CN111474369A - 一种平滑肌蛋白SM22α作为检测心血管疾病标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种平滑肌蛋白SM22α作为检测心血管疾病标志物的应用,属于医学领域。本发明的平滑肌蛋白SM22α可以作为心血管疾病的预测、诊断和治疗预后评估的生物标记物。尤其是外周血标记物,通过定性、定量评价检测外周血中的SM22α水平,提高心血管疾病早期诊断的敏感性和特异性。
Description
一、技术领域
本发明属于医学领域,具体涉及一种平滑肌蛋白SM22α作为心血管疾病的预测、诊断和治疗预后评估的生物标记物及其应用。
二、背景技术
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管中的主要细胞类型。正常情况下,成熟机体的VSMCs处于静止状态,通过表达一系列收缩蛋白来维持全身和局部血管张力和血压;当血管受到损伤后或者局部环境信号发生改变时,VSMCs发生表型转化,由收缩型转化成合成型,其特点是VSMCs异常增殖迁移、细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成增加。VSMCs这种由于适应不良性表型转化进而引起的血管可塑性不均衡,最终可能会导致一系列血管相关疾病的发生、发展。
VSMCs表型转化标记物大致分为两类:收缩型标记物和合成型标记物。其中,收缩型标记物包括平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)、平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)等;合成型标记物包括骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、胚胎型平滑肌肌球蛋白重链(embryonic form of smooth muscle myosin heavy chain,SMemb)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN))基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等。
其中SM22α是一种仅在收缩型VSMCs中大量表达的细胞骨架相关蛋白,因其相对分子量是22kDa而得名,其表达具有细胞表型特异性和平滑肌组织特异性,是鉴定VSMCs 表型转化的一个极为敏感的特异性标志物。
但是,目前对于SM22α的与心血管疾病病理以及疾病的指引作用并不明确。并且,对于SM22α的检测局限于组织水平,免疫组化、Western blot、ELISA等检测手段是SM22α的常用方法,由于组织样本来源的局限性,这些方法会对患者造成创伤,应该寻求一种无创、灵敏的生物标记物对心血管疾病进行预测、诊断和治疗预后的评估。
三、发明内容
我们的研究表明SM22α表达异常与心血管疾病的发生、发展密切相关,鉴于SM22α的表达具有平滑肌细胞特异性,其表达水平变化可反映血管结构和功能状态,可表征心血管疾病的发生和发展,同时我们也发现SM22α的外周血水平与组织、细胞水平正相关,将SM22α作为心血管疾病的预测、诊断和治疗预后的生物标志物具有敏感、特异和可靠等优势,对于提高临床血管疾病的外周血快速、无创性检测能力具有十分重要的意义,因此,本发明提供一种平滑肌蛋白SM22α作为心血管疾病预测,诊断和治疗预后评估的生物标志物的应用。
优选的,所述心血管疾病是血管结构和功能状态异常导致的疾病。
进一步,所述血管结构和功能状态异常包括动脉粥样硬化(AS)、血管内皮功能障碍或者血管损伤。
例如,AS的初始阶段是由血管内皮细胞(endothelial cell,ECs)激活驱动的,活化的 ECs在细胞膜上表达多种细胞黏附分子,介导免疫细胞对血管壁的黏附集聚,单核细胞迁移至内膜下激活炎症因子引起炎症反应;中膜VSMCs迅速增殖并迁移至内膜,同时产生大量的ECM,加速重构,提高细胞增殖、迁移的能力。增殖迁移的VSMCs和ECM共同构成了新生内膜的主要成分,加剧内膜扩张,并最终引起血管管腔增厚、狭窄;AS引起的动脉壁缺血将导致中层弹力纤维局部断裂或坏死,使得动脉壁机械强度下降、血流动力学改变。
更进一步,所述的血管结构异常包括炎症、氧化应激、内皮损伤引起的细胞迁移、增殖能力增强、细胞外基质沉积、胶原增多、管壁增厚、管腔狭窄等改变;
所述功能状态异常包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)发生表型转化,由收缩型向合成型转变,由生理状态下的收缩型向具有很强增殖、迁移能力的合成型转变,表现为合成型VSMCs标志物OPN高表达以及反映VSMCs增殖、迁移能力的标记物表达上调,而收缩型VSMCs标志物SM22α的表达水平则显著下降;合成型VSMCs 可分泌大量ECM,加速血管重构,血管内膜增生加剧,并最终引起血管壁增厚、管腔狭窄等。
进一步,所述VSMC表型在收缩型与合成型之间的转化。更优选的,SM22α明显降低或升高表明血管平滑肌细胞为合成型或者收缩型。优选的,所述表型转化外周血标记物为平滑肌细胞分化早期特征性标志物。
进一步,所述反映VSMCs增殖、迁移能力的标记物包括增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)单核细胞趋化蛋白(monocytechemotactic protein,MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesionmolecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)或基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)。
优选的,导致所述血管损伤因素包括VSMC炎症反应、氧化应激或细胞衰老等。
更进一步,所述疾病包括高血压、动脉粥样硬化、主动脉夹层、腹主动脉瘤以及血管介入治疗后血管再狭窄等。
更进一步,所述SM22α表达水平在动脉粥样硬化、主动脉夹层、腹主动脉瘤以及血管介入治疗后血管再狭窄疾病中明显下降;而在高血压中表达升高。
更进一步,所述SM22α表达水平下降时,个体发生动脉粥样硬化、主动脉夹层、腹主动脉瘤以及血管介入治疗后血管再狭窄风险增加;SM22α表达水平上升时,个体发生高血压的风险增加。
优选的,所述标志物为外周血标记物,更优选的,所述标志物为血清或者血浆标记物。
优选的,所述治疗预后评估是评估血管介入治疗后再狭窄的发生风险,例如预测支架植入或血管搭桥术后再狭窄的发生风险。
更优选的,当患者SM22α表达水平下降时,血管介入治疗后再狭窄的发生风险增加。
本发明还提供一种检测上述生物标记物的方法,所述方法包括:
(1)获得样本;
(2)对样本中的SM22α的进行检测,从而对心血管疾病进行预测,诊断和治疗预后评估。
优选的,所述样本为来源于外周血,更优选的,所述样本来源于血清或者血浆。
优选的,利用ELISA试剂盒对SM22α进行检测。
本发明还提供一种SM22α检测试剂在制备试剂盒中的用途,其中,所述试剂盒用于对样本检测,从而对心血管疾病进行预测、诊断和治疗预后评估。
优选的,所述样本来源于外周血,更优选的,所述样本来源于血清或者血浆。
本发明的有益效果在于:1.定性、定量评价检测人外周血中SM22α水平,作为心血管疾病预测、诊断以及治疗预后评估的一种手段,提高心血管疾病早期诊断的敏感性和特异性;2.方法灵敏、可靠、可操作、无创。
以上只是概括了本发明的一些方面,不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
除非特别说明,本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如:
1Guesdon JL.Enzyme Immunoassays:From Concept to Product Developments[J]. Biochimie,1996,78(10):888-889.
2Voller A.ELISA and Other Solid Phase Immunoassays[J].Immunology,1989,67(2):282.
3J R,Crowther.The ELISA guidebook[J].Methods in molecular biology(Clifton, N.J.),2000,149:III-IV,1-413.
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到,对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明,不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
四、附图说明
以下,结合附图对本发明进行详细说明:
图1:Sm22α+/+和Sm22α-/-小鼠中腹主动脉瘤(AAA)直径,Saline为生理盐水对照组,AngⅡ为AngⅡ微渗透泵复制AAA模型组。
图2:AAA组织中SM22α的表达,NC-Mouse为小鼠正常腹主动脉组织,AAA-Mouse 为小鼠腹主动脉瘤组织。
图3:颈总动脉球囊损伤血管再狭窄模型中内膜增生程度,其中,NC为假手术对照组, Vascular stenosis为血管再狭窄组。
图4:Sm22α+/+与Sm22α-/-小鼠血管损伤重塑模型中内膜/中膜(I/M)比值。
图5:Sm22α+/+小鼠和Sm22α-/-小鼠收缩压(SBP)变化情况,Saline为生理盐水对照组, AngⅡ为复制高血压模型组。
图6:慢性AngⅡ刺激建立VSMCs衰老模型中衰老标志蛋白p53、核增殖抗原PCNA、SM22α的表达。
图7:高脂饲料喂养Sm22α+/+与Sm22α-/-小鼠中主动脉脂质含量分析,其中WT为野生型Sm22α+/+小鼠,KO为Sm22α-/-小鼠,HFD为高脂喂养组。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中,主要的设备和材料是从以下所指出的几家公司获得:
1.实验材料
1.1实验动物
C57BL/6J野生型(Sm22α+/+)小鼠和雄性SD大鼠(清洁级)由河北医科大学实验动物中心提供。
Sm22α基因敲除(Sm22α-/-)小鼠均购自美国Jackson实验室,品系名称: B6.129S6-Taglntm2(cre)Yec/J。
1.2实验试剂
表1主要试剂
2.统计分析
实验数据用均值±标准差(Mean±SD)表示。两组数据用非配对t检验(Non-pairedt test),多组数据用单因素方差分析(One way ANOVA)。以至少P<0.05为有显著性统计学意义。采用GraphPad Prism 5绘图软件作图。
实施例1:SM22α作为腹主动脉瘤发生和诊断的生物学标记
为确定SM22α是否可以作为评估腹主动脉瘤(AAA)的生物标志物,我们建立腹主动脉瘤等模型,并评估SM22α与该疾病的关系。
1.为观察SM22α的水平对腹主动脉瘤发生的影响,利用Sm22α-/-小鼠和同窝Sm22α+/+小鼠经背部皮下植入AngⅡ微渗透泵复制腹主动脉瘤(AAA)模型,检测其腹主动脉瘤的发生。
1.1制备方法
选取雄性8-10周Sm22α-/-小鼠(n=15)和同窝Sm22α+/+小鼠(n=15),经5%异氟烷麻醉后,在肩胛骨皮下植入生理盐水(Saline)或AngⅡ灌装的微渗透泵(以1μg/kg/min的速度持续缓慢释放AngⅡ),手术过程中以2%异氟烷维持麻醉。
1.2结果
利用小动物超声进行检测,结果显示:
(1)与生理盐水对照组相比,AngⅡ灌注28天后Sm22α-/-和Sm22α+/+两种基因型小鼠在腹主动脉部位均有动脉瘤发生,其发病率分别为66.7%(10/15)和26.7%(4/15),Sm22α-/-小鼠发病率明显高于Sm22α+/+小鼠;
(2)使用小动物超声测量腹主动脉直径的结果显示:与对照组(Saline)相比,两种基因型小鼠的腹主动脉直径均增加,但Sm22α-/-小鼠腹主动脉直径(1.331±0.219mm)明显高于Sm22α+/+小鼠(1.107±0.277mm,P<0.05)(参见图1、表2)。
表2 Sm22α+/+和Sm22α-/-小鼠中腹主动脉瘤的直径大小(mm)
**P<0.001 vs Saline,#P<0.05 vs Sm22α+/+AngⅡ.
1.3结论:
Sm22α-/-小鼠中无论是腹主动脉瘤的发生率还是腹主动脉瘤的直径都大于Sm22α+/+小鼠组以及Sm22α-/-生理盐水对照组,这些结果提示SM22α缺失可促发腹主动脉瘤形成,SM22α的水平与腹主动脉瘤的发生密切相关,SM22α水平降低可作为预测腹主动脉瘤发生的重要生物标志物。
2.进一步,我们在Sm22α+/+小鼠建立腹主动脉瘤模型,检测小鼠腹主动脉瘤(AAA)及邻近正常动脉组织(NC)中的SM22α蛋白水平。
2.1 AAA模型制备方法
选取Sm22α+/+小鼠建立AAA模型:利用浸有0.5mol/L CaCl2溶液的海绵敷贴小鼠腹主动脉15min,4周后观察到AAA形成。
2.2检测方法
选取小鼠AAA及邻近正常动脉组织(n=20),Western blot检测SM22α蛋白水平:收集组织总蛋白→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→半干转膜→牛奶封闭→一抗结合→洗膜→二抗结合→洗膜→发光。
2.3结果
结果显示,与正常对照组(NC)相比,小鼠AAA模型的病变血管组织中SM22α表达下调(2.112±0.393 vs 1.250±0.230,P<0.01)(参见图2)。
2.4结论
小鼠AAA模型中SM22α的表达下调,提示SM22α水平变化与AAA有关联性,检测 SM22α的水平可预测个体腹主动脉瘤的发生,SM22α水平降低可作为预测腹主动脉瘤发生的重要生物标志物。
实施例2:SM22α作为评估血管再狭窄的生物标志物
为确定SM22α是否可以作为评估血管再狭窄的生物标志物,我们建立血管再狭窄模型,并评估SM22α与该疾病的关系。
1.为确定SM22α的是否可以作为评估血管再狭窄(Vascular stenosis)的生物标志物,我们利用Sm22α+/+小鼠行颈总动脉球囊损伤制备血管再狭窄模型,并检测其SM22α总水平、内膜增生程度和炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB的表达。
1.1制备血管再狭窄模型
腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg麻醉后,固定四肢头部,颈部消毒后正中切口暴露颈总、颈内及颈外动脉,导引钢丝和2F球囊经由左颈外动脉插入颈总动脉,充盈球囊至适当阻力,旋转拖拉球囊三次,取出导引钢丝和球囊,关闭切口。以右侧颈总动脉作为假手术对照组(NC)。
1.2免疫组织化学染色
血管组织标本经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,5μm厚连续切片,免疫组化染色采用SP法,过程如下:二甲苯脱蜡→梯度乙醇复水→水洗4min复PBS平衡4min复高压抗原修复→PBS洗5min/次×1次→滤纸擦干组织周围的液体,滴加3%过氧化氢,湿盒中室温孵育8min→PBS洗:5min/次×3次,滤纸擦干组织周围的液体→滴加山羊血浆,室温湿盒中孵育15min,以封闭内源性抗原,滤纸吸干组织周围血浆→滴加适当比例稀释的一抗,湿盒中4℃过夜→PBS洗5min×3次,滤纸吸干组织周围液体→滴加生物素标记的二抗,室温湿盒中孵育15min→PBS洗5min×3次,滤纸吸干组织周围液体→滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,室温湿盒中孵育15min→PBS洗5min×3次,滤纸吸干组织周围液体→滴加DAB混合液进行显色,镜下观察,当细胞内出现棕黄色颗粒后,蒸馏水冲洗终止反应→苏木精复染4min→水洗→放入1%盐酸乙醇溶液中片刻,用于除去切片上过染的染料→梯度乙醇脱水→透明→封片,镜下观察内膜增生情况,计算内膜/中膜(I/M)比值;用免疫组化染色和阳性颗粒的相对定量分析,显示炎症因子的表达变化。
1.3结果
SM22α和炎性因子的表达如表3所示:
表3颈总动脉球囊损伤血管再狭窄模型中SM22α和炎性因子的表达
NC | Vascular stenosis | |
SM22α | 5.025±0.340 | 1.025±1.650* |
TNF-α | 1.450±0.129 | 4.725±0.499* |
IL-6 | 0.975±0.170 | 4.450±0.404* |
NF-κB | 0.900±0.183 | 5.825±0.465* |
*P<0.05vs NC.
从上表数据可知,血管再狭窄组(Vascular stenosis)中的炎性因子显著性地高于对照组(NC),相反,SM22α在血管再狭窄模型中显著性地低于对照组,SM22α表达水平与炎症因子表达呈负相关,SM22α表达下降提示血管炎性反应增加。
同时,如图3所示,在血管再狭窄组(Vascular stenosis)中,血管内膜增生程度增加,其内膜/中膜(I/M)比值可达2.417±0.147,而对照组(NC)只有0.175±0.034,两者有显著性的差异(P<0.01)且血管内膜增生程度与SM22α表达水平也呈负相关,SM22α表达下降提示血管内膜增生程度增加。
1.4结论
在血管再狭窄中SM22α表达水平下降,而导致血管再狭窄的炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB的表达增加,且内膜增生程度明显增加,提示根据SM22α表达水平可以预测血管是否易于狭窄,尤其是可以用于预测血管介入治疗,例如支架植入或血管搭桥术后再狭窄的发生风险。
2.进一步,确认炎性反应对VSMCs中SM22α的影响
2.1制备及检测方法
以大鼠VSMCs为研究对象,选择肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)模拟炎症反应微环境,刺激浓度10ng/mL、刺激VSMCs 12-24h,提取总RNA和总蛋白分别利用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SM22α的表达。
qRT-PCR过程如下:提取VSMCs总RNA→逆转录获得cDNA的第一条链→SYBR Green法检测基因表达水平。
Western blot过程如下:收集VSMCs总蛋白→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→半干转膜→牛奶封闭→一抗结合→洗膜→二抗结合→洗膜→发光,检测SM22α蛋白表达。
2.2结果
表4 TNF-α刺激下VSMCs中SM22α基因和蛋白表达水平
NC | TNF-α | |
qRT-PCR法 | 1 | 0.478±0.011* |
Western blot法 | 0.595±0.269 | 0.267±0.109* |
*P<0.05 vs NC.
如表4所示:TNF-α刺激下VSMCs中SM22α的表达无论在基因水平还是在蛋白水平都显著性低于正常对照组。
2.3结论
炎症反应是血管损伤性疾病的共同病理基础之一,TNF-α刺激VSMCs发生炎症反应,显著降低SM22α的表达,可见,通过检测SM22α表达水平可反映VSMCs炎症反应水平,进而提示个体发生血管损伤性疾病的风险。
3.我们模拟了血管损伤后的病理性重塑过程,观察敲除SM22α对病理性重塑的影响。
3.1制备和检测方法
利用Sm22α-/-小鼠和Sm22α+/+小鼠建立颈总动脉结扎模型模拟血管损伤后的病理性重塑过程:腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉后,固定四肢头部,颈部消毒后正中切口暴露颈总、颈内及颈外动脉,小心分离颈总动脉与迷走神经,剥离颈总动脉至交叉部位,取适当粗细的手术缝合线穿过左侧颈总动脉下,在分叉部位近心端结扎。
对组织进行HE染色,HE染色过程:二甲苯脱蜡→梯度乙醇复水→水洗→苏木精染色→水洗→分化→水洗→伊红染色→水洗→梯度乙醇脱水→透明→封片。
免疫组化检测MMP-2等粘附相关因子:切片用0.3%过氧化氢封闭→氧化正常山羊血浆预孵育→滴加适当比例稀释的一抗MMP-2(1:1000)、MMP-9(1:1000)、ICAM-1(1:500)、VCAM-1(1:500)、OPN(1:500)、Integrinβ(1:500)、SM22α(1:1000)4℃孵育过夜→滴加生物素标记的二抗,室温孵育→链霉亲和素辣根过氧化物酶和DAB孵育→苏木精复染。
3.2结果
HE染色结果如图4、表5-1所示,Sm22α-/-组的内膜明显厚于Sm22α+/+组。
表5-1 Sm22α+/+与Sm22α-/-小鼠血管损伤重塑模型中内膜/中膜(I/M)比值
Sm22α<sup>+/+</sup> | Sm22α<sup>-/-</sup> | |
I/M | 0.828±0.099 | 1.812±0.128* |
*P<0.05 vs Sm22α+/+.
免疫组化分析结果如表5-2所示,与Sm22α+/+小鼠相比,Sm22α-/-组中膜和新生内膜中迁移和粘附相关分子的表达上调(MMP-9、MMP-2、VCAM-1、ICAM-1、Integrinβ和OPN)。
表5-2 Sm22α+/+与Sm22α-/-小鼠血管损伤重塑模型中迁移和粘附分子的表达
Sm22α<sup>+/+</sup> | Sm22α<sup>-/-</sup> | |
ICAM-1 | 0.950±0.129 | 2.562±0.149* |
VCAM-1 | 0.983±0.196 | 3.163±0.138* |
MMP-2 | 0.940±0.153 | 1.950±0.129* |
MMP-9 | 0.923±0.199 | 2.840±0.111* |
OPN | 0.945±0.257 | 1.925±0.171* |
Integrinβ | 0.950±0.265 | 1.765±0.178* |
*P<0.05 vs Sm22α+/+.
3.3结论
VSMCs异常增殖、迁移是血管再狭窄的主要病理变化,SM22α减少或缺失时,VSMCs的迁移和增殖能力大大增强,因此,根据SM22α表达水平的高低,可用于预测血管介入治疗,例如支架植入或血管搭桥术后再狭窄的发生风险。
4.为进一步证实SM22α的减少与VSMCs增殖的关系,我们以大鼠VSMCs为研究对象,一组给予血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)诱导VSMCs增殖,一组给予全反式维甲酸(a11-trans retinoic acid,ATRA)抑制VSMCs增殖,并检测其中的SM22α。
4.1制备和检测方法
以大鼠VSMCs为研究对象,一组给予PDGF诱导VSMCs增殖,刺激浓度10ng/mL、刺激时间24h、48h;一组给予ATRA抑制VSMCs增殖、诱导细胞分化,刺激浓度10μmol/L、刺激时间24h、48h。
Western blot检测上述两组细胞中SM22α的表达。Western blot过程如下:收集VSMCs 总蛋白→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→半干转膜→牛奶封闭→一抗结合→洗膜→二抗结合→洗膜→发光,检测SM22α蛋白表达。
BrdU掺入检测细胞增殖活性。过程如下:4个/mL细胞数接种细胞于48孔板中;用含0.5%FBS的DMEM培养24h,使绝大多数细胞处于G0期;加入PDGF(10ng/mL)刺激24、48h,刺激结束前12h,每孔加入40μl稀释后的BrdU试剂;加入固定液200μ l,室温孵育30min;加入稀释后的BrdU抗体100μl,室温孵育1h;加入100μl二抗,室温孵育30min;加入100μl底物,避光,室温30min;加入终止溶液100μl终止反应,阳性孔的颜色由蓝色变成明黄色,酶标仪450nm读取吸光值。
VSMC收缩性分析,将VSMC接种于24孔板内,ATRA(10μmol/L)刺激24h、48 h,诱导细胞分化为收缩型;将待测孔内的培养基换为37℃的Hepes-生理盐水缓冲液 (Hepes-PSS);置于倒置相差显微镜下观察,并用成像系统采集细胞图像,加入AngII(100 nmol/L),连续拍摄同一个视野10min内的细胞形态变化,图像采集时间间隔10s。用 Image-Pro Plus(V6.0)软件,测量细胞长轴长度,其收缩性表示为细胞长轴长度缩短的变化值占刺激前初始长度的百分比。
4.2结果
表6-1 PDGF刺激不同时间点SM22α表达和细胞增殖情况
*P<0.05,**P<0.01 vs PDGF 0h.
表6-2 ATRA刺激不同时间点SM22α的表达情况
*P<0.05vs ATRA 0h.
如表6-1、6-2所示,PDGF刺激可诱导VSMCs增殖,SM22α表达下调;而ATRA刺激下VSMCs分化为收缩型,SM22α表达上调。
4.3结论
上述结果表明,SM22α表达与VSMC增殖能力和血管狭窄的发生发展成负相关关系,动态监测SM22α水平,可预测支架植入或血管搭桥术后再狭窄的发生风险。
实施例3:SM22α作为预测主动脉夹层(AD)发生风险的生物标志物
为确定SM22α是否可以作为评估主动脉夹层(AD)的生物标志物,我们建立主动脉夹层(AD)模型,并评估SM22α与该疾病的关系。
1.1建立主动脉夹层(AD)大鼠模型,检测组织中的SM22α水平
1.1制备和检测方法
建立主动脉夹层(AD)大鼠模型:给予0.25%β-氨基丙腈(BAPN)腹腔注射,在正常饮食条件下,随意饮水,连续6周,每周监测动物体重,死亡的动物立即被解剖,存活下来的在6周后处死。
选取大鼠AD及邻近正常动脉组织(n=3),Western blot检测SM22α蛋白水平:收集组织总蛋白→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→半干转膜→牛奶封闭→一抗结合→洗膜→二抗结合→洗膜→发光。
1.2结果
表7主动脉夹层中的SM22α表达
NC | AD | |
SM22α/β-actin | 0.670±0.112 | 0.458±0.019* |
*P<0.05 vs NC.
如表7所示:与正常对照组相比,AD大鼠的病变血管组织中SM22α表达下调。
1.3结论
主动脉夹层病变组织中SM22α表达下调,提示组织中SM22α水平变化与AD损伤程度呈负相关。
实施例4:SM22α作为预测高血压发生风险的生物标志物
为确定SM22α是否可作为预测高血压发生风险的生物标志物,我们在Sm22α+/+小鼠和 Sm22α-/-小鼠中复制高血压模型,以确定SM22α与高血压的关联。
1.复制高血压模型,确定SM22α与高血压的关联
1.1制备和检测方法
用商品化的Sm22α+/+(n=15)和Sm22α-/-小鼠(n=15)皮下植入AngⅡ(1μg/kg/min)微渗泵,持续给药4周,复制高血压模型,使用无创血压计测量小鼠尾动脉血压,并定期记录其收缩压(SBP)。
1.2结果
表8 Sm22α+/+小鼠和Sm22α-/-小鼠收缩压(SBP)变化情况
*P<0.05,**P<0.001 vs Saline,#P<0.001 vs Sm22α+/+AngⅡ.
如表8和图5所示:与对照组相比,AngⅡ在两基因型小鼠中都表现出明显的的升压作用,在AngⅡ灌注7天时已有统计学意义(P<0.05),之后14天、21和28天血压持续升高,但21-28天时,Sm22α-/-小鼠血压升高的程度明显低于Sm22α+/+小鼠(P<0.001)。
1.3结论
上述结果提示Sm22α基因敲除可改善AngⅡ诱导的小鼠血压升高。
2.衰老是多种心血管疾病的危险因素,细胞衰老参与高血压发展进程,与高血压关系密切,为进一步确定SM22α在VSMCs衰老促进高血压发展中作用,我们利用AngⅡ诱导建立VSMCs衰老模型,并检测其中的衰老标志蛋白和SM22α表达情况。
2.1制备和检测方法
利用AngⅡ诱导建立VSMCs衰老模型:选取大鼠胸腹主动脉,用贴块法分离培养VSMCs,利用AngⅡ(10-7mol/L)慢性刺激VSMCs 7天,获得VSMCs应激衰老模型。 SA-β-Gal染色:去除六孔板细胞培养液,用预冷的PBS清洗→固定液室温固定15min→ PBS清洗3遍→SA-β-Gal衰老染色液加入六孔板,37℃孵育染色过夜→弃染液,PBS清洗 3遍→光学显微镜下观察染色情况并拍照分析。Western blot检测衰老标志蛋白p53、核增殖抗原PCNA以及VSMCs中SM22α表达情况:收集组织总蛋白→SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)→半干转膜→牛奶封闭→一抗结合→洗膜→二抗结合→洗膜→发光。
2.2结果
表9-1 VSMCs衰老模型中SA-β-gal染色阳性细胞百分比
*P<0.05 vs Ang Ⅱ 0 day.
表9-2 VSMCs衰老模型中p53、PCNA和SM22α表达
**P<0.001 vs 0day,*P<0.05 vs 0day.
如图6、表9-1、9-2所示:AngⅡ持续刺激VSMCs 5天和7天后,SA-β-gal染色阳性细胞数目明显增多,表明慢性AngⅡ刺激(5-7天)时,可显著诱导VSMCs衰老,Western blot结果显示衰老标志蛋白p53和SM22α表达上调,核增殖抗原PCNA表达下调。
2.3结论
AngⅡ持续刺激VSMCs 5天和7天后,SA-β-gal活性显著增强、衰老标志蛋白p53表达增高、核增殖抗原PCNA表达下调,表明细胞进入生长停滞的衰老状态。
AngⅡ诱导VSMCs衰老过程中SM22α表达显著上调,与细胞衰老进程具有平行,细胞衰老可加重高血压组织器官损害,而细胞衰老参与高血压发展进程,通过检测SM22α表达水平可以评估细胞衰老进程,并进一步预测高血压的血管退化程度。
实施例5:SM22α作为预测动脉粥样硬化发生风险的生物标志物。
为确定SM22α是否可作为预测动脉粥样硬化发生风险的生物标志物,我们在Sm22α+/+小鼠和Sm22α-/-小鼠中复制动脉粥样硬化模型,以确定SM22α与动脉粥样硬化的关联。
1.复制动脉粥样硬化模型,确定SM22α与动脉粥样硬化的关联
1.1制备和检测方法
用商品化的Sm22α+/+(n=15)和Sm22α-/-小鼠(n=15)给予高脂饲料(为实验用Paigen 饲料:脂肪15%,胆固醇1.25%,脱氧胆酸钠0.5%)持续喂养24周,复制动脉粥样硬化模型,进行M型和多普勒超声心动图测量,分别测量主动脉流出道、主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉处收缩期和舒张期的直径(As和Ad)以及多普勒血流反流比(VR/VF),以此评估主动脉僵硬度。24周时处死动物,测定主动脉脂质含量,主要步骤,采用改良的 Blign&Dyer脂质抽提方法,新鲜的主动脉组织置入含1mL预冷PBS的匀浆管,匀浆15s。将匀浆液转入10mL的玻璃管,加入2:1的氯仿/甲醇溶液4mL,封盖。旋涡混匀器剧烈涡旋震荡充分混匀,低温离心机中4封盖。旋涡混匀器剧烈涡离心30min分相。将上层水相转移至一支新的试管中,此部分需再抽提一次。取下层有机相转移到另一只10mL玻璃管中。在装有水相的玻璃管中加入3mL氯仿/甲醇,封盖,剧烈涡旋混匀,4℃条件下2000 rpm离心30min分相,弃上层水相。取下层有机相,合并入第一次抽提的有机相中。在通风橱中用氮气吹干有机相,加3%Triton X-100(v/v)溶液500μL,反复吹打并恒温摇床50 复吹振荡30min促进脂质溶解。用薄层层析法检测主动脉各种脂质含量。
1.2结果
表10超声心动测量主动脉僵硬度
主动脉僵硬参数 | Sm22α<sup>+/+</sup> | Sm22α<sup>-/-</sup> | P值 |
主动脉流出道 | |||
D(动脉膨胀系数) | 0.0136±0.001 | 0.007±0.002 | <0.0001 |
Β(僵硬指数) | 1.733±0.167 | 2.878±0.119 | <0.0001 |
Ep(弹性模量) | 194.678±30.534 | 428.994±45.376 | <0.0001 |
主动脉弓 | |||
VR/VF(血流反流比) | 10.0701.225 | 19.4701791 | <0.0001 |
D(动脉膨胀系数) | 0.013510.001 | 0.00651.001 | <0.0001 |
β(僵硬指数) | 1.92501.165 | 2.43401.176 | 0.0015 |
Ep(弹性模量) | 148.808±48.808 | 308.605470.711 | 0.0026 |
如表10所示:高脂喂养24周后Sm22α-/-小鼠主动脉流出道和主动脉弓部位的僵硬度明显增大,动脉弹性降低。如图7所示:高脂喂养(HFD)24周后,脂质抽提分析显示 Sm22α-/-小鼠主动脉组织总胆固醇含量显著高于Sm22α+/+小鼠。
1.3结论
高脂饮食24周后Sm22α-/-小鼠主动脉流出道和主动脉弓部位均出现明显动脉硬化,取材时血管僵硬度感明显增加,且主动脉壁中总胆固醇含量显著高于Sm22α+/+小鼠,提示 SM22α的缺陷可提高动脉粥样硬化的发病风险。通过检测SM22α过表达水平可以预测动脉粥样硬化程度,SM22α水平降低时,动脉粥样硬化程度高。
实施例6:血浆SM22α水平与细胞、组织水平的关系。
我们同时测定了实施例1-5中相关疾病患者血浆中的SM22α水平
1、检测方法
1.1收集血样:采集自河北医科大学第四医院门诊和住院部患有心血管疾病的患者,按实施例1-5中的腹主动脉瘤、颈动脉斑块导致颈动脉狭窄、主动脉夹层、高血压和动脉粥样硬化患者血浆样本以及正常人(对照组,NC)血浆样本进行分组,采集全血,离心取上清,立即检测或分装后-80℃保存,避免反复冻融。
1.2 ELISA试剂盒测定血浆中人平滑肌蛋白SM22α浓度。
具体操作如下:
(1)设置标准孔、样品孔,在对应的孔中加入标准品和样品,37℃温育60min,弃之;
(2)在各孔中加入生物素标记的检测抗体,37℃温育60min,彻底洗涤;
(3)每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素100μL,37℃温育60min,彻底洗涤;
(4)每孔加入底物液90μL,37℃避光显色20min;
(5)每孔加入终止液50μL,15min内在450nm波长下测定各孔吸光度值(OD值);
(6)绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品浓度;
(7)结果判定。
1.3血浆SM22αELISA检测方法标准曲线的建立
(1)人SM22α标准曲线;将20ng/mL标准蛋白倍比稀释浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0ng/mL,按ELISA试剂盒操作,在450nm波长下测定吸光度值(OD 值),至少2个复孔,绘制标准曲线。
(2)大鼠SM22α绘标准曲线;绘制流程同前。
(3)灵敏度,特异性(与阳性对照比较,如OPN),重现性(批内差异:同一样品测量三次;批间差异:测量三份不同人或大鼠血浆SM22α份水平),以确定测定血浆SM22α定结果的稳定性;
(4)血浆SM22α水平检测。
2、检测结果
表11人血浆中的SM22α水平
血浆SM22α(ng/mL) | |
正常对照 | 1.167±0.419 |
实施例1腹主动脉瘤 | 0.869±0.117* |
实施例2颈动脉狭窄 | 0.744±0.112* |
实施例3主动脉夹层 | 0.704±0.029* |
实施例4高血压 | 4.072±1.211** |
实施例5动脉粥样硬化 | 0.822±0.103* |
*P<0.05 vs NC,**P<0.01 vs NC
从表11可以看出,在腹主动脉瘤、颈动脉狭窄、主动脉夹层和动脉粥样硬化患者中SM22α水平降低,与正常对照组相比有显著差异(P<0.05),而高血压患者血浆SM22α水平升高同样具有统计学意义(P<0.01)。
3、结论
如上所示,在腹主动脉瘤、颈动脉狭窄、主动脉夹层和动脉粥样硬化患者血浆中SM22α水平降低,而高血压患者中血浆SM22α水平升高,提示血浆SM22α水平与心血管疾病有相关性,其水平的高低可预示心血管疾病发生的风险,并且这一结论的提出基于我们前述实施例发现在不同心血管疾病动物模型组织或细胞中的SM22α表达水平和不同心血管疾病患者血清或者血浆中SM22α表达水平趋势一致,两者呈正相关,提示血清或者血浆中的SM22α表达水平可以反映出细胞和组织中的SM22α表达水平,以SM22α作为外周血,例如血清或者血浆标记物用于心血管疾病的预测、诊断和治疗预后评估,具有敏感性、可靠性和特异性。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种平滑肌蛋白SM22α作为心血管疾病预测,诊断和治疗预后评估的生物标志物的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述心血管疾病是血管结构和功能状态异常导致的疾病。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述血管结构和功能状态异常包括动脉粥样硬化、血管内皮功能障碍或血管损伤。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述血管功能状态异常包括血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)发生表型转化,由收缩型向合成型转变。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的血管损伤包括VSMC炎症反应、氧化应激或细胞衰老导致的血管损伤。
6.如权利要求1-5任一所述的应用,其特征在于,所述心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、主动脉夹层、腹主动脉瘤以及血管介入治疗后再狭窄。
7.如权利要求1-6任一所述的应用,其特征在于,所述生物标志物为外周血标记物。
8.一种SM22α检测试剂在制备试剂盒中的用途,其中,所述试剂盒用于对样本检测,从而对心血管疾病进行预测、诊断和治疗预后评估。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述样本为外周血样本。
10.一种检测SM22α的方法,所述方法包括:
(1)获得样本;
(2)对样本中的SM22α进行检测,从而对心血管疾病进行预测、诊断和治疗预后评估。
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