CN111466337A - 一种腹主动脉瘤动物模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种腹主动脉瘤动物模型及其构建方法，该腹主动脉瘤动物模型以促红细胞生成素作为诱导剂。本发明所述的腹主动脉瘤动物模型造模时间短，成瘤率高，不需要外科手术，仅需腹腔注射，对动物创伤小，对实验人员技术要求低，可操作性强，并且不需要特定基因敲除小鼠，野生型即可实现。

Description

一种腹主动脉瘤动物模型及其构建方法

技术领域

本发明涉及动物模型构建领域，具体涉及一种腹主动脉瘤动物模型及其构建方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是一类发病率高、死亡率高、检出率低、控制率低的严重大血管疾病。AAA定义为腹主动脉局部扩张，其直径超过30mm，虽然有些作者将AAA定义为腹主动脉直径大于正常直径的50％，但由于不同个体的腹主动脉正常值变异较大，临床实践中常采用第一种定义。本病主要发生在老年男性，根据西方国家的流行病学调查结果，65岁以上男性AAA的发病率约为4％-7％，女性则为1％-2％。根据国家统计局2015年发布的人口数据，我国65岁以上的人口已占全国总人口的10.1％，为13755万人，如以男女各占50％、AAA男女平均发病率各为5.5％和1.5％计算，我国AAA发病人数高达480万人。鉴于吸烟是AAA最重要的危险因素，而我国是世界第一吸烟大国，实际的发病人数可能更多。

AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉，患者通常没有症状，即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉，患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA，因此早期发现极为困难。然而，AAA常呈进行性膨胀，内径增长速率约为1-6mm/年，AAA直径越大，扩张速度越快，AAA最大直径与AAA破裂风险之间呈指数曲线关系，尤其是在女性，女性发生AAA破裂时的腹主动脉直径较男性平均小10m。一旦发生AAA破裂，死亡率高达85％-90％，几乎是不治之症。如何发现AAA的发病原因和快速膨胀因素并进行有效的抑制，是临床医学界面临的重大难题。尽管在AAA发病机制的研究领域已取得了巨大进展，但目前尚无有效的临床预测因子或药物治疗来降低AAA的发病风险或限制其进展。β受体阻滞剂、抗生素和抗炎药的随机临床试验以及血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、他汀类药物、抗血小板药和金属蛋白酶抑制剂强力霉素的非随机临床试验均获得了阴性的结果，表明这些药物对于AAA的病程没有影响。当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时，可实施外科矫正术或血管内介入手术，术后存活率超过95％。因此，对于预防AAA破裂，手术矫正和支架介入是唯一有效的方法，但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药，已成为AAA研究领域中的当务之急。

促红细胞生成素(EPO)由165个氨基酸和4条分子量为34kd的紧密球状结构的碳水化合物侧链组成。EPO对正常红细胞的产生至关重要，主要由胎儿肝脏及成年人肾脏合成。组织氧分压降低时EPO的产生增加，缺氧诱导因子(HIF)被认为是EPO基因表达的主要转录因子，而缺氧诱导因子α-氨酰羟化酶是控制EPO产生的主要氧传感器。EPO主要通过刺激造血系统中的促红细胞生成素受体(EPOR)起到促进红细胞生成的作用。EPO的生理功能很大程度上取决于在全身组织中的分布。谱系追踪技术显示，在骨髓微环境中EPOR只分布于红系细胞中。在红系祖细胞中，EPOR形成的同型二聚体可被EPO配体激活，而由EPOR和βcR(CD131)亚基组成的异型二聚体能够发挥组织修复和保护的功能。EPO可在缺氧时由肾小管间质细胞产生，通过促进红细胞生成和抑制红细胞祖细胞的凋亡而增加红细胞数量，在这一过程中，EPO起到了循环激素样的作用。此外，EPO潜在的造血外功能也备受关注。研究表明，EPO可由肾脏以外组织产生，且EPORs在红系祖细胞以外的其他组织中亦有广泛分布。肾脏以外产生的EPO是通过旁分泌/自分泌的途径而发挥作用，而非造血功能中的激素样作用。在创伤和炎症反应中，EPO及其受体表达明显增加，从而触发创伤组织和器官中的关键保护反应。EPO的组织保护作用已在多个动物的疾病模型中得到证实，包括局灶性脑缺血、栓塞性卒中、创伤性脑损伤、心肌缺血、急性肾损伤、肢体缺血、组织创伤等。临床研究表明，在严重创伤患者中给予EPO治疗可降低患者的死亡率。

最近的研究发现，EPO可通过促进内皮细胞增殖迁移和基质金属蛋白酶2(MMP2)表达促进血管新生。尽管以往的研究发现，EPO可抑制心肌细胞凋亡并促进内皮细胞的NO合成而发挥心脏保护作用，但最近的汇总分析发现EPO治疗并未对急性心肌梗死患者的左室功能、梗死面积、心血管事件及全因死亡率产生益处。相反，高浓度血浆EPO可增加新发心力衰竭的危险性。此外，临床研究表明，接受腹主动脉腔内修复的AAA患者有三分之一患有贫血，其血红蛋白水平与AAA的大小呈独立负相关，但其机制并不明确。最近一项高脂血症小鼠中输注血管紧张素II(Ang II)的实验研究发现，抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)减弱了AAA的进展。众所周知，慢性贫血和HIF可增加EPO的生成，而最近的证据表明，Ang II可直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节EPO的基因表达来影响造血功能。

发明内容

因此，本发明的目的是在于提供一种新的AAA动物模型及其构建方法和应用。本发明所述的AAA动物模型以EPO为诱导剂，造模时间短，成瘤率高，且成瘤位置均位于腹主动脉段，更接近人体AAA特征，为实验研究中探索AAA的机制提供了新的工具。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种AAA动物模型，其以EPO作为诱导剂。所述动物模型尤其指小鼠模型。

本发明的所述的AAA动物模型中，成瘤位置均位于腹主动脉段，且腹主动脉段组织中显示动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管壁内可伴有血栓形成。

在本发明中，EPO诱导AAA时，不影响血压、血脂、肝功和肾功的变化。

在本发明的实施方式中，发明人以低、中、高剂量的EPO作为诱导剂构建AAA动物模型时，检测模型动物的收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组血压并没有明显变化；同样，检测模型动物总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现EPO干预后并未影响模型动物的血脂变化。因此，本发明采用EPO作为诱导剂构建AAA动物模型时，对模型动物的血压、血脂无显著影响。

在本发明的实施方式中，发明人以低、中、高剂量的EPO作为诱导剂构建AAA动物模型时，检测模型动物的丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组的指标并没有明显变化；取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色，组织形态亦没有明显差别。因此，本发明采用EPO作为诱导剂构建AAA动物模型时，不会引起肝脏和肾脏的功能障碍。

在本发明中，EPO是通过(EPOR)2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成。

在本发明的实施方式中，发明人发现采用EPO异源二聚体受体的选择性激活剂pHBSP，分别以高低剂量pHBSP干预发现其并不能诱导模型动物发生AAA，因而，本发明发现EPO导致的AAA模型的形成可能是EPO通过其同源二聚体受体(EPOR)2发挥作用。

在本发明中，EPO诱导AAA不依赖于高脂饮食和高胆固醇血脂。

在本发明的实施方式中，以EPO作为诱导剂构建AAA动物模型时，发明人分别以普通饲料和高脂或高胆固醇饲料饲喂模型动物，结果发现，高脂或高胆固醇饲料组与普通饲料组在AAA的发生率上并无明显区别。高脂饮食和高胆固醇血脂不影响EPO作为诱导剂形成AAA的剂量效应。因此，本发明采用EPO诱导AAA不依赖于高脂饮食和高胆固醇血脂的影响。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种构建上述第一方面中所述的AAA动物模型的方法，其包括向动物注射施与EPO。

在本发明的实施方式中，所述注射方式为腹腔注射。采用腹腔注射，不需要外科手术，对动物创伤小，对实验人员技术要求低，可操作性更强。

在本发明的实施方式中，EPO的单次注射剂量为不低于2,500IU/kg/day，优选地，EPO的单次注射剂量为5,000-10,000IU/kg/day。

在本发明的一些实施方式中，发明人发现EPO剂量依赖性的诱导AAA的形成，比如，在一些实施方式中，在相同饮食条件下，以2,500IU/kg/day作为低剂量组、以5,000IU/kg/day作为中剂量组、以及以10,000IU/kg/day作为高剂量组对动物进行腹腔注射，并以腹腔注射生理盐水作为对照组，施药相同时间后，相较于对照组EPO低剂量、中剂量以及高剂量组均产生了AAA，但，AAA的发生率为高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，腹主动脉直径明显增加，尤其是EPO中剂量和EPO高剂量组，明显高于对照组和EPO小剂量组。

在本发明的实施方式中，所述注射持续时间为2-6周，优选为4周。

在本发明的实施方式中，所述动物为鼠；所述鼠为Apoe^-/-小鼠或野生型小鼠。本发明发现EPO剂量依赖性地促进了AAA的形成，并在Apoe^-/-小鼠和野生型小鼠中均有较高的发生率。

在本发明的一些实施方式中，本发明探讨了EPO对ApoE^-/-小鼠和野生型小鼠AAA形成的影响，结果发现，以EPO作为诱导剂时，可以采用特定基因敲除的小鼠，但是不必然需要特定基因敲除的小鼠，野生型小鼠即可实现模型的构建。且EPO导致野生型小鼠AAA发生率更高。

此外，在本发明的实施方式中发现EPO导致ApoE^-/-小鼠AAA发生率与Ang II相当，但EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang II。

此外，本发明在研究中发现EPO诱导AAA雄性小鼠发病率高于雌性。

基于以上，在本发明的第三方面，本发明提供了EPO在构建AAA动物模型中的应用。

以及，在本发明的第四方面，本发明提供了EPO在制备用于构建AAA动物模型的产品中的应用。所述产品可以为药品或试剂。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种检测血清EPO水平的试剂或试剂盒在制备诊断AAA的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，AAA患者血清EPO水平高于正常人组群，EPO可作为诊断诊断AAA的标志物。

相较于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明以EPO构建AAA动物模型，不需要特定基因敲除小鼠，野生型即可实现；不需要微量渗透泵，节约成本；EPO为临床常用药物，容易获得；施药时，不需要外科手术，仅需腹腔注射，对小鼠创伤小，对实验人员技术要求低，可操作性强；并且造模所需时间短，成瘤率高，且成瘤位置均位于腹主动脉段，更接近人体AAA特征。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了EPO剂量依赖性地诱导ApoE^-/-小鼠AAA的发生；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠主动脉代表图片；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠AAA发生率比较；C.对照组或高中低剂量EPO组小鼠腹主动脉直径比较；D.对照组或高中低剂量EPO组小鼠死亡率比较(四条折线自上而下依次对应Vehicle、Low、Medium、High)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2示出了EPO导致ApoE^-/-小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂；A.Ang II诱导AAA和EPO高剂量组诱导AAA发生率的统计分析；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠腹主动脉组织H&E染色和Verhoff染色代表图片。***P<0.001。

图3示出了EPO对ApoE^-/-小鼠血压和血脂的影响；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠血压的比较(SBP、MBP、DBP每一项对应的四条柱状图从左至右依次为Vehicle、Low、Medium、High)；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠血脂的比较。SBP：收缩压；DBP：舒张压；MBP：平均动脉压；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇。

图4示出了EPO对ApoE^-/-小鼠肝脏和肾脏的影响；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮水平的比较；B.对照组或高剂量EPO组小鼠肝脏和肾脏组织H&E染色代表图片。ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；Cr：肌酐；BUN：尿素氮。

图5示出了高脂饮食对EPO剂量依赖性地诱导ApoE^-/-小鼠AAA发生的影响；A.给予正常饮食和高脂饮食喂养后，对照组或高中低剂量EPO组小鼠AAA发生率比较；B.高脂饮食高剂量EPO组和普通饮食高剂量EPO组小鼠死亡率的比较。ND：正常饮食；HFD：高脂饮食。

图6示出了EPO剂量依赖性地诱导野生型小鼠AAA的发生；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠主动脉代表图片；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠AAA发生率比较；C.对照组或高中低剂量EPO组小鼠腹主动脉直径比较；D.对照组或高中低剂量EPO组小鼠死亡率比较(四条折线自上而下依次对应Vehicle、Low、Medium、High)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；WT：野生型。

图7示出了EPO导致野生型小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂；A.Ang II诱导野生型小鼠AAA和EPO高剂量组诱导AAA发生率的统计分析；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠腹主动脉组织H&E染色和Verhoff染色代表图片。**P<0.01，***P<0.001；WT：野生型。

图8示出了EPO对野生型小鼠血压和血脂的影响；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠血压的比较(SBP、MBP、DBP每一项对应的四条柱状图从左至右依次为Vehicle、Low、Medium、High)；B.对照组或高中低剂量EPO组小鼠血脂的比较。WT：野生型；SBP：收缩压；DBP：舒张压；MBP：平均动脉压；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇。

图9示出了EPO对野生型小鼠肝脏和肾脏的影响；A.对照组或高中低剂量EPO组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮水平的比较；B.对照组或高剂量EPO组小鼠肝脏和肾脏组织H&E染色代表图片。WT：野生型；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；Cr：肌酐；BUN：尿素氮。

图10示出了EPO可诱导雌性ApoE^-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生；中剂量EPO诱导两种基因型雌性小鼠AAA的发生。

图11示出了pHBSP不能剂量依赖性地诱导小鼠AAA的发生；A.对照组或高低剂量pHBSP组ApoE^-/-小鼠主动脉代表图片；B.对照组或高低剂量pHBSP组野生型小鼠主动脉代表图片。

图12示出了AAA患者血清EPO水平和腹主动脉直径的分析；A.对照组和AAA患者血清EPO水平的比较；B.AAA患者中≤65岁和＞65岁患者动脉瘤直径的比较；C.AAA患者中男性和女性患者动脉瘤直径的比较；D.AAA患者中吸烟与不吸烟患者动脉瘤直径的比较。***P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

1、材料与方法

1.1研究对象

(1)7-8周龄雄性ApoE^-/-小鼠170只，基因背景C57/BL6J，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，引自美国Jackson Laboratory；

(2)7-8周龄雄性野生型小鼠110只，基因背景C57/BL6J，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司；

(3)7-8周龄雌性ApoE^-/-小鼠30只，基因背景C57/BL6J，购买自北京华阜康生物科技有限公司，引自美国Jackson Laboratory；

(4)7-8周龄雌性野生型小鼠30只，基因背景C57/BL6J，购买自北京华阜康生物科技有限公司。

以上所有动物实验程序均经山东大学齐鲁医院动物实验伦理委员会批准，并按照中国卫生部动物管理规定执行。所有实验小鼠饲养在山东大学齐鲁医院心血管重构与功能研究实验室动物房内。饲养环境为12小时光照/黑暗循环交替，温度湿度恒定，不限制饮食和饮水。

1.2实验仪器设备

(1)显微手术器械：购自杭州六六视觉医疗器械有限公司；

(2)鼠尾血压计：日本软隆株式会社，型号BP-2010A；

(3)宠物电推剪：深圳科德士电器有限公司，型号CP-8000；

(4)全自动生化分析仪：深圳雷杜生命科技，型号Chemray 240；

(5)兽用全自动血液细胞分析仪：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号BC-2800vet；

(6)4℃冰箱：中国合肥美菱股份有限公司，型号BCD-201KCK；

(7)-20℃冰箱：中国合肥美的电冰箱有限公司，型号BCD-545WKM(Q)；

(8)-80℃冰箱：英国New Brunswick Scientific公司，型号Innova U725；

(9)微型台式真空泵：美国Kylin-Bell Lab Instruments公司，型号GL-802B；

(10)脱色摇床：美国Kylin-Bell Lab Instruments公司，型号TS-2；

(11)液氮罐：查特低温设备(成都)有限公司，型号YDS-120-216；

(12)制冰机：意大利Scotsman公司，型号AF-156；

(13)全自动组织脱水机：德国Leica公司，型号TP1020；

(14)石蜡包埋机：德国Leica公司，型号HistoCore Arcadia H；

(15)石蜡包埋机冷台：德国Leica公司，型号HistoCore Arcadia C；

(16)轮转式切片机：德国Leica公司，型号RM2245；

(17)摊片机：德国Leica公司，型号HI 1210；

(18)烘片机：德国Leica公司，型号HI 1220；

(19)多功能染色机：德国Leica公司，型号ST5020；

(20)全自动封片机：德国Leica公司，型号CV5030；

(21)微波炉：美的微波电器，型号EM720FF2-NA1；

(22)双目显微镜：日本奥林巴斯株式会社，型号BX41-12P05；

(23)大体显微镜：日本奥林巴斯株式会社，型号SZ51；

(24)高压蒸汽灭菌器：三洋电机株式会社，型号MLS-3780；

(25)超纯水系统：美国默克密理博公司，型号Milli-Q；

(26)电热恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司，型号DK-8D；

(27)干燥箱：上海福玛实验设备有限公司，规格45*45；

(28)游标卡尺：日本三丰株式会社，型号1204-70；

(29)恒温恒湿箱：上海精宏实验设备有限公司，型号HWS-080；

(30)烘箱：德国BINDER公司，型号ED 400；

(31)电子天平：德国sartorius公司，型号：CP323S；

(32)干湿恒温器：杭州朗基科学仪器有限公司，型号BG32

(33)全波长光吸收酶标仪：美国Molecular Devices公司，型号SpectraMax Plus384。

1.3主要材料和试剂

(1)促红细胞生成素：购自沈阳三生制药股份有限公司，商品名益比奥；

(2)pHBSP：购自上海吉尔生化有限公司；

(3)高脂高胆固醇饲料：购自南通特洛菲饲料科技有限公司，货号为TP28521；

(4)普通饲料：购自江苏协同医药生物工程有限公司；

(5)异氟烷：购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；

(6)5-0缝合线：购自上海浦东金环医疗用品股份有限公司；

(7)植入式胶囊渗透压泵：购自四川成都医疗器械有限公司，型号为ALZET MODEL2004；

(8)戊巴比妥钠：购自国药集团化学试剂有限公司，货号为69020181；

(9)促凝管：购自美国BD公司，货号为367955；

(10)4％固定液：购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号为KGIHC016CS；

(11)组织包埋盒：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为31050102W；

(12)粘附载玻片：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为188105；

(13)显微镜盖玻片：购自江苏世泰实验器材有限公司，货号为10212450C

(14)环保透明剂：购自无锡市江原实业技贸总公司；

(15)乙醇：购自国药集团化学试剂有限公司；

(16)苏木素染液：购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号为G1005-1；

(17)伊红染液：购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号为G1005-2；

(18)弹力纤维染色试剂盒：购自英国abcam公司，货号为ab150667；

(19)人EPO Elisa试剂盒：购自美国R&D公司，货号为DEPRU0。

1.4主要试剂的配制

1％盐酸酒精

1.5实验方法

1.5.1动物模型的建立和分组

(1)第一部分：为了探讨EPO对雄性ApoE^-/-小鼠中AAA形成的剂量效应，EPO设计为大、中、小三个剂量。雄性ApoE^-/-小鼠60只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为4组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予EPO 2,500IU/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000IU/kg/day腹腔注射，高剂量组给予EPO 10,000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。

(2)第二部分：为了探讨高脂高胆固醇饮食是否影响EPO对雄性ApoE^-/-小鼠AAA形成的剂量效应，EPO设计为大、中、小三个剂量。雄性ApoE^-/-小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予EPO 2,500IU/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000IU/kg/day腹腔注射，高剂量组给予EPO 10,000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。

(3)第三部分：为了探讨EPO对雄性野生型小鼠中AAA形成的剂量效应，EPO设计为大、中、小三个剂量。雄性野生型小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，低剂量组给予EPO 2,500IU/kg/day腹腔注射，中剂量组给予5,000IU/kg/day腹腔注射，高剂量组给予EPO 10,000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。

(4)第四部分：为了探讨EPO对雌性ApoE^-/-小鼠和野生型小鼠AAA形成的影响，选取EPO中剂量进行实验。雌性ApoE^-/-小鼠30只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为2组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；雌性野生型小鼠30只，全程给予普通饲料喂养，随机分为2组，每组15只；其中对照组给予生理盐水腹腔注射，EPO组给予5,000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。

(5)第五部分：为了探讨EPO的异源二聚体受体对AAA形成的影响，本实验采用EPO异源二聚体受体的选择性激活剂pHBSP，并设计为高、低两个剂量。雄性ApoE^-/-小鼠45只，在给予4周高脂高胆固醇饲料喂养后，随机分为3组，每组15只，并且继续高脂高胆固醇喂养至实验结束；雄性野生型小鼠45只，全程给予普通饲料喂养，随机分为3组，每组15只；本实验采用的给药方式为植入式胶囊渗透压泵，配制好适当浓度的药品溶液，每个渗透压泵装入250μl液体，遂浸泡于生理盐水中，37℃孵育过夜，次日用异氟烷吸入麻醉小鼠，颈背部备皮消毒，沿肩胛骨连线处横向剪开背部皮肤，将渗透压泵埋于皮下，泵开口端朝向鼠尾，持续恒速泵入药物28天。其中对照组给予生理盐水持续泵入，低剂量组给予pHBSP 30mg/kg/day持续泵入，高剂量组给予pHBSP 300mg/kg/day持续泵入，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。

1.5.2鼠尾血压测量

在给予药物干预4周末，应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压，测量部位为小鼠尾动脉，每只小鼠检测3次，取其平均值作为最终数值。

1.5.3组织取材步骤

(1)小鼠取材前饥饿6-8小时；

(2)腹腔注射1％戊巴比妥钠，剂量为60mg/kg，以麻醉小鼠；

(3)待小鼠麻醉后，固定小鼠于工作台，提起腹部皮肤，沿腹部中央位置U型剪开腹腔，注意避开肝脏；沿肋骨测剪开膈肌，钝性分离心脏周围脂肪组织及心包膜，清晰暴露心脏；

(4)迅速用1ml无菌注射器从左心室侧壁进针，抽取1.5ml左右血液，少量滴入含EDTA抗凝管中，轻弹管壁，用于全血检测；剩余多量置于黄色促凝管中，促凝管中血液室温静置30分钟后3000RPM离心15分钟，收取血清，-80℃冰箱保存；

(5)剪开右心耳，使用输液器，心尖处进针灌入生理盐水，进行在体灌流，直至肝肾脂肪等组织灌流干净，右心耳处流出清亮液体；

(6)立刻分离心脏、肝脏、脾脏、肾脏、附睾脂肪组织、腹股沟皮下脂肪组织和主动脉；脾脏称重；主动脉包括升主动脉至髂动脉，仔细分离主动脉周围结缔组织，留出左右颈总动脉和左锁骨下动脉，血管大体拍照保存；并用游标卡尺测量腹主动脉段最大直径，当超过正常对照组平均直径的50％时，即认为AAA(King,V.L.,et al.,Selectivecyclooxygenase-2inhibition with celecoxib decreases angiotensin II-inducedabdominal aortic aneurysm formation in mice.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006.26(5):p.1137-43.)。

(7)各组织视实验需要一部分放入液氮速冻，后转移至-80℃冰箱保存，一部分置于5倍体积的4％多聚甲醛中固定48小时，以备后续实验。

1.5.4血脂血常规、肝肾功检测

(1)使用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量；

(2)使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。

1.5.5石蜡切片制备

(1)切取腹主动脉段血管组织或者肝肾组织块，厚度约0.5厘米，至石蜡包埋盒，如果体积过小，用纱布包绕组织，以防丢失；包埋盒用铅笔写清组别；

(2)包埋盒浸于自来水中，用流水冲洗去除甲醛，3-4小时；

(3)将包埋盒放入全自动组织脱水机器中，选择相应的程序；

(4)选择与组织大小合适的石蜡模具，将组织切面朝下浸于充满石蜡的模具中，置于冰台，待石蜡凝固后，取出蜡块，室温保存；

(5)使用石蜡切片机修切蜡块，暴露组织后，将蜡块浸入冰水混合物中2小时；

(6)后将石蜡组织切成5μm的连续薄片，放入37℃温水台中展平；

(7)用载玻片轻轻捞起，每个载玻片2-3块组织，控水，置于65℃烤台2小时，后收放与切片盒中，室温保存。

1.5.6石蜡切片脱腊至水步骤

(1)石蜡切片置于65℃烤箱30分钟；

(2)环保透明剂I10分钟；

(3)环保透明剂II 10分钟；

(4)100％乙醇5分钟；

(5)95％乙醇4分钟；

(6)90％乙醇3分钟；

(7)80％乙醇3分钟；

(8)70％乙醇2分钟；

(9)自来水I 5分钟；

(10)自来水II 5分钟；

(11)取出切片待染色。

1.5.7苏木素-伊红染色步骤

(1)石蜡切片脱腊至水后，置于苏木素染液中3分钟，镜下观察细胞核染为紫蓝色；

(2)将切片置于自来水中洗去苏木素浮色；

(3)将切片置于1％盐酸酒精分化数秒，镜下观察细胞质无色，细胞核仍为紫蓝色；

(4)流水中浸泡切片30秒-1分钟，直至细胞核变为蓝色；

(5)将切片置于伊红染液中3-5分钟，镜下观察细胞质染为粉红色；

(6)将切片置于自来水中洗去伊红浮色；

(7)80％乙醇5秒；

(8)95％乙醇1分钟；

(9)100％乙醇I 5分钟；

(10)100％乙醇II 5分钟；

(11)环保透明剂I 5分钟；

(12)环保透明剂II 5分钟；

(13)切片一侧滴加中性树胶，缓慢盖上盖玻片，避免气泡产生。

1.5.8 Verhoff弹力纤维染色

(1)石蜡切片脱蜡至水；

(2)放入弹力纤维染色液中，15分钟；

(3)自来水冲洗，洗去浮色；

(4)在Verhoff分化液中分化，15-20次，自来水冲洗；

(5)显微镜下观察分化程度，如需要可重复步骤4，至弹力纤维清晰可见；

(6)将切片放入硫代硫酸钠溶液浸泡1分钟，脱碘；

(7)流水冲洗；

(8)用配制好的Van Gieson染色液浸泡切片2-5分钟；

(9)95％乙醇1分钟；

(10)100％乙醇I 5分钟；

(11)100％乙醇II 5分钟；

(12)环保透明剂I 5分钟；

(13)环保透明剂II 5分钟；

(14)切片一侧滴加中性树胶，缓慢盖上盖玻片，避免气泡产生。

1.5.9酶联免疫吸附实验(ELISA)

(1)取出样品4℃解冻，瞬时离心；

(2)将ELISA检测试剂盒从4℃或者-20℃中取出，复温至室温；

(3)配制标准品，等比稀释原液，设置浓度梯度；

(4)将不同浓度的标准品和待检测样品合理分配加入包被好的酶标板中；

(5)将酶标板用封板膜粘上，37℃孵育1小时；

(6)用预先配制的洗涤液清洗酶标板，共5次，每次1分钟，每次将酶标板反扣于吸水纸上，拍打，将水吸干；

(7)每孔分别加入适量体积的酶标试剂；

(8)粘上封板膜，37℃孵育30分钟；

(9)用预先配制的洗涤液清洗酶标板，共5次，每次1分钟，每次将酶标板反扣于吸水纸上，拍打，将水吸干；

(10)避光显色，37℃孵育20分钟；

(11)加入终止液，用酶标仪测定各孔的OD值，激发波长为450nm；

(12)按照标准品吸光度和对应的蛋白浓度计算标准曲线，根据标准曲线公式，可计算得样品浓度。

1.5.10腹主动脉瘤病人血清收集

本实验纳入40例在2017年-2019年间经CT血管造影证实为腹主动脉瘤的住院患者，其中男性33例，女性7例，平均年龄为68.45±1.886，并在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组，其中男性36例，女性9例，平均年龄为66.00±1.196。此测定方案经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准，所有患者及志愿者均给予书面知情同意参与研究。

1.5.11数据统计分析

所有数据均以均数±标准误来表示，采用SPSS 19.0进行统计分析；使用Shapiro-Wilk检验检测数据是否符合正态分布，符合正态分布的两组计量资料采用独立样本t检验，多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验(方差齐)；不符合正态分布的数据采用秩和检验；计数资料采用卡方检验；生存分析采用Log-Rank检验；P＜0.05认为有统计学差异。

2、实验结果

2.1 EPO剂量依赖性地诱导ApoE^-/-小鼠AAA的发生

为了与经典AAA动物模型(Ang II诱导)进行对比，本实验首先选用雄性ApoE^-/-小鼠并给予高脂喂养(动物模型，第一部分)。腹腔注射高中低剂量EPO 4周后，发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率(图1A-1B)，其中EPO低剂量组发生率为7％，EPO中剂量组发生率为40％，EPO高剂量组发生率为60％；腹主动脉直径明显增加，尤其是EPO中剂量和EPO高剂量组，明显高于对照组和EPO小剂量组(图1C)；同时，随着AAA的发生率增加，小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加(图1D)，其中EPO低剂量组死亡率为0，EPO中剂量组死亡率为20％，EPO高剂量组死亡率为40％。而与Ang II诱导的AAA发生率(80％)相比，EPO高剂量组诱导的AAA发生率(60％)并无统计学差异(图2A)。由以上结果可知，EPO剂量依赖性的诱导ApoE^-/-小鼠发生了AAA。

2.2 EPO导致ApoE^-/-小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂

为了观察EPO诱导ApoE^-/-小鼠发生AAA后管壁的变化，本实验切取小鼠腹主动脉段组织，进行H&E染色和Verhoff弹力纤维染色，结果显示给予EPO低中高剂量注射后，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管腔内可伴有血栓形成(图2B)。

2.3 EPO不影响ApoE^-/-小鼠血压和血脂的变化

EPO干预4周后，检测小鼠收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组血压并无显著差异(图3A)；同样，检测小鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现EPO干预后并没有影响小鼠血脂变化(图3B)。由此推断，EPO注射4周，对小鼠的血压和血脂无显著影响。

2.4 EPO不影响ApoE^-/-小鼠肝功和肾功的变化

EPO干预四周后，检测小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组的指标并没有明显变化(图4A)；取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色，组织形态亦没有明显差别(图4B)。由此，从药物毒理学角度推测，EPO注射4周，并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。

2.5高脂饮食不影响EPO对ApoE^-/-小鼠AAA形成的剂量效应

为了明确高脂饮食在EPO诱导ApoE^-/-小鼠形成AAA中的作用，本实验选用雄性ApoE^-/-小鼠并全程给予普通饲料喂养(动物模型，第二部分)，发现EPO剂量依赖地增加了小鼠AAA的发生率，且与高脂喂养模型的发生率无显著差异(图5A)，其中普通饲料喂养的EPO低中高剂量组的发生率分别为7％、38.9％和60％；同时，高脂喂养与否，EPO高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义(图5B)。由此得出，高脂饮食不影响EPO对ApoE^-/-小鼠AAA形成的剂量效应。

2.6 EPO剂量依赖性地诱导野生型小鼠AAA的发生

本实验又选用了血脂水平正常的野生型小鼠给予EPO注射(动物模型第三部分)，腹腔注射高中低剂量EPO 4周后，发现EPO剂量依赖地增加了小鼠AAA的发生率(图6A-6B)，其中EPO低剂量组发生率为27％，EPO中剂量组发生率为53％，EPO高剂量组发生率为60％；腹主动脉直径明显增加，尤其是EPO中剂量和EPO高剂量组，明显高于对照组和EPO小剂量组(图6C)；同时，随着AAA的发生率增加，小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加(图6D)，其中EPO低剂量组死亡率为7，EPO中剂量组死亡率为27％，EPO高剂量组死亡率为47％。关键的是，EPO高剂量组诱导的AAA发生率(60％)明显高于Ang II诱导野生型小鼠的AAA发生率(13.3％)(图7A)。由以上结果可知，EPO剂量依赖性地诱导野生型小鼠发生了AAA。

2.7 EPO导致野生型小鼠腹主动脉管壁增厚和弹力板断裂

为了观察EPO诱导野生型小鼠发生AAA后管壁的变化，本实验切取小鼠腹主动脉段组织，进行H&E染色和Verhoff弹力纤维染色，结果显示给予EPO低中高剂量注射后，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管腔内可伴有血栓形成(图7B)。

2.8 EPO不影响野生型小鼠血压和血脂的变化

EPO干预4周后，检测小鼠收缩压、舒张压和平均动脉压，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组血压并无显著差异(图8A)；同样，检测小鼠总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇，发现EPO注射后并没有影响小鼠血脂水平(图8B)。由此推断，EPO注射4周，对小鼠的血压和血脂无显著影响。

2.9 EPO不影响野生型小鼠肝功和肾功的变化

EPO注射四周后，检测小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮，发现与对照组相比，EPO低剂量组、EPO中剂量组和EPO高剂量组的指标并无明显变化(图9A)；取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色，组织形态亦没有明显差别(图9B)。由此，从药物毒理学角度推测，EPO注射4周，并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。

2.10 EPO可诱导雌性ApoE^-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生

为进一步观察EPO是否可以让雌性小鼠发生AAA，本实验选取雌性ApoE^-/-小鼠和雌性野生型小鼠(动物模型，第四部分)，结果显示，在中剂量EPO影响下雌性ApoE^-/-小鼠发生率为21％，雌性野生型小鼠发生率为40％，均有AAA发生，但都略低于雄性小鼠发生率，这也符合人类AAA发病率中，男性高于女性的特征。

2.11 pHBSP不能剂量依赖性地诱导小鼠AAA的发生

为了探讨EPO的异源二聚体受体对AAA形成的影响，本实验选用EPO异源二聚体受体的选择性激活剂pHBSP，分为高、低剂量干预小鼠4周后(动物模型，第五部分)，结果显示pHBSP并不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA，因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用，导致AAA。

2.12 AAA患者血清EPO水平明显增高

为了评估血清EPO水平和AAA患者之间的关系，本实验收集了40例AAA患者和45例健康志愿者血清，检测其血清EPO浓度。两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显著差异，但吸烟者在AAA组比正常对照组更常见(表1)。在40例AAA患者中，11例患者接受了腹主动脉超声扫描，38例患者(95％)接受了腹部CT血管造影，34例患者(85％)接受了手术干预。通过分析显示，年龄在＞65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显著差异(图12B-12D)，这表明在这组患者中，AAA直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。相反，与健康对照组相比，AAA患者的血清EPO水平显著升高(图12A)，这表明该组患分泌了更多的EPO于循环血液中。

表1.健康对照组和AAA患者的临床特征

3、讨论

3.1 AAA动物模型和人类AAA病变特征

由于AAA的无症状特点，早期病例研究较少。人类AAA病变的主要特点为：①瘤体可发生破裂；②管壁破坏并出现夹层；③瘤体进行性增大；④管腔内血栓形成；⑤管壁内血栓形成；⑥常合并动脉粥样硬化；⑦血管中层变性；⑧管壁组织白细胞浸润(Senemaud,J.,etal.,Translational relevance and recent advances of animal models of abdominalaortic aneurysm.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017.37(3):p.401-410.)。但手术切除的AAA组织仅在晚期才获得，不能提供AAA起始和发展相关的信息。在这种情况下，AAA的基础研究尤其是动物模型的重要性与日俱增。目前，文献中已报告7种AAA动物模型(Senemaud,J.,et al.,Translational relevance and recent advances of animalmodels of abdominal aortic aneurysm.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2017.37(3):p.401-410.)：①弹性蛋白酶模型：在大鼠或小鼠的腹主动脉中局部加压滴注弹性酶，可降解管壁中层的弹性纤维，导致腹主动脉扩张；②脱细胞腹主动脉异种移植模型：将切除的豚鼠腹主动脉体外处理去除平滑肌细胞，然后移植入大鼠体内，诱发移植血管的免疫反应和进行性扩张；③囊状腹主动脉瘤模型：利用血管端-侧吻合技术和异种移植，可建立此种易于破裂的模型；④血管外膜氯化钙浸润模型：将浸泡氯化钙的纱布敷于小鼠腹主动脉外膜，钙离子可浸入管壁形成磷酸钙而破坏弹性纤维，导致腹主动脉扩张；⑤血管紧张素II皮下泵注射模型：在高脂喂养的ApoE^-/-或LDLR^-/-小鼠埋置皮下注射泵，持续注射大剂量血管紧张素II，可导致AAA，这是目前最常应用的动物模型；⑥赖氨酰氧化酶抑制剂模型：此酶由血管平滑肌细胞所分泌，负责前胶原和弹性蛋白原之间的共价键连接以形成不可溶性的原纤维，在大鼠或小鼠中长期使用赖氨酰氧化酶抑制剂β-氨基丙腈，可导致腹主动脉中层变性、弹力纤维断裂、外膜中性粒细胞浸润和AAA；⑦盐皮质激素和盐负荷模型：在小鼠中使用去氧皮质酮或醛固酮以及高盐饮食，可增强氧化应激而诱发AAA。

3.2 Ang II诱导的AAA动物模型

在上述的动物模型中，Daugherty A创立的Ang II注射模型与人类AAA的病理改变最为相似，表现出一些与人类一致的病理特征，包括炎性浸润、细胞外基质(ECM)降解、中膜层细胞凋亡、血管新生、氧化应激和夹层内血栓形成(Maegdefessel,L.,R.L.Dalman,andP.S.Tsao,Pathogenesis of abdominal aortic aneurysms:microRNAs,proteases,genetic associations.Annu Rev Med,2014.65:p.49-62.；Satoh,K.,et al.,Cyclophilin A enhances vascular oxidative stress and the development ofangiotensin II-induced aortic aneurysms.Nat Med,2009.15(6):p.649-56.；Escudero,P.,et al.,Combined treatment with bexarotene and rosuvastatinreduces angiotensin-II-induced abdominal aortic aneurysm in apoE(-/-)mice andangiogenesis.Br J Pharmacol,2015.172(12):p.2946-60.)，因此该模型成为基础实验研究中最常用的模型。然而，这种动物模型依然有重要的局限性。首先，人类AAA的主要危险因素是吸烟，吸烟诱发AAA的风险与吸烟数量和持续时间成正比，而Daugherty A模型依赖RAS的过度激活，这种模型需要在小鼠中注入超生理剂量的Ang II以诱导AAA，大量Ang II泵入势必会导致高血压和血管损伤，而在AAA患者中，高血压只是一个次要的危险因素，与正常血压人群相比，高血压患者发生AAA的OR值仅为1.25(Kent,K.C.,et al.,Analysis ofrisk factors for abdominal aortic aneurysm in a cohort of more than 3 millionindividuals.J Vasc Surg,2010.52(3):p.539-48.)。虽然文献报道，该模型诱导血管壁发生重构，独立于Ang II介导的动脉血压升高(Daugherty,A.,M.W.Manning,andL.A.Cassis,Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms inapolipoprotein E-deficient mice.J Clin Invest,2000.105(11):p.1605-12.)，但作为Ang II副作用仍不可忽视。其次，高脂血症是获得高发生率AAA小鼠模型的必要条件。据文献报道在野生型小鼠中注射Ang II，AAA的发生率只有10％-20％(Lu,H.,et al.,Hypercholesterolemia induced by a PCSK9 gain-of-function mutation augmentsangiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms in C57BL/6 mice-briefreport.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2016.36(9):p.1753-7.)。在该实验中，Ang II诱导野生型小鼠AAA发生率为15.4％。Ang II诱导AAA模型的应用依赖于ApoE^-/-小鼠、LDLR^-/-小鼠或PCSK9功能突变后诱发高胆固醇血症的野生型小鼠(Lu,H.,et al.,Hypercholesterolemia induced by a PCSK9 gain-of-function mutation augmentsangiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms in C57BL/6 mice-briefreport.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2016.36(9):p.1753-7.)。而在临床研究中，高胆固醇血症与AAA的相关较弱，与正常血脂人群相比，高胆固醇血症患者发生AAA的OR值仅为1.34。另外Ang II诱导的AAA模型瘤体无进行性增大，管腔内无血栓形成。上述原因解释了为何由AAA动物模型得出的药物靶点在临床试验中均以失败而告终，而控制人群吸烟却可收到意外的效果(Svensjo,S.,et al.,Low prevalence of abdominal aorticaneurysm among 65-year-old Swedish men indicates a change in the epidemiologyof the disease.Circulation,2011.124(10):p.1118-23.)。即便如此，对ApoE^-/-小鼠注射Ang II以诱发AAA的研究进行荟萃分析的结果显示，AAA的发生率为60％(Trachet,B.,etal.,Incidence,severity,mortality,and confounding factors for dissecting AAAdetection in angiotensin II-infused mice:a meta-analysis.Cardiovasc Res,2015.108(1):p.159-70.)。该实验中对ApoE^-/-小鼠注射Ang II以诱发AAA的发生率高达80％，而死亡率却高达47％。因此，目前的AAA动物模型远非理想，亟需发现一个无需Ang II输注和高脂喂养而诱发AAA的造模新方法。

3.3 EPO诱导的AAA动物模型

本实验研究者在EPO与脂代谢的研究中意外发现，在小鼠中使用EPO可导致AAA的发生。在最初的研究中，选用EPO剂量为3000IU/kg，每周三次，给予小鼠腹腔注射20周后，腹主动脉瘤形成率约为30％。由于Ang II造模时间为4周，为了与经典模型有较好的比较，本实验增加了EPO剂量，并设为高中低三个剂量组(10,000IU/kg/day，5,000IU/kg/day，2,500IU/kg/day)，同样给予4周腹腔注射发现，EPO剂量依赖性地诱导ApoE^-/-小鼠发生AAA，且EPO高剂量组发生率为60％。考虑到ApoE^-/-小鼠饲以高脂饮食，可能加重AAA的发生和发展，本实验又选用普通饮食饲以ApoE^-/-小鼠发现，与高脂饮食相比，高中低剂量EPO依然可以诱导AAA，且发病率和死亡率无统计学差异。

由于AAA总是与主动脉壁的严重动脉粥样硬化损伤相关，因此它一直被认为是动脉粥样硬化的后果。然而这一传统观点近年来受到越来越多的挑战。临床和基础研究表明，AAA的发病机制与动脉粥样硬化性疾病有若干不同。日本学者的研究表明，在AAA患者中冠心病的发病率仅为53％，提示动脉粥样硬化不可能是AAA的病因(Ito,S.,et al.,Differences in atherosclerotic profiles between patients with thoracic andabdominal aortic aneurysms.Am J Cardiol,2008.101(5):p.696-9.)。对Ang II诱导的AAA发病的进程发现，动脉夹层的出现要早于动脉粥样硬化的形成(Saraff,K.,et al.,Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis inangiotensin II-infused,apolipoprotein E-deficient mice.Arterioscler ThrombVasc Biol,2003.23(9):p.1621-6.)。虽然在成熟的动脉瘤组织中存在明显的动脉粥样硬化病变，但一些因素表明它们是独立发展的，而不是作为AAA的启动因子。因此，本实验选用血脂水平正常的野生型小鼠，给予EPO腹腔注射，4周后发现高剂量EPO组的AAA发生率达60％，远远超过Ang II诱导野生型小鼠AAA的15.4％，且更符合上述人类AAA的特征。

不管是ApoE^-/-小鼠还是野生型小鼠，给予EPO注射后，血流动力学和血脂都没有发生变化，这符合人类高血压高胆固醇血症与AAA相关性较弱的特征。并且EPO组小鼠的肝功和肾功也没有明显变化，从药物毒理学角度推测，EPO注射4周，并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。相比于其他AAA动物模型，EPO诱导的AAA更具夹层动脉瘤的特征，且不需要手术操作，简单易行。这些结果表明，在ApoE^-/-小鼠和野生型小鼠体内注射EPO提供了一种新的夹层动脉瘤的动物模型，这比传统的Ang II灌注ApoE^-/-小鼠模型具有优势，为在实验研究中探索AAA的机制提供了新的工具。

3.4性别和AAA发病率

男性AAA的发病率比女性高四倍以上(Singh,K.,et al.,Prevalence of andrisk factors for abdominal aortic aneurysms in a population-based study:TheTromso Study.Am J Epidemiol,2001.154(3):p.236-44.)，男性的发病率估计在1.3％到8.9％之间，女性的发病率估计在1.0％到2.2％之间(Sakalihasan,N.,R.Limet,andO.D.Defawe,Abdominal aortic aneurysm.Lancet,2005.365(9470):p.1577-89.；Lederle,F.A.,et al.,Abdominal aortic aneurysm in women.J Vasc Surg,2001.34(1):p.122-6.)，但性别是AAA不可改变的危险因素。在观察影响AAA动物模型成瘤率的各种因素时，发现注入Ang II的雄性小鼠的发病率和死亡率远远高于雌性小鼠(Trachet,B.,etal.,Incidence,severity,mortality,and confounding factors for dissecting AAAdetection in angiotensin II-infused mice:a meta-analysis.Cardiovasc Res,2015.108(1):p.159-70.)。睾酮被证明是Ang II诱导AAA性别差异的主要调节因子，因为阉割雄性小鼠使其AAA的发病率可降低至年龄相当的雌性小鼠的水平，而给予双氢睾酮则使阉割雄性小鼠的AAA发生率恢复(Henriques,T.,et al.,Androgen increases AT1areceptor expression in abdominal aortas to promote angiotensin II-inducedAAAs in apolipoprotein E-deficient mice.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008.28(7):p.1251-6.)。另有研究表明，阉割雄性小鼠可以阻止Ang II诱导的AAA的进展，表现为更小的AAA管腔直径，增厚的血管壁，平滑肌细胞和胶原沉积更明显(Zhang,X.,et al.,Castration of male mice prevents the progression of established angiotensinII-induced abdominal aortic aneurysms.J Vasc Surg,2015.61(3):p.767-76.)。因此，本实验选择了雌性ApoE^-/-小鼠和雌性野生型小鼠给予EPO注射，结果显示雌性小鼠均有AAA发生，但都低于雄性小鼠发生率，这与在人体动脉瘤中观察到的结果一致。

3.5 EPO受体类型与AAA

促红细胞生成素(EPO)是一种主要产生于肾脏的进化保守激素，其在促红细胞生成中具有不可或缺的作用。EPO属于1型细胞因子超家族，由165个氨基酸形成的四个α螺旋。在人体中，由于高水平的糖基化，使得肾脏产生的EPO血浆半衰期为5-6小时。当红细胞水平降低，肾小管间质细胞检测到相对缺氧，便以经典的内分泌方式将EPO分泌到血液循环中。随后，EPO迁移至骨髓，与红细胞祖细胞上的同型二聚体(EPOR)2结合，促进红细胞生成。由于(EPOR)2的高亲和力，当受经典的负反馈通路调节时，人血清中微量的EPO便能够维持红细胞生成的稳态。正常人血清EPO浓度在1-10pmol/L范围内。近年来，大量研究表明EPO的作用远远超出红细胞生成。内皮细胞是首先发现的对EPO有反应的非造血细胞，其受体的激活引起内皮细胞有丝分裂和迁移。然而，这种活性所需EPO的有效浓度(1-2nmol/L)明显高于造血所需EPO的有效浓度。随后，神经系统、肾脏和心脏也被证明对EPO有反应，但与内皮细胞相似，它们需要的EPO浓度高于造血所需的浓度。红细胞前体表达的(EPOR)2与非造血细胞表达的受体，在亲和力上存在显著差异，提示不同组织中的EPO受体作用强度不同。1型细胞因子超家族受体的显著特征是它们通常由不同的亚基组成，βcommon receptor(βCR或CD131)即为1型细胞因子共享的亚基受体，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素3(IL-3)和白介素5(IL-5)。由亲和力色谱分析法和共免疫沉淀观察到，βCR和EPOR形成了一个异源二聚体复合物。而在βCR缺失时，EPO和其衍生物的组织保护和愈合作用消失。EPO的衍生物不具备促红细胞生成作用，但仍显示出组织保护功能。这些研究表明，EPO及其衍生物的组织保护作用主要是由异源二聚体EPOR/βCR介导的(Yang,C.,et al.,A novelproteolysis-resistant cyclic helix B peptide ameliorates kidney ischemiareperfusion injury.Biochim Biophys Acta,2014.1842(11):p.2306-17.；Peng,B.,etal.,Erythropoietin and its derivatives:from tissue protection to immuneregulation.Cell Death Dis,2020.11(2):p.79.)。该受体通常不在正常组织中表达，而是由损伤或炎症所迅速诱导。基于这一认识，近年开发了EPO衍生物，可选择性地激活EPOR/βCR异源二聚体，而不与EPOR同型二聚体相互作用。最新一代的EPOR/βCR异源二聚体特异性配体称为焦谷氨酸螺旋B表面肽(pHBSP)，由11个氨基酸根据EPO在螺旋B区域的三维结构构而建成。尽管pHBSP的血浆半衰期很短，但它能激活下游分子从而引发持续的生物学效应，这在许多疾病动物实验模型和临床试验中都已观察到。为了探讨EPO通过哪种类型的受体发挥促AAA的作用，本实验选用EPO异源二聚体受体的选择性激活剂pHBSP，分为高、低剂量用于小鼠，4周后发现，pHBSP并不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA，因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用，导致AAA。

3.6 AAA患者与血清EPO水平

临床上EPO主要用于治疗慢性肾衰竭继发贫血或恶性肿瘤伴发贫血的病人。对于需要长期EPO治疗的严重贫血患者，建议定期行腹部超声或CT检查以监测AAA的发生。另外，由于EPO的表达受HIF的调控，而缺氧是HIF的重要调控因素之一，因此慢性缺氧患者，如慢性高原病患者，应引起重视。与正常人群对比，慢性高原病患者的骨髓细胞HIF-1α和EPOR表达变化不明显，但骨髓细胞中HIF-2α和EPO显著增高，并明显增加微血管密度，由此属于AAA高风险人群，如有必要应对生活在高海拔的无症状人群进行AAA筛查。阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSA)是一种常见的疾病，反复的呼吸暂停使心血管系统暴露于重复性缺氧和二氧化碳潴留的环境中。有报道显示，有40％的小型AAA患者存在OSA，OSA患者可能更容易发生AAA并进展。在多元回归分析中，OSA被确定为AAA扩张的一个强有力的独立预测因子。通过本实验收集的AAA患者与健康人血清对比发现，AAA患者体内血清EPO水平明显升高，提示本实验血清EPO水平对于预测AAA发病或许有着重要作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种腹主动脉瘤动物模型，其特征在于，以促红细胞生成素作为诱导剂。

2.根据权利要求1所述的腹主动脉瘤动物模型，其特征在于，所述动物模型的成瘤位置位于腹主动脉段，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管壁内可伴有血栓形成。

3.根据权利要求1所述的腹主动脉瘤动物模型，其特征在于，促红细胞生成素诱导的腹主动脉瘤动物模型中，血压、血脂、肝功和肾功的变化不受影响。

4.根据权利要求1所述的腹主动脉瘤动物模型，其特征在于，EPO通过其同源二聚体受体(EPOR)2发挥作用导致腹主动脉瘤；

优选地，促红细胞生成素诱导腹主动脉瘤不受高脂饮食和高胆固醇血脂的影响；

优选地，所述动物模型为小鼠模型。

5.权利要求1至4中任一项所述的腹主动脉瘤动物模型的构建方法，其包括向动物注射施与促红细胞生成素；

优选地，所述注射方式为腹腔注射。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，促红细胞生成素的单次注射剂量为不低于2,500IU/kg/day；

优选地，促红细胞生成素的单次注射剂量为5,000-10,000IU/kg/day；

优选地，所述注射持续时间为2-6周，优选为4周。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述动物为鼠；

优选地，所述鼠为Apoe^-/-小鼠或野生型小鼠。

8.促红细胞生成素在构建腹主动脉瘤动物模型中的应用。

9.促红细胞生成素在制备用于构建腹主动脉瘤动物模型的产品中的应用。

10.一种检测促红细胞生成素水平的试剂或试剂盒在制备诊断腹主动脉瘤的产品中的应用。

Images