KR101317872B1

KR101317872B1 - 인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101317872B1
Application number: KR1020110040403A
Authority: KR
Inventors: 양정윤; 김성대; 이균영; 오달균
Original assignee: 주식회사 리제론
Priority date: 2010-04-28
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2013-10-16
Also published as: KR20110120254A

Abstract

본 발명은 인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이를 이용하는 피부 상태 개선 방법에 관한 것이다. 본 발명은 아토피성 피부의 치료, 주름개선, 피부탄력 개선, 여드름 개선, 피부노화 개선, 피부보습 개선 등과 같은 다양한 피부 상태 개선 효능을 발휘한다.

Description

인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물{Compositions for Improving Skin Conditions Comprising Human Placental Lactogen as an Active Ingredient}

본 발명은 인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이를 이용하는 피부 상태 개선 방법에 관한 것이다.

인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen: hPL)과 같은 고분자(약22 kDa)단백질은 고난도 고비용의 대량 생산 분리 정제 과정이 필요할 뿐 아니라 정제 후에도 용액상에서의 불안정성 때문에 피부도포용 액상제제로서 정상피부에 도포 하여 인간 태반성 락토젠의 작용에 의한 미용적, 의학적 효능을 발휘하는 화장품이나 의약품으로 개발하기까지에는 여러 산업기술적 경제적 난관을 극복해야 한다.

인간 태반성 락토젠과 같은 고분자 단백질의 생활성을 유지하면서 액상에서의 안정성을 높이기 위한 방안으로 리포좀을 이용하는 방법이 사용되었다. 단백질을 리포좀으로 싸서 피부에 도포하는 경우, 정상 피부에서는 리포좀은 단백질을 모낭으로 전달하는 효율적인 운반체가 될 수 있고, 손상된 피부에서는 체내 단백질 분해효소 등의 공격으로부터 보호하여 리포좀 내에 싼 단백질의 서방성 운반체의 역할을 하여 상대적으로 긴 시간 단백질이 지닌 효능을 효율적으로 발휘하게 할 수 있다. 리포좀을 이용한 단백질의 피부에의 전달효율은 아직까지는 사례가 많지 않고 경험적인 부분이 많아 일관된 법칙은 아직 밝혀져 있지 않다. 다만 단백질을 리포좀으로 둘러싸서 전달하는 경우에도 리포좀 내외의 pH 및 전하상태를 포함한 리포좀을 구성하는 인지질의 종류와 인지질에 부착되어 있거나 인지질이 둘러싸고 있는 단백질의 종류와 모공을 이루는 여러 구성조직의 구성성분, 이들 세 요소의 복합적 상호작용에 의해서 아직까지는 일반적인 법칙에 따르기 보다는 경험적으로 전달효율이 결정되는 듯이 보인다.

인간 태반성 락토젠(Human placental lactogen: hPL)은 인간 융모성 유선자극 호르몬(Human chorionic somatomammotropin: hCS)이라고도 불리는 폴리펩타이드 태반성 호르몬이다. hPL의 구조 및 기능은 인간 성장호르몬(Human growth hormone)과 유사하다고 알려졌으며, 임신기간 동안 태아에게 에너지 공급을 촉진하기 위하여 산모의 물질대사 상태를 변형시킨다. 또한, hPL은 인슐린의 활성을 저하시키는 항인슐린(anti-insulin)이다. hPL은 두 개의 이황화 결합으로 연결된 191개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 임신기간 동안 융합세포영양막(syncytiotrophoblast)에서 분비된다. hPL의 분자량은 22,125 Da이며, 반감기는 약 15분이다. hPL은 오직 임신기간 동안만 태아 및 태반의 성장과 관련하여 존재하며, 최대 수치는 약 5-7 ㎎/㎖ 이고, 다태 임신(Multiple gestation) 환자에게서는 보다 높은 수치로 관찰된다.

생물검정법(bioassay)을 이용한 실험에서 hPL은 프로락틴(prolactin)과 유사한 기능을 하는 것으로 나타났으나, 아직 인간의 수유에 있어 어떤 기능을 하는지는 분명하지 않다. hPL은 산모 기관의 물질대사 체계에 영향을 주는데, 산모의 인슐린 감수성을 감소시켜 산모 혈액의 포도당 수치를 증가시키나 산모의 포도당 이용은 감소시켜 태아에게 적당한 영양분을 공급할 수 있도록 한다. 만성 저혈당증은 hPL 수치를 높이게 되며, hPL은 자유 지방산을 방출하는 지방 분해를 유도하여 산모의 기관에서 에너지원으로 이용됨으로써, 태아가 더 많은 포도당을 이용할 수 있도록 돕는다. 또한, 자유 지방산으로부터 생성된 케톤은 태반을 통과할 수 있으며, 태아에 의하여 이용될 수 있다. 이러한 기능은 산모가 영양결핍의 상태에 처하였을 때에도 태아가 영양을 공급받을 수 있도록 돕게 된다. hPL은 단백질 조직의 형성을 야기하는 면에서 성장호르몬과 약간의 유사성을 갖고 화학적 구조에서도 유사하지만, 성장을 촉진하는데 필요한 양은 성장호르몬보다 약 100배 이상을 필요로 하는 등 여러 가지 면에서 차이를 나타낸다(Guyton and hall (2005) (in en). Textbook of Medical Physiology (11 ed.). Philadelphia: Saunders. pp. 1033. ISBN 81-8147-920-3. "This hormone has weak actions similar to those of growth hormone, causing the formation of protein tissues in the same way that growth hormone.).

본 발명은 혈액을 통하여 인간 태반성 락토젠의 효능이 전달되는 방식이 아니라 혈액이 직접 접촉하지 않는 부분인 정상 피부표면에 화장품의 용도로 바르는 방식으로 인간 태반성 락토젠이 아토피성 피부의 개선, 자외선에 의한 피부손상의 개선, 주름의 개선, 여드름의 개선, 건성 피부의 개선 등과 같은 피부에 대한 미용적 의학적 효능을 나타낼 수 있다는 것을 보여준 최초의 보고이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 피부 상태를 개선시킬 수 있는 물질을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen)을 피부에 적용하면 피부 상태를 크게 개선할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 상태(conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 상태(conditions) 개선 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen)을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(conditions) 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 상태(conditions) 개선 방법을 제공한다.

본 발명자들은 인간 태반성 락토젠의 신규한 용도를 찾기 위하여 연구 노력한 결과, 인간 태반성 락토젠을 피부에 적용하면 피부 상태를 크게 개선할 수 있다는 사실을 발견하였다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen: hPL)으로는 인간 태반성 락토젠 활성을 나타내는 어떠한 폴리펩타이드도 사용 가능하며, 예컨대, mature hPL, Met-hPL, hPL variants, modified-hPL, hPL fragments 또는 hPL analogue 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 바람직하게는, mature hPL 또는 Met-hPL이다. mature hPL은 인체 혈액 내에 존재하는 주(major) 인간 태반성 락토젠의 아미노산서열을 가진 인간 태반성 락토젠을 가리키고, Met-hPL은 mature hPL의 N-말단에 메티오닌이 첨가된 인간 태반성 락토젠을 가리키고, hPL variants는 인체 내에 존재하는 주 인간 태반성 락토젠 이외의 인간 태반성 락토젠의 아미노산서열을 가진 인간 태반성 락토젠을 가리키고, modified hPL은 인간 태반성 락토젠의 하나 이상의 아미노산 잔기에 pegylation이나 glycation 등과 같은 첨가물의 부착으로 변형된 인간 태반성 락토젠을 가리키고, hPL fragments는 인간 태반성 락토젠의 아미노산 서열 일부를 유전공학적 방법이나 생화학적 방법에 의해 제거시킨 인간성장 호르몬을 가리키고, hPL analogue는 인간 태반성 락토젠의 아미노산서열을 유전공학적 방법으로 유사한 성질을 가진 다른 아미노산서열로 변형시킨 인간 태반성 락토젠을 가리킨다. 본 발명의 인간 태반성 락토젠은 두 가지 방법 중 하나에 의하여 특정될 수 있다. 하나는 인간 태반성 락토젠 결합단백질 또는 인간 태반성 락토젠 수용체와 결합하는지의 여부에 의하여 특정될 수 있고 다른 하나는 인간 태반성 락토젠의 생물학적 활성 측정방법에 의하여 특정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 리포좀 조성을 갖는다. 즉, 유효성분인 인간 태반성 락토젠은 리포좀에 포위되어 피부에 적용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 나노리포좀의 조성을 갖는다. 본 명세서에서, 용어 “나노리포좀”은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 20-1000 nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50-500 nm이고, 보다 바람직하게는, 50-350 nm이며, 가장 바람직하게는 100-250 nm이다.

리포좀은 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 베시클로 정의되는데, 수용성 헤드(친수기)와 불용성 테일(소수기)을 가진 양친매성 분자로 구성된 리포좀은 이들의 상호작용에 의하여 자발적으로 결합하여 정렬된 구조를 보이는데, 그 크기와 적층성(Lamellarity)에 따라 SUV(Small Unilamellar Vesicle), LUV(Large Unilamellar Vesicle) 및 MLV(Multi Lamellar Vesicle)로 분류된다.

이와 같이 다양한 적층성을 나타내는 리포좀은 세포막과 유사한 이중막 구조를 갖는다.

본 발명에서의 (나노)리포좀은 인지질, 폴리올, 계면활성제, 지방산 또는/및 물을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용되는 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질(예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다.

본 발명의 (나노)리포좀에 이용될 수 있는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨 및 솔비톨을 포함한다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용될 수 있는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제(예: 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트), 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제(예: 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르)가 사용될 수 있다.

본 발명의 (나노)리포좀 제조에 이용될 수 있는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C_12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다.

본 발명의 (나노)리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노(리포좀)은 인지질과 물만으로 제조되는 데, 이의 구체적인 예는 하기의 실시예에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 hPL-함유 나노리포좀은 다음의 단계를 포함하는 공정을 통해 제조된다: (a) 리포좀을 형성할 수 있는 인지질(바람직하게는, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴)을 인간 태반성 락토젠을 함유한 수용액에 용해하는 단계; 및 (b) 인간 태반성 락토젠과 인지질을 함유한 수용액을 고압균질기에 반복적으로 통과시키되, 통과 회수에 따라 인지질의 함량과 고압균질기의 압력을 점차적으로 증가시켜 인간 태반성 락토젠을 함유하는 나노 리포좀을 제조하는 단계.

인간 태반성 락토젠을 함유하는 수용액은 pH 6-8, 바람직하게는 약 pH 7의 완충액(예컨대, 소듐 포스페이트 완충액)이 바람직하다. 소듐 포스페이트 완충액이 이용되는 경우에는, 그 농도는 5-100 mM, 보다 바람직하게는 5-60 mM, 보다 더 바람직하게는 10-30 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM이다.

본 발명의 방법에 있어서, 가장 특이한 측면은 인지질과 hPL-함유 수용액의 혼합물을 고압균질기에 수회 통과시키는 데, 통과 횟수가 증가함에 따라 인지질의 양과 균질기의 압력을 순차적으로 증가시키는 데에 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 균질기의 압력은 0-1000 bar, 바람직하게는 0-800 bar까지 순차적으로 증가시킨다. 얍력은 50 bar 또는 100 bar, 바람직하게는 100 bar씩 증가시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인지질의 양은 5-40 w/v(%), 5-30 w/v(%)까지 순차적으로 증가시킨다.

이러한 순차적인 인지질 함량과 압력의 증가가 있는 고압균질 공정을 통해, hPL-함유 나노리포좀이 제조되며, 바람직하게는 액상의 hPL-함유 나노리포좀이 제조된다.

본 발명의 조성물은 다양한 피부 상태(conditions)의 개선에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 아토피성 피부의 치료 또는 개선, 주름개선, 미백 개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선, 여드름 치료, 발모촉진, 피부노화 방지, 피부보습 개선 및 피부표피 줄기세포 활성화에 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 아토피성 피부의 개선, 주름개선 및 피부탄력 개선에 유효하다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 hPL-함유 리포좀(Lipo-hPL) 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 피부보호용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 피부투여 목적으로 개발되었다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 피부 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-2000 ng/cm²(피부표면적), 보다 바람직하게는 0.01-200 ng/cm², 가장 바람직하게는 0.1-20 ng/cm²이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 나노리포좀을 포함하는 용액 형태가 가장 바람직하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(ⅰ) 본 발명은 인간 태반성 락토젠을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이를 이용하는 피부 상태 개선 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 피부세포에 작용하여 자외선에 의해 손상된 피부와 노화로 인한 주름을 개선하고, 피부탄력을 개선하는 작용을 하며, 아토피성 피부염을 치료하고 피부수분 유지를 돕는 효능을 나타낸다. 종합적으로, 본 발명의 조성물은 피부 상태를 크게 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 나노리포좀으로 제조되는 경우에는 안정성도 매우 탁월하다.

도 1은 인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen: hPL)의 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 상기 hPL 아미노산 서열 중 1-25 아미노산 서열은 시그널 펩타이드 부분이며, 26-216 아미노산 서열은 성숙한 hPL 단백질을 나타낸다.
도 2는 인간 태반성 락토젠을 코딩하는 DNA 서열(CDS)을 나타내는 도면이다. 상기 DNA 서열 중 검은색으로 표시된 1-8 b.p. 부분은 엑손 1, 파란색으로 표시된 9-168 b.p. 부분은 엑손 2, 빨간색으로 표시된 169-288 b.p. 부분은 엑손 3, 초록색으로 표시된 289-453 b.p. 부분은 엑손 4 및 보라색으로 표시된 456-651 b.p. 부분은 엑손 5를 나타낸다. 또한, 상기 서열 중 밑줄부분(1-75 b.p.)은 시그널 펩타이드 부분이다.
도 3은 발현벡터(pUC-narK-Met-hPL)를 균주 Rz4500에 형질전환 시킨 후 배양한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 재조합 인간 태반성 락토젠을 정제한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 태반성 락토젠(hPL)에 의한 주름개선 효과의 도면이다.
도 6은 인간 태반성 락토젠(hPL)에 의한 피부탄력도 증대 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 인간 태반성 락토젠(hPL)에 의한 수분손실도 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 8은 인간 태반성 락토젠(hPL)에 의한 UV 조사후의 피부조직의 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 단기간 도포한 도포제에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부변화 육안관찰의 도면이다.
도 10은 Lipo-hPL의 단기간 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부손상도을 나타내는 도면이다.
도 11은 장기간 Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부변화 육안관찰의 도면이다.
도 12는 장기간 Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부손상도 변화를 나타내는 도면이다.
도 13은 장기간 Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부손상도 변화를 나타내는 도면이다.
도 14는 단기간 Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부조직 H&E 염색을 나타내는 도면이다.
도 15는 Lipo-hPL의 장기간 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부조직 변화 H&E 염색 후 관찰한 도면이다.
도 16은 장기간 Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부두께 변화를 나타내는 도면입니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 I: 인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen, hPL) 단백질의 획득

1. 인간 태반성 락토젠 유전자의 획득

hPL 단백질은 human placental lactogen의 약자로 191개 아미노산으로 구성되어 있고, 대략 임신 5주째부터 분비되는 호르몬이다(도 1). hPL의 주요 역할은 임신 기간 중 탄수화물 및 지방대사에 관여하고 또한 유선을 성장시키고 자극하여서 수유준비를 하게 하는 호르몬이다. hPL 유전자를 클로닝하기 위하여 첫번째로 HEK 293T(Human embryonic Kidney)세포주(ATCC CRL-11268)로부터 게놈 DNA를 주형(template)으로 사용하여 인간 태반성 락토젠(hPL)을 코딩하는 엑손 DNA절편들을 얻기 위한 PCR을 실행하였다. 각각의 엑손 DNA절편들을 연결하기 위해 연결부위의 일부 염기들이 서로 염기쌍(base pairing)을 이룰 수 있도록 설계하였고, 모든 PCR에는 Stratagene pfu DNA 폴리머라아제(Stratagene, cat. number 600154-81, USA)를 사용하였다.

인간 태반성 락토젠(hPL) 유전자를 구성하는 엑손들을 증폭하기 위한 기본적인 PCR 방법은 다음과 같다. HEK 293T 세포주에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 엑손 1을 포함하는 hPL 1U 프라이머(IDT, USA; 이하에서 사용되는 모든 올리고머는 IDT사에서 제작)와 hPL 2D 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(35 싸이클; 98℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분)을 수행하여 191 b.p. 크기의 엑손 1, 2 중합체를 획득했다. 동일한 방법으로 hPL 3U와 hPL 4D 프라이머 쌍을 이용하여 150 b.p.의 엑손 3을, hPL 5U와 hPL 6D 프라이머 쌍을 이용하여 200 b.p.의 엑손 4를, 그리고 hPL 7U와 hPL 8D 프라이머 쌍을 이용하여 219 b.p.의 엑손 5를 얻었다.

2차 PCR에서는 상기 기술한 방법으로 획득한 엑손 1, 2 중합체와 엑손 3을 주형으로 사용하여 hPL 1U와 hPL 4D 프라이머 쌍을 넣고 PCR(35 싸이클; 98℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분)을 수행하여 엑손 1, 2, 3 중합체를 증폭 획득했다. 동일한 방법으로 엑손 4와 엑손 5를 주형으로 hPL 5U와 hPL 8D 프라이머 쌍을 사용하여 엑손4, 5 중합체를 얻었다.

3차 PCR에서는 엑손 1, 2, 3 중합체와 엑손 4, 5 중합체를 주형으로 hPL 1U와 hPL 8D 프라이머 쌍을 사용하여 상기 기술한 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 시그널 펩타이드(signal peptide)를 포함하는 hPL 유전자를 확보했다(도 2). 3차 PCR 반응에서 얻은 시그널 펩타이드를 포함하는 hPL 유전자 절편을 주형으로 사용하여 hPL 9U와 hPL 8D 프라이머 쌍을 사용하여 상기 기술한 동일한 방법으로 성숙한(mature) hPL 유전자를 획득했다.

상기 프라이머 hPL 1U, hPL 2D, hPL 3U, hPL 4D, hPL 5U, hPL 6D, hPL 7U, hPL 8D 및 hPL 9U의 염기서열은 표 1에 나타내었다.

프라이머 염기서열

프라이머	염기서열(5’-3’)
hPL 1U	gggaattccatatggctccaggctcaaaccgttccc
hPL 2D	ataggtttcttcaaactcctggtaggtgtcaatg
hPL 3U	taccaggagtttgaagaaacctatatcccaaagg
hPL 4D	cagctctagattggatttctgttgcgtttcctc
hPL 5U	caacagaaatccaatctagagctgctccgcatc
hPL 6D	gtcttccagcctccccatcagcgtttggatg
hPL 7U	acgctgatggggaggctggaagacggcagc
hPL 8D	cggggtaccctagaagccacagctgccc
hPL 9U	gggaattccatatggtccaaaccgttcccttatc

2. Nark 프로모터와 hPL을 포함하는 발현벡터의 제조

Met-인간 태반성 락토젠(Met-hPL) 단백질을 코딩하는 유전자와 pNKmut 플라스미드(-10 시그널 서열이 돌연변이된 narK 프로모터를 포함, (주)리제론, 참조: 대한민국 특허출원공개 제2006-0089086호)를 NdeI과 KpnI으로 절단하고, T4 DNA 리가제로 연결시킨 후, Top10F' 균주에 형질전환시켰다. 이후 37℃에서 15시간동안 배양한 후, 8개의 콜로니들을 임의 선정하여 배양하고, 알칼리 라이시스 방법으로 플라스미드들을 얻은 후, 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 크기를 확인 하고 염기서열을 분석함으로써 원하는 플라스미드를 선택하였다(pUC-narK-Met-hPL).

3. 인간 태반성 락토젠 단백질의 정제

상기 제조한 발현벡터를 발현용 균주인 Rz4500(고려대학교 생명공학연구소, 한국)에 형질전환시키고 7 리터 발효조에서 배양을 했다(도 3). 발현된 재조합 hPL 단백질을 포함하는 대장균을 원심분리를 이용하여 회수하고 증류수에 현탁한 후 초음파를 이용하여 세포를 파쇄 하였다. 침전물을 고속원심분리를 이용하여 회수한 후 0.5% 트리톤 X 100 용액으로 교반한 다음 고속 원심분리 하여 침전물을 다시 회수하였는데 이 침전물이 봉입체(inclusion body)이다. 봉입체를 가용액(25 mM NaOH)으로 교반하여 단백질을 용해시키고 10% 아세트산을 이용하여 중화시킨 후 고속원심분리를 이용하여 불순물을 제거하였다. 다음에 상등액을 대상으로 겔 여과 크로마토그라피를 이용하여 재조합 hPL 단백질을 정제하였다(도 4).

실시예 Ⅱ: 인간 태반성 락토젠-함유 리포좀(Lipo-hPL) 제조방법

Lipo-hPL 제조에 이용된 인지질은 대두 레시틴(soybean lecithin; (주)신동방, 한국), Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) 또는 Emultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) 이다.

기기 출구(outlet)의 온도가 30℃가 넘지 않게 열교환기를 장치한 고압균질기 (max. output 5 L/hr, 최대압력 1200 bar, Model HS-1002, (주)화성기계 (Korea))의 열교환기를 얼음물속에 장치한 후 증류수로 기기 내부를 세척하여 작동준비한 후, 완충용액(20 mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA)에 용해되어 있는 1 ㎎/㎖ 농도의 상기 실시예 I에서 얻은 hPL 용액에 인지질을 10 w/v% 비율로 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 이를 상온에서 균질기를 이용하여 저압 0 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 14 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 100 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 18 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 200 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그러고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 20 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 300 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 22 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 400 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 24 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 500 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그러고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 26 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 600 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 28 w/v% 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 700 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액을 800 bar에서 3회 이상 균질기를 통과한 후 균질기로부터 용액을 배출하고 15,000 x g에서 30분간 고속원심분리하여 상등액을 분리하였다. 이때 리포좀 내에 들어가지 않은 인간 성장호르몬은 젤 투과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)로 제거하고 액상의 리포좀을 수득하였다.

실시예 Ⅲ: Lipo-hPL 함유 크림 화장품 시제품의 제조

상기 실시예 Ⅱ에서 얻은 Lipo-hPL을 포함하는 크림 제형의 화장품 시제품을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
Lipo-hPL	2.0
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

실시예 IV: 무모 마우스(Hairless nude mouse)를 이용한 주름/피부탄력/수분손실/표피두께 평가

1.실험 설계

그룹 No.	1	2	3	4	5	6	7
UV	-	+	+	+	+	+	+
시료	_	_	EtOH (15%)	RA	리포좀 (2%)	Lipo-hPL	Lipo-His-hPL
부피 (㎕)	-	-	100	100	300	300	300

참고: His-hPL: hPL의 N-말단 Met 다음에 6개의 His가 삽입된 hPL

2. 실험동물의 준비

실험동물은 4 주령의 암컷 SKH-1 무모 마우스를 두열 바이오텍에서 구입하였다(Sungnam, Korea). 실험동물은 온도 24± 2℃, 상대습도 50± 10%, 명암순환이 12시간 단위로 조절되는 조건에서 사육하였으며 2주간 순치시킨 후 임의로 7개의 군으로 나누어 이후 실험을 진행하였다.

UV 조사기기는 VLX-3W stimulator(Vilber Lourmat, Marne la Vallee, France)를 사용하였다. UVB 조사는 주당 3회씩 총 11주간 조사하였다. 조사량은 1-2주는 30 mJ/cm2,3-4주는 40 mJ/cm2,5-9주는 50 mJ/cm2,10-11주는 60 mJ/cm2로 조사하였다. 단백질 군 및 vehicle 군의 처리는 총 11주 동안 매주 5회 각각 300 ㎕씩 도포했다. EtOH(Merck)군과 레티노산(retinoic acid, Sigma) 군은 100㎕씩 처리하였다. UV를 처리하게 되는 날의 경우 UV조사 한 시간 전에 샘플을 도포하여 주었다. 도포는 미리 준비된 샘플을 미술용 3호 붓(Hwasung, Chuncheon, Korea)을 이용하며 등 전체에 골고루 펴 발라 주었다. 각각의 단백질 처리 농도는 다음과 같다.

그룹별 단백질 처리농도

그룹	단백질 처리농도
그룹 1	비처리군, UV(-)
그룹 2	비처리군, UV(+)
그룹 3	15% EtOH 100㎕, UV(+)
그룹 4	EtOH에 0.01% 레티노산 용해(최종 15%), UV(+)
그룹 5	2% 리포좀, UV(+)
그룹 6	Lipo-hPL(20 ㎍/㎖), UV(+)
그룹 7	Lipo-his-hPL(4 ㎍/㎖), UV(+)

3. 무모 마우스를 이용한 Lipo-hPL의 주름개선 효능 분석

장기간에 걸쳐 지속적인 UV가 조사될 경우 SKH-1 무모 마우스에서 굵고 깊은 주름이 생기는 것은 널리 알려져 있다. 본 실험의 육안적 피부 주름의 평가의 기준 또한 UV조사에 의해 형성되는 깊은 주름의 생성을 기준으로 하여 11주 동안의 UV 와 샘플 처리 종료 후 다음과 같은 기준으로 평가했다.

- : 관찰되지 않음(Not observed)

* : 경도 두께 및 깊이의 주름(Mild thick and deep wrinkle)

** : 경도 초과 중등도 미만 두께 및 깊이의 주름(Mild to Morderate thick and deep wrinkle)

*** : 중등도 두께 및 깊이의 주름(Morderate thick and deep wrinkle)

**** : 중등도 초과 중증 미만 두께 및 깊이의 주름(Morderate to severe thick and deep wrinkle)

***** : 중증 두께 및 깊이의 주름(Severely thick and deep wrinkle)

실험결과, 그룹 2 내지 3 및 그룹 5에서 중등도 이상의 주름이 발견되었으나, 그룹 4 및 6 내지 7에서는 경도 또는 중등도 미만의 두께 및 깊이의 주름을 관찰할 수 있었다(도 5).

UV(-)	UV(+)	UV(+) Liposome only	UV(+) Lipo-hPL	UV(+) Lipo-His-hPL	UV(+) EtOH	UV(+) Retinoic acid
-	*****	****	**	**	*****	**

4. 무모 마우스를 이용한 Lipo-hPL의 피부탄력도 및 수분손실도 효능 분석

피부 탄력도 및 수분손실량 측정은 11주 동안의 UV 와 샘플 처리 종료 후 항온 항습실(온도 22± 2℃, 습도 50± 10%)에서 피실험동물을 20분간 안정화 시킨 다음 측정을 수행하였다. 피부 효능 기기 평가에 널리 사용되는 Multi Probe Adaptor systems, MPA580(Courage+Khazaka, Germany)를 이용하여 등(dorsal) 부위에 수분손실량을 Texameter, TM300 probe(Courage+Khazaka, Germany)를 사용하여 측정하고 탄력도는 Cutometer SEM 575 probe(Courage+Khazaka, Germany)로 각각 3회 측정한 수치의 평균을 결과로 하였다(Pressure : 500 mbar, Probe aperture: 2 mm, On-time: 1 seconds, Off-time: 1 seconds, Repetitions: 5).

실험결과, Lipo-hPL의 피부탄력도에 대한 영향은 미미하였으나 다른 실험 (수분손실도, 주름개선, H&E 염색, 인공피부실험) 결과들과 비교 유추할 때 무모 마우스 마리 수를 늘리거나 장기적으로 적용하면 피부탄력도 증가시키리라 생각된다(도 6). 하지만, 수분손실도에서 EtOH 군(그룹 3), UV(+)군(그룹 2) 및 리포좀 군(그룹 5)과 비교하여 Lipo-hPL 군(그룹 6) 및 Lipo-His-hPL(그룹 7) 군은 명확한 수분 손실 방지 효과를 나타내었다(도 7).

5. 무모 마우스를 이용한 Lipo-hPL의 UV에 의한 피부손상 억제 효능 분석

조직 분석을 통한 피부 표피 두께 측정은 11주 동안 UV와 각각의 도포제를 처리한 암컷 SKH-1 무모 마우스의 등 피부조직을 적출하여 4% 파라포름알데히드가 첨가된 0.1M 인산염 고정액에 담가 4℃에 O/N처리하였고, 조직의 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 포매하여 블록을 제작하였다. 다음에 Leica microtome를 이용하여 조직을 3 ㎛의 두께의 절편으로 자른 후, 절편슬라이드를 제작하여 탈파라핀과정과 함수과정을 거친 후, Herris’s 헤마톡실린(Hematoxylin, Sigma, U.S.A.)과 에오신(eosin, Alpha Chem, Inc, U.K.)으로 염색하였다. 그리고나서 Zeiss Axiostar Plus 현미경으로 관찰 후, AxioCam MR 카메라를 이용하여 촬영하였고, Axiovision 소프트웨어를 이용하여 표피두께를 측정하였다.

UV 조사에 의해 주름이 유발된 실험 동물에서 주름 개선에 효과가 있다고 알려진 많은 물질들이 UV 조사에 의한 피부 표피(epidermis) 비후화를 예방하는 것으로 보고되고 있다. 도 8에 나타난 바와 같이, UV 조사에 의해 유발된 피부 주름이 Lipo-hPL 또는 Lipo-His-hPL 처리로 현저하게 개선됐고 또한 조직학적으로 피부 표피 비후화가 감소되었다. 아마도 UV 조사에 의해 기저세포의 복제, 분화, 탈피되는 일련의 과정이 비정상적으로 이루어져 나타나는 피부 표피 비후화가 태반성 락토젠에 의해 피부 표피 기저세포의 항상성(homeostasis)이 정상적으로 이루어져 표피 비후화를 예방하는 것으로 사료된다.

실시예 V: Lipo-hPL의 아토피 피부개선 효능 확인 실험

1. Lipo-hPL의 단기 및 장기 아토피 유발 피부 손상에 대한 효능시험

(1) 피부염 동물 모델

- 실험동물

(주)오리엔트바이오에서 4주령된 수컷 Nc/Nga mouse를 구입하여 24± 2℃의 온도와 50± 10%의 습도 환경에서 12시간 주기의 밤낮 조건으로 사육하였다. 실험동물은 구입후, 실험실환경에서 1주간 순치시킨 후에 실험을 진행하였다.

(2) 아토피 유발

- 단기 아토피 유발

Nc/Nga mouse 등 부위를 제모하여 5% TNCB 150ul를 도포하여 민감성을 증가 시킨 뒤, 1% TNCB으로 Olive Oil에 섞어 주 1회씩 6주 동안 도포하였다.

- 장기 아토피 유발

Nc/Nga mouse 등 부위를 제모하여 5% TNCB 150ul를 도포하여 민감성을 증가 시킨 뒤, 1% TNCB으로 Olive Oil에 섞어 13주 동안 22회 도포하였음.

(3) 군 구성

- 단기 Lipo-hPL 도포 군

군	투여량(ul)	마리수
Group 1: 대조군 (TNCB 및 단백질 무처리군)	0	2
Group 2: TNCB처리 군	150	3
Group 3: Tacrolimus(FK506)처리 군	150	3
Group 4: Lipo-hPL (20ug/ml)	150	3

- 장기 Lipo-hPL 도포 군

군	투여량(ul)	마리수
Group 1: 대조군 (TNCB 및 단백질 무처리군)	0	3
Group 2: TNCB처리 군	150	2
Group 3: Tacrolimus(FK506)처리 군	150	2
Group 4: Lipo hPL (20ug/ml)	150	2

(4) 투여 경로 및 투여 회수

주 5회 피부에 도포하였다.

(5) 평가 항목

가) 피부손상 강도평가

매주 등 부위의 사진을 촬영한 사진을 토대로 피부의 상태를 관찰하여 홍반, 부종,찰과상, 건성의 네 가지 항목에 따라 4단계로 Score를 부여하였다(표 7).

항목 및 증상 기준

항목	Score
홍반 (erythema)	0(no symptoms), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)
부종 (edema)	0(no symptoms), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)
찰과상 (erosion)	0(no symptoms), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)
건성 (dryness, scaling)	0(no symptoms), 1(mild), 2(moderate), 3(severe)

* 증상 없음; 0, 증상이 있는 것 같아 보임; 1, 증상이 뚜렷함; 2, 증상이 심함; 3

나) 혈청 내 IgE 수치 측정

○ 실험을 종료한 후, 복대정맥에서 혈액을 채취 후, 원심분리를 통하여 혈청을 얻어낸다. IgE ELISA kit(고마바이오텍, 한국)을 이용하여 혈청 내 IgE 수치를 측정하였다.

다) 피부조직학적 관찰

○ 실험을 종료한 후, 등 부위의 피부를 적출하여 4% paraformaldehyde에 고정하고, paraffin block으로 제작하여 microtome으로 10um의 두께로 잘라 절편슬라이드를 만들고 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다.

라) 피부두께 측정

○ H&E 염색한 조직슬라이드를 현미경으로 관찰한 사진을 현미경 software의 기능을 이용하여 피부표피부터 지방층과 근육층의 경계부위까지의 두께를 측정하였다.

2) Lipo-hPL의 단기 및 장기 아토피 유발 피부 손상에 대한 효능시험 결과

(1) 피부손상 강도평가

가) 아토피 유발된 Nc/Nga mouse 피부의 단기 도포에 따른 피부손상(도 9)

Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 피부증상 측정결과

	홍반	부종	찰과상	건성
None treat	0	0	0	0
TNCB	8	4	9	6
FK506	3	0	3	3
Lipo-hPL	3	0	2	3

* 최고 점수; 10.

표 9 및 도 10에서 확인할 수 있듯이, Lipo-hPL의 단기 도포를 한 경우, 아토피 유발에 의한 피부 손상을 억제하였다.

다) 아토피 유발된 Nc/Nga mouse 피부의 장기 Lipo-hPL 도포에 따른 피부 손상도 변화

	홍반	부종	찰과상	건성
None treat	0	0	0	0
TNCB	2	2	4.5	6
FK506	1.5	1.5	3.5	3
Lipo-placental lactogen (L-hPL)	1	0	0.5	1.5

* 최고점수; 10점

표 10, 도 11 및 도 12에서 확인할 수 있듯이, Lipo-hPL의 장기 도포를 한 경우, 아토피 유발에 의한 피부 손상을 억제하였다.

(2) 혈청 내 IgE 측정 결과(도 13)

Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발된 Nc/Nga mouse의 혈중내 IgE 수치 측정

	N	IgE(ng/ml)	S.D
None treat	2	3.7	0.7
TNCB	5	99.9	16.9
FK506	3	107.1	10.6
Lipo-hPL	3	71.0	17.6

표 11 및 도 13에서 확인할 수 있듯이, Lipo-hPL의 장기 도포를 한 경우, 아토피 유발에 의한 피부 손상을 억제하였다.

(3) 피부조직학적 관찰

가) Lipo-hPL의 단기 도포(도 14)

나) Lipo-hPL의 장기 도포(도 15)

(4) Lipo-hPL의 도포에 따fms 아토피 유발된 유발된 Nc/Nga mouse의 피부두께 변화(도 16)

2. Lipo-hPL의 도포에 따른 아토피 유발 피부 손상에 대한 효능시험 결과 및 고찰

1) Lipo-hPL의 도포에 따른 단기 및 장기 아토피 유발 피부 손상에 대한 효능시험

(1) Lipo-hPL의 아토피성 피부손상에 대한 효능

○ 단기간 Lipo-hPL을 도포한 Nc/Nga mouse 중 아무것도 바르지 않은 대조군에 비해, 아토피를 유발시키는 TNCB군에서는 9.0± 0.8의 값으로 피부손상이 일어났음을 확인하였고, FK506 도포군은 (3.0± 0.3), Lipo-hPL 도포군은 (2.7± 0.2)의 값으로 피부손상을 억제하는 효과가 나타났다. 또한 장기간 아무것도 바르지 않은 TNCB군은 3.6± 0.7의 값으로 피부손상이 일어났음을 확인하였으며, FK506은 (2.4± 0.7), Lipo-hPL은 (0.8± 0.4) 값으로 피부손상 억제효과가 나타났다.

(2) 피부두께 및 표피두께 변화

○ 정상대조군의 평균치가 289.5± 9.3㎛인데 반해, TNCB군의 평균치는 464.9±34.8㎛로 피부두께가 약 1.6배 증가하였으며, FK506 (408.8± 23.4㎛), Lipo-hPL (366.8± 24.2)군에서는 TNCB처리군에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 또한 정상대조군과 FK506, Lipo-hPL은 비슷한 표피두께로 관찰되었지만 TNCB군에서는 약 10배정도 비후되었음을 관찰하였다.

(3) 혈중 면역 글로블린 E(IgE) 측정

○ 정상 대조군의 수치가 가장 낮은 (3.7± 0.7) 값을 나타냈으며, TNCB군은 (99.9±16.9)로 높게 나타났다. 스테로이드계 면역억제제로 알려진 FK506은 실험군 중 가장 높은 (107.1± 10.6)으로 나타났으며, Lipo-hPL은 (71.0±17.6)으로 감소한 것으로 나타났다.

(4) 피부 조직학적 분석

○ 정상대조군에 비해 TNCB군에서 면역세포의 침윤, 다방향 적혈구의 이동의 이상소견이 관찰되었고, FK506이나 Lipo-hPL을 도포한 군에서는 Eosinophile이 다소 감소하였으며, 또한 Lipo-hPL군은 조직학적 관찰에서 정상대조군과 비슷한 정도의 각질 발생양상을 보였다.

3. 결론

Lipo-hPL은 아토피 유발물질에 의한 단기 및 장기적 피부의 손상을 경감시키고, 표피의 비정상적인 비후 및 각질화를 억제하는 등, 아토피 피부개선 효능이 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 태반성 락토젠(Human Placental Lactogen, hPL)-함유 리포좀을 유효성분으로 포함하는 피부 상태(conditions) 개선용 화장료 조성물로, 상기 피부 상태의 개선은 여드름 치료 또는 개선, 아토피성 피부의 치료 또는 개선, 주름개선, 미백 개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선, 발모촉진, 피부노화 방지 또는 개선 또는 피부보습 개선인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 리포좀은 나노리포좀인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 아토피성 피부의 치료 또는 개선, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지 또는 피부보습 개선인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.