CN117625775A - 一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents
一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物及其应用。本发明提供了一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物——NSun2基因或其编码的蛋白，NSun2在HCM患者心肌组织、非HCM心肌肥厚患者心肌组织中的表达显著高于正常人心肌组织，差异具有统计学意义。因此，NSun2可作为心肌肥厚的辅助诊断指标，用于评估诊断区分心肌肥厚患者和正常人；而且，采用NSun2表达水平诊断区分心肌肥厚患者和正常人时，其ROC曲线下面积AUC为0.881，对应的灵敏度为76.5％，特异度为88.2％，具有较高的准确性，为临床对心肌肥厚诊断提供了新的参考依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物及其应用。
背景技术
在成人心脏中，心肌细胞始终末分化的。单个心肌细胞不再增殖，而是增大，心脏出现肥大以降低心室壁张力和维持心输出量，从而应对心脏负荷的增加。心肌肥厚最初是作为对各种病理刺激的适应性反应而诱发的，如慢性高血压、心肌梗塞、主动脉瓣狭窄、二尖瓣反流、贮积性疾病和编码肌纤维蛋白的基因突变(肥厚型心肌病，HCM)。除非在早期阶段立即消除这些压力，否则肥厚的心脏很容易进入失代偿状态，最终导致心力衰竭。
一般认为，病理状态主要通过神经内分泌激素和机械力促进心脏肥厚重塑，同时伴有大量下游效应通路激活，而PKA信号在调节心脏性能和形态方面发挥着重要作用。在肥厚应激状态下，PKA使离散微域中的靶蛋白磷酸化，以增加心脏体积、改善心肌的收缩和舒张功能。
NSun2最初被认为是tRNA胞嘧啶甲基转移酶，现在已被广泛研究其甲基化mRNA(5-甲基胞嘧啶，m5C)的能力影响RNA代谢过程的几乎所有方面，包括mRNA的成熟、翻译和降解。但NSun2是否参与了心脏后负荷过载情况下心肌的适应性重构和心肌功能调节，尚未可知。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物及其应用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种用于心肌肥厚辅助诊断的生物标志物，所述生物标志物为NSun2基因或其编码的蛋白。
通过Western Blot检测NSun2在正常大鼠心室肌细胞(NRVMs)、Ang II诱导的肥厚型NRVMs细胞、PE(苯丙肾上腺素)诱导的肥厚型NRVMs细胞中的表达情况，发现NSun2在AngII、PE诱导的肥厚型NRVMs细胞中的表达水平显著高于正常NRVMs细胞，差异具有统计学意义；说明NSun2在心肌肥厚的大鼠NRVMs细胞中表达上调。
通过Western Blot检测NSun2在TAC诱导心肌肥厚小鼠模型心肌组织、假手术小鼠心肌组织中的表达情况，发现NSun2在TAC诱导心肌肥厚小鼠模型心肌组织中表达水平显著高于假手术小鼠，差异具有统计学意义；说明NSun2在心肌肥厚的小鼠心肌组织中表达上调。
通过Western Blot检测NSun2在正常人心肌组织、HCM患者心肌组织、非HCM心肌肥厚患者心肌组织中的表达情况，发现NSun2在HCM患者心肌组织、非HCM心肌肥厚患者心肌组织中的表达显著高于正常人心肌组织，差异具有统计学意义；说明NSun2在心肌肥厚患者心肌组织中表达上调。
本发明第二方面提供了NSun2基因或其编码的蛋白的检测试剂在制备心肌肥厚辅助诊断产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blot、Western Blot、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中NSun2基因或其编码的蛋白的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述产品含有与NSun2蛋白特异性结合的抗体或特异性扩增NSun2基因的引物。更加优选地，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单域抗体。
根据上述的应用，优选地，所述产品的检测样本为细胞、组织或血清。
根据上述的应用，优选地，所述产品进行心肌肥厚诊断时，预测心肌肥厚的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))；其中，PRE表示概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，NSun2/GAPDH为NSun2与GAPDH蛋白表达量的比值。
根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
根据上述的应用，优选地，所述心肌肥厚为压力负荷性心肌肥厚。
本发明第三方面提供了一种用于心肌肥厚辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒中含有NSun2基因或其编码的蛋白的检测试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂为通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blot、Western Blot、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中NSun2基因或其编码的蛋白的表达水平的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂含有与NSun2蛋白特异性结合的抗体或特异性扩增NSun2基因的引物。更加优选地，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单域抗体。
根据上述的试剂盒，优选地，的检测样本为细胞、组织或血清。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒进行心肌肥厚诊断时，预测心肌肥厚的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))；其中，PRE表示概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，NSun2/GAPDH为NSun2与GAPDH蛋白表达量的比值。
根据上述的试剂盒，优选地，所述心肌肥厚为压力负荷性心肌肥厚。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果如下：
本发明首次发现NSun2在心肌肥厚患者心肌细胞中表达显著上调，因此，NSun2可作为心肌肥厚的辅助诊断指标，用于评估诊断区分心肌肥厚患者和正常人；而且，采用NSun2表达水平诊断区分心肌肥厚患者和正常人时，其ROC曲线下面积AUC为0.881，对应的灵敏度为76.5％，特异度为88.2％，具有较高的准确性，为临床对心肌肥厚诊断提供了新的参考依据。
附图说明
图1为大鼠NRVMs细胞中NSun2、MYH7、GAPDH表达的Western Blot的检测结果图；其中，A为Western Blot检测经PE、Ang II诱导后NRVMs中NSun2、MYH7、GAPDH表达水平，B为A图的灰度统计结果；PE表示PE诱导处理的NRVMs细胞，Ang II表示Ang II诱导处理的NRVMs细胞，Vehicle表示正常NRVMs细胞；
图2为人心肌细胞中NSun2表达的Western Blot的检测结果；其中，A为WesternBlot检测健康对照(Normal)、HCM(肥厚性心肌病)、Non-HCM Hypertrophy(主动脉狭窄左心室肥厚)心脏组织中NSun2、MYH7、GAPDH的表达水平，B为A图的统计结果；
图3为TAC诱导心肌肥厚小鼠的超声心动检测结果；其中，TAC表示TAC诱导组，Sham表示假手术组；
图4为TAC诱导心肌肥厚小鼠的心脏HE染色检测结果图；其中，TAC表示TAC诱导组，Sham表示假手术组；
图5为TAC诱导心肌肥厚小鼠心肌细胞中NSun2表达的Western Blot的检测结果；其中，A为Western Blot检测TAC术后4周，心脏细胞中NSun2、MYH7、GAPDH的表达水平结果图，B为A图的统计结果，TAC表示TAC诱导心肌肥厚小鼠，Sham表示假手术小鼠；
图6为构建NSun2 cKO小鼠的模式图；
图7为NSun2 cKO小鼠心肌细胞中NSun2、GAPDH的表达水平的Western Blot检测结果；其中，NSun2 cKO表示NSun2 cKO小鼠，NSun2 f/f表示NSun2flox/flox小鼠；
图8为NSun2 cKO小鼠超声心动检测检测结果；其中，NSun2 cKO表示NSun2 cKO小鼠，NSun2f/f表示NSun2flox/flox小鼠；
图9为NSun2 cKO小鼠心脏HE染色图，其中，NSun2 cKO表示NSun2 cKO小鼠，NSun2f/f表示NSun2flox/flox小鼠；
图10为AC诱导处理后NSun2 cKO小鼠的超声心动检测结果；
图11为FF组、FT组、CT组小鼠心肌细胞中NSun2表达的Western Blot的检测结果；其中，A为Western Blot检测FF组、FT组、CT组心肌细胞NSun2、MYH7、Caspase3、GAPDH的表达水平，B为A的统计结果图；
图12为FF组、FT组、CT组小鼠心脏HE染色结果；
图13为NSun2甲基化修饰PRKACA基因mRNA并影响其表达及PKA活性分析结果图；A为筛选差异表达的编码蛋白的基因，进行GO分析功能注释的结果图；B为GV软件对不同组的PRKACA富集m5C峰进行可视的结果图；C为m5C-RIP检测PRKACA甲基化水平结果图；D为Western Blot检测PRKACA蛋白表达水平结果图；E为PKA活性检测结果图；**，P≤0.01；
图14为健康对照组、心肌肥厚组心脏组织中NSun2表达量的Western Blot检测结果；
图15为训练集中NSun2诊断区分心肌肥厚和健康对照的ROC曲线；
图16为验证集中NSun2诊断区分心肌肥厚和健康对照的ROC曲线。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：NSun2在大鼠心室肌细胞(NRVMs)中的表达情况研究
采用Western Blot检测检测大鼠正常NRVMs细胞、诱导心肌肥厚的NRVMs细胞中的NSun2表达。
1、实验方法：
(1)、NRVMs细胞分离：
1-3日龄的斯普拉格-道利大鼠提取心脏，用冰冷的PBS冲洗，以消除任何残留的血液。随后，心室解剖并切碎成小碎片，然后在由1mg/ml胶原酶II和0.125％胰蛋白酶组成的消化缓冲液中进行酶解。在37℃的水浴中轻轻摇晃，直到心室块完全消失，然后加入含有10％FBS的F12培养基终止消化。取上清液，上清液经100μ过滤器过滤，500rpm离心5min。丢弃上清液，悬浮细胞颗粒用100mm组织培养皿在完全培养基(F12培养基(Gibco)与10％胎牛血清(FBS)(Gibco)，20U/ml青霉素，20U/ml链霉素)中37℃培养90min后，将心肌细胞悬浮在上清液中，收集上清，得到NRVMs细胞上清液，剩余液体附着成纤维细胞丢弃。
(2)、诱导心肌肥厚：
将步骤1)得到的NRVMs细胞上清液在500rpm下离心5min，弃上清，收集心肌细胞，用含有溴脱氧尿苷(100μmol/L，sigma)的完全培养基重悬心肌细胞，并以1×106cells/dish的密度置于35mm组织培养皿中培养48h，然后用无血清培养基替换培养基继续培养24h。随后，加入Ang II(1M)或PE(苯丙肾上腺素，100M)(均购自MCE)，培养48h，诱导心肌细胞肥厚。
(3)、Western Blot检测大鼠NRVMs细胞中NSun2表达：
Western Blot检测心肌细胞中NSun2表达的具体步骤如下：
1)蛋白提取及定量
弃去细胞中的培养基，用PBS清洗细胞表面两次，胰酶消化或者用细胞刮将细胞收集到离心管中，4℃、3000rpm，离心5分钟；吸弃上清，加入RIPA裂解液(含100×cocktail)200μl(以6孔板为例)，冰上裂解30分钟，每10分钟震荡混匀；4℃、12000rpm离心10分钟，弃沉淀。
将蛋白样品按一定倍数稀释后，取25μl置于96孔板中；另取25μl H2O作空白对照，从5个不同浓度的牛血清蛋白标准液(125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml，2000μg/ml)中各取出25μl，加入96孔板中，再向各孔中加入200μl BCA反应混合液(A液:B液＝50:1)，37℃孵育30分钟，在酶标仪上检测570nm处吸收峰，根据不同浓度蛋白标准液读数拟合得到的标准曲线，然后根据样品的吸光度值计算得到样品的蛋白质浓度。
2)SDS-PAGE电泳
根据蛋白浓度，取适量细胞裂解液，加入6×SDS蛋白上样缓冲液(100mM Tris-HCl，200mM DTTpH＝6.8，4％SDS，0.01％溴酚蓝，20％甘油)，混匀后95℃孵育5分钟，上样，准备电泳。电泳系统具体如下：
表1浓缩胶成分组成
| 浓缩胶： | 4ml |
| 30％Acr-Bis(Acr:Bis＝29:1) | 0.67ml |
| 1MTris-HCl,pH6.8 | 0.5ml |
| 10％SDS | 0.04ml |
| 10％AP | 0.04ml |
| TEMED | 0.004ml |
| dddH2O | 2.7ml |
表2分离胶成分组成
| 分离胶： | 10ml |
| 30％Acr-Bis(Acr:Bis＝29:1) | 4ml |
| 1.5MTris-HCl,pH8.8 | 2.5ml |
| 10％SDS | 0.1ml |
| 10％AP | 0.1ml |
| TEMED | 0.005ml |
| dddH2O | 3.3ml |
表35×Tris-甘氨酸电泳缓冲液成分组成
| Tris | 15.1g |
| 甘氨酸 | 94g |
| 10％SDS | 50ml |
| 加ddH2O至 | 1000ml |
样品在浓缩胶中以10V/cm，分离胶中以15V/cm的电压电泳至溴酚蓝距凝胶底部1cm时停止电泳。
(3)湿式转膜
取出凝胶，去除浓缩胶部分，裁剪与待转印凝胶大小相同的滤纸4张及硝酸纤维素膜(NC膜)1张，将膜在转膜缓冲液(48mM Tris，39mM甘氨酸，20％甲醇)浸泡5分钟以上。阴极板上整齐地堆放4张以转印缓冲液浸湿的滤纸，将凝胶对齐放于其上。将膜覆盖在凝胶上，作好标记，将另外4张浸湿的滤纸放在膜上，将阳极板盖上，整个过程注意排出气泡。根据蛋白分子量大小，采用250mA恒流转印90-120分钟。将硝酸纤维素膜取下，进行下面的杂交反应。
(4)杂交和结果处理
将转印好的NC膜用TBST(20mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.5％Tween 20)漂洗5分钟。室温摇床上用含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时；用TBST漂洗2次，按抗体说明书比例分别加入一抗(浓度0.2μg/ml)NSun2(#36103S，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，USA))、MYH7(#sc-53090，Santa Cruz,CA,USA)、BNP(A2179,Abclonal，Wuhan,Hubei,China)、GAPDH(#AC001，Abclonal，Wuhan,Hubei,China)，4℃孵育过夜。室温下用TBST漂洗5分钟×4次，加入相应的HRP-标记的二抗(1:2000)或荧光标记二抗(1:2000)，室温下避光孵育1小时。TBST漂洗5分钟×4次，用ECL超敏发光液暗室曝光或者采用Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描。使用Image-J软件，对Western Blot曝光结果进行灰度扫描并分析。
2、实验结果
大鼠NRVMs细胞中NSun2、MYH7、GAPDH的Western Blot的检测结果如图1所示。
由图1可知，与正常大鼠NRVMs细胞相比，NSun2和MYH7在Ang II、PE诱导的心肌肥厚NRVMs细胞中表达均显著上调，表明NSun2可能参与了心肌肥厚的调控。
实施例2：NSun2在人心肌组织中的表达情况研究
采用Western Blot检测检测正常人心肌细胞、心肌肥厚患者心肌细胞中的NSun2表达。
1、样本选取：
收集8例健康人的心脏组织和8例心肌肥厚患者的心脏组织，其中，8例心肌肥厚患者包括4例肥厚性心肌病(HCM)患者和4例主动脉狭窄左心室肥厚(Non-HCM)患者，结合严重左心室流出道阻塞(流出道压力梯度≥50毫米汞柱)和接受改良手术部分心室肌肉切除健康成人心脏组织)。
2、实验方法：
分离8例健康人的心脏组织和8例心肌肥厚患者的心脏组织的心肌细胞，采用Western Blot检测检测正常人心肌细胞、心肌肥厚患者心肌细胞中的NSun2表达。WesternBlot的具体操作步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
3、实验结果
人心肌细胞中NSun2表达的Western Blot的检测结果如图2所示。
由图2可知，与正常人心肌细胞相比，NSun2和MYH7在心肌肥厚患者的心肌细胞中表达均显著上调，表明NSun2可能参与了心肌肥厚的调控。
实施例3：NSun2在TAC诱导心肌肥厚小鼠模型心肌细胞中的表达情况研究
采用Western Blot检测TAC诱导的小鼠心肌肥厚的小鼠模型中NSun2的表达水平。
1、实验小鼠选取及分组：
野生型c57小鼠购自Gempharmatech科技有限公司(Nanjing,Jiangsu,China)。并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠均在特定(温度：20-25℃；湿度：50±5％)屏障条件下，在单独的通风笼中饲养。
将实验小鼠随机分为TAC诱导组、假手术组，每组11只。TAC诱导组小鼠进行TAC手术处理，假手术组(Sham)小鼠行相同的手术，但没有进行结扎处理。
2、TAC诱导心肌肥厚小鼠模型的构建
使用8-10周龄的小鼠(体重：20-25g)，并通过腹腔注射克他命/甲苯噻嗪(55mg/kg/3.3mg/kg)麻醉。当小鼠被深度麻醉时，切开气管前部的皮肤，分离肌肉组织。轻轻抬起并切开第二根肋骨，拉到两侧，充分暴露主动脉弓。采用6-0尼龙缝合线收紧并结扎26号针，以完成右无名、左颈总动脉之间的横主动脉收缩，然后缝合胸骨和皮肤。多普勒超声心动图显示经主动脉横切速度大于4m/s，证实了TAC手术成功。将小鼠转移到加热垫上，并进行密切监测。当小鼠恢复意识时，每天给予丁丙诺啡(1mg/kg皮下注射)两次，连续2天。所有操作人员和分析人员均采用盲法随机化，以避免小鼠基因型偏好。假手术组(Sham)小鼠行相同的手术，但没有进行结扎处理。
3、TAC诱导心肌肥厚小鼠模型的心肌性能检测：
(1)超声心动检测
TAC手术成功后4周，采用带有MS400C探头的Vevo 3100系统对TAC诱导组、假手术组小鼠进行超声心动检测。通过测量乳头肌水平的二维肌模式来确定收缩期和舒张期心室直径和壁厚。计算射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心室壁厚度(LVAW,s收缩末期左室前壁厚度；LVPW,s收缩末期左室后壁厚度)和心脏重量/胫骨长度比(HW/TL)，以及心室腔大小(LVID,s收缩末期左室直径；LVID,d舒张末期左室直径)。具体结果如图3所示。
由图3可知，TAC诱导的心肌肥厚小鼠模型中，EF、FS、LVAW,s、LVPW,s、和HW/TL增加，LVID,s、LVID,d明显减少，提示成功诱导代偿性心肌肥厚。
(2)TAC诱导的心肌肥厚小鼠心脏HE染色检测
TAC术后4周，心脏在室温下用4％多聚甲醛固定，24小时内进行石蜡切片或2小时内冷冻切片。脱水后，用石蜡(石蜡切片)或OCT(冷冻切片)包埋后，切片沿短轴连续切片5μm，直到达到心脏的最大短轴横截面。采用HE染色评估心脏形态。使用奥林巴斯数字扫描成像系统FV1000(Olympus,Tokyo,Japan)进行扫描后，使用Image J软件(NIH，Bethesda，MD，USA)对捕获的图像进行定量分析。具体结果如图4所示。
由图4可知，与Sham组相比，TAC组小鼠心脏变大，心肌明显增厚。
4、TAC诱导处理后的小鼠心脏组织心肌细胞中NSun2表达的Western Blot检测
(1)小鼠心肌细胞的分离：
TAC术后4周，使用Langendorff灌注仪分离TAC诱导心肌肥厚小鼠的心肌细胞。具体步骤如下：
小鼠在开始手术前腹腔注射1000U/kg的肝素30min。随后，用5％异氟醚麻醉，颈椎脱位处死。取包含主动脉约2-3mm的心脏，放置于Langendorff灌注系统。给心脏灌注无钙培养基(135mM NaCl,4mM KCl,1mM MgCl2,10mM HEPES,0.33mM NaH2PO4,10mM D-(+)-Glucose,10mM BDM,5mM taurine，调整pH至7.4)，用酶心肌细胞分离缓冲液(无钙培养基、525U/mlII型胶原酶和0.67g/L BSA)，在37°下10-15min，一旦心脏达到柔软、肿胀、粉红色状态，将心脏从插管的注射器针上取下，切除多余的组织和血管，将左心室在酶心肌细胞分离缓冲液中切成小块。轻轻地上下抽吸枪头，直到所有的细胞都被分离出来。细胞悬液用100目的细胞过滤器进行过滤。静息10min，重复过滤3次后，收集自然沉降的心肌细胞。
(2)Western Blot检测
采用Western Blot检测TAC诱导心肌肥厚小鼠模型心肌细胞中NSun2、MYH7、GAPDH的表达水平。Western Blot检测的具体操作步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
Western Blot的检测结果如图5所示。
由图5可知，与Sham组小鼠相比，TAC诱导心肌肥厚小鼠心肌细胞中NSun2和MYH7的表达显著上调，表明NSun2可能参与了心肌肥厚的调控。
实施例4：小鼠心肌细胞Nsun2基因敲除及基因敲除后对心肌的影响研究
1、小鼠选取：
NSun2flox/flox小鼠在C57/BL6背景下使用Cyagen生物科学公司(Suzhou,Jiangsu,China)的CRISPR/cas9靶向和同源定向修复。野生型小鼠和Myh6-CreERT2购自Gempharmatech科技有限公司(Nanjing,Jiangsu,China)。并在研究开始前接受适应性喂养1周。所有小鼠均在特定(温度：20-25℃；湿度：50±5％)屏障条件下，在单独的通风笼中饲养。
2、心肌细胞Nsun2基因敲除小鼠(NSun2 cKO小鼠)模型构建：
NSun2flox/flox/Myh6-CreERT2(NSun2 cKO)小鼠通过NSun2flox/flox小鼠和Myh6-CreERT2小鼠之间的交配和繁殖获得(如图6所示)，采用PCR扩增进行验证基因分型。条件敲除NSun2基因的NSun2 cKO小鼠在8周龄时，每天采用75mg/kg他莫昔芬(T-5648，sigma)腹腔注射，连续注射5天，使cre重组酶在雄性小鼠中被激活。。
3、NSun2 cKO小鼠心肌细胞中Nsun2表达的Western Blot检测：
使用Langendorff灌注仪分离NSun2 cKO小鼠的心肌细胞(他莫昔芬最后一次注射完成后4周)，具体操作与实施例3相同，在此不再赘述。
采用Western Blot检测NSun2 cKO小鼠、NSun2flox/flox小鼠心肌细胞中NSun2、GAPDH的表达水平。Western Blot检测的具体操作步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
Western Blot的检测结果如图7所示。
由图7可知，NSun2 cKO小鼠心肌中NSun2几乎完全缺失，表明NSun2 cKO小鼠模型构建成功。
4、NSun2 cKO小鼠超声心动检测
NSun2 cKO小鼠超声心动检测的具体操作与实施例3相同，在此不再赘述。超声心动检测结果图图8所示。
由图8可知，与NSun2flox/flox小鼠相比，敲除NSun2不会影响小鼠的心脏功能或心室壁厚度、直径和HW/TL指数。
5、NSun2 cKO小鼠心脏HE染色：
NSun2 cKO小鼠心脏HE染色的具体实验方法与实施例3相同，在此不再赘述。NSun2cKO小鼠心脏HE染色结果如图9所示。
由图9可知，小鼠心脏NSun2基因敲除后，心脏大小和形态几乎没有变化。以上实验说明，心脏特异性敲除NSun2不会影响小鼠心肌细胞的大小或心脏功能。
实施例5：TAC诱导对NSun2 cKO小鼠心肌影响的研究
对NSun2 cKO小鼠进行TAC诱导，研究小鼠心肌细胞敲除NSun2基因后的心肌肥厚代偿反应。
1、小鼠选取及实验分组：
选取实施例4中构建的NSun2 cKO小鼠和NSun2flox/flox小鼠。实验设置三个分组，分别为FF组、FT组、CT组，每组9只小鼠；其中FF组是采用NSun2 cKO小鼠作为实验对象，并对NSun2 cKO小鼠进行TAC诱导处理；FT组是采用NSun2flox/flox小鼠作为实验对象，并对NSun2flox/flox小鼠进行TAC诱导处理；CT组是采用NSun2flox/flox小鼠作为实验对象，不对NSun2flox/flox小鼠进行TAC诱导处理，只进行假手术处理(假手术处理是指小鼠行相同的手术，但没有进行结扎处理)。
2、TAC诱导处理：
NSun2 cKO小鼠他莫昔芬最后一次注射完成后4周)，对NSun2 cKO小鼠进行手术处理。具体操作如下。
通过腹腔注射克他命/甲苯噻嗪(55mg/kg/3.3mg/kg)对小鼠进行麻醉。当小鼠被深度麻醉时，切开气管前部的皮肤，分离肌肉组织。轻轻抬起并切开第二根肋骨，拉到两侧，充分暴露主动脉弓。采用6-0尼龙缝合线收紧并结扎26号针，以完成右无名、左颈总动脉之间的横主动脉收缩，然后缝合胸骨和皮肤。多普勒超声心动图显示经主动脉横切速度大于4m/s，证实了TAC手术成功。将小鼠转移到加热垫上，并进行密切监测。当小鼠恢复意识时，每天给予丁丙诺啡(1mg/kg皮下注射)两次，连续2天。所有操作人员和分析人员均采用盲法随机化，以避免小鼠基因型偏好。
3、TAC诱导处理后NSun2 cKO小鼠心脏超声心动检测：
TAC术后4周，采用带有MS400C探头的Vevo 3100系统对TAC诱导心肌肥厚小鼠进行超声心动检测。通过测量乳头肌水平的二维肌模式来确定收缩期和舒张期心室直径和壁厚。计算射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心室壁厚度(LVAW,s收缩末期左室前壁厚度；LVPW,s收缩末期左室后壁厚度)和心脏重量/胫骨长度比(HW/TL)，以及心室腔大小(LVID,s收缩末期左室直径；LVID,d舒张末期左室直径)。具体结果如图10所示。
由图10可以看出，敲除NSun2使心脏功能进入失代偿阶段。
4、Western Blot检测：
TAC术后4周，从FF组、FT组、CT组小鼠中每组随机选取6只小鼠，使用Langendorff灌注仪分离FF组、FT组、CT组选取的18只小鼠的心肌细胞，采用Western Blot检测小鼠心肌细胞中NSun2的表达水平。其中，使用Langendorff灌注仪分离FF组、FT组、CT组小鼠的心肌细胞的具体操作与实施例3相同，在此不再赘述；Western Blot检测的具体操作步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
Western Blot的检测结果如图11所示。
由图11可知，敲除NSun2后，心肌肥厚相关marker MYH7明显降低，心脏功能进入失代偿阶段。
5、小鼠心脏HE染色：
TAC术后4周，对FF组、FT组、CT组小鼠心脏进行HE染色，HE染色的具体实验方法与实施例3相同，在此不再赘述。小鼠心脏HE染色结果如图12所示。
由图12可知，在NSun2基因敲除的情况下，TAC诱导处理不会引发心脏肥厚反应。
实施例6：NSun2调控心肌细胞肥厚的机制研究
采用m5C-RIP测序检测实施例5中FF组、FT组、CT组小鼠心肌细胞中PRKACA的mRNAm5C甲基化水平。
1、m5C-RIP-seq检测：
TAC术后4周，从FF组、FT组、CT组小鼠中每组随机选取6只小鼠，使用Langendorff灌注仪分离FF组、FT组、CT组选取的18只小鼠的心肌细胞，，使用Trizol试剂(Invitrogen，#15596026)从Langendorff分离的心肌细胞中提取总RNA。用DNase I提取RNA后进行DNA酶切。用NanodropTMOneC分光光度计(Thermo Fisher科学公司)检测A260/A280，检测RNA质量。用Qsep 100(BIOptic Inc)确认RNA完整性(RQN)。200μg总RNA用VAHTS mRNA捕获珠富集多聚腺苷化RNA(VAHTS,cat.NO.N401-01/02)。将20mM ZnCl2加入到mRNA中，在95℃下孵育5-10min，直到RNA片段主要分布在100-200nt内。然后将10％的RNA片段保存为“input”，其余用于m5C免疫沉淀。将特异性抗m5C抗体(Abcam，ab10805)用于m5C免疫共沉淀。使用Trizol试剂制备Input和IP的RNA样本。通过MeRIP实验和高通量测序筛选差异表达的编码蛋白的基因，并差异表达的蛋白进行GO分析功能注释，其结果如图13中A所示。MeRIP实验和高通量测序和数据分析由Seqhealth Technology有限公司(中国武汉)进行。
用IGV软件对不同组的PRKACA富集m5C峰进行可视化，如图14中B所示。
由图13中B可知，与对照组FF相比，TAC诱导使PRKACA基因m5C甲基化水平升高，而NSun2基因敲除明显降低了TAC诱导的PRKACA基因m5C峰的富集。
2、用m5C-RIP-qPCR验证PRKACAmRNA上的甲基化：
TAC术后4周，从FT、CT组小鼠中分离出的心肌细胞的总RNA用DNaseI(ThermoFisher Scientific)处理，用RNA片段试剂(ThermoFisher Scientific，AM8740)切成100-200个核苷酸片段，乙醇沉淀纯化RNA。将5微克lgG和m5C抗体(Abcam,ab10805)在4℃下与50uL蛋白A/G磁珠预结合2小时。片段RNA与MeRIP缓冲液(10mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.1％NP-40，pH7.4,0.4U/μLRNase抑制剂)混合，与蛋白A/G磁珠在4℃孵育4小时。样品在IP洗涤缓冲液中洗涤4次。通过蛋白酶K消化、苯酚氯仿提取和乙醇沉淀提取结合RNA。Input和m5C富集的RNA用随机六聚体的上标III进行逆转录，并用定量PCR进行分析。计算甲基化修饰水平如图13中C所示。
由图13中C可知，在小鼠心肌细胞中，敲除NSun2明显降低了PRKACAmRNA的m5C甲基化水平。由此说明，RNAm5C修饰在调节心脏功能和稳态中发挥重要作用，而在心脏肥厚重塑过程中NSun2介导的PRKACAmRNA的m5C甲基化水平增加。
3、检测FT、CT组小鼠心肌中PRKACA蛋白表达及PKA活性
TAC诱导手术处理后4周，使用Langendorff灌注仪分离FT组、CT组小鼠的心肌细胞，采用Western Blot检测FT组、CT组小鼠心肌细胞中PRKACA的表达水平。PRKACA抗体购自Abclonal，Wuhan,Hubei,China(A18603)。Western Blot检测结果如图13中D所示。
PKA活性检测使用PKA比色活性试剂盒(EIAPKA；ThermoFisher Scientific)，通过测量特定PKA底物的磷酸化水平来检测PKA活性。每次测定使用来自langendorff分离的心肌细胞的30ug的蛋白质样品。PKA活性检测结果如图13中E可知。
由图13中D可知，敲除NSun2小鼠，PRKACA蛋白表达水平明显下降；由图13中E可知，TAC模型可增加PKA活性，而敲除NSun2使得PKA活性明显下降。由此说明，NSun2可甲基化PRKACA的mRNA，调控PRKACA蛋白表达，影响PKA信号活性进而影响心肌细胞肥厚进程。
实施例7：NSun2用于心肌肥厚诊断的能力评估
为了进一步验证NSun2用于心肌肥厚诊断的能力，进一步收集新样本采用WesternBlot检测新样本心脏组织中NSun2的表达量，根据表达量构建心肌肥厚诊断模型，并评估其诊断价值。
1、实验样本
收集24例健康人(健康组)和49例心肌肥厚患者(心肌肥厚组)的心脏组织。
样本的纳入和排除标准如下：
心肌肥厚样本来自于：肥厚型心肌病(原发性)以及因先天性主动脉弓缩窄(或主动脉瓣狭窄)所致心肌肥厚(继发性心肌肥厚)导致流出道梗阻需行改良Morrow手术切除部分心肌的患者。原发性肥厚性心肌病诊断标准依据《中国成人肥厚型心肌病诊断与治疗指南2023》，成人(年龄≥18岁)，超声心动图或者磁共振检查左心室舒张末期任意部位室壁厚度≥15mm，或致病基因检测阳性者或者遗传受累家系成员检查发现左心室壁厚度≥13mm；排除其他的心血管疾病或全身性、代谢性疾病引起的心室壁增厚。改良Morrow手术标准：心肌肥厚诊断明确，年龄>18周岁；存在呼吸困难、晕厥或心功能障碍的劳力性或非劳力性症状；左室流出道压差(休息或激发)>50mmHg；室间隔与左室后壁比值>1.3:1；或无症状患者左室流出到静息压差>75mmHg。
健康对照样本来自于拟行心脏移植但因各种原因未移植成功的供体心脏样本，排除心脏疾病及其他遗传病。
2、Western Blot检测：
采用Western Blot检测健康组、心肌肥厚组心脏组织心肌细胞中的NSun2、GAPDH的表达量，并计算NSun2、GAPDH表达量的比值。Western Blot的具体操作步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
NSun2、GAPDH表达量的比值结果如图14所示。
由图14可知，心肌肥厚组患者心肌细胞中NSun2/GAPDH水平明显高于健康组。
3、心肌肥厚诊断模型的构建及诊断价值评估
按7:3的比例将24例健康人和49例心肌肥厚患者的心脏组织随机分为训练集和验证集；其中，训练集中心肌肥厚患者34例(记作心肌肥厚组)，健康对照17例(记作健康组)；验证集中心肌肥厚患者15例(记作心肌肥厚组)，健康对照7例(记作健康组)。
(1)心肌肥厚诊断模型的构建
以训练集心肌样本中NSun2、GAPDH表达量的比值(记作NSun2/GAPDH)作为自变量，是否患心肌肥厚为因变量，对心肌肥厚组和健康组心脏样本中NSun2/GAPDH表达量比值进行Logistic回归分析，构建诊断区分心肌肥厚患者和健康对照的诊断模型，该诊断模型为：
PRE(P＝HCM)＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))；其中，PRE表示预测概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，NSun2/GAPDH表示NSun2表达量与GAPDH蛋白表达量的比值。
将训练集中健康对照组、心肌肥厚组心脏样本中NSun2/GAPDH表达量比值带入上述诊断模型，即可得到各个心脏样本的预测概率(即PRE值)，根据预测概率绘制ROC曲线，ROC曲线如图15所示。进一步根据ROC曲线的坐标计算约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，约登指数最大时对应的PRE值为诊断区分心肌肥厚患者和正常人的最佳截断值，并计算灵敏度和特异度
由图15可知，NSun2诊断区分心肌肥厚患者和健康对照的ROC曲线下面积AUC为0.881，最佳截断值为0.590，对应的灵敏度为76.5％，特异度为88.2％，具有较高的诊断价值，能够用于心肌肥厚的辅助诊断。
(2)采用验证集验证该诊断模型诊断心肌肥厚的价值
将验证集中15例心肌肥厚患者和7例健康对照心肌样本中NSun2与GAPDH蛋白表达水平的比值代入上述构建的诊断模型PRE(P＝HCM)＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))中，即可得到各个心脏样本的预测概率。根据预测概率绘制ROC曲线(如图16所示)，验证NSun2与GAPDH蛋白表达水平的比值诊断心肌肥厚的价值。以约登指数最大时对应的PRE值为最佳截断值，并计算对应的灵敏度和特异度。
由图16可知，验证集中该诊断模型区分心肌肥厚和正常人的ROC曲线下面积AUC为0.810，与训练集基本一致；而且，灵敏度达到了71.4％，特异度达到了100％。
这也再次证明心肌样本中NSun2与GAPDH蛋白表达水平的比值能够用于心肌肥厚的诊断。而且，采用诊断模型PRE(P＝HCM)＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×
NSun2/GAPDH)))进行心肌肥厚诊断时，将受试者心肌样本中NSun2与GAPDH蛋白表达水平的比值带入上述诊断模型中，计算受试者的PRE值，若PRE值大于等于最佳截断值，则初步判定受试者为心肌肥厚患者，后续可以再进行其它检查手段再进一步排查，若PRE值小于最佳截断值，则初步判定受试者为健康对照。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.NSun2基因或其编码的蛋白的检测试剂在制备心肌肥厚辅助诊断产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blot、Western Blot、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中NSun2基因或其编码的蛋白的表达水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品含有与NSun2蛋白特异性结合的抗体或特异性扩增NSun2基因的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品的检测样本为细胞、组织或血清；所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或单域抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品进行心肌肥厚诊断时，预测心肌肥厚的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))；其中，PRE表示概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，NSun2/GAPDH为NSun2与GAPDH蛋白表达量的比值。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述心肌肥厚为压力负荷性心肌肥厚。
8.一种用于心肌肥厚辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有NSun2基因或其编码的蛋白的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern Blot、Western Blot、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中NSun2基因或其编码的蛋白的表达水平的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂含有与NSun2蛋白特异性结合的抗体或特异性扩增NSun2基因的引物；所述试剂盒进行心肌肥厚诊断时，预测心肌肥厚的概率计算公式为：PRE＝1/(1+EXP(-(-12.27+667.5×NSun2/GAPDH)))；其中，PRE表示概率，EXP表示以自然常数e为底的指数函数，NSun2/GAPDH为NSun2与GAPDH蛋白表达量的比值。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109853A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-09-27 | 上海市胸科医院 | 一种肺腺癌诊断标志物及其应用 |
| CN115873937A (zh) * | 2022-08-15 | 2023-03-31 | 苏州市立医院 | 一种预测反复种植失败发生的生物标志物及其应用 |
| CN117079710A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-17 | 上海爱谱蒂康生物科技有限公司 | 生物标志物及其在预测和/或诊断utuc肌肉浸润中的应用 |
| CN117563017A (zh) * | 2023-11-30 | 2024-02-20 | 唐颢 | NSun2基因或其编码的蛋白压力负荷性心力衰竭治疗中的应用 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115109853A (zh) * | 2022-08-12 | 2022-09-27 | 上海市胸科医院 | 一种肺腺癌诊断标志物及其应用 |
| CN115873937A (zh) * | 2022-08-15 | 2023-03-31 | 苏州市立医院 | 一种预测反复种植失败发生的生物标志物及其应用 |
| CN117079710A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-17 | 上海爱谱蒂康生物科技有限公司 | 生物标志物及其在预测和/或诊断utuc肌肉浸润中的应用 |
| CN117563017A (zh) * | 2023-11-30 | 2024-02-20 | 唐颢 | NSun2基因或其编码的蛋白压力负荷性心力衰竭治疗中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LINDSEY VAN HAUTE: "NSUN2 introduces 5-methylcytosines in mammalian mitochondrial tRNAs", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 47, no. 16, 5 July 2019 (2019-07-05), pages 8720 * |
| XIAOLEI CHENG: "Circulating cardiac MicroRNAs safeguard against dilated cardiomyopathy", CLIN. TRANSL. MED., 3 May 2023 (2023-05-03), pages 1 - 21 * |
| 李恩: "miR-455-3p通过靶基因HDAC2抑制心肌梗死后心肌肥厚", 实用医学杂志, vol. 32, no. 22, 30 November 2016 (2016-11-30), pages 3654 - 3657 * |
| 郑丽娜: "NSUN2对阿霉素诱导 H9C2细胞损伤的作用及机制", 湖北医药学院学报, vol. 42, no. 3, 30 June 2023 (2023-06-30), pages 252 - 256 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117563017A (zh) * | 2023-11-30 | 2024-02-20 | 唐颢 | NSun2基因或其编码的蛋白压力负荷性心力衰竭治疗中的应用 |
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