KR102143557B1

KR102143557B1 - 인간 열 활성화 단백질 90a의 절편을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102143557B1
Application number: KR1020130094930A
Authority: KR
Inventors: 남기범; 이균영; 조영욱; 오달균
Original assignee: 주식회사 리제론
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2020-08-12
Also published as: EP3030253B1; US20170087211A1; CN105813649A; WO2015020499A1; EP3030253A4; RU2016108144A3; CN105813649B; JP6516742B2; RU2016108144A; JP2016527309A; EP3030253A1; CA2924146A1; KR20150018255A; US9956263B2

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선, 및 피하지방 감소촉진 또는 증가억제용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 아토피성 피부의 치료 또는 개선, 주름개선, 미백 개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선 및 피부노화 방지와 같은 다양한 피부 상태의 개선효능, 및 피하지방 감소촉진 또는 증가억제에 효능을 발휘한다.

Description

인간 열 활성화 단백질 90A의 절편을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN CONDITIONS COMPRISING A FRAGMENT OF HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN 90A AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선, 및 피하지방 감소촉진 또는 증가억제용 조성물에 관한 것이다.

생명과학과 바이오산업의 비약적인 발전에 따라, 종래 표면적인 미용에 국한되어 있던 화장품의 역할이 이제 노화개선 효능까지 표방하고 나설 수 있게 되었다. 인체성장인자와 같은 인체 단백질은 분자량이 너무 커서 피부장벽을 통과할 수 없고 설령 일부가 피부 속으로 들어갔다 하더라도 인체 내에서 쉽게 빨리 생분해되기 때문에, 인체 내에서의 잠재적 부작용 및 장기적 안전성 문제에 대한 우려가 극히 적다. 또한, 이러한 인체 단백질들은 그 다양성과 함께 면역 반응으로 인한 부작용에 대한 염려가 거의 없기 때문에 화장품 원료로서는 최적의 후보물질이다.

아토피성 피부염은 주로 유아 및 소아에서 발생하며 성인에게까지도 유발하는 만성 피부염으로서, 아직도 그 원인과 치료가 명확히 알려져 있지 않은 난치성 피부 질환이다. 아토피성 피부염 치료에 유용한 신물질 개발의 요구가 지속되고 있지만, 국내에서의 신물질 개발은 아직도 미미한 상태여서 아토피성 피부염의 치료제는 주로 수입에 의존하고 있는 실정이다. 대표적인 아토피성 피부염 치료제의 원료로는 항히스타민 계열 물질, 스테로이드 계열 물질, 면역억제제 등이 있다. 그러나 이러한 물질들은 장기간 투여로 인한 인체 면역시스템의 전반적인 기능저하를 불러오는 부작용을 유발할 수 있기 때문에, 이러한 부작용을 회피할 수 있는 새로운 신약 및 개량 신약의 개발이 필요하다.

한편, 열 활성화 단백질 90A(Heat Shock Protein 90a, 이하 "HSP90a"로 지칭함)는 인산기가 붙어 있는 형태로 서로 결합되어 있는 이중체(dimer)를 형성하며, 특정 조건하에서는 여러 형태가 결합되어 있는 복합체(oligomer)로 변하는 특징을 갖는다. 일반적으로 열 활성화 단백질들은 세포 내에서 작용하는 것으로 알려져 있지만, 세포 밖으로 분비되는 열 활성화 단백질들이 알려지게 되면서 이전과 다른 새로운 기능을 수행한다고 하는 사실이 알려지게 되었다. 이러한 기작의 대표적인 예로서 Cheng CF 등은 세포 밖으로 분비되는 인간 열 활성화 단백질 90a의 전체 단백질 부위 중 링커 및 중간 도메인 부위에 걸쳐 있는 115개의 아미노산 절편이 전체 인간 열 활성화 단백질 90a와 동일하게 당뇨성 피부괴사를 일으키는 마우스의 상처 치유에 매우 뛰어난 효능을 보인다고 보고하였다(문헌[Cheng CF 등, J Clin Invest., 121(11):4348-61, 2012] 참조). 그러나, 인간 열 활성화 단백질 90a의 면역 반응 억제 효과에 대해서는 현재까지 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 인체 단백질을 이용한 화장품 또는 약학 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 인간 열 활성화 단백질 90a 절편이 피부 진피의 분화는 촉진시키지만 피하층 지방전구세포의 분화는 억제하며, 면역세포의 피부 침윤 및 기능을 억제하여 아토피의 진행 정도를 억제시킨다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아토피 피부염의 치료나 피부 상태 개선에 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피하지방 축적 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피하지방 감소촉진 또는 증가억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 피부 세포에 작용하여 자외선에 의해 손상된 피부와 노화로 인한 주름을 개선하고, 피부 탄력을 개선하거나 피부 미백 개선 작용을 하며, 아토피성 피부염 치료에 효능을 나타낼 수 있으므로 피부 상태를 크게 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라, 피하지방 감소를 촉진시키는 데에도 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 인간 열 활성화 단백질 90a(HSP90a)의 전체 아미노산 서열로부터 236 내지 350번째에 해당하는 본 발명의 HSP90a 절편(HPf) 부위를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 HPf와 융합 파트너로서 티오레독신(TRX)을 재조합하여 형성된 재조합 단백질 TRX-HPf의 제조공정을 나타낸다.
도 3은 재조합 단백질 TRX-HPf의 발현 유무를 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.
도 4는 발현된 재조합 단백질이 HSP90a에서 유래한 것인지 확인하기 위해 수행된 면역블롯 결과이다.
도 5는 HPf를 대량생산하기 위해 수행한 50L 발효공정 및 그 결과물을 나타내는 도면이다.
도 6은 HPf의 정제 과정을 나타내는 도면이다.
도 7은 최종적으로 정제된 HPf의 순도를 확인하기 위해 HPLC 및 SDS-PAGE 수행 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 생산된 재조합 단백질이 HSP90a에서 유래한 것인지 확인하기 위해 수행된 MALDI-TOF 분석 결과이다.
도 9는 HPf의 입자크기를 ELS (빛 강도, 입자 질량 및 입자 수) 및 GFC로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10A는 HPf 농도에 따른 상피세포주 및 진피세포주의 24시간 세포 생존율 결과이고, 도 10B는 HPf 농도에 따른 진피세포주의 48 내지 168시간 세포 생존율 결과이다.
도 11은 온도 및 시간에 따른 겔 및 버퍼 형태의 HPf 안정성을 분석한 도면이다.
도 12는 RBL-2H3 세포주에서의 탈과립화 저해 능력을 β-헥소사미니다제 분비 활성을 측정하여 확인한 도면이다.
도 13은 DNFB 도포에 의해 피부 손상이 유발된 NC/Nga 마우스에 HPf를 처리한 후 아토피 치료능을 육안으로 관찰한 도면이다.
도 14는 DNFB 도포에 의해 피부 손상이 유발된 NC/Nga 마우스에 HPf를 처리한 후 피부조직내 변화를 관찰한 도면이다.
도 15는 상피세포주(HaCaT)와 진피세포주(CCD986-sk)에서 HPf 처리에 따른 KRT10, TGM 1 및 IVL 유전자 발현량을 나타내는 도면이다.
도 16은 HPf의 지방 세포분화 능력을 오일 레드 O 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 17은 3D 인공피부배양 실험에서 HPf 처리에 따른 세포분화 정도를 나타내는 도면이다.
도 18은 HPf의 멜라닌 생합성 저해능력을 확인한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피하지방 감소촉진 또는 증가억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질은 인간 열 활성화 단백질 90A의 절편(Heat shock protein 90A fragment, 이하 "HPf"로 지칭함)인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용된 용어 "인간 열 활성화 단백질 90A의 절편" 또는 "HSP90a 절편"은 인간 열 활성화 단백질 90a의 전체 아미노산 서열 일부를 유전공학적 방법이나 생화학적 방법에 의해 제거시킨 HSP90a를 지칭하며, "HPf"와 혼용하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 HPf는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 HSP90a의 전체 서열로부터 236번째 내지 350번째의 115개의 아미노산에 해당하는 절편인 것을 특징으로 한다(도 1 참고).

본 발명의 HSP90a 절편은 두 가지 방법 중 하나에 의하여 특정될 수 있다. 하나는 HSP90a 절편 결합 단백질 또는 HSP90a 절편 수용체와 결합하는지의 여부에 의하여 특정될 수 있고, 다른 하나는 HSP90a 절편의 생물학적 활성 측정방법에 의하여 특정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리포좀 조성을 갖는다. 즉, 유효 성분인 서열번호 1로 표시되는 단백질은 리포좀에 포위되어 피부에 적용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 보다 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 나노 리포좀에 포위된 나노 리포좀의 조성을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "나노 리포좀"은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 20 내지 1000 nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 나노 리포좀의 평균 입자 지름은 50 내지 500 nm, 바람직하게는, 50 내지 350 nm, 100 내지 250 nm일 수 있다.

리포좀은 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 베시클(vesicle)로 정의되는데, 수용성 헤드(친수기)와 불용성 테일(소수기)을 가진 양친매성 분자로 구성된 리포좀은 이들의 상호작용에 의하여 자발적으로 결합하여 정렬된 구조를 보이며, 그 크기와 적층성(Lamellarity)에 따라 SUV(Small Unilamellar Vesicle), LUV(Large Unilamellar Vesicle) 및 MLV(Multi Lamellar Vesicle)로 분류된다. 이와 같이 다양한 적층성을 나타내는 리포좀은 세포막과 유사한 이중막 구조를 갖는다.

본 발명에서 (나노)리포좀은 인지질, 폴리올, 계면활성제, 지방산 또는/및 물을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질 (예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린 등) 및 합성 인지질(예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴 등)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 폴리올은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제(예: 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트 등), 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제(예: 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르 등)가 사용될 수 있다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C_12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 나노(리포좀)은 인지질과 물만으로 제조되는데, 이의 구체적인 예는 하기의 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 HSP90a의 절편(HPf) 함유 나노 리포좀은 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정을 통해 제조된다: (a) 리포좀을 형성할 수 있는 인지질(바람직하게는, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴)을 HSP90a 절편을 함유한 수용액에 용해하는 단계; 및 (b) HSP90a 절편과 인지질을 함유한 수용액을 고압균질기에 반복적으로 통과시키되, 통과 회수에 따라 인지질의 함량과 고압균질기의 압력을 점차적으로 증가시켜 HSP90a 절편을 함유하는 나노 리포좀을 제조하는 단계.

단계 (a)에서 HSP90a 절편을 함유하는 수용액은 pH 6 내지 8, 바람직하게는 약 pH 7의 완충액(예컨대, 소듐 포스페이트 완충액)이 바람직하다. 소듐 포스페이트 완충액이 이용되는 경우, 그 농도는 5 내지 100 mM, 5 내지 60 mM, 10 내지 30 mM일 수 있으며, 가장 바람직하게는 약 20 mM이다.

상기 방법에 있어서, 가장 특이한 측면은 인지질과 HSP90a 절편-함유 수용액의 혼합물을 고압균질기에 수회 통과시키는데, 통과 횟수가 증가함에 따라 인지질의 양과 균질기의 압력을 순차적으로 증가시키는 데에 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 균질기의 압력은 0 내지 1000 bar, 바람직하게는 0 내지 800 bar까지 순차적으로 증가시킨다. 압력은 50 bar 또는 100 bar, 바람직하게는 100 bar씩 증가시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 인지질의 양은 5 내지 40 w/v(%), 바람직하게는 5 내지 30 w/v(%)까지 순차적으로 증가시킨다. 이러한 순차적인 인지질 함량과 압력의 증가가 있는 고압균질 공정을 통해, HSP90a 절편 함유 나노 리포좀이 제조되며, 바람직하게는 액상의 HSP90a의 절편-함유 나노 리포좀이 제조된다.

기존에 알려져 있는 항히스타민이나 스테로이드 계열의 물질들이 면역 억제의 기능만 있는 것에 반해, 본 발명의 조성물은 면역억제의 기능과 동시에 상처 치유 능력을 같이 보이므로 아토피 피부염과 같은 난치성 피부질환에 매우 최적화된 물질이다.

따라서, 본 발명의 조성물은 다양한 피부 상태(conditions)의 개선에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 아토피성 피부의 치료 또는 개선, 주름개선, 미백 개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 또는 이들의 조합에 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 아토피성 피부의 개선, 주름개선, 피부탄력 개선 또는 이들의 조합에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 피하지방 감소촉진 또는 증가억제에 이용될 수 있으며, 이에 따라 비만, 셀룰라이트(Cellulite), 하지정맥류, 및 하지정맥류에 의한 하지부종, 피부 착색, 정맥성 습진, 피부경화증, 혈전염, 피부궤양, 만성통증, 다리 기능저하와 같은 합병증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 증상의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효 성분으로서 HSP90a 절편-함유 리포좀 (Lipo-HSP90a) 이외에도 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 담체 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 나노 리포좀을 포함하는 용액 형태가 가장 바람직하다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 예컨대, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 겔라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 상기 부형제는 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학 조성물은 피부투여 목적으로 개발되었다. 본 발명의 조성물은 피부의 국소표면에 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물의 피부 투여량은 바람직하게는 1일당 HPf 10 pg/cm² 내지 1 mg/cm², 1 ng/cm² 내지 10 μg/cm², 가장 바람직하게는 10 ng/cm²내지 1 μg/cm²일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(ⅰ) 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 피부 상태 개선용 조성물은 피부 세포에 작용하여 자외선에 의해 손상된 피부와 노화로 인한 주름을 개선하고, 피부 탄력을 개선하거나 미백 개선의 작용을 하며, 아토피성 피부염 치료의 효능을 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 상태를 크게 개선시킬 수 있다.

(iii) 또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피하지방 감소촉진 또는 증가예방용 조성물을 제공한다.

(iv) 본 발명의 조성물은 피부 세포에 작용하여 피하지방 감소 촉진 또는 증가억제 효능을 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 비만, 셀룰라이트, 하지정맥류, 및 하지정맥류에 의한 하지부종, 피부 착색, 정맥성 습진, 피부경화증, 혈전염, 피부궤양, 만성통증, 다리 기능저하 등의 합병증을 예방 또는 치료하는데 효능을 나타낼 수 있다.

(v) 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 나노 리포좀으로 제조되는 경우에는 안정성 또한 매우 탁월하다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HSP90a의 절편 유전자 확보

1-1) HSP90a의 절편 유전자의 증폭

서열번호 2의 아미노산으로 표시되는 인간 열 활성화 단백질 90a(UniProt id: P07900)에서 236번째(Glu) 내지 350번째(ASP)까지의 115개의 아미노산만을 본 발명에 따른 대상 단백질(HPf)로 선정하였다. HPf 유전자를 대량 생산하기 위하여, 상기 HPf의 유전자를 클로닝한 후 단백질 발현용 대장균 숙주에 형질전환시켰다.

구체적으로, 인간 cDNA 라이브러리로부터 유전자를 클로닝하기 위하여, HEK(Human Embryonic kidney) 293 세포주(CRL-1537, ATCC, USA)를 약 3일 동안 6-웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 배지 상층액을 제거하고 TRizol 용액(Invitrogen, USA) 1ml를 첨가하여 세포를 녹여 내었다. 여기에 다시 200 μl의 클로로포름을 첨가한 후 10초간 강하게 볼텍싱(vortexing)하고 12,000 x g(Centrifuge 5418, eppendorf, USA)에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 새로운 E-튜브에 옮긴 후, 0.5 ml 이소프로필 알콜을 첨가하고 12,000 x g에서 10분간 원심분리하여 전체 RNA를 침전시켰다. 70% 에탄올을 이용하여 1회 세척한 후 DNase, RNase-무함유 물(DNase, RNase-free water)을 이용하여 RNA를 녹여내었다. 이렇게 정제된 RNA를 이용하여 세포의 cDNA 라이브러리를 제작하는 과정을 거쳤다.

cDNA의 합성은 옴니스크립트 역전사 키트(Omniscript Reverse Transcription kit, Qiagen, USA)를 이용하여 제작하였으며 제조 방법은 제조사의 매뉴얼을 참조하였다. 우선 총 RNA (1μg), 1 x RT 버퍼, dNTP mix, 올리고-dT 프라이머, RNase 억제제(Promega, USA) 및 옴니스크립트 역전사효소를 첨가한 후 DNase, RNase-무함유 물을 이용하여 전체 볼륨을 20μl로 맞춘 후 37℃에서 60분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR로 클로닝할 유전자를 합성하였다. PCR 반응물의 조성은 전체 100μl의 용액 안에 1 x PCR 버퍼, 6.4 μl의 2.5 mM dNTP mix, 주형(cDNA), 0.8μl의 100 pmole 프라이머 스톡(primer stock, 서열번호 4 및 5) 및 0.4 μl의 프루프-리딩 Taq 폴리머라제(TAKARA, Japan)이며, PCR 조건은 변성(95℃, 30초), 어닐링(60℃, 30초) 및 증폭(72℃, 45초)을 1싸이클로 하여 35회 반복하여 HPf 유전자를 증폭시켰다. 이어, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 유전자 증폭 여부를 확인하였다. HPf의 염기서열은 서열번호 3으로 표시되고 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된다.

1-2) 재조합 단백질의 제조

상기 1-1에서 수득한 HPf 유전자(서열번호 4와 5의 프라이머를 이용하여 증폭한 서열번호 3의 유전자)를 단백질 발현용 벡터인 pNKmut 플라스미드(대한민국 특허출원공개 제 2006-0089086호)에 DNA 제한효소 NdeI과 K pnI을 이용하여 클로닝하였다(도 2).

티오레독신 A와 융합 단백질로 발현시키기 위하여, 우선 티오레독신 A(TRX, pET-32a, Novagen, USA) 유전자를 증폭시키기 위해서는 서열번호 6 및 7의 프라이머 및 주형으로 pET-32a(0.1 μg)을 이용하여, 상기 1-1과 동일한 방식으로 PCR을 수행하여 서열번호 9의 염기서열을 갖는 TRX 유전자를 수득하였다. TRX 유전자와 융합하는 HPf 유전자에 TEV 단백질 분해효소(Tabacco etch Virus protease) 인식부위를 삽입하기 위해 서열번호 5 및 8의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다.

이렇게 획득한 HPf 및 융합 파트너로서 TRX를 재조합 단백질로 연결시키기 위하여, 주형으로 상기 2가지 유전자를 1:1 비율로 첨가한 후, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 상기 1-1과 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 이때, 이들 사이에 TEV 단백질 분해효소 인식부위(서열번호 10)를 삽입하여 추후 최종 HPf의 정제를 용이하게 하였다. PCR에 사용된 프라이머들의 염기서열은 하기 표 1과 같다.

프라이머명	서열	서열번호
HPf-up	5'-GAGACATATGGAAGAAAAGGAAGACAAAGAAGAAGAA-3'	4
HPf-dn	5'-TATAGGTACCTTAATCAAAAGGAGCACGTCGTGGGACA-3'	5
TRX-up	5'-TTAATTCATATGAGCGATAAAATTATTCACC-3'	6
TRX-dn	5'-CTGGAAGTACAGGTTTTCGGATCCATTACCGTTTTTGAACAGCAGCAG-3'	7
HPf-TEV-up	5'-GGATCCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTGAAGAAAAGGAAGACAAAGAAGAAGAA-3'	8

이어, 재조합 유전자 TRX-HPf를 DNA 제한효소 NdeI과 KpnI을 이용하여 pNKmut 벡터에 클로닝한 후, 클로닝된 HPf 및 TRX-HPf 클론의 염기서열을 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인한 결과 각 유전자의 염기서열이 100% 일치함을 알 수 있었다. 이렇게 확인된 각 클론을 단백질 발현용 대장균주인 RZ4500(고려대학교 생명공학연구소, 한국)에 형질전환시켰다. 5 ml의 루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지에서 37℃에서 16시간 배양시킨 후, HPf 및 TRX-HPf에서 발현되는 단백질량을 SDS-PAGE를 이용하여 비교 분석하였다.

그 결과, TRX-HPf의 재조합 단백질이 RZ4500에서 잘 발현됨을 확인하였으며, 이에 따라 RZ4500에 형질전환시킨 TRX-HPf 발현용 균주를 본 발명의 HPf 대량 생산용 균주로 사용하였다.

실시예 2: 항체를 이용한 후보 단백질의 발현 확인

상기 실시예 1에서 발현된 재조합 단백질이 HPf와 동일한 단백질인지를 확인하기 위해, HPf에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯(Immunoblot)을 수행하였다(도 3).

재조합 HPf 및 재조합 단백질 TRX-HPf를 발현하는 대장균(RZ4500) 각각을 앰피실린이 첨가된 LB 배지 5 ml에 접종한 후 37℃ 배양기를 이용하여 약 16시간 진탕 배양하였다. 이어, 배양액 0.5 ml을 회수하여 원심분리한 후, 시료 10 μl를 회수하여 SDS-PAGE 및 전기영동하였다. 전기 영동한 겔을 다시 PVDF 막(Millipore, USA)으로 전기영동(12V, 2시간 30분)하여 단백질을 전이시키고, 비-특이적인 항체 결합을 억제하기 위하여 블로킹 버퍼(10% 탈지우유, 0.02% 트윈-20 함유 트리스완충식염수)로 1시간 반응시켰다. 그 후 PVDF 막을 HPf에 특이적인 항체(Rabbit anti-HSP90 antibody, CalbioChem, USA)로 상온에서 1시간 30분간 반응시키고, 비-특이적 결합을 제거하기 위하여 세척 완충액(0.02% 트윈-20 함유 트리스 완충식염수)으로 10분간 3회 세척하였다. 이어, 2차 항체인 염소 항-면역글로불린(HRP-linked, KOMA, Korea)을 첨가하여 다시 1시간 반응시킨 후 세척 완충액으로 3회 세척하였다.

최종 발색과정은 화학 발광(Chemiluminescence, LAS-4000, Fuji, Japan)을 이용하여 확인하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, HPf만을 단독으로 발현시킨 것과 재조합 단백질(TRX-HPf)의 형태로 발현시킨 것 모두 항체에 의해 정확히 인지되는 것을 확인하였다.

실시예 3: HPf의 대량 발현

상기 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방식으로, HPf 유전자를 포함하는 재조합 단백질 발현용 벡터를 발효용 대장균 균주(RZ4500)에 형질전환시킨 후, 재조합 단백질의 발현이 극대화되도록 유도하는 조건을 탐색하였다. 구체적으로, 상기 대장균 균주를 1 L 플라스크 배양(LB 배지, pH7.5), 7 L 발효기(FMT-07/C-B, Fermentec, Korea) 및 최종 50 L 발효기(FMT-50, Fermentec, Korea)를 이용하여 순차적으로 배양하였다. 이때, 50 L 발효기에 사용된 발효용 배지의 조합은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.

성분	% (W/V)
NaHPO₄	0.7
KH₂PO₄	0.3
NH₄Cl	0.1
NaCl	0.05
NaNO₃	0.1
효모 추출물	4
글리세롤	2
물	to 100
pH	7.2

먼저, 50L 발효기에 접종하기 위한 종균 배양(seed culture) 배지는 1 L 플라스크를 이용하여 앰피실린이 포함된 LB 배지(pH7.4) 500ml에 TRX-HPf 재조합 단백질을 발현하는 대장균 균주(RZ4500, 글리세롤 스톡) 1 ml을 접종한 후, 37℃ 배양기에서 6시간 동안 진탕배양(OD₆₀₀= 0.5 ~ 0.6)하였다. 그 후 50 L 발효기로 계대 배양을 진행하였다 (종균 배양액 : 50 L 배양기 배양액 = 1 : 100).

종균 배양액을 첨가한 직후, 50 L 배양기의 용존 산소량을 100%으로 환산할 때 배양 시간이 늘어남에 따라 용존 산소량은 서서히 낮아졌으며 약 15시간이 되었을 때 약 10%의 용존 산소량을 나타내었다(도 5). 이때 멸균된 100% 글리세롤 용액을 100 ~ 200 ml 첨가하여 발효용 균주의 카본 소스를 보충해 주었다.

배양시간이 15시간째부터는 1시간 단위로 배양액 일부를 샘플링하여 pH, 용존 산소량 및 그리고 O.D.값을 측정하여 발효균의 성장 곡선을 확인하였다(도 5). 최종적으로 O.D.값이 35 ~ 40에 이르렀을 때 발효 공정을 중지하였다. 이때 발효액 일부를 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 수행하였다.

이어, 발현된 단백질을 정량화하기 위하여 농도를 알고 있는 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma, USA)를 대조군으로 하여 발현량을 덴시토미터(TotalLabQuant, Totallab, USA)를 이용하여 측정한 결과, 재조합 단백질의 양은 > 1 g/L이었다.

실시예 4: HPf 절편의 정제 및 최적화

HPf의 대량 발현된 대장균을 회수한 후 멸균된 증류수에 현탁하였다. 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄한 후 초고속 원심분리기(hanil, Korea)를 이용하여 0.5% 트리톤 X-100 용액으로 1회 세척 후 상층액을 제거하고 침전물인 대장균 봉입체(Inclusion body)만을 회수하였다. 이렇게 회수한 대장균 봉입체를 가용액 (25 mM NaOH)에 용해시키고 10% 아세트산을 이용하여 중화시킨 후 불순물을 제거시키기 위하여 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 각 정제 단계에서 일정량을 샘플링하여 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, HPf는 대장균 세포질(cytosol)이 아닌 대장균의 봉입체 내로 발현되며(레인 4 및 5), 알칼리 조건에서의 용해 및 중화과정 (renaturation)으로 정상적인 단백질 구조를 다시 이루는 것을 확인하였다(레인 7). 또한, 재조합 단백질에서 HPf만을 순수 분리하기 위하여 TEV 프로테아제(TRX-HPf : TEV 프로테이제 = 10 : 1)를 첨가하여 4℃에서 24시간 반응시킨 후 SDS-PAGE 이용하여 단백질 절단 유무를 확인하였으며(레인 8-11), 겔 여과 크로마토그래피로 HPf만을 정제하였다.

도 6에서 각 레인은 다음과 같다: 레인 1(단백질 마커), 레인 2(음성 대조군으로서 경쟁세포(competent cell)), 레인 3(전체 세포 용해물), 레인 4(균질화 후의 상층 분획), 레인 5(봉합체의 음파처리 후 펠렛), 레인 6(펠렛의 세척액), 레인 7(수용화된 봉합체) 및 레인 8-11(수용화된 봉합체 + TEV 프로테아제).

정제된 HPf의 순도 및 양을 확인하기 위해, HPLC 및 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과(도 7), HPf는 순도 >95% 이상, 정제율 약 0.1 내지 0.2 g/L으로 나타났다.

실시예 5: HPf의 MALDI-TOF 분석

HPf의 효능 및 안정성 평가에 앞서서, 최종적으로 정제된 HPf가 HSP90a의 절편인지를 확인하기 위하여 MALDI-TOF (Voyager-DE STR, Applied BioSystems, USA) 분석을 실시하였다.

상기 실시예 4에서 정제된 HPf를 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동한 후, 날카로운 칼을 이용하여 겔 상에서 해당 단백질을 잘라내었다. 잘라낸 겔을 0.1M 중탄산 암모늄 용액에 1시간 동안 담가 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 다시 50% 아세토니트릴 함유 0.1M 중탄산 암모늄 용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 100% 아세토니트릴 용액에 약 15분간 반응시킨 후, 상층액을 제거하고 0.01% 단백질 서열 그레이드 트립신(Promega, USA) 함유 25 mM 중탄산 암모늄 용액에서 약 16시간(37℃) 동안 반응시켜 인-겔 트립신 분해(in-gel trypsin digest)를 수행하였다. 그 후 60% 아세토니트릴 함유 5% TFA 용액을 첨가한 후 원심 분리하여 상층액만을 회수하여 MALDI-TOF 분석을 위한 질량분석 과정을 수행하였다.

이어, 트립신에 의해 잘려진 각 펩타이드들의 질량을 측정한 후, 단백질 질량분석 데이터 베이스를 통해 단백질의 신원을 확인한 결과, 정제된 HPf가 HSP90a의 절편인 것으로 판명되었으며 이를 바탕으로 재조합 단백질의 안전성 및 유효성 검사를 실시하였다(도 8).

실시예 6: HPf의 입자크기 분석

HPf를 포함하는 나노 리포좀 캡슐레이션 및 화장품 제형을 제조하기 위하여, 정제된 단백질의 수용액 상에서의 크기를 확인하였다. 수용액 상에서의 최종적으로 정제된 HPf의 크기를 나노 입도분석기를 이용하여 측정하였다.

최종적으로 정제된 HPf를 인산완충용액(Phosphate buffered saline; pH 7.2)에 1 mg/ml 이상의 농도로 희석한 후, 나노 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer, ELS-8000)를 이용하여 ELS의 빛 강도(LS Intensity), 입자의 질량(Weight) 및 입자 수(Number) 등의 기준을 고려하여 입자의 크기를 판별하였다. 그 결과, 대략 10-14 nm 정도의 단백질 크기를 나타내었다(도 9A 내지 9C).

HPf 단량체(nomomer)의 3차원 입체구조를 소프트웨어 프로그램(UCSF Chemera)을 이용하여 살펴보면 대략 4.4 nm 정도의 크기로 존재한다. 실제 단량체와 수용액 상에서의 단백질 크기가 차이나는 이유가 HPf가 복합체(oligomer) 상태로 존재할 가능성이 있기 때문에, 겔 여과 크로마토그래피(GE, USA)를 이용하여 단백질의 크기를 분석하였다. 그 결과 비교 대조군으로 사용된 블루 덱스트란(200 kDa, Sigma-Aldrich, USA)보다 약간 크기가 작은 피크 위치에 HPf가 걸쳐 나오는 결과를 보였다(도 9D). 이와 같은 결과는 수용액 상에서 HPf가 단량체로 존재하지 않고 여러 개가 결합되어 있는 복합체(oligomer)로 존재함을 보여준다.

실시예 7: 피부세포를 이용한 HPf의 안전성 평가

인간 상피세포주(HaCaT)(문헌[Schoop, Veronika M., Journal of Investigative Dermatology., 112 (3): 343-353] 참조) 및 진피세포주(HEF)(CRL-7039, ATCC, USA)를 이용하여 HPf의 안전성 평가를 실시하였다.

각 세포주에 처리하는 HPf는 (주)리제론에서 제조하고 있는 상피세포성장인자(Epidermal growth factor, EGF) 화장품 소재 농도(Clairesome-EF, 1-10 μg/ml)의 10-100 배수 이상을 최대 7일 동안 처리하여 세포의 최종 독성을 확인하였다. 구체적으로, 10% FBS(Fetal Bovine Serum Albumin, Hyclone, USA) 함유 DMEM(Hyclone, USA) 배지를 이용하여 각 세포주를 96웰 세포 배양 플레이트에 2~10 x 10³ 세포/웰이 되게 접종한 후 HPf를 각 농도별(0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 50 및 100 μg/ml)로 처리하고 37℃ CO₂ 배양기에서 약 1주일간 배양하여 세포의 성장을 확인하였다.

세포의 성장률(%)의 측정은, 5 mg/ml의 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸일-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, Sigma-Aldrich, USA) 용액을 96-웰 플레이트 배지 100μl 당 10μl씩 처리한 후 37℃ CO₂ 배양기에서 4시간을 반응시킨 후 불용성 MTT 침전물을 용해 버퍼(10% 트리톤X-100 및 0.1N HCl)로 녹인 후 분광 광도계(Molecular Device, USA)로 595 nm에서 O.D. 값을 측정하였다.

그 결과, 24시간 동안 HPf(100 μg/ml)를 2종류의 인간 피부세포주에 처리하여도 세포의 생존율이 90% 이상 유지되었으며(도 10A), 약 7일 동안의 장기간 생존율도 85% 이상을 유지하였다(도 10B). 이와 같은 결과는 HPf가 화장품 원료 및 의약품 원료로 사용하였을 때 매우 안전한 물질임을 나타낸다.

실시예 8: 수용액내에서의 HPf의 안정성(stability) 평가

단백질 제제의 최대 약점인 액상에서의 물리/화학적 불안정성 및 바이오활성 (bioactivity) 소실을 억제하고, 화장품과 같은 액상에서도 장기간 안정적으로 생물학적 활성을 유지하기 위해서는 여러 장치가 필요하다. 이러한 안전장치의 개발에 앞서, HPf의 안정성을 평가하기 위하여 인산완충식염수(pH 7.2) 및 겔 상에서 단백질 안정성을 측정하였다.

실험에 사용된 겔은 고형화에 영향을 주는 카보머와 글리세롤을 주성분으로 하여 하기 표 3에 기재된 성분들을 이용하여 제조하였다. 이때 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인을 최대한 배제하였다.

성분	용량 (%)
KOH	0.28
카보머	0.4
글리세린	10
페녹시에탄올	0.6
HPf	1 mg/ml
물	88.72

안정성 평가 실험은 다음과 같다. 먼저, HPf를 인산완충식염수에 10 μg/ml의 농도로, 그리고 겔 상에서는 1 mg/ml의 농도로 각각 희석한 후, 4℃ 및 37℃에서 각각 약 1 달간 방치시켰다. 3, 7, 14 및 30일 간격으로 단백질을 샘플링하여 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 통해 단백질의 양 및 분해 정도를 육안으로 판별하였고, 단백질 안정성은 덴시토미터(TotalLabQuant, Totallab, USA)를 이용하여 수치화하였다.

도 11에서 보는 바와 같이, 인산완충식염수 및 겔 상에서 모두 4℃ 및 37℃의 온도에서도 1달간 방치한 후 단백질의 안정성이 거의 변화 없는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 세포주 모델을 통한 HPf의 아토피 개선 효능 평가

탈과립화 저해 능력 평가를 통한 HPf의 항-염증효과

IgE를 매개로한 비만세포의 탈과립현상(Degranulation)은 아토피 피부염의 대표적인 증상이다. HPf의 항-염증효과를 평가하기 위하여 호염기성(basophilic) 세포주인 RBL-2H3를 이용하여 탈과립의 바이오마커인 β-헥소사미니다제 분비 저해 활성을 측정함으로써 탈과립화 정도를 측정하였다.

세포배양용 48-웰 플레이트에 RBL-2H3 세포(CRL-2256, ATCC, USA)를 2.5 x 10⁵ 세포/웰의 농도로 희석하여 접종한 후 37℃ CO₂ 배양기에서 3시간동안 배양하여 세포가 웰 플레이트에 부착하도록 하였다. 세포의 감작(Sensitization)을 위하여 IgE (1.0 μg/ml)를 3 내지 24시간 처리한 후 남아있는 IgE를 제거하기 위해 HBS(HEPES buffered Saline)로 4번 세척하였다.

세포 자극을 위한 항원처리로 2,4-디나이트로페닐헵텐-인간 혈청 알부민(DNP-HSA, Biosearch Technologies, USA) 800 내지 1000 ng/ml로 세포를 자극시킨 후, 상층액 50 μl을 200μl의 1mM p-니트로페닐 N-아세틸-베타-D-글루코사민 함유 0.05 M 시트레이트 버퍼(pH 4.5)와 약 1시간 동안 반응시켰다. 반응을 멈추기 위하여 0.05 M 탄산나트륨 버퍼(pH 10) 500μl를 첨가한 후 405 nm에서 O.D.값을 분광광도계로 측정하였다.

대조군(PBS 처리군)과 HPf 처리군의 탈과립화 저해능력을 비교 분석한 결과, HPf는 100μg/ml의 농도에서 β-헥소사미니다제 분비능이 대조군을 기준으로 약 60%로 감소하였다(도 12). 이와 같은 결과는 HPf가 β-헥소사미니다제 분비를 억제시켜 아토피 증상을 완화시킬 수 있는 물질임을 증명한다.

실시예 10: 동물 모델을 통한 HPf의 아토피 개선 효능 평가

NC/Nga 마우스에 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)를 이용하여 아토피 피부염을 유발한 후, HPf 처리에 따른 항염증 및 상처회복 효능을 평가하였다.

10-1) 육안을 통한 피부손상 정도 평가

NC/Nga 마우스의 등 부위 털을 제거한 후, 150 μl의 0.15% DNFB 용액(아세톤: 올리브오일 = 3:1)을 NC/Nga 마우스 등에 일주일에 1회씩 4주간 도포하여 아토피 피부염을 유발시켰다. 대조군 및 HPf 처리군(100 μl)을 1주일에 3회씩 4주간 처리하여 육안을 통안 피부 손상정도 및 피부 조직 염색을 통한 면역세포의 침윤과 조직 회복정도를 평가하였다(도 13A). 상기 대조군 및 HPf 처리군은 하기 표 4에 기재된 조성으로 겔 상으로 제작하여 피부 접착성을 증가시켜 마우스 피부에서 흘러내림을 억제시켰다.

성분	용량 (%)
성분	대조군	HPf 처리군
KOH	0.28	0.28
카보머	0.4	0.4
글리세린	10	10
페녹시에탄올	0.6	0.6
HPf	-	1 mg/ml
물	88.72	88.72

동물실험기간 동안 DNFB로 유발된 피부의 소견을 제외하고 HPf의 도포에 의한 이상 현상은 생기지 않았다. Nc/Nga 마우스 등에 3주간 DNFB를 처리한 결과 심한 피부 손상에 의한 각질의 탈피와 염증반응이 관찰되었다(도 13B). HPf 처리군(DNFB + HPf)에서는 4주후 약간의 각질만이 피부 상피에 덮여 있고 상처조직이 아물어 있는 반면, DNFB만 처리한 군(DNFB only)과 DNFB 및 대조군 처리군(DNFB + control)에서는 상처가 아직 아물지 않은 상태로 피부손상이 상당히 남아 있었다(도 13B). 이와 같은 결과는 HPf가 아토피 피부염을 개선시키는 효능이 있음을 의미한다.

10-2) 피부조직 관찰을 통한 항염증 및 상처치유 능력 평가

Nc/Nga 마우스의 손상된 피부조직 회복 능력을 보다 정밀하게 관찰하기 위하여, 관찰 4주 후 마우스의 피부조직을 떼어내어 H&E(Hematoxylin & eosin) 염색을 실시하여 피부조직 내의 변화를 확인하였다. 그 결과, DNFB만을 처리한 군(도 14B)과 DNFB에 대조군을 함께 처리한 군(도 14C)에서는 마우스 피부의 심한 각질층 이탈현상을 관찰할 수 있었지만, DNFB에 HPf를 처리한 군(도 14D)에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다.

또한, 아토피성 피부염은 피부조직에서의 여러 화학주성(Chemoattractive) 사이토카인을 분비하여 피부조직 부위로 면역세포의 침윤현상이 일어난다. 실제 DNFB만을 처리한 군(도 14B)과 대조군을 처리한 군(도 14C)에서는 면역세포의 침윤현상이 증가하여 H&E 염색 상에서 피하조직내의 많은 세포들을 관찰할 수 있었지만, DNFB를 처리하지 않은 무처리군(도 14A)과 HPf를 처리한 군(도 14D)에서는 침윤현상이 거의 일어나지 않았다. 이와 같은 결과는 HPf 실제 생체 내에서 과도한 면역반응을 억제시키며 동시에 상처 치유의 능력을 나타내는 물질이라는 사실을 증명한다.

실시예 11: HPf에 의한 인간 피부세포 분화능력 평가

HPf에 의한 피부 상피세포(keratinocyte) 및 섬유아세포(fibroblast)의 세포 분화능력을 평가하는 실험을 수행하였다.

인간 피부 상피세포주는 HaCaT 세포(문헌[Schoop, Veronika M., Journal of Investigative Dermatology., 112(3): 343-353] 참조)를 섬유아세포주는 CCD-986sk (SCRL-1947, ATCC, USA)를 사용하였으며, HPf(100 μg/ml)을 24시간 처리한 후 각각의 세포로부터 RNA를 추출하여 qRT-PCR (SYBR-Green)을 실시하였다.

구체적으로, 10% FBS가 첨가된 DMEM(Hyclone, USA) 배지에 0.3 x 10⁶ 세포/ml의 농도로 6-웰 세포 배양 플레이트에 각각의 세포를 접종한 후 컨플루언시(confluency)가 약 70-80%에 이를 때까지 세포를 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 상기 세포에 HPf를 100μg/ml가 되게 처리한 후 24시간 동안 다시 배양한 후, 상층액을 제거하고 TRizol 용액(Invitrogen, USA) 1ml를 첨가하여 세포를 용액으로 녹여내었다. 여기에 다시 200μl의 클로로포름을 첨가한 후 10초간 강하게 볼텍싱하고 12,000 x g (Centrifuge 5418, eppendorf, USA)에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 E-튜브에 옮긴 후 0.5 ml의 이소프로필 알콜을 첨가하고 12,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 전체 RNA을 침전시켰다. 상층액을 제거하고 70% 에탄올을 첨가한 후 다시 12,000 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 DNase, RNase-미함유 물을 이용하여 RNA를 녹였다. 이렇게 정제된 RNA를 이용하여 각 세포의 cDNA 라이브러리를 제작하는 과정을 거쳤다.

cDNA의 합성은 옴니스크립트 역전사 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 제작하였다. 우선 총 RNA (1μg), 10 x RT 버퍼, dNTP mix, Oligo-dT 프라이머, RNase 억제제(Promega, USA), 옴니스크립트 역전사효소를 첨가한 후 DNase, RNase-미함유 물을 이용하여 전체 볼륨을 20μl로 맞춘 후 37℃에서 60분간 반응시켜 cDNA 합성을 완성하였다.

이어, 세포 분화의 정도를 나타내는 대표적인 유전자인 케라틴 10(keratin 10, KRT10), 트랜스글루타미나제 1(transglutaminase 1, TGM 1) 및 인볼루크린(involucrin, IVL)의 유전자 발현량을 상대적으로 비교하기 위하여 RT-PCR (LightCycler 480, Roche, USA)을 수행하였다. 각 유전자에 대한 PCR 프라이머 염기서열을 하기 표 5에 나타내었으며, RT-PCR용 시약은 Applied Biosystem사의 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 이용하였다. PCR 조건은 변성(95℃, 10초), 어닐링(60℃, 10초) 및 증폭(72℃, 10초)을 1싸이클로 하여 45회 반복하고 맨 마지막 비-특이적 밴드의 확인을 위하여 멜팅 커브 분석(Melting curve analysis) 과정을 거쳤다. RT-PCR의 결과분석은 델타 델타 CT(delta delta CT, ddCt algorithm) 방법을 통하여 각 유전자의 발현량을 상대적으로 표시하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.

그 결과, HPf가 처리된 HaCaT 세포에서는 대조군에 비해 분화표지 유전자들이 최소 20 내지 최대 250배 이상 증가하였으며(도 15A), CCD986-sk 세포에서는 평균 20배 이상의 유전자 발현 증가가 일어났다(도 15B). 이와 같은 결과는 HPf가 인간 피부세포의 분화를 조절하는 매우 중요한 단백질로, 상처 치료제 및 향장성 원료의 소재로 매우 유용한 물질임을 입증한다.

유전자		서열	서열번호
KRT10	sense	5'-GGTGGGAGTTATGGAGGCAG-3'	11
KRT10	antisense	5'-CGAACTTTGTCCAAGTAGGAAGC-3'	12
TGM 1	sense	5'-CATCAAGAATGGCCTGGTCT-3'	13
TGM 1	antisense	5'-CAATCTTGAAGCTGCCATCA-3'	14
IVL	sense	5'-TCCTCCAGTCAATACCCATCAG-3'	15
IVL	antisense	5'-CAGCAGTCATGTGCTTTTCCT-3'	16

실시예 12: HPf의 지방 세포분화 능력

피부기저의 지방조직은 피부 조직의 유지에 필요한 인자들을 분비한다. 피하지방에는 아직 지방세포로 분화하지 않은 지방선구세포(preadipocyte)나 지방줄기세포가 존재하는데, HPf가 지방선구세포나 지방줄기세포들의 분화를 촉진할지 억제할지에 대한 연구를 진행하였다.

3T3L1 세포주(CL-173, ATCC, USA)에 대조군(control)으로는 멸균된 PBS(pH 7.2)를 처리하고 실험군으로 HPf(100ug/ml)를 처리한 후, 오일 레드 O 염색법으로 염색하여 지방세포 분화에 대한 HPf의 영향을 측정하였다.

그 결과, HPf를 처리한 실험군은 약 40% 정도의 지방세포 분화 억제 효과를 나타내었다(도 16). 상기 결과는 HPf를 이용하면 피하지방 감소를 촉진 또는 증가를 억제할 수 있다는 것을 최초로 증명한다.

실시예 13: 3D 인공 피부세포조직 배양을 통한 HPf의 효능 평가

인간 피부와 매우 유사한 3D 피부세포조직 배양을 통해 HPf가 실제 인간 피부에 미치는 영향을 조직학적 방법으로 살펴보았다.

3D 인공피부의 배양은 TEGO 셀 사이언스(Korea)사의 Neoderm ED 제품을 사용하여 제조사의 지시대로 세포배양 및 조건을 맞춰 실험을 수행하였다. Neoderm ED 제품은 사람의 피부와 매우 유사한 피부 상피 및 진피층을 모두 가지고 있는 인공피부로서 신약개발 및 화장품 원료의 효능평가에 모두 사용되고 있는 제품으로 알려져 있다.

세포 배양용 용기 위에 콜라겐 메트릭스 및 섬유아세포를 세포 배지와 함께 1일 정도 키운 후, 그 위에 각질형성세포를 접종하여 4일간 배양하여 단층막 세포층을 형성시켰다. 그 후 16-20일 정도 공기 중에 노출시켜 진피층의 형성을 유도하였다. 마지막으로, 100μg/ml의 HPf와 대조군으로 동량의 인산화 완충용액 (Phosphated buffered saline, pH 7.2)을 3D 피부세포 배양에 일주일 동안 처리하고 H&E 염색을 통하여 그 피부 조직의 변화를 살펴보았다.

도 17에서 보는 바와 같이, 대조군(C-1 내지 C-3) 및 실험군(H-1 내지 H-4) 모두 인공피부의 상피세포 조직에는 아무런 변화가 없었지만, HPf를 처리한 실험군에서만 진피세포층의 두께가 상당히 두꺼워지는 현상을 관찰할 수 있었다. 또한, 각 샘플들의 진피층의 두께를 측정한 후 측정값을 수치화한 결과, 대조군에 비해 HPf를 처리한 조직의 진피 두께가 약 2배 증가함을 알 수 있었다.

이는 HPf가 진피세포의 성장 및 분화를 촉진시키고, 콜라겐, 엘라스틴과 같은 여러 피부구조 단백질의 발현을 증가시키기 때문으로 생각되며, 향장소재로 HPf를 이용하면 피부의 탄력을 증가시켜 항 주름 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

실시예 14: HPf의 멜라닌 생합성 저해 능력 평가

아토피 치료제 소재로의 기능 이외에 HPf의 미백효능을 평가하기 위한 멜라닌 생성 저해 실험을 실시하였다.

B16F10 세포주(CRL-6475, ATCC, USA)에 HPf를 100μg/ml의 농도로 처리하고 48시간 경과 후 MTT 어세이로 세포 생존율 및 생성된 멜라닌의 함량을 측정하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이때 대조군으로는 PBS를 처리하였다.

도 18에서 보는 바와 같이, HPf를 100μg/ml의 농도로 처리하여도 세포의 생존율에는 변화가 없어 세포내 독성이 거의 없는 것을 알 수 있었으며, 생성되는 멜라닌의 양이 대조군에 비하여 약 70%의 수준으로 감소하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 HPf를 미백소재의 화장품 원료로 사용할 수 있음을 의미한다.

제조예 1: HPf를 함유하는 리포좀(Lipo-HPf)의 제조

Lipo-HPf 제조에 이용된 인지질은 대두 레시틴(soybean lecithin; (주)신동방, 한국), Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) 또는 Emultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)이다.

기기 출구(outlet)의 온도가 30℃가 넘지 않게 열교환기를 장치한 고압균질기(최대 output 5 L/hr, 최대압력 1200 bar, Model HS-1002, (주)화성기계 (Korea))의 열교환기를 얼음물 속에 장치한 후 증류수로 기기 내부를 세척하여 작동준비한 후, 완충용액(20 mM NaH₂PO₄, pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA)에 용해되어 있는 1 ㎎/㎖ 농도로 HPf를 포함하는 용액에 인지질을 10중량% 비율로 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 이를 상온에서 균질기를 이용하여 저압 0 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 14중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 100 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 18 중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 200 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그러고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 20 중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 300 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 22중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 400 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 24중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 500 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그러고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 26중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 600 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다.

이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 28중량% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 700 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액을 800 bar에서 3회 이상 균질기를 통과한 후 균질기로부터 용액을 배출하고 15,000 x g에서 30분간 고속원심분리하여 상등액을 분리하였다. 이때 리포좀 내에 들어가지 않은 인간 열 활성화 단백질 90a 절편은 젤 투과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)로 제거하고, 최종적으로 액상의 리포좀을 수득하였다.

<110> REGERON, INC. <120> COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN CONDITIONS COMPRISING A FRAGMENT OF HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN 90A AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> FPD/201308-0005 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu 1 5 10 15 Ser Glu Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Lys Lys Asp Gly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys 35 40 45 Tyr Ile Asp Gln Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg 50 55 60 Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys Ser 65 70 75 80 Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val 85 90 95 Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Leu Leu Phe Val Pro Arg Arg Ala 100 105 110 Pro Phe Asp 115 <210> 2 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Glu Glu Thr Gln Thr Gln Asp Gln Pro Met Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Val Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu 20 25 30 Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu 50 55 60 Thr Asp Pro Ser Lys Leu Asp Ser Gly Lys Glu Leu His Ile Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Asn Lys Gln Asp Arg Thr Leu Thr Ile Val Asp Thr Gly Ile 85 90 95 Gly Met Thr Lys Ala Asp Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys 100 105 110 Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile 115 120 125 Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val 130 135 140 Ala Glu Lys Val Thr Val Ile Thr Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Trp Glu Ser Ser Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val Arg Thr Asp Thr 165 170 175 Gly Glu Pro Met Gly Arg Gly Thr Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu 180 185 190 Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Ile Lys Glu Ile Val Lys 195 200 205 Lys His Ser Gln Phe Ile Gly Tyr Pro Ile Thr Leu Phe Val Glu Lys 210 215 220 Glu Arg Asp Lys Glu Val Ser Asp Asp Glu Ala Glu Glu Lys Glu Asp 225 230 235 240 Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Ser Glu Asp Lys Pro 245 250 255 Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Gly 260 265 270 Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu 275 280 285 Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile 290 295 300 Thr Asn Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp 305 310 315 320 Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu 325 330 335 Phe Arg Ala Leu Leu Phe Val Pro Arg Arg Ala Pro Phe Asp Leu Phe 340 345 350 Glu Asn Arg Lys Lys Lys Asn Asn Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val 355 360 365 Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro Glu Tyr Leu Asn Phe 370 375 380 Ile Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro Leu Asn Ile Ser Arg 385 390 395 400 Glu Met Leu Gln Gln Ser Lys Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Leu 405 410 415 Val Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe Thr Glu Leu Ala Glu Asp Lys Glu 420 425 430 Asn Tyr Lys Lys Phe Tyr Glu Gln Phe Ser Lys Asn Ile Lys Leu Gly 435 440 445 Ile His Glu Asp Ser Gln Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Leu Leu Arg 450 455 460 Tyr Tyr Thr Ser Ala Ser Gly Asp Glu Met Val Ser Leu Lys Asp Tyr 465 470 475 480 Cys Thr Arg Met Lys Glu Asn Gln Lys His Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly 485 490 495 Glu Thr Lys Asp Gln Val Ala Asn Ser Ala Phe Val Glu Arg Leu Arg 500 505 510 Lys His Gly Leu Glu Val Ile Tyr Met Ile Glu Pro Ile Asp Glu Tyr 515 520 525 Cys Val Gln Gln Leu Lys Glu Phe Glu Gly Lys Thr Leu Val Ser Val 530 535 540 Thr Lys Glu Gly Leu Glu Leu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys 545 550 555 560 Gln Glu Glu Lys Lys Thr Lys Phe Glu Asn Leu Cys Lys Ile Met Lys 565 570 575 Asp Ile Leu Glu Lys Lys Val Glu Lys Val Val Val Ser Asn Arg Leu 580 585 590 Val Thr Ser Pro Cys Cys Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gly Trp Thr Ala 595 600 605 Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Leu Arg Asp Asn Ser Thr 610 615 620 Met Gly Tyr Met Ala Ala Lys Lys His Leu Glu Ile Asn Pro Asp His 625 630 635 640 Ser Ile Ile Glu Thr Leu Arg Gln Lys Ala Glu Ala Asp Lys Asn Asp 645 650 655 Lys Ser Val Lys Asp Leu Val Ile Leu Leu Tyr Glu Thr Ala Leu Leu 660 665 670 Ser Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp Pro Gln Thr His Ala Asn Arg Ile 675 680 685 Tyr Arg Met Ile Lys Leu Gly Leu Gly Ile Asp Glu Asp Asp Pro Thr 690 695 700 Ala Asp Asp Thr Ser Ala Ala Val Thr Glu Glu Met Pro Pro Leu Glu 705 710 715 720 Gly Asp Asp Asp Thr Ser Arg Met Glu Glu Val Asp 725 730 <210> 3 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence of HPf gene <400> 3 gaagaaaagg aagacaaaga agaagaaaaa gaaaaagaag agaaagagtc ggaagacaaa 60 cctgaaattg aagatgttgg ttctgatgag gaagaagaaa agaaggatgg tgacaagaag 120 aagaagaaga agattaagga aaagtacatc gatcaagaag agctcaacaa aacaaagccc 180 atctggacca gaaatcccga cgatattact aatgaggagt acggagaatt ctataagagc 240 ttgaccaatg actgggaaga tcacttggca gtgaagcatt tttcagttga aggacagttg 300 gaattcagag cccttctatt tgtcccacga cgtgctcctt ttgat 345 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR primer HPf-up <400> 4 gagacatatg gaagaaaagg aagacaaaga agaagaa 37 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tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtaatgg atcc 264 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease recognition site <400> 10 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR sense primer of KRT10 <400> 11 ggtgggagtt atggaggcag 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR antisense primer of KRT10 <400> 12 cgaactttgt ccaagtagga agc 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR sense primer of TGM 1 <400> 13 catcaagaat ggcctggtct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR antisense primer of TGM 1 <400> 14 caatcttgaa gctgccatca 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR sense primer of IVL <400> 15 tcctccagtc aatacccatc ag 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base sequence for PCR antisense primer of IVL <400> 16 cagcagtcat gtgcttttcc t 21

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서,
상기 피부 상태 개선이, 아토피성 피부의 개선, 주름 개선, 미백 개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선, 피부노화 방지 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 단백질이 리포좀에 포함된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 리포좀이 나노 리포좀인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
삭제
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부의 치료용 약학 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 단백질이 리포좀에 포함된 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 리포좀이 나노 리포좀인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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