ES2914308T3

ES2914308T3 - Uromodulina para su uso en la prevención y terapia de calcificación vascular o inflamación vascular

Info

Publication number: ES2914308T3
Application number: ES18706531T
Authority: ES
Inventors: Jakob Völkl; Ioana Alesutan; Jürgen Scherberich
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2022-06-09
Anticipated expiration: 2038-02-27
Also published as: US11161887B2; EP3589306A1; EP3589306B1; US20200010520A1; WO2018158267A1

Abstract

Un polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular o una enfermedad provocada por la calcificación vascular.

Description

DESCRIPCIÓN

Uromodulina para su uso en la prevención y terapia de calcificación vascular o inflamación vascular

La presente invención se refiere al uso de uromodulina y derivados polipeptídicos relacionados para tratar o prevenir afecciones relacionadas con la cristalización patológica de fosfato de calcio.

Descripción

La calcificación vascular predice mortalidad cardiovascular. La presencia de calcificación vascular se asocia con un riesgo 3-4 veces mayor de eventos cardiovasculares y mortalidad y se ha sugerido como un culpable subyacente que provoca la alta mortalidad cardiovascular en el mundo occidental. En la población general, la calcificación de la aorta abdominal se asocia con eventos cardiovasculares y muerte. Las calcificaciones más extensas se observan en pacientes con enfermedad renal crónica, y se ha sugerido que estas calcificaciones provocan la mortalidad cardiovascular extrema en estos pacientes. La calcificación en pacientes con insuficiencia renal es fuertemente promovida por el fosfato, que ha sido reconocido como una toxina vascular también en pacientes sin insuficiencia renal manifiesta.

La calcificación vascular ha sido reconocida como un proceso activo gobernado por las células del músculo liso vascular, que se desdiferencian y muestran un fenotipo de células similares a los osteoblastos bajo estrés patológico. El fenotipo osteoblástico se caracteriza por la expresión de factores de transcripción osteo/condroblásticos, como CBFA1/RUNX2, MSX2 y fosfatasa alcalina (ALPL). Estas células osteoblásticas transformadas promueven activamente la calcificación de los tejidos blandos, predominantemente en las arterias. La reprogramación es fomentada por citoquinas inflamatorias y está asociada a una inflamación generalizada. No hay ningún agente terapéutico disponible clínicamente para impedir la progresión de la calcificación vascular. Hamirani et al. (Atherosclerosis, vol. 201, no. 1, 1 de noviembre de 2008 (2008-11-01), páginas 1-7) analiza ciertas opciones de tratamiento para la calcificación vascular. Oberoi etal. (PLOS ONE, vol. 11, N° 7, julio de 2016, XP055470136) demuestra un efecto del anticuerpo anti-TNF-a adalimumab sobre la activación endotelial y la adhesión de monocitos en la inflamación vascular.

Hasta el momento, no hay un tratamiento disponible para los practicantes clínicos para prevenir de manera eficaz la aparición de calcificaciones vasculares o dificultar su progresión.

La uromodulina (Uniprot Identificador P07911, SEQ ID NO 001), también denominada glicoproteína de Tamm-Horsfall (THP), es una proteína producida principalmente en el riñón y secretada en la orina. Como una de las proteínas más abundantes en la orina, desempeña varias funciones, incluyendo la regulación del equilibrio de sal. Investigaciones recientes demostraron que la uromodulina también se secreta en la sangre y llega a la circulación sistémica con niveles en plasma medios de uromodulina de aproximadamente 200 ng/ml en sujetos sanos. Jian et al. (International Journal of Clinical and Experimental Pathology, vol. 8, N°. 9, 2015, páginas 11356-11363) investiga la uromodulina en la hipertensión.

Lo que es más importante, durante la insuficiencia renal, los niveles de uromodulina disminuyen con la progresión de la enfermedad y se ha sugerido como un marcador de la función renal restante. Sin embargo, no ha habido información disponible sobre ningún efecto funcional de la uromodulina en la circulación sistémica, antes de la presente memoria descriptiva.

Basándose en las propiedades de la uromodulina, los inventores investigaron un papel funcional para la uromodulina, lo que puede explicar su presencia en la circulación sistémica. Hemos descubierto que la uromodulina es un inhibidor potente de la calcificación vascular.

En base al estado de la técnica mencionado anteriormente, el objetivo de la presente invención es proporcionar medios para la prevención y el tratamiento de la calcificación vascular y sus síntomas y consecuencias clínicas asociados. Este objetivo se logra mediante las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva.

Términos y definiciones

El término uromodulina en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la proteína de la SEQ ID NO 001:

SEQ ID NO 001: isoforma 1 de uromodulina humana

MGQPSLTWMLMWVASWFITTAATDTSEARWCSECHSNATCTEDEAVTTCTCQEGFTGDG

LTCVDLDECAIPGAHNCSANSSCVNTPGSFSCVCPEGFRLSPGLGCTDVDECAEPGLSHC

HALATCVNVVGSYLCVCPAGYRGDGWHCECSPGSCGPGLDCVPEGDALVCADPCQAHRTL

DEYWRSTEYGEGYACDTDLRGWYRFVGQGGARMAETCVPVLRCNTAAPMWLNGTHPSSDE

GIVSRKACAHWSGHCCLWDASVQVKACAGGYYVYNLTAPPECHLAYCTDPSSVEGTCEEC

SIDEDCKSNNGRWHCQCKQDFNITDISLLEHRLECGANDMKVSLGKCQLKSLGFDKVFMY

LSDSRCSGFNDRDNRDWVSVVTPARDGPCGTVLTRNETHATYSNTLYLADEIIIRDLNIK

INFACSYPLDMKVSLKTALQPMVSALNIRVGGTGMFTVRMALFQTPSYTQPYQGSSVTLS

TEAFLYVGTMLDGGDLSRFALLMTNCYATPSSNATDPLKYFIIQDRCPHTRDSTIQVVEN

GESSQGRFSVQMFRFAGNYDLVYLHCEVYLCDTMNEKCKPTCSGTRFRSGSVIDQSRVLN

LGPITRKGVQATVSRAFSSLGLLKVWLPLLLSATLTLTFQ

El término actividad biológica del polipéptido de uromodulina de la SEQ ID NO 001 en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a la actividad medida en el ensayo que se muestra en la Fig. 1.

Las secuencias de aminoácidos se dan desde el extremo terminal amino al carboxilo. Las letras mayúsculas para las posiciones de la secuencia se refieren a L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Bioquímica, 3a ed. pág. 21).

En el contexto de la presente memoria descriptiva, los términos identidad de secuencia y porcentaje de identidad de secuencia se refieren a los valores determinados comparando dos secuencias alineadas. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.

48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente, por ejemplo, a través del National Center for Biotechnology-Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Un ejemplo de comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que usa la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 3; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Costes del Espacio: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: ajuste de matriz de puntuación de composición condicional. Uno de tales ejemplos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN que usa la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 28; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; Puntuaciones de coincidencia/malapareamiento: 1.-2; Costes del espacio: Lineal. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido usando el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) usando los parámetros predeterminados identificados anteriormente para comparación de proteínas y ácidos nucleicos, respectivamente.

Como se usa en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo, calcificación vascular o cualquiera de sus patologías asociadas y efectos nocivos descendentes) se refiere en una realización a mejorar la enfermedad o el trastorno (por ejemplo, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o por lo menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar por lo menos un parámetro físico, incluyendo aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos. Los métodos para evaluar el tratamiento y/o la prevención de la enfermedad son conocidos generalmente en la técnica, a menos que se describa específicamente en la presente a continuación.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular o una enfermedad provocada por la calcificación vascular, particularmente la calcificación vascular en la enfermedad renal crónica, en la diabetes, en el envejecimiento y en la aterosclerosis.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular comprende o consiste esencialmente de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular

a. comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos caracterizada por más del (>) 85% de identidad, particularmente >90% de identidad, incluso más particularmente >92%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, o >99% de identidad con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001, y

b. se caracteriza por al menos un 85% de actividad biológica del polipéptido de uromodulina de la SEQ ID NO 001.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular es un péptido recombinante.

En ciertas realizaciones, el polipéptido de uromodulina se proporciona para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular, en donde la enfermedad se caracteriza por un nivel de uromodulina periférica por debajo de 180 ng/ml, particularmente un nivel de uromodulina periférica por debajo de 160 ng/ml, incluso más particularmente un nivel de uromodulina periférica por debajo de 125 ng/ml, particularmente por debajo de 110 ng/ml, aún más particularmente por debajo de 100 ng/ml, 80 ng/ml o 60 ng/ml.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular, en particular en donde la inflamación vascular está asociada con la calcificación vascular.

En ciertas realizaciones de este aspecto de la invención, el péptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular comprende o consiste esencialmente de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001.

En ciertas realizaciones de este aspecto de la invención, el péptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular

La descripción también divulga una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de uromodulina como se ha especificado anteriormente, para uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular.

Las condiciones relacionadas con la cristalización patológica de fosfato de calcio para las que los polipéptidos de la presente invención son particularmente útiles incluyen la calcificación vascular, particularmente la calcificación vascular en la enfermedad renal crónica, en la diabetes, en el envejecimiento y en la aterosclerosis. Los polipéptidos de la presente invención son además particularmente útiles para mitigar enfermedades asociadas con la calcificación como disfunción e hipertrofia cardíaca, insuficiencia cardíaca, derrame cerebral e insuficiencia renal, hipertensión, fibrosis de órganos, enfermedad arterial periférica y calcifilaxis.

El polipéptido de uromodulina para su uso como se especifica en la presente puede modificarse para mejorar su estabilidad, evitar la agregación o, de otro modo, hacer que el polipéptido esté más disponible farmacéuticamente para el paciente. Las modificaciones incluyen la encapsulación de micropartículas, por ejemplo, en microesferas o nanoesferas biodegradables. El polipéptido puede modificarse adicional o alternativamente con fracciones de polietilenglicol (PEG) ("pegilado"), o puede ser parte de una proteína de fusión que comprende una cadena polipeptídica conocida por impartir estabilidad a la proteína terapéutica en el torrente sanguíneo, como la cadena Fc del anticuerpo IgG.

De manera similar, se divulga una forma de dosificación para la prevención o el tratamiento de la calcificación vascular, que comprende un polipéptido de uromodulina de acuerdo con uno de los aspectos anteriores de la invención. Las formas de dosificación pueden ser para administración parenteral como formas de inyección subcutánea, intravenosa, intrahepática o intramuscular. Opcionalmente, puede estar presente un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a un sistema de expresión de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por más del (>) 85% de identidad, particularmente >90% de identidad, incluso más particularmente >92%, >94%, >95%, >96, >97%, >98% o >99% de identidad con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001, en donde dicho polipéptido se caracteriza por al menos un 85% de identidad biológica actividad del polipéptido de uromodulina de la SEQ ID NO 001, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o inflamación vascular.

En ciertas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos está bajo el control de un promotor operable en una célula humana, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o inflamación vascular. En ciertas realizaciones, dicho promotor es operativo en una célula epitelial vascular. En ciertas realizaciones, el promotor es constitutivamente activo. En ciertas otras realizaciones, el promotor es inducible, por ejemplo, por un producto farmacéutico de molécula pequeña.

En ciertas realizaciones, el sistema de ácidos nucleicos es un virus, particularmente un virus seleccionado de adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o inflamación vascular.

Siempre que se presenten alternativas para características individuales separables en la presente como "realizaciones", debe entenderse que tales alternativas pueden combinarse libremente para formar realizaciones discretas de la invención divulgada en la presente.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y figuras, a partir de los cuales pueden extraerse otras realizaciones y ventajas adicionales. Se pretende que estos ejemplos pretenden ilustren la invención pero no que limiten su alcance.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 A. Imágenes originales representativas que muestran la tinción con rojo de alizarina en HAoSMC después del tratamiento durante 11 días con control o con medio de calcificación (Calc, p-glicerofosfato 10 mM CaCl2 1,5 mM) sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). Las imágenes son representativas de seis experimentos independientes. Las áreas calcificadas se muestran como tinción roja. B. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4, |jg/mg de proteína) del contenido de calcio en HAoSMC después del tratamiento durante 11 días con control o con medio de calcificación (Calc, p-glicerofosfato 10 mM CaCI21,5 mM) sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). C. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4, U/mg de proteína) de actividad de fosfatasa alcalina en HAoSMC después del tratamiento durante 7 días con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). D,E. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=8; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de CBFA1 (D) y ALPL (E) en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa (URO, 0-100 ng/ml) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA).*(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativas frente a HAoSMC tratadas con control; f(p<0,05), ttt(p<0,001) estadísticamente significativa frente a HAoSMC tratadas con Calc./Pi solo.

Fig. 2 A,B. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=8; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de CBFAl (A) y ALPL (B) en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) y con anticuerpo monoclonal de ratón contra la uromodulina humana (mAb) o IgG de ratón de control negativo (IgG). *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativa frente a HAoSMC tratadas con IgG; t(p<0,05), ttt(p<0,001) estadísticamente significativa frente a HAoSMC tratadas con IgG y Pi; §§(p<0,01), §§§(p<0,001) estadísticamente significativo entre HAoSMC tratadas con Pi+URO+IgG y Pi+URO+mAb. C,D. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4; a.u.) de la expresión relativa de ARNm de CBFA1 (C) y ALPL (D) en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana recombinante (rhURO). **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con control; tt(p<0,01) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con Pi solo.

Fig. 3A,B. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=6; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de CBFA1 (A) y ALPL (B) en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con suero normal (NS) al 15% o suero urémico (US) sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO). *(p<0,05), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con NS; t(p<0,05), ttt(p<0,001) estadísticamente significativo frente a las HAoSMC tratadas con suero respectivas.

Fig. 4 A. Transferencias Western originales representativas (n=4) de la expresión de la proteína uromodulina, IL-1 p y TNFaa en suero total (entrada) y en muestras inmunoprecipitadas de IgG de control negativo o uromodulina de suero humano recogidas de pacientes en hemodiálisis antes de la diálisis (ERC) y de voluntarios sanos (CTR). B,C. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (unidades arbitrarias, a.u.) de la actividad transcripcional dependiente de NF-kB medida por el ensayo informador de luciferasa en HAoSMC después de la transfección durante 48 horas con constructos de luciferasa/Renilla sensibles a NF-kB y tratamiento durante 30 min con 10 ng/ml de IL-1 p (B, n=6) o con 10 ng/ml de TNFa (C, n=8) y sin o con tratamiento adicional con las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa (URO, 0-100 ng/ml) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). *(p<0,05), **(p<0,01) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con control; t(p<0.05) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con IL-1 p/TNFa solo. D. Diagramas de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4; a.u.) de la actividad transcripcional dependiente de NF-kB medida por el ensayo informador de luciferasa en HAoSMC después de la transfección durante 48 horas con constructos de luciferasa/Renilla sensibles a NF-kB y tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con control; tt(p<0,00) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con Pi solo. E. Imágenes de microscopía confocal representativas (n=3) que muestran la expresión y localización de la proteína NF-kB p65 en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). Expresión de NF-kB p65: marcado verde, núcleos: marcado morado. Barra de escala: 25 pm.

Fig. 5 A. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4, U/mg de proteína) de la actividad de la fosfatasa alcalina en HAoSMC después del tratamiento durante 7 días con control o con 5 pg/ml de hidroxiapatita (HAp) sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). B,C. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=6; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de CBFA1 (B) y ALPL (C) en HAoSMC después del tratamiento durante 24 horas con control o con 5 pg/ml de hidroxiapatita (HAp) sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina humana nativa (URO) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con control; t(p<0,05),ft(p<0,01),ttt(p<0,001) estadísticamente significativo frente a HAoSMC tratadas con HAp solo. D. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5; mg/dl) de los niveles de calcio en el sedimento precipitado después de la precipitación con fosfato de calcio en presencia de las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa (URO, 0-100 ng/ml) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA). E. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5; mg/dl) de los niveles de calcio en el sedimento y el sobrenadante, respectivamente, después de la disociación de las nanopartículas de hidroxiapatita en presencia de las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa (URO, 0-100 ng/ml) o 100 ng/ml de albúmina de suero (SA).

Fig. A. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa del ARNm de Umod en células MOVAS después de la transfección durante 48 horas con vector vacío (V) o con un constructo que codifica uromodulina de ratón (Uro). B. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4, pg/mg de proteína) del contenido de calcio en HAoSMC después de la transfección durante 11 días con vector vacío (V) o con un constructo que codifica uromodulina de ratón (Uro) y tratamiento con control o con medio de calcificación (Calc, p-glicerofosfato 10 mM CaCl2 1,5 mM). C. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=4, U/mg de proteína) de la actividad de la fosfatasa alcalina en HAoSMC después de la transfección durante 7 días con vector vacío (V) o con un constructo que codifica uromodulina de ratón (Uro) y tratamiento con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM. D,E. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5; a.u.) de la expresión relativa de ARNm de Cbfal (D) y Alpl (E) en células MOVAS después de la transfección durante 48 horas con vector vacío (V) o con un constructo que codifica uromodulina de ratón (Uro) y tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM. *(p<0,05), **(p<0,01), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a células MOVAS transfectadas con V; t(p<0,05), tt(p<0,01), ttt(p<0,001) estadísticamente significativo frente a células MOVAS transfectadas con V y tratadas con Calc./Pi.

Fig. 7 Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=6; unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de Cbfal (A) y Alp l(B) en células MOVAS después del tratamiento durante 24 horas con control o con p-glicerofosfato (Pi) 2 mM sin o con tratamiento adicional con 100 ng/ml de uromodulina de ratón recombinante (rmUro). *(p<0,05), ***(p<0,001) estadísticamente significativo frente a células MOVAS tratadas con control; t(p<0,05), ttt(p<0,001) estadísticamente significativo frente a células MOVAS tratadas con Calc./Pi solo.

Fig. 8 A. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5; pg/mg de proteína) del contenido de calcio en el arco aórtico de ratones tratados con AAV8-GFP como control (CTR) o con AAV8-uromodulina de ratón (Uro) y tratamiento adicional con dosis altas de colecalciferol (vD). B,C. Gráficos de puntos de dispersión y medias aritméticas ± SEM (n=5, unidades arbitrarias, a.u.) de la expresión relativa de ARNm de Cbfal (B) y Alpl (C) en tejido aórtico de ratones tratados con AAV8-GFP como control (CTR) o con AAV8-uromodulina de ratón (Uro) y tratamiento adicional con dosis altas de colecalciferol (vD). *(p<0,05), **(p<0,01) estadísticamente significativo frente a ratones tratados con CTR vD.

Fig. 9 Gráfico de puntos de dispersión de la correlación entre las concentraciones de uromodulina en suero (ng/ml) y la propensión a la calcificación en suero medido como tiempo de maduración de partículas de calciproteína (T50, min) en pacientes humanos con CKD (n=138). Los valores de P se indican en la figura.

Materiales y métodos

Cultivo celular de células primarias de músculo liso aórtico humano

Se cultivaron células primarias de músculo liso aórtico humano (HAoSMC) obtenidas comercialmente de Thermo Fisher Scientific en medio MB 752/1 de Waymouth y mezcla de nutrientes F-12 de Ham (proporción 1:1, Thermo Fisher Scientific) suplementado 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific), 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific). Las células se cultivaron hasta la confluencia y se usaron en todos los experimentos de los pases 4 a 11. En la confluencia, las HAoSMC se separaron usando una solución de tripsina/EDTA (Thermo Fisher Scientific) y se cultivaron en placas de 6 pocillos o portaobjetos de cámara de 4 pocillos (BD Biostatus) durante 24 horas antes del tratamiento. Las HAoSMC se trataron durante el tiempo indicado con p-glicerofosfato 2 mM (Sigma Aldrich), 5 pg/ml de nanopartículas de hidroxiapatita (Sigma-Aldrich), 0-100 ng/ml de uromodulina humana nativa (BBI solutions), 100 ng/ml de uromodulina humana recombinante (Origene), 100 ng/ml de albúmina de suero bovino (Sigma Aldrich), dilución 1:5000 de anticuerpo monoclonal de ratón antiuromodulina humana (Euroimmun) o IgG de ratón como control (Santa Cruz Biotechnology), 10 ng/ml de TNFa humana (stock en PBS, R&D Systems) y 10 ng/ml de IL-1 p humana (stock en PBS/BSA al 0,1%, R&D Systems). Se usaron cantidades iguales de vehículo como control. Las HAoSMC se privaron de suero durante 24 horas antes del tratamiento durante 24 horas con suero urémico al 15% de pacientes en hemodiálisis (suero urémico, US) o suero de control de individuos sanos emparejados (suero normal, NS). El tratamiento durante 11 días con p-glicerofosfato 10 mM y CaCl21,5 mM (Sigma-Aldrich) se usó como medio de calcificación para la cuantificación de los depósitos de calcio y para la tinción con rojo de alizarina. Se añadieron medios nuevos con agentes cada 2-3 días.

Cultivo celular de células MOVAS

Las células MOVAS, una línea de células de músculo liso aórtico de ratón, obtenidas comercialmente de la ATCC, se cultivaron en medio DMEM con alto contenido de glucosa (Thermo Fisher Scientific) suplementado con 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific) y 0,2 mg/ml de G-418 (Thermo Fisher Scientific). En la confluencia, las células MOVAS se separaron usando una solución de tripsina/EDTA (Thermo Fisher Scientific) y se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 horas antes del tratamiento. Las células MOVAS se transfectaron con 2 pg de ADN que codifica uromodulina de ratón en el vector pCMV6Kan/Neo (Origene) o vector vacío como control (Origene) usando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La eficacia de la transfección se determinó mediante RT-PCR cuantitativa. Las células MOVAS se trataron durante el tiempo indicado con p-glicerofosfato 2 mM (Sigma Aldrich), 100 ng/ml de uromodulina de ratón recombinante (Creative BioMart) o 100 ng/ml de albúmina de suero bovino (Sigma Aldrich). Se usaron tratamientos durante 11 días con p-glicerofosfato 10 mM y Cal2 1,5 mM (Sigma-Aldrich) como medio de calcificación para la cuantificación de los depósitos de calcio. Se añadieron medios nuevos con agentes cada 2-3 días.

Experimentos con animales

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, así como la ley alemana para el bienestar de los animales y fueron aprobados por las autoridades locales. La generación de vectores pseudotipados de AAV8 que contenían uromodulina de ratón o un control de GFP se realizó usando procedimientos estándar. Los AAV (1012vg/ratón) se inyectaron por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Posteriormente, se inyectó a los ratones vehículo o 400000 UI/kg de peso corporal de colecalciferol (Sigma-Aldrich) por vía subcutánea durante tres días. Después de seis días, se recogió sangre mediante punción retroorbitaria. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical bajo anestesia con isoflurano por inhalación y los tejidos aórticos se recogieron rápidamente y se congelaron al instante. Las concentraciones en plasma de fosfato y calcio se midieron con el kit de ensayo QuantiChrom Phosphate y el kit de ensayo QuantiChrom Calcium, respectivamente (BioAssay Systems).

Análisis de calcificación

La cuantificación de la calcificación del arco aórtico se realizó mediante la incubación de los tejidos durante la noche a 37° C en HCl 0,6 M. Las células se descalcificaron durante 24 horas a 4° C en HCl 0,6 M. El contenido de calcio se determinó uszando el kit de ensayo QuantiChrom Calcium (BioAssay Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los tejidos o las células se lisaron con NaOH 0,1 M/SDS al 0,1% y la concentración de proteína total se midió mediante el ensayo Bradford (Bio-Rad Laboratories). El contenido de calcio se normalizó a la concentración de proteína total. Para visualizar los depósitos de calcio, las HAoSMC se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con rojo de alizarina al 2% (pH 4,5). Las áreas calcificadas se muestran como tinción roja.

Ensayo de actividad de fosfatasa alcalina (ALPL)

La actividad de ALPL en el extracto de células completas se determinó usando el kit de ensayo colorimétrico ALPL (Abcam) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La actividad de ALPL se normalizó a la concentración de proteína total medida por el ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories).

Ensayo de luciferasa

Las HAoSMC se transfectaron durante 48 horas con 1 pg de mezcla de ADN de una constructo de luciferasa sensible a NF-kB y un constructo de Renilla de expresión constitutiva (proporción 40:1, Qiagen) como control para la eficiencia de la transfección usando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del período de incubación, las HAoSMC se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega) y se analizó la actividad transcripcional usando el ensayo indformador de luciferasa dual (Promega) y un luminómetro (lector de placas Victor 2, Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados se expresan como la proporción de NF-kB de luciferasa de luciérnaga a luciferasa de Renilla (unidades relativas de luz) normalizadas para controlar las HAoSMC tratadas.

RT-PCR cuantitativa

El ARN total se aisló de tejidos aórticos murinos, células HAoSMC o MOVAS usando reactivo Trifast (Peqlab) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa de 2 pg de ARN se realizó usando cebadores oligo(dT)12-18 (Thermo Fisher Scientific) y transcriptasa inversa Superscript III (Thermo Fisher Scientific). La RT-PCR cuantitativa se realizó con el sistema de detección de PCR en tiempo real iCycler iQ™ (Bio-Rad Laboratories) y iQ™ Sybr Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron los siguientes cebadores humanos (Thermo Fisher Scientific, orientación 5’^-3 ’):

ALPL directo: GGGACTGGTACTCAGACAACG (SEQ ID NO 002);

ALPL inverso: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC (SEQ ID NO 003);

CBFA1 directo: GCCTTCCACTCTCAGTAAGAAGA (SEQ ID NO 004);

CBFA1 inverso: GCCTGGGGTCTGAAAAAGGG (SEQ ID NO 005);

GAPDHdirecto: GAGTCAACGGATTTGGTCGT (SEQ ID NO 006);

GAPDH inverso: GACAAGCTTCCCGTTCTCAG (SEQ ID NO 007).

Se usaron los siguientes cebadores de ratón (Thermo Fisher Scientific, orientación 5'^3'):

Alpldirecto: TTGTGCCAGAGAAAGAGAGAGA (SEQ ID NO 008);

Alplinverso: GTTTCAGGGCATTTTTCAAGGT (SEQ ID NO 009);

Cbfa1 directo: AGAGTCAGATTACAGATCCCAGG (SEQ ID NO 010);

Cbfa1 inverso: AGGAGGGGTAAGACTGGTCATA (SEQ ID NO 011);

Gapdh directo: AGGTCGGTGTGAACGGATTTG (SEQ ID NO 012);

Gapdh inverso: TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA (SEQ ID NO 013);

Umoddirecto: GGCACCCATGTGGCTCAAT (SEQ ID NO 014);

Umod inverso: GGGCGCTGTCAAGTTGTAAAT (SEQ ID NO 015).

La especificidad de los productos de la PCR se confirmó mediante el análisis de las curvas de fusión. Todas las PCR se realizaron por duplicado y las veces de cambio de ARNm relativas se calcularon mediante el método de 2-ññCt usando GAPDH como referencia interna. Para experimentos con animales, se calcularon las veces de cambio relativas del ARNm para un ratón de control que recibió solo vehículo.

Inmunotinción y microscopía confocal

Las HAoSMC cultivados en portaobjetos de cámara de cuatro pocillos (BD Biostatus) se fijaron con metanol al 100% enfriado con hielo durante 10 min a temperatura ambiente. Para reducir la tinción de fondo no específica, los portaobjetos se incubaron con suero de cabra normal al 5% en PBS/Triton-X100 al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se incubaron durante la noche a 4° C con anticuerpo primario policlonal de conejo anti-NF-kB p65 (diluido 1:50, Santa Cruz Biotechnology) y luego con anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con Alexa488 (diluido 1:1000, Thermo Fisher Scientific) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron usando colorante DRAQ5 (diluido 1:1000, Biostatus) durante 10 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montaron con reactivo antidecoloración Prolong Gold (Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se recopilaron con un sistema de imagen confocal (A1Rsi+, Nikon Instruments) usando un objetivo de 60x (Oil), 1,4NA. Las imágenes confocales son representativas de tres experimentos independientes. Los controles negativos se llevaron a cabo simultáneamente con todos los experimentos omitiendo la incubación con el anticuerpo primario.

Análisis de inmunoprecipitación y transferencia Western

La inmunoprecipitación de uromodulina a partir de suero humano se realizó usando el kit Pierce Direct IP (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El acoplamiento de 6 pl de anticuerpo monoclonal de ratón anti-uromodulina humana (Euroimmun) o IgG de ratón como control (Santa Cruz Biotechnology) a la resina de acoplamiento AminoLink Plus (Thermo Fisher Scientific) se realizó durante 2 horas a TAe. Se incubó suero humano (2 mg de proteínas) de pacientes en hemodiálisis antes de la diálisis (CKD) y de voluntarios sanos (CTR) con el control/anticuerpo inmovilizado para formar el complejo inmunitario durante la noche a 4° C en un rotador. Luego, los inmunocomplejos se lavaron para eliminar las proteínas no unidas y se usó un tampón de elución de pH bajo para disociar el antígeno unido del anticuerpo. Las proteínas eluidas o cantidades iguales de proteínas totales de suero humano se hirvieron en tampón Roti-Load1 (Carl Roth GmbH) calentando durante 5 minutos a 100° C. Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron durante la noche a 4° C con anticuerpos primarios: anticuerpo de ratón anti-uromodulina humana (diluido 1:1000, Euroimmun), anticuerpo de ratón anti-1 L-1 p (diluido 1:1000, Cell Signaling) o anticuerpo de conejo anti-TNFa (diluido 1:1000, Cell Signaling) y luego con anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón (diluido 1:2000, Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpo conjugado con HRP anti-conejo (diluido 1:1000, Cell Signaling) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se decaparon en tampón de decapado (Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente durante 10 min. La unión de anticuerpo se detectó con reactivo de detección ECL (Thermo Fisher Scientific).

Ensayo de precipitación de fosfato de calcio

El ensayo de formación de la fase mineral de fosfato de calcio se realizó usando un sistema homogéneo que contenía CaCl²10 mM (Sigma-Aldrich) y tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4, Sigma Aldrich) en tampón HEPES 500 mM (pH 7,4, Sigma Aldrich) en presencia de las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa. Después de una incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 1890 g durante 30 segundos y el sedimento obtenido se disolvió en HCl 150 mM. Los niveles de calcio se determinaron colorimétricamente usando el kit de ensayo QuantiChrom Calcium (BioAssay Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Ensayo de disociación de hidroxiapatita

El ensayo de disociación de hidroxiapatita se realizó usando un sistema homogéneo que contenía nanopartículas de hidroxiapatita 2 mM (tamaño de partícula <200 nm, Sigma Aldrich) en tampón HEpES 500 mM (pH 7,4, Sigma Aldrich) en presencia de las concentraciones indicadas de uromodulina humana nativa. Después de una incubación durante la noche a 37° C en un agitador (100 rpm), las muestras se centrifugaron a 1890 g durante 30 segundos y el sedimento obtenido se disolvió en HCl 150 mM. Los niveles de calcio en el sobrenadante y el sedimento, respectivamente, se determinaron colorimétricamente usando el kit de ensayo QuantiChrom Calcium (BioAssay Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Muestras humanas

Todos los pacientes y voluntarios dieron su consentimiento informado. Se recogió sangre de pacientes de varias etapas de CKD para obtener suero. Voluntarios sanos sirvieron como controles. Los niveles de uromodulina se midieron por ELISA (Euroimmun). La propensión a la calcificación sérica se analizó determinando el tiempo de transición máximo medio (T⁵⁰) de la transformación in vitro de partículas de calciproteína primaria a secundaria usando un nefelómetro Nephelostar Plus (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Cuando se indicó, se añadió uromodulina a las muestras de suero.

Estadísticas

Los datos se muestran como diagramas de puntos de dispersión y media aritmética ± SEM. La normalidad se probó con la prueba de Shapiro-Wilk. Los conjuntos de datos no normales se transformaron (log, recíproco o cuadrado) antes de la prueba estadística para proporcionar normalidad de acuerdo con la prueba de Shapiro-Wilk. La prueba estadística se realizó mediante Anova unidireccional seguido de la prueba de Tukey para datos homoscedásticos o la prueba de Games-Howell para datos heteroscedásticos. Los datos no normales se probaron mediante el método de Steel-Dwass. Para los experimentos de tratamiento con TNFa e IL-1 p se usó la prueba de Steel y la prueba de Dunett, de acuerdo con distribución de normalidad. Se compararon dos grupos mediante la prueba t de dos colas para datos no emparejados. Para el análisis de correlación, se realizó la prueba de correlación de Spearman. P<0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: la suplementación con uromodulina es capaz de eliminar la calcificación vascular.

La suplementación con uromodulina es capaz de prevenir las propiedades osteoinductoras del fosfato. El tratamiento incluso con concentraciones bajas de uromodulina es capaz de inhibir la transformación osteogénica de las células primarias del músculo liso aórtico humano (Fig. 1; Fig. 2). La transformación osteoblástica se evalúa como el aumento relativo de la expresión del factor de unión al núcleo alfa 1 (CBFA1) y de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (ALPL), así como de la actividad de ALPL. Este poderoso efecto no puede reproducirse mediante el tratamiento con albúmina de suero como control (Fig. 1). Además, este efecto puede ser suprimido por un anticuerpo bloqueante anti-uromodulina (Fig. 2). Por lo tanto, la uromodulina ejerce poderosos efectos para prevenir la transformación osteoinductora de las células del músculo liso vascular.

Lo más importante, la uromodulina es capaz prevenir la calcificación vascular. El tratamiento con uromodulina previene completamente la calcificación de las células primarias del músculo liso aórtico humano inducida por el medio de calcificación (Fig. 1). Estos experimentos reflejan los procesos de calcificación en el tejido vascular. Por lo tanto, el tratamiento con uromodulina es un potente antagonista de la calcificación vascular.

El tratamiento con uromodulina también es capaz inhibir la transformación osteogénica primaria de las células del músculo liso aórtico humano inducida durante condiciones urémicas (Fig. 3). Por tanto, la uromodulina puede reducir la progresión de la calcificación vascular desencadenada por condiciones complejas como la enfermedad renal crónica.

El tratamiento con uromodulina también es capaz de inhibir la transformación osteogénica de las células primarias del músculo liso aórtico humano inducida por cristales de hidroxiapatita preformados (Fig. 5). Por lo tanto, la uromodulina inhibe la calcificación vascular no por la simple inhibición de la precipitación de calcio y fosfato, sino por un efecto activo sobre las células del músculo liso vascular.

Ejemplo 2: la suplementación con uromodulina es capaz de inhibir la inflamación vascular

La uromodulina actúa sobre las células del músculo liso vascular para inhibir la inflamación vascular. El tratamiento con uromodulina inhibe la activación del "potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de las células B activadas" inducida por el entorno pro-calcificado (Fig. 4). Este efecto es específico para la uromodulina y no puede replicarse con la albúmina de suero como control. Por lo tanto, la uromodulina puede usarse para prevenir la inflamación vascular.

La uromodulina es capaz de contrarrestar los efectos de las citoquinas inflamatorias. La uromodulina presumiblemente inactiva los efectos de las citoquinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNFa ) y la interleucina 1 beta (IL-1 p) (Fig. 4). Por lo tanto, la uromodulina puede usarse como inhibidor de la inflamación.

La uromodulina sérica es capaz de interactuar con las citoquinas inflamatorias endógenas TNFa e IL-1 p en el suero de pacientes humanos, como lo demuestra la detección de estas citoquinas en muestras de suero inmunoprecipitadas con uromodulina (Fig. 4).

Un uso particular en el que el tratamiento de acuerdo con la invención es beneficioso es la mejora de los procesos inflamatorios desencadenados por o asociados con TNFa o IL-1 p.

Ejemplo 3: la sobreexpresión de uromodulina es capaz de reducir la calcificación vascular in vivo

La sobreexpresión de uromodulina es capaz de reducir la calcificación aórtica y la expresión de marcadores osteogénicos aórticos después del tratamiento con dosis altas de colecalciferol en ratones (Fig. 8). La sobreexpresión de uromodulina muestra efectos anticalcificantes en los tejidos vasculares sin afectar significativamente a las concentraciones en plasma de calcio o fósforo en los ratones tratados con colecalciferol (Tabla 1).

Tabla 1.

Estos resultados también se confirmaron en células de músculo liso de ratón in vitro. La sobreexpresión de uromodulina es capaz de prevenir la calcificación inducida por fosfato y la señalización osteoinductora en células de músculo liso aórtico de ratón MOVAS (Fig. 6). De manera similar, la suplementación con uromodulina es capaz de prevenir las propiedades osteoinductoras del fosfato en las células MOVAS (Fig. 7).

Ejemplo 4: Los niveles de uromodulina en suero están inversamente correlacionados con la propensión a la calcificación en suero en pacientes con enfermedad renal crónica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular o una enfermedad provocada por la calcificación vascular.

2. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad provocada por, o asociada con, la calcificación vascular es calcificación vascular en enfermedad renal crónica, en diabetes, en envejecimiento o en ateroesclerosis.

3. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el péptido de uromodulina comprende o consiste esencialmente de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001.

4. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido de uromodulina

a. comprende o consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos caracterizada por más del (>) 85% de identidad, particularmente >90% de identidad, incluso más particularmente >92%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98%, o >99% de identidad con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001, y

b. se caracteriza por al menos un 85% de actividad biológica del polipéptido de uromodulina de la SEQ ID NO 001.

5. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la enfermedad se caracteriza por un nivel de uromodulina periférica por debajo de 125 ng/ml, particularmente por debajo de 110 ng/ml, incluso más particularmente por debajo de 100 ng/ml, 80 ng/ml o 60 ng/ml.

6. Un polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular.

7. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la inflamación vascular está asociada con calcificación vascular.

8. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el péptido de uromodulina comprende o consiste esencialmente de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001.

9. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la inflamación vascular de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el péptido de uromodulina

10. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de inflamación vascular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde la enfermedad se caracteriza por un nivel de uromodulina periférica por debajo de 125 ng/ml, particularmente por debajo de 110 ng/ml, incluso más particularmente por debajo de 100 ng/ml, 80 ng/ml o 60 ng/ml.

11. El polipéptido de uromodulina para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular o la inflamación vascular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el péptido de uromodulina es un péptido recombinante.

12. Un sistema de expresión de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos caracterizada por más del (>) 85% de identidad, particularmente >90% de identidad, incluso más particularmente >92%, >94%, >95%, >96%, >97%, >98% o >99% de identidad con la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO 001, en donde dicho polipéptido se caracteriza por al menos un 85% de actividad biológica del polipéptido de uromodulina de la SEQ ID NO 001, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o la inflamación vascular.

13. El sistema de expresión de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos está bajo el control de un promotor operable en una célula humana, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o la inflamación vascular.

14. El sistema de expresión de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde dicho sistema de ácidos nucleicos es un virus, particularmente un virus seleccionado de adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus, para su uso en la prevención o terapia de la calcificación vascular y/o la inflamación vascular.