【発明の詳細な説明】
ニューロン細胞の誘導および維持法
発明の背景
受精卵から胚葉の形成、そして引き続きボディプラン (body plan)を導く過程
を解明することは、発生学の中心課題である。脊椎動物のボディプランの発生に
ついて知られていることの多くは、両性網の研究からのものであり、その形幼生
段階では、主要な体軸は、頭、脈幹および尾のように前区から後区に組織される
背側構造脊索、脊髄および体節から成る。全ての動物組織が３つの胚葉から派生
し、そして中胚葉は体軸の組織化において中枢的役割を果たす (Keller,R.,細胞 生物学における方法(Methods in Cell Biology
)、KayおよびPeng編集、アカデミ
ック出版：サンディエゴ、1991)。原腸形成の変化を導く中胚葉の細胞 (Keller
ら、(1989) Development 103:193-210;およびWilsonら、(1989) Development 10
5:155-166)は、神経系のパターン化 (patterning)に必要であり (Mangoldら、(1
933) Natyrwissenschaften 21:761-766;およびHemmati-Brivanlouら、(1990) Sc
ience 250:800-802)、そしてそれら自体は筋肉、骨格、循環および排泄系を生じ
る。さらに、初期原腸からの背側の中胚葉の一部、スペマンの形成体は、別の部
位に移植後に第二の体軸を誘導し、そして組織することができる (Spemannら、(
1924) Arch mikr Anat EntwMech 100:599-638)。
全ての脊椎動物において神経系の発生は、原腸形成の終点までたどることがで
きる。この時点で、胚の背側の外胚葉は表皮性から神経性へとその成長（fate）
を変化させる。新たに形成した神経性外胚葉は厚くなり、数種の脊椎動物では中
心溝（神経溝）および厚くなった側方縁(later
al edges:神経ひだ)が特徴である神経板と呼ばれる平坦化した構造を形成する。
この分化の初期段階で、神経板はその前後区（Ａ−Ｐ）および中外側軸（Ｍ−Ｌ
）に沿って局所的な分化の兆候をすでに表す。神経ひだは最終的に背中線で融合
し、そして前区で脳に、ならびに後区で脊髄に分化する神経管を形成する。神経
管が閉じると、事前の中外側の分化により背側／腹側の分化が達成される。こう
して神経胚形成の終わりに、神経管は明らかな前−後（Ａ−Ｐ）、背腹側（Ｄ−
Ｖ）および中外側（Ｍ−Ｌ）極を有する（例えば、神経科学の原理(Principles in Neural Science
)、第３版、Kandel、SchwartzおよびJcssell編集、サイエン
ス出版社(Science Publishing Campany)；NY、1991;およびDevelopment Biology
（第３版）、S.F.Gilbert編集、シナウアーアソシエイツ (Sinauer Associate:
サンダーランド、マサチューセッツ州、1991を参照にされたい)。
カエル胞胚中で原腸形成前に、３つの胚葉が上から下へと単純に配列する。外
胚葉は上、すなわち動物極から、中胚葉は中、すなわち辺縁層から、そして内胚
葉は下、すなわち植物極から生じる。中胚葉は動物極細胞中（動物キャップ）に
植物極から発する信号により誘導されることができる。数種のペプチド成長因子
が、インビトロで動物キャップ中に中胚葉を誘導できることが確認された。動物
キャップ組織は胞胚から外植され、そして隔離されて培養された時に、表皮の球
になる。しかし中胚葉誘導因子の存在下では、動物キャップは脊索、筋肉および
血液を含む中葉誘導物に分化するだろう。繊維芽細胞増殖因子ファミリーの一員
、特に塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF)およびトランスフォーミング成長因子
−β (TGF-β)ファミリー、特にアクチビンおよびVg-1は、この
アッセイの有力な誘導物質である。Wnt遺伝子一ファミリーのアフリカツメガエ
ルの相同物も、中胚葉誘導において役割を有する。Xwnt1(McMahonら、(1989) Ce ll
58,1075-1084)およびXwnt8メッセンジャーＲＮＡの両方が、初期の胚の腹側
に注射されたとき、背側の中胚葉形成、Vg-1および少ないがアクチビンＲＮＡと
共有する活性を引き出す。bFGFおよびアクチビンタンパク質は初期胚に検出する
ことができるが、アクチビンの局在する場所に関するデータは無く、bFGFは初期
胞胚の辺縁層および植物極に存在する証拠がある。Vg-1は適切な時期に、かつ中
胚葉をインビボで誘導する原因として知られている右側領域に存在する。Xwnt1
およびXwnt8は、背側の中胚葉誘導を起こすのに適切な時期または場所には存在
せず、この役割を果たす他のXwntが存在するのかもしれない。
動物細胞間では多種類の伝達が起こっている。これらは血中を循環し、そして
適切なレセプターを有する体内の任意の細胞に作用する比較的安定なホルモンの
ような長期の作用から、それとは離れてわずか２−３ミクロンの距離だけに作用
する大変不安定な神経伝達物質の速やかな作用まで様々である。発生において特
に重要なのは、胚誘導と呼ばれる種類の細胞相互作用であり、これには隣接細胞
間に、または場合によっては10細胞直径よりも広範囲にわたって作用する効果が
含まれる（Saxenら、(1989) Int J Dev Biol 33:21-48；およびGurdonら、(1987
) Development 9:285-306)。胚誘導は1つの組織または細胞（誘導性），と別の
組織または細胞（反応性）との間の相互作用と定義され、その結果反応性細胞が
分化の方向に変化を受ける。この相互作用はしばしば、脊椎動物の発生において
最も重要なメカニズムの１つと考えられ、細胞間の分化を導き、そして細胞を組
織および器官へ組織化する。脊椎動物およびおそらく無
脊椎動物の成長した器官は、上皮と間充織細胞との間、すなわち外胚葉／内胚葉
および中胚葉との間の相互作用を通してそれそれ形成される。
発生の細胞相互作用の効果は様々である。典型的には、細胞を反応細胞の非誘
導および誘導状態のいずれとも異なる細胞に誘導することにより、反応性細胞は
１つの細胞分化経路から別の経路へとそらされる（誘導）。時折、細胞はその隣
接細胞の分化を自身のように誘導する（同質誘導）；他の場合では細胞はそれ自
身のように隣接細胞が分化することを阻害する。初期発生における細胞相互作用
は、２種類の細胞間の最初の誘導が多様性を進行的に増幅するような連続的なも
のであってよい。さらに、誘導的な相互作用は胚に起こるだけでなく、成長細胞
にも同様に生じ、そして形態学的パターンを確立そして維持し、同時に分化を誘
導するように作用できる（J.B.Gurdon(1992) Cell 68:185-199)。
中胚葉誘導の原因である分子の同定にはかなりの進歩があったが、神経誘導の
分子的性質については実際何も知られていない。神経パターン化物質の候補は、
初期段階の中胚葉パターン化に関与し、後期に神経系の細胞サブセット中に位置
するようになる成長因子である。これらの分子はWnt、TGF-βおよびFGFファミリ
ーの様々な員を含んでいる。Wntファミリーの３つの員であるWnt-1、Wnt-3およ
びWnt-3Aは、上衣板（背の脊髄）および脳細胞のサブセットに位置する。Wnt生
成物が神経管を模るという良い証拠はWnt-1遺伝子産物を欠損しているホモ接合
体マウスから生まれ、これらの突然変異体マウスは前区菱脳および後区中脳（エ
ングレイルド-2:engrailed-2発現細胞）(MacMahonら、(1992) Cell.69:581-595
と一致する領域)に著しい異常を表す。Vg-1、BMP-4(Jonesら、(1991) Developme nt
.111;532-542)およびドルサリン-１ (dorsalin-1)(B
lumbergら、(1991) Science 253:194-196)は、胚の神経系に限られた発現を表す
TGF-βファミリーの一員の例である(Loynsら、(1991) TrendsGenet 7:408-412；
およびMassagueら、(1990) J.Biol.Chem 265:21393-21396も参照にされたい)。
ドルサリン-１は運動性ニューロンの分化を阻害し、そして神経堤細胞の移動を
誘導し、したがって神経管の背側腹側パターン化に関与することができる（Blum
bergら、(1991) Science 253:194-196）。最後に酸性FGF(aFGF)、塩基性 (bFGF)
ならびに新たに特性決定されたアフリカツメガエルの胚由来のFGF、XeFGF、(Isaa
csら、(1992) Development 114:711-20)はすべて、神経管を発生している幾つか
の細胞中で発現する（Weiseら、(1992) Cell & Tissue Research. 276;125-130
；およびTannahillら、(1992) Development.115:695-702)。
天然の胚の神経誘導物質またはパターン化物質は未だに特性が明らかにされて
いないので、誘導およびパターン化のメカニズムの分析は困難である。しかし、
実験では脊索が神経構造を誘導そして模ることができることが実証され（Jones
ら、(1989) Development.107:785-791；およびSharpeら、(1987) Cell.50.749-7
58)、これは軸性の中胚葉から重層している外胚葉に垂直に移動することができ
る信号を意味する。神経化が中胚葉により誘導できるこというこの知見は、神経
誘導にパラクリン様式で作用する信号が関与することを示唆し、その変換にはプ
ロテインキナーゼが関与しているようである（Otteら、(1991) Science.251:570
-573)。スペマンの基本的な考えを調査する最近の一連の実験では、神経系の誘
導およびパターン化の両方に関与する信号が外胚葉の板を通って移動できること
が実証された（Dixonら、(1989) Development.106:749-757；Doniachら、(1992)
Science 257:542-545；およびRuiz i Altab
a,A.(1992) Development.115:67-80)。現在では、両方の種類のメカニズムが胚
に同時に存在し、そして神経形成に役割を果たすと考えられている。
発明の要約
本発明はニューロンの分化を誘導し、そしてインビトロおよびインビボの両方
でニューロン細胞の死および／または退化を防止する方法を利用できるようにす
る。この主題の方法は従来の神経誘導の考え方とは対照的に、外胚葉組織の不履
行的成長 (default fate)が中胚葉性および／または表皮性であるというよりニ
ューロン性であるという予期せぬ知見からもたらされた。特に、TGF-βファミリ
ー(今後TGF-β型成長因子と呼ぶ)の成長因子のための細胞中の発信経路を防止ま
たはそれに拮抗することで、その細胞にニューロン分化を生じさせることができ
ることが見いだされた。主題の方法では、TGF-β型成長因子による発信がTGF-β
型成長因子の阻害活性と拮抗することにより破壊される。例えば、これは成長因
子を成長因子結合タンパク質（神経−阻害成長因子がアクチビンの場合はアクチ
ビン−結合タンパク質のような）で封鎖することにより、あるいは目的細胞の表
面上の成長因子レセプターに結合する成長因子と競合する拮抗物質により達成で
きる。
本方法の細胞を分化してニューロン細胞表現型に誘導する１つの態様は、通常
非−ニューロン表現型に細胞を誘導するTGF-βファミリーの少なくとも１つのポ
リペプチド成長因子の生物的作用と拮抗する薬剤に、細胞を接触させることを含
んで成る。拮抗剤は、例えば成長因子と処理細胞の表面上のそのレセプターとの
結合を妨げることにより、TGF-β型成長因子の生物活性を阻害することができる
。別の態様では、拮抗剤は
レセプターに結合できないように成長因子に結合し、そして成長因子を封鎖する
。
さらに本発明を説明するために、拮抗剤はホリスタチン、α-2マクログロブリ
ン、少なくとも１つのホリスタチンモジュールを含むタンパク質およびTGF-βフ
ァミリーの成長因子の短縮レセプターから成る群から選択されることができる。
短縮されたレセプターの場合には、TGF-βレセプターの可溶性成長因子−結合ド
メインであることができ、あるいは別の態様では、短縮されたレセプターは膜結
合レセプターであることができ、そしてTGF-βレセプターの細胞外成長因子−結
合ドメイン、細胞外ドメインを細胞表面膜に連結させるためのトランスメンブラ
ンドメインおよび機能不全の細胞質ドメインを含んで成る。後者の態様では、短
縮されたレセプターは処理細胞中で組換えにより発現する。
本方法のある態様では、ニューロンの分化を阻害するTGF-β型成長因子はアク
チビンである。そのような場合には、本方法は、細胞中のアクチビン発信経路を
破壊する薬剤と細胞とを接触させることを含んで成り、例えば中胚葉および／ま
たは表皮性への成長というよりも、細胞がニューロンに分化しないようにさせる
。
本方法は例えば培養中の細胞にニューロンの表現型を誘導するために、インビ
トロで使用することができる。さらに、本方法は治療的応用に利用でき、以下に
記載するように、アルツハイマー疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、
ピック病、ハンチントン病、多発性硬化症、無酸素性虚血から生じるニューロン
の傷害、外傷から生じるニューロンの傷害および自然な加齢に伴うニューロンの
退化から生じるような、例えばニューロン細胞の進行的かつ永続的な損失に伴う
神経変性疾患を処置す
るために使用できる。
本発明の詳細な説明
本明細書に記載するように、優性陰性効果を与える短縮アクチビンレセプター
あるいは組換えホリスタチンまたはインヒビンのいずれかを使用して行った集合
的実験群では、TGF-βファミリーの成長因子の発信経路がインビボでの神経性誘
導の阻害に関与していることを確証する。この知見は脊椎動物で初めて、神経化
が不履行状態であることを示す。以下の実施例に記載するようにこの結果は、こ
れらのTGF-β信号が細胞を表皮性、中胚葉性または外胚葉性の成長のような非−
ニューロン性の発育へと向かうように指示するように、アクチビンまたは短縮さ
れたアクチビンレセプターと相互反応するTGF-βファミリーの任意の他の員が、
神経誘導を阻害できることを示している。TGF-β型成長因子による信号転換を短
縮アクチビンレセプター、ホリスタチンまたはインヒビンで阻害すると、完全な
動物キャップの細胞を、検出可能な中胚葉の不在下でニューロンの成長へと切り
替えることを誘導した。このデータは動物キャップ中の推定上の神経組織がTGF-
β型成長因子に反応でき、そして中胚葉および／または表皮性組織を形成するが
、もし因子によるこの組織の特性が遮断されると細胞が神経性となることを示し
ている。以下に記載するように、アクチビンはニューロン分化を阻害するＴＧＦ
-β型成長因子として強力に関係している。アクチビンおよびそのレセプターの
両方が、動物キャップ中に天然に存在し、これはアクチビンの発信を遮断する内
因性の活性が外胚葉から神経の成長へと組織を転換することを示している。した
がって内因性アクチビンは神経阻害物質として作用でき（表皮性の発生および／
または中胚葉を誘導するように作用する）、そ
して神経化にはアクチビン活性の抑制が必要である。
本発明はニューロン分化の誘導し、かつ／またはニューロン細胞の死または退
化を防ぐ方法を利用可能にする。一般的にこの方法は、インビボまたはインビト
ロのいずれかで、細胞をトランスフォーミング成長因子-βｓファミリーに由来
するタンパク質の生物作用と拮抗することができる薬剤と接触させることを含ん
で成る。拮抗剤の作用機構は例えば、成長因子の細胞表面レセプターに競合的ま
たは非競合的に結合すること、成長因子の封鎖、または成長因子レセプターによ
り媒介される信号転換の出来事を阻害することを含んで成る。各々の態様を以下
にさらに詳細に記載する。
この主題の方法は従来の神経誘導の考え方とは対照的に、外胚葉組織の不履行
的発達が表皮性であるというよりニューロン性であるという予期せぬ知見からも
たらされた。特に、細胞のTGF-β型成長因子の発信経路を防止または拮抗するこ
とにより、その細胞のニューロン分化を生じることができることが見いだされた
。主題の方法では、TGF-β型成長因子による発信はTGF-β型成長因子の阻害活性
と拮抗することにより破壊される。例えば、これは成長因子を成長因子結合タン
パク質（アクチビン−結合タンパク質のような）で封鎖することにより、あるい
は目的細胞の表面上の成長因子レセプターに結合する成長因子と競合する拮抗物
質で処置することにより達成できる。
本明細書に記載するように、本方法はインビトロで使用することができ、例え
ば培養により細胞を誘導してニューロン性の表現型に分化することができる。１
つの態様では、分化した細胞の培養を継続し、そして有用なインビトロアッセイ
システムならびにさらに神経発生を解明する
ための価値ある研究道具を提供するために使用できる。別の態様では、分化した
細胞を移植のためにインビボで使用する。さらに本方法は治療的応用を可能とし
、そして以下に記載するように、パーキンソン病、アルツハイマー疾患、筋萎縮
性側索硬化症およびハンチングトン病で生じるようなニューロン細胞の進行性の
、かつ永続的損失に付随する神経変性疾患を治療するために使用できる。
簡略化するために、以下の説明ではアクチビンの発信と拮抗する薬剤の使用を
記載するが、多くの他のそのような薬剤も様々なTGF-β型成長因子に結合あるい
は拮抗し、それによりあるとすれば神経化の阻害を破壊することができる。本明
細書で使用するように、“トランスフォーミング成長因子−ベータ”および“TG
F-β”は、脊椎動物に偏在して見いだされるパラクリンポリペプチドに構造的に
関連する一ファミリーであり、そして後期生物の成長、分化および形態形成因子
の大きな一ファミリーの原型を言う (総説として、Massaqueら、(1990) Ann Rev Cell Biol
6:597-641；およびSpornら、(1992) J Cell Biol 119:1017-1021を
参照にされたい)。さらに本発明、すなわち神経化は不履行状態であるという知
見は、細胞がこの不履行状態に到達することを阻害する（例えば活発に非−ニュ
ーロン性の分化を誘導する）他のTGF-β-様成長因子を含む他の因子の同定を容
易にするだろう。このような考えに照らして、これらの因子を破壊する薬剤を本
発明では特に企図する。
細胞にニューロン分化の不履行を引き起こすように、ニューロン分化の防止に
関与するTGF-β因子の発信経路と拮抗することができる薬剤は、本明細書では神
経化剤、すなわち“ＮＡ”と呼ぶ。
１つの態様では、ＮＡは例えばホリスタチン、α2-マクログロブリン
およびアクチビンレセプターを含むアクチビン-結合剤を用いて、細胞外環境中
でアクチビンを封鎖することにより、アクチビンの生物学的利用を減じることが
できる、アクチビン−結合タンパク質である。本方法の他のアクチビン-結合タ
ンパク質には、アグリン、アグリン−関連タンパク質、およびホリスタチンモジ
ュールを含有する他のタンパク質を含むことができる。好適な態様では、ＮＡは
ホリスタチンまたはアクチビンレセプターのいずれかのオーダーで、あるいはそ
れより大きいオーダーのアクチビンに対する結合親和性を有する。
本方法の具体的な態様では、ＮＡはアクチビンに結合し、そして封鎖できるホ
リスタチンである。ホリスタチンは小胞−刺激ホルモン放出を阻害する能力に基
づき、初めて単離された一本鎖のグリコシル化ポリペプチドである。ヒトを含む
数種の種に由来するホリスタチンは、構造的に特徴が決定され、そしてクローン
化された。(例えば、Eschら、 (1987)Mol.Endocrinology 11:849；Lingら、国際
公開第89/01945号明細書；Lingら、米国特許第5,182,375号明細書；Lingら、米
国特許第5,041,538号明細書；およびイノウエら、(1991) Endocrinology 129:81
5-822を参照にされたい)。例えば２つの形のヒトホリスタチンがクローン化され
、そして発現し、１つは315個アミノ酸残基を、そしてもう１つは288個のアミノ
酸残基を有した（イノウエら、同上）。ヒトホリスタチンはＮＩＨの国立ホルモ
ンおよび下垂体プログラム (National Hormone and Pituitary Program)から入
手できる。１つの態様では、本方法のホリスタチンは以下に示すように、より大
きい状態のホリスタチンに比べて、アクチビンに対して大きな結合親和性を有す
ると思われるので、より短い種類のホリスタチンである（例えば288a.a.ヒト 同
ファミリー体）。
別の例示的実施例では、アクチビン−結合タンパク質はアクチビンレセプター
またはその一部であることができる。アクチビンレセプターは数種の種からクロ
ーン化された (Attisanoら、(1992) Cell 68:97-108)；およびGerogiら、(1990)
Cell 61:635-645)。NAが拡散性分子であることが望まれる本発明の態様では、
アクチビンレセプターの可溶性の細胞外部分を使用することができるが、ただし
細胞外部分がアクチビン−結合を保持するように選択される。例えばアクチビン
レセプターの可溶性状態はAttisanoらのクローン化されたアクチビンレセプター
遺伝子を使用して作成することができ、これは分泌のための内因性シグナル配列
を含む (Attisanoら、(1992) Cell 68:97-108)。例えば、終止コドンはトランス
メンブランドメインをコードする遺伝子の５’部位に導入することができ（例え
ば、Thr-13をコードするACCをTAAに突然変異させることができる）。さらに以下
に記載するように、他のポリペプチド配列を含むために、短縮されたアクチビン
レセプターを融合タンパク質として操作することができる。
さらに本発明の別の具体的態様では、処理細胞上のアクチビンと同起源レセプ
ターにアクチビンが結合することを競合的に阻害するアクチビン拮抗薬、あるい
はレセプタータンパク質に結合するアクチビンを非競合的に阻害するアクチビン
拮抗薬と細胞を接触させることができる。そのような神経化剤はアクチビンの発
信を遮断するために使用でき、そしてそれによって処置細胞にニューロン分化を
誘導するか、あるいはすでに存在するニューロン分化を維持するようにする。イ
ンヒビンファミリーを含む、この種の数多くの有力なアクチビン拮抗薬が当該技
術分野で知られている。インヒビンおよびアクチビンは、下垂体細胞によるFSH
の放出を阻害（インヒビン）または刺激（アクチビン）するそれらの能力に基づ
き、小胞液から初めて単離、そして精製された。成熟インヒビンは、典型的には
共通のα-サブユニット、ならびにβAおよびβBの２つのβ-サブユニットの１つ
から成るヘテロ二量体の糖タンパク質である。インヒビンに加えて、本発明は神
経誘導においてアクチビンに拮抗的に作用するアクチビン変異体を作成するため
に、突然変異させたアクチビンを使用して行うことができる。アクチビンはイン
ヒビンβ-サブユニット（例えばβAβAまたはβAβB）のヘテロ二量体状態であ
る。そのような拮抗薬は、例えば当該技術分野で公知である組合わせ突然変異誘
発法により作成できる (例えば、Ladnerら、国際公開第90/02909号明細書；Garr
ardら、国際公開第92/09690号明細書；Marksら、(1992) J.Biol.Chem.267:16007
-16010；Griffthsら、(1993) EMBO J 12:725-734；Clacksonら、(1991) Nature
352:624-628；およびBarbasら、(1992) PNAS 89:4457-4461を参照にされたい)。
さらに、ペプチド模造物（peptidomimetics:例えばアクチビンまたはインヒビン
の）、あるいは以下に説明するアッセイで同定できるような他の小さい分子が、
レセプターに結合し、そしてアクチビンによる機能的結合（またはレセプターの
オリゴマー化）を防ぐことにより、アクチビンの発信を拮抗するために使用でき
る。
さらなる態様では、神経化薬はアクチビン結合とは関係なくアクチビンレセプ
ターによる信号転換を遮断するように作用する。そのような薬剤は、レセプター
の可溶性状態のようにではなく、例えばトランスメンブランドメインおよび少な
くとも細胞質ドメインを含む、膜に結合した優性陰性レセプターを含む。そのよ
うなレセプターは単に機能的レセプ
ターからアクチビジンを封鎖するというよりは、アクチビジン結合に反応する適
切な細胞内の第二メッセンジャー経路を活性化することができない。野生型レセ
プターを発現する細胞内で、これらの優性陰性レセプターの発現は、例えば野生
型レセプターでの非生産的オリゴマーの形成により、アクチビジンに対する細胞
の感受性を無くすることができる。同様に、アクチビジンレセプターの下流のア
クチビジンレセプター第二メッセンジャー経路を阻害する他の薬剤を、細胞のア
クチビジン−媒介誘導を阻害するために使用できる。
本アッセイのさらに別の態様の特徴は、標的細胞中のアクチビンレセプターの
合成を阻害するために単離された核酸構築物の“アンチセンス”療法による使用
である。本明細書にて使用する“アンチセンス”療法とは、細胞の条件下で、ア
クチビジンレセプターの発現を阻害するように（例えば、転写および／または翻
訳を阻害することによる）、アクチビジンレセプターをコードする細胞性mRNAお
よび／またはゲノムDNAと特異的にハイブリダイズ（例えば結合）する、オリゴ
ヌクレオチドプローブまたはその誘導体の投与あるいはin situ生成を言う。こ
の結合は通常の塩基対の相補性によるものであってよく、あるいは例えば二本鎖
ＤＮＡの場合には、二重ヘリックスの主溝中の特異的な相互作用を介してもよい
。一般的に“アンチセンス”療法とは当該技術分野で多く採用される技術範囲を
言い、そしてオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合することに依存する任意の
治療を含む。
本発明のアンチセンス構築物は、例えば細胞中で転写された時に、アクチビジ
ンレセプターをコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも独自な部分に相補的であ
るＲＮＡを生成する発現プラスミドに由来することが
できる。あるいはアンチセンス構築物は、ex vivoで生成され、そして処置した
細胞中に導入した時に、アクチビジンレセプター遺伝子のｍＲＮＡおよび／また
はゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害を引き起こすオリゴヌ
クレオチドプローブであることができる。そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブは好ましくは内因性ヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼおよび／または
エンドヌクレアーゼ）に耐性である修飾オリゴヌクレオチドであり、したがって
インビボで安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための
核酸分子の例には、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエート、およびメ
チルホスホネート類似体 (米国特許第5,176,996号；同5,264,564号；および同5,
256,775号明細書を参照にされたい)である。さらに、アンチセンス治療法に有用
なオリゴマーを構築するための一般的取り組みについては、例えばvan der Krol
ら、(1988) Biotechniques 6:958-976;およびSteinら、(1988) Cancer Res 48:2
659-2688を再検討した。
ある態様では、適当な場合に、神経化薬は細胞外マトリックスの成分に結合す
る部分を含んで成るキメラタンパク質であることができる。そのようなキメラＮ
Ａは、治療部位からＮＡの拡散が望ましくない局所の環境に有用であることがで
き、そして治療部位に、またはその近位にキメラＮＡを局在させることによりそ
の目的を果たすだろう。この態様のＮＡは、融合遺伝子の生成物として、あるい
は化学的に架橋させることにより生成することができる。例えば多くのタンパク
質が、キメラＮＡを標的部位に局在することを支持する組織の細胞外マトリック
ス（ECM）から特性決定された。性質が明らかにされているタンパク質の１例は
フィブロネクチンである。フィブロネクチンは多くの機能的ドメインを持つ、
大きな接着性糖タンパク質である。これらの幾つかのドメインがマトリックス付
着活性を有する。例えば、これらの１つはテトラペプチド配列R-G-D-Sを含む一
回の“III型反復 (type-III repeat)”である (Pierschbacherら、(1984) Natur e
309:30-3;およびKornblihttら、(1985) EMBO 4:1755-9)。これらのアミノ酸を
含有するペンタペプチドほど小さいペプチドは、ECM成分との結合を介して細胞
の付着を支持することができる(Ruoslahtiら、(1987) Science 238:491-497;Pie
rschbacheretら、(1987) J.Biol.Chem 262:17294-8;Hynes(1987) Cell 48:549-5
4;およびHynes(1992) Cell 69:11-25)。事実、数社が細胞培養の試薬および様々
な生物材料への応用に使用するために、この細胞付着配列に基づく生成物を商品
化した。例えば、テリオス ファーマシューティカル (Telios Pharmaceutical)
、ＢＲＬ、ストラタジーン (Stratagene)、プロテインポリマーテクノロジー (P
rotein Polymer Technologies)等のカタログ、ならびに米国特許第4,517,686号
；同4,589,881号；同4,578,079号;同4,614,517号；同4,661,11号および同4,792,
525号明細書を参照にされたい。したがってフィブロネクチン結合配列は、例え
ば本明細書に記載される可溶性アクチビンレセプターに付加することができる。
本発明の別の観点は、アクチビン誘導に反応性の神経細胞の分化状態を誘導お
よび／または維持する方法、ならびに／あるいは神経細胞の生存増強法に関し、
この方法は細胞を神経化剤（例えばアクチビン拮抗薬）と接触させることによる
。例えば本発明で意図することは、脊椎動物において分化した神経組織の規則的
な空間的配置の形成に明らかに広くアクチビンが関与しているという知見に照ら
して、本主題の方法がインビトロおよびインビボの両方で異なる神経組織の配列
を生成および／また
は維持するために使用できるということである。神経化薬は、適当には単離され
たポリペプチド、遺伝子治療用構築物、アンチセンス分子、ペプチド模造物また
は本明細書で提供する薬物アッセイで確認された薬剤を含む上記の任意の調製物
であることができる。
例えば、本方法は細胞培養法に応用することができる。インビトロのニューロ
ン培養系は神経発生の研究、ならびに神経成長因子(NGF)、線毛栄養因子(CNTF)
および脳由来神経栄養因子 (BDNF)のような神経栄養因子の同定に基本的かつ必
須の道具となることが証明された。ニューロン細胞はいったん終期に分化したな
らば、それは典型的には終期に分化した別の細胞型には変化しないだろう。しか
しこれにもかかわらず、ニューロン細胞は容易にその分化状態を失うことができ
る。これは通常、それらが成長組織からの培養物中で生育し、かつ再生中に芽体
を形成した時に観察される。本方法は分化の様々な段階でニューロン細胞を維持
するために、十分に制限された環境を確実にするための手段を提供し、そして例
えば他の栄養因子の特異的活性を試験するために設計された細胞培養中で使用す
ることができる。本方法のそのような態様では、ニューロンの分化（例えば幹細
胞の）を誘導するために、または分化の損失を防ぐことにより終期に分化したニ
ューロン細胞培養物の完全性を維持するために、培養した細胞を本発明の神経化
薬と接触させることができる。培養中の神経化薬の供給源は例えば、細胞培養培
地に直接加える精製された、または半精製のタンパク質組成物に由来するもの、
あるいは様々なニューロン細胞の成長を支持し、かつすでに神経化薬を与えたポ
リマー性デバイスから放出されるものであることができる。適当な場合には、神
経化薬の供給源は目的とするニューロン細胞と同時に培養され、かつ
組換え神経化薬を生成する細胞であることもできる。あるいは、供給源は組換え
神経化薬を生成するように操作されたニューロン細胞自体であることができる。
例示的な態様では、例えば細胞の知覚ニューロンあるいは運動ニューロンへの分
化を誘導するために、天然のニューロン細胞（例えば幹細胞）をアクチビン拮抗
剤で処理する。そのようなニューロン培養物は便利なアッセイシステムならびに
治療的処置のための移植しうる細胞の供給源として使用できる。
さらに有力な用途を具体的に示すために、中枢神経系療法に対するさらなる研
究として、大脳内移植を検討したことを特記する。例えば、損傷脳組織の修復に
対する１つの取り組みには、胎児または新生児の動物由来の細胞を成人の脳へ移
植することが関与する（Dunnettら、(1987) J Exp Biol 123：265-289;およびFr
eundら、(1985) J Neurosci 5:603-616)。様々な脳の領域に由来する胎児のニュ
ーロンは、成功裏に成人の脳に埋め込まれ、そしてそのような移植片は、行動性
の欠陥を軽減することができる。例えば、ドパミン作用性突起から基底核にかけ
ての損傷により誘発される運動不全疾患は、胚のドパミン作用性ニューロンの移
植片により防止することができる。新皮質の損傷後に生じる複雑な認識機能も、
胚の皮質細胞の移植により一部回復することができる。したがって、アクチビン
拮抗薬をニューロン細胞培養物の維持に使用することは、移植しうるニューロン
組織の供給源を提供する助けとなりうる。神経化薬を培養に使用することは分化
の損失を防止し、あるいは胎児組織が使用される場合、特にニューロン幹細胞が
使用される場合に、本発明の神経化薬は分化を誘導するために使用できる。
本発明に有用な幹細胞は一般的に知られている。例えば、数種の神経
稜細胞が同定され、その幾つかは多型潜在性であり、そして拘束されていない神
経稜細胞を表すようであるが、他の細胞は知覚ニューロンのような１種類の細胞
だけを生成でき、拘束された子孫細胞を表すようである。そのような幹細胞を培
養するために本発明に使用するアクチビン−破壊剤の役割は、拘束されていない
子孫の分化を誘導でき、それにより約束された子孫細胞を生じるか、あるいは約
束された子孫細胞が終期に分化したニューロン細胞になるように発生の成長をさ
らに制限することができる。例えば、本方法はインビトロで、神経稜細胞のグリ
ア細胞、シュワン細胞、クロム親性細胞、コリン作用性交換神経または副交換神
経ニューロン、ならびにペプチド作用性およびセロトニン作用性ニューロンへの
分化を誘導および／または維持するために使用できる。神経化薬は単独で、また
はニューロン子孫細胞の特定の分化の成長をさらに一層増強するように作用する
他の神経栄養因子と組み合わせて使用することもできる。後者の場合に神経化薬
は、細胞が第二の神経栄養因子と接触した際に正しく誘導されるように、細胞が
特定の分化経路と釣り合うように、処理した細胞が特定の表現型となることを確
実にすることを主眼とする。同様な様式で、比較的未分化の幹細胞またはプリマ
ティブ(primative) な神経芽細胞を培養物中に維持し、そして主題の神経形成薬
で処置することにより分化を引き起こすことができる。プリマティブ細胞の例は
、明らかな分化が起こるはるか以前の胚の神経板または神経管から回収した細胞
を含んで成る。
本発明の方法は“モルフォゲン”（すなわちその厳しい域値濃度が発生中の特
別な細胞の成長を決定する分子）としてのホリスタチンの有力な役割をさらに決
定することも容易にするだろう(Wolpert,L.(1969) J.
Theor Biol
.25:1-47)。最初にモルフォゲンと定性された分子はビコイド (bicoi
d)であり、これはキイロショウジョウバエ胚中のシンシチウム中の段階的分布が
、特別な細胞の成長の形成を導くＤＮＡ結合タンパク質である (Drieverら、(19
88) Cell 54:95-104)。さらに最近２つの因子、アフリカツメガエルの胚中のア
クチビン (Greenら、(1992) Cell 71:731-739)、およびキイロショウジョウバエ
の胚中のデカペンタプレジク(decapentaplegic:dpl)(Fergusonら、(1992) Cell
71:451-461)は、インビトロでモルフォゲンとして作用することが示された。こ
れらの両因子はペプチド成長因子のTGF-β上科に属し、両方とも厳しい域値濃度
で異なる細胞の成長を特定することができる。ホリスタチンはアクチビンの阻害
剤であり、そしてアクチビンリガンドおよびレセプターＲＮＡの両方が推定上の
外胚葉中で発現するので、アクチビンのようにホリスタチンはモルフォゲンの活
性を有するかもしれない。優性陰性アクチビンレセプターおよびホリスタチンの
両方が、以下に記載するように、直接的な神経組織形成を引き出す。このデータ
に基づき、神経組織が推定上の外胚葉中のアクチビン発信に関して不履行状態を
表すことが明らかである。このモデルでは、キャップに存在するアクチビンリガ
ンドおよびレセプターの量が、細胞を表皮性に維持し、そして更なるアクチビン
が細胞の成長を中胚葉性へと変化させる。アクチビンを程度を変化させて阻害す
ることにより、ホリスタチンもモルフォゲンとして作用できた。
ホリスタチン（または別のＮＡ）がモルフォゲンとして作用できるかどうかを
試験するためのインビトロ アッセイシステムの具体的な態様では、解離してい
る動物キャップ細胞を培養し、そして再会合時に短尾奇形のような一般的中胚葉
マーカーを発生させるに十分な濃度のアクチ
ビンを投与することができる。次にアクチビンの活性を、ホリスタチンタンパク
質濃度を小増分変化することにより攻撃することができる。ホリスタチンがモル
フォゲンとして作用していることを指示するのは、小さい濃度の差異で、組織学
的に、または細胞−型に特異的な分子マーカーの使用を介して識別できる異なる
細胞の成長を生じると言う観察を含むだろう。これらの研究は推定上の外胚葉に
存在する非依存性の細胞の発育数の程度の測定、ならびに動物キャップがどの割
合でホリスタチンの様々な濃度に反応して神経性になるのかを測定することを可
能にする。
ホリスタチン（または他のＮＡ）濃度が、拘束されていないまたは約束された
子孫細胞のニューロン分化の経路に影響するかどうか、ならびに最終的に濃度が
、生じた子孫細胞の終期に分化した特定の誘導に影響するかどうかを決定するた
めに、同様な実験を上記の神経稜細胞のような幹細胞で行うことができる。
別の態様では、インビトロ細胞培養をアクチビン発信の破壊に反応して発現さ
れる、したがって同様にニューロン形成に関与する遺伝子および遺伝子生成物の
同定、単離および研究のために使用できる。これらの遺伝子はアクチビン信号の
“下流”にあり、ニューロンの分化に必要である。例えば、もし新たな転写が神
経化に必要ならば、対照動物キャップで調製した、およびホリスタチンで処理し
て調製した消去式ｃＤＮＡライブラリー(subtractive cDNA library)を、この過
程を開始させる、または終わらせる遺伝子を単離するために使用できる。Wandお
よびBrownにより記載されたPCR法を含む強力な消去式ライブラリー法(Wandら、(
1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11505-11509)は、そのような遺伝子を単離す
るために本発明と組み合わせて有用な方法の例である。例え
ばこの方法は、アフリカツメガエル中で甲状腺ホルモンの処理有り、または無し
の尾吸収 (tail resorption)に関与する16よりも多くの遺伝子を成功裏に単離す
るために使用された。開始する遺伝子を単離するために、対照および処理キャッ
プを使用して、誘導プールを非誘導プールから消去し、そして次に終わらせる遺
伝子のために非誘導プールを誘導プールから消去することができると予想される
。この調査から、２種類のｍＲＮＡを同定できると予想される。クラスＩＲＮＡ
は未処理キャップ中で発現するＲＮＡを含み、誘導キャップ中では減少するか、
または排除され、すなわち下方に調節されるＲＮＡ群である。クラスIIＲＮＡは
、誘導に反応して上方に調節されるＲＮＡを含み、したがって未処理キャップ中
よりも処理中でより豊富に存在する。処理対未処理キャップから抽出したＲＮＡ
は、ライブラリーから単離したクローンの分類する主要な試験に使用できる。さ
らに各クラスからのクローンをシークエンシングにより、そして胚中で測定され
るそれらの時空的分布を、全載in situおよび発生的ノーザンブロット分析で、
さらに特徴決定できる。
例えば、この消去法アッセイの１つの態様では、神経誘導に極め初期に反応す
ると証明された遺伝子に対して、特別な注意を払うべきである。このように定性
するために、これらの遺伝子は次の４つの基準を満たさなければならない。第一
にＲＮＡは誘導物質の適用後、迅速に現れるべきである (10から30分)。この要
求性を試験するために、ＲＮＡを誘導したキャップから様々な時間で単離し、そ
してノーザンブロットにより遺伝子発現について点数を付けることができる。第
二に、遺伝子の誘導は事前のタンパク質合成を必要とはしないはずである。した
がってキャップはシクロヘキシイミド (5μg/ml)と一緒に、ホリスタチンとの短
いイ
ンキューベーション前、および中にインキューベーションされ (30分)、その後
キャップをより長時間(90分)ホリスタチン中に維持し、そしてノーザンブロッテ
ィングにより分析することができる。この戦略はMix.１（アクチビンおよびbFGF
の両方に極めて初期に反応を表すホメオボックス遺伝子）が、アフリカツメガエ
ルの動物キャップから単離されたときに同様な状況で使用された（Rosa,F.M.(19
89) Cell.57:965-974）。これらの条件は、誘導期間中にタンパク質合成の75％
−80％を阻害し、そして後期エクスプラント中にアクチビンに反応する筋肉アク
チンｍＲＮＡの誘導を完全に破壊するに十分である (Bolceら、(1993) Developm ental Biology
160)。第三に、直後に反応する遺伝子は誘導物質との接触の結果
として発現するべきであり、二次的な細胞−細胞誘導から発現されるべきではな
い。これらの２つの反応間を識別するための１つの方法は、動物キャップの細胞
をCa/Mg無しの培地で解離し、ホリスタチンを加え、そして解離した細胞対完全
なキャップ中で誘導された転写量を比較することである。両方の種類のキャップ
でレベルが比較できるようならば、この誘導に関して細胞−細胞接触は必要では
なく、したがってこれはホリスタチン処理の直接的反応であると結論できる。最
後にこれらの遺伝子はニューロン発生中に神経系に存在し、そして活性化される
と期待される。
いったん単離されると、ホリスタチンにより調節された遺伝子は配列決定され
、そしてそれらの胚の分布は全載法により測定できる。それらの胚の発現が予想
されるニューロン発生機能と一致するならば、それらはホリスタチンおよび他の
ＮＡに関して、本明細書に記載するように動物キャップ中および胚中の神経化活
性を試験することができる。
さらに、本発明は新規な神経化薬を同定するためのアッセイを提供する。例え
ばアッセイは、アクチビンのような神経化を阻害するTGF-β型因子の存在下で培
養した動物キャップ細胞、またはその均等な細胞を含んで成ることができる。細
胞の一部を候補薬剤と接触させ、そして任意の細胞のニューロン分化を、細胞に
より発現されるＮＣＡＭのようなニューロンマーカーの存在により点数をつける
。
アッセイの他の態様では、ＴＧＦ-βおよびその同起源のレセプターとの間の
タンパク質−タンパク質相互作用を阻害するために加えた薬剤の能力について、
単に点数を付けることができる。例えば１つの態様では、アッセイはアクチビン
ポリペプチドとアクチビンレセプターとの結合をモジュレートする化合物の能力
の評価する。本発明に関して十分である様々なアッセイの形式が当業者に理解さ
れるだろう。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する、多くの薬物スクリーニン
グプログラムでは、所定時間に調査する化合物の数を最大にするために、高処理
量アッセイが望まれる。精製された、または半精製タンパク質から作られるよう
な無細胞系で行われるアッセイは、“主要な”スクリーンとしてよく行われ、こ
のスクリーンでは迅速な発生および試験化合物により媒介される分子標的中の変
化の比較的容易な検出を可能にすることができる。さらに、試験化合物の細胞毒
性および／または生物学的利用能は、インビトロ系では一般的に無視することが
でき、かわりにアッセイはレセプタータンパク質との結合親和性中の変化に出現
しうるような、主に薬剤の分子標的に対する効果に集中する。したがって、本発
明の例示的スクリーニングアッセイでは目的化合物を、通常アクチビンタンパク
質に結合できるアクチビンレセプターポリペプチドと
接触させる。次に化合物およびレセプターの混合物に、アクチビンポリペプチド
を含む組成物を加える。レセプター／アクチビン複合体の検出および定量は、レ
セプタータンパク質とアクチビンポリペプチドとの間の複合体の形成を阻害する
化合物の効力を測定する手段を提供する。化合物の効力は、様々な試験化合物濃
度を使用して得たデータからの用量応答曲線を作成することにより評価すること
ができる。さらに、対照アッセイも比較のためのベースラインを提供するために
行うことができる。対照アッセイでは、単離され、そして精製されたアクチビン
ポリペプチドをレセプタータンパク質を含有する組成物に加え、そしてレセプタ
ー／アクチビン複合体の形成を試験化合物の不在で定量する。
アクチビンポリペプチドとアクチビンレセプターとの間の複合体形成は、様々
な方法で検出できる。例えば、複合体の形成をモジュレートすることは、例えば
放射性標識、蛍光標識、または酵素的に標識したアクチビンポリペプチドのよう
な検出可能な標識タンパク質を使用して、イムノアッセイにより、またはクロマ
トグラフィー的検出により定量することができる。
したがって、タンパク質およびポリペプチドならびにペプチド模造物および他
の小分子（天然生成物を含む）のような、広範の薬剤を試験できる。例えば上記
の薬物スクリーニングアッセイは、本発明のアクチビンポリペプチドとアクチビ
ンレセプターとの結合を破壊することができる、例えばペプチドまたは非ペプチ
ド剤のような模造物を生成するために、インヒビンタンパク質のアクチビンを減
少させるために使用できる。例えば、アクチビンレセプターの結合に関与するア
クチビンタンパク質の重要なアミノ酸残基をマップするためのスキャンニング突
然変異誘発
法 (scanning mutagenesis)を採用することにより、レセプターに結合するこの
ような残基を模するペプチド模造化合物を生成することができ、そして本明細書
に記載するようなスクリーニングアッセイで検出できるように、最終的にアクチ
ビンのそのレセプターへの結合を阻害することができる。例えば、そのような残
基の非ハイブリダイズ性のペプチド同ファミリー体は、ベンゾジアゼピン (例え
ばFreidingerら、ペプチド：化学および生物学(Peptides:Chemistry and Biolog y
)、G.R.Marshall編集、ESCOM 出版社：ライデン、オランダ、1988を参照にされ
たい)、アゼピン (例えばHuffmanら、ペプチド：化学および生物学(Peptides:Ch emistry and Biology
)、G.R.Marshall 編集、ESCOM 出版社：ライデン、オラン
ダ、1988を参照にされたい)、置換ガンマラクタム環(Ｇarveyら、ペプチド：化 学および生物学
(Peptides:Chemistry and Biology)、G.R.Marshall 編集、ESCOM
出版社：ライデン、オランダ、1988)、ケト−メチレン疑ペプチド (Ewensonら
、(1986) J Med Chem 29:295;およびEwensonら、ペプチド：構造および機能(Pep tides:Structure and Function)
(第９回アメリカペプチドシンポジウム)ピアス
化学社(Pierce Chemical Co.)、ロックランド、イリノイ州、1985)、β-回りジ
ペプチドコア(ナガイら、(1985) Tetrahedron Lett 26:647;およびサトーら、(1
986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)およびβ-アミロアルコール (Gordonら
、(1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419;およびDannら、(1986) Biochem Res Commun
134:71)を使用して生成できる。
ＮＡ存在下で培養された細胞の移植、ならびに上記のインビトロでの用途に加
えて、本発明のさらに別の目的は、中枢神経系および末梢神経系の両方で、ニュ
ーロンおよび他のニューロン性細胞の生存を増強させ
るアクチビン−破壊剤の治療的投与に関する。神経系の発生中のみならず、おそ
らくは成長段階においても、ホリスタチンのニューロン分化を調節する能力は、
ＮＡがメインテナンス、機能的達成度および正常細胞の加齢に関する成人ニュー
ロンの制御を；化学的または機械的な損傷細胞の修復および再生過程を；ならび
に特定の病状での分化の損失から生じる変性および死の防止を容易にする、とい
うことを合理的に予想できることを示唆している。このような考えに照らして、
本発明は特に次の病状から生じる神経症状の治療（予防および／または重症度の
緩和）に対する本方法の応用を企図するものである；（ｉ）感染性／炎症性およ
び腫瘍−誘発損傷を伴う、外傷、化学的損傷、脈管損傷および欠損（発作から生
じる虚血のような）を含む、急性、亜急性または慢性の神経系に対する損傷；（
ii）アルツハイマー疾患を含む神経系の老化；（iii）パーキンソン病、ハンチ
ングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症等、ならびに旧小脳退化を含む神経系の慢
性神経変性疾患；（iv）多発性硬化症を含む神経系の慢性の免疫疾患または神経
系への作用；および（ｖ）網膜の変性的疾患。
多くの神経疾患はニューロン要素の個別の群の退化に関連し、そして本発明の
神経化薬を含む治療的処方により治療できる。例えばアルツハイマー疾患には、
新皮質に突出した、そして皮質にある両方の幾つかの神経伝達系中の欠損が関与
する。例えば、アルツハイマー疾患の患者の基底核は、年齢が一致する対照と比
較してニューロンの根深い損失（75％）が観察された。アルツハイマー疾患は痴
呆の最も通常の状態であるが、他の幾つかの疾患は痴呆を起こすことがある。多
くは年齢に関連しており、若年よりは老年により多く発生する。これらの変性疾
患の幾つ
かは中枢神経系、特に大脳皮質のさまざまな部分でのニューロンの死が特徴であ
る。しかし、痴呆の状態によっては大脳皮質の下にあるタルムス（thalmus）ま
たは白質の変性が関連することもある。ここで、認識機能不全は、遠心性神経お
よび求心性神経の退化による皮質領域の孤立から生じる。ハンチングトン病は、
イントラスタレイタルの（intrastraital）および皮質のコリン作用性ニューロ
ンならびにガンマアミノ酪酸作用性（GABAergic）ニューロンの変性が関与する
。ピック病は、前頭および前区側頭葉の新皮質中の重度のニューロン退化であり
、時折線条中のニューロンの死が伴う。そのような変性疾患にかかっている患者
の治療には、例えばニューロンの損失を生じるニューロンの脱−分化および枯死
を操作するために、神経化薬ポリペプチド、またはそれらの効果を模する薬剤を
投与することを含むことができる。好適な態様では、神経化薬の供給源は変性の
領域内、またはその近位に定位的に提供される。
退化性−誘発痴呆に加えて、振顫および不随意の運動を表す神経退化性疾患の
治療において、神経化薬の医薬的調製物を都合よく投与することができる。例え
ばパーキンソン病は、主に皮質下構造に影響を及ぼし、そして黒質線状体経路、
縫線核、青斑および迷走神経の運動性核の退化が特徴である。バリズムは典型的
には視床下核に対する損傷と関連し、しばしば急性の脈管事故が原因である。ま
た最終的に抹消神経系の体細胞分裂に影響を及ぼし、神経筋肉疾患を表すニュー
ロン形成性およびミオパシー性疾患も関与する。例として筋萎縮性側索硬化症、
ギラン-バレ症候群のような慢性萎縮症および慢性抹消神経障害、ならびに進行
性の球麻痺または脊髄筋肉萎縮症として発病しうる他の疾患を含む。本方
法は損傷と同じ側の四肢に疾患を生じる小脳の損傷のような、低血圧症または運
動失調を生じる小脳を疾患の治療を可能にする。例えば本発明の神経化薬は、ア
ルコール中毒患者に共通するような前葉（虫部および脚部）が関与する限定され
た小脳皮質の退化の形成を治療するために使用できる。
さらに別の態様では、本方法は筋萎縮性側索硬化症の治療に使用される。ALS
は、上部および下部運動ニューロンを含んでなる合併症に与えられた名称である
。患者には進行性の脊髄の筋肉萎縮、進行性の球麻痺、主側索硬化症またはこれ
らの症状の合併症状がある。主な病理学的異常は、選択的かつ進行性の脊髄中の
下部運動ニューロンおよび小脳皮質中の上部運動ニューロンの退化が特徴である
。アクチビジン拮抗薬の治療的投与は、ALS患者の運動ニューロンの退化を防止
および／または好転させるために、単独またはCNTF、BDNFまたはNGFのような他
の神経栄養因子と組み合わせて使用することができる。
本発明の神経形成薬は、抹消神経系の自律疾患の治療にも使用でき、それには
平滑筋内分泌組織（腺組織のような）の神経支配に影響する疾患を含む。例えば
神経化薬組成物は、心臓の横紋筋を神経支配する神経の変性状態から生じうる頻
脈または心房性の不整脈を治療するのに有用でありうる。
さらに別の態様では、本主題の神経化薬は神経組織が関与する新生物または増
殖性の形質転換の治療に使用できる。例えば、アクチビジン拮抗薬は後−有糸分
裂性となり、おそらくはアポトーシスするように、形質転換したニューロン細胞
の分化を誘導することができるようである。アクチビジンが媒介する誘導性の出
来事を阻害することは、数種のニュ
ーロン腫瘍の新生の形質転換に関与すると考えられるPDGF自己刺激性ループのよ
うな、オートクラインループの破壊にも関与するらしい。したがって本主題の方
法は、例えば悪性のグリオソーム、髄芽、神経外胚葉の腫瘍および上皮腫の治療
に使用される。
ＮＡまたはその医薬的に許容できる塩を投与するために、水、緩衝塩溶液、ポ
リオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレング
リコール等）ならびに適当なその混合物のような生物学的に許容できる媒質と都
合よく配合することができる。選択した媒質中の有効成分（１つまたは複数）の
最適濃度は、医化学者により周知な方法に従いエンペリカリー (emperically)に
定められる。本明細書で使用する“生物学的に許容できる媒質”とは、医薬調製
物の所望の投与経路に適する任意のすべての溶媒、分散剤等を含む。医薬的な活
性物質用に、そのような媒質を使用することは当該技術分野では周知である。Ｎ
Ａの活性と適合しない従来の媒質または薬剤を除くかぎり、本発明の医薬組成物
中にそれらを使用することも意図するところである。他のタンパク質を含みうる
、適当な賦形剤およびその組成物が、例えばレミングトンの薬化学 (Remington' s Pharmaceutical Science
)(レミングトンの薬化学、マック出版社、イーストン
、ペンシルバニア、米国、1985) に記載されている。これらの賦形剤は注射可能
な“デポジット組成物 (deposit formulation)”を含む。上記に基づき、制限す
るわけではないが、医薬組成物はＮＡ溶液またはＮＡの凍結乾燥粉末（ホリスタ
チンのような）を、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と一緒に
含み、そして適当なｐＨの緩衝化媒質を含み、そして生理学的流体により等張で
ある。説明の目的のみに、そして同様に制限することを意味せずに、
可能な神経系疾患の治療のための溶液状態に調製されうるＮＡとの配合組成物は
、della Valleの米国特許第5,218,094号明細書に与えられている。凍結−乾燥調
製物の場合は、制限するわけではないがマンニトールまたはグリシンのような支
持助剤を使用でき、そして所望容量の適当な緩衝化溶液が十分な等張性の所望ｐ
Ｈの緩衝液を得るように与えられるだろう。同様な溶液を所望容量の等張溶液状
態のＮＡの医薬組成物のためにも使用でき、そして制限する訳ではないが、適当
濃度のリン酸またはクエン酸の緩衝塩溶液を、等張医薬調製物についていつでも
、例えば中性ｐＨのような所望のｐＨが得られるように使用することを含む。
治療部位にＮＡを導入する方法は、制限するわけではないが、皮内、筋肉内、
腹腔内、静脈内、皮下、経口および鼻内を含む。さらに、本発明の医薬組成物を
、心室内および鞘内注射を含む任意の適当な経路により中枢神経系に導入するこ
とが望ましいかもしれない。心室内注射は、例えばOmmaya リザーバーのような
リザーバーを付けたカテーテルにより容易になりうる。
導入法は、再装薬または生分解性デバイスにより提供することもできる。様々
なゆっくりと放出するポリマー性デバイスが開発され、そして近年、タンパク質
様生物薬剤を含む薬剤を制御して送達するためにインビボで試験された。生分解
性および非−分解性ポリマーの両方を含む、様々な生物適合性ポリマー（ヒドロ
ゲルを含む）が、特定の標的部位にＮＡを徐々に放出するためのインプラントを
形成するために使用できる。本発明のそのような態様は、外部で精製したＮＡの
送達に使用することができ、ＮＡはポリマー性デバイス中に包含されるか、また
はポリマー性デバイス中にカプセル化された細胞により生成されるＮＡの送達に
使
用されることができる。
特定のインプラントの態様の本質的特徴は、ＮＡの直線的放出であり、これは
ポリマー組成および形態の操作を通して達成することができる。モノマー組成あ
るいは重合法の選択により、水量、多孔性そして結果的に透過性を制御すること
ができる。形、大きさ、ポリマーおよび移植法の選択は、治療する疾患および個
別の患者の反応に従い、個人を基本として決定できる。そのようなインプラント
の生成は一般的に当該技術で周知である。例えば、医学および歯科用材料の簡易 的辞典
(Concise Encylopedia of Medical & Dental Materials)、David William
s編集(MIT出版：ケンブリッジ、マサチューセッツ州、1990)；およびSabelら、
米国特許第4,883,666号明細書を参照にされたい。インプラントの他の態様では
、ＮＡを生成する細胞源、または精製ＮＡを含有するヒドロゲルマトリックス溶
液を、移植可能なホローファイバーにカプセル化する。そのようなファイバーは
前以て遠心し、そして引き続きＮＡ源を装填するか (Aebischerら、米国特許第4
,892,538号明細書：Aebischerら、米国特許第5,106,627号明細書；Hoffmanら、(
1990) Exp.Neurobiol.110:39-44；Jaegerら、(1990)Prog.Brain Res.82:41-46；
およびAebischerら、(1991) J Biomech.Eng．113:178-183)、あるいはＮＡ源に
ついてポリマーコートを形成するように作用するポリマーと一緒に同時に押し出
すことができる (Lim米国特許第4,391,909号明細書；Sefton米国特許第4,353,88
8号明細書；スガモリら、(1989) Trans.Am.Artif.Intern.Organs 35:791-799；S
eftonら、(1987) Biotehnol.Bioeng.29:1135-1143；およびAebischerら、Biomat erials
12:50-55)。
さらに本発明の別の態様では、神経化薬を他の薬剤との組合わせ療法
の一部として投与できる。例えば組合わせ療法は、ホリスタチンのような神経化
薬を少なくとも１つの栄養因子と一緒に含むことができる。栄養因子の例には、
神経成長因子、線毛神経栄養成長因子 (ciliary neurotrophic growth factor)
、schwanoma-由来成長因子、グリア成長因子、stiatal-由来神経栄養因子、血小
板−由来成長因子、およびscatter因子(HGF-SF)を含む。hedgehog-様タンパク質
、ノギン（noggin）およびNotchレセプターリガンドのような他の神経誘導性タ
ンパク質も、本神経化薬と組み合わせて使用できる。例えば周辺のグリア細胞ま
たは星状細胞の増殖が神経細胞の再生には望ましくない時、抗有糸分裂活性剤も
使用することができる。そのような抗有糸分裂活性剤の例は、シトシン、アラビ
ノシド、5-フルオロウラシル、ヒドロジウレアおよびメトトレキセートを含む。
さらに、優性陰性アクチビンレセプター（可溶性または膜結合のいずれか）の
ような特定の神経化薬は、遺伝子治療で送達を可能とすることができる。例えば
、本優性陰性レセプターの発現構築物を、任意の生物的に効果的なキャリアー（
例えば優性陰性レセプター遺伝子をインビボの細胞に効果的に送達できる配合物
または組成物）中に適用することができる。方法として、組換えレトロウイルス
、アデノウイルス、アデノ−伴生ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス−１ある
いは組換え細菌または真核プラスミドを含むウイルスベクター遺伝子中への突然
変異レセプター遺伝子の挿入を含む。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフ
ェクトする一方、プラスミドＤＮＡも、例えばカチオン性リポソーム（リポフェ
クチン）または誘導化されることにより（例えば抗体結合）、ポリリシン結合、
グラマシジンＳ、人工的ウイルスエンベロップあるいは
そのような細胞内キャリアーの援助により送達されることができ、ならびにイン
ビボで行われる遺伝子構築物の注入またはCaPO4沈殿により送達されることがで
きる。適当な標的細胞への遺伝子導入は遺伝子治療の重大な第一段階であるので
、特定の遺伝子送達システムの選択は目的とする標的の表現型および投与経路（
例えば局所または全身）のような因子に依存するであろうと考えられる。さらに
アクチビン発現のインビボ遺伝子導入のために提供される特定の遺伝子構築物は
、上記のエクスビボ組織培養システムに使用するような、細胞のインビトロ遺伝
子導入にも有用であると考えられる。
実施例
神経化が中胚葉誘導と緊密に関連しているという事実は、神経誘導物質および
パターン化物質の分子特性について調査されたこれまでのほとんどの成果を妨害
した。したがって、神経誘導およびパターン化に関与する因子を単離する試みは
、中胚葉誘導物質およびモディファイヤーの同定および特性決定で終了した。以
下の実施例に記載するデータは、２つのアクチビン拮抗薬、アクチビンレセプタ
ーの優性陰性状態（Δ１ＸＡＲ１）およびホリスタチンが、中胚葉誘導をあらか
じめ必要とすることなく、両方とも胚のエクスプラントに直接的な神経化を表す
ことを実証する。さらにアフリカツメガエルホリスタチンの完全長ｃＤＮＡが単
離され、そしてその胚での位置がインビボでの神経発生において役割を果たす完
全な配列であることが示された。アクチビンの信号と拮抗することが神経化を生
じるという観察は、脊椎動物での神経誘導が不履行状態を表していることを初め
て示唆するものである。
さらに以下の実施例に記載するように、短縮化したアクチビンレセプ
ターは動物キャップ中の外因FGFによる中胚葉誘導を遮断せず、そしてさらに内
因FGFはΔ１ＸＡＲ１を注入した胚の有意な画分中に中胚葉を誘導しない。さら
に、胚の半分にΔ１ＸＡＲ１を注射した時、たとえFGFが動物キャップアッセイ
において短尾奇形の有力な誘導物質であるとしても、半分は試験した全ての胚中
（ｎ＝２５）でXbra発現を欠く。これらのデータは、内因のFGF発信が短尾奇形
発現を、またはΔ１ＸＡＲ１を注射した胚の辺縁層中に中胚葉誘導を援助するの
に十分でないことを示している。同時に、優性陰性FGFレセプターでの他の実験
から、FGFが軸のパターン化、特に後区の構造に重要な役割を果たすことが明ら
かである (Amayaら、(1991) Cell.66:257-270)。まとめて考えると、これらの知
見から中胚葉の誘導時のFGF発信には機能的アクチビン回路が必要であるという
可能性が生まれる。
本発明を一般的に記載したが、本発明の態様の特別な観点を説明するだけの目
的で、かつ本発明を制限するものではない以下の実施例を参照にすることにより
、本発明は容易に理解されるだろう。
実施例１
短縮化したアクチビンレセプターによるアクチビン発信の阻害は
インビボの神経構造を誘導する
神経化は、内因性のアクチビン分子の阻害が必要である不履行状態を表してい
るという判断を実証するために、胚中の神経化を異所的に誘導する優性陰性アク
チビンレセプターの能力を定めた。ＸＡＲ１の短縮体は、全部の細胞外性かつト
ランスメンブランのドメインを含むが、セリン／トレオニンキナーゼを含むほと
んどすべての細胞質ドメインを欠くように構築した。Δ１ＸＡＲ１を構築するた
めに、全細胞外ドメイン(シ
グナル配列を含む) をコードするＸＡＲ１からのＤＮＡ断片（Hemmati-Brivanlo
uら、(1991) Dev Dyn 194:1-11）、トランスメンブランドメイン、および細胞質
ドメインの１０アミノ酸残基ならびに完全に３’および５’非翻訳配列を含まな
いものをpSP64T (Kreigら、(1984) Nucleic Acids Res 12:7057-7070)中にサブ
クロー化した。キャップ化センスＲＮＡを生成するために、直線化したプラスミ
ドをインビトロでSP6で転写した。短縮化アクチビンレセプターをコードする生
成したＲＮＡを、野生型または腹側化した (ventralized)胚のいずれかの細胞中
に注入した。野生型の胚では2種類の実験を行った。第一組の実験では、Δ１Ｘ
ＡＲ１をコードするＲＮＡを初期胚の動物極（例えば２細胞期）に導入した。動
物極は将来、外胚葉を生じ、そして次に表皮性または神経性となる成長の胚の領
域である。Δ１ＸＡＲ１を推定上の外胚葉の部位に標的することにより、ほとん
どが前区性の嵩高く肥大した神経構造を持つ胚を生じる。例えば、胚は最高８個
の目および５個のセメント腺 (cement gland)を形成し、抗−NCAMでの全載免疫
組織化学(whole mount immunohistochemistry)では胚のほとんどの細胞が一般的
な神経マーカーで陽性に染色されることが明らかである。胚の動物極は神経形成
に参加するので、この実験は神経誘導が増幅されたことを実証した。
第二組では、初期開裂期の胚の植物極の２−３の細胞に、Δ１ＸＡＲ１ ＲＮ
Ａを注入した。これらの細胞は通常、内胚葉を生じ、神経組織は形成しない。驚
くべきことに、植物極細胞にΔ１ＸＡＲ１を注入すると胚の中に異所性の神経構
造の形成を引き起こす。一つの植物極細胞にΔ１ＸＡＲ１およびβ−Ｇａｌ Ｒ
ＮＡを同時に注入する線形トレーサー実験 (lineage tracing experiment)では
、注入された植物細胞の成
長が、グロビンおよびβ-Ｇａｌ ＲＮＡを注入した対照と比較して、変化するこ
とを示す。
さらに、注入した対照細胞（例えば、グロビン注入）は、ほとんど内胚葉組織
を集合する一方、Δ１ＸＡＲ１を注入した細胞は胚の背側(dorso)−前区位を占
める。そのような注入胚の全載免疫組織化学は、拡大した神経組織を表し、そし
てこの拡大は線形トレーサー（β-Ｇａｌ）の存在と相関することを示す。これ
らの実験は、細胞を再使用し、そしてそれらの元の成長を変化させることにより
、Δ１ＸＡＲ１がインビボの胚細胞を神経化でき、これにより神経組織の量を劇
的に増大させることを説明している。
Δ１ＸＡＲ１が、完全に軸構造を欠いている腹側化した胚に神経構造を誘導す
る能力も調査した。最初の細胞周期中の胚にＵＶ照射し、そして初期胚胞期の１
つの割球にΔ１ＸＡＲ１およびβ-ＧａｌをコードするＲＮＡを同時に注入した
。次に胚を、姉妹細胞の非ＵＶ照射胚が尾芽期に達するまで発生させ、そして次
にβ-Ｇａｌおよび神経マーカーNCAMの存在に関して染色した。Δ１ＸＡＲ１お
よびβ-Ｇａｌを発現する腹側化した胚を持つ正常な胚（実質的にＵＶ照射胚を
欠いている）の神経軸の染色の比較では、（ｉ）Δ１ＸＡＲ１は胚に神経組織を
誘導でき、そうでなければ背構造を欠く、（ii）神経組織は実際に神経管に似て
いる構造を形成する、そして（iii）マーカーとして線形トレーサーによりＲＮ
Ａを受容した細胞は神経組織の一部である、ことが実証された。これらの観察に
より、さらにΔ１ＸＡＲ１は軸の中胚葉が無い胚中であっても組織をインビボで
神経化できることを確証する。
この実験中に成された別の観察は、短縮化されたレセプターが、アク
チビンにさらされた動物キャップの初期の形態学的反応を、完全かつ特異的に遮
断する一方で、bFGFに対する反応には影響を及ぼさないことであった。予期せぬ
観察は、緩衝液だけでインキューベーションしたものを含むΔ１ＸＡＲ１注入胚
由来の動物キャップが、セメント腺を形成したことである。対照および非注入動
物キャップはセメント腺または中胚葉の組織を形成しなかった。
中胚葉誘導の初期および後期分子マーカーも、短縮化されたアクチビンレセプ
ターにより特異的に遮断された。アクチビンで処理した動物キャップ、アフリカ
ツメガエル 短尾奇形（Xbra）およびXhox-4では、Mix-1に緊密に関連するホメオ
ボックスタンパク質 (Rosa,F.M.(1989) Cell 57:965-974)を、中胚葉誘導の極め
て初期のマーカーとして使用した。Δ１ＸＡＲ１ ＲＮＡを注入した動物キャッ
プをアクチビンとインキューベーションした時、XbraおよびXhox-4の両方の発現
が遮断された。この遮断の特異性は、bFGFによるXbraの誘導が阻害されないとい
う事実により実証された。実際、bFGFによるXbra誘導はΔ１ＸＡＲ１の存在で増
大した。中期原腸腔 (midgastrulae)では短尾奇形は通常、辺縁層の下部に環と
して存在し (Smithら、(1991) Cell 67:79-87)、そして将来の背、外側、ならび
に腹側の中胚葉のマーカーである。Mix-1のようにXhox-4は、初期の植物細胞な
らびに推定上の背側および腹側の中胚葉をマークする。したがってXbraおよびXh
ox-4発現の阻害は、すべての種類の中胚葉が短縮化レセプターにより遮断された
ことを示していた。さらにこの主張は、グーセコイド (goosecoid)（中期原腸腔
期で頭部中胚葉のマーカー）が、すべての注入キャップ中に存在せず、そしてア
クチビンに反応するXwnt-8発現の誘導（腹側中胚葉のマーカー）が、短縮化アク
チビ
ンレセプターの注入により遮断されたという事実からも支持された。筋肉アクチ
ンの発現、原腸形成の末期に発現し、そして神経胚形成中に増加する中胚葉−特
異的遺伝子の発現も、短縮化レセプターを注入した動物キャップ中で選択的に阻
害された。筋肉アクチンの誘導に対する阻害は、Δ１ＸＡＲ１の投与に依存する
ことが分かった。対照キャップと比較すると、短縮化アクチビンレセプターを注
入したキャップにおいて、およそ１０倍高いレベルのbFGF誘導筋肉アクチンに注
目することは興味深い。このデータおよびΔ１ＸＡＲ１存在下のbFGFに反応する
Xbra発現の増強は、アクチビンがbFGFの中胚葉−誘導能力と拮抗し、そして突然
変異レセプターがアクチビンの効果を遮断することにより、bFGFのさらなる誘導
活性を増幅または暴露することを示していると解釈される。この考察は、１つの
発信経路を遮断する胚細胞内の機能的な重複により、その効果を相補するために
平行する経路の増強を導くことができることを実証している。
ここで報告した実験は、極端な表現型においてアクチビンの発信を破壊するこ
とは、中胚葉誘導および背側の体軸形成を妨げることができることを表す。中胚
葉組織の組織学的差異は見つからず、初期および後期分子マーカーは遮断され、
そして原腸形成は進行しない。これらの結果により、アクチビンがインビボでの
中胚葉誘導の主要決定因子として確実となり、そして他のいくつかの誘導物質を
単に模するだけの分子ではないことが確実である。
実施例２
阻害された内因性中胚葉誘導信号（１つまたは複数）
上記の実施例１に説明した実験は、短縮化したアクチビンレセプター
が、外植した動物キャップ細胞で中胚葉の誘導を遮断できることを示している。
全胚では、中胚葉は動物キャップ細胞というよりは辺縁層（胞胚の赤道領域）か
ら派生し、これは通常、外胚葉の成長となる。短縮化レセプターが完全な胚の辺
縁層中の中胚葉マーカーの誘導を遮断することができるかどうかを試験するため
に、短縮化レセプターを２−細胞胚の１つの細胞中に注入した。各々の場合で、
半分の非注入胚を対照として使用した。対照の胚中で完全な環として発現する短
尾奇形の発現は、注入胚中では半環に減少した。これは短縮化したアクチビンレ
セプターが、インビボで中胚葉を形成する細胞中のXbra RNAの誘導を遮断したこ
とを示していた。
本明細書に記載する実験はさらに、中胚葉が欠如している全胚の表現型、およ
びそれに付随する形態学的変化を決定することができることを示唆している。２
−細胞期の両方の細胞に短縮化アクチビンレセプターを注入した胚は、一つの範
囲の表現型を表し、そのすべが中胚葉および軸発生を欠失していると記録する。
胚に4ngのΔ１ＸＡＲ１またはβ-globin RNAのいずれかを、２−細胞胚の両方
の割球の赤道領域に注入した。胚は姉妹細胞の非注入対照が尾芽期になるまで発
達させ、その時点で生存細胞の表現型について記録した。軸構造が無い胚の中で
、ほぼ半分が原腸形成 (scant battle-細胞形成のみ)の最小の証拠を示し、そし
て組織学的または分子マーカーアッセイのいずれかにより検出できる筋肉または
脊索は無かった。他は部分的な原腸形成のみを表し、そしてこれらマーカーの正
常量の20％未満を含んだ。部分的な軸の欠失は、頭部または尾部がない動物であ
り、正常量の50％未満の脊索および筋肉を含んでいる。このクラスへの分割、極
端な、および部分的な欠失は、欠失が観察された範囲で任意である。ｎ＝胚の数
。
尾芽期に達する時間を制御することにより、極端な表現型（注入したうちの約
50％）を表す胚は、その発生がひどく欠けている。最も極端な場合では、体軸形
成の兆候がなく、胚は動物−植物軸に止まっているが、前−後区または背側−腹
側のボディプランの誘導が無かった。時々、いくつかのボトル(bottle)細胞が形
成し、そして原腸形成が始まったが、陥入が小さい唇を越えて進行することは無
かった。注入した動物キャップエクスプラントでの観察では、セメント腺の分化
は起こらなかった。組織学的な区分では、極端な場合で中胚葉分化または原腸形
成の証拠が明らかにされたものはなかった。胞胚腔は完全なままであり、そして
推定上の胚葉の再配列はほとんど無かった。分化の分子マーカーのアッセイでは
、これらの胚が脊索を形成せず、筋肉アクチンまたはXbra RNAを発現したことを
示した。筋肉アクチンおよびXbra RNA発現によりアッセイされたように、中胚葉
の分化が無いことは、注入された短縮化アクチ
ビンレセプターＲＮＡの投与に依存した。4ngのＲＮＡを注入すると、筋肉アク
チンおよび短尾奇形発現の両方が劇的に減少した。
残りの胚は、さまざまな程度で、中胚葉発生、原腸形成および軸形成の痕跡程
度の兆候を示したが、正常な胚は生成されなかった。これらは常に脊索および筋
肉形成の減少が特記され、この種類の胚のほとんが正常量の半数未満の脊索また
は筋肉を形成した。対照ＲＮＡを注入した胚では、これら中胚葉または軸欠失の
いずれも有意な程度で観察されることはなかった。
実施例３
野生型アクチビンレセプターによる援助
短縮化アクチビンレセプターによるアクチビン発信の破壊が、観察された中胚
葉および軸欠失の原因であるならば、野生型アクチビンレセプターの注入は表現
型を助けるはずである。事実、中胚葉マーカーに関する大まかな形態学および分
子アッセイから判断すると、野生型アクチビンレセプターＲＮＡ量を、短縮化ア
クチビンレセプターをコードするＲＮＡの一定量で増大させて注入すると、胚を
救うことができる。興味深いことには、この援助には比較的低量の野生型アクチ
ビンレセプターが必要であり、そして野生型レセプターのみの異所的発現に観察
されるように、野生型レセプターの高濃度では多数で、かつ曲がった軸を形成す
る。
実施例４
Δ１ＸＡＲ１での胚外胚葉の神経化
実施例１−３に説明した実験は、アクチビンレセプターの短縮した形態（Δ１
ＸＡＲ１のような）が、アクチビンの発信を阻害し、そして動
物キャップ細胞の成長を表皮性から神経性へと変化させることを実証する。N-CA
M発現でアッセイしたこのキャップの神経形成は、その中に中胚葉の細胞の成長
が検出されなかった点で直接的であった。Δ１ＸＡＲ１のさらなる神経化活性の
特性決定は、動物キャップエクスプラントを使用して行った。
２−細胞期のアフリカツメガエルの胚に、様々な濃度のΔ１ＸＡＲ１または対
照ＲＮＡを注入した。動物キャップは胞胚段階で取り出し、そして姉妹細胞対照
が初期尾芽期になるまで塩溶液中で培養した。ＲＮＡを抽出し、そしてノーザン
ブロット法により神経−特異的マーカーの存在について分析した。Δ１ＸＡＲ１
を注入した動物キャップは２つの一般的な神経マーカーを発現した：N-CAM（こ
れはアフリカツメガエルの胚の中枢神経系（ＣＮＳ）で専ら、かつ偏在して発現
される）、およびβ−チューブリン アイソタイプIIをコードする転写物（これ
も専らCNS中で発現する）。グロビンＲＮＡの注入は、これらの神経マーカーの
発現を促進しなかった。
前述の実施例では、短縮化したアクチビンレセプターを発現する動物キャップ
細胞は、いかなる中胚葉マーカーも発現しないことを示す。、極めて初期および
後期、ならびに背側および腹側の中胚葉マーカーがすべてアッセイされ、そして
Δ１ＸＡＲ１ｍＲＮＡを注入した細胞中では発現されないことが分かった。本実
験において、両方の神経マーカーならびにセメント腺（XAG1）マーカー（Siveら
、(1989) Cell 58:171-180）は、筋肉マーカー（心臓アクチン：Gurdonら、(198
5) Cell 41:913-922）で試験したように、軸の中胚葉が無くても発現する。セメ
ント腺は、前区から前脳部に位置する外胚葉組織である。したがってΔ１ＸＡＲ
１の
発現による推定上の外胚葉の神経化は、中胚葉誘導によっては進行しないし、そ
れに依存もせず、神経誘導が直接的であることをさらに確証している。
実施例５
Δ１ＸＡＲ１により誘導される神経組織はパターン化される
初期の神経形成中、神経板（形態学的には識別できない細胞を含んで成るもの
であるが）は、前後方向の、および中外側の極性を表す。例えば、エングレイル
ド−２ (En-2)（中脳−菱脳構造のマーカー）（Hemmati-BrivanlouおよびHarlan
d,(1989) Development 106:611-617）、およびKrox-20(菱脳の神経小片3および5
のマーカー)(Bradleyら、(1993) Mech Dev 40:73-84)は、両方とも鋭い前後方向
の境界を持つ片として発現する。Δ１ＸＡＲ１は外胚葉細胞の成長を表皮性から
神経性へと変化させるので、神経化された組織がパターン化(patterned)される
かどうかを、ノーザンブロット、免疫組織化学または逆転写ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）により試験し、局部的に発現する一連の神経マーカーについ
て評価した。
モノクローナル抗体(MAb)3C3は、アフリカツメガエルの胚の全CNSを染色し、
そしてMAb25.4はほとんどの知覚神経系を染色する。両方のMAbは、全Δ１ＸＡＲ
１またはグロビン対照ｍＲＮＡのいずれかを注入した胚に由来する動物キャップ
をアッセイするために使用した。Δ１ＸＡＲ１を注射した動物キャップがMAb3C3
で陽性に染色されたが（１０のうちの７）、グロビンを注射した動物キャップは
染色されなかった（１０のうちの０）。この神経−特異的抗原を発現する細胞は
、クラスター状で存在し、そしてエクスプラント全体に分散していなかった。Δ
１ＸＡＲ
１ ｍＲＮＡと同時に注入した線形トレーサーは、外移植した動物キャップのほ
とんどすべての細胞がΔ１ＸＡＲ１ ｍＲＮＡを含んでいることを示し、これら
の結果はΔ１ＸＡＲ１を発現する細胞のサブセットのみがMAb3C3により認識され
るＣＮＳ抗原を発現することを示している。Δ１ＸＡＲ１を発現する動物キャッ
プ細胞はMAb25.4で染まり（１０の動物キャップのうちの８）、一方、グロビン
を発現する細胞は染まらないことが観察された。これは、神経化した細胞のいく
つかが知覚ニューロンの成長に適合したことを示唆している。
動物キャップの前後方向の軸に沿った様々な位置に関する神経マーカーの発現
は、姉妹細胞対照が尾芽期に達した時にＲＴ−ＰＣＲを使用して評価された。オ
プシン（目のマーカー） (SabaおよびGrainger,(1993)Mol Brain Res 17:307-31
8)、En-2、Krox-20およびタナビン(tanabin)をアッセイした。目は前脳から派生
し、即ちオプシン発現は前脳細胞の存在を示している。En-2発現は中脳細胞の存
在を示している。タナビンは菱脳の神経小片２、４、６および８、三叉神経の神
経節、ならびに目、前脳および脊髄の２−３の細胞をはっきり分ける神経−特異
的中間ニューロフィラメントである。Krox-20の発現が大変低いので、菱脳細胞
の存在は確実性が低く、そしてタナビンの発現は光受容体または前脳のような、
より前区のCNS細胞の存在を示唆している。これらのすべてのマーカーは、予め
Δ１ＸＡＲ１を注入したキャップ中で発現するが、非注入またはグロビン−注入
キャップでは発現しないことが分かった。脊髄−特異的マーカーXlhbox-6(Wrigh
tら、(1990) Development 109:225-234)は、Δ１ＸＡＲ１エクスプラント中には
存在しないか、または低レベルで発現した。これらの注入エクスプラント中のN-
CAMの存在、および
筋肉アクチン発現の不在で、これらのマーカーが中胚葉誘導無しで発現すること
を実証している。これらの結果を以下の表２に要約する。
表２に関して：全ての場合でマーカーは、姉妹細胞対照が尾芽期に達した時に
評価された。NCAM、β-チューブリンアイソタイプIIおよび3C3
は、一般的な神経マーカーであり、そしてすべて発現した。前後方向のマーカー
はオプシン（目の光受容体マーカー）、En-2(後区中脳を分ける)、そして前区菱
脳Krox-20(菱脳の神経小片3および5を分ける)、およびタナビン(菱脳の神経小片
２、４、６および８、三叉神経神経節、ならびに目および脊髄の2-3の細胞のマ
ーカー)を含む。Xlhbox-6は脊髄のマーカーである。Tor25.4は知覚神経のマーカ
ーである。XAG1はセメント腺マーカーである。この表に表すデータはノーザンブ
ロット、ＲＴ−ＰＣＲおよび全載免疫組織化学により得た結果の組合わせである
。
実施例６
Δ１ＸＡＲ１は全胚中の推定上の外胚葉および中胚葉割球を
神経性の成長へと変える
上記記載の結果は、アクチビンII型レセプター発信の阻害がエクスプラント中
の推定上の胚の外胚葉の神経化およびパターン化を引き起こすことを示している
。この神経化が全胚で生じることができることを確証するために、Δ１ＸＡＲ１
をコードする合成ＲＮＡを野生型胚の推定上の外胚葉に注入した。第一組の実験
では、Δ１ＸＡＲ１をコードするＲＮＡを初期胚の動物極（将来外胚葉を生じ、
そして次に表皮性または神経性となる領域）に注入した。推定上の外胚葉の部位
にΔ１ＸＡＲ１を標的することは、胚に大いに肥大した神経構造を導くことが判
明した。注入胚は８つの目と５つのセメント腺を形成した。組織化学的な実験で
は、Δ１ＸＡＲ１−注入胚が通常、CNSならびに異所性の神経組織の肥大を表す
ことが明らかになった。したがって、推定上の外胚葉中のΔ１ＸＡＲ１発現は、
神経組織の形成を増幅した。
第二組の実験では、８−細胞アルビノ胚の植物極の単一細胞に、Δ１
ＸＡＲ１およびβ-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌ）ＲＮＡ（線形トレーサーとし
て）を同時に注入した。アルビノは線形トレーサーおよび分子マーカーの全載分
析のためによく適しているので使用した。４つの植物割球の２つの腹側割球が、
主に後区消化管および後区体節に貢献している (MoodyおよびKline,(1990) Anat Embryol
182:347-362)。背側の対は主に脊索前方の頭部中胚葉および咽頭内胚
葉に貢献している。背側および腹側植物細胞のいずれも、通常は前区神経組織を
生じない（MoodyおよびKline,同上）。アルビノ胚が注入されてから、推定上の
背側または腹側植物割球の間を区別することはできなかった。この結果は、推定
上の背側または腹側植物割球の成長が、Δ１ＸＡＲ１発現の結果として前区神経
組織に変化するという上記になされた観察の確証を示した。対照グロビンおよび
β-ｇａｌ ＲＮＡを注入した植物割球の子孫は、神経組織に貢献しない（５０の
うちの４９）。しかし、Δ１ＸＡＲ１およびβ-ｇａｌ ＲＮＡを植物細胞に同時
注入すると、注入細胞のほとんどの子孫を胚の背前方域へと再配置させる結果を
生じた(５０のうちの５０)。この細胞の再配置は、ホメオボックス遺伝子グーセ
コイドを発現する割球中で観察されたものと同様である(Niehrsら、(1993) Cell
72:491-503)。Δ１ＸＡＲ１が前区神経組織を動物キャップエクスプラント中に
誘導するという事実と一致して、これらの注入細胞のほとんどが前脳、中脳およ
び目のような神経組織に参加している。さらに、細胞のなかには体節のような軸
中胚葉誘導物中に包含されたものもある。
同じ注入実験で、神経−特異的抗体3C3での二重染色により、正常CNSの集団化
に加えて、注入細胞の子孫が検出された異所性の神経組織に貢献していることが
確認された。動物キャップエクスプラント中に中胚葉
の誘導を完全に遮断しないΔ１ＸＡＲ１ ｍＲＮＡの投与量 (胚 あたり500pg)
を、これらの実験で注入した。したがって、短縮化アクチビンレセプターを発現
する植物細胞（推定上の内胚葉）は、その成長を神経性に変えるが、一方これら
の細胞は通常、前区神経構造に有意に貢献しないだろう。
実施例７
Δ１ＸＡＲ１は軸の援助無くＵＶ−腹側化胚を神経化する
短縮化されたアクチビンレセプターの神経化特性をさらに調べるために、ＵＶ
照射により腹側化された胚に対するその効果を測定した。第一細胞周期中の受精
卵の植物極の照射は、腹側化（背側の軸構造、体節の筋肉、脊索または神経管が
無い胚の形成）を生じる (Malacinskiら、(1975) Dev Biol 56:24-39)、Scharf
およびGerhart、(1983) Dev Biol.99:75-87)。ＵＶ−照射胚に、Δ１ＸＡＲ１お
よびβ-ｇａｌあるいは陰性対照としてグロビンおよびβ-ｇａｌのいずれかをコ
ードするＲＮＡを同時注入した。１つの植物割球に８−から１６−細胞期で注入
し、胚は姉妹細胞非−照射対照が尾芽期になるまで発生させ、そして胚をβ-ｇ
ａｌおよび一般的な神経マーカー3C3の存在について染色した。
この結果は、Δ１ＸＡＲ１がそうでなければ背側構造が欠けている胚に神経組
織を誘導でき、そして誘導した神経組織が神経管に似ている管−様構造を形成す
ることを実証する。Δ１ＸＡＲ１ ＲＮＡを受容した細胞（β-ｇａｌの発現が記
される）は、神経組織の一部であった。しかし、すべての神経細胞が線形トレー
サーを含むわけではない。幾つかの神経細胞は、Δ１ＸＡＲ１を注入した神経細
胞から発信する信号により二次的に形成することができた。神経構造の誘導は、
不完全な管とし
てパターン化されることがあっても、腹側化したＵＶ胚の表現型に完全な軸の援
助を明らかに導かない。これらの結果はさらに、Δ１ＸＡＲ１がインビボで組織
を神経化できることを確証する。
複雑な事実は、Δ１ＸＡＲ１を注入したＵＶ胚中の幾つかの筋肉−特異的抗原
（12/101染色）の観察結果であった。12/101で染色した細胞は、β-ｇａｌにつ
いては染まらず、したがって注入された割球からは派生しない。この結果は、神
経管が周辺筋肉を誘導またはパターン化できたという興味深い可能性を生む。
実施例８
アフリカツメガエル ホリスタチンのクローニング
アクチビンが内因性の神経分化阻害物質であるかどうかをさらに確認するため
に、２つの周知のアクチビンの特異的阻害物質であるホリスタチンおよびインヒ
ビンをアッセイした。これら２つのタンパク質のアフリカツメガエルの完全長ｃ
ＤＮＡは入手できないので、対応するラット遺伝子の可能性のある神経化活性を
、動物キャップアッセイにより、インビトロで初めて試験した。アフリカツメガ
エルの胚の組織化を、ラットホリスタチンおよびインヒビンの両方で観察した。
同じ実験をアフリカツメガエルの相同物でも行った。この実験を行うために、
アフリカツメガエルｃＤＮＡライブラリーからの完全長ホリスタチンクローンを
標準的方法で単離した。このクローンの配列は、シグナルペプチド（これは典型
的には分泌因子を示している）、および成熟タンパク質の約75％を包含する３つ
の親密に関連したドメイン（既に“ホリスタチンモジュール”として報告された
：Patthyら、(1993) Trends in Neurol.Science 16:76-81)を含む。ホリスタチ
ンモジュールは、
最近、オステオネクチン、アグリン、ラット脳由来のタンパク質SC1およびヒト
テスチカンのような、少なくとも４つの他のタンパク質中で認識された。SC1、
テスチカンおよびオステオネクチンは１つのホリスタチンモジュールを有するが
、アグリンはＮ−末端に９つの直列に反復しているモジュールを有する (Patthy
ら、(1993) Trends in Neurol.Science 16:76-81)。
ヒト、ブタ、ラットおよびアフリカツメガエルを含むホリスタチンｃＤＮＡが
単離されたすべての種で、２種類の転写物が検出された。ヒト、ブタ、およびラ
ットゲノムクローンを使用した配列分析、Ｓ１マッピングおよびＲＮａｓｅ保護
により、これら２つの転写物がディファレンシャルスプライシングにより生成す
ることが明らかになった。このディファレンシャルスプライシングは、２つの単
量体グリコシル化タンパク質の翻訳を導く。これまでに調査したすべての種の中
でより低分子量状態は、より大きな前駆体のカルボキン−末端が短縮された状態
を表し、そしてより大きな前駆体から酸性アミノ酸の高度に酸性な広がりを除去
することにより生成される。各タンパク質中のアミノ酸数は、各サブタイプを命
名するために従来から使用されている。したがってヒトホリスタチンタンパク質
はＦＳ３１５およびＦＳ２８８と呼ばれ、ラットはＦＳ３４４およびＦＳ３１７
であり、そしてブタはＦＳ３００およびＦＳ２８８と呼ばれている。同じ慣習を
使用して、アフリカツメガエル ホリスタチンはＸＦＳ３１９と呼ばれている。
このタンパク質は他の種からクローン化されたホリスタチンのより小さなサブタ
イプの相同物であり、酸性のカルボキン末端が欠失している。２つの異なる長さ
のＦＳアミノ酸鎖に加えて、天然タンパク質は様々なグリコシル化の程度を表し
、これ
がホリスタチンの分子量の異質性に寄与している (イノウエら、(1991)Endocrin ology
,129:815-822)。
実施例９
ホリスタチンタンパク質、合成ＲＮＡおよび発現ベクターの作成
ホリスタチンの大量な活性合成ＤＮＡの生成を可能にするプラスミドを作成し
た。このプラスミドpSP64TXFS-319は、XFS-319（配列番号１）の読み取り枠をプ
ラスミドpSP64Tにサブクローン化することにより作成した。pSP64Tは、ｍＲＮＡ
の安定性および翻訳を増強するために、アフリカツメガエルβ-グロビン遺伝子
の５’および３’非翻訳領域を含むように改変された公に入手可能なpSP64ベク
ターに由来する。この構造物で、安定で翻訳が増強されたキャップＲＮＡの大量
生産が可能になる。アクチビンの遮断が野生型のように活性であるXFS-319のエ
ピトープ標識型を作成した。これはもともとヒトのmycタンパク質に由来する１
２アミノ酸をXFD-319のＣ−末端に付加することにより構築された。この分子タ
グはモノクローナル抗体(Mal9E10)により認識され、そして全胚中で注入ホリス
タチンタンパク質を追跡することができる。
アフリカツメガエル ホリスタチン (XFS-319)を過剰発現する細胞培養系は、
pSP64TXFS-319構築物を使用して構築することができる。ヒト ホリスタチンを
チャイニーズハムスター卵巣細胞系（CHO）で成功裏に過剰発現することが証明
された手順に従い (イウノエら、(1991) Endocrinology,129:815-822)、XFS-319
の読み取り枠をSV40プロモーターおよびポリアデニレーション配列を含むプラス
ミドにサブクローン化することができる（pSV2）。このベクターをdhfrを発現す
る同じベクター(pSVdhfr)と一緒に、リン酸カルシウム沈殿法によりdhfr−欠失C
HO細胞
系（CHO-DF-44）中に同時−トランスフェクションする。アフリカツメガエル遺
伝子はメトトレキセート (MYX)を使用して増幅する。これらのトランスフェクシ
ョン細胞からのコンディション培地を非トランスフェクション対照と一緒に直接
的に使用でき、あるいは精製タンパク質が必要な場合には既に記載されたように
(イウノエら、(1991) Endocrinology,129:815-822)コンディション培地からXFS
-319を精製するためにアクチビンアフィニティーカラムを使用することができる
。
数種の発現ベクターを胚中のXFS-319の発現のために使用できる。例えば、XFS
-319は細胞骨格アクチンプロモーターの制御下に位置することができ、これは強
力な構成的に活性なプロモーターである。同様にXFS-319はアフリカツメガエル
熱ショクプロモーターの制御下に位置することができる。このプロモーターは、
通常は20℃に保たれる受容体胚の温度が24−25℃に上昇した時にのみ活性である
(Harlandら、(1988) Development 102:837-852;およびVizeら、アフリカツメガ エル：細胞および分子生物学における実践的使用
（Xenopus laevis：Practical uses in Cell and Molecular Biology
）KayおよびPeng編集、アカデミック出版
社：フロリダ、1991)。アフリカツメガエルの接合子の転写は中期−胞胚期（MBT
）まで始まらないので、そのような構築物は胚中のホリスタチンの後期の機能を
決定するのに有用でありうる。
実施例１０
アフリカツメガエル発生中のホリスタチン発現
様々な胚の段階からのＲＮＡのノーザンブロットにより、哺乳類の場合のよう
に、2.4および3.6kbの2つの明らかなＲＮＡがホリスタチン遺伝子から転写され
、そしてその2.4kbのメッセージが受精卵の母方に存
在することが明らかになった。より大きなアフリカツメガエル ホリスタチンサ
ブタイプの一部をコードする部分的なｃＤＮＡクローンも、最近アフリカツメガ
エルの胚から単離された（Tashiroら、(1991) Biochem Biophys Res Comm.174:1
022-1027)。種間のアミノ酸同一性は大変高く、哺乳類では約98％の同一性（イ
ウノエら、(1991) Endocrinology,129:815-822)、ならびにアフリカツメガエル
とヒトの間には86％の同一性がある。
2つのタンパク質型を生成するディファレンシャルスプライシングは、両方の
転写物がホリスタチンを発現するすべての組織に存在するので、組織に特異的な
調節下にあるのではないようである。より短いヒトホリスタチン（HF 288）は、
インビトロおよびインビボの両方で８−１０倍強力にアクチビンを阻害すること
を示した (イウノエら、(1991) Endocrinology,129:815-822)。事実、ヒトホリ
スタチンのより短い状態が、インヒビン（アクチビンの他の特異的阻害物）より
も良い、アチビンの最も強力な阻害物である (イウノエら、(1991) Endocrinolo gy
,129:815-822)。固相アッセイを使用した混合ヒトＦＳのアクチビンへの結合
のカイネチック分析により、ＦＳ−アクチビン相互作用は、アクチビンのそのレ
セプターへの結合で予想されるものに等しい、高い親和性であることが明らかに
されなかった。インヒビンはＦＳ結合アッセイにおいて、アクチビンと比較して
相対的な力が約500-1000倍低い。
実施例１１
ホリスタチンはスペマンの形成体中で再配置する
アフリカツメガエルの胚発生の様々な段階中で、でホリスタチンの場所的な分
布を検出するために、アンチ-センス XFS-319 RNAを用いた全 載in
situハイブリダイゼーション (Hemmati-Brivanlouら、(1990) Development
110:325-330)を使用した。これらの実験で使用したプローブは、ノーザンブロ
ットで使用したものであり、したがって両方のホリスタチン転写物を認識できる
。この方法により、ホリスタチンＲＮＡは、形成体の２、３の細胞がXFS転写物
を発現する原腸形成の開始段階で最初に検出された。原腸で、ホリスタチンＲＮ
Ａは背側に位置する。この位置は、原腸形成の開始時に分かれた(disect)胚から
抽出されたＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲにより、背側に位置するマーカーノギ
ン (Smithら、(1992) Cell 70:829-840)およびグーセコイド (Blumbergら、(199
1) Science 253:194-196)を対照として使用して確認される。
胚のこの領域は、動物キャップアッセイで以前に有力な神経誘導物質として特
徴付けられた。発現は後期原腸および初期神経段階で、前区において脊索の２／
３まで続く。これらの胚の段階の横向きの区分は、ホリスタチンＲＮＡが脊索前
方および脊髄の中胚葉の細胞のサブセット中に発現することを示す。この発現は
前区の螺旋状中胚葉中で最強であり、そして強度は後区末端に向かって衰える。
初期の神経胚では、神経板が未だ開放している時、ホリスタチンの発現が頭部中
胚葉および前区脊索で確認される。これらの初期神経胚の横向きの区分は、背側
中胚葉の発現に加えて、ホリスタチンＲＮＡはちょうど脊索に対して腹側の脊髄
腹側の２−３の細胞中にも検出することができる。これらの段階で、ホリスタチ
ンを発現する前区脊索の部分は間脳（前脳）の床に触れ、そして中脳、菱脳およ
び約半分の前区脊髄の下にある。脊索中の発現は、発生が進行するにつれて後区
に広がり、そして２１期までに全脊索を含む。この胚の形成体領域は、動物キャ
ップアッセイでは以前に強力な神経誘
導物として特性が決定された。したがってホリスタチンの側頭の、かつ場所的な
位置は、神経誘導活性を含むと一般的に予想される部位と完全に一致している。
神経管が形成された後、ホルスタチンＲＮＡも前脳、推定上の中脳、中脳−菱
脳接合部および菱脳中に検出される。さらに一過性のホリスタチン発現が、前腎
および血島に近い腹外側中胚葉にある。また尾芽期の網膜の光受容体中の発現が
ある。浮いている(swimming)形幼生期に、ほとんどの発現は脊索および頭部に位
置する。前脳で、ホリスタチンの発現は脳室辺の細胞中の背腹側に分布した３つ
の片に対して確認された。神経管の床または上衣板の明らかな染色は無い。
実施例１２
アフリカツメガエル ホリスタチンＲＮＡおよびタンパク質は
アクチビンで誘導される中胚葉形成および形態学的な変化を遮断する
ホリスタチンがアクチビン活性を阻害する能力を、２つの独立した方法で試験
した。第一組の実験では、両方の割球の動物極の２−細胞期に、胚に1ngのXFS-3
19 RNAまたはグロビン対照RNAのいずれかを注入した。この胚を、それらが８胞
胚期に到達するまで発生させ、その時点で動物キャップを分け(dissected)、そ
して緩衝液単独、またはアクチビン中でインキューベーションした。対照グロビ
ンＲＮＡの注入は、アクチビンが誘導した形態学的な変化には影響を与えなかっ
たが、XFS-319の注入はアクチビン処理による誘導に関連する形態学的な変化を
完全に遮断した。さらに、XFS-319を注入し、そして緩衝液またはアクチビン中
でインキューベーションした動物キャップは、明らかなセメント腺を表し、これ
は上記記載の優性陰性アクチビンレセプターの効果と平行している。
第二組の実験では、XFS-319をコードする50ngのＲＮＡまたはアフリカツメガ
エル アクチビンβbをコードする12ngのＲＮＡのいずれかを、成熟（第６期）の
アフリカツメガエル卵母細胞に注入した。48時間後、これらの卵母細胞または非
注入卵母細胞によりコンディショニングした培地を集め、そして第８期の割球胚
の動物キャップエクスプラントに適用した。エクスプラントを緩衝液単独または
非注入卵母細胞由来のコンディション培地のいずれかの中でインキューベーショ
ンした時、それらは球状態を保った。対照的に、アクチビン−注入卵母細胞から
のコンディション培地中でインキューベーションしたエクスプラントは、劇的に
拡大する。XFS-319 を注入した卵母細胞によりコンディションした培地中でイン
キューベーションした動物キャップは、球状を維持した。最後にアクチビンおよ
びXFS-319を注入した卵母細胞からのコンディション培地を１：１の比で混合し
た時、アクチビンにより誘導された形態学的な変化は完全に遮断される。これら
２つの実験は、XFS-319が他の種の相同物と同様に、アクチビンの有力な阻害物
であることを実証している。
この阻害強度を評価するために、用量応答実験を行い、その中では２−細胞期
の胚の動物極に、対照グロビンＲＮＡまたは様々な濃度のXFS-319を注入した。
第一組の実験のように、注入胚由来の動物キャップを８期で外植し、そして強力
な中胚葉誘導物アクチビンとインキューべーションした。これらのキャップを非
注入の姉妹細胞胚が尾芽期になるまで培養し、その時点で全ＲＮＡをエクスプラ
ントから単離し、そしてノーザンブロッティングにより分析した。軸中胚葉マー
カー筋肉アクチンの発現で評価すると、4ngの対照グロビンＲＮＡはアクチビン
の中胚葉誘導活性を妨害しないように見え、250pgのXFS-319 RNAはアクチビン作
用を完全に遮断するに十分であることが判明した。さらに、4.00、1.00または0.
25ngのXFS-319 RNAおよびアクチビン処理細胞（各濃度について20のエクスプラ
ント）はいずれも拡大の兆候がなかった。
実施例１３
ホリスタチンは直接的な神経誘導物質である
XFS-319の直接的な神経誘導活性も、動物キャップエクスプラントで試験した
。XFS-319がこの種の活性を持つかもしれないという示唆は、XFS-319を注入した
エクスプラント中にセメント腺が誘導されたという観察からきたものである。胚
は２−細胞期で動物極中に2ngのXFS-319 RNAを注入され、そしてこのRNAの注入
は、一般的な神経マーカーN-CAMおよびβ-チューブリンアイソタイプIIの発現に
より実証されるように、動物キャップ中に神経組織の誘導を表すことが判明した
。これらのマーカーは筋肉アクチン無しで発現し、この誘導が直接的、すなわち
中胚葉誘導を同時に伴わないことを示唆している。さらにこれは、神経誘導性ホ
リスタチンを持つ１つの内因性の胚分子が、神経化の阻害物質としてのアクチビ
ンの証拠も提供する初めての証拠を示す、ということが注目される。
これらのエクスプラント中の一般的な神経マーカーの誘導は、明らかにXFS-31
9の神経化活性を実証している。しかしこの誘導は筋肉アクチンマーカーの不在
で起こるが、他の中胚葉組織はなお存在した。この問題を解決するために、XFS-
319または対照ＲＮＡを上記と同じ条件下で注入した。動物キャップエクスプラ
ントの一部は、姉妹細胞対照が中期原腸期に達するまで進行させ、中間の初期中
胚葉マーカーの発現を分析し、そして残りは尾芽期になるまで発生させ、そして
筋肉アクチンおよ
び神経マーカーについてアッセイした。非注入動物キャップ、あるいは緩衝液単
独でインキューベーションしたXFS-319または対照ＲＮＡを注入したエクスプラ
ントは、アッセイしたいかなる５つの中胚葉マーカーも発現しなかった。初期の
−背側−特異的中胚葉マーカーであるグーセコイドおよびノギン（noggin）、な
らびに腹側マーカーであるXwnt-8(Chrisitanら、(1991) Development 111:1045-
1056)、および一般的な初期中胚葉マーカーであるX-bra (Smithら、(1991) Cell
67:79-87)およびMix-1は、2ngのXFS-319 RNAを注入したキャップ中で発現しな
い。対照的に非注入動物キャップは、アクチビンに反応してこれらのすべてのマ
ーカーを発現した。さらに、尾芽期まで発生させるようにしたエクスプラントも
、神経マーカーN−CAMを発現するが、筋肉アクチンは発現しないことが判明し、
XFS-319がこれらの実験で神経組織の誘導に活性であることを示している。これ
らの実験はさらに、XFS-319の神経化活性が評価しうる中胚葉の不在で起こると
いう概念を支持し、この定義により、直接的である。さらに、ホリスタチンがノ
ギン発現を誘導しないと言う事実は、ホリスタチンによる神経誘導メカニズムが
ノギン作用に依存しないか、またはホリスタチンがこの点に関してノギンの下流
で作用するかのいずれかを示唆している。
実施例１４
神経誘導に必要なホリスタチンＲＮＡの投与量
次に、動物キャップエクスプラント中に一般的な神経マーカーおよびセメント
腺を誘導するのに必要な投与量を測定することにより、ホリスタチンの直接的な
神経誘導活性を特徴付けることを計画した。胚の２−細胞期で、動物極に様々な
濃度のXFS-319 RNAを注入した。注入胚由来
の動物キャップを、胞胚期で外植し、そして姉妹細胞非注入対照が初期尾芽期に
達するまで発生させた。様々な濃度のXFS-319 RNAを注入したエクスプラントか
ら抽出したＲＮＡを、非注入エクスプラントおよび対照胚由来のＲＮＡと一緒に
ノーザンブロットで分析した。一般的な神経マーカーβ-チューブリンアイソタ
イプIIが、少なくとも50pgのXFS-319 RNAを注入することにより、これらのキャ
ップ中に誘導でき、一方セメント腺マーカーXAG-1(Siveら、(1989) Cell 58:171
-180)は最少250pgを必要とすることも観察された。筋肉アクチンパネルは再度、
神経化が直接的であり、エクスプラントが中胚葉を含まないことを実証した。
実施例１５
ホリスタチンは前区神経マーカーを誘導する
上記の実施例１−７は、胚のエクスプラント中のII型アクチビンレセプターを
通る発信を妨害することが、前区神経マーカーの誘導を生じることを実証する。
ホリスタチンは異なるメカニズムでアクチビンの発信を妨害するので、どの種類
の神経組織が動物キャップエクスプラント中にXFS-319発現で誘導されるのかを
追求することは重要である。このために、実施例１３に記載した実験と同じ実験
を行い、そしてＲＴ−ＰＣＲを一連の前後方向の神経マーカーを評価するために
使用した。短縮化アクチビンレセプターの場合のように、前区神経マーカーであ
るオプシン（これは前脳から派生する網膜の光受容体を分ける）、En-2(これは
中脳-菱脳接合部のマーカー)、およびタナビン（これは原理的には菱脳、三叉神
経節、ならびに目、前脳および脊髄の２−３の細胞のマーカー）は、すべてホリ
スタチンにより誘導された。興味深いことには、Krox-20（別の菱脳マーカー）
およびXlhbox-6(脊髄マーカー)は、これらのキャ
ップ中には検出されない。これらの結果を表３に要約する。
表３について：すべての場合でマーカーは、姉妹細胞対照が尾芽期に到達した
時に評価された。N-CAMおよびβ-チューブリン アイソタイプIIは一般的な神経
マーカーであり、両方が発現する。前後方向のマーカーにはオプシン（これは目
の光受容体のマーカー）、En-2(これは後区中脳および前区菱脳を分ける)、Krox -20
（菱脳の神経小片３および５を分ける）およびタナビン(これは前脳および網
膜の２−３の細胞のマー
カーであるが、ほとんどが菱脳の神経小片２、４、６および８、ならびに三叉神
経節のマーカー) を含む。Xlhbox-6は脊髄のマーカーである。XAG1はセメント腺
マーカーである。この表に与えたデータは、ノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣ
Ｒにより得た結果を組み合わせたものである。
これらの結果から、前脳および中脳のような前区神経組織は、XFS-319を発現
する動物キャップ中に存在すると結論する。しかし菱脳の存在は、この種類のア
ッセイではよく確証されない。Krox-20発現の不在は、菱脳の神経小片３および
５がこれらのエクスプラント中に存在しないことを示唆している。タナビン発現
は偶数の菱脳の神経小片の存在として、あるいは単に中脳または前脳の存在の確
証のいずれかと解釈できる。Xlhbox-6信号が無いことは、脊髄のような後区神経
組織が不在であることを示唆している。N-CAMおよび筋肉アクチンの染色パター
ンで、この神経化が直接的であることを確認した。
実施例１６
ノギンではなくアクチビンがホリスタチン発現を誘導する
タンパク質ノギンは動物キャップエクスプラント中に神経組織を誘導すること
が既に実証されている(Lambら、(1993) Science 262:713-718)。しかしノギンに
よる神経誘導は直接的であるが、対照的にアクチビンは明らかに直接的な神経誘
導物質ではなく、そしてアクチビンで処理したエクスプラント中の神経組織は、
中胚葉による二次的な誘導から生じるらしい。アクチビンが動物キャップエクス
プラント中にノギンの発現を誘導できることがすでに示され(ThomsenおよびMelt
on、(1993) Cell 74:433-441)、そしてそれを確認した（実施例１３を参照にさ
れたい）。したがってアクチビンの間接的な神経誘導活性はノギンにより媒介さ
れ
るということが論点であった。ホリスタチンは直接的な神経誘導活性をエクスプ
ラント中で示す；しかし、実施例１３はこの神経誘導がノギンにより媒介されな
いことを実証している。さらにノギン、ホリスタチンおよびアクチビンの神経誘
導活性間の関連の可能性を調査するために、次のことを試験することにした：第
一にノギンの神経誘導活性がホリスタチン発現から生じるものかどうか、そして
第二にアクチビンに反応するエクスプラントおよび胚中の神経誘導が、ホリスタ
チンの発現と相関しているかどうか。
２−細胞期の胚に、1ngのノギン ＲＮＡを動物極に注入した。胞胚期（８期）
で、これらの胚の動物極を、対照注入物および非注入胚と一緒に外植した。外植
の半分を、誘導が始まる中期−原腸段階まで発生させ（10.5;期）、そして次に
ＲＴ−ＰＣＲによりホリスタチン発現をアッセイした。他の半分はノギンの機能
について陽性対照を提供するために初期尾芽期まで発生させた。この実験条件下
で、動物キャップエクスプラント中のノギン発現は、ホリスタチンを誘導すると
観察されなかった。したがって動物キャップエクスプラント中のノギンの神経誘
導活性は、少なくとも転写レベルでホリスタチンにより媒介されない。これらの
実験においてノギンは、明らかにエクスプラント中で神経マーカーN-CAMを直接
誘導することにおいて活性であった。
動物キャップエクスプラント中へのアクチビンの添加がホリスタチンの発現を
誘導するのかどうかを決定するために、８期で分けた非注入動物キャップを、緩
衝液単独またはアクチビンの存在中でインキューべーションした。アクチビンを
動物キャップに添加することで、XFS-319 RNA発現を誘導することが判明した。
これらのエクスプラント中でアクチ
ビンはノギン発現を誘導することもできるので、アクチビンの神経誘導活性はノ
ギンまたはホリスタチン、あるいはその両方を介して媒介されうると結論する。
実施例１７
アクチビンにより誘導された第二軸中のホリスタチン発現
胚の腹側に注入した時、アクチビンＲＮＡは脊髄および菱脳を含む部分的な第
二軸(secondary axes)を誘導することもできるが、より前区構造は誘導できない
(Thomsenら、(1990) Cell 63:485-493)。線形トレーサー実験で、アクチビンＲ
ＮＡを受容した細胞は、誘導された異所性の神経組織中にはない。したがって、
ホリスタチンが異所性の神経軸の誘導に関与できるのかどうかを直ぐに追求した
。アフリカツメガエル アクチビンβb ＲＮＡまたは対照ＲＮＡを、８−から
１６−細胞期の胚の１つの胞胚の腹側に注入した。対照ＲＮＡではなくアフリカ
ツメガエル アクチビンβb転写物を注入した胚は、部分的な第二の背軸をすで
に報告されているように表した。これらの胚を神経段階（２１期）でホリスタチ
ンＲＮＡの発現および分布に関して、全載in situハイブリダイゼーションによ
り分析した。ホリスタチンＲＮＡが対照の1つの脊索中に存在する一方、二重軸
を持つほとんどの胚が第一および第二軸にホリスタチンの存在を表す（ｎ＝２５
のうちの１８）。したがって、第二軸中のホリスタチンの存在は、第二神経軸の
誘導が原因であるかもしれない。この実験は、アクチビンが胚のエクスプラント
および全胚の内容中の両方の中で、ホリスタチン発現を誘導できることを実証し
ている。したがって、アクチビンの神経誘導活性はノギンまたはホリスタチン、
あるいはその両方のいずれかにより媒介されることができる。
実施例１８
野生型胚中へのホリスタチンの異所的注入
神経誘導刺激物質に反応する外胚葉細胞の能力と神経板の大きさとの間には直
接的な相関がある。外胚葉の能力に対するホリスタチンの効果をアッセイするた
めに、ホリスタチンＲＮＡを２細胞期の胚の１つ、または両方のいずれかの動物
極に注入することができる。例えば、実験の胚に様々な濃度のmyc-標識ホリスタ
チンおよび1種類の濃度のβ-Ｇａｌを同時に注入することができる。対照胚にβ
-Ｇａｌのみを注入する。この胚を神経板が未だに開放している中期神経段階に
到達するまで発生させ、そして次にβ-ＧａｌおよびNCAMについて同時に全載と
して染色する。胚の動物極は、ほとんど表皮および神経誘導物質に貢献するので
、対照胚は神経外胚葉および表皮の両方で、β-Ｇａｌ染色により通常の大きさ
の神経板を表すと期待される。実験の胚についての結果には幾つかの可能性があ
る。１つのシナリオでは、β-Ｇａｌの分布にかかわらず、神経板の大きさに変
化は見られず、ホリスタチンが動物キャップの能力をモディファイしなかったこ
とを示すだろう。もう１つのシナリオでは、胚は未だに拡大した神経板および異
所性の組織を有し、ほとんどのβ-Ｇａｌおよびｍｙｃ陽性細胞が拡大した神経
組織中にある。この後者の結果は、ホリスタチンが神経誘導について外胚葉細胞
の能力を変化させることができ、そして表皮性の成長の細胞を神経性の成長に導
いたことを示す。
腹側の神経構造を誘導するためのホリスタチンの能力も、全胚の内容中で同様
な様式にて試験することができる。このために、ホリスタチンおよびβ-Ｇａｌ
ＲＮＡまたはβ-Ｇａｌ ＲＮＡのみを、８細胞期の胚
の腹側に注入する。対照および実験の胚を、姉妹細胞対照が尾芽期に到達したと
きに回収し、そして形態学、組織学、および全載染色により検査する。NCAMに関
する染色も、任意の異所性神経組織を検出するために使用できる。第二の神経軸
または神経組織の形成は、明らかにホリスタチンがインビボで神経化できること
を示している。β-Ｇａｌ染色はここでも、ホリスタチンタンパク質を生成する
細胞の成長に関して有益である。スペマンをもとの実験では、第二軸中のほとん
どの神経組織が宿主胚の腹側から派生し、そして形成体からは生じなかった。も
し、β-Ｇａｌ発現細胞が誘導された異所性神経軸中に参加していなければ、実
験はホリスタチンの神経誘導能力は形成体の神経誘導物質に平行することを実証
した。もし異所性神経組織が生成しなければ形成体からの他の因子も異所性の神
経誘導に必要であると結論するかもしれない。最後に、もし第二神経軸中のすべ
ての細胞がβ-Ｇａｌを有すれば、ホリスタチンは神経化できるが、この神経化
は胚により使用される経路と同じではないという結論と一致するだろう。
実施例１９
ＵＶ胚へのホリスタチンの注入
インビボのホリスタチンの神経化活性のより緊密なアッセイは、完全に背側構
造を欠く胚中に神経軸を誘導するこの因子の能力を試験することである。最初の
細胞−周期中にアフリカツメガエルの胚をＵＶ照射すると、背軸を欠く胚が導か
れる。これらの胚は以前は、軸中胚葉の誘導およびパターン化に関与する因子を
単離するためのアッセイ系に使用された (Smithら、(1992) Cell 70:829-840)。
さらに、形成体活性を持つほとんどの成長因子は、これらの腹側化した胚中に完
全な、または部分
的な背軸を援助することができる。他の神経化活性に関するアッセイの１つの態
様では、β-Ｇａｌおよび様々な濃度のホリスタチンＲＮＡを、ＵＶ照射した胚
の１つの胞胚に同時注入する。この胚を初期の尾芽期まで発生させ、この時点で
それらを組織学により検査し、そしてβ-ＧａｌおよびNCAMタンパク質について
全載染色する。対照胚はβ-Ｇａｌ単独注入および非注入胚を含んで成ることが
できる。２つの後者の対照は、ＵＶ腹側化の性質を評価できる。所定濃度のホリ
スタチンで異所性の神経組織が誘導される、またはされないだろう。もし誘導す
れば、誘導した神経軸に集まるβ-Ｇａｌ陽性細胞のレベルを測定できる。神経
組織の周辺にある中胚葉の特徴は、それが腹側性を維持しているか、あるいはす
でに背側化されたかどうかを見るために評価できる。もし中胚葉が未だに腹側の
特性ならば、ホリスタチンが腹側外胚葉細胞を異所性の神経組織の形成について
再使用したと結論できるかもしれない。もし中胚葉が背側化したら（すなわち、
筋肉アクチンのような背側マーカーまたは脊索が存在するならば）、中胚葉また
は神経組織が最初に誘導されたかどうかを決定する必要があるだろう。
すべての上記に引用した文献および報告は、引用により本明細書に編入される
。
均等物
当業者は、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載した特別な方法お
よび試薬の多くの均等物を認識、または確信することができるだろう。そのよう
な均等物は本発明の範囲内にあり、そして以下の請求の範囲に網羅されると考え
る。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＡ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＡＭ
Ｇ０１Ｎ 33/50 9051−4Ｃ 37/04 ＡＡＢ
33/53 9051−4Ｃ 37/02