WO2013032248A2 - 인간 골형성 단백질 수용체 1ａ의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

인간 골형성 단백질 수용체 1ａ의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDF

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윤병학
최승현
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Definitions

  • Composition for improving skin condition comprising extracellular domain of human osteogenic protein receptor la as an active ingredient
  • the present invention relates to a composition for improving skin conditions comprising the extracellular domain of the human osteogenic protein receptor la as an active ingredient.
  • BMPs Bone Morphogenetic Proteins
  • TGF transforming growth factor beta
  • BMP signaling plays an important role in cardiac, nerve and cartilage development as well as acquired bone formation.
  • BMPs induce bone formation in cascade cartilage and play a decisive role in skeletal and joint morphogenesis (Urist, Science, 150: 893-899 (1965), 01 sen et al., Annu. Rev. Cell Dev Biol. 16: 191-220 (2000), Kronenberg, Nature 423: 332-336 (2003), Thomas et al., Nat. Genet. 12: 315-317 (1996), Thomas et al., Nat. Genet. 17: 58-64 (1997), Polinkowsky et al., Nat. Genet. 17: 18-19 (1997), Storm et al., Nature, 368: 639-643 (1994)).
  • BMPs signal through serine / threonine kinase receptors comprising both types 1 and 2.
  • One receptors of three types [type la and lb BMP receptor and type 1 activin receptor (ActRl)] bind BMP ligands (Koenig et al., Mo J. Cell. Biol. 14: 5961-5974 ( 1994), Ten Dijke et al., J. Biol Chew. 269: 16985-16988 (1994), Macias-Silva et al., J. Biol. Chem. 273: 25628-25636 (1998).
  • BMP is a large dimeric pro-protein, synthesized in the cytoplasm and cleaved by proteases upon secretion. Each monomer contains 300 amino acids as a proprotein. Functional carboxyl moieties (100-120 pieces in each monomer) Amino acids) are secreted into the extracellular zone and bind to cell membrane receptors on target cells. There are a series of extracellular proteins that antagonize or otherwise alter the function of BMP, which include Glypican-3, Noggin, Cordin, Cerberus, and Follistatin. (Follistatin) (Fainsod et al., Mech. Dev. 63: 39-50 (1997), Grisaru et al., Dev. Biol.
  • Type 1 and 2 BMP receptors are differentially expressed in a variety of tissues, but both are essential for signal transduction. Upon ligand binding, the Type 1 and 2 BMP receptors form heterotetrameric-activated receptor complexes and These include two pairs of type 1 and 2 receptor complexes (Moustakas et al., Genes Dev. 16: 67-87 (2002). Both receptor types are essential for signaling (Hogan, Genes Dev. 10: 1580-).
  • Type 1 BMP receptors transmit signals through Smad proteins (Smad 1/5), which are important for relaying BMP signals from the receptor to target genes in the nucleus.
  • Smad 1/5 Smad proteins
  • the phosphorylated Smad proteins associate with the related protein Smad4 acting as a shared partner.
  • the complex enters the nucleus and, like other transcription factors, participates in gene transcription. Little is known about the anti-wrinkle and ameliorative effects of atopic dermatitis diseases of type 1 BMP receptor proteins that play an important role in signal transduction.
  • Wrinkles are formed by the repetitive movement of muscles in a specific direction for a long time, affected by age, external environment, and ultraviolet radiation.
  • the human skin fibroblasts in the dermis become aging, and the ability to produce fibers and substrates decreases, and the amount of the substrate decreases overall, resulting in thinner skin and reduced skin elasticity.
  • Wrinkles are formed.
  • ROS reactive oxygen species
  • atopy means congenital allergic reactions to food or other inhalable substances, but most of them are incurable diseases that are difficult to treat without knowing the exact cause.
  • Atopic dermatitis is most common in people with genetic constitutions that cause eczema, asthma, high fever, and allergies, but it is known that more environmental factors are caused by the pollution of modern urban dwellings. It is a chronic skin disease that begins with infant eczema and is chronic and recurrent.
  • Atopic dermatitis develops in 10-20% of children and 1 ⁇ 3% in adults. By age group, 60% of infants are younger than 1 year and 90% begin symptoms before 5 years of age. It is estimated that 4% of Korea's total population (approximately 1.85 million people) have atopic symptoms, and it is on the rise. The recent survey shows that 4 out of 10 children under 6 years of age have atopic dermatitis. (December 27, 2005, Reported Dong-A Ilbo).
  • the present inventors have diligently researched to develop a substance that can improve skin conditions. As a result, the topical application of the extracellular domain of the human bone morphogenetic protein receptor la to the skin can significantly improve skin conditions.
  • the discovery has completed the present invention.
  • an object of the present invention to provide a composition for improving skin conditions (conditions) comprising a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for improving skin conditions (conditions) comprising a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence as an active ingredient.
  • the present inventors have conducted research to find a novel use of the extracellular domain of the human bone morphogenetic protein receptor la. Local application of the extracellular domain of la to the skin was found to significantly improve skin condition.
  • the extracellular domain (ECD) of the human bone morphogenetic protein receptor la (hBMPRla) used as an active ingredient in the present invention is a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Together with '3 ⁇ 4 (intracel lular kinase domain), it constitutes a human bone morphogenetic protein receptor.
  • the extracellular domain of the human osteogenic protein receptor la of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid molecule encoding the extracellular domain of the human bone morphogenic protein receptor la of the invention is most preferably the nucleotide of SEQ ID NO: 2.
  • Nucleic acid molecules of the present invention encoding the extracellular domain of the human bone morphogenic protein receptor la are also construed to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequences described above. The substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the maximum, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • the present invention provides a vector for expressing the extracellular domain of human osteogenic protein receptor la comprising the nucleic acid molecule of the present invention described above encoding the extracellular domain of human osteogenic protein receptor la.
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
  • Vectors of the invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of promoting transcription for example, the tac promoter, lac Promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, ⁇ promoter, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • ribosome binding sites for example, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • transcription / detoxification for initiation of detoxification It is common to include a termination sequence.
  • vectors that can be used in the present invention are plasmids often used in the art (eg pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phage (eg ⁇ ⁇ 4 ⁇ , ⁇ -Charon , ⁇ and M13) or viruses (eg SV40, etc.).
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adeno Late virus promoter, vaccinia virus 7.5k promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adeno Late virus promoter, vaccinia virus 7.5k promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • the vector of the present invention may be fused with other sequences as necessary to facilitate the purification of the extracellular domain proteins of the human osteogenic protein receptor la of the present invention expressed therefrom, and the sequences to be fused are, for example, glutathione S- Transferases (Pharmacia, USA), maltose binding proteins (NEB, USA), FLAGdBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) and the like can be used, but are not limited thereto.
  • the vector of the present invention used for the purification of the extracellular domain protein of the human bone morphogenic protein receptor la of the present invention may additionally include a thiorredoxin gene in addition to the extracellular domain gene of the human bone morphogenic protein receptor la. Can be.
  • the expression vector of the present invention as an optional marker, and may include antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, Genes resistant to gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline.
  • antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, Genes resistant to gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline.
  • the present invention provides a transformant comprising the vector of the present invention described above.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention may use any host cell known in the art, for example, E. coli JM109, E. coli BL2KDE3), E. coli RR1, E strains of the genus Bacillus, such as coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species Same enterobacteria and strains.
  • E. coli JM109 E. coli BL2KDE3
  • E. coli RR1 E strains of the genus Bacillus, such as coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia mars
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • nasal cells e.g., CH0 cell line (Chinese hamster ovary), W138, ⁇ , C0S-7, 293) , HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)) when the host cell is a prokaryotic cell. , One method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 ( 1983) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • a micro-injection method Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • calcium phosphate precipitation method Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)
  • Electroporation Nectron et al., EMB0 J ,, 1: 841 (1982)
  • liposome-mediated transfection Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)
  • DEAE- Dextran treatment Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)
  • gene balm Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)
  • the vector can be injected into the host cell by, for example.
  • the vector injected into the host cell can be expressed in the host cell, in which case a large amount of the extracellular domain protein of the human osteogenic protein receptor la of the present invention is obtained.
  • the expression vector may have a lac promoter.
  • IPTG can be treated in the host cell to induce gene expression.
  • the composition of the present invention has a liposome composition. That is, the extracellular domain of the human bone morphogenetic protein receptor la, which is an active ingredient, is preferably surrounded by liposomes and applied to the skin.
  • the composition of the present invention has a composition of nanoliposomes.
  • nanoliposomes refers to liposomes having an average particle diameter of 20-1000 nm as having the form of conventional liposomes.
  • the average particle diameter of the nanoliposomes is 50-500 nm, more preferably 50-350 nm and most preferably 100-200 nm.
  • Liposomes are defined as spherical phospholipid becycloes of colloidal particles that associate themselves with liposomes having water-soluble heads (hydrophilic groups) and insoluble tails (hydrophobic groups): amphiphilic molecules spontaneously bound and aligned by their interactions. It is classified into SUV (Smal 1 Unilamellar Vesicle), LUV (Large Unilamellar Vesicle) and 'MLVC Multi Lamellar Vesicle' according to its size and lameness. Such liposomes exhibiting various laminations have a double membrane structure similar to that of cell membranes.
  • the (nano) liposomes in the present invention can be prepared using phospholipids, polys, surfactants, fatty acids or / and water.
  • Phospholipids which are components used in the preparation of the (nano) liposomes of the present invention, are used as amphoteric lipids, including natural phospholipids (eg, egg yolk lecithin or soy lecithin, sphingomyelin) and synthetic phospholipids (eg dipalmitoyl).
  • Phosphatidylcholine or hydrogenated lecithin preferably lecithin. More preferably, the lecithin is hydrogenated lecithin derived from soybean.
  • the poly that can be used in the (nano) liposome of the present invention is not particularly limited, preferably propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3- butylene glycol, glycerin, methyl propane, isoprene glycol, pentylene glycol, Includes Erisri, Zyri and Solbi.
  • Surfactants that can be used in the preparation of the (nano) liposomes of the present invention may be any known in the art, and include, for example, anionic surfactants (eg, alkylacylglutamate, alkylphosphates, alkyllactylates).
  • Dialkyl phosphates and trialkyl phosphates cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants (eg alkoxylated alkyl ethers, alkoxylated alkyl esters, alkylpolyglycosides, polyglyceryl esters and sugar esters) ) Can be used.
  • Fatty acids that can be used to prepare the (nano) liposomes of the present invention are higher fatty acids, preferably saturated or unsaturated fatty acids of C 12 -22 alkyl chains, for example, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid. Oleic acid and linoleic acid.
  • the water used to prepare the (nano) liposomes of the present invention is generally deionized distilled water.
  • the (nano) liposomes of the present invention are prepared only with phospholipids and water, specific examples of which are described in the following examples.
  • the extracellular domain-containing nanoliposomes of the human osteogenic protein receptor la of the invention are prepared via a process comprising the following steps: (a) Phospholipids capable of forming liposomes ( Preferably, the hydrogenated lecithin) is dissolved in an aqueous solution containing the extracellular domain of the human osteogenic protein receptor la; And (b) repeatedly passing the aqueous solution containing the extracellular domain and the phospholipid of the human bone morphogenetic protein receptor la through a high pressure homogenizer to prepare a nanoliposome containing the extracellular domain of the human bone morphogenetic protein receptor la.
  • the nanoliposomes of the present invention contains hydrogenated lecithin derived from soybean as a main component.
  • Aqueous solutions containing the extracellular domain of human osteogenic protein receptor la are preferably H 6-8, preferably about pH 7, complete solution (eg sodium phosphate buffer). If sodium phosphate buffer is used, the concentration is 5-100 mM, more preferably 5-60 mM, even more preferably 10-30 mM, most preferably about 20 mM.
  • extracellular domain-containing nanoliposomes of human bone morphogenic protein receptor la are prepared, preferably extracellular domain-containing nanoliposomes of liquid human bone morphogenic protein receptor la are prepared.
  • the compositions of the present invention can be used to improve various skin conditions.
  • the composition of the present invention is effective for improving wrinkles, improving dermatitis diseases, improving skin whitening, improving skin elasticity, promoting hair growth, preventing skin aging, and improving skin moisturizing, and more preferably, improving wrinkles, improving skin epidermal thickness, and atopy. Effective for improving dermatitis diseases.
  • Dermatitis refers to eczema dermatitis. Eczema is characterized by vesicles, erythema, and edema accompanied by itching in the acute phase. lichniscation, scale, skin color change, etc. are formed. Dermatitis is classified into contact dermatitis, atopic dermatitis and seborrheic dermatitis. -The term "improvement of skin epidermal thickness" as used in the present invention means inhibiting thickening of the skin epidermis.
  • composition of the present invention may be prepared as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the extracellular domain _ containing liposomes of the human osteogenic protein receptor la as an active ingredient, and include, for example, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and Conventional adjuvants such as perfumes, and carriers.
  • the cosmetic composition for protecting the skin of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactants- It may be formulated as containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, supple lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence , eye cream , It may be prepared in the form of a cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the carrier components include animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, salulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silica, talc or zinc oxide. Can be used.
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, and in particular, in the case of spray, additionally chloroflutohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, a solubilizer or an emulsifier is used as the carrier component, for example water, ethane, isopropane, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • a solvent, a solubilizer or an emulsifier for example water, ethane, isopropane, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • the carrier component may be water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a polyoxyethylene sorbate ester or a suspending agent such as a polyoxyethylene sorbitan ester, Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxyde bentonite, agar or tracant can be used.
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide ether.
  • composition of the present invention when prepared as a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, mantle, starch, acacia rubber, calcium phosphate, Alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl salose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / Or mineral oil.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, mantle, starch, acacia rubber, calcium phosphate, Alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl salose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / Or mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • Carriers and formulation with appropriate pharmaceutically acceptable are described in detail in Remington's Pharmaceutical Scj 'ences (19t ed., 1995),
  • the pharmaceutical composition of the present invention was developed for the purpose of topical administration of skin. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age of the patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response. Can be. On the other hand, the topical dosage of the present invention and pharmaceutical composition is preferably 0.001-100 ng / cm 2 (skin surface area) per day, more preferably 0.01-10 ng / cm 2 , most preferably 0.1-2 ng / cm 2 .
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation is most preferably in the form of a solution containing nanoliposomes.
  • the composition of the present invention acts on the epidermal cells to improve wrinkles, and has the effect of improving atopic dermatitis disease. Overall, the compositions of the present invention can greatly improve skin condition and are very safe for human body.
  • the protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence in the composition for improving skin condition of the present invention may be a fusion protein to which a thiorredoxin protein is bound.
  • fusion protein refers to a protein in which thioredoxin is bound to the extracellular domain of human osteogenic protein receptor la.
  • Thioredoxin used in the present invention has a microorganism, human or animal derived thioredoxin amino acid sequence, and preferably has a microorganism derived thioredoxin amino acid sequence. More preferably the thioredoxin of the present invention
  • the nucleic acid molecule encoding thioredoxin of the present invention, having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is most preferably the nucleotide of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention provides a fusion protein in which a thioredoxin protein is bound to a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • Thioredoxin included in the extracellular domain fusion protein of thioredoxin-human bone morphogenic protein receptor la of the present invention has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleic acid molecule encoding thioredoxin of the present invention is most preferably a nucleotide of SEQ ID NO: 4.
  • Nucleic acid molecules of the present invention encoding thioredoxin are also construed to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequences described above. The substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention is aligned with the nucleotide sequence of the present invention to the maximum correspondence, and when the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. Nucleotide sequence that exhibits homology of, more preferably, at least 90%, and most preferably, at least 95%.
  • the fusion protein in which the thioredoxin protein is bound to the protein having the amino acid sequence of the first sequence of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a method for improving skin conditions, comprising administering to a subject a composition comprising a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient. to provide. ⁇ effect ⁇
  • the present invention provides a composition for improving skin conditions comprising the extracellular domain of the human osteogenic protein receptor la as an active ingredient.
  • composition of the present invention has an effect of improving wrinkles and improving atopic dermatitis diseases.
  • FIG. 1 is a diagram of human BMPRla ECD protein transformed into E. coli, cultured, purified and confirmed on an SDS-PAGE gel.
  • Figure 2 is a figure confirming the wrinkle-improving effect of the protein application site after applying Lipo-BMPRla ECD for 11 weeks to nude mice induced wrinkles through UV irradiation.
  • 3 is a graph evaluating the effect of improving wrinkles by assigning a score based on a photograph of a region to which Lipo-BMPRla ECD was applied.
  • Figure 4 shows the effect of improving the atopic dermatitis disease at the protein application site after applying Lipo-BMPRla ECD for 10 weeks to atopic dermatitis-induced mice by applying TNCB.
  • Figure 5 is a graph evaluating the effect of atopic dermatitis disease by assigning a score based on the photograph of the site where the Lipo-BMPRla ECD was applied.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the change of skin epidermal thickness according to Lipo-BMPRla ECD application by hematoxylin eosin staining method.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of skin epidermal thickness change according to Lipo-BMPRla ECD application.
  • FIG. 8 is a diagram showing that the thioredoxin-BMPRla ECD fusion protein was transformed into E. coli, cultured, purified and confirmed on an SDS-PAGE gel.
  • FIG. 9 is a graph illustrating the effect of improving wrinkles by applying thioredoxin-BMPRla ECD fusion protein to nude mice.
  • TRX thioredoxin
  • DNA fragments obtained by fusion of DNA fragments encoding ECDs (extracellular domains) of BMPRla (bone morphogenetic protein receptor la) proteins were synthesized and obtained by GeneScript (USA). Between the thioredoxin gene and the BMPRla ECD gene, there is a linker region consisting of 36 amino acids. E. coli. The thioredoxin protein consists of 109 amino acids and the human BMPRla ECD consists of 129 amino acids. Preparation of expression vector containing thioredoxin-human BMPRla ECD gene
  • the thioredoxin-human BMPRla ECD gene and the pET_32a (+) vector were cleaved with and EcoRi, linked with T4 DNA ligase (NEB, USA), and then transformed into the DH5a strain (BioPrince, USA) I was. Then, after incubation for 15 hours at 37 ° C, 10 colonies were randomly selected and cultured, plasmids were obtained using a plasmid purification kit (Qiagen), and then electrophoresed in 1.2% agarose gel. The desired polamide was selected by checking the nucleotide sequence.
  • An expression vector containing thioredoxin-human BMPRla ECD gene was transformed into an expression strain Orgami B (DE3) (Novagen, USA) and cultured in a large scale. After incubating the Orgami B (DE3) strain transformed with a thioredoxin-human BMPRla ECD expression vector in a 50 L incubator at 16 ° C and inducing expression, Cell pellets were obtained by centrifugation. After suspension of the cell pellet with buffer A (50 mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0), the cells were crushed twice at 800 bar using a homogenizer twice per 10 minutes and a supernatant was obtained by centrifugation.
  • buffer A 50 mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0
  • Experimental animals were purchased from Dooyeol Biotech, 4 weeks old female SKH-1 nude mouse (Sungnam, Korea). The experimental animals were reared under conditions of 24:21: silver, 50 ⁇ 10% humidity, 12 hours daytime: 12 hours night cycle, incubated for 2 weeks, and then randomly divided into 6 groups. The experimental group is shown in Table 1.
  • R.A Retinoic acid, 0.01 wt% retinoic acid dissolved in 15 vol% ethane
  • BMPRla ECD protein lyophilized at 4 ° C., was dissolved in 20 mM NaH 2 P0 4 [pH 7.0], 1 L EDTA 1 L solution at a concentration of 10 g / ml, then 10 g A liposome (Soya-SPL 75H, Onetech Co.) was added and stirred for 30 minutes to prepare a sample containing the final 1% liposome and 13 g / ml BMPRla ECD protein.
  • the liposomes used are based on soybean lecithin derived from soybean.
  • the prepared sample was passed through a homogenizer five times under 15,000 psi pressure in a high pressure homogenizer equipped with a heat exchanger (NanoDeBEE, USA, Model 45-1) to prepare a final sample. Under the above conditions, most liposome sizes are 100-200 nm.
  • Protein treatment group (group 6), positive control group (group 4), group 3 and group 5 was treated with 300 ⁇ each five times a week, and when UV treatment, it was applied before irradiation with ultraviolet light. Samples were evenly applied to the entire back using a No. 3 brush (Hwahong, Korea) for art. UV irradiation on nude mouse
  • the UV irradiator was a VLX-3W st imulator (Vi Iber Lourmat, Marnela Val lee, France). Ultraviolet rays were irradiated 3 times per week for 11 weeks, 40 mJ / cm 2 for 1-2 weeks, 50 mJ / cm 2 for 3-4 weeks, 60 mJ / cm 2 for 5-9 weeks, and 70 mJ / cm 2 for 10-11 weeks. It was.
  • NC / Nga mice (Woongseong, 4 weeks old, Central Experimental Animal, Korea) were used for the experiment after 24 ⁇ 2C temperature, 50 ⁇ 10% humidity, 12 hours incubation for 2 weeks under conditions of 12 hours night cycle. It was. Body weights of mice incubated for two weeks were measured and divided into five groups as shown in Table 2.
  • Table 2
  • 150 ⁇ was applied to induce atopy.
  • FK506 and Lipo-BMPRla ECD was applied five times a week for 10 weeks,
  • SKH-1 nude mice (magnetic, 4 weeks old, Dooyeol Biotech, Korea) were kept at 24 ⁇ 2C temperature, 50 ⁇ 10% humidity, 12 hours daytime: 2 weeks under conditions of 12 hours night cycle. After incantation, it was arbitrarily divided into 6 groups and used for the experiment.
  • the protein group and the control group were treated with 300 ⁇ of each sample five times a week.
  • the sample prepared in advance was prepared by using No. 3 brush (Hwahong, Incheon, Korea) for one hour before UV irradiation. And evenly applied to the entire back. UV irradiation on nude mouse
  • UV irradiator was used VLX-3W stimulatorCilber Lourmat, Marne la Vallee, France). Ultraviolet rays were irradiated 3 times per week for 11 weeks, 40 mJ / cm 2 for 1-2 weeks, 50 mJ / cm 2 for 3-4 weeks, 60 mJ / cm 2 for 5-9 weeks, and 70 mJ / cm 2 for 10-11 weeks. It was. Mouse skin staining
  • SKH-1 nude mice (magnetic, 4 weeks old, Dooyeol Biotech, Korea) were incubated at 24 ⁇ 2C temperature, 50 ⁇ 10% humidity, 12 hours daytime for 2 weeks under conditions of 12 hours night cycle, and then randomly divided into 6 groups. It was used for the experiment.
  • the protein group and the control group were treated with 300 ⁇ of each sample five times a week.
  • the sample prepared in advance was prepared by using No. 3 brush (Hwahong, Incheon, Korea) for one hour before UV irradiation. And evenly applied to the entire back. UV irradiation on nude mouse
  • Ultraviolet irradiation equipment is VLX-3W stimulator (Vilber Lourmat, Marne la
  • UV radiation is 3 times a week for 11 weeks, 1-2 weeks, 40 mJ / cm 2 , 3-4 weeks 50 mJ / cm 2 , 5-9 weeks 60 mJ / cm 2 , 10-11 weeks 70 mJ / cm 2 Investigate. Anti-wrinkle Effect of Lipo-Tioredoxin-BMPRla ECD

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Abstract

본 발명은 인간 골형성 단백질 수용체 1a의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(conditions) 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명은 수첨레시틴을 구성성분으로 포함하는 나노리포좀 내부에 인간 골형성 단백질 수용체 1a의 세포외 도메인을 유효성분으로 함유하고 있으며 입자크기는 50-250 nm이다. 본 발명의 조성물은 주름 개선 및 아토피성 피부염 질환 개선 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명은 인간 골형성 단백질 수용체 1a의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태(conditions) 개선 방법을 제공한다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
【기술분야】
본 발명은 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
골형성 단백질들 (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)은 형질전환 성장 인자 (Transforming growth factor beta, TGF ) 상과 (super family)의 일원인 다기능성 성장인자들이다. BMP 신호전달은 심장, 신경 및 연골 발생은 물론 후천적 골 형성에서 중요한 역할을 하고 있다. BMP 들은 연쇄적 (cascade) 연골 내 골형성을 유도하고 골격 및 관절 형태발생에 결정적인 역할을 한다 (Urist, Science, 150:893-899 (1965)， 01 sen et al . , Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:191-220 (2000), Kronenberg, Nature 423:332-336 (2003) , Thomas et al. , Nat. Genet. 12:315-317 (1996), Thomas et al . , Nat. Genet. 17:58-64 (1997), Polinkowsky et al . , Nat. Genet. 17:18-19 (1997), Storm et al . , Nature, 368:639-643 (1994)).
BMP는 타입 1 및 2 둘 다를 포함하는 세린 /트레오닌 키나제 수용체를 통해 신호전달한다. 세 가지의 타입 [타입 la 및 lb BMP 수용체 및 타입 1 액티빈 수용체 (ActRl)]의 1 수용체들은 BMP 리간드들과 결합한다 (Koenig et al. , Mo J. Cell. Biol. 14:5961-5974 (1994), Ten Dijke et al . , J. Biol Chew. 269:16985-16988(1994), Macias-Silva et al., J. Biol. Chem. 273:25628-25636(1998)).
BMP 는 커다란 이량성 전구 -단백질로서 세포질에서 합성되며 분비 시 단백질 분해효소에 의해 절단된다. 각 단량체들은 전구단백질로서 300 개의 아미노산을 포함하고 있다. 관능성 카르복시 부위 (각 단량체에서 100-120 개 아미노산)가 세포외 구역으로 분비되어 타겟 세포 상의 세포막 수용체와 결합한다. BMP의 기능을 길항하거나또는 다르게 변경시키는 일련의 세포외 단백질이 있는데， 이러한 단백질들은 글리피칸 (Glypican)-3, 노긴 (Noggin), 코르딘 (Chordin), 세르비러스 (Cerberus)， 및 폴리스타틴 (Follistatin)을 포함한다 (Fainsod et al. , Mech. Dev. 63:39-50(1997), Grisaru et al. , Dev. Biol. 231:31-46(2001), Hoi ley et al . , Cell 86:607-617(1996), lemur a et al. , Proc. Natl. Acad. U.S.A. 95:9337-9342(1998), Jackson et al. , Development 124:4113-4120(1997), Paine-Saunders et al . , Dev. Biol. 225:179-187(2000), Piccolo et al ,， Cell 86:589-598(1996), Re'em-Kalma et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:12141-12145(1995)， Sasai et al. , Nature 376:333-336(1995), Zi讓 erman et al . , Cell 86： 599- 606(1996)). 타입 1 및 2 BMP 수용체들은 다양한 조직에서 차등적으로 발현되지만， 둘 다 신호 전달에 필수적이다, 리간드 결합시， 상기 타입 1 및 2 BMP 수용체들은 이종사량성 (heterotetrameric)-활성화된 수용체 복합체들을 형성하고 이들은 두 쌍의 타입 1 과 2 수용체 복합체들을 포함한다 (Moustakas et al . , Genes Dev. 16:67-87(2002). 양쪽 수용체 타입들은 신호전달에 필수적이다 (Hogan, Genes Dev. 10:1580-1594(1996), Nellen et al. , Cell 78:225-237(1994)， Ruber te et al. , Cell 80:889- 897(1995), Ten Dijke et al. , Curr. Op in. CellBiol. 8:139-145(1996)， Weis-Garcia et al . , EMBO J. 15:276-289(1996)， Wrana et al. , Nature 370:341-347(1994)). 타입 2 수용체들은 리간드 결합시 타입 1 수용체들을 인산화시키는， 상시 (const i tut ively) 활성적 키나제 활성을 가진다. 인산화된 타입 1 수용체들은 신호를 하류 타겟 단백질로 전달한다.
타입 1 BMP 수용체들은 Smad 단백질들 (Smad 1/5)을 통해 신호를 전달하는 데， 이 단백질들은 BMP 신호를 상기수용체에서 핵 내의 타겟 유전자로 중계하는 데 중요하다. 상기 수용체로부터 분비 시， 상기 인산화된 Smad 단백질들은 공유된 파트너로서 활동하는 관련 단백질 Smad4 와 연합한다. 이러한 복합체는 핵 내로 진입하게 되고 다른 전사인자들과 같이 유전자 전사에 참여하게 된다. 신호 전달에 중요한 역할을 하는 타입 1 BMP 수용체 단백질들의 주름 개선 및 아토피성 피부염 질환에 대한 개선 효과에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.
주름은 특정 방향으로 근육이 오랜 기간 동안 반복하여 움직임으로써 형성되는데， 연령， 외부환경， 자외선 조사 등에 의해서 영향을 받는다. 즉, 피부조직의 노화에 따라 진피층에 있는 섬유아세포 (human skin fibroblast)가 노화되어 섬유질과 기질의 생성능력이 줄어들게 되며， 기질의 양이 전반적으로 감소하여 피부의 두께가 얇아지고 피부의 탄력을 저하시켜 주름이 형성된다. 또한， 피부가 자외선에 노출되면 피부세포 손상의 주원인인 자유 라디칼 (free radical)과 활성산소종 (react ive oxygen species, ROS)이 생성되는데， 이들은 DNA 의 손상을 유발하고 세포막구조를 공격하여 노화반점을 발생시키며 피부를 촉촉하고 부드러우며 유연하게 탄력을 유지시키는 교원질과 섬유질을 공격하여 주름생성을 가속화할 수도 있다. 이러한 의부환경 또는 내부기작에 의하여 발생하는 피부 주름을 즐이기 위하여 다양한 방법이 제안되고 있다.
또한， 아토피는 음식물이나 기타 흡입성 물질에 대한 선천성 알러지 반웅을 의미하지만， 대부분 정확한 원인을 알 수 없는 치료가 힘든 난치성 질환이다. 아토피성 피부염은 습진, 천식， 고초열， 알러지 등을 잘 일으키는 유전적 체질을 가진 사람에게 많이 발생되지만， 현대의 도시 주거 환경오염으로 인한 환경적 요인이 더 많은 것으로 알려지고 있으며， 흔히 태열이라고 말하는 유아 습진으로 시작하여 만성적， 재발성인 경과를 보이는 만성 피부 질환이다.
아토피성 피부염은 어린이에게 10-20%， 어른에게 1ᅳ3% 발병하며 연령대별로는 유아 환자의 60%는 1 세 미만， 90%가 5 세 이전에 증상이 시작된다. 우리나라 총인구의 4% (약 185 만 명)가 아토피 증상을 가진 것으로 추정되며, 계속 증가하고 있는 추세인 데 서울에 사는 6 세 미만 아동 10 명 중 4 명이 아토피성 피부염을 앓았다는 최근 조사에서도 잘 알 수 있다 (2005년 12월 27일， 동아일보 보도).
유아성 아토피는 3-5 세 정도에 많이 호전되지만， 일부는 청소년기 또는 성인까지 지속되며， 최근에는 청소년기 이후에도 아토피 발병 환자가 증가 추세이다. 아토피성 피부염을 치료하는 방법으로 스킨케어 즉， 건조하고 갈라지고 비후해진 피부를 부드럽게 하여 알러지 원인물질， 미생물, 기타 자극인자들이 쉽게 피부를 침투하지 못하게 하고, 정확한 알러지 원인을 검사하여 제거하는 방법, 국소 항염증제 의약품， 항생제를 도포하는 방법 등이 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】
본 발명자들은 피부 상태를 개선시킬 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과， 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인을 피부에 국소적으로 적용하면 피부 상태 (conditions)를 크게 개선할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인의 신규한 용도를 찾기 위하여 연구 노력한 결과， 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 피부에 국소적으로 적용하면 피부 상태를 크게 개선할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명에서 유효성분으로 이용되는 인간 골형성 단백질 수용체 la (human bone morphogenet i c protein receptor la: hBMPRla)의 세포외 도메인 (extracellular domain: ECD)은 단일 트랜스멤브레인 도메인 (single transmembrane domain) 및 세포내 키나아제 도메 '¾(intracel lular kinase domain)과 함께 인간 골형성 단백질 수용체를 구성한다.
본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는， 가장 바람직하게는, 서열목록 제 2 서열의 뉴클레오타이드이다. 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은， 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성， 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성， 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명은 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인을 발현용 백터를 제공한다.
본 발명의 백터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며， 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al .， Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory
Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명의 백터는 전형적으로 클로닝을 위한 백터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 백터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
본 발명의 백터가 발현 백터이고， 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， tac 프로모터， lac 프로모터， lacUV5 프로모터， lpp 프로모터， ρίλ프로모터, ρί^λ프로모터, rac5 프로모터， amp 프로모터， recA 프로모터， SP6 프로머터， trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)， 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli 7} 이용되는 경우， E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C.， J. Bacteriol. , 158 :1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (ρίλ프로모터， Herskowitz, I. and Hagen, D. , Ann. Rev. Genet,, 14 :399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편， 본 발명에 이용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSClOl, ColEl, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λ^4λΒ, λ -Charon, λΔζΙ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편， 본 발명의 백터가 발현 백터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는， 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니아 바이러스 7.5Κ 프로모터， SV40 프로모터， 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV 의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며， 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 백터는 그로부터 발현되는 본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 , 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며， 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAGdBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인 단백질의 정제하기 위해 사용되는 본 발명의 백터는 백터 내에 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인 유전자 외에 티오레독신 (thioredoxin) 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편， 본 발명의 발현 백터는 선택표지로서， 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜， 스트렙토마이신， 카나마이신, 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 백터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL2KDE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움， 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 백터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤층 세포 및 사람 세포 (예컨대， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138, ΒΗΚ, C0S-7, 293， HepG2, 3Τ3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은， 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci . USA, 9：2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mol. Biol. , 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al . , Nucleic. Acids Res. , 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한， 숙주세포가 진핵세포인 경우에는， 미세 주입법 (Capecchi, M.R. , Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al. , Virology, 52：456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al . , EMB0 J,, 1:841(1982)), 리포좀 -매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al .， Gene, 10:87(1980)), DEAE- 덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. , 5： 1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. , 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 백터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
숙주세포 내로 주입된 백터는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 백터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG 를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리포좀 조성을 갖는다. 즉， 유효성분인 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인은 리포좀에 포위되어 피부에 적용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 나노리포좀의 조성을 갖는다. 본 명세서에서， 용어 "나노리포좀" 은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 20-1000 nm 인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50-500 nm 이고， 보다 바람직하게는, 50-350 nm 이며， 가장 바람직하게는 100-200 nm이다.
리포좀은 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 베시클로 정의되는데， 수용성 헤드 (친수기)와 불용성 테일 (소수기)을 가진: 양친매성 분자로 구성된 리포좀은 이들의 상호작용에 의하여 자발적으로 결합하여 정렬된 구조를 보이는데 , 그 크기와 적층성 (Lame liar ity)에 따라 SUV(Smal 1 Unilamellar Vesicle) , LUV(Large Unilamellar Vesicle) 및' MLVCMulti Lamellar Vesicle) 로 분류된다. 이와 같이 다양한 적층성을 나타내는 리포좀은 세포막과 유사한 이중막 구조를 갖는다.
본 발명에서의 (나노)리포좀은 인지질, 폴리을， 계면활성제， 지방산 또는 /및 물을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용되는 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질 (예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴， 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질 (예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며， 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는， 상기 레시틴은 대두 유래의 수첨 레시틴이다.
본 발명의 (나노)리포좀에 이용될 수 있는 폴리을은 특히 제한되지 않으며， 바람직하게는 프로필렌글리콜， 디프로필렌글리콜， 1,3- 부틸렌글리콜， 글리세린， 메틸프로판디을， 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리를， 자이리를 및 솔비를을 포함한다. 본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성계 (예: 알킬아실글루타메이트， 알킬포스페이트， 알킬락틸레이트， 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트) , 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제 (예: 알콕시레이티드알킬에테르， 알콕시레이티드알킬에스테르， 알킬폴리글리코사이드， 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르)가 사용될 수 있다.
본 발명의 (나노)리포좀 제조에 이용될 수 있는 지방산은 고급 지방산으로서， 바람직하게는 C12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서 , 예컨대， 라우린산, 미리스트산， 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다.
본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 (나노)리포좀은 인지질과 물만으로 제조되는데, 이의 구체적인 예는 하기의 실시예에 기재되어 있다,
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인 -함유 나노리포좀은 다음의 단계를 포함하는 공정을 통해 제조된다: (a) 리포좀을 형성할 수 있는 인지질 (바람직하게는， 수첨레시틴)을 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 함유한 수용액에 용해하는 단계; 및 (b) 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인과 인지질을 함유한 수용액을 고압균질기에 반복적으로 통과시켜 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 함유하는 나노리포좀을 제조하는 단계 .
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 나노리포좀은 콩 유래의 수첨레시틴을 주성분으로 포함한다.
인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인을 함유하는 수용액은 H 6-8, 바람직하게는 약 pH 7 의 완층액 (예컨대, 소듐 포스페이트 완충액)이 바람직하다. 소듐 포스페이트 완충액이 이용되는 경우에는， 그 농도는 5—100 mM, 보다 바람직하게는 5-60 mM, 보다 더 바람작하게는 10-30 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM이다. 이러한 고압균질 공정을 통해, 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인 -함유 나노리포좀이 제조되며， 바람직하게는 액상의 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인 -함유 나노리포좀이 제조된다. 본 발명의 조성물은 다양한 피부 상태 (conditions)의 개선에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선， 피부염 질환 개선， 피부 미백， 피부탄력 개선， 발모촉진， 피부노화 방지 및 피부보습 개선에 유효하며， 보다 바람직하게는 주름개선, 피부표피 두께 개선 및 아토피성 피부염 질환 개선에 유효하다.
피부염 (dermatitis)은 습진성 피부염을 의미하는데， 습진 (eczema)은 급성 기에 가려움을 동반하는 수포 (vesicle), 흥반 (erythema)， 부종 등이 나타나고, 만성기에는 부종과 수포는 감소되는 반면에 태선화 (lichniscation), 인설 (scale), 피부색의 변화 등이 형성되는 특징을 갖는다. 피부염은 접촉성 피부염 (contact dermatitis), 아토피 피부염 (atopic dermatitis) 및 지루성 피부염 (seborrheic dermatitis)으로 분류된다. - 본 발명에서 사용되는 용어 "피부표피 두께 개선" 은 피부표피가 두꺼워지는 것을 억제한다는 것을 의미한다。
본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인 _함유 리포좀 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제， 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제， 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 피부보호용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어， 용액， 현탁액, 유탁액， 페이스트 , 겔 , 크림， 로션， 파우더 , 비누， 계면활성제 -함유 클린싱， 오일， 분말 파운데이션， 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 , 영양 화장수， 영양 크림 , 마사지 크림 , 에센스， 아이 크림， 클렌징 크림， 클렌징 포음， 클렌징 워터， 팩， 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유， 식물성유， 왁스， 파라핀, 전분, 트라칸트， 샐를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트， 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스， 탈크， 실리카， 알루미늄 히드록시드， 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플투오로히드로카본， 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물， 에탄을， 이소프로판을， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트， 벤질 알코올， 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜， 1,3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물， 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제， 에톡실화 이소스테아릴 알코올， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소결정성 셀를로오스， 알루미늄 메타히드록시드ᅳ 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 둥이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트， 지방족 알코을 에테르 설페이트， 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트 이미다졸리늄 유도체 , 메틸타우레이트, 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코올, 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며， 예컨대， 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니틀， 전분， 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스, 물， 시럽， 메틸 샐를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슘 및 /또는 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Scj'ences(19t ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다,
본 발명의 약제학적 조성물은 피부국소투여 목적으로 개발되었다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체증， 성， 병적 상태, 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명와 약제학적 조성물의 피부국소 투여량은 바람직하게는 1 일 당 0.001-100 ng/cm2 (피부표면적)， 보다 바람직하게는 0.01-10 ng/cm2, 가장 바람직하게는 0.1-2 ng/cm2이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 나노리포좀을 포함하는 용액 형태가 가장 바람직하다. 본 발명의 조성물은 표피세포에 작용하여 주름을 개선시키고, 아토피성 피부염 질환을 개선하는 효능을 나타낸다. 종합적으로, 본 발명의 조성물은 피부 상태를 크게 개선시킬 수 있으며 인체에 매우 안전하다。
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 피부 상태 개선용 조성물에서 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 티오레독신 (thioredoxin) 단백질이 결합된 융합단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "융합단백질" 은 인간 골형성 단백질 수용체 la의 세포외 도메인에 티오레독신이 결합된 단백질을 의미한다. 본 발명에서 이용되는 티오레독신은 미생물, 인간 또는 동물 유래 티오레독신 아미노산 서열을 가지며， 바람직하게는 미생물 유래 티오레독신 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는 본 발명의 티오레독신은 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열을 갖는다, 본 발명의 티오레독신을 인코딩하는 핵산 분자는, 가장 바람직하게는， 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 티오레독신 단백질이 결합된 융합단백질을 제공한다,
본 발명의 티오레독신 -인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인 융합 단백질에 포함되는 티오레독신은 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 티오레독신을 인코딩하는 핵산 분자는, 가장 바람직하게는， 서열목록 제 4 서열의 뉴클레오타이드이다. 티오레독신을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은， 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고， 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에 , 최소 80%의 상동성， 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성 , 가장 바람직하게는 최소 95>의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목톡 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 티오레독신 단백질이 결합된 융합단백질은 서열목록 제 5서열의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 서열목톡 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선 방법을 제공한다. 【효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 인간 골형성 단백질 수용체 la 의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선용 조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명의 조성물은 주름 개선 및 아토피성 피부염 질환 개선 효과를 나타낸다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 인간 BMPRla ECD 단백질을 대장균에 형질전환하여 배양한 후 정제하여 SDS-PAGE 겔 상에서 확인한 그림이다.
도 2는 자외선 조사를 통해 주름발생을 유도한 누드 마우스에 Lipo- BMPRla ECD를 11주간 도포한 후, 단백질 도포 부위의 주름 개선 효과를 확인한 그림이다.
도 3은 Lipo-BMPRla ECD를 도포한 부위의 사진을 토대로 스코어를 부여하여 주름 개선 효과를 평가한 그래프이다.
도 4는 TNCB를 도포를 통해 아토피를 유도한 마우스에 Lipo-BMPRla ECD를 10주간 도포한 후， 단백질 도포 부위의 아토피성 피부염 질환 개선 효과를 확인한 그림이다.
도 5은 Lipo-BMPRla ECD를 도포한 부위의 사진을 토대로 스코어를 부여하여 아토피성 피부염 질환 개선 효과를 평가한 그래프이다.
도 6은 Lipo-BMPRla ECD 도포에 따른 피부 표피 두께 변화를 헤마토자일린 에오신 염색법으로 확인한그림이다.
도 7은 Lipo-BMPRla ECD 도포에 따른 피부 표피 두께 변화의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 티오레독신 -BMPRla ECD 융합단백질을 대장균에 형질전환하여 배양한 후 정제하여 SDS-PAGE 겔 상에서 확인한 그림이다.
도 9는 티오레독신 -BMPRla ECD 융합단백질을 누드 마우스에 도포하여 주름 개선 효과를 평가한 그래프이다.
도 10은 티오레독신 -BMPRla ECD 융합단백질을 도포한 부위의 사진을 토대로 스코어를 부여하여 주름 개선 효과를 평가한 그래프이다. 【발명의 실시를 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다ᅳ 실시예
실시예 1: 인간 BMPRla ECD발현백터 제조
티오레독신 -인간 BMPRla ECD 유전자 획득
.co//에서 유래하는 티오레독신 (thioredoxin, TRX) 유전자와 인간
BMPRla (bone morphogenetic protein receptor la) 단백질의 ECD(extracellular domain)를 코딩하는 DNA 절편을 융합한 형태의 DNA 절편을 GeneScript(USA)에 합성 의뢰하여 획득하였다. 티오레독신 유전자와 BMPRla ECD 유전자 사이에는 36개의 아미노산으로 이루어진 링커 부위를 포함하고 있다. E. coli. 티오레독신 단백질은 109개의 아미노산으로 구성되어 있으며， 인간 BMPRla ECD는 129개의 아미노산으로 이루어져 있다。 티오레독신 -인간 BMPRla ECD 유전자를포함하는 발현백터 제조
티오레독신 -인간 BMPRla ECD 유전자와 pET_32a (+) 백터 (Novagen, 미국)를 과 EcoRi으로 절단하고, T4 DNA 리가아제 (NEB, 미국)로 연결시킨 후, DH5a 균주 (BioPrince, 미국)에 형질전환시켰다. 그 다음， 37°C에서 15시간 동안 배양한 후, 10개의 콜로니들을 무작위로 선정하여 배양하고， 플라스미드 정제 키트 (Qiagen)를 이용하여 플라스미드를 수득한 후， 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 크기를 확인 하고 염기서열을 분석함으로써 원하는 폴라스미드를 선택하였다. 인간 BMPRla ECD 단백질 및 티오레독신 -인간 BMPRla ECD 단백질 정제
티오레독신 -인간 BMPRla ECD 유전자를 포함하는 발현백터를 발현용 균주인 Orgami B(DE3)( Novagen, USA)에 형질전환하고 대규모 배양을 하였다. 50 L 배양기에서 티오레독신 -인간 BMPRla ECD 발현백터로 형질전환된 Orgami B(DE3) 균주를 16°C에서 배양하고 발현을 유도시킨 후에， 원심분리를 통하여 세포 펠릿을 수득하였다. 버퍼 A(50mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0)로 세포 펠릿을 현탁 시킨 후에 10분씩 2번 균질기를 이용하여 800 bar에서 두 번 세포를 파쇄하고 원심분리를 통하여 상등액을 수득하였다. 버퍼 B(50 mM Tris, 0.5M NaCl, 20 mM 이미다졸， pH 8.0)와 버퍼 C(50 mM Tris, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸， pH 8.0)를 이용하여 샘플 상등액을 로딩하여 티오레독신 -인간 BMPRla ECD 단백질을 분리한 후에, TFF 시스템을 이용하여 버퍼 A로 버퍼 교환과 농축을 실시하였다. 그 다음， 1 g의 티오레독신—인간 BMPRla ECD 단백질당 2,000 유닛 트름빈을 넣어 4°C에서 하룻밤동안 반웅시킨 후， 버퍼 A와 버퍼 C를 이용하여 Ni-NTA 어피니티 컬럼 정제를 수행하고 다음에 마지막으로 버퍼 A를 이용하여 Supersex 100 컬럼을 이용하여 인간 BMPRla ECD 단백질을 정제하고 정량하였다. 실시예 2 ： 주름개선 효과 확인 실험
누드 마우스에 단백질처리
실험동물은 4주령의 자성 SKH-1 누드 마우스를 두열바이오텍에서 구입하였다 (Sungnam, Korea) . 실험동물은 24土 21： 은도, 50±10% 습도， 12시간 낮: 12시간 밤 사이클의 조건에서 사육하였으며 2주간 순치시킨 후 임의로 6개의 군으로 나누어 이후 실험을 진행하였다. 실험 그룹은 표 1과 같다.
【표 1]
Figure imgf000018_0001
R.A: 레티노산， 15 vol% 에탄을에 용해된 0.01 wt% 레티노산
4°C에서 동결건조된 상태인 BMPRla ECD 단백질을 20 mM NaH2P04[pH 7.0], 1 mM EDTA 1 L 용액에 10 g/ml의 농도로 녹인 다음， 10 g 리포좀 (Soya-SPL 75H, Onetech Co.)을 넣어서 30분 동안 교반하여 최종 1% 리포좀과 13 g/ml BMPRla ECD 단백질을 함유하는 샘플을 제조하였다. 이용된 리포좀은 콩 유래의 수첨레시틴을 주성분으로 한다. 제조한 샘플을 열교환기를 장치한 고압균질기 (NanoDeBEE, USA, Model 45-1)에서 15,000 psi 압력 하에서 5번 균질기를 통과시켜 최종 샘플을 제조하였다. 위의 조건에서 대부분의 리포좀 크기는 100-200nm 이다.
단백질 처리군 (그룹 6)， 양성대조군 (그룹 4), 그룹 3 및 그룹 5은 매주 5회 각각 300 μί을 처리하였으며， 자외선을 처리하는 경우， 자외선을 조사하기 전에 도포하였다. 샘플은 미술용 3호 붓 (Hwahong, 한국)을 이용하며 등전체에 골고루 도포 하였다. 누드 마우스에자외선조사
자외선 조사기기는 VLX-3W st imulator (Vi IberLourmat , MarnelaVal lee, 프랑스)를 사용하였다. 자외선은 주당 3회씩 총 11주간， 1-2주는 40 mJ/cm2, 3-4주는 50 mJ/cm2, 5-9주는 60 mJ/cm2, 10-11주는 70 mJ/cm2로 조사하였다.
Lipo-BMPRla ECD의 주름개선효과
매주 실험동물의 등 부위의 사진을 촬영하고， 사진을 토대로 실험에 참가하지 않는 사람이 피부의 상태를 관찰하여 UV 조사에 의해 횡으로 유발된 굵은 주름의 수， 굵기 및 깊이 항목을 종합하여 10 단계로 스코어를 부여하여 주름개선 효과를 평가하였다 (도 1-2). 육안으로 관찰하여 각 항목에 대한 평가를 종합한 결과， 자외선만 처리한 군에 비해 Lipo- BMPRla (리포좀 -BMPRla) ECD를 도포한 군에서 피부주름이 약 75% 개선됨을 확인하였다. 실시예 3: 아토피성 피부염 질환 개선효과 확인 실험
실험동물
NC/Nga 마우스 (웅성， 4주령， (주)중앙실험동물， 한국)를 24±2C 온도， 50 ±10% 습도， 12시간 낮: 12시간 밤 사이클의 조건에서 2주간 순치시킨 후 실험에 사용하였다. 2주간 순치시킨 마우스의 체중을 측정하여 표 2와 같이 다섯 그룹으로 나누었다. 【표 2】
Figure imgf000020_0001
- TNCB( 1 , 3 , 5-t r i n i t r ochl or obenzene , Sigma, 미국): 아토피 유도 물질
- FK506: 양성대조군으로서 T cell 면역 억제제 아토피 유도 및 샘플도포
아토피성 피부염 질환을 유도하기 위해， 먼저 제모제를 이용하여 실험동물의 등부위의 털을 제거하고， 4% SDS용액을 도포하고 건조시킨 후， 5% TNCB (아세톤: 에탄올 = 1:4에 용해)를 150 ≠ 도포하였다. 5일 후， 일주일 간격으로 총 5회， 1% TNCB (을리브 오일에 용해), 150 ^를 도포하여 아토피를 유도하였다, 5주 동안 TNCB를 도포하여 아토피를 유도한 후, FK506 및 Lipo-BMPRla ECD를 각각주 5회씩 10주 동안 도포하였다,
Lipo-BMPRla ECD의 아토피성피부염 질환개선효과
매주 실험동물의 등 부위의 사진을 촬영하고， 사진을 토대로 실험에 참가하지 않는 사람이 피부의 상태를 관찰하여 흥반， 부종， 찰과상， 건성의 네 가지 항목을 종합하여 10단계로 스코어를 부여하여 아토피 증상을 평가하였다 (도 3-4). 육안으로 관찰하여 각 항목에 대한 평가를 종합한 결과， TNCB만ᅮ처리한 군ᅩ에 비해 Lipo-BMPRla ECD 도포한 군에서 아토피성 피부염 질환 상태가 약 60% 감소함을 확인하였다. 실시예 4: 피부 표피 두께 측정 실험
실험동물
SKH-1 누드 마우스 (자성, 4주령, 두열 바이오텍, 한국)를 24±2C 온도， 50 ±10% 습도, 12시간 낮: 12시간 밤 사이클의 조건에서 2주간 순치시킨 후 임의로 6개 군으로 분리하여 실험에 사용하였다.
【표 3】
Figure imgf000021_0001
샘플도£
단백질군 및 대조군은 매주 5회에 걸쳐 해당 샘플을 각각 300 μΐ씩 처리하였으며， UV를 처리하는 날은 UV 조사 한 시간 전에 샘플을 미리 준비된 샘플을 미술용 3호 붓 (Hwahong, Incheon, Korea)을 이용하며 등 전체에 골고루 도포하였다. 누드 마우스에자외선조사
자외선 조사기기는 VLX-3W stimulatorCVilber Lourmat , Marne la Vallee, France)를 사용하였다. 자외선은 주당 3회씩 총 11주간, 1-2주는 40 mJ/cm2, 3-4주는 50 mJ/cm2, 5-9주는 60 mJ/cm2, 10-11주는 70 mJ/cm2로 조사하였다. 마우스 피부 염색
상기 6군의 동물 그룹에 대한 3개월 실험이 끝난 후에， 종래에 알려진 방법에 띠:란ᅵ혜만토자일. 에오신 염색을 수행하 ¾다. Lipo-BMPRla ECD의 피부 두께증가 억제
헤마토자일렌 에오신 염색 결과 Lipo-BMPRla ECD를 도포한 군에서는 UV 조사에 의해 피부 표피가 두꺼워지는 것이 크게 억제되는 것으로 나타났으며， 그 효과는 레티노산을 처리한 군과 비교하였을 때， 동등 이상을 나타냈다 (도 6-7). 실시예 5: 티오레독신 -인간 BMPRla ECD의 주름개선효과 측정 . 실험동물
SKH-1 누드 마우스 (자성, 4주령, 두열 바이오텍, 한국)를 24±2C 온도， 50 ±10% 습도， 12시간 낮: 12시간 밤 사이클의 조건에서 2주간 순치시킨 후 임의로 6개 군으로 분리하여 실험에 사용하였다.
【표 4】
Figure imgf000022_0001
샘폴도 f
단백질군 및 대조군은 매주 5회에 걸쳐 해당 샘플을 각각 300 μΐ씩 처리하였으며， UV를 처리하는 날은 UV 조사 한 시간 전에 샘플을 미리 준비된 샘플을 미술용 3호 붓 (Hwahong, Incheon, Korea)을 이용하며 등 전체에 골고루 도포하였다. 누드 마우스에자외선조사
자외선 조사 기기는 VLX-3W stimulator(Vilber Lourmat , Marne la
Val lee, France)를 사용하였다. 자외선은 주당 3회씩 총 11주간, 1-2주는, 40 mJ/cm2, 3-4주는 50 mJ/cm2, 5-9주는 60 mJ/cm2, 10-11주는 70 mJ/cm2로 조사하였다. Lipo-티오레독신 -BMPRla ECD의 주름개선효과
매주 실험동물의 등 부위의 사진을 촬영하고， 사진을 토대로 실험에 참가하지 않는 사람이 피부의 상태를 관찰하여 UV 조사에 의해 횡으로 유발된 굵은 주름의 수， 굵기 및 깊이 항목을 종합하여 10단계로 스코어를 부여하여 주름개선 효과를 평가하였다 (도 9-10). 육안으로 관찰하여 각 항목에 대한 평가를 종합한 결과, 자외선만 처리한 군에 비해 피부주름이 레티노산을 도포한 군에서 약 38%， Lipo-BMPRla ECD를 도포한 군에서 약 42%, Lipo-티오레독신 -BMPRla ECD를 도포한 군에서 약 59% 개선됨을 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선용 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 피부 상태 개선용 조성물은 피부국소표면 투여 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 리포좀에 포위된 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 4】
제 3 항에 있어서， 상기 리포좀은 나노리포좀인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서, 상기 나노리포좀은 레시틴을 구성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 6]
제 1 항에 있어서， 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부표피 두께 또는 피부염 질환一 ᅵ개선인 것을 특징으로 한는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 피부염 질환은 아토피성 피부염인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 8]
제 1 항에 있어서， 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물인 것올 특징으로 하는 피부 상태 개선용 조성물.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서， 상기 단백질은 티오레독신 (thioredoxin) 단백질이 결합된 융합단백질인 것을 톡징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 티오레독신 (thioredoxin) 단백질이 결합된 융합단백질.
【청구항 11】
서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태 (conditions) 개선 방법.
【청구항 12]
제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 피부국소표면 투여 조성물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13]
제 11 항에 있어서， 상기 서열목록 제 1서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 리포좀에 포위된 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14]
제 13 항에 있어서， 상기 리포좀은 나노리포좀인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 15]
제 14 항에 있어서， 상기 나노리포좀은 레시틴을 구성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16】
제 11 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선， 피부표피 두께 또는 피부염 질환 개선인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17]
제 16 항에 있어서， 상기 피부염 질환은 아토피성 피부염인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 18]
제 11 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 19】
제 11 항에 있어서， 상기 단백질은 티오레독신 (thioredoxin) 단백질이 결합된 융합단백질인 것을 특징으로 하는 방법。
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