하고 번식시켜 실험용 GNZ/Tek-Cre + 마우스를 생성하였다. GNZ/Tek-Cre-한배 새끼들은 음성 대조군으로 사용하였다. 제조자에 의해 GNZ 및 Tek-Cre 마우스 품종용으로 추천된 특이적 프라이머를 사용하여 마우스 유전형질에세이(genotyping)을 실시하였다. 모든 경우에서, 마취하여 안락사를 실시하였다. 모든 과정에 대해 복강내 마취(자일라진 13 mg/kg 및 케타민 87 mg/kg)를 이용하였다. 수술 후 기저선 신장 기능을 평가하기 위하여 두번째 수술한지 1주일 후 대복재 정맥 혈액 샘플을 취하였다. 희생시킬 때, 심장내 자창, 및 절개된 심장 및 대동맥으로부터 일괄적으로 채혈하였다.

9.4. 1.2 이눌린 클리어런스

안락사가 28주이면, 20주 또는 26주에서 이눌린 클리어런스를 제조자의 지시(BioPal Inc., Worcester, MA)에 따라서 실시하였다.

9.4. 1.3 화학적 석회화 정량

희생시 대동맥 및 심장을 해부하고, 해부 현미경하에서 비절개 박리에 의해 모든 외부 조직을 제거하였다. 조직들을 60℃에서 20-24시간 동안 탈수시키고, 중량측정하며 막자와 막자사발을 이용하여 분말로 분쇄하였다. 칼슘을 4℃에서 24시간 동안 1N HCL에 용리시켰다. 용리액의 칼슘 함량은 크레소프탈레인 캄플렉손 방법(Sigma, St Louis)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 에세이하고, 결과를 건조 조직 중량에 대해 보정하였다.

9.4. 1.4 혈액 시험

채혈 당일 혈청을 표준 자동에세이기 실험실 방법에 의해 혈액 요소 질소 (BUN), 칼슘, 및 포스페이트에 대해 에세이하였다. 헐청 액티빈 (Fitzgerald Industries, Acton, MA), 폴리스타틴 (MYBIOSOURCE Inc., San Diego, CA) 및 폴리스타틴-유사 3 (MYBIOSOURCE Inc.) 수준을 ELISA 에세이로 측정하였다. 혈청 Dkk1 수준은 ELISA에 의해 에세이하였다(R&D Systems, Minn., MN). ELISA 에세이의 경우, 안락사 시점에 대복재 정맥 또는 심장천자에 의해 채혈하였다. 모든 혈액 샘플을 수집시 얼음 위에 놓았다. 4℃, 6000 rpm에서 5분간 또 14000 rpm에서 2분간 2단계 원심분리에 의해 혈소판 부족 EDTA 혈장 샘플을 제조하였다. 이들 샘플은 사용할 때까지 20℃ 아래에서 냉동 저장하였다.

9.4. 1.5 조직학 및 면역조직화학

대동맥, 신장 및 심장 조직을 10% 중성 완충 포르말린에서 밤새 고정한 다음, 4℃에서 70% 에탄올로 전달하고, 파라핀에 매립하며, 5 마이크론 절편을 준비하였다. 자일렌에서 슬라이드를 탈파라핀화시키고 점진적 에탄올 시리즈에서 탈수시킨 다음 재수화시켰다. 메이슨 트리크롬 염색(Mason Trichrome staining)을 이용하여 신장 및 심장 섬유화를 검출하고 또 알리자린 레드 염색(Alizarin red staining)을 이용하여 표준 수순에 따라 석회화를 검출하였다(Gregory, C.A., et al., 2004. Analytical Biochemistry 329:77-84.). 면역조직화학 염색의 경우, 내생 퍼옥시다제를 메탄올 중 3% H₂O₂를 사용하여 15분간 차단시켰다. 비특이적 결합은 애비딘 및 비오틴 차단제를 사용하여 30분간 차단(벡터 라보라토리즈, Burlingame, CA, USA)한 다음, 3% 정상 당나귀 혈청을 사용하여 20분간 차단하였다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 4℃에서 밤새 일차 항체와 함께 배양한 다음 비오티닐화된 이차 항체(Vector laboratories)와 실온에서 1시간 동안 차단한 다음, DAB 키트 (SK-4100, Vector laboratories)를 이용하여 스트렙트애비딘 결합된 퍼옥시다제 염색을 실시하였다. 이중 면역형광 염색의 경우, 절편들을 20% 염소 혈청에서 차단시키고 제조자 지시에 따라 신호 증폭을 위해 염소-항 토끼 Alexa 488 및 Alexa 568 이차 항체 1:400 (Life Technologies, A11008 및 A11011) 또는 TSA 키트 (Life Technologies, T 20932)를 사용하여 제1 일차 및 이차 항체 그리고 제2 일차 및 이차 항체에 의해 순차적으로 염색하였다. 동일 종으로부터의 일차 항체를 이중 염색을 위해 사용하였을 때, 제2 염색 이전에 마이크로웨이브 내 시트레이트 완충액 중에서 슬라이드를 5분간 가열하였다(Toth and Mezey, 2007). 면역염색을 위해 상기 연구에서 다음 일차 항체를 사용하였다: 토끼 다클론 항-ActRIIA 항체 1:250 (Abcam, ab 135634), 토끼 다클론 항-인히빈 베타 A 항체 1:100 (Santa Cruz, sc-50288), 토끼 다클론 항-CD31 항체 1:50 (Abcam, ab28364) 및 토끼 다클론 항-GFP 항체 1:1000 (Abcam, ab6556).

9.4. 1.6 RT - PCR

RNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 대동맥 및 세포 배양액으로부터 RNA를 추출하였다. Bio-Rad (Hercules, Ca)로부터 iScript cDNA 합성 키트를 이용하여 제조자의 지시에 따라 1 μg의 전체 RNA를 DNase로 처리하여 역전사시켰다. 벡터 NTI (Invitrogen, Grand Island, NY) 또는 프라이머 익스프레스 (Primer Express) 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 설계하였다. 퍼킨-엘머 DNA 써멀사이클러(Thermal Cycler)를 이용하여 반응을 실시하였다. 상기와 같이 역전사반응을 실시한 후, StepOne Plus 실시간 PCR 기구 (AB), 시그마(St. Louis)로부터 구입한 SYBR Green 및 인비트로겐으로부터 구입한 PCR 키트를 사용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 각 반응은 95℃에서 45초 및 60℃에서 30초 및 72℃에서 60초간 40 주기로 3회 실시하였다. 이어 60℃ 내지 95℃ 온도에서 단계적으로 증가하는 것으로 구성되는 용융 주기를 실시하였다. 각 유전자의 해리 곡선에서 단일의 우세한 피크가 관찰되었고, 이는 PCR 산물의 특이성을 지지한다. Ct 치(임계치)를 PCR의 지수기 이내에 설정하고 이를 이용하여 관심 유전자의 발현 수준을 산출하였다. B2m를 내부 표준으로 사용하고 이를 이용하여 상기 값을 정규화하였다. Ct 대 로그 cDNA 희석으로 구성된 표준 곡선 (로그 복제수에 상응함)은 미지량의 암플리콘(amplicon)에 상응하는 cDNA의 연속 희석을 증폭하는 것에 의해 생성하였다. 음성 대조는 게놈 DNA가 증폭되지 않았음을 입증하도록 RT-PCR 전 5분 동안 끓이는 것에 의해 역전사효소를 불활성화시켜 실시하였다.

9.4. 1.7 면역블러팅 ( 웨스턴 에세이)

프로테아제 억제제 칵테일 (Santa Cruz)을 함유하는 RIPA 용해 완충액 (Thermo Scientific)에 의해 마우스의 신장 및 대동맥으로부터 전체 세포 용해물 단백질을 제조하였다. 용해물(20 μg)을 8-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 인히빈 β-A (Santa Cruz), α-튜불린 (Santa Cruz), snai 1 (Cell Signaling), 알파-SMA (Sigma), Runx2 (Cell Signaling), MYOCD (Santa Cruz), ACVRL1 (Origene), ACVR1 (Cell Signaling), Erk1/2 (Cell Signaling), 포스포-Erk1/2 (Cell Signaling), ACVR1B (Origene), Col1a1 (Santa Cruz), Smad2/3 (Cell Signaling), 또는 포스포-Smad2/3 (Cell Signaling)에 대한 항체에 의해 면역블러팅시켰다. 면역침강(IP) 에세이에서는 동일한 전체 세포 용해물 단백질을 사용하였다. 비특이적 결합을 감소시키기 위하여, 미리 세척된 단백질 A 아가로오스 비드(Cell Signaling)를 사용하여 샘플을 예비 세정하였다. 미리 세정된 샘플을 포스포-세린 항체 (Abcam)와 밤새 배양하였다. IP-항체 착물을 단백질 A 아가로오스 비드 상에 포획하고 면역블러팅 에세이에 의해 단백질을 검출하였다.

9.4. 1.8 인간 연구

헬싱키 선언으로부터 가이드라인에 따라 사전 동의를 받은 후 대상체를 등록하였다. 대상체는 18세 이상이고 3 단계 CKD를 가지고 있었다면 자격이 되었다 (신장병 연구 방정식에서 식이 변형을 이용하여 GFR 30-59 ml/min/1.73m² 로 추정 (Levey, A.S., et al., 1999. Ann Intern Med 130:461-470.). 배제 기준은 임신, 뼈 질환, 심근경색, 울혈심부전, 심장확장기 기능장애 또는 심각한 고혈압을 포함하였다. 연구팀의 구성원은 시험대상군 기준을 만족하고 연구에 관심이 있는 임상 환자를 확인하였다. 등록하기 전에 최종 자격을 결정하기 위하여 의료 기록을 검토하였다. 기저선 도달 및 12 개월의 치료 후 각 대상체로부터 혈액 샘플을 얻었다. 혈액 샘플을 얻은 날에 대상 사이에 변이가 있었다. 각 샘플로부터 등분량의 혈장을 생성하고 생화학 시험에 즉시 사용하거나 80℃에서 냉동시켰다. 액티빈의 혈장 수준은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트를 이용하여 제조자의 지시(R&D Systems, Minneapolis, MN)에 따라서 이중으로 측정하였다.

9.4.1.9 통계학

ANOVA를 이용하여 통계학적 에세이를 실시하였다. 도면 범례에 다르게 명시되지 않은 한, 모든 데이터는 평균±SD로 나타낸다. 그룹 간의 차이는 Fisher LSD 방법을 이용하여 평가하고 p <0.05이면 유의한 것으로 간주하였다. Sigma Stat 통계학적 소프트웨어 (Point Richmond, CA)를 이용하여 에세이를 실시하였다. 모든 그룹에 대한 데이터는 7-15의 "n"을 나타낸다. 실시간 PCR 에세이의 경우 최소 3개 샘플을 각 실험군에 사용하였다. 독립검정(Unpaired) t-시험을 이용하여 mActRIIA-Fc으로 치료된 CKD-3 마우스 대 비히클 치료된 CKD-3 V 마우스 또는 모의 수술받은 마우스 (sham)를 비교하였다. 도 6에서, 박스는 중앙값 및 사분범위(25^th내지 75^th퍼센타일)를 나타내고, 에러바는 25^th아래 75^th퍼센타일 초과의 사분범위의 1.5-배를 나타낸다. 유의한 차이에 대한 중요 수준으로서 복수의 대조 p<0.05에 대한 ANOVA Holm-Sidak 방법을 이용하여 평균을 비교하였다.

9.4. 2 결과

9.4. 2.1 CKD 모델에서 신장 기능

인간 3 단계 CKD(CKD-3)에 대한 CKD 유사체를 3개 실험 모델에서 유도하였다. 제1 모델은 CKD-자극된 죽상동맥경화성 혈관 석회화의 모델: ldlr -/- 고 지방식을 섭취시킨 마우스이었다(Fang, Y., et al., 2014. Kidney Int 85:142-150; Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763; Davies, M.R., et al., 2003. J Am Soc Nephrol 14:1559-1567; Davies, M.R., et al., 2005. J Am Soc Nephrol 16:917-928; Lund, R.J., et al., 2004. J Am Soc Nephrol 15:359-369; Mathew, S., et al., 2008. J Am Soc Nephrol 19:1092-1105. PMCID:PMC2396927; Mathew, S., et al., 2007. J Am Soc Nephrol 18:122-130; Mathew, S., et al., 2008. J Am Soc Nephrol 19:1509-1519. PMCID:PMC2488263.). 이눌린 클리어런스에 의해 또 BUN 수준에 의해 측정된 신장 기능은 9.4.1.1 부분에 기재된 바와 같이 ldlr-/- 고 지방식을 섭취한 마우스에서 인간 3 단계 CKD의 수준으로 감소되었고, 이들 마우스는 CKD-3라 칭한다(도 12a 및 도 12b). 또한, 상기 CKD-3 마우스는 고인산혈증(표 11)이었고, 이는 인간 3-4 단계 CKD와 일치한다. CKD의 제2 모델은 IV형 콜라겐 (Col4α5) (알포트 증후군)의 α5 사슬에서 결핍된 마우스 및 인간에서 발생하는 자연적 CKD였다(Rheault, M.N., et al., 2004. Journal of the American Society of Nephrology 15:1466-1474.). 200일령의 Col4α5-결핍 마우스는 이눌린 클리어런스가 감소되었고 BUN 상승은 인간 3-4 단계 CKD에 상응한다(도 12c 및 도 12d). GNZ 마우스에서 제3의 모델인 CKD-3은 9.4.1.1 부분 및 이하에 기재되어 있다.

변수	그룹 1 야생형	그룹 2 모의(sham)	그룹 3 CKD-3	그룹 4 CKD-3	그룹 5 CKD-3
종	C57/BJ6	Ldlr -/-	Ldlr -/-	Ldlr -/-	Ldlr -/-
식이	일반식	고 지방	고 지방	고 지방	고 지방
수술	없음	모의(sham)	CKD	CKD	CKD
생후 주수	28	28	28	28	28
치료	없음	없음	비히클	mActRIIA-Fc	LaC03
N	12	15	14	15	12
BUN (mg/ dL )	24.0 ± 4.6	20.6 ± 3.7	37.7 ± 7.6	36.5 ± 5.8	35.6 ± 9.1
Ca (mg/ di )	8.3 ± 1.8	8.9 ± 0.9	9.4 ± 0.8	8.8 ± 0.3	8.8 ± 1.4
인 (mg/ di )	8.9 ± 0.2	7.9 ± 2.3	11.0 ± 1.6	11.8 ± 1.2	10.5 ± 2.1

표 11. 다양한 그룹의 동물에서 혈청 생화학적 변수

9.4. 2.2 액티빈 수준 및 대동맥 액티빈 수용체 IIA형 ( ActRIIA )

TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 순환 수준을 자극하는, CKD에서 신장 회복 능력을 조사하였다. 순환하는 액티빈 수준은 CKD 모델에서 증가하였다(도 13a 및 도 13b). 신장 및 대동맥 조직을 액티빈 A (인히빈 베타 A의 동종이량체(Inhba))용 mRNA에 대해 에세이하였다. Inhba mRNA는 신장 및 대동맥에서 CKD에 의해 유도하였고(도 13c), 단백질 수준은 신장에서 증가하였다(도 13d). TGFβ 수퍼패밀리 II형 수용체의 도입을 위해 CKD-3을 갖는 마우스로부터 대동맥을 에세이하며, 이는 II형 및 I형 (ALK) 수용체로 구성된 수퍼패밀리 수용체 헤테로다량체의 리간드 결합 성분이다. ldlr -/- 고지방 식이를 섭취한 마우스에서 생성된 CKD-3은 대동맥 혈관 평활근에서 액티빈 II형 수용체 A (ActRIIA)의 상향 조절(up regulation)을 유도하였다(도 13e). 액티빈은 순환 수준 (도 13f 및 도 13g)과 조직 수준이 CKD-3에 의해 영향을 받지 않는 조절된 억제 인자인, 폴리스타틴 및 폴리스타틴 유사 3 (fstL3)과 관련된다(Welt, C., et al., 2002. Experimental Biology and Medicine 227:724-752.). 순환에서 액티빈 A 수준 (>5000pg/ml)에 대비한 폴리스타틴, fstL3, 및 인히빈의 화학양론 (미측정 인히빈의 620pg/ml과 400pg/ml의 합)(Sharpe, R.M., et al., 1999. Journal of Andrology 20:94-101.)은 CKD가 상당한 자유 액티빈 수준을 생성함을 제시하며, 이는 액티빈 A를 CKD에서 순환 인자로 만드는 병례이다.

9.4. 2.3 CKD에서 대동맥 내피간엽전환 전환

이들 연구에는 CKD의 제3 실험 모델을 이용하였다. 세포 계통 추적을 위해 GNZ 마우스를 사용하고(Stoller, J.Z., et al., 2008. Genesis (New York, N.Y . : 2000) 46:200-204.), GNZ 마우스는, 상류 loxP 인접 STOP 서열이 제거되면, 핵내 분포(nuclear-localized) 녹색 형광 단백질 및 베타 갈락토시다제(GFP/LacZ)를 발현한다(도 14a). GNZ 마우스에서 loxP 부위를 제거하기 위하여, 이들 마우스를 티로신 키나제 Tek (Tie2) 프로모터/인핸서의 지도하에서 Cre 리콤비나제를 발현하는 Tek-Cre 마우스와 교배시켰다. Tie2는 내피세포 계통 특이적 안지오포이에틴 수용체이므로, GNZ/Tek-Cre+ 마우스는 내피세포 계통 세포에서 핵 및 세포질성 GFP를 발현한다(도 14a) (Moore-Morris, T., et al., 2014. The Journal of Clinical Investigation 124:2921-2934.). GNZ/Tek-Cre+ 마우스에서, DAPI 핵 염색으로 공국재화된(colocalized) 대동맥 GFP는 CD31 바이오마커에 의해 마킹된 내피세포에 제한되지 않는다(도 14b, 화살표 참조). CKD-3가 GNZ/Tek-Cre+ 마우스에서 생성되었을 때, 내피 세포 외에, 대동맥 중막 및 외막 내의 세포는 GFP 염색을 나타내었고, 이는 이들 세포가 내피간엽전환 전환(EnMT)을 통하여 내피세포 계통으로부터 유도된 것임을 나타낸다(도 14c, 14d, 화살표 참조). CKD가 EnMT를 자극하는지 여부를 더욱 에세이하기 위하여, EnMT에 관여된 전사인자, Snai 1,의 발현을 자연적 CKD 모델인, 알포트 증후군 마우스에서 조사하였다. Snai 1은 CKD 과정의 초기(75 doa)에서 상향조절되었고(도 14e), 이는 피크 액티빈 수준의 타이밍과 일치한다 (하기 참조).

9.4. 2.4 CKD에서 ActRIIA 신호전달을 억제하는 혈관 효과

IgG1의 Fc 도메인에 융합된 ActRIIA의 세포외 도메인으로 구성된 리간드 트랩 (도 23a), (이후 mActRIIA-Fc라 칭함)을 이용하였다. 도 23b는 CKD-3에 의해 자극된 혈관 석회화가, mActRIIA-Fc를 개시하기 전에, 8주 동안 발달하게 하는 치료 프로토콜을 이용하여 혈관 석회화 모델에서 mActRIIA-Fc를 이용하기 위한 실험 설계를 도시한다. 상기 프로토콜을 이용하여, CKD-3 마우스를 ActRIIA 리간드 트랩으로 치료하면 ldlr -/- 고지방 식이를 섭취한 CKD-3 마우스에서 CKD-3 자극된 대동맥 Runx2 발현 및 대동맥 알칼리성 포스파타제(ALP) 발현을 감소시켰다(도 25a). Runx2 및 ALP 발현은 ActRIIA 신호전달의 잠재적 하류 효과 및 mActRIIA-Fc-치료에 의해 반전된, 대동맥에서 골아세포 전이의 바이오마커를 나타낸다.

분화된 혈관 평활근 세포의 바이오마커인 대동맥 평활근 22α (Sm22-알파)는 CKD-3에 의해 감소되었고 mActRIIA-Fc에 의해 자극되었다. CKD-3은 혈관 평활근 세포 특이적 전사 인자인 대동맥 미오카르딘 (MYOCD) 발현 감소를 초래하였지만, 미오카르딘은 mActRIIA-Fc-치료에 의해 영향을 받지 않았다. 혈관 석회화 (Lim, K., et al., 2012. Circulation 125:2243-2255.)와 연관된 대동맥 클로토 발현은 신장과 비교하여 매우 낮았다 (데이터 제시되지 않음). 도 25a에서 mRNAs의 대동맥 단백질 수준에 대한 CKD-3 및 mActRIIA-Fc-치료 효과의 측면에서, CKD는 대동맥 Runx2 수준 및 mActRIIA-Fc 정규화 대동맥 Runx2 수준을 증가시켰다(도 25b). CKD는 분화된 혈관 평활근 세포의 다른 바이오마커인 알파 평활근 액틴 (αSMA)의 대동맥 수준을 감소시켰고, mActRIIA-Fc 치료는 αSMA의 대동맥 수준을 증가시켰다 (도 25b). 미오카르딘 수준은 CKD- 또는 mActRIIA-Fc-치료에 의해 변하지 않았다.

9.4. 2.5 혈관 석회화에 대한 ActRIIA 신호전달 감소의 효과

혈관 석회화의 CKD 자극을 상술한 바와 같이 절제성(ablative) CKD를 갖는 ldlr-/- 고 지방식을 섭취한 마우스인 죽상동맥경화 및 2형 당뇨병 모델에서 연구하였다(Al-Aly, Z., et al., 2007. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 27:2589-2596; Towler, D.A., et al., 1998. Journal of Biological Chemistry 273:30427-30434.). CKD-3은 CKD-3 비히클 치료된 마우스 (CKD-3 V)에서 대동맥 죽종에서 칼슘 퇴적물의 축적을 초래하며(도 15a), 이는 mActRIIA-Fc으로 치료된 CKD-3 마우스 (CKD-3 R)에서는 존재하지 않았고, 또한 상기 대동맥 조직 칼슘 함량은 야생형 마우스에서 관찰되는 수준까지 감소하였고, 이는 mActRIIA-Fc 치료(CKD-3)의 개시 시간에 존재하였던 수준보다 상당히 낮았다 (도 15b).

9.4. 2.6 CKD 자극된 심장병에 대한 ActRIIA 신호전달 감소의 효과

심장병의 CKD 자극은 혈관 석회화 모델에서 연구하였다. CKD-3 V 마우스는 mActRIIA-Fc-치료에 의해 반전된 심장 중량 증가(도 16a)를 나타내지만, 탄산란탄 치료 (CKD-3 L (Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763.))에 의해서는 그렇지 않았고, CKD-3 V는 경증 심장비대를 유도하였다(도 16b). 그러나, 심장 섬유화의 증거는 없었던 반면(도 16C), 근세포 비대의 증거는 있었고, 이는 mActRIIA-Fc-치료에 의해 반전되었다.

CKD에서 혈관 석회화 및 심장비대 관련성의 1개 메카니즘은 큰 동맥 경직을 통한 것이기 때문에, 이전에 보고된 방법을 이용하여 혈관 경직 및 혈압을 측정하였다(Wagenseil, J.E., et al., 2009. Circulation Research 104:1217-1224; Wagenseil, J.E., et al., 2005. AJP - Heart and Circulatory Physiology 289:H1209-H1217.). ldlr -/- 고 지방식을 섭취한 죽상동맥경화 마우스에서 CKD-3는 경동맥 또는 대동맥의 혈관 경직도(도 19a 및 19b) 또는 혈압 상승(표 12)을 생성하지 않았다. 또한, Dkk1에 대한 중화 항체에 의해 치료된 CKD-3 마우스에서 Dkk1 중화(Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763.)는 경직도 증가 부재하에서도 대동맥 경직도에 영향을 갖지 않았다.

	WT	모의(sham)	CKD-3 V	CKD-3 Dkk1 mAb
SBP	108.9±1.1	111.9±4.7	100.4±4.6	110.7±4.8
DBP	77.27±1.0	78.56±2.2	69.14±3.1	77.55±3.6
맥압	31.63±0.3	33.32±2.5	31.27±2.1	33.1±1.9
심박수	547.1±4.7	501.2±17.4	505.6±14.3	558.6±11.2

BP= 심장수축기 혈압, DBP=심장확장기 혈압. 상기 값들은 평균 ± 평균의 표준 오차로 제시된다. N= 그룹당 4-6 마우스

표 12. 28주령 마우스의 생리학적 심혈관 변수

9.4. 2.7 대동맥 및 신장에서 ActRIIA 신호전달 및 신장 섬유화

TGFβ 수퍼패밀리에 의한 정규 신호 전달은 이들의 세린/트레오닌 키나제 활성을 활성화하고 I형 수용체인, Alk 키나제의 결합 및 인산화를 자극하는 II형 수용체에 결합하는 리간드를 포함한다(참조. 도 20 중의 다이그램도). TGFβ 수퍼패밀리에 의해 이용된 7개의 Alk 키나제가 있고, Alk4 (ActRIB)는 액티빈/ActRIIA 신호전달과 가장 흔히 관련된 I형 수용체이다(Abe Y, et al., 2004. Growth Factors (Chur, Switzerland) 22:105-110.). CKD-3 마우스 모델로부터의 신장 균질물에서, Alk4 인산화는 이전 연구와 마찬가지로 증가하지 않았다(Antsiferova, M., and Werner, S. 2012. Journal of Cell Science 125:3929-3937.) (도 18a). 대조적으로, 포스포스마드2는 CKD-3에 의해 증가하였고 mActRIIA-Fc에 의해서는 감소하였으며(도 18a), 이는 CKD에서의 신장 액티빈 신호전달에서 다른 Alk 수용체의 역할을 나타낸다. 간질성 신염에 걸린 병든 CKD-3 신장에서, Col1A1는 상향조절되었고 또mActRIIA-Fc는 Col1a1 수준을 감소시켰고(도 18a), 이는 mActRIIA-Fc에 의해 유도된 포스포스마드2 감소와 일치한다. 또한, mActRIIA-Fc에 의해 치료된 CKD-3 V 마우스에서 유도된 신장 클로토 발현에서 상당한 감소가 있었다(도 18b). 그 결과, CKD-3 V에서 액티빈이 발현되었던 신장 격실을 에세이하였고, 뇨세관주위 근섬유아세포(peritubular myofibroblasts)에서는 발현이 심하였지만 상피에서는 그렇지 않음이 확인되었다.

대동맥 평활근에서, Alk4 및 Alk1이 검출(도 18a)되었지만, Alk5 또는 Alk2는 검출되지 않았다. Alk4 및 Alk1의 수준은 CKD-3에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, CKD-3는 대동맥 포스포스마드2/3 수준을 증가시키지도 않았고, mActRIIA-Fc는 이들을 감소시키지도 않았다(도 18a). 그러나, 비정규 ActRIIA 신호전달의 에세이(도 20)은 맵 키나제(phosphoErk1/2)가 CKD에 의해 활성화되지도 않았고 mActRIIA-Fc에 의해 억제되지도 않은 것과 p38 및 JNK의 혈관 평활근 수준이 아주 낮은 것을 나타내었다. 대동맥 액틴2 수준은 또한 매우 낮았고, CKD-3-자극되지 않았다. Axin2 수준은 정규 Wnt 신호전달의 표준 바이오마커이다. 그러나, Dkk1은 정규 Wnt 신호전달의 전사 표적이기 때문에, 신장 및 대동맥에서의 Dkk1 수준을 Wnt 활성의 바이오마커로서 에세이하였고, 이는 mActRIIA-Fc-치료가 CKD-3 마우스에서 신장 Dkk1 수준을 감소(도 18c)시켜서, 혈장 Dkk1 수준을 현저히 감소시킴(도 18c)을 나타낸다. 또한, 대동맥 Dkk1 수준은 CKD-3에 의해 증가하였고 mActRIIA-Fc에 의해 억제되었다 (도 18c). 이는 신장 및 혈관 평활근 Wnt 신호전달 및 Dkk1의 전신 방출이 액티빈 억제에 의해 억제됨을 나타내었다. 따라서, 혈관 ActRIIA 증가를 통한 CKD 신호에서의 순환 액티빈 증가는 Wnt 신호전달을 활성화하고 죽상동맥경화성 석회화를 자극한다.

9.4. 2.8 전임상 연구의 인간 병태생리학 및 진료로의 해석

도 19에 도시된 바와 같이, 혈청 액티빈 수준은 건강 대조군과 비교하여 CKD 3 단계에 의한 환자 코호르트(cohort)에서 증가하였다.

9.4. 3 결론

이 실시예는 액티빈이 CKD 동안 순환계에서 증가하는, 신장 회복에 관여된 제2 인자임을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, 상기 결과는 액티빈 발현이 병든 신장에서는 감소되고, 액티빈이 순환계로 방출되며, 대동맥 혈관 평활근 탈분화 및 내피간엽 전환에 기여하는 골아세포 전이를 자극함을 나타내고, 이들 효과는 CKD-자극된 죽상동맥경화성 석회화 및 심장비대를 초래한다. CKD는 근섬유아세포에서 신장 액티빈 발현을 상향조절하고 또 신장 섬유화 증가를 통하여 신장병의 진행을 자극한다. ActRIIA 신호전달의 억제는 대동맥에서 골아세포 전이 및 죽상동맥경화성 석회화를 억제한다. ActRIIA 신호전달의 억제는 심장비대 및 신장 섬유화를 억제한다. 초기 CKD-MBD 증후군에 대한 ActRIIA 리간드 트랩, mActRIIA-Fc,의 효과는 CKD-자극된 혈관 석회화에서 Dkk1에 대한 단일클론 항체의 효과와 유사하다(Fang, Y., et al., 2014. J Am Soc Nephrol 25:1760-1763.). 이들 데이터는 병든 신장에서 ActRIIA 신호전달의 억제가 Wnt 활성화 및 순환 Wnt 억제제를 감소시킴을 나타낸다. 또한, 혈관 평활근에서, 액티빈은 mActRIIA-Fc에 의해 억제되는 Wnt 활성을 자극한다. 따라서, 2개의 신장 발달 인자인 Wnts 및 액티빈의 재활성화는 CKD에서 순환 Wnt 억제제 및 액티빈을 생성하여, 혈관 질환 및 심장병을 초래한다. 이것은 신장병이 직접적으로 심혈관계 질환을 유발하고 또 신장병 과정의 고려는 신장 회복 및 그에 따른 심혈관계 질환의 자극으로부터 분리될 수 없음을 나타낸다.

또한, 이 실시예는 신장 액티빈 발현이 3개의 만성 신장병 모델에서는 증가하여, 순환계에서 액티빈 억제제의 수준을 초과하는 증가된 순환 액티빈을 생성함을 나타낸다. 순환 액티빈은 ActRIIA 수용체를 통하여 신호 전달을 자극하여 대동맥 혈관 평활근 탈분화, 골아세포 전이, 및 죽상동맥경화 플라크의 석회화를 생성하였다. 이들 효과는, CKD가 대동맥 액티빈 mRNA 증가를 유도하였지만(도 13b) 대동맥에서 액티빈 단백질 수준 증가의 부재로 지지되는 바와 같이, 순환 액티빈에 기인한다. 이론에 얽매이지 않고, 이들 데이터는 혈관 액티빈 신호전달이 신장에 의한 내분비 액티빈의 생산을 통하여 CKD에 의해 자극되는 것임을 나타낸다.

EnMT는 Smad-매개된 과정(Cooley, B.C., et al., 2014. Science Translational Medicine 6:227ra234.)으로, TGFβs, 뼈 형태형성 단백질(BMP), 액티빈/인히빈, 및 성장 및 분화 인자(GDF)를 포함하는 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원에 의해 활성화(Piek, E., et al., 1999. The FASEB Journal 13:2105-2124.)되기 때문에, CKD-3을 갖는 혈관 석회화 모델의 대동맥을, 수용체의 리간드 결합 성분인 TGFβ 수퍼패밀리의 II형 수용체의 수준에서의 변화에 대해, 에세이하였다. 액티빈 수용체 IIA형 (ActRIIA)은 대동맥 혈관 평활근에서 상향 조절되었다. 리간드 트랩인 IgG1의 Fc 도메인 (mActRIIA-Fc)과의 융합 단백질에서 ActRIIA의 세포외 도메인의 투여는 ActRIIA 신호전달의 억제가 대동맥 평활근 세포에서 골아세포 전이의 억제, 혈관 평활근 세포 유전자 발현의 자극 및 CKD 자극된 죽상동맥경화 모델에서 대동맥 석회화의 반전을 생성함을 나타내었다. 또한, CKD는 계통 추적 마우스 모델에서 EnMT를 자극하였다. 그러나, 액티빈 기능의 주요 부위는 ActRIIA 발현이 증가되었던 혈관 평활근에 존재하는 것으로 나타났다.

심장비대, 특히 좌심실 비대는 CKD에서 상당히 일반적이다(Moran, A., et al., 2008. American Journal of Kidney Diseases 52:839-848; Park, M., et al., 2012. Journal of the American Society of Nephrology 23:1725-1734.). 또한, 죽상동맥경화성 혈관 석회화 모델은 심장비대를 특징으로 하였다(도 16). 그러나, 모델에서 심장비대 생성은 CKD-자극된 혈관 경직(Townsend, R.R. 2015. Current Opinion in Nephrology and Hypertension 24:47-53 10.1097/MNH.0000000000000086; Merx, M.W., et al., 2005. Journal of the American Society of Nephrology 16:3357-3364.), 고혈압, 및 심장 리모델링의 일반적 파라다임과는 메카니즘적으로 상이한데, 이는 죽상동맥경화증 CKD-3 마우스 (ldlr -/- 고 지방식을 섭취한 당뇨병 마우스)가 혈관 경직을 나타내지 않을 뿐만 아니라 고혈압도 나타내지 않았기 때문이다. mActRIIA-Fc는 FGF23 수준에서의 변화가 없을 때 심장비대를 교정하기 때문에(도 19), CKD-3 마우스에서의 심장비대가 FGF23에 기인하는 것으로 볼 수 없다 (Faul, C., et al., 2011. J Clin Invest 121:4393-4408.).

결론적으로, 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 CKD 동안 순환계에서 증가하고 심장병을 초래하는 신장 회복에 제2 인자가 관련됨을 나타낸다. 이론에 얽매이지 않고, 본 실시예는 액티빈 발현이 병든 신장에서 증가하고, 액티빈이 순환계로 방출되어 대동맥 혈관 평활근 탈분화 및 내피간엽 전환에 기여하는 골아세포 전이를 자극하고, 이들 효과가 CKD-자극된 죽상동맥경화성 석회화, 및 심장비대를 초래함을 나타낸다. CKD는 근섬유아세포에서 신장 액티빈 발현을 상향조절하고 신장 섬유화를 증가시키는 것을 통하여 신장병의 진행을 자극한다. ActRIIA 신호전달의 억제는 대동맥에서 골아세포 전이 및 죽상동맥경화성 석회화를 억제한다. ActRIIA 신호전달의 억제는 심장비대 및 신장 섬유화를 억제한다. 초기 CKD-MBD 증후군에 대한 ActRIIA 리간드 트랩, mActRIIA-Fc,의 효과는 병든 신장에서 ActRIIA 신호전달의 억제가 Wnt 활성화 및 순환 Wnt 억제제를 감소시킴을 나타낸다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고, 2개의 신장 발달 인자인 Wnts 및 액티빈의 재활성화는 CKD에서 순환 Wnt 억제제 및 액티빈을 생성하여, 혈관 질환 및 심장병을 초래한다; 따라서 신장병은 심혈관계 질환을 초래한다.

9.5 실시예 5: 신장 손상/회복은 전신적 Wnt 억제 및 액티빈을 통하여 혈관 질환을 자극한다

9.5. 1 배경

본 실시예에 제시된 결과는 실시예 4 (9.4 부분)에 제시된 결과에 관련된다.

신장병은 신장 회복 동안 전신적 Wnt 억제 및 액티빈 분비를 생성하는 것에 의해 죽상동맥경화성 혈관 석회화를 초래한다. 만성 신장병(CKD)의 혈관 효과는 Wnt 억제 및 액티빈-유도된 액티빈 수용체 기능 조절의 상호작용이다.

9.5. 2 방법

상승된 Wnt 억제제, 특히 Dkk1, 및 액티빈을 갖는 CKD를 계통 추적 및 혈관 석회화를 위한 마우스 모델에서 유도하고 알포트 마우스에서 자연스럽게 발달시켰다. 액티빈, Dkk1, 액티빈 수용체 2A형 (ActRIIA), 포스포스마드 2/3, 및 콜라겐 수준을 ELISA, RT-PCR, 및 웨스턴 블럿에 의해 측정하였다. 혈관 평활근 기능을 압력-유도된 동맥 확장에 의해 측정하였다. 세포 계통 추적은 내피-특이적 Tie2-Cre 마우스에 교배된 Rosa-tdT 마우스에서 실시하였다. Rosa-tdT를 갖는 마우스는 Cre 리콤비나제를 갖는 세포에서 토마토 레드를 발현한다. mActRIIA-Fc는 액티빈 A 리간드 트랩을 지칭한다(참조, 예를 들어, 미국 특허 제8,173,601호 및 Carrancio et al., 2014, British Journal of Haematology, 165:870-882).

9.5.3 결과

CKD는 순환 Dkk1 및 액티빈 수준을 증가시켰다. 병든 신장에서, 액티빈은 근섬유아세포에서 발현되었고, 포스포스마드 3을 통한 ActRIIA 신호전달도 증가하였다. 병든 신장에서, mActRIIA-Fc, ActRIIA 리간드 트랩,은 신장 psmad 3, Col1A1 발현, 뇨 단백질 수준, 및 Dkk1 수준을 억제하였고 클로토 수준을 증가시켰다. 혈관계에서, ActRIIA 수준 및 신호전달은 혈관 평활근 분화 및 기능 감소와 함께 CKD에 의해 손상되었다. CKD 마우스 혈관계에서, mActRIIA-Fc는 혈관 평활근 세포 분화를 증가시켰고 또 골아세포 전이 및 혈관 석회화를 억제시켰다. 순환계에서, mActRIIA-Fc는 Dkk1 수준을 감소시켰다. CKD는 Tek-Cre/Rosa-tdT CKD 마우스 대 정상 신장 기능을 갖는 Tek-Cre/Rosa-tdT 마우스의 손상된 대퇴동맥의 외막 세포에서 토마토 레드의 발현을 유도하였고, 상기 토마토 레드는 대퇴 동맥 내피에만 한정되었고, 이는 혈관 손상 동안 CKD가 Tie2-양성 세포를 유도함을 나타낸다.

9.5. 4 결론

CKD는 혈관 평활근 기능을 감소시켰고 골아세포 전이 및 혈관 석회화를 자극하였다. CKD에서 액티빈 상승과 함께 mActRIIA-Fc의 감소 효과는 Smad-의존적 신장 섬유화를 억제하였고, 대동맥 골아세포 전이를 차단하였으며, 혈관 평활근 분화를 증가시키고, 혈관 석회화를 감소시켰다.

9.6 실시예 6: CKD- MBD의 신장 골이영양증의 발병에서 액티빈 신호전달의 역할

9.6. 1.1 서론

만성 신장병-미네랄/뼈 질환(CKD-MBD)은 혈관 석회화 및 골이영양증을 포함한다. CKD는 순환 액티빈 (TGFβ 수퍼패밀리의 리간드) 및 액티빈 신호전달(도 21a)을 증가시킨다. 액티빈 IIA형 수용체 (ActRIIA) 리간드 트랩 (mActRIIA-Fc)에 의한 ActRIIA 신호전달의 억제는 혈관 석회화를 억제하고 심장비대를 방지한다. 본 실시예는 신장 골이영양증의 발병에서 액티빈 신호전달의 역할을 나타낸다.

9.6. 1.2 방법

모의 수술받은 ldlr-/- 고 지방식을 섭취한 마우스 (sham; n=12)는 당뇨병 및 고콜레스테롤혈증을 나타낸다. 고인산혈증, FGF-23 증가, 및 사구체 여과율에서 60% 감소를 갖는 CKD (CKD-3)는 ldlr-/- 고지방식을 섭취한 마우스에서 14주령에서 5/6 신장절제술에 의해 유도되었고, 이는 죽상동맥경화성 혈관 석회화의 모델이다. CKD-3 마우스를 mActRIIA-Fc 10 mg/kg (mActRIIA-Fc; n=15) 또는 비히클 (VEH; n=13)에 의해 처리하고, 22주령 개시부터 매주 복강내 주사하고 골격 조직형태계측 및 마이크로-전산화 단층촬영에 의해 28주에서 연구하였다. CKD-3의 결과를 야생형 (WT; n=5) 마우스 및 모의(SHAM) 결과와 비교하였다.

9.6. 2 결과

WT (해면골 체적/조직 체적(BV/TV): 12.90%)에 관하여, 모의 마우스는 무력증 뼈 질환과 관련된 감소된 BV/TV (10.92%)를 나타내었다. CKD-3의 유도는 VEH 마우스에서 고-교체 뼈 질환 및 낮은 BV/TV (11.22%)를 초래하였다; 이것은 6주의 mActRIIA-Fc-치료에 의해 반전되었다(13.28%). CKD-3의 유도는 해면골 두께 감소를 초래하였고, 6주의 mActRIIA-Fc-치료에 의해 반전되었다. CKD-3 VEH-치료된 마우스는 모의 마우스(1.05% 및 33.40/100 mm)에 비하여 더 많은 부식 표면/뼈 표면과 더 높은 파골세포 수/100 mm 뼈 길이 (각각 1.83% 및 62.32/100 mm)를 나타내었고, 이는 mActRIIA-Fc에 의해 경감되었다(1.23% 및 38.37/100 mm). CKD-3 VEH-치료된 마우스는 또한 WT 또는 모의 마우스와 비교할 때 더 많은 골아세포 표면/뼈 표면과 더 많은 골아세포 수/100 mm 뼈 길이 (각각 1.58% 및 110.63/100 mm; P<0.05)를 나타내었다 (각각 도 21b 및 도 21c). mActRIIA-Fc는 VEH와 비교할 때 현저하게 감소된 골아세포 표면/뼈 표면 및 골아세포 수/100 mm 뼈 길이 (0.68% 및 43.18/100 mm; P<0.05)를 나타내었다. VEH에 비하여 골아세포 수에서의 현저한 감소에도 불구하고, mActRIIA-Fc 치료로 골석회화 속도는 유지되었고 (각각 0.42 및 0.40 μm3/일), 뼈 형성속도/골아세포는 WT (0.42 μm3/100 세포/년)과 유사하게 (도 21d) 현저하게 높았다(각각 0.17 대 0.48 μm3/100 세포/년; P<0.05 vs. VEH).

	모의(sham)	CKD-3 + 비히클	CKD-3 + mActRIIA - Fc
BV , %	10.9±1.3	11.2±0.8	13.3±1.2
골소주 두께 (플레이트), μm	30.9±2.1	31.8±1.7	33.2±1.9
골소주 분리 (플레이트) μm	269.4±17.3	261.9±16.6	238.1±24.9
유골( Osteoid ) 체적/ BV , %	0.3±0.1용	0.4±0.1	0.2±0.1
유골 표면/뼈 표면, %	2.5±0.6	2.9±0.7	1.7±0.4
유골 두께, μm	2.1±0.4	1.9±0.3	1.9±0.2
부식 표면/뼈 표면, %	1.1±0.2	1.8±0.5	1.2±0.5
파골세포 수/뼈 주위, #/ 100 mm	33.4±5.1	62.3±19.5	38.4±15.4
파골세포 표면/뼈 표면, %	1.0±0.2	1.7±0.5	1.1±0.5
골석회화 속도/일, μm /일	0.4±0.0	0.4±0.1	0.4±0.0
이중 라벨/뼈 표면, %	3.0±0.9	3.7±1.0	1.6±0.3
단일 라벨/뼈 표면, %	8.0±0.9	10.1±1.1	10.3±1.9
표면/뼈 표면의 석회화, %	7.0±0.9	8.8±1.1	6.8±1.1
뼈 형성속도/뼈 표면, mm ³ / cm ² /년	10.8±2.3	13.9±2.5	9.5±1.2
석회화 지연 시간, 일	1.9±0.4	1.9±0.5	1.3±0.3
유골 성숙 시간, 일	6.3±1.4	5.4±0.9	4.9±0.5
SEM = 평균의 표준 오차

표 13. 조직형태계측 결과 (평균 + SEM)

mActRIIA-Fc는 고인산혈증 및 FGF-23 수준에 영향을 주지 않았다.

9.6. 3 결론

순환 액티빈 증가는 CKD-3과 관련된 고-교체 골이영양증에 기여한다. ActRIIA 리간드 트랩인 mActRIIA-Fc에 의한 액티빈 신호전달 억제는 뼈 흡수를 억제하고, 골석회화 속도 및 뼈 형성속도/골아세포를 정상화하는 것에 의해 CKD-3에서 골 체적을 증가시켜, CKD의 부정적 효과를 상쇄시켰다.

9.7 실시예 7: 투여량 수준이 증가되는 hACTRIIA - Fc 치료된 혈액투석 대상체에서 골 중량 및 복부 대동맥 혈관 석회화에 대한 정량적 전산화 단층촬영 결과

9.7. 1 서론

고-교체 신장 골이영양증은 피질 감소 및 지주골 중량 증가를 특징으로 하며, 골절 위험 증가를 초래한다. 액티빈 II형 수용체-IgG1 융합 단백질인 hActRIIA-Fc는 액티빈 A 신호전달을 차단하고 파골세포형성을 감소시킬 수 있으며, 시험관 데이터를 기초로 뼈에서 골아세포 성숙을 증진시킨다. 대상체에서 혈액투석 (HD)에 대한 현재의 에세이는 정량적 전산화 단층촬영 (QCT)을 이용하여 골밀도 (BMD) 및 복부 대동맥 혈관 석회화에 대한 hActRIIA-Fc의 효과를 평가하였다.

9.7. 2 방법

빈혈 개선을 위한 HD에 대한 대상체에서의 hActRIIA-Fc의 연구에서, 에리쓰로포이에틴 자극제(ESA) 감응성이었던 대상체를, 헤모글로빈 (Hb)이 <10 g/dL일 때까지 이들의 ESA 효과로부터 워시아웃(washed out)시킨 다음, 매 28일 마다 8회 이하의 투여 주기 동안 피하 투여되는 hActRIIA-Fc 0.3 mg/kg (n=9), 0.5 mg/kg (n=8), 0.7 mg/kg (n=9; 7 완료, 2 진행중), 또는 위약 (PBO; n=9) 그룹으로 무작위로 나누었다. 14일 투여 주기를 이용하는 투여 그룹을 현재 등록하고 있다. Hb, 안전성 변수, BMD, 혈관 석회화, 및 뼈 교체의 바이오마커에 대한 효과에 대하여 대상체를 평가하였다. 치료 실패(Hb <9 g/dL)는 ESA/수혈에 의해 구제하였다. 둔부, 요추, 및 복부 대동맥의 QCT 스캔은 기저선 및 225-일 치료 상 이후에 얻었다.

9.7. 3 결과

연구에 무작위로 나눈 35명의 대상체 중에서, 20명은 양측(paired) QCT 평가 (PBO: n=3; 0.3 mg/kg: n=6; 0.5 mg/kg: n=5; 및 0.7 mg/kg: n=6)를 받았다. 양측 QCT를 받은 일부 대상체는 치료 실패로 인하여 hActRIIA-Fc 노출이 제한되었다. 표 14는 PBO 및 각각의 hActRIIA-Fc 투여 그룹에 대해 BMD 및 혈관 석회화 결과를 나타낸다. hActRIIA-Fc는 피질 및 골소주 BMD에 대한 고-교체 신장 골이영양증의 효과를 경감시키고 또 PBO에 비하여 혈관 석회화의 진행을 늦추는 것으로 보인다.

9.7. 4 결과

이들 데이터는 hActRIIA-Fc가 투여량 의존적 방식으로 피질 및 지주골에 대한 고-교체 신장 골이영양증의 효과를 반전시키며 혈관 석회화의 진행을 늦추는 것을 나타낸다.

9.8 실시예 8. 투여량 수준이 증가되는 ACTRIIA -HFC (서열 7; “소타터셉트”)로 치료된 혈액투석 대상체에서 골 중량 및 복부 대동맥 혈관 석회화에 대한 정량적 전산화 단층촬영 결과:

9.8. 1 서론

실시예 6 (9.7 부분)의 서론 (9.7. 1 부분 ) 및 방법 (9.7. 2 부분 ) 참조. 이 실시예는 실시예 6 (9.7 부분)에서 실시된 연구로부터 이 연구의 나중 날짜에서 얻은 부가적 데이터를 제공한다.

9.8. 2 결과

총 35명의 대상체를 무작위로 나누고 하기 표 15에 나타낸 바와 같이 적어도 1회 투여량의 위약 또는 ActRIIA-hFc (서열 7; “소타터셉트”)를 투여하였다.

대상체	위약	소타터셉트 0.3 mg/kg	소타터셉트 0.5 mg/kg	소타터셉트 0.7 mg/kg
무작위로 나누고 ≥ 1 투여량의 위약 또는 소타터셉트 투여받음	9	9	8	9
기저선 및 225일에 QCT 측정	4	6	5	6

표 15. 무작위로 나눈 대상체 및 QCT 에세이 서브세트

기저선 및 225일에서의 양측 QCT 측정한 대상체를 포함한 대상체 배치는 도 22a에 도시한다. 연구 치료를 중단한 대부분의 대상체는 일반적으로 헤모글로빈 농도가 9 g/dL 미만이었기 때문에 구조 치료를 필요로 하는 치료 실패를 나타냈다. 연구 치료를 중단한 대부분의 대상체는 위약 또는 0.3 mg/kg의 소타터셉트를 투여받았다. 어떤 대상체도 유해 사례로 인하여 치료를 중단하지 않았다. 또한, 양측 QCT 측정을 받은 21명의 대상체 중에서, 12명은 치료 상 동안 헤모글로빈 치료 실패로 인하여 구조 치료를 필요로 하였고, 이들 중 9명은 처음 3회 투여 주기 이내에 구조 치료를 필요로 하였다.

양측 QCT 측정을 받은 대상체 중에서, 기저선 인구통계적 및 임상 특징은 일반적으로 처리군 전반과 유사하였다(표 16). 그러나, 가장 젊은 그룹이기도 한 위약 그룹에서는 투석 시간이 실질적으로 더 길었다. 기저선 바이오마커 및 아가츠톤 점수에서 그룹간 차이가 존재하였다(표 17).

	위약 (n=4)	소타터셉트 0.3 mg/kg (n=6)	소타터셉트 0.5 mg/kg (n=5)	소타터셉트 0.7 mg/kg (n=6)
연령, 평균, 년	51.3	57.3	60.8	63.0
여성, n ( % )	1 (25.0)	6 (66.7)	0 (0.0)	4 (66.7)
인종, n ( % )
백인	1 (25.0)	3 (50.0)	3 (60.0)	5 (83.3)
흑인	2 (50.0)	3 (50.0)	2 (40.0)	1 (16.7)
아시아인	1 (25.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
민족, n ( % )
라틴아메리카계	0 (0.0)	2 (33.3)	3 (60.0)	2 (33.3)
비-라틴아메리카계	4 (100.0)	4 (66.7)	2 (40.0)	4 (66.7)
투석후 체중, 평균, kg	65.5	80.3	79.4	84.5
체중량 지수, 평균, kg/m ²	24.2	27.7	26.9	29.9
당뇨병, n ( % )	2 (50.0)	5 (83.3)	5 (100.0)	5 (83.3)
부갑상선적출술, n ( % )	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
투석 시간, 평균, 개월	165.8	43.3	22.4	68.1
비칼슘 포스페이트 결합제, n ( % )*	4 (100.0)	3 (50.0)	3 (60.0)	3 (50.0)
칼슘계 포스페이트 결합제, n ( % )*	1 (25.0)	4 (66.7)	4 (80.0)	4 (66.7)
칼슘수용체 작동약 , n (%)*	1 (25.0)	2 (33.3)	0 (0.0)	2 (33.3)
1,25-OH 비타민 D 유사체, n ( % )	3 (75.0)	5 (83.3)	2 (40.0)	4 (66.7)
* 대상체는 다수 유형의 결합제를 투여받을 수 있었다

표 16. 양측 QCT 측정을 받은 대상체의 기저선 인구통계적 및 임상 특징

	위약 (n=4)	소타터셉트 0.3 mg/kg (n=6)	소타터셉트 0.5 mg/kg (n=5)	소타터셉트 0.7 mg/kg (n=6)
기저선 전체 PTH , pg/mL	209.2	104.8	135.5	100.4
BSAP ^a , μg /L	24.0	18.0	13.2	15.5
P1NP ^b , ng/mL	548.3	376.2	468.4	437.5
CTX ^c , pg /mL	3,152.3	2,062.5	2,266.8	2,246.5
총 둔부 적분 BMD , mg/cm ³	276.8	286.6	280.0	281.0
대퇴 경부 피질 BMD , mg/cm ³	640.5	667.0	593.1	594.8
평균 척추 (L1, L2) BMD, mg/ cm ³	140.1	125.6	149.1	118.7
VC 총 아가츠톤 점수 ^d	6,498.8	9,472.7	3,618.5	1,862.1
주: n은 양측 QCT 평가를 받은 무작위로 나눈 대상체의 수를 나타낸다; 각 변수당 유용 대상체의 실제 수는 다양할 수 있다. PTH= 부갑상선 호르몬. ^a뼈= 특이적 알칼리성 포스파타제(BSAP) 기준 범위: 남성, 6-30; 여성 (폐경전), 3-19; 여성 (폐경후), 6-26. ^b프로콜라겐 1형 N-프로펩티드 (P1NP) 기준 범위: 남성, 30-110; 여성 20-108 ^cC-말단 텔로펩티드 (CTX) 기준 범위: 남성, 0-854; 여성 (폐경전), 26-573; 여성 (폐경후), 104-1,008 ^d 낮은 아가츠톤 점수는 낮은 수준의 혈관 석회화를 나타낸다.

표 17. 양측 QCT 측정을 받은 대상체의 평균 기저선 바이오마커, 체적 BMD, 및 아가츠톤 점수

심각한 유해 사례는 일반적으로 소타터셉트와 관련되지 않은 것으로 간주되며, 치료 중단을 초래하지 않고, 연속 요법으로 해결하였다. 소타터셉트 처리군에서는 사망자가 보고되지 않았다. 유해 사례는 대부분 심각성에서 경미하거나 중간 정도이고, 연구 약물과 관련이 없으며, 처리군 사이에서는 비교적 비슷하고, 일반적으로 대상체의 병력과 일치하였다. 처음 28일 투여 주기에서 및 225일 치료 상 동안, 가정에서의 혈압측정은 어떤 처리군의 대상체에서도 기저선으로부터 일관된 변화 또는 투여량 의존적 변화를 보이지 않았다.

복부 대동맥 총 아가츠톤 점수에서의 기저선으로부터의 변화는 표 18에 제시되어 있다. 복부 대동맥 총 아가츠톤 점수에서 <15% 진행을 갖는 대상체의 비율은 도 22b에 도시되어 있다.

	위약 (n=4)	소타터셉트 0.3 mg/kg (n=6)	소타터셉트 0.5 mg/kg (n=5)	소타터셉트 0.7 mg/kg (n=6)
복부 대동맥 총 아가츠톤 점수
기저선 총 아가츠톤 점수	6,498.8	9,472.7	3,618.5	1,862.1
기저선 총 아가츠톤 점수로부터 변화	787.8	8.578.9	225.7	171.0
% 기저선 총 아가츠톤 점수로부터 변화	58.4	29.9	17.3	7.4
제곱근 변환 총 체적 점수
총 체적의 기저선 제곱근, mm ³	39.0	46.2	33.1	27.4
총 체적의 기저선 제곱근으로부터 변화 mm ³	3.4	11.1	1.2	1.3
주: n은 양측 QCT 평가를 받은 무작위로 나눈 대상체의 수를 나타낸다; 각 변수당 유용 대상체의 실제 수는 다양할 수 있다. *더 낮은 총 아가츠톤 및 제곱근 변환 총 체적 점수는 낮은 수준의 혈관 석회화를 나타낸다.

표 18. 복부 대동맥 총 아가츠톤 점수 및 제곱근 변환 총 체적 점수에서 기저선 및 기저선으로부터 변화*

또한, 표 19는 대퇴 경부 피질 및 평균 요추 골소주 체적 BMD 측정에서 기저선으로부터의 변화 %를 제공한다. 대퇴 경부 피질 BMD에서 >2% 이득을 갖는 대상체의 비율을 에세이하고 소타터셉트에 의한 치료가 대퇴 경부 피질골에서 ≥2% 증가를 갖는 대상체의 비율 증가와 관련되어 있는 것으로 판정하였다(표 19 및 도 22c 참조). 또한 Malluche et al., 2014, Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 9:1254-1262 참조. 또한, 고-교체 ROD에서, 일반 집단과 비교할 때, ESKD에서 척추 골절율 감소 없이 요추 골소주 BMD에 의해 측정된 바와 같이 지주골 중량은 증가한다(참조, Leonard MB, 2009, Semin. Nephrol., 29:133-143, and Duan et al., 1999, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:718-722). 이러한 설정에서, 상기 지주골 중량 증가는 불량한 품질을 나타낸다(참조 Malluche et al, 2012, J. Am. Soc. Nephrol. 23:525-532). 소타터셉트를 사용한 치료는 요추에서 지주골 중량 증가를 늦춘다(표 19).

	위약 (n=4)	소타터셉트 0.3 mg/kg (n=6)	소타터셉트 0.5 mg/kg (n=5)	소타터셉트 0.7 mg/kg (n=6)
대퇴 경부 피질
기저선 BMD , mg/ cm ³	640.5	667.0	593.1	594.8
기저선 BMD로부터 % 변화 % (n)	-1.4 (4)	-1.4 (5)	1.6 (5)	-0.1 (4)
평균 요추 (L1, L2) 골소주
기저선 BMD , mg/ cm ³	140.1	125.6	149.1	118.7
기저선 BMD로부터 % 변화 (n)	10.9 (4)	8.0 (6)	0.5 (5)	4.5 (6)
주: n은 양측 QCT 평가를 한 무작위로 나눈 대상체의 수를 나타내고; 각 변수에 대해 유용한 대상체의 실제 수는 다양할 수 있다.

표 19. 대퇴 경부 피질 및 평균 요추 (L1, L2) 골소주 BMD에서 기저선 및 기저선으로부터의 퍼센트 변화

9.8. 3 결론

기저선 바이오마커 데이터를 기초할 때, 본 실시예에서의 대상체는 고-교체 ROD를 갖는 경향이 있었다. 위약 그룹은 피질골 중량이 감소하였고, 지주골 중량은 증가하였으며, 고-교체 ROD에서 예상되는 바와 같이 ESKD에서 다른 대형 연구와 유사한 비율로 생기는 혈관 석회화가 증가하였다(Raggi et al., 2011, Nephrol. Dial. Transplant. 26:1327-1339).

기저선 및 225일 (8회의 28-일 투여 주기까지의 이후임)에 측정된 QCT 데이터는 소타터셉트를 사용한 고-교체 ROD의 치료가 혈관 석회화의 지연 진행, 대퇴 경부 피질골 중량 증가 및 요추 골 중량에서 느린 증가를 비롯한 CKD-MBD의 복수 변수에 대한 효과를 초래함을 나타내었다, 혈관 석회화 감소 및 골 중량 증가는 고 지방식을 섭취하고, 혈관 석회화로 5/6 신장절제술을 받은 ldlr -/- 마우스 모델에서 조직학적 발견과 일치한다(Fang et al., 2014, Abstract, ASN Kidney Week 2014, November 11-16, 2014, Philadelphia, PA).

9.9 실시예 9: ACTRILLA -HFC (서열 7, “소타터셉트”)는 말기 신장병의 다수의 징후에 영향을 준다

9.9. 1 배경

본 실시예는 임상 연구로부터의 데이터를 제시한다. 실시예 7 및 8 (9.7 부분 및 9.8 부분) 또한 이 연구로부터의 데이터를 제시한다.

진행중인 무작위로 나눈, 단순 맹검, 위약-제어 연구는 혈액투석 대상체에서 빈혈을 치료하기 위하여 ActRIIA-IgG1 융합 단백질 리간드 트랩인 ActRIIA-hFc (서열 7; “소타터셉트”)의 약물동력학, 안전성, 및 헤모글로빈 효과를 평가하였고, 정량적 전산화 단층촬영을 이용하여 혈관 석회화 및 골밀도에 대한 그의 효과를 조사하였다. 이 실시예는 0.3, 0.5, 및 0.7 mg/kg 투여 그룹에 대한 반기실적(interim results)을 제공한다.

9.9. 2 방법

에리쓰로포이에틴 자극제(ESA)-감응성 대상체를, 헤모글로빈이 <10 g/dL일 때까지 ESA 효과로부터 워시아웃시키고, 28 일 마다 ≤8 투여 주기로 피하 투여되는 위약 또는 소타터셉트군으로 무작위로 나누었다. 치료 실패(헤모글로빈<9 g/dL)는 ESA 또는 수혈에 의해 구제하였다; 대상체 내 투여량 증가는 허용되지 않았다. 기저선 및 225-일 치료 상 이후에 둔부, 요추, 및 복부 대동맥의 정량적 전산화 단층촬영을 얻었다. 약물동력학, 안전성, 가정 혈압, 헤모글로빈, 혈관 석회화, 및 골밀도 효과에 대한 반기실적을 보고하였다.

9.9. 3 결과

위약 (n=9) 또는 소타터셉트 0.3 mg/kg (n=9), 0.5 mg/kg (n=8), 및 0.7 mg/kg (n=9)으로 치료된 대상체 중에서, 유해 사례는 대부분 경미/중간 정도이고, 연구 약물과는 관계가 없었고, 그룹간 유형/심각도에서는 비교적 유사하였으며, 대상체 병력과 대체로 일치하였다. 위약 그룹에서 2명의 사망자가 생겼다. 가정 혈압에서는 투여량 의존적 변화가 없었다. 225-일 치료 상에서, 헤모글로빈은 위약 또는 소타터셉트 0.3, 0.5, 또는 0.7 mg/kg으로 각각 치료된 대상체의 33%, 33%, 63%, 및 78%에서 >10 g/dL이었다. 위약 또는 소타터셉트 0.3, 0.5, 또는 0.7 mg/kg으로 치료된 4, 6, 5, 및 6 대상체에서 얻은 양측 정량적 전산화 단층촬영은 33%, 80%, 80%, 및 100%에서 <15%의 혈관 석회화 진행, 및 0%, 20%, 40%, 및 75%에서 대퇴 경부 피질골밀도의 >2% 증가를 나타내었다.

9.9. 4 결론

소타터셉트는 혈액투석시 가정 혈압의 증가 없이 허용가능한 안전성 프로파일로 허용되었다. 헤모글로빈, 혈관 석회화, 및 골밀도에서 소타터셉트에 대한 투여량-의존적 반응이 있었다.

9.10 실시예 10: CKD에서 ACTRIIA 시그널링 장애는 죽상동맥경화성 석회화 및 신장 섬유화에 기여한다

이 실시예는 실시예 4를 비롯한 본원에 기재된 다른 실시예에 기재되고 실시된 실험에 관련된다.

9.10.1 방법

9.10.1.1 동물 모델의 생산

죽상동맥경화 저밀도 지단백질 수용체 결핍( ldlr -/-) 웅성 마우스(C57Bl/6J 백그라운드)를 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하고 12주령에서부터 고 지방 식이(지방으로부터 칼로리 42%)을 섭취시켰다. 상기 마우스는 비만이고, 22주령에서는 인슐린 내성이며, 28주령에는 당뇨병이고 고콜레스테롤혈증이었다.

앞서 기재된 바와 같이 만성 신장병을 생성하기 위하여 2단계 과정을 이용하였다. (Davies MR, et al. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 1559-1567; Davies MR, et al. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 917-928). 생후 12 주에 2 cm 옆구리 절개를 통하여 우측 신장에 전기소작법을 실시한 다음, 14주령에 좌측 전체 신장절제술을 시행하였다. 상기 소작법의 강도는 중간 정도의 (CKD-3) 신장 손상을 생성하도록 변동될 수 있으며, 이는 20주령에서 이눌린 클리어런스에 의해 확인되었다(도 33a, b). 대조 동물은 모의 수술을 받았고, 이때 적절한 신장을 노출시켜 동원하지만 다른 방법으로는 처리되지 않았다. 이 연구에는 5개 그룹의 마우스를 사용하였다(도 23b). 제1 그룹은 보통 음식을 섭취한 야생형 C57Bl/6J 마우스였다(WT). 이는 정상 대조치를 위해 사용된 정상 신장 기능 및 식이 그룹이었다. 제2 그룹은 고 지방식을 섭취하고 모의 수술을 받은 ldlr -/- 마우스였다(Sham). 이 그룹은 신장병의 효과를 결정하기 위한 대조 그룹으로 이용하였다. 제3 그룹은 고 지방식을 섭취한 인간 CKD 3 단계 (CKD-3)과 동등한 GFR 감소를 갖는 ldlr -/- 마우스였고, 22주에 안락사시켰고, 도 25a, b, c에 사용된 기저선 혈관 석회화 그룹 (CKD-3)이었다. 제4 그룹은 22주에 시작하여 28주에 안락사시킬 때까지 주당 2회씩 비히클 (포스페이트 완충 염수)를 피하 주사된 ldlr -/- 마우스였다(CKD-3 V). 제5 그룹은 22주에 시작해서 28주에 안락사시킬 때까지 주당 2회씩 mActRIIA-Fc (Celgene, Summit, NJ)를 10 mg/kg로 피하 주사된 CKD-3을 갖는 ldlr -/- 마우스였다(CKD-3 R). 사용된 투여량은 앞선 PK/PD 연구에서 뼈 형성 자극에 유효한 투여량인 것으로 밝혀져 있었다.

사용된 CKD의 제2 모델은 IV형 콜라겐, COL4A5의 α5 사슬에 대한 유전자에서의 결핍인 X-결합된 알포트 증후군의 마우스 상동체였다 (Rheault MN, et al. J. the Am. Soc. Neph. 2004; 15: 1466-1474). 이는 자연적 신장병 모델이며, 신장 절제 유도된 CKD의 효과를 확인하기 위하여 결과 전반에서 사용되었다. 번식용 마우스 쌍을 잭슨 라보라토리즈로부터 구입하고 실험을 위해 번식시켰다. 반접합체 웅성은 생후 150 일에는 인간 CKD 3-4 단계에 필적하는 신장병이 자연스럽게 생겼고, 75일령에는 혈뇨증이 생겼다.

모든 경우에서, 마취를 하여 안락사시켰다. 모든 과정에는 복강내 마취(자일라진 13 mg/kg 및 케타민 87 mg/kg)를 이용하였다. 수술후 기저선 신장 기능을 평가하기 위해 제2 수술한지 1주 후에 대복재 정맥 혈액 샘플을 취하였다. 희생시킬 때, 심장내 자창에 의해 혈액을 취하고, 심장 및 대동맥을 함께 해부하였다.

9.10.1. 2 이눌린 클리어런스

안락사가 28주였다면 이눌린 클리어런스를 20주 또는 26주에 제조자 (BioPal Inc., Worcester, MA) 지시에 따라서 실시하였다.

9.10.1. 3 화학 석회화 정량

희생시켰을 때 대동맥을 해부하고, 해부 현미경 하에서 비절개 박리에 의해 모든 외래 조직을 제거하였다. 조직들을 60℃에서 20-24시간 탈수시키고, 중량 측정하고 막자와 막자사발을 이용하여 분말로 분쇄하였다. 칼슘을 4℃에서 1N HCL에 24 시간 동안 용리시켰다. 용리액의 칼슘 함량을 제조자의 지시에 따라 크레솔프탈레인 콤플렉손법(Sigma, St Louis, MO)을 이용하여 평가하고, 결과를 건조 조직 중량에 대해 보정하였다.

9.10.1. 4 혈액 시험

동물 시설에 의해 실시된 표준 자동에세이기 실험실 방법에 의해 혈청을 채혈일에 혈액 요소 질소 (BUN), 칼슘, 및 포스페이트에 대해 에세이하였다. 혈장 액티빈 (Fitzgerald Industries, Acton, MA), 폴리스타틴 (MYBIOSOURCE Inc., San Diego, CA) 및 폴리스타틴-유사 3 (MYBIOSOURCE Inc.) 수준은 ELISA 에세이에 의해 결정하였다. 혈청 Dkk1 수준은 ELISA (R&D Systems, Minn., MN)에 의해 에세이하였다. Elisa 에세이를 위해 안락사시켰을 당시 대복재 정맥 또는 심장천자에 의해 혈액을 취하였다. 모든 혈액 샘플은 수집시 얼음 위에 두었다. 혈소판이 부족한 EDTA 혈장 샘플은 6000 rpm에서 5분간 그리고 14000 rpm에서 2분간의 2-단계 원심분리(양쪽 모두 4℃)에 의해 준비하였다. 샘플은 사용되기까지 20℃ 이하에서 저장하였다.

9.10.1. 5 조직학 및 면역조직화학

대동맥 및 신장 조직을 10% 중성 완충된 포르말린에서 밤새 고정시킨 다음, 4℃의 70% 에탄올에 전달하고, 파라핀에 매립시켜 5 마이크론 절편을 제조하였다. 슬라이드를 자일렌에서 탈파라핀화시키고, 단계적 에탄올 시리즈로 탈수시킨 다음 재수화시켰다. 메이슨 트리콤 염색을 이용하여 신장 및 심장 섬유화를 검출하고 또 알리자린 레드 염색을 이용하여 표준 수법에 따라 석회화를 검출하였다(Gregory CA, et al. Analytical Biochem. 2004; 329: 77-84). 면역염색을 위해, 슬라이드를 20% 정상 염소 혈청에서 20분간 블로킹시키고 일차 항체와 4℃에서 밤새 배양하였 다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 염소-항 토끼 Alexa 488 이차 항체 1:400 (Life Technologies, A11008)와 함께 실온에서 30분간 배양 또는 신호 증폭시키기 위하여 제조자 지시에 따라 (Life Technologies, T 20932) TSA 키트를 사용하여 배양하기 전에 20% 정상 염소 혈청에서 20분간 블로킹하였다. 이중 면역형광 염색을 위해, 절편들을 20% 염소 혈청에서 블로킹시키고 염소-항 토끼 Alexa 488 및 Alexa 568 이차 항체 1:400 (Life Technologies, A11008 및 A11011) 또는 신호 증폭을 위해 제조자의 지시에 따라 (Life Technologies, T20932 and T20934) TSA 키트를 사용하여 제1 일차 및 이차 항체와 제2 일차 및 이차 항체로 순차적으로 염색시켰다. 동일 종으로부터의 일차 항체를 이중 염색을 위해 사용하였을 때, 제2 염색 전에 전자렌지 내 시트레이트에서 슬라이드를 5분간 가열하였다. (Toth ZE, J. HistoChem. & CytoChem. 2007; 55: 545-554). 면역염색을 위한 이 연구에서 사용된 일차 항체: 토끼 다클론 항-ActRIIA 항체 1:250 (Abcam, ab 135634), 토끼 다클론 항-인히빈 베타 A 항체 1:100 (Santa Cruz, sc-50288), 토끼 다클론 항-CD31 항체 1:50 (Abcam, ab28364) 및 토끼 다클론 항-베타-카테닌 항체 1:500 (Abcam, ab32572).

9.10.1. 6 RT - PCR

RNeasy Mini Kits (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 대동맥 및 신장으로부터 RNA를 추출하였다. 1 μg의 총 RNA를 Bio-Rad (Hercules, Ca)가 제조한 iScript cDNA 합성 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 Veriti Termal Cycler (Applied Biosystems) 상에서 DNase 처리시키고 역전사시켰다. Vector NTI (Invitrogen, Grand Island, NY) 또는 Primer Express (Life Technologies, Grand Island, NY) 소프트웨어를 이용하여 프라이머를 설계하였다. 역전사 후, StepOne Plus 실시간PCR 기구 (Applied Biosystems), Sigma 사 (St. Louis) 제조 SYBR Green 및 Invitrogen사 제조 PCR 키트를 이용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 각 반응은 95℃에서 45초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 60초를 40주기 동안 삼중으로 실시하였다. 이어 60℃에서부터 95℃까지 단계적 온도 상승으로 이루어진 용융 주기를 실시하였다. 각 유전자의 해리 곡선에서는 뚜렷한 단일 피크가 관찰되었고, 이는 PCR 생성물의 특이성을 지지한다. Ct치(임계치)는 PCR의 지수 증식기 이내에 설정하였고 관심을 두는 유전자의 발현 수준을 산출하는데 이용하였다. B2m는 내부 표준으로 사용되었고 그 값을 정규화한다. c _T 대 로그(Log) cDNA 희석 (로그 복제수에 상응)으로 구성된 표준 곡선은 미지량의 암플리콘에 상응하는 cDNA의 연속 희석물을 증폭시키는 것에 의해 생성하였다. 음성 대조는 게놈 DNA가 증폭되지 않았음을 보장하기 위하여 RT-PCR 전에 5분간 끓이는 것에 의해 역전사효소를 불활성화하는 것에 의해 실시하였다.

9.10.1. 7 면역블러팅 ( 웨스턴 에세이)

프로테아제 억제제 칵테일 (Santa Cruz)을 함유하는 RIPA 용해 완충액 (Thermo Scientific)에 의해 마우스의 신장 및 대동맥으로부터 전세포 용해 단백질을 준비하였다. 용해물(20 μg)을 8-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 인히빈 β-A (Santa Cruz), α-튜불린(Santa Cruz), 액틴-α 평활근 (Sigma), Runx2 (Cell Signaling), Myocd (Santa Cruz), ACVRL1 (Origene), ACVR1 (Cell Signaling), Erk1/2 (Cell Signaling), 포스포- Erk1/2 (Cell Signaling), ACVR1B (Origene), Col1a1 (Santa Cruz), Smad2/3 (Cell Signaling), 또는 포스포-Smad2/3 (Cell Signaling)에 대한 항체를 사용하여 면역블럿팅시켰다. 면역침강(IP) 에세이는 동일한 전세포 용해 단백질을 사용하였다. 비특이적 결합을 감소시키기 위하여, 미리 세척된 단백질 A 아가로오스 비드 (Cell Signaling)를 사용하여 샘플을 미리 세정하였다. 미리 세정된 샘플을 포스포-세린 항체 (Abcam)와 밤새 배양하였다. IP-항체 착물을 단백질 A 아가로오스 비드 상에 포획하고 면역블러팅 에세이에 의해 단백질을 검출하였다.

ANOVA를 이용하여 통계학적 에세이를 실시하였다. 도면에 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 모든 데이터는 평균 ± SD로 나타낸다. 그룹 간의 차이를 Fisher LSD법을 이용하여 사후 평가하고, p <0.05 이면 유의한 것으로 간주하였다. 모든 그룹에 대한 데이터는 "n”이 7-15인 것을 나타낸다. 실시간 PCR 에세이의 경우, 각 실험 그룹에 최소 3개 샘플을 사용하였다. 도 26c에서 혈관 석회화 데이터의 경우, 박스는 중앙값 및 사분범위(25^th내지 75^th퍼센타일)을 나타내고, 에러바는 25^th아래 75^th퍼센타일 초과의 사분범위의 1.5-배를 나타낸다. 유의한 차이에 대한 중요 수준으로서 복수의 대조 p<0.05에 대한 ANOVA Holm Sidak 방법을 이용하여 중앙값을 비교하였다.

9.10.2 결과

9.10.2. 1 CKD 모델에서 실험 설계 및 신장 기능

고 지방식을 섭취한 ldlr -/- 마우스는 죽상동맥경화성 혈관 석회화를 생성하기 위한 식이 및 유전형을 필요로 하는 죽상동맥경화성 혈관 석회화의 모델이다.(Davies MR, et al. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 1559-1567; Towler DA, et al. J. Biological Chem. 1998; 273: 30427-30434). 신장 기능은 ldlr -/- 고 지방식을 섭취한 마우스에서 신장 피질 손상 및 반대측 신장절제술에 의해 인간 3 단계 CKD (CKD-3)과 유사하게 감소하였다 (도 33a, b). CKD-3 마우스는 고인산혈증(표 20)이었고, 이는 인간 3-4 단계 CKD에서 고인산혈증의 개시와 일치하였다(Isakova T, et al. Kidney Int 2011; 79: 1370-1378).

변수	그룹 1	그룹 2	그룹 3	그룹 4
변수	야생형	모의(Sham)	CKD-3 V	CKD-3 R
마우스 종	C57/BJ6	Idlr-/-	Idlr-/-	Idlr-/-
식이	일반식	고 지방	고 지방	고 지방
수술	없음	모의(sham)	CKD	CKD
생후 주수	28	28	28	28
치료	없음	없음	비히클	mActRIIA-Fc
N	12	15	14	15
BUN (mg/dl)	24.0 ± 4.6	20.6 ± 3.7	37.7 ± 7.6*	36.5 ± 5.8*
Ca (mg/ di )	8.3 ± 1.8	8.9 ± 0.9	9.4 ± 0.8	8.8 ± 0.3
인(mg/ di )	8.9 ± 0.2	7.9 ± 2.3	11.0 ± 1.6*	11.8 ± 1.2*

*:<0.05, 그룹 2에 비교한 그룹 3 및 4

표 20: 시험된 동물에서 혈청 생화학 변수

9.10.2. 2 CKD에서 액티빈 수용체 IIA형 ( ActRIIA ) 수준

고 지방식을 섭취한, CKD-3을 갖는 ldlr -/- 마우스로부터 얻은 대동맥을 II형 및 I형 (ALK) 수용체로 구성된 수퍼패밀리 수용체 헤테로다량체의 1개 리간드 결합 성분인 TGFβ 수퍼패밀리 II형 수용체에 대해 에세이하였다. 액티빈 II형 수용체 A (ActRIIA)는 대동맥 혈관 평활근 세포(VSMC)에서 발현되었다(도 24a, b). ldlr-/- 고 지방식을 섭취한 마우스에서 생긴 CKD-3은 대동맥에서 ActRIIA 하향 조절을 유도하였다(도 24a). 이는, 특정 이론에 얽매이지 않고, 다른 조직에서 보고된 고순환 리간드 수준에 의해 생긴 ActRIIA의 내재화 및 분해와 일치한다. (Simone ND, et al. Endocrinology 1998; 139: 1147-1155; Liu ZH, et al. J. Endocrinology 2006; 189: 409-421). 내피 세포 ActRIIA는 면역화학적 및 면역형광 검출에 의해서는 검출되지 않았다. (도 24b).

9.10.2. 3 CKD에서 ActRIIA 리간드 트랩의 혈관 효과

ActRIIA 수준의 CKD-유도된 억제의 효과는 비히클 또는 ActRIIA 리간드 트랩 (mActRIIA-Fc)으로 처리된 CKD-3 마우스로부터 얻은 대동맥 균질물에서 에세이하였다(도 25a, b). CKD-3 자극된 골아세포 전이는 ldlr -/- 고 지방식을 섭취한 마우스의 대동맥에서 Runx2 및 알칼리성 포스파타제(Alpl)에 대한 mRNA의 발현에 의해 평가하였다. CKD-3 자극된 이들의 발현 및 mActRIIA-Fc 치료는 CKD의 효과를 반전시켰다(도 25a). Runx2 및 Alpl 발현은 mActRIIA-Fc 치료에 의해 반전된 대동맥에서 골아세포 전이의 바이오마커를 나타낸다. 분화된 혈관 평활근 세포의 바이오마커인 평활근 22α 또는 트랜스젤린 (Tagln)(Li L, Miano, et al. Circulation Res. 1996; 78: 188-195)의 대동맥 mRNA는CKD-3에 의해 감소되었고 mActRIIA-Fc에 의해 자극되었다. CKD-3는 또한 혈관 평활근 세포 특이적 전사 인자인 대동맥 미오카르딘 (Myocd) mRNA 발현 감소를 초래하였지만, 미오카르딘은 mActRIIA-Fc 치료에 의해 영향을 받지 않았다. 도 25a에서 연구된 각 mRNAs의 대동맥 단백질 수준에 대한 CKD-3 및 mActRIIA-Fc 치료의 효과의 측면에서, CKD는 대동맥 Runx2 및 Alpl 수준을 증가시켰고 mActRIIA-Fc는 이들을 정상화시켰다(도 25b, Alpl에 대한 데이터는 도시되지 않음). CKD는 Tagln 및 분화된 혈관 평활근 세포의 다른 바이오마커인 알파 평활근 액틴(αSMA)의 대동맥 수준을 감소시켰고 mActRIIA-Fc 치료는 이들을 증가시켰다(도 25b, Tagln에 대한 데이터는 도시되지 않음). 미오카르딘 수준은 CKD 또는 mActRIIA-Fc 치료에 의해 변하지 않았다.

ldlr -/- 고 지방식을 섭취한 마우스는 죽상동맥경화, 죽상동맥경화성 석회화 및 2형 당뇨병의 모델이다, (Al-Aly Z, et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biol. 2007; 27: 2589-2596; Towler DA, et al. J. Biological Chem. 1998; 273: 30427-30434). 그 중에서 CKD-3는 CKD-3 비히클 처리된 마우스 (CKD-3 V)에서 대동맥 죽종(atheroma)에서의 칼슘 침적물 축적을 초래하고 (도 26a) 총 조직 칼슘 수준을 증가(도 26b)시키는 것이 확인되었다. 가시적 칼슘 침적물은 mActRIIA-Fc으로 치료된 CKD-3 마우스 (CKD-3 mActRIIA-Fc)에서는 존재하지 않았다. 또한, mActRIIA-Fc는 대동맥 조직 칼슘 함량을 야생형 및 모의 마우스에서 관찰된 수준과 유사한 수준으로까지 및 mActRIIA-Fc 치료 개시시에 존재한 수준보다 현저하게 아래 수준까지 감소시켰다 (도 26b).

9.10.2. 4 대동맥에서 ActRIIA 신호전달

TGFβ 수퍼패밀리에 의한 정규 신호 전달은 이들의 세린/트레오닌 키나제 활성을 활성화하고 I형 수용체, Alk 키나제의 결합과 인산화를 자극하는 II형 수용체에 대한 리간드 결합을 포함한다 (도 34에 도시된 다이아그램도 참조). TGFβ 수퍼패밀리에 의해 이용된 7개의 Alk 키나제가 있고, Alk4 (ActRIB)는 ActRIIA 신호전달과 가장 흔히 관련된 I형 수용체이다. (Abe Y MT, et al. Growth Factors (Chur, Switzerland) 2004; 22: 105-110). ActRIIA 수준은 도 24에서 확인되는 바와 같이 CKD-3 마우스로부터 단리된 대동맥 균질물에서는 감소되지 않았고, Alk4 및 Alk1의 감소된 조직 수준과 관련되지 않았다 (도 27a). ActRIIA 신호전달과 관련된 다른 1형 수용체인 Alk5 및 Alk2는 검출될 수 없었다. ActRIIA 활성은 수용체 헤테로다량체화 (예컨대, 조절 Smads의 인산화)의 효과를 측정하는 것에 의해 평가하였다. CKD-3는 대동맥 포스포스마드 2/3 수준 (활성화된 smad 2/3)을 감소시켰고, mActRIIA-Fc는 이들을 CKD-3V와 필적하게 증가시켰다(도 27a, b). 비정규 ActRIIA 신호전달 (도 34)도 또한 에세이하였다: (1) 맵 키나제(포스포-Erk1/2)는 CKD에 의해 감소되었고 mActRIIA-Fc에 의해서 더 영향을 받지 않았으며 (도 27a), 또 (2) p38 및 JNK의 혈관 평활근 수준은 매우 낮았다. 또한, mActRIIA-Fc p-AKT 수준은 영향을 받지 않고 유지되었고, 이는 대동맥 AKT/PI3 키나제가 ActRIIA 신호전달에 의해 영향을 받지 않았음을 나타내었다. 대동맥 ActRIIA 신호전달 (포스포스마드 3)은 CKD에 의해 감소되었고 ActRIIA 리간드 트랩에 의해 죽상동맥경화 대동맥에서 골아세포 전이의 억제와 관련된 ActRIIA 리간드 트랩에 의해 자극되었다 (도 25a, b, c).

다른 비-정규 ActRIIA 신호전달 경로, Wnt 경로를 조사하였다 (도 34). Wnt 신호전달은 대동맥 내피와 VSMC 사이에서 상이하게 조절되는 것으로 보였다. 주요한 정규 Wnt 유도된 전사 인자인 대동맥 β-카테닌은 내피 세포에 대한 면역형광에 의해 국재화(localized)되었고 VSMC으로는 검출될 수 없었다 (도 28a, b). Dkk1 수준은 VSMC에 의해 Wnt 활성의 바이오마커로 에세이하였다. CKD는 VSMC Dkk1 수준을 증가시켰고 mActRIIA-Fc 치료는 CKD-3 마우스에서 Dkk1 수준을 감소시켰다 (도 28d). mActRIIA-Fc에 의한 대동맥 Dkk1 수준의 증가는 혈관 평활근 Wnt 신호전달이 ActRIIA 리간드 트랩에 의해 억제되었음을 나타낸다. 또한, 아래에 나타낸 바와 같이 신장 Wnt 활성을 감소시키는 ActRIIA 리간드 트랩의 효과는 순환 Dkk1 수준에서 큰 감소를 초래한다 (도 28e). 전신적 Dkk1 감소는 내피에 영향을 줄 가능성이 많았다. 이는 내피에서 Wnt 신호전달 증가를 초래하였고, 베타-카테닌은 대동맥 Axin2 수준에서의 증가로 나타낸 바와 같이 증가하였다 (도 28c). Axin2는 베타-카테닌에 의해 자극된 최초기(immediate early gene) 유전자이고 Wnt 신호전달 평가를 위해 흔히 사용된다. (Mao J, Wang J, Liu B, et al. Mol. Cell 2001; 7: 801-809).

9.10.2.5 α클로토 및 신장 ActRIIA 신호전달에 대한 ActRIIA 리간드 트랩의 효과

신장 α클로토 수준 및 CKD-3과 mActRIIA-Fc 치료의 효과를 조사하였다. 도 29a에 도시된 바와 같이, mActRIIA-Fc 치료에 의해 신장 α클로토 수준의 상당한 증가가 유도되었다. 신장 ActRIIA 수준 및 ActRIIA 신호전달을 조사하였다. 신장 ActRIIA 수준은 CKD-3에 의해 영향을 받지 않았다 (도 29b). 일차 ActRIIA 리간드, 액티빈 A,는 CKD-3 마우스에서 강하게 유도되었고 mActRIIA-Fc 치료에 의해 억제되었다 (도 31a-d). 유용 포스포-Alk 항체의 결여는 I형 수용체 활성화의 검출을 손상시켰고, 면역침강시키기 위하여 포스포세린 항체를 필요로 하였다. 항-Alk 항체를 사용하여 침전물의 면역블럿을 실시하였다. Alk4 인산화는 CKD-3 모델의 병든 신장에서 또는 mActRIIA-Fc 치료에 의해 그다지 변경되지 않았다 (도 29b). 그러나, 신장 포스포스마드 2/3는 CKD-3에 의해 증가되었고 mActRIIA-Fc에 의해 감소되었는데, 이는 ActRIIA를 통하여 매개된 CKD에서 신장 Smad 2/3 활성화의 성분이 Alk4와는 다른 Alk를 포함함을 나타낸다 (도 29c).

ActRIIA 리간드 트랩의 효과를 신장 섬유화로 조사하였다. 도 30a-d는 CKD-3V 치료된 마우스(도 30a 및 도 30b)와 비교할 때 CKD-3 mActRIIA-Fc 치료된 마우스로부터 얻은 트리크롬 염색된 신장 피질 부분에서 신장 섬유화 감소를 나타낸다(도 30c 및 도 30d). 도 35a-d는 저배율 관상 신장 부분을 도시하며, 화살표는 도 30a-d에서 고전력 부분을 취한 것을 확인하며 화살표 촉은 전기소작법 신장 손상으로부터 상처 반응을 식별한다. mActRIIA-Fc는 상처 치유에서 액티빈의 역할과 일치하게 상처 반응을 감소시켰다. 또한, mActRIIA-Fc는 신장 포스포스마드 2/3 및 mActRIIA-Fc 치료에 의해 유도된 섬유화에서의 감소와 일치하게 CKD-3에 의해 자극된 단백뇨증을 감소시켰다 (도 30e).

9.10.2. 6 CKD에서 잠재적 ActRIIA 리간드

수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 액티빈 A 및 B, 성장 및 분화 인자 11 (GDF11), 뼈 형태형성 단백질 9 및 10 (BMP9 및 10), 및 BMP7과 같은 기타 BMP를 비롯한 다수의 잠재적 ActRIIA 리간드가 있다. 그러나, 일차 ActRIIA 리간드는 액티빈이다. CKD의 2개 모델을 이용하여, 전신 순환 액티빈 A 수준은 ldlr -/- 절제성 CKD 모델에서 10배 상승하였고 Col4A5 알포트 증후군 마우스 모델에서는 5배 상승하였다 (도 31a, b). 액티빈 B, GDF11, 및 BMP9 수준은 이들 모델에서 CKD에 의해 영향을 받지 않았다. 생리적으로, 순환계에는 소량의 자유 액티빈이 있을 것으로 생각되었다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 이는 액티빈 수준과 화학양론적 동일한 억제제 수준에 기인한 것일 수 있다. 액티빈은 순환성 억제 인자, 폴리스타틴 및 폴리스타틴 유사 3 (fstL3)(Welt C, et al. Experimental Biol. and Med. 2002; 227: 724-752)그리고 순환 수준 (도 36a, b) 및 조직 수준이 CKD-3에 의해 영향을 받지 않거나 감소되지 않는 인히빈과 관련된다. 순환계에서 액티빈 A 수준 (>5000 pg/ml) 대비 폴리스타틴, fstL3, 및 인히빈의 화학양론 (예컨대, 620 pg/ml + 미측정 인히빈의 400 pg/ml의 합(Sharpe RM, et al. J. Andrology 1999; 20: 94-101))은 CKD가 병리 사례인 상당한 자유 액티빈 수준을 생성하여, 액티빈 A를 CKD에서 활성 순환 인자로 만드는 것을 제시한다. 이 데이터는 신장병이 혈관 ActRIIA를 하향조절할 수 있는 하나 이상의 순환 ActRIIA 리간드를 생성함을 나타낸다.

순환 액티빈 증가원을 확인하기 위하여 액티빈 A (인히빈 베타 A (Inhba)의 동종이량체)에 대한 ldlr -/- 죽상동맥경화성 석회화 모델로부터 신장 조직을 에세이하였다. Inhba mRNA는 신장에서 CKD에 의해 증가하였고 (도 31c) 또 액티빈 (인히빈 β-A) 단백질 수준은 증가하였다 (도 31d). 신장 액티빈 발현은 CKD-3 마우스의 뇨세관주위 근섬유아세포에서 확인되었다 (도 32a, b).

9.10.3 결론

이 실시예는 mActRIIA-Fc가 인산화된 Smad2/3의 수준에 의해 평가된 대동맥 ActRIIA 신호전달을 증가시킴을 나타낸다. 또한, mActRIIA-Rc 치료는 CKD-유도된 혈관 평활근 탈분화, 골아세포 전이 및 네오인티말 플라크(neointimal plaque) 석회화를 반전시켰다. 병든 신장에서, mActRIIA-Fc는 ActRIIA 신호전달을 자극하기 보다는 억제시켰고 신장 섬유화 및 단백뇨증을 감소시켰다. mActRIIA-Fc 치료는 신장 및 순환 Dkk1 수준을 감소시켰고, 이는 Wnt 활성화가 ActRIIA의 하류에 있음을 나타낸다. 이 실시예는 CKD에서 ActRIIA 신호전달 장애가 CKD-MBD 및 신장 섬유화에 기여하며, ActRIIA 신호전달을 CKD에서 치료 표적으로 확인함을 나타내고, 또 액티빈 리간드 트랩 (예컨대, mActRIIA-Fc)이 CKD 치료에 이용될 수 있음을 나타낸다.

10. 서열의 설명

서열 (SEQ ID NO:)	설명	서열
1	인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드	MGAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLAYLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQEVVVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAGCVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL
2	인간 ActRIIA 가용성 (세포외), 가공된 폴리펩티드 서열	ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP
3	인간 ActRIIA 가용성 (세포외), C-말단 15개 아미노산이 결실된 가공된 폴리펩티드 서열	ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM
4	인간 ActRIIA 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열	GTTGGCCTTAAAATTTGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGGTACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCGAAAGGGATGCATTTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTCTCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAGGAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGCATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAATGGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCCAGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAACAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAATGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA
5	인간 ActRIIA 가용성 (세포외) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열	ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC
6	Fc 도메인에 융합된 ActRIIA의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질	THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDX1VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKX2VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNX3HYTQKSLSLSPGK* (여기서, X1은 D 또는 A이고; X2는 K 또는 A이며; 또 X3은 N 또는 A임)
7	인간 Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIA의 세포외 도메인	ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8	꿀벌 멜리틴의 리더 서열 (HBML)	MKFLVNVALVFMVVYISYIYA
9	조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA)의 리더 서열	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP
10	천연 ActRIIA 리더	MGAAAKLAFAVFLISCSSGA
11	ActRIIA-hFc 및 mActRIIA-Fc N-말단서열	ILGRSETQE
12	ActRIIA의 세포외 도메인의 C-말단 15개 아미노산이 결실된 ActRIIA-Fc 단백질	ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
13	TPA 리더 서열을 갖는 미가공(unprocessed) ActRIIA-hFc	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
14	TPA 리더 서열을 갖는, 미가공 ActRIIA-hFc를 코딩하는 핵산 서열	ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGTAAATGAGAATTC
15	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 4개 아미노산이 결실되며(서열 28의 아미노산 25-130), L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGP EVTYEPPP
16	인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (A64)	MTAPWVALALLWGSLWPGSGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI
17	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 19-134)	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
18	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), C-말단 15개 아미노산이 결실된 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 19-119)	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA
19	인간 ActRIIB (A64) 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열	GGCTGTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGACACCCACGGACAGGTAGGCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACTTCCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTGCTGTGGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATGAGTACATGCTGCCCTTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGAGGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCACAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAAGATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTTTGTGTGACCATCGAGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGCTGTGTGGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCGGACTGTCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCCCTAAAGAGTCAAGCATCTAA
20	Fc 도메인에 융합된 ActRIIB (A64; 서열 17)의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
21	Fc 도메인에 융합된, C-말단 15개 아미노산이 결실된 ActRIIB (A64)의 가용성 세포외 도메인(서열 18)을 포함하는 융합 단백질	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
22	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 5개 아미노산이 결실되며 (서열 28의 아미노산 25-129) L79D 돌연변이를 갖는가공된 폴리펩티드 서열	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPP
23	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되며(서열 28의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPT
24	EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되며 (서열 28의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이와 TPA 리더 서열을 갖는 미가공 ActRIIB-Fc 융합 단백질	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
25	EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되며(서열 28의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이를 갖는 가공된 ActRIIB-Fc 융합 단백질	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
26	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
27	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), C-말단 15개 아미노산이 결실된 가공된 폴리펩티드 서열(서열 16의 아미노산 20-119)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE A
28	인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (R64)	MTAPWVALALLWGSLWPGSGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTLLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMSRGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI
29	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 19-134)	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
30	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), C-말단 15개 아미노산이 결실된 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 19-119)	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA
31	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
32	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), C-말단 15개 아미노산이 결실된 가공된 폴리펩티드 서열(서열 28의 아미노산 20-119)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPE A
33	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되며(서열 16의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPT
34	EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되는(서열 16의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이와 TPA 리더 서열을 갖는 미가공 ActRIIB-Fc 융합 단백질	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
35	EC 도메인의 N-말단 6개 아미노산이 결실되고 EC 도메인의 C-말단 3개 아미노산이 결실되며(서열 16의 아미노산 25-131) L79D 돌연변이를 갖는 가공된 ActRIIB-Fc 융합 단백질	ETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
36	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
37	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
38	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), Fc 도메인에 융합된 L79D 돌연변이와 GGG 링커를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
39	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), Fc 도메인에 융합된 L79D 돌연변이를 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 20-134)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
40	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), Fc 도메인에 융합된 L79D 돌연변이를 갖고 TPA 리더 서열을 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 28의 아미노산 20-134)	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
41	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), Fc 도메인에 융합된 L79D 돌연변이를 갖고 TPA 리더 서열을 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (서열 16의 아미노산 20-134)	MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
42	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), 변이체 C-말단 서열을 갖는 가공된 폴리펩티드 서열 (WO2007/053775호에 기재)	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE
43	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), L79D 돌연변이를 갖는 변이체 C-말단 서열 (WO2007/053775호에 기재)을 갖는 가공된 폴리펩티드 서열	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE
44	인간 ActRIIB 가용성 (세포외), Fc 도메인에 융합된 L79D 돌연변이를 갖고 TGGG 링커를 갖는 변이체 C-말단 서열 (WO2007/053775호에 기재)을 갖는 가공된 폴리펩티드 서열	GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWASTTIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHETGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
45	서열 24를 코딩하는 핵산 서열	TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA
46	Fc 도메인에 융합된 ActRIIB (R64; 서열 29)의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
47	Fc 도메인에 융합된, C-말단 15 아미노산 결실된(서열 30) ActRIIB (R64)의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질	SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
48	Runx2 qRT-PCR 프라이머 1	CCGCACGACAACCGCACCAT
49	Runx2 qRT-PCR 프라이머 2	CGCTCCGGCCCACAAATCTC
50	Alp qRT-PCR 프라이머 1	ACGTGGCTAAGAATGTCATC
51	Alp qRT-PCR 프라이머 2	CTGGTAGGCGATGTCCTTA
52	오스테릭스 qRT-PCR 프라이머 1	TAGTGGTTTGGGGTTTGTTTACCGC
53	오스테릭스 qRT-PCR 프라이머 2	AACCAAATAACTCTTATTCCCTAAGT
54	클로토 qRT-PCR 프라이머 1	GCTCTCAAAGCCCACATACTG
55	클로토 qRT-PCR 프라이머 1	GCAGCATAACGATAGAGGCC
56	Sm22-알파 qRT-PCR 프라이머 1	GTTCCAGACTGTTGACCTCTTT
57	Sm22-알파 qRT-PCR 프라이머 2	CTGCGCTTTCTTCATAAACC
58	인간 Runx2 mRNA	TTTACTTCATGTTTACAAATAACTGTTTGCTTTTTAATGCAGTACTTTGAAATATATCAGCCAAAACCATAACTTACAATAATTTCTTAGGTATTCTGAATAAAATTCCATTTCTTTTGGATATGCTTTACCATTCTTAGGTTTCTGTGGAACAAAAATATTTGTAGCATTTTGTGTAAATACAAGCTTTCATTTTTATTTTTTCCAATTGCTATTGCCCAAGAATTGCTTTCCATGCACATATTGTAAAAATTCCGCTTTGTGCCACAGGTCATGATTGTGGATGAGTTTACTCTTAACTTCAAAGGGACTATTTGTATTGTATGTTGCAACTGTAAATTGAATTATTTGGCATTTTTCTCATGATTGTAATATTAATTTGAAGTTTGAATTTAATTTTCAATAAAATGGCTTTTTTGGTTTTGTTA
59	인간 Alp mRNA	CTGCCCTTTGGCCAACAGGGTAGATTTCTCTTGGGCAGGCAGAGAGTACAGACTGCAGACATTCTCAAAGCCTCTTATTTTTCTAGCGAACGTATTTCTCCAGACCCAGAGGCCCTGAAGCCTCCGTGGAACATTCTGGATCTGACCCTCCCAGTCTCATCTCCTGACCCTCCCACTCCCATCTCCTTACCTCTGGAACCCCCCAGGCCCTACAATGCTCATGTCCCTGTCCCCAGGCCCAGCCCTCCTTCAGGGGAGTTGAGGTCTTTCTCCTCAGGACAAGGCCTTGCTCACTCACTCACTCCAAGACCACCAGGGTCCCAGGAAGCCGGTGCCTGGGTGGCCATCCTACCCAGCGTGGCCCAGGCCGGGAAGAGCCACCTGGCAGGGCTCACACTCCTGGGCTCTGAACACACACGCCAGCTCCTCTCTGAAGCGACTCTCCTGTTTGGAACGGCAAAAAAAAATTTTTTTTTCTCTTTTTGGTGGTGGTTAAAAGGGAACACAAAACATTTAAATAAAACTTTCCAAATATTTCCGAGGACAAAAAAAAAAA
60	인간 오스테릭스 mRNA	CATTGTGGAATGGAAGGGATCATGCCCTTTGTGGAGTCTTTTTTTTTTAATTTAATAAATAAAAGTTGGATTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
61	인간 클로토 mRNA	TCTGAATAACACTGGATTTGTTTCTGTGATCTCTGAGGTCTATTTTATGTTTTTGCTGCTACTTCTGTGGAAGTAGCTTTGAACTAGTTTTACTTTGAACTTTCACGCTGAAACATGCTAGTGATATCTAGAAAGGGCTAATTAGGTCTCATCCTTTAATGCCCCTTAAATAAGTCTTGCTGATTTTCAGACAGGGAAGTCTCTCTATTACACTGGAGCTGTTTTATAGATAAGTCAATATTGTATCAGGCAAGATAAACCAATGTCATAACAGGCATTGCCAACCTCACTGACACAGGGTCATAGTGTATAATAATATACTGTACTATATAATATATCATCTTTAGAGGTATGATTTTTTCATGAAAGATAAGCTTTTGGTAATATTCATTTTAAAGTGGACTTATTAAAATTGGATGCTAGAGAATCAAGTTTATTTTATGTATATATTTTTCTGATTATAAGAGTAATATATGTTCATTGTAAAAATTTTTAAAACACAGAAACTATATGCAAAGAAAAAATAAAAATTATCTATAATCTCAGAACCCAGAAATAGCCACTATTAACATTTCCTACGTATTTTATTTTACATAGATCATATTGTATATAGTTAGTATCTTTATTAATTTTTATTATGAAACTTTCCTTTGTCATTATTAGTCTTCAAAAGCATGATTTTTAATAGTTGTTGAGTATTCCACCACAGGAATGTATCACAACTTAACCGTTCCCGTTTGTTAGACTAGTTTCTTATTAATGTTGATGAATGTTGTTTAAAAATAATTTTGTTGCTACATTTACTTTAATTTCCTTGACTGTAAAGAGAAGTAATTTTGCTCCTTGATAAAGTATTATATTAATAATAAATCTGCCTGCAACTTTTTGCCTTCTTTCATAATC
62	인간 Sm22-알파 mRNA	GAGGGAAAGCATGTCATTGGCCTTCAGATGGGCAGCAACAGAGGGGCCTCCCAGGCCGGCATGACAGGCTACGGACGACCTCGGCAGATCATCAGTTAGAGCGGAGAGGGCTAGCCCTGAGCCCGGCCCTCCCCCAGCTCCTTGGCTGCAGCCATCCCGCTTAGCCTGCCTCACCCACACCCGTGTGGTACCTTCAGCCCTGGCCAAGCTTTGAGGCTCTGTCACTGAGCAATGGTAACTGCACCTGGGCAGCTCCTCCCTGTGCCCCCAGCCTCAGCCCAACTTCTTACCCGAAAGCATCACTGCCTTGGCCCCTCCCTCCCGGCTGCCCCCATCACCTCTACTGTCTCCTCCCTGGGCTAAGCAGGGGAGAAGCGGGCTGGGGGTAGCCTGGATGTGGGCCAAGTCCACTGTCCTCCTTGGCGGCAAAAGCCCATTGAAGAAGAACCAGCCCAGCCTGCCCCCTATCTTGTCCTGGAATATTTTTGGGGTTGGAACTCAAAAAAAAAAAAAAAAAATCAATCTTTTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
63	인간 Runx2 단백질	MASNSLFSTVTPCQQNFFWDPSTSRRFSPPSSSLQPGKMSDVSPVVAAQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQEAAAAAAAAAAAAAAAAAVPRLRPPHDNRTMVEIIADHPAELVRTDSPNFLCSVLPSHWRCNKTLPVAFKVVALGEVPDGTVVTVMAGNDENYSAELRNASAVMKNQVARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPPQVATYHRAIKVTVDGPREPRRHRQKLDDSKPSLFSDRLSDLGRIPHPSMRVGVPPQNPRPSLNSAPSPFNPQGQSQITDPRQAQSSPPWSYDQSYPSYLSQMTSPSIHSTTPLSSTRGTGLPAITDVPRRISDDDTATSDFCLWPSTLSKKSQAGASELGPFSDPRQFPSISSLTESRFSNPRMHYPATFTYTPPVTSGMSLGMSATTHYHTYLPPPYPGSSQSQSGPFQTSSTPYLYYGTSSGSYQFPMVPGGDRSPSRMLPPCTTTSNGSTLLNPNLPNQNDGVDADGSHSSSPTVLNSSGRMDESVWRPY
64	인간 Alp 단백질	MISPFLVLAIGTCLTNSLVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAKNVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIVTTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMGGGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTELLTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVEGGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGYTPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQAQSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCAPASSAGSLAAGPLLLALALYPLSVLF
65	인간 오스테릭스 단백질	MASSLLEEEVHYGSSPLAMLTAACSKFGGSSPLRDSTTLGKAGTKKPYSVGSDLSASKTMG일PAPFTSTNGLLSPAGSPPAPTSGYANDYPPFSHSFPGPTGTQDPGLLVPKGHSSSDCLPSVYTSLDMTHPYGSWYKAGIHAGISPGPGNTPTPWWDMHPGGNWLGGGQGQGDGLQGTLPTGPAQPPLNPQLPTYPSDFAPLNPAPYPAPHLLQPGPQHVLPQDVYKPKAVGNSGQLEGSGGAKPPRGASTGGSGGYGGSGAGRSSCDCPNCQELERLGAAAAGLRKKPIHSC둔부GCGKVYGKASHLKAHLRWHTGERPFVCNWLFCGKRFTRSDELERHVRTHTREKKFTCLLCSKRFTRSDHLSKHQRTHGEPGPGPPPSGPKELGEGRSTGEEEASQTPRPSASPATPEKAPGGSPEQSNLLEI
66	인간 클로토 단백질	MPASAPPRRPRPPPPSLSLLLVLLGLGGRRLRAEPGDGAQTWARFSRPPAPEAAGLFQGTFPDGFLWAVGSAAYQTEGGWQQHGKGASIWDTFTHHPLAPPGDSRNASLPLGAPSPLQPATGDVASDSYNNVFRDTEALRELGVTHYRFSISWARVLPNGSAGVPNREGLRYYRRLLERLRELGVQPVVTLYHWDLPQRLQ일GGWANRALADHFRDYAELCFRHFGGQVKYWITIDNPYVVAWHGYATGRLAPGIRGSPRLGYLVAHNLLLAHAKVWHLYNTSFRPTQGGQVSIALSSHWINPRRMTDHSIKECQKSLDFVLGWFAKPVFIDGDYPESMKNNLSSILPDFTESEKKFIKGTADFFALCFGPTLSFQLLDPHMKFRQLESPNLRQLLSWIDLEFNHPQIFIVENGWFVSGTTKRDDAKYMYYLKKFIMETLKAIKLDGVDVIGYTAWSLMDGFEWHRGYSIRRGLFYVDFLSQDKMLLPKSSALFYQKLIEKNGFPPLPENQPLEGTFPCDFAWGVVDNYIQVDTTLSQFTDLNVYLWDVHHSKRLIKVDGVVTKKRKSYCVDFAAIQPQIALLQEMHVTHFRFSLDWALILPLGNQSQVNHTILQYYRCMASELVRVNITPVVALWQPMAPNQGLPRLLARQGAWENPYTALAFAEYARLCFQELGHHVKLWITMNEPYTRNMTYSAGHNLLKAHALAWHVYNEKFRHAQNGKISIALQADWIEPACPFSQKDKEVAERVLEFDIGWLAEPIFGSGDYPWVMRDWLNQRNNFLLPYFTEDEKKLIQGTFDFLALSHYTTILVDSEKEDPIKYNDYLEVQEMTDITWLNSPSQVAVVPWGLRKVLNWLKFKYGDLPMYIISNGIDDGLHAEDDQLRVYYMQNYINEALKAHILDGINLCGYFAYSFNDRTAPRFGLYRYAADQFEPKASMKHYRKIIDSNGFPGPETLERFCPEEFTVCTECSFFHTRKSLLAFIAFLFFASIISLSLIFYYSKKGRRSYK
67	인간 Sm22-알파 단백질	MANKGPSYGMSREVQSKIEKKYDEELEERLVEWIIVQCGPDVGRPDRGRLGFQVWLKNGVILSKLVNSLYPDGSKPVKVPENPPSMVFKQMEQVAQFLKAAEDYGVIKTDMFQTVDLFEGKDMAAVQRTLMALGSLAVTKNDGHYRGDPNWFMKKAQEHKREFTESQLQEGKHVIGLQMGSNRGASQAGMTGYGRPRQIIS
68	인간 알파-SMA 단백질	MCEEEDSTALVCDNGSGLCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHSFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGY알파IMRLDLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNVLSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDEAGPSIVHRKCF
69	인간 MYOCD 단백질	MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDTPSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLPPNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTLPNYQSSSSTSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASSDLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPVHVCTEESLMSSLNGGSVPSELDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQKQKRNNCSEKKPLPFLAASIKQEEAVSSCPFASQVPVKRQSSSSECHPPACEAAQLQPLGNAHCVESSDQTNVLSSTFLSPQCSPQHSPLGAVKSPQHISLPPSPNNPHFLPSSSGAQGEGHRVSSPISSQVCTAQNSGAHDGHPPSFSPHSSSLHPPFSGAQADSSHGAGGNPCPKSPCVQQKMAGLHSSDKVGPKFSIPSPTFSKSSSAISEVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW
70	인간 알파-SMA mRNA	GCCGAGATCTCACTGACTACCTCATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTATTCCTTCGTTACTACTGCTGAGCGTGAGATTGTCCGGGACATCAAGGAGAAACTGTGTTATGTAGCTCTGGACTTTGAAAATGAGATGGCCACTGCCGCATCCTCATCCTCCCTTGAGAAGAGTTACGAGTTGCCTGATGGGCAAGTGATCACCATCGGAAATGAACGTTTCCGCTGCCCAGAGACCCTGTTCCAGCCATCCTTCATCGGGATGGAGTCTGCTGGCATCCATGAAACCACCTACAACAGCATCATGAAGTGTGATATTGACATCAGGAAGGACCTCTATGCTAACAATGTCCTATCAGGGGGCACCACTATGTACCCTGGCATTGCCGACCGAATGCAGAAGGAGATCACGGCCCTAGCACCCAGCACCATGAAGATCAAGATCATTGCCCCTCCGGAGCGCAAATACTCTGTCTGGATCGGTGGCTCCATCCTGGCCTCTCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAACAGGAATACGATGAAGCCGGGCCTTCCATTGTCCACCGCAAATGCTTCTAAAACACTTTCCTGCTCCTCTCTGTCTCTAGCACACAACTGTGAATGTCCTGTGGAATTATGCCTTCAGTTCTTTTCCAAATCATTCCTAGCCAAAGCTCTGACTCGTTACCTATGTGTTTTTTAATAAATCTGAAATAGGCTACTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
71	인간 MYOCD mRNA	GGAAGCTTTTTTAATGTTTTCCAAAGGAAAGGAACCCACACTGCTCCCCAGAGTTCCTTTCCAATGGCCCTGCAGTAAGAACGGAGGACAATGTATTGCTGGGTGCTTAAAATCCTCCCTCAGTGAAGCACAAAGAGACACTTTGTAAAGAAAAAAAGAGCAAGCATAGGTTCTCTGTGGGACCTTGTGGAGTGGTGTTTTCACGTTGGTCTCTTTGGCTCAATTGAGCATAATCAGAAAGAAATGTGGGTTATTGGGAAGAGACAAAAAGCAGTGGCTAAAATACCAAAGTTGGCATGTGTTCTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAATGCATATATTTTTAAATAAAATGTTTATTTTAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA
72	인간 BSAP 단백질	MISPFLVLAIGTCLTNSLVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAKNVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIVTTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMGGGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTELLTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVEGGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGYTPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQAQSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCAPASSAGSLAAGPLLLALALYPLSVLF
73	인간 BSAP mRNA	CTGCCCTTTGGCCAACAGGGTAGATTTCTCTTGGGCAGGCAGAGAGTACAGACTGCAGACATTCTCAAAGCCTCTTATTTTTCTAGCGAACGTATTTCTCCAGACCCAGAGGCCCTGAAGCCTCCGTGGAACATTCTGGATCTGACCCTCCCAGTCTCATCTCCTGACCCTCCCACTCCCATCTCCTTACCTCTGGAACCCCCCAGGCCCTACAATGCTCATGTCCCTGTCCCCAGGCCCAGCCCTCCTTCAGGGGAGTTGAGGTCTTTCTCCTCAGGACAAGGCCTTGCTCACTCACTCACTCCAAGACCACCAGGGTCCCAGGAAGCCGGTGCCTGGGTGGCCATCCTACCCAGCGTGGCCCAGGCCGGGAAGAGCCACCTGGCAGGGCTCACACTCCTGGGCTCTGAACACACACGCCAGCTCCTCTCTGAAGCGACTCTCCTGTTTGGAACGGCAAAAAAAAATTTTTTTTTCTCTTTTTGGTGGTGGTTAAAAGGGAACACAAAACATTTAAATAAAACTTTCCAAATATTTCCGAGGACAAAAAAAAAAA
74	Snai1 mRNA	TGATGAAGACCATTTTCTGGTTCTGTGTCCTCTGCCTGGGCTCTGGAAGAGGCCTTCCCATGGCCATTTCTGTGGAGGGAGGGCAGCTGGCCCCCAGCCCTGGGGGATTCCTGAGCTGGCCTGTCTGCGTGGGTTTTTGTATCCAGAGCTGTTTGGATACAGCTGCTTTGAGCTACAGGACAAAGGCTGACAGACTCACTGGGAAGCTCCCACCCCACTCAGGGGACCCCACTCCCCTCACACACACCCCCCCACAAGGAACCCTCAGGCCACCCTCCACGAGGTGTGACTAACTATGCAATAATCCACCCCCAGGTGCAGCCCCAGGGCCTGCGGAGGCGGTGGCAGACTAGAGTCTGAGATGCCCCGAGCCCAGGCAGCTATTTCAGCCTCCTGTTTGGTGGGGTGGCACCTGTTTCCCGGGCAATTTAACAATGTCTGAAAAGGGACTGTGAGTAATGGCTGTCACTTGTCGGGGGCCCAAGTGGGGTGCTCTGGTCTGACCGATGTGTCTCCCAGAACTATTCTGGGGGCCCGACAGGTGGGCCTGGGAGGAAGATGTTTACATTTTTAAAGGTACACTGGTATTTATATTTCAAACATTTTGTATCAAGGAAACGTTTTGTATAGTTATATGTACAGTTTATTGATATTCAATAAAGCAGTTAATTTATATATTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
75	Dkk1 mRNA	AACTCAATCCTAAGGATATACAAGTTCTGTGGTTTCAGTTAAGCATTCCAATAACACCTTCCAAAAACCTGGAGTGTAAGAGCTTTGTTTCTTTATGGAACTCCCCTGTGATTGCAGTAAATTACTGTATTGTAAATTCTCAGTGTGGCACTTACCTGTAAATGCAATGAAACTTTTAATTATTTTTCTAAAGGTGCTGCACTGCCTATTTTTCCTCTTGTTATGTAAATTTTTGTACACATTGATTGTTATCTTGACTGACAAATATTCTATATTGAACTGAAGTAAATCATTTCAGCTTATAGTTCTTAAAAGCATAACCCTTTACCCCATTTAATTCTAGAGTCTAGAACGCAAGGATCTCTTGGAATGACAAATGATAGGTACCTAAAATGTAACATGAAAATACTAGCTTATTTTCTGAAATGTACTATCTTAATGCTTAAATTATATTTCCCTTTAGGCTGTGATAGTTTTTGAAATAAAATTTAACATTTAATATCATGAAATGTTATAAGTAGACATACATTTTGGGATTGTGATCTTAGAGGTTTGTGTGTGTGTACGTATGTGTGTGTTCTACAAGAACGGAAGTGTGATATGTTTAAAGATGATCAGAGAAAAGACAGTGTCTAAATATAAGACAATATTGATCAGCTCTAGAATAACTTTAAAGAAAGACGTGTTCTGCATTGATAAACTCAAATGATCATGGCAGAATGAGAGTGAATCTTACATTACTACTTTCAAAAATAGTTTCCAATAAATTAATAATACCTAAAAAAAAAAA
76	Col1a1 mRNA	CCCTTCGTTTTTGAGGGGGTCATGCCGGGGGAGCCACCAGCCCCTCACTGGGTTCGGAGGAGAGTCAGGAAGGGCCACGACAAAGCAGAAACATCGGATTTGGGGAACGCGTGTCAATCCCTTGTGCCGCAGGGCTGGGCGGGAGAGACTGTTCTGTTCCTTGTGTAACTGTGTTGCTGAAAGACTACCTCGTTCTTGTCTTGATGTGTCACCGGGGCAACTGCCTGGGGGCGGGGATGGGGGCAGGGTGGAAGCGGCTCCCCATTTTATACCAAAGGTGCTACATCTATGTGATGGGTGGGGTGGGGAGGGAATCACTGGTGCTATAGAAATTGAGATGCCCCCCCAGGCCAGCAAATGTTCCTTTTTGTTCAAAGTCTATTTTTATTCCTTGATATTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGATGGGGACTTGTGAATTTTTCTAAAGGTGCTATTTAACATGGGAGGAGAGCGTGTGCGGCTCCAGCCCAGCCCGCTGCTCACTTTCCACCCTCTCTCCACCTGCCTCTGGCTTCTCAGGCCTCTGCTCTCCGACCTCTCTCCTCTGAAACCCTCCTCCACAGCTGCAGCCCATCCTCCCGGCTCCCTCCTAGTCTGTCCTGCGTCCTCTGTCCCCGGGTTTCAGAGACAACTTCCCAAAGCACAAAGCAGTTTTTCCCCCTAGGGGTGGGAGGAAGCAAAAGACTCTGTACCTATTTTGTATGTGTATAATAATTTGAGATGTTTTTAATTATTTTGATTGCTGGAATAAAGCATGTGGAAATGACCCAAACATAA
77	액티빈 A mRNA	CATTGAACCAGCAGTTACTTTTGGGACACTGACTTTTGCTCTCTGAAAGAAAAAAAAATAAATAAAACAACCAGTTTTGTTCTTTCTAAAGTTACTAAGAGCTCTCTGCCAAGGAACGAACCTTGACAAAGTACTCTCAGATACTACGCTGAAGTCACTCAATCTTAAGAGGAAGAAG
78	Snai1 프라이머 1	TCGGAAGCCTAACTACAGCGA
79	Snai1 프라이머 2	AGATGAGCATTGGCAGCGAG
80	Dkk1 프라이머 1	CCTTGAACTCGGTTCTCAATTCC
81	Dkk1 프라이머 2	CAATGGTCTGGTACTTATTCCCG
82	Col1a1 프라이머 1	GAGGGCCAAGACGAAGACATC
83	Col1a1 프라이머 2	CAGATCACGTCATCGCACAAC
84	액티빈 프라이머 1	TCATCACGTTTGCCGAGTCA
85	액티빈 프라이머 2	GCTAGTCCGCTACCATCACC
86	인간 Axin2 mRNA	TTTGTCATGACATTTTGTTCTACTTATACTGTAAATTATGCATTATAAAGAGTTCATTTAAGGAAAATTACTTGGTACAATAATTATTGTAATTAAGAGATGTAGCCTTTATTAAAATTTTATATTTTTCAAAAAAAAAAA
87	인간 Axin2 아미노산 서열	MSSAMLVTCLPDPSSSFREDAPRPPVPGEEGETPPCQPGVGKGQVTKPMPVSSNTRRNEDGLGEPEGRASPDSPLTRWTKSLHSLLGDQDGAYLFRTFLEREKCVDTLDFWFACNGFRQMNLKDTKTLRVAKAIYKRYIENNSIVSKQLKPATKTYIRDGIKKQQIDSIMFDQAQTEIQSVMEENAYQMFLTSDIYLEYVRSGGENTAYMSNGGLGSLKVVCGYLPTLNEEEEWTCADFKCKLSPTVVGLSSKTLRATASVRSTETVDSGYRSFKRSDPVNPYHIGSGYVFAPATSANDSEISSDALTDDSMSMTDSSVDGIPPYRVGSKKQLQREMHRSVKANGQVSLPHFPRTHRLPKEMTPVEPATFAAELISRLEKLKLELESRHSLEERLQQIREDEEREGSELTLNSREGAPTQHPLSLLPSGSYEEDPQTILDDHLSRVLKTPGCQSPGVGRYSPRSRSPDHHHHHHSQYHSLLPPGGKLPPAAASPGACPLLGGKGFVTKQTTKHVHHHYIHHHAVPKTKEEIEAEATQRVHCFCPGGSEYYCYSKCKSHSKAPETMPSEQFGGSRGSTLPKRNGKGTEPGLALPAREGGAPGGAGALQLPREEGDRSQDVWQWMLESERQSKPKPHSAQSTKKAYPLESARSSPGERASRHHLWGGNSGHPRTTPRAHLFTQDPAMPPLTPPNTLAQLEEACRRLAEVSKPPKQRCCVASQQRDRNHSATVQTGATPFSNPSLAPEDHKEPKKLAGVHALQASELVVTYFFCGEEIPYRRMLKAQSLTLGHFKEQLSKKGNYRYYFKKASDEFACGAVFEEIWEDETVLPMYEGRILGKVERID

표 21: 서열 정보

11. 균등물

본 발명은 특정 실시양태를 참조하여 자세하게 기재되었지만, 기능적 등가인 변형도 본 발명의 범위 내에 드는 것임을 이해해야 한다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 상술한 상세한 설명과 첨부한 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부한 특허청구범위 내에 포함되는 것이다. 당분야의 숙련자는 통상의 실험을 이용하여 본원에 기재된 발명의 특정 실시양태에 대한 수많은 등가물이 존재한다는 것을 인식하거나 통상적인 실험만을 통하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 이하의 특허청구범위에 의해 포괄되는 것으로 간주된다.

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각 개별 공보, 특허 또는 특허출원이 특이적으로 또 개별적으로 그 전문을 본원에 참고로 인용되는 것으로 기재한 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Celgene Corporation Washington University <120> TREATMENT OF CARDIOVASCULAR DISEASE USING ACTRII LIGAND TRAPS <130> 12827-934-228 <150> 62/062,021 <151> 2014-10-09 <150> 62/078,321 <151> 2014-11-11 <150> 62/103,515 <151> 2015-01-14 <150> 62/167,052 <151> 2015-05-27 <150> 62/170,015 <151> 2015-06-02 <160> 87 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human ActRIIA precursor polypeptide <400> 1 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val 145 150 155 160 Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln 165 170 175 Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190 Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys 195 200 205 Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln 210 215 220 Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His 435 440 445 Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His 450 455 460 Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr 465 470 475 480 Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr 485 490 495 Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser 500 505 510 Leu <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human ActRIIA soluble (extracellular), processed polypeptide sequence <400> 2 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro 115 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIA soluble (extracellular), processed polypeptide sequence with the C-terminal 15 amino acids deleted <400> 3 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met 100 <210> 4 <211> 1542 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> nucleic acid sequence encoding human ActRIIA precursor protein <400> 4 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccagagatg 360 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420 ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480 tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact agggttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt cgaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380 tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440 cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtctat ga 1542 <210> 5 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> nucleic acid sequence encoding a human ActRIIA soluble (extracellular) polypeptide <400> 5 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccagagatg 300 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345 <210> 6 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein comprising a soluble extracellular domain of ActRIIA fused to an Fc domain <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> Xaa = Asp or Ala <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> Xaa = Lys or Ala <220> <221> misc_feature <222> (215)..(215) <223> Xaa = Asn or Ala <400> 6 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Xaa Val Ser His Glu 35 40 45 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Lys Cys Lys Xaa Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 7 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular domain of human ActRIIA fused to a human Fc domain <400> 7 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 210 215 220 Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 245 250 255 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 305 310 315 320 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 325 330 335 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence of Honey bee mellitin (HBML) <400> 8 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence of Tissue Plasminogen Activator (TPA) <400> 9 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Native ActRIIA leader <400> 10 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala 20 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ActRIIA-hFc and mActRIIA-Fc N-terminal sequence <400> 11 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu 1 5 <210> 12 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ActRIIA-Fc Protein with deletion of the C-terminal 15 amino acids of the extracellular domain of ActRIIA <400> 12 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 130 135 140 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 13 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Unprocessed ActRIIA-hFc with TPA leader sequence <400> 13 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr 20 25 30 Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn 35 40 45 Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His 50 55 60 Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys 65 70 75 80 Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn Cys 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Val Glu Trp Glu 290 295 300 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 305 310 315 320 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 325 330 335 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 340 345 350 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 355 360 365 Lys <210> 14 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding Unprocessed ActRIIA-hFc with TPA leader sequence <400> 14 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg ccgctatact tggtagatca gaaactcagg agtgtctttt tttaatgcta 120 attgggaaaa agacagaacc aatcaaactg gtgttgaacc gtgttatggt gacaaagata 180 aacggcggca ttgttttgct acctggaaga atatttctgg ttccattgaa tagtgaaaca 240 aggttgttgg ctggatgata tcaactgcta tgacaggact gattgtgtag aaaaaaaaga 300 cagccctgaa gtatatttct gttgctgtga gggcaatatg tgtaatgaaa agttttctta 360 ttttccggag atggaagtca cacagcccac ttcaaatcca gttacaccta agccacccac 420 cggtggtgga actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc 480 agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 540 cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt 600 ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 660 gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 720 caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agtccccatc gagaaaacca tctccaaagc 780 caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 840 caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 900 ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 960 ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1020 ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 1080 gagcctctcc ctgtctccgg taaatgagaa ttc 1113 <210> 15 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence with the N-terminal 6 amino acids of the EC domain deleted and the C-terminal 4 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-130 of SEQ ID NO:28) and with an L79D mutation <400> 15 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 <210> 16 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human ActRIIB precursor protein sequence (A64) <400> 16 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Trp 1 5 10 15 Pro Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys 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(extracellular), processed polypeptide sequence with the C-terminal 15 amino acids deleted (amino acids 19-119 of SEQ ID NO:16) <400> 18 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala 100 <210> 19 <211> 1539 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> nucleic acid sequence encoding a human ActRIIB (A64) precursor protein <400> 19 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtggcc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggg ccaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gagcgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420 tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480 cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540 ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600 tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660 ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720 cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780 ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840 atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900 ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539 <210> 20 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein comprising a soluble extracellular domain of ActRIIB (A64; SEQ ID NO:17) fused to an Fc domain <400> 20 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 210 215 220 Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 245 250 255 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 22 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence with the N-terminal 6 amino acids of the EC domain deleted and the C-terminal 5 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-129 of SEQ ID NO:28) and with an L79D mutation <400> 22 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence with the N-terminal 6 amino acids of the EC domain deleted and the C-terminal 3 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-131 of SEQ ID NO:28) and with an L79D mutation <400> 23 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 <210> 24 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Unprocessed ActRIIB-Fc fusion protein with the N-terminal 6 amino acids of the EC domain deleted and the C-terminal 3 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-131 of SEQ ID NO:28) and with an L79D mutation and with TPA leader sequence <400> 24 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp 65 70 75 80 Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu 85 90 95 Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu 100 105 110 Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu 115 120 125 Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 130 135 140 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 165 170 175 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 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the C-terminal 3 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-131 of SEQ ID NO:28) and with an L79D mutation <400> 25 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45 Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60 Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly 85 90 95 Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His 100 105 110 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 130 135 140 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 145 150 155 160 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 165 170 175 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 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20-119 of SEQ ID NO:28) <400> 32 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala 100 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence with the N-terminal 6 amino acids of the EC domain deleted and the C-terminal 3 amino acids of the EC domain deleted (amino acids 25-131 of SEQ ID NO:16) and with an L79D mutation <400> 33 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg 20 25 30 Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala 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<213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence (amino acids 20-134 of SEQ ID NO:16) with L79D mutation <400> 37 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 110 Ala Pro Thr 115 <210> 38 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human ActRIIB soluble (extracellular), processed polypeptide sequence (amino acids 20-134 of SEQ ID NO:28) with L79D mutation fused to an Fc domain with a GGG linker <400> 38 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 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cagcagcaac agcagcagca gcaacagcag cagcagcagc agcaacagca gcagcagcag 420 caggaggcgg cggcggcggc tgcggcggcg gcggcggctg cggcggcggc agctgcagtg 480 ccccggttgc ggccgcccca cgacaaccgc accatggtgg agatcatcgc cgaccacccg 540 gccgaactcg tccgcaccga cagccccaac ttcctgtgct cggtgctgcc ctcgcactgg 600 cgctgcaaca agaccctgcc cgtggccttc aaggtggtag ccctcggaga ggtaccagat 660 gggactgtgg ttactgtcat ggcgggtaac gatgaaaatt attctgctga gctccggaat 720 gcctctgctg ttatgaaaaa ccaagtagca aggttcaacg atctgagatt tgtgggccgg 780 agtggacgag gcaagagttt caccttgacc ataaccgtct tcacaaatcc tccccaagta 840 gctacctatc acagagcaat taaagttaca gtagatggac ctcgggaacc cagaaggcac 900 agacagaagc ttgatgactc taaacctagt ttgttctctg accgcctcag tgatttaggg 960 cgcattcctc atcccagtat gagagtaggt gtcccgcctc agaacccacg gccctccctg 1020 aactctgcac caagtccttt taatccacaa ggacagagtc agattacaga ccccaggcag 1080 gcacagtctt ccccgccgtg gtcctatgac cagtcttacc cctcctacct gagccagatg 1140 acgtccccgt ccatccactc taccaccccg ctgtcttcca cacggggcac tgggcttcct 1200 gccatcaccg atgtgcctag gcgcatttca gatgatgaca ctgccacctc tgacttctgc 1260 ctctggcctt ccactctcag taagaagagc caggcaggtg cttcagaact gggccctttt 1320 tcagacccca ggcagttccc aagcatttca tccctcactg agagccgctt ctccaaccca 1380 cgaatgcact atccagccac ctttacttac accccgccag tcacctcagg catgtccctc 1440 ggtatgtccg ccaccactca ctaccacacc tacctgccac caccctaccc cggctcttcc 1500 caaagccaga gtggaccctt ccagaccagc agcactccat atctctacta tggcacttcg 1560 tcaggatcct atcagtttcc catggtgccg gggggagacc ggtctccttc cagaatgctt 1620 ccgccatgca ccaccacctc gaatggcagc acgctattaa atccaaattt gcctaaccag 1680 aatgatggtg ttgacgctga tggaagccac agcagttccc caactgtttt gaattctagt 1740 ggcagaatgg atgaatctgt ttggcgacca tattgaaatt cctcagcagt ggcccagtgg 1800 tatctggggg ccacatccca cacgtatcaa tatatacata tatagagaga gtgcatatat 1860 atgtatatcg attagctatc tacaaagtgc ctatttttta gaagattttt cattcactca 1920 ctcagtcatg atcttgcagc cataagaggg tagatattga gaagcagaag gctcaagaga 1980 gacaattgca atcgagcttc agattgttta ctatttaaga tgtactttta caaaggaaca 2040 aagaagggaa aaggtatttt tgtttttgtt gtttggtctg ttatcatcaa taacctgttc 2100 atatgccaat tcagagaggt ggactccagg ttcaggaggg agaagagcaa agccgcttcc 2160 tctctgtgct ttgaaacttc acaccctcac ggtggcagct gtgtatggac cagtgccctc 2220 cgcagacagc tcacaaaacc agttgaggtg cactaaaggg acatgaggta gaatggatgc 2280 ttccatcaca gtaccatcat tcagaataac tcttccaatt tctgctttca gacatgctgc 2340 aggtcctcat ctgaactgtt gggttcgttt tttttttttt ttttcctgct ccaagaaagt 2400 gacttcaaaa ataactgatc aggatagatt attttatttt actttttaac actccttctc 2460 cccttttccc actgaaccaa aaagaaatcc catccctaaa acctgccttc tccttttatg 2520 caaaactgaa aatggcaata cattattata gccataatgg tatagatagt gattgcgttt 2580 ggctatgtgt tgttttcttt ttttttaaat tatgaatatg tgtaaaatct gaggtaactt 2640 gctaacgtga atggtcatat aactttaaag atatatttat aattatttaa tgacatttgg 2700 acccttgaaa catttcttag tgtattgata tgttgacttc ggtctctaaa agtgctcttt 2760 attaaataac aaatttcttc agtggtctag agccatatct gaaatattgc taagcaattt 2820 cagttcatcc aggcacaatg tgattttaaa aaatacttcc atctccaaat attttagata 2880 tagattgttt ttgtgatgta tgaaggaaat gttatgttta gttctttcag atctttgaat 2940 gcctctaaca cagctttgcc ttctaaagcg gtaattaggg atttaaaaaa caacctttag 3000 ccctttatca gcatgaaatg ctggagtgat gtggttttct aatttctttg gggtaattat 3060 gactcttgtc atattaaaaa gacaagcaca agtaaatcat tgaactacag aaaaatgttc 3120 tgtggtttca tagttaagca aaactctaaa tcgccaggct tcatagcaaa gacatagtca 3180 gctaaaagcc gcacatgtgg atagagggtt caattatgag acacctagta caggagagca 3240 aaattgcacc agagattctt aaccaaccag ccttaccaaa caacacaaca ggggaacccc 3300 aatctgcctt acccaaggcc ccactggcag ctttccacag aatttgcatt tagaggagca 3360 gaatgacatc actgtccttt gggagtaggt cctctgaaaa ggcagcaggt tccagcaggt 3420 agctgagctg agaggacata tggcccacgg ggacctacag acagcctttg acatttgtat 3480 ttcttacaat ggagggccaa ggagggcaag gggctgtgga gtttggtgtc tactagtgtg 3540 tatgaatttg agctagagtc cttctgtggc atgcactttg accactcctg gcagtcacat 3600 ggcagatttc caagtgcaaa tccttaatcc aaacaaggat catctaatga caccaccagg 3660 ccaatccctg ctctcctccc cgaaaagtca gggtcccttc attggaatcc tccacccacc 3720 caagcagaat 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agtctatttt tattccttga 5520 tatttttctt tttttttttt tttttttgtg gatggggact tgtgaatttt tctaaaggtg 5580 ctatttaaca tgggaggaga gcgtgtgcgg ctccagccca gcccgctgct cactttccac 5640 cctctctcca cctgcctctg gcttctcagg cctctgctct ccgacctctc tcctctgaaa 5700 ccctcctcca cagctgcagc ccatcctccc ggctccctcc tagtctgtcc tgcgtcctct 5760 gtccccgggt ttcagagaca acttcccaaa gcacaaagca gtttttcccc ctaggggtgg 5820 gaggaagcaa aagactctgt acctattttg tatgtgtata ataatttgag atgtttttaa 5880 ttattttgat tgctggaata aagcatgtgg aaatgaccca aacataa 5927 <210> 77 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin A mRNA <400> 77 atgcccttgc tttggctgag aggatttctg ttggcaagtt gctggattat agtgaggagt 60 tcccccaccc caggatccga ggggcacagc gcggcccccg actgtccgtc ctgtgcgctg 120 gccgccctcc caaaggatgt acccaactct cagccagaga tggtggaggc cgtcaagaag 180 cacattttaa acatgctgca cttgaagaag agacccgatg tcacccagcc ggtacccaag 240 gcggcgcttc tgaacgcgat cagaaagctt catgtgggca aagtcgggga gaacgggtat 300 gtggagatag aggatgacat tggaaggagg gcagaaatga 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taagaggaag 1200 aag 1203 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snai1 primer 1 <400> 78 tcggaagcct aactacagcg a 21 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snai1 primer 2 <400> 79 agatgagcat tggcagcgag 20 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dkk1 primer 1 <400> 80 ccttgaactc ggttctcaat tcc 23 <210> 81 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dkk1 primer 2 <400> 81 caatggtctg gtacttattc ccg 23 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 primer 1 <400> 82 gagggccaag acgaagacat c 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col1a1 primer 2 <400> 83 cagatcacgt catcgcacaa c 21 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin primer 1 <400> 84 tcatcacgtt tgccgagtca 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin primer 2 <400> 85 gctagtccgc taccatcacc 20 <210> 86 <211> 4241 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human Axin2 mRNA <400> 86 actggctccg cgagcctggc ccgggggagt cggctggagc cggctgcgct ttgataaggt 60 cctggcaact cagtaacagc ccgagagccg ggaaataaaa ataacccctc agagcgatgg 120 atttcggggc cgcccggcgg ccgaggcgcc cgccgaaggc cctgctgtaa aagagaggag 180 gttcagatga gcccctgctg acttgagaga gacagagaga ccacgccgat tgctgagagg 240 aactggaaga agaaaaattc ccagactcag tgggaagagc tccctcacca tgagtagcgc 300 tatgttggtg acttgcctcc cggaccccag cagcagcttc cgtgaggatg ccccgcggcc 360 cccagtgcca ggggaagaag gggagacccc accgtgtcag ccaggggtgg gcaagggcca 420 ggtcaccaaa cccatgcctg tctcttccaa caccaggcgg aacgaagatg ggttggggga 480 gccggagggg cgggcatctc cggattcccc tctgacccgg tggaccaagt ccttacactc 540 cttattgggc gatcaagacg gtgcttacct gttccgaact ttcctggaga gggagaaatg 600 cgtggatacc ttagacttct ggtttgcctg caatggattc aggcagatga acctgaagga 660 taccaaaact ttacgagtag ccaaagcgat ctacaaaagg tacattgaga acaacagcat 720 tgtctccaag cagctgaagc ctgccaccaa gacctacata agagatggca tcaagaagca 780 gcagattgat tccatcatgt ttgaccaggc gcagaccgag atccagtcgg tgatggagga 840 aaatgcctac cagatgtttt tgacttctga tatatacctc gaatatgtga ggagtggggg 900 agaaaacaca gcttacatga gtaatggggg actcgggagc ctaaaggtcg tgtgtggcta 960 tctccccacc ttgaatgaag aagaggagtg gacttgtgcc gacttcaagt gcaaactttc 1020 gccaaccgtg gttggcttgt ccagcaaaac tctgagggcc acggcgagtg tgaggtccac 1080 ggaaactgtt gacagtggat acaggtcctt caagaggagc gatcctgtta atccttatca 1140 cataggttct ggctatgtct ttgcaccagc caccagcgcc aacgacagtg agatatccag 1200 tgatgcgctg acggatgatt ccatgtccat gacggacagc agtgtagatg gaattcctcc 1260 ttatcgtgtg ggcagtaaga aacagctcca gagagaaatg catcgcagtg tgaaggccaa 1320 tggccaagtg tctctacctc atttcccgag aacccaccgc ctgcccaagg agatgacccc 1380 cgtggaaccc gccacctttg cagctgagct gatctcgagg ctggaaaagc tgaagctgga 1440 gttggagagc cgccacagcc tggaggagcg cctgcagcag atccgagagg atgaagagag 1500 agagggctcc gagctcacac tcaattcgcg ggagggggcg cccacgcagc accccctctc 1560 cctactgccc tccggcagct acgaggaaga cccgcagacg atactggacg atcacctgtc 1620 cagggtcctc aagacccctg gctgccagtc tccaggcgta ggccgctata gcccccgctc 1680 ccgctccccg gaccaccacc accaccacca ttcgcagtac cactccctgc tcccgcccgg 1740 tggcaagctg cctcccgcgg ccgcctcgcc gggcgcctgc cccctcctcg ggggcaaagg 1800 ctttgtgacc aagcagacga cgaagcatgt ccaccaccac tacatccacc accatgccgt 1860 ccccaagacc aaggaggaga tcgaggcgga ggccacgcag cgggtgcact gcttctgccc 1920 tgggggcagc gagtattact gctactcgaa atgcaaaagc cactccaagg ctccggaaac 1980 catgcccagc gagcagtttg gcggcagcag aggcagtacc ttgcccaaac gcaatgggaa 2040 aggcacggag ccgggcctgg ccctgcccgc cagggaagga ggggcccccg gcggagctgg 2100 ggccctgcag cttccccggg aggaaggaga caggtcgcag gatgtctggc agtggatgct 2160 ggagagtgag cggcagagca agcccaagcc ccatagtgcc caaagcacaa aaaaggccta 2220 ccccttggag tctgcccgct cgtctccagg cgaacgagcc agccggcacc atctgtgggg 2280 gggcaacagc gggcaccccc gcaccacccc ccgtgcccac ctgttcaccc aggaccctgc 2340 gatgcctccc ctgaccccac ccaacacgct ggctcagctg gaggaggcct gtcgcaggct 2400 agctgaggtg tcgaagcccc caaagcagcg gtgctgtgtg gccagtcagc agagggacag 2460 gaatcattcg gccactgttc agacgggagc cacacccttc tccaatccaa gcctggctcc 2520 agaagatcac aaagagccaa agaaactggc aggtgtccac gcgctccagg ccagtgagtt 2580 ggttgtcact tactttttct gtggggaaga aattccatac cggaggatgc tgaaggctca 2640 gagcttgacc ctgggccact ttaaagagca gctcagcaaa aagggaaatt ataggtatta 2700 cttcaaaaaa gcaagcgatg agtttgcctg tggagcggtg tttgaggaga tctgggagga 2760 tgagacggtg ctcccgatgt atgaaggccg gattctgggc aaagtggagc ggatcgattg 2820 agccctgggg tctggctttg gtgaactgtt ggagcccgaa gctcttgtga actgtcttgg 2880 ctgtgagcaa ctgcgacaaa acattttgaa ggaaaattaa accaatgaag aagacaaagt 2940 ctaaggaaga atcggccagt gggccttcgg gagggcgggg ggaggttgat tttcatgatt 3000 catgagctgg gtactgactg agataagaaa agcctgaact atttattaaa aacatgacca 3060 ctcttggcta ttgaagatgc tgcctgtatt tgagagactg ccatacataa tatatgactt 3120 cctagggatc tgaaatccat aaactaagag aaactgtgta tagcttacct gaacaggaat 3180 ccttactgat atttatagaa cagttgattt cccccatccc cagtttatgg atatgctgct 3240 ttaaacttgg aagggggaga caggaagttt taattgttct gactaaactt aggagttgag 3300 ctaggagtgc gttcatggtt tcttcactaa cagaggaatt atgctttgca ctacgtccct 3360 ccaagtgaag acagactgtt ttagacagac tttttaaaat ggtgccctac cattgacaca 3420 tgcagaaatt ggtgcgtttt gttttttttt ttcctatgct gctctgtttt gtcttaaagg 3480 tcttgagggt tgaccatgtt gcgtcatcat caacattttg ggggttgtgt tggatgggat 3540 gatctgttgc agagggagag gcagggaacc ctgctccttc gggccccagg ttgatcctgt 3600 gactgaggct ccccctcatg tagcctcccc aggcccaggg ccctgaggcc tgctagaatc 3660 actgccgctg tgctttcgtg gaaatgacag ttccttgttt tttttgtttc tgtttttgtt 3720 ttacattagt cattggacca cagccattca ggaactaccc cctgccccac aaagaaatga 3780 acagttgtag ggagacccag cagcaccttt cctccacaca ccttcatttt gatgttcggg 3840 tttttgtgtt aagttaatct gtacattctg tttgccattg ttacttgtac tatacatctg 3900 tatatagtgt acggcaaaag agtattaatc cactatctct agtgcttgac tttaaatcag 3960 tacagtacct gtacctgcac ggtcacccgc tccgtgtgtc gccctatatt gagggctcaa 4020 gctttccctt gttttttgaa aggggtttat gtataaatat attttatgcc tttttattac 4080 aagtcttgta ctcaatgact tttgtcatga cattttgttc tacttatact gtaaattatg 4140 cattataaag agttcattta aggaaaatta cttggtacaa taattattgt aattaagaga 4200 tgtagccttt attaaaattt tatatttttc aaaaaaaaaa a 4241 <210> 87 <211> 843 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human Axin2 amino acid sequence <400> 87 Met Ser Ser Ala Met Leu Val Thr Cys Leu Pro Asp Pro Ser Ser Ser 1 5 10 15 Phe Arg Glu Asp Ala Pro Arg Pro Pro Val Pro Gly Glu Glu Gly Glu 20 25 30 Thr Pro Pro Cys Gln Pro Gly Val Gly Lys Gly Gln Val Thr Lys Pro 35 40 45 Met Pro Val Ser Ser Asn Thr Arg Arg Asn Glu Asp Gly Leu Gly Glu 50 55 60 Pro Glu Gly Arg Ala Ser Pro Asp Ser Pro Leu Thr Arg Trp Thr Lys 65 70 75 80 Ser Leu His Ser Leu Leu Gly Asp Gln Asp Gly Ala Tyr Leu Phe Arg 85 90 95 Thr Phe Leu Glu Arg Glu Lys Cys Val Asp Thr Leu Asp Phe Trp Phe 100 105 110 Ala Cys Asn Gly Phe Arg Gln Met Asn Leu Lys Asp Thr Lys Thr Leu 115 120 125 Arg Val Ala Lys Ala Ile Tyr Lys Arg Tyr Ile Glu Asn Asn Ser Ile 130 135 140 Val Ser Lys Gln Leu Lys Pro Ala Thr Lys Thr Tyr Ile Arg Asp Gly 145 150 155 160 Ile Lys Lys Gln Gln Ile Asp Ser Ile Met Phe Asp Gln Ala Gln 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Claims

약제학적 유효 투여량의 액티빈 수용체 II형(activin receptor type II)(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 런트 관련 전사인자 2(runt-related transcription factor 2)(Runx2)의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 알칼리 포스파타제(Alp)의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 스네일 상동체 1(snail homolog 1)(Snai1)의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2(phosphosmad2)의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 dickkopf 상동체 1(Dkk1)의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 콜라겐 1형 알파 1(col1a1)의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 골 특이적 알칼리 포스파타제(bone-specific alkaline phosphatase)(BSAP)의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스(Osterix)의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 클로토(Klotho)의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin)(알파-SMA)의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 미오카르딘(myocardin)(MYOCD)의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 평활근 단백질 22-알파(Sm22-알파)의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질(urinary protein)의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈관 석회화(vascular calcification)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖는, 대상체에서 혈관 석회화(vascular calcification)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖고,
상기 심혈관계 질환은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화에 기인한, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 증가된 수준의 동맥 경직을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖는, 대상체에서 증가된 수준의 동맥 경직을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖고,
상기 심혈관계 질환은 증가된 수준의 동맥 경직도와 관련되거나 및/또는 증가된 수준의 동맥 경직도에 기인한, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 좌심실비대(LVH)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖는, 대상체에서 좌심실비대(LVH)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖고,
상기 심혈관계 질환은 좌심실비대와 관련되거나 및/또는 좌심실비대에 기인한, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖고,
상기 심혈관계 질환은 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병에 기인한, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
약제학적 유효 투여량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 골흡수(bone resorption)를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 대상체가,
(a) 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가된 수준의 Runx2;
(b) 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가된 수준의 Alp;
(c) 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가된 수준의 Snai1;
(d) 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드2;
(e) 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가된 수준의 Dkk1;
(f) 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가된 수준의 col1a1;
(g) 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가된 수준의 액티빈;
(h) 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가된 수준의 BSAP;
(i) 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가된 수준의 CTX;
(j) 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가된 수준의 오스테릭스;
(k) 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소된 수준의 Klotho;
(l) 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소된 수준의 알파-SMA;
(m) 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소된 수준의 MYOCD;
(n) 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소된 수준의 Sm22-알파;
(o) 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가된 수준의 포스포스마드3;
(p) 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가된 수준의 요단백질; 및/또는
(q) 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소된 수준의 ActRIIA
를 갖는, 대상체에서 골흡수(bone resorption)를 감소시키기 위한 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효 투여량은 약 15 mg, 약 30 mg, 약 45 mg, 약 60 mg, 약 75 mg, 약 90 mg, 또는 약 1 g 또는 약 0.1 mg/kg, 약 0.13 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.26 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 또는 약 1.5 mg/kg인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 유효 투여량은 주사를 통해 투여되는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 유효 투여량은 (i) 14일에 한번; (ii) 21일에 한번; (iii) 28일에 한번, 또는 (iv) 42일에 한번 투여되는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 유효 투여량은 지속적 및/또는 무기한적으로 투여되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 큰 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 큰 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 이의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화로부터 유래되며, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되고, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병으로부터 유래되며, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되고, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 동맥 경직도의 증가된 수준과 관련되거나 및/또는 동맥 경직도의 증가된 수준으로부터 유래되며, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되고, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 상기 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 좌심실비대와 관련되거나 및/또는 좌심실비대로부터 유래되며, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되고, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 골흡수를 감소시키는, 대상체에서 골흡수를 감소시키기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 혈관 석회화를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 동맥 경직도의 증가된 수준을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 동맥 경직도의 증가된 수준을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 동맥 경직도의 증가된 수준과 관련되거나 및/또는 동맥 경직도의 증가된 수준으로부터 유래되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 좌심실비대(LVH)를 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 좌심실비대(LVH)를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 좌심실비대와 관련되거나 및/또는 좌심실비대로부터 유래되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 혈관 석회화와 관련되거나 및/또는 혈관 석회화로부터 유래되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
심혈관계 질환은 신장병과 관련되거나 및/또는 신장병으로부터 유래되며, 상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하는, 대상체에서 심혈관계 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
(a) 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량을 상기 대상체에 투여하는 단계;
(b) 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 1차 측정하는 단계;
(c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준을 2차 측정하는 단계; 및
(d) 액티빈 수용체 II형 신호전달 억제제의 조절된 투여량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
상기 조절된 투여량은 1차 측정과 2차 측정 사이에 검출된 변화를 기본으로 하여, 골흡수를 감소시키는, 대상체에서 골흡수를 감소시키기 위한 방법.
제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 초기 투여량은 약 15 mg, 약 30 mg, 약 45 mg, 약 60 mg, 약 75 mg, 약 90 mg, 또는 약 1 g 또는 약 0.1 mg/kg, 약 0.13 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.26 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.1 mg/kg, 약 1.2 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.4 mg/kg, 또는 약 1.5 mg/kg인 방법.
제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 투여량은 주사를 통해 투여되는 방법.
제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 투여량은 (i) 14일에 한번; (ii) 21일에 한번; (iii) 28일에 한번, 또는 (iv) 42일에 한번 투여되는 방법.
제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량은,
(a) Runx2의 수준이 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 증가;
(b) Alp의 수준이 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 증가;
(c) Snai1의 수준이 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 증가;
(d) 포스포스마드2의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 증가;
(e) Dkk1의 수준이 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 증가;
(f) col1a1의 수준이 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 증가;
(g) 액티빈의 수준이 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 증가;
(h) BSAP의 수준이 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 증가;
(i) CTX의 수준이 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 증가;
(j) 오스테릭스의 수준이 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 증가;
(k) Klotho의 수준이 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 감소;
(l) 알파-SMA의 수진이 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 감소;
(m) MYOCD의 수준이 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 감소;
(n) Sm22-알파의 수준이 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 감소;
(o) 포스포스마드3의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 증가;
(p) 요단백질의 수준이 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 증가;
(q) ActRIIA의 수준이 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 감소; 및/또는
(r) Axin2의 수준이 기준 집단에서 Axin2의 수준에 비해 감소된 경우에 초기 투여량에 비해 많은 방법.
제37항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 많거나, 초기 투여량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 많은 방법.
제37항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 보다 자주 투여되는 방법.
제18항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 또는 40일 마다 투여되는 방법.
제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제의 조절된 투여량은,
(a) Runx2의 수준이 기준 집단에서 Runx2의 수준에 비해 감소;
(b) Alp의 수준이 기준 집단에서 Alp의 수준에 비해 감소;
(c) Snai1의 수준이 기준 집단에서 Snai1의 수준에 비해 감소;
(d) 포스포스마드2의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드2의 수준에 비해 감소;
(e) Dkk1의 수준이 기준 집단에서 Dkk1의 수준에 비해 감소;
(f) col1a1의 수준이 기준 집단에서 col1a1의 수준에 비해 감소;
(g) 액티빈의 수준이 기준 집단에서 액티빈의 수준에 비해 감소;
(h) BSAP의 수준이 기준 집단에서 BSAP의 수준에 비해 감소;
(i) CTX의 수준이 기준 집단에서 CTX의 수준에 비해 감소;
(j) 오스테릭스의 수준이 기준 집단에서 오스테릭스의 수준에 비해 감소;
(k) Klotho의 수준이 기준 집단에서 Klotho의 수준에 비해 증가;
(l) 알파-SMA의 수진이 기준 집단에서 알파-SMA의 수준에 비해 증가;
(m) MYOCD의 수준이 기준 집단에서 MYOCD의 수준에 비해 증가;
(n) Sm22-알파의 수준이 기준 집단에서 Sm22-알파의 수준에 비해 증가;
(o) 포스포스마드3의 수준이 기준 집단에서 포스포스마드3의 수준에 비해 감소;
(p) 요단백질의 수준이 기준 집단에서 요단백질의 수준에 비해 감소;
(q) ActRIIA의 수준이 기준 집단에서 ActRIIA의 수준에 비해 증가; 및/또는
(r) Axin2의 수준이 기준 집단에서 Axin2의 수준에 비해 증가된 경우에 초기 투여량에 비해 적은 방법.
제41항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 적거나, 초기 투여량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 적은 방법.
제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 초기 투여량에 비해 덜 자주 투여되는 방법.
제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 또는 90일 마다 투여되는 방법.
제18항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 투여량은 지속적 및/또는 무기한적으로 투여되는 방법.
제18항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 측정은 치료의 개시에 이전에 실시되는 방법.
제18항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 측정은 치료의 개시 직후에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 2개월 내에 실시되는 방법.
제18항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 측정은 치료의 개시 직후에 실시되거나, 치료 개시의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 내에 실시되는 방법.
제37항에 있어서,
(a) Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고/크거나;
(b) Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
제49항에 있어서,
(a) Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고/크거나;
(b) Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
제41항에 있어서,
(a) Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준은 기준 집단에서 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고/크거나;
(b) Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준은 기준 집단에서 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준보다 각각 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
제51항에 있어서,
(a) Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 증가된 수준은 기준 집단에서 상위 10%, 상위 5%, 상위 4%, 상위 3%, 상위 2%, 또는 상위 1%의 Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 90%, 100%, 200%, 또는 500% 크고/크거나;
(b) Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 감소된 수준은 기준 집단에서 하위 10%, 하위 5%, 하위 4%, 하위 3%, 하위 2%, 또는 하위 1%의 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 및/또는 오스테릭스의 수준과 각각 동일하거나, 약 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 100% 작은 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준인 방법.
제18항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, 포스포스마드2, 포스포스마드3, 요단백질, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 단백질 수준인 방법.
제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 단백질 수준은 효소결합 면역흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)에 의해 측정되는 방법.
제55항에 있어서, 상기 ELISA는,
(a) Runx2 수준을 측정하기 위한 Runx2 특이 항체 SC-390715(Santa Cruz);
(b) Alp 수준을 측정하기 위한 Alp 특이 항체 SC-98652(Santa Cruz);
(c) Snai1 수준을 측정하기 위한 Snai1 특이 항체 sc-393172(Santa Cruz);
(d) 포스포스마드2 수준을 측정하기 위한 포스포스마드2 특이 항체 sc-101801(Santa Cruz);
(e) 포스포스마드3 수준을 측정하기 위한 포스포스마드3 특이 항체 sc-130218(Santa Cruz);
(f) Dkk1 수준을 측정하기 위한 Dkk1 특이 항체 sc-374574(Santa Cruz);
(g) col1a1 수준을 측정하기 위한 col1a1 특이 항체 sc-8784(Santa Cruz);
(h) 액티빈 수준을 측정하기 위한 액티빈 특이 항체 A1594(Sigma Aldrich));
(i) BSAP 수준을 측정하기 위한 BSAP 특이 항체 SC-98652(Santa Cruz);
(j) CTX 수준을 측정하기 위한 CTX 특이 항체 ABIN1173415 (Antibodies Online);
(k) 오스테릭스 수준을 측정하기 위한 오스테릭스 특이 항체 SC-22538(Santa Cruz);
(l) Klotho 수준을 측정하기 위한 Klotho 특이 항체 SC-22218(Santa Cruz);
(m) 알파-SMA 수준을 측정하기 위한 알파-SMA 특이 항체 SC-53142(Santa Cruz);
(n) MYOCD 수준을 측정하기 위한 MYOCD 특이 항체 SC-21561(Santa Cruz); 및/또는
(o) Sm22-알파 수준을 측정하기 위한 Sm22-알파 특이 항체 SC-271719(Santa Cruz);
(p) ActRIIA 수준을 측정하기 위한 ActRIIA 특이 항체 ab135634(Abcam)
를 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준인 방법.
제18항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 수준은 각각 Snai1, Dkk1, col1a1, 액티빈, Runx2, Alp, BSAP, CTX, 오스테릭스, Klotho, 알파-SMA, MYOCD, ActRIIA, Axin2, 및/또는 Sm22-알파의 mRNA 수준인 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 mRNA 수준은 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)(qRT-PCR)에 의해 측정되는 방법.
제59항에 있어서, 상기 qRT-PCR은,
(a) Runx2 수준을 측정하기 위한 Runx2 특이 프라이머(서열 48 및 49);
(b) Alp 수준을 측정하기 위한 Alp 특이 프라이머(서열 50 및 51);
(c) col1a1 수준을 측정하기 위한 col1a1 특이 프라이머(서열 82 및 83);
(d) Snai1 수준을 측정하기 위한 Snai1 특이 프라이머(서열 78 및 79);
(e) Dkk1 수준을 측정하기 위한 Dkk1 특이 프라이머(서열 80 및 81);
(f) 액티빈 수준을 측정하기 위한 액티빈 특이 프라이머(서열 84 및 85);
(g) 오스테릭스 수준을 측정하기 위한 오스테릭스 특이 프라이머(서열 52 및 53);
(h) Klotho 수준을 측정하기 위한 Klotho 특이 프라이머(서열 54 및 55); 및/또는
(i) Sm22-알파 수준을 측정하기 위한 Sm22-알파 특이 프라이머(서열 56 및 57)
를 사용하여 수행되는 방법.
제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수준은 조직에 존재하는 방법.
제61항에 있어서, 상기 조직은 대동맥, 혈청, 골수, 간, 또는 비장인 방법.
제2항, 제3항, 제18항, 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관 석회화는 석회화성 죽상동맥경화증(calcific atherosclerosis), 석회화성 중막 혈관병증(calcific medial vasculopathy)(또한, 뫼케베르그 중막 석회화성 경화증으로 공지), 중막 석회화, 탄력섬유증(elastocalcinosis), 석회화 요독성 세동맥병증(calcific uremic arteriolopathy), 석회화 대동맥 판막 협착증, 또는 간문맥 석회화인 방법.
제1항, 제19항, 또는 제26항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 죽상동맥경화증, 고지혈증, 골다공증, 고혈압, 염증, 2형 당뇨병, 말기 신장병, 필수 절단(required amputation), 탄력 섬유성 가황색종, 선천성 이엽성 판막, 류마티스성 심장질환, 문맥압 항진증, 또는 간질환과 같은 혈관 석회화와 관련된 질병인 방법.
제1항, 제19항, 또는 제26항에 있어서, 상기 심혈관계 질환은 만성 신장병에 대해 부차적인 방법.
제65항에 있어서, 상기 만성 신장병은 3, 4, 또는 5 단계의 만성 신장병인 방법.
제65항에 있어서, 상기 만성 신장병은 만성 신장병 미네랄 뼈 질환인 방법.
제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는,
(a) 서열 2와 90% 동일;
(b) 서열 2와 95% 동일;
(c) 서열 2와 98% 동일;
(d) 서열 2;
(e) 서열 3과 90% 동일;
(f) 서열 3과 95% 동일;
(g) 서열 3과 98% 동일;
(h) 서열 3;
(i) 서열 6과 90% 동일;
(j) 서열 6과 95% 동일;
(k) 서열 6과 98% 동일;
(l) 서열 6;
(m) 서열 7과 90% 동일;
(n) 서열 7과 95% 동일;
(o) 서열 7과 98% 동일;
(p) 서열 7;
(q) 서열 12와 90% 동일;
(r) 서열 12와 95% 동일;
(s) 서열 12와 98% 동일;
(t) 서열 12;
(u) 서열 17과 90% 동일;
(v) 서열 17과 95% 동일;
(w) 서열 17과 98% 동일;
(x) 서열 17;
(y) 서열 20과 90% 동일;
(z) 서열 20과 95% 동일;
(aa) 서열 20과 98% 동일;
(bb) 서열 20;
(cc) 서열 21과 90% 동일;
(dd) 서열 21과 95% 동일;
(ee) 서열 21과 98% 동일; 및
(ff) 서열 21
로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 방법.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ActRII 신호전달 억제제는 ActRII의 세포외 도메인(domain) 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질(humanized fusion-protein)인 방법.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 방법.
제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 또는 1000 개체로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 건강한 사람들(healthy people)로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 대상체로서 동일한 나이, 체중, 및/또는 성별의 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 심혈관계 질환이 없는 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 혈관 석회화가 없는 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 신장병이 없는 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 만성 신장병이 없는 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 비정상적으로 증가된 수준의 동맥 경직도가 없는 사람들로 이루어진 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기준 집단은 좌심실비대가 없는 사람들로 이루어진 방법.