CN105813649B - 用于改善皮肤状况的含有人热休克蛋白90a片段作为活性成分的组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了脂质体和/或纳米脂质体包封的HSP90a、HPf多肽(115个氨基酸)及新的多肽HPfΔC1(101个氨基酸)和HPfΔC2(87个氨基酸)，以及生产/制备和使用所述组合物的方法。提供了包含HSP90a、HPf‑多肽、HPfΔC1或HPfΔC2多肽的嵌合的融合蛋白。提供了能够表达所述嵌合的融合蛋白的转化的细胞系和表达载体。描述了使用表达载体和转化的细胞系制备大量重组HSP90a、HPf多肽、HPfΔC1或HPfΔC2多肽的方法。提供了局部递送及其他递送形式的制剂，以及使用所述制剂的方法，包括改善皮肤状况(特应性皮炎、皱纹、皮肤弹性、暗斑(色素沉着过度)、全面皮肤护理、皮肤老化)的治疗性和化妆性应用的方法。本文公开了促进伤口愈合的脂质体制剂及其使用方法，以及抑制皮下脂肪细胞分化和降低皮下脂肪形成的方法。

Description

用于改善皮肤状况的含有人热休克蛋白90A片段作为活性成 分的组合物

发明背景

相关申请的交叉引用

该国际申请是2014年8月9日于韩国受理局递交的。本PCT申请要求享有2013年8月9日递交的韩国专利申请10-2013-0094930 的优先权。

技术领域

本发明涉及适用于局部施用的组合物，所述组合物包含具有药理活性的多肽，所述多肽被包封于脂质体和/或纳米脂质体内。本发明还涉及制备脂质体和/或纳米脂质体制剂的方法。本发明还涉及改善和/或治疗皮肤状况、促进伤口愈合以及抑制皮下脂肪形成的方法。

相关技术

热休克蛋白90a(下文简称HSP90a)是由两个含有磷酸基团的单体组成的二聚体，其分子量为90KD。在某些条件下，例如在水溶液中时，这两个单体倾向于变得容易寡聚化。已知大多数热休克蛋白在细胞内发挥功能。其他报道表明一些热休克蛋白在细胞外发挥作用，显示了替代性生理作用。有人提出了HSP90a在免疫调节中的作用¹⁰, ¹²。然而，尚未对HSP90a进行系统性研究，其也没有被描述为具有任何影响皮肤状况的活性，如特应性皮炎或皮肤老化，或影响皮下脂肪形成或积聚。HSP90a片段相对大的尺寸排除了将该分子用于局部制剂中，因为其无法渗透皮肤的真皮层⁶。

特应性皮炎(AD)是由角质层缺陷引起的慢性皮肤病症，其通常被认为是特发性的⁹。它影响到成人及儿童。已知在流行病学上其与遗传⁴或环境原因⁷以及免疫学因素⁹有关。

至今没有已知的AD治愈疗法，尽管治疗可减低皮炎斑的严重性和频率。治疗特应性皮炎的常用组合物包括具有抗组胺、类固醇或免疫抑制特性的基于小分子的化合物。或者，可尝试系统性免疫抑制剂，如环孢霉素、甲氨蝶呤、干扰素γ-lb、霉酚酸酯和硫唑嘌呤⁴。然而由于这些基于小分子的化合物伴随有严重的副作用，如长期施用后免疫功能退化，人们亟需治疗这些和其他病况的克服这些障碍的新材料。

不同于基于小分子的药物，使用多肽作为活性成分治疗皮肤病症和/或制备皮肤化妆品具有明显的优势。例如，多肽与免疫系统和细胞相互作用通常更具相容性，且通常通过前生理学方式在体内分解，因此，尤其是在长期使用期间，相比含有小分子(化学品)的制剂，多肽产生更少的副作用。而且，当涉及用于药妆制剂中时，包含小分子的化妆品通常仅产生短期的化妆效果，而包含多肽的药妆制剂已经记载其提供更长期的全面皮肤状况改善，甚至皮肤护理³。然而，很多潜在的有用多肽的总体尺寸和庞大体积阻碍了这些成分渗透到皮肤组织中。

传统上，由于皮肤的角蛋白屏障⁶，具有500道尔顿或更高的分子量的大分子被认为太大而不能透过皮肤的表皮。即使当与化学渗透促进剂一起使用时，分子量大于2000道尔顿的大分子被认为用于局部使用实际上是难以置信的，因为它们无法渗透过皮肤的表皮。因此，被开发为药用/化妆用成分的肽已被局限于具有很小尺寸的那些肽，如尺寸小于10个氨基酸(大概约1100道尔顿分子量)，以便优化所述活性成分至皮肤真皮的递送。因此，尺寸为10个氨基酸或更大的很多潜在的有用多肽没有被应用于局部制剂中。需要将活性成分如多肽递送至皮肤的真皮层，以便通过功能性药用/化妆用制剂来提供最具药学意义的结果。

已报道了基于脂质体递送人生长激素(hGH)，其分子量22,124道尔顿(191个氨基酸大小)^1-3。然而，与有效地局部递送其他药理学上不同的肽/蛋白如热休克蛋白Hsp90a有关的挑战依然存在。

115个氨基酸的热休克蛋白片段(称为HPf)，由跨越天然内源性 HSP序列的连接子和中间结构域的氨基酸序列编码(图1)。已报道了该片段改善了由糖尿病溃疡引起的皮肤坏死⁸。然而，递送产品的改善缺乏促进这些和相关多肽的充分利用和配制。

皮下脂肪是分布最广泛的皮下组织层，其主要由脂肪细胞组成。身体不同区域的脂肪细胞数目各不相同，其大小也根据身体的营养状态而不同(SubcutaneousTissue.Medical Subject Headings(MeSH). NLM Retrieved 5June 2013)。一些报道提出，降低脂肪细胞的大小能改善脂肪细胞对胰岛素的敏感性⁵。已经研发用于抑制脂肪积聚的众多基于小分子的口服递送药物并上市。然而，口服施用这些类型的制剂伴随副作用。在这类应用中，局部制剂应该更有效，还将提供靶向身体的脂肪积聚问题区域的优势，以及其他优势。

在局部制剂中使用多肽的众多障碍之一还是这些多肽和蛋白分子的尺寸和庞大体积，由于皮肤组织的结构，这些多肽无法充分渗透皮肤以便在身体内提供有益的药学和生理学效果。针对该问题的常规方法已采用了微观治疗装置(mesotherapeutic devices)，如微注射针、电穿孔装置、激光治疗和红外辐射。由于多种原因，这些方法还未提供充分有效和便利的方法来局部施用包含肽的制剂。与足够的保质期和产品生物学稳定性有关的问题也限制了基于多肽/肽/蛋白的局部制剂和其他制剂的应用。

医学领域继续存在对具有保持的生物活性和改善的保质期的、经鉴别的基于多肽/蛋白的分子的改良局部制剂的需要。此外，还继续存在对实现有效地递送这些和其他有效多肽/蛋白制剂进入皮肤组织深处从而获得对患者的最大生理益处的需求。本发明提供了针对医学邻域这些和其他技术问题的解决方案，将基于多肽和/或蛋白的分子用于局部递送制剂和其他递送制剂应用和治疗方法。

发明概述

本发明首次提供了脂质体和纳米脂质体包封的热休克蛋白(HSP) 制剂，以及包含HSP的较小多肽片段(即HPf(115个氨基酸)、新的多肽HPfΔC1(101个氨基酸)和HPfΔC2(87个氨基酸))的制剂。所述脂质体制剂还被证明在皮肤表面进行局部递送时具有众多新的和有益的生理效果，包括促进伤口愈合、抑制脂肪细胞分化、改善皮肤状况 (包括特应性皮炎、皱纹、皮肤弹性和暗斑，并促进全面皮肤护理)，并有效递送至皮肤毛囊。

所述多肽组合物和制剂还可提供为纳米脂质体包封的制剂。这些制剂被证明具有长期的储存稳定性并在溶液中保留生物活性。所述制剂还可提供为适于局部施用、微观治疗施用或系统施用的递送形式。

出人意料地，本发明采用基于脂质体的递送制剂中的多肽局部制剂，已实现了有效地递送HPf(HSP90a的115个氨基酸的片段)至完整皮肤和受伤皮肤的角质层。

根据本发明的一些方面，提供了脂质体(尤其是纳米脂质体)包封的多肽组合物，其包含热休克蛋白和HPf多肽或其片段作为活性成分。所述HPf多肽片段可包含具有115个氨基酸的序列(称为HPf) (SEQ ID.No.1)、101个氨基酸的序列(HPfΔC1)(SEQ ID.NO.20)、87 个氨基酸的序列(HPfΔC2)(SEQ ID.NO.21)、HSP90a氨基酸序列 (SEQ.ID NO.2)或它们的组合的多肽。在一些实施方案中，所述组合物被配制为适于局部应用于皮肤，尤其是用于制备药妆制剂(化妆品、皮肤调理剂等)。

在具体的实施方案中，所述纳米脂质体粒径为50-500nm、50- 350nm或100-250nm。

本发明包括以下发现：HSP90a片段如HPf，以及不同于天然序列的合成多肽序列如HPfΔC1(101个氨基酸)和HPfΔC2(87个氨基酸)，促进皮肤细胞的分化(表皮和真皮)，但抑制在皮下层的前脂肪细胞的分化。该活性进而抑制特应性湿疹和/或特应性皮炎的发展和严重性。该特征提供了本发明的另一目的。

在本发明的另一实施方案中，提供了用于抑制皮下脂肪积聚和脂肪细胞分化的药物的组合物。

在另一个方面，本发明提供了降低和/或抑制皮下脂肪积聚和/或抑制皮下脂肪细胞分化的方法，所述方法包括局部应用包含多肽的纳米脂质体组合物，所述多肽具有对应于热休克蛋白片段的序列。在一些实施方案中，所述多肽由115个氨基酸的序列(称为HPf)(SEQ ID. No.1)、101个氨基酸的序列(HPfΔC1)(SEQ ID.NO.20)、87个氨基酸的序列(HPfΔC2)(SEQ ID.NO.21)或HSP90a氨基酸序列(SEQ.ID NO.2)限定，所述多肽被包封于纳米脂质体中。

在另一个方面，本发明提供了用于治疗以下疾病的药物中的纳米脂质体制剂：肥胖症、脂肪团、伴有溃疡的下肢静脉曲张、下半身水肿、静脉曲张、皮肤变色、静脉湿疹、硬皮症、炎性血栓、皮肤溃疡或慢性疼痛。

本发明又一个方面提供了可用于生产和/或制备重组HSP90a和 HPf多肽(HSP90a、HPf、HPfΔC1、HPfΔC2)的转化的细胞系。以示例的方式，可用于制备这些转化的细胞系的细胞系包括TOP 10细胞系、BL21(D3)pLys细胞系、RosettaBlue(DE3)细胞系和RZ4500细胞系。还公开了包含编码融合蛋白的序列的表达载体，所述融合蛋白含有HSP90am HPf和/或HPf多肽片段以及融合伴侣蛋白/肽，所述表达载体用于大规模且经济地生产这些有用的治疗多肽。所述融合蛋白构建体也被确定为本发明的一部分。

本发明另一个方面提供了生产重组HSP90a和HPf多肽，包括 HSP90a、HPf、HPfΔC1和HPfΔC2多肽，的方法。

本发明又一个方面提供了用于治疗皮肤状况的包含HSP90a、 HPf多肽(HSP90a、HPf、HPfΔC1和HPfΔC2)或它们的组合的局部用脂质体多肽制剂，其中所述皮肤状况是特应性皮炎、皱纹、暗斑、皮肤弹性或皮肤老化，其中所述组合物包含浓度约100ng/ml至约1mg/ml的所述HPf多肽或HPf多肽片段。

本发明又一个方面提供了用于治疗皮下脂肪积聚的包含 HSP90a、HPf多肽(HSP90a、HPf、HPfΔC1和HPfΔC2)或它们的组合的局部用脂质体多肽制剂，其中所述制剂包含浓度约100ng/ml至约 1mg/ml的所述多肽。

本发明还提供了HSP90a、HPf多肽或其片段(HPfΔC1、HPfΔC2) 或它们的组合在制备用于治疗皮肤状况的制剂中的用途，其中所述皮肤状况是特应性皮炎、皱纹、暗斑、皮肤弹性或皮肤老化。

本发明还提供了HSP90a、HPf多肽或其片段(HPfΔC1、HPfΔC2) 或它们的组合在制备用于治疗以下疾病的制剂中的用途：肥胖症、脂肪团、伴有溃疡的下肢静脉曲张、下半身水肿、静脉曲张、皮肤变色、静脉湿疹、硬皮症、炎性血栓、皮肤溃疡或慢性疼痛。

附图说明

图1显示了内源性HSP90a多肽三(3)个片段的序列：115个氨基酸的片段(Glu236aa至Asp350aa)，称为HPf；101个氨基酸的片段 (Glu236-Glu336)，称为HPfΔC1；以及87个氨基酸的片段(Glu236- Asp322)，称为HPfΔC2。HPf和HPfΔC2被用作本发明制剂(preparations/formulations)的活性成分。

图2-1显示了HPf(A)与融合伴侣硫氧还蛋白A(TRX)的重组融合蛋白构建体TRX(NGc)-HPf(B)和TRX(TEVc)-HPf(C)，羟胺和TEV 蛋白酶识别位点分别被插入至二者之间，其为HPf的温和切割与纯化所需。图2-2显示了HPfΔC1(A)、TRX(TEVc)-HPfΔC1(B)、 HPfΔC2(C)和TRX(TEVc)-HPfΔC2(D)的结构。TEV蛋白酶识别位点插入在TRX之后，其与HPfΔC1或HPfΔC2偶联，以便促进融合蛋白的切割和HPfΔC1或HPfΔC2纯化。图2-3显示了包含His×6 (“His×6”公开为SEQ ID NO:34)的融合伴侣麦芽糖结合蛋白(MBP)和 TEV的重组融合蛋白构建体MBP(TEVc)-His-TEV(A)，和没有His×6 (“His×6”公开为SEQ ID NO:34)的MBP和HPf的重组融合蛋白构建体MBP(TEVc)-HPf(B)。插入至每个融合构建体中的TEV蛋白酶识别位点是TEV或HPf的温和切割和纯化所需。图2-4显示了HPf和融合伴侣人生长激素(HGH)的重组融合蛋白构建体HGH(TEVc)- HPf，TEV蛋白酶识别位点被插入至二者之间，其为HPf的温和切割与纯化所需。图2-4将“His×7”和“7His”公开为SEQ ID NO:35。图 2-5显示了用于克隆HSP90a基因(B)的引物的位置，以及由所述引物扩增的PCR产物的结果(A)。

图3-1是由其重组表达载体的表达产生的重组蛋白HPf、 TRX(NGc)-HPf和TRX(TEVc)-HPf的SDS-PAGE结果。重组表达载体构建体在RZ4500、BL21(DE3)pLyS和RosettaBlue(DE3)细胞系中表达，以对这些表达载体构建体的表达水平进行定量。图3-2是涉及 HPfΔC2、TRX(TEVc)-HPfΔC1和TRX(TEVc)-HPfΔC2的小量(5ml) 蛋白表达实验的SDS-PAGE结果。图3-3是由其重组表达载体的表达产生的重组蛋白MBP(TEVc)-HPf的SDS-PAGE结果。图3-4是由其重组表达载体表达产生的重组蛋白HGH(TEVc)-HPf的SDS-PAGE结果。图3-5是由HSP90a表达载体转化的大肠杆菌(E.coli)细胞产生的 HSP90a蛋白的SDS-PAGE结果。

图4A是通过TRX(TEVc)-HPf融合蛋白的HPf肽产物(1.对照， 2.HPf，3.对照，4.TRX(TEVc)-HPf)的凝胶结果。图4B是通过 HGH(TEVc)-HPf融合构建体的HPf肽产物(1.HPf，2.HGH(TEVc)- HPf，3.完整HSP90a蛋白)的凝胶结果。

图5A显示了在制备蛋白的大规模发酵(50升)中TRX(TEVc)-HPf 融合蛋白产物随培养时间增加的变化；图5B显示了溶解的氧气的变化。图5C显示了pH(5C)的变化，图5D显示了光密度的变化。

图6显示了从重组TRX(TEVc)-HPf融合蛋白分离HPf的结果，分离为内含体，且其TEV-切割效率取决于所添加的TEV的量。1. 蛋白标记物，2.感受态细胞(阴性对照)，3.总的细胞裂解物，4.匀浆后的上清级分，5.声处理后的球块(内含体),6.球块的洗涤溶液， 7.溶解的内含体，8-11.溶解的内含体+TEV蛋白酶。

图7A是HPLC的结果，图7B是SDS-PAGE，确认纯化的HPf 的纯度。

图8描述了HPf蛋白的MALDI-TOF分析结果，确认其氨基酸序列与HSP90a一致。

图9-1是纯化的HPfl的ELS和GFC分析结果，估计在其纯化期间形成的不同HPfl聚集体的质量、大小和数目。图9-1(A)显示了Ls int.分布(IS)；图9-l(B)显示了Wt.conv.分布(WT)；图9-1(C)显示了 No conv.分布(NO)；图9-1(D)显示了GFC(凝胶过滤层析)曲线图。图 9-2是采用TEM电子显微照片(EF-TEM；能量过滤透射电子显微镜，KBSI,韩国)进行HPf的粒径分析。

图10A-1显示了不同HPf浓度对角化细胞的细胞系(HaCaT)的24 小时孵育存活率的效果，图10A-2、10B-1、10B-2和10B-3显示了不同HPf浓度分别对胚胎纤维母细胞(HEF)的24、48、120和168小时孵育存活率的效果。

图11A显示了随温度和储存时间变化，保存于凝胶状态中的HPf 蛋白的稳定性。图11B随温度和储存时间变化，保存于缓冲液状态中的HPf蛋白的稳定性。

图12通过测量分泌β-己糖胺酶的活性，显示了HPf在RBL-2H3 细胞系中抑制脱颗粒作用的能力。

图13A显示了时间线和检测的HPf处理。图13B-1显示了无 DNFB的特应性皮炎状况。图13B-2显示了仅DNFB的特应性皮炎状况。图13B-3显示了DNFB+对照的特应性皮炎状况，图13B-4显示对通过应用DNFB诱发的NC/Nga小鼠皮肤伤口局部施用HPf，改善了特应性皮炎状况。

图14A-1显示了无处理下的皮肤组织结构变化，图14A-2为仅 DNFB处理，图14A-3为DNFB+对照-1，以及图14A-4为 DNFB+HPf-1处理；图14B显示了对应的一系列组织学样本简直相同的结果。对通过应用DNFB诱发的NC/Nga小鼠皮肤伤口局部施用了 HPf。

图15A显示了在表皮细胞系(HaCaT)(角化细胞)中，KRT10(角蛋白10)、TGM1(转谷胺酰胺酶1)或IVL(外皮蛋白)基因的表达水平。图15B显示了在用HPf或PBS(对照)处理的真皮细胞系 (CCD986-sk)(纤维母细胞)中，KRT10、TGM1或IVL基因的表达水平。在皮肤表皮干细胞分化过程中，角化细胞增加了角蛋白10、转谷胺酰胺酶1和外皮蛋白有关的基因表达。因此，KRT10、TGM1或IVL基因被用作反映角化细胞中细胞分化程度的标记物。

图16显示了HPf对皮下脂肪细胞分化的效果，其由Red O染色 (图16A)和其图解表示(图16B)确认。

图17A(C-l、C-2、C-3)-对照；图17B(H-l、H-2、H-3、H-4)- HPf局部施用于人造的人皮肤。图17C-图解显示了HPf局部施用促进了人造的人皮肤结构中的真皮层增厚。

图18A-应用100μg/ml HPf后的细胞活力。HPf没有影响细胞的活力；图18B-应用100μg/ml HPf后的黑色素含量。HPf抑制了黑色素的生物合成。

发明详述

本发明对于鉴定和制备在体内具有强药理学活性的局部用脂质体包封的HPf多肽和HPf多肽片段组合物进行了深入研究。所述局部制剂包含由SEQ ID.No.1的氨基酸编码的多肽或其片段作为活性成分。所述组合物的药理学活性包括改善皮肤状况，包括特应性皮炎、皱纹、暗斑、改善皮肤弹性和皮肤护理，以及促进伤口愈合。此外，所述组合物还被证明抑制皮下脂肪细胞分化和抑制皮下脂肪的积聚。

术语“人热休克蛋白90a片段”或“HSP90a片段”，是指通过生物化学或DNA重组技术去除了部分序列的HSP90a。HSP90a的多肽片段在本文被描述为HPf。HPf是内源性HSP90a的115个氨基酸的片段，其由跨越氨基酸(aa)236至aa350的序列编码，包括“连接子”区 (参见图1)。HPfΔC1是内源性HSP90a的101个氨基酸的片段，其由跨越aa236至aa336的序列编码；而HPfΔC2是内源性HSP90a的87 个氨基酸的片段，其由跨越HSP90a完整氨基酸序列(SEQID.NO.2) 的aa236至aa322的序列编码(参见图1)。

由于HPf蛋白表现出极高的形成聚集物的倾向，如图9的ELS 和GFC分析所表征，因HPf聚集的原因而检测其氨基酸序列和3D 结构，而本发明人试图设计出可克服该聚集问题的方式。本发明人怀疑HPf中氨基酸序列的疏水性伸展(stretch)可能是该聚集的原因。因此，设计了其他两个构建体HPfΔC1和HPfΔC2，其去除了HPf的疏水性伸展并呈现为新的多肽。所得到的HPfΔC1和HPfΔC2表现出更好的聚集属性(profile)，因而赋予HPfΔC1或HPfΔC2比HPf更好的分离和纯化。当各自进行过表达时，HPfΔC1构建体产生了可溶性 HPfΔC1蛋白形式，而HPfΔC2产生内含体形式。为了提高分离产率和改善纯化效率，选择最小的片段HPfΔC2进一步研究。出人意料地发现，HPfΔC2多肽具有至少与HPf一样的活性，且在某些参数上甚至具有比HPf更好的活性。

基于以下3个因素可确定HPf和HPfΔC2的生化/生物学特性：1) 与HPf或HPfΔC2具有90％以上的氨基酸序列同一性，2)将各片段结合至内源性HSP90a的受体或其他结合蛋白，以及3)HPf或 HPfΔC2的生物学活性。

根据一些实施方案，本发明的组合物是磷脂或脂质体组合物，优选为脂质体或纳米脂质体组合物。在一些实施方案中，HPf(由SEQ ID.NO.1编码)被包封于脂质体或纳米脂质体内，并应用于皮肤。根据一些实施方案，本发明的组合物为被配制用于局部施用的纳米脂质体组合物。

如本文所用，术语“纳米脂质体”是指具有常规脂质体形式且平均粒径为20-1000nm的脂质体。根据一些实施方案，所述纳米脂质体的平均粒径为50-500nm，更优选50-350nm，最优选100-250nm。

如本文所用，术语“脂质体”是指相互结合的胶粒的球形磷脂囊泡，且脂质体由各自具有水溶性头(亲水基团)和水不溶性尾(疏水基团) 的两亲性分子组成，且展现出由它们之间相互作用引起的自发结合产生的结构对齐。脂质体根据其尺寸和层状指数(lamellarity)被分为 SUV(小单层囊泡)、LUV(大单层囊泡)和MLV(多层囊泡)。如上所述，显示多个层状指数的脂质体具有类似于细胞膜的双层膜结构。

可使用磷脂、多元醇、表面活性剂、脂肪酸、盐和/或水制备本发明的纳米脂质体和脂质体。

用作脂质体和纳米脂质体制剂的组分的磷脂是作为两亲性脂质使用的。以示例的方式，所述两亲性脂质包括天然磷脂(例如，蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂和鞘磷脂)和合成磷脂(例如，二棕榈酰磷脂酰胆碱或氢化卵磷脂)，优选卵磷脂。更优选地，所述卵磷脂从大豆或蛋黄提取的天然来源不饱和或饱和卵磷脂。

可用于本发明纳米脂质体的制剂中的多元醇没有特别限制，可包括丙二醇、二丙二醇、1,3-丁二醇、甘油、甲基丙二醇、异戊二醇、戊二醇、赤藓糖醇、木糖醇和山梨糖醇。

可用于本发明纳米脂质体的制剂中的表面活性剂可为本领域已知的任何表面活性剂，其实例包括阴离子表面活性剂(例如，谷氨酸烃基酰基酯、磷酸烃基酯、乳酸烃基酯、磷酸二烃基酯和磷酸三烃基酯)、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂(例如，烷氧基化烃基醚、烷氧基化烃基酯、烃基聚葡糖苷、聚甘油酯和糖酯)。

可用于本发明纳米脂质体的制剂中的脂肪酸为高级脂肪酸，优选具有C12-22烃基链的饱和或不饱和的脂肪酸，其实例包括月桂酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸、油酸和亚油酸。

可用于本发明纳米脂质体的制剂中的水通常为去离子蒸馏水。

根据一些实施方案，仅使用磷脂、盐和水制备本发明的纳米脂质体，如下文的实施例所详述。

根据一些实施方案，通过包括以下步骤的方法制备所述含有HPf 的纳米脂质体：(a)将能够形成脂质体的磷脂(优选蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂)溶解于包含HPf的缓冲盐水溶液中；以及(b)使包含HPf和磷脂的水溶液通过高压匀浆器，随着通过次数增加的同时逐渐增加磷脂含量和高压匀浆器的压力，从而制备包含HPf的纳米脂质体。

包含HPf的水溶液优选为pH 6-8的缓冲液，更优选为如约pH 7 的磷酸钠缓冲液。如使用磷酸钠缓冲液，其浓度优选为5-100mM，更优选5-60mM，甚至更优选10-30mM，最优选约20mM。

使磷脂和所述含有HPf的水溶液的混合物通过高压匀浆器数次，其中随着通过次数增加的同时逐渐增加磷脂含量和所述匀浆器的压力。根据本发明的优选实施方案，所述匀浆器的压力逐渐增加至0- 1000bar，优选0-800bar。在每个循环中所述压力可增加50bar或 100bar，优选100bar。根据本发明的优选实施方案，在每个循环中所述磷脂含量逐渐增加至5-40w/v(％)，更优选5-30w/v(％)。通过所述高压匀浆过程，包括逐渐增加磷脂含量和压力，制备了包含HPf 的纳米脂质体，优选制备液体的包含HPf的纳米脂质体。

在本文中，本发明展现出治疗特应性皮炎的有效性。尽管不受任何具体理论或作用机制的影响，考虑到该效果可能是抑制受影响区域附近免疫功能的同时愈合伤口的结果，然而通常用于特应性皮炎的包含抗组胺或类固醇的组合物，其作用仅为抑制免疫功能而无伤口愈合活性。

本发明的组合物还显示出改善了各种其他皮肤状况。例如，所述组合物为各种皮肤状况提供了有效治疗，包括皱纹、暗斑、改善皮肤弹性、降低皮肤老化和改善皮肤湿度。

而且，本发明的组合物有效抑制皮下脂肪细胞分化，从而降低皮下脂肪积聚。因此，本发明的脂质体包封的HPf有效治疗肥胖症及其伴随的不良因素，如脂肪团、伴有溃疡的下肢静脉曲张、由于静脉曲张引起的下肢水肿、皮肤变色、静脉湿疹、硬皮症、炎性血栓、皮肤溃疡、慢性疼痛、腿功能丧失或由肥胖症引起上述症状的任何组合。

本发明的组合物可提供为化妆用组合物或药物组合物。因此，除了HPf和包封用的纳米脂质体，活性成分和有效成分包括通常用于制备化妆品的组合物，如稳定剂、乳化剂、维生素、着色剂、香料、助剂以及载体或它们的任意组合。上述产物被称为Lipo-HSP90a。

用于改善皮肤状况的本发明化妆用组合物可被配制为众多不同形式，例如，包括溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、软膏、凝胶、乳膏、洗剂、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、粉底乳、粉底蜡和喷雾剂。

可根据制剂类型而改变包含于本发明化妆用组合物中的化妆用可接受的载体。例如，软膏、糊剂、乳膏或凝胶制剂可包含动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌或这些物质的混合物。在粉剂或喷雾剂制剂中，可包含乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末和这些物质的混合物。喷雾剂还可包含常规喷射剂，例如，氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

溶液和乳液制剂可包含溶剂、增溶剂和乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇，油特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯或这些物质的混合物。悬浮液制剂可包含液体稀释剂例如水、乙醇或丙二醇，悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂和黄蓍胶或这些物质的混合物。

肥皂制剂可包含脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸半酯的盐、脂肪酸蛋白水解产物、异硫氰酸酯、羊毛脂、脂肪醇、植物油、甘油、糖或这些物质的混合物。

此外，本发明的化妆用组合物可包含助剂以及载体。助剂的非限制性实例包括防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、着色剂、气味改进剂或这些物质的混合物。

根据本领域技术人员所知的常规技术，本发明的所述药物组合物可与如上所述的药学可接受的载体和/或赋形剂一起配制，最终提供几种形式，包括单位剂量形式。最优选地，所述药物组合物为包含纳米脂质体的溶液。

所述药物组合物包含药学可接受的载体。所述可接受的载体包括但不限于，碳水化合物(例如，乳糖、直链淀粉、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、纤维素)、金合欢胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、糖浆、植物油(例如、玉米油、棉子油、花生油、橄榄油、椰子油)、聚乙二醇、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。本发明的所述药物组合物还可包含润湿剂、甜味剂、乳化剂、缓冲剂、悬浮剂、防腐剂、调味剂、香料、润滑剂、稳定剂或这些物质的混合物。合适的药学可接受的载体和制剂的详情可参见Remington'sPharmaceutical Sciences(1995 年第19版)，其通过引用并入本文。

本发明的所述药物组合物研制用于局部施用于皮肤。本发明的药物组合物的正确剂量将根据以下因素变化：具体制剂，应用方式，患者年龄、体重和性别，饮食，给药时间，患者状况，药物组合，反应敏感性和疾病严重程度。应理解本领域医生能够容易地确定并开出该药物组合物的正确剂量处方。根据本发明的优选实施方案，合适的单位剂量为以10pgHPf/cm²受影响区域至1mg/cm²受影响区域每天施用一次，1ng/cm²至10μg/cm²，最优选10ng/cm²至1μg/cm²。

实施例

以下具体实施例旨在说明本发明，而不应解释为限制所附权利要求书确定的本发明保护范围。

实施例1.获得HSP90a的片段(HPf)

1-1)扩增HSP90a片段(HPf)cDNA

本发明所用的115个氨基酸的多肽(SEQ ID.NO.1)是HSP90a的片段(UniProt id:P07900)，该序列跨越内源性蛋白的氨基酸(aa)no. 236至aa no.350。该片段称为片段HPf。为了大规模制备HPf，将 HPf基因克隆并表达于大肠杆菌(E.coli)。

更具体地，为了克隆来自人cDNA文库的基因，将HEK(人胚胎肾)293细胞系(CRL-1537,ATCC,USA)在6孔板中孵育3天。去除培养基后，加入1ml TRizol溶液(Invitrogen,USA)以溶解所述细胞，然后通过强烈蜗旋10秒钟将其与200μl氯仿混合。所述混合物于 12,000×g(Centrifuge 5418,Eppendorf,USA)离心15min。收集上清液并转移至新的E-管后，加入0.5ml异丙醇并于12,000×g离心10min 以沉淀总RNA。所述总RNA用70％乙醇洗涤一次，然后溶解于无 DNA酶和RNA酶的水中。将该纯化的RNA用于构建cDNA文库。按照生产商的手册中提供的指导，采用Omniscript逆转录试剂盒 (Qiagen,U.S.A.)合成cDNA。首先，将总RNA 1μg、1倍RT缓冲液、dNTP混合物、寡聚-dT引物、RNA酶抑制剂和Omniscript逆转录酶混合，然后加入无DNA酶、RNA酶的水将体积调整为20μl，然后将其于37℃孵育60min以获得cDNA文库。使用所述cDNA文库作为模板，通过PCR扩增制备待克隆的基因。所述PCR混合物含有1倍PCR缓冲液、6.4μl 2.5mM dNTP混合物、模板(上述制备的 cDNA)、0.8μ1100pmole引物储备液(SEQ ID.NO.4和5)和0.4μl校对活性Taq聚合酶(TAKARA,Japan)，总体积为100μl。所述PCR按如下进行：95℃,30秒变性；60℃,30秒退火；72℃,45秒扩增；重复35个循环以扩增HPf基因。随后用琼脂糖凝胶电泳分析产物，以证实HPf基因的扩增。HPf核苷酸序列由SEQID.NO.3编码，氨基酸由SEQ ID.NO.1的序列编码。

1-2)制备重组HPf蛋白

使用限制酶NdeI和KpnI，将使用两个引物(SEQ ID.NO.4和 SEQ ID.NO.5)扩增制备的、从上述实施例步骤1-1)获得的HPf cDNA(SEQ ID.NO.3的cDNA)克隆进入pNKmut质粒(韩国专利第 10-0985746号)(图2-1A)。

为了增加HPf的稳定性和生产，使用TRX(硫氧还蛋白A,pET- 32a,Novagen,USA)、MBP(麦芽糖结合蛋白,GeneScript,USA)或 HGH(人生长激素，DNA-序列ID:NM_000515.3)作为融合伴侣融合于HPf前面，以表达HPf的融合蛋白。

为了促进从与TRX的融合蛋白纯化HPf，将针对羟胺(Asn/Gly； N/G)或TEV(烟草蚀纹病毒)的切割位点插入至融合构建体的TRX和 HPf之间。

为了制备融合蛋白TRX(NGc)-HPf(其为具有内部羟胺切割位点的HPf偶联至融合伴侣TRX的嵌合构建体)，按照上述实施例1-1的步骤，使用引物(SEQ ID.NO.8和SEQID.NO.9)以及pET-32a(0.1 μg)作为模板进行PCR获得TRX DNA部分TRX(NGc)(SEQ ID.NO.18)。类似地，按照上述实施例1-1的步骤，使用引物(SEQ ID.NO.5 和SEQ ID.NO.11)以及pET-32a(0.1μg)作为模板进行PCR获得HPf DNA部分。为了使TRX(NGc)和HPf DNA结合，采用引物(SEQ ID. NO.5和SEQ ID.NO.8)并使用1:1的TRX(NGc)和HPf混合物为模板进行PCR。使用DNA限制酶NdeI和KpnI，将随后的PCR产物亚克隆进入表达载体pNKmut(韩国专利第10-0985746号)(图2-1B)。

同样，为制备融合蛋白TRX(TEVc)-HPf(其为HPf偶联至融合伴侣TRX并具有内部TEV切割位点的嵌合构建体)，按照上述实施例 1-1，使用引物(SEQ ID.NO.8和SEQID.NO.10)和pET-32a(0.1μg) 作为模板进行PCR获得TRX DNA部分TRX(TEVc)(SEQ ID.NO.19)。类似地，按照实施例1-1的相同步骤，使用引物(SEQ ID.NO.5 和SEQ ID.NO.12)进行PCR获得HPf DNA部分。并在TRX和HPf 之间创建BamHI限制位点以便于后续的克隆操作。为使TRX(TEVc) 和HPf DNA结合，使用引物(SEQ ID.NO.5和SEQ ID.NO.8)并将 1:1的TRX(TEVc)和HPf混合物作为模板进行PCR。使用DNA限制酶NdeI和KpnI，将随后的PCR产物亚克隆进入表达载体pNKmut (韩国专利第10-0985746号)(图2-lC)。

从而，在转化的大肠杆菌中制备TRX(NGc)-HPf或TRX(TEVc)- HPf融合蛋白，显示出相比无TRX融合伴侣下制备的HPf具有显著更高的表达水平(图3-1A和3-1B)。

构建了HPf蛋白的c-端缺失突变体：HpfΔC1和HPfΔC2。 HPfΔC1是HSP90a的片段(HSP90a一部分)，由HSP90a蛋白的 Glu236至Glu336的总共101个氨基酸组成(UniProt ID:P0790)，其在 HPf的羧基端删除了14个氨基酸(SEQ ID.NO.20)。同样，HPfΔC2 是HSP90a的片段，由HSP90a的Glu236至Asp322的总共87个氨基酸组成，其比HPf少28个羧基端氨基酸而产生了本发明的最小蛋白(SEQ ID.NO.21)(图1)。

为了表达HPfΔC1重组蛋白，将从实施例1-1步骤获得的HPf cDNA作为模板以及SEQ.no.4和6作为引物，进行如实施例1-1所述的PCR方法。从而获得了与SEQ.no.22序列一致的HPfΔC1基因，并使用DNA限制酶NdeI和KpnI，克隆进入蛋白表达载体 pNKmut(韩国专利第10-0985746号)(图2-2A)。

为了克隆包含偶联有TEV蛋白酶识别位点的硫氧还蛋白A的 TRX(TEVc)-HpfΔC1融合蛋白，采用HPf cDNA作为模板以及 SEQ.no 6和12作为引物按照上述实施例1-1所述的相同PCR方法进行PCR获得HPfΔC1基因。用BamHI和KpnI DNA限制酶消化 TRX(TEVc)-HPf融合蛋白-表达质粒和PCR产生的HPfΔC1基因，然后通过置换将HPfΔC1克隆进入HPf基因缺失的质粒，产生 HGH(TEVc)-HPfΔC1融合蛋白-表达质粒(图2-2B)。

为了表达HPfΔC2重组蛋白，将从实施例1-1步骤获得的HPf cDNA作为模板以及SEQ.no.4和7作为引物，进行如实施例1-1所述的PCR方法，以获得如SEQ.no.23的HPfΔC2。使用DNA限制酶 NdeI和KpnI，将所得的PCR产物克隆进入蛋白表达载体pNKmut (韩国专利第10-0985746号)(图2-2C)。

为了克隆包含偶联有TEV蛋白酶识别位点的硫氧还蛋白A的 TRX(TEVc)-HpfΔC2融合蛋白，采用从实施例1-1获得的HPf cDNA 作为模板以及SEQ.no 7和12作为引物按照上述实施例1-1所述的相同PCR方法进行PCR获得HPfΔC2基因。用BamHI和KpnI DNA限制酶消化TRX(TEVc)-HPf融合蛋白-表达质粒和PCR产生的HPfΔC2 基因，然后通过置换将HPfΔC2克隆进入HPf基因缺失的质粒，产生 HGH(TEVc)-HPfΔC2融合蛋白-表达质粒(图2-2D)。

将TRX(TEVc)-HPfΔC1和TRX(TEVc)-HPfΔC2转化至大肠杆菌菌株中进行大规模发酵，然后用SDS-PAGE确定其各自的蛋白表达。出人意料的是，这两个更小型的蛋白HPfΔC1和HPfΔC2在细胞质中表达为可溶蛋白形式，而所有含HPf的融合蛋白均表达为内含体形式(图3-2C)。

用于所有PCR过程的引物如以下表1中所示。

[表1]用于PCR的引物序列

为了表达偶联至MBP(麦芽糖结合蛋白)融合伴侣的作为融合蛋白的HPf和HPfΔC2，参考Paul,et al(2007)(GeneScript.USA)所述合成MBP-TEV融合构建体。为了促进MBP与其他待表达基因的克隆，通过在MBP和TEV基因开始、末尾和它们之间分别引入DNA 限制酶位点NdeI、KpnI和BamHI来修饰MBP-TEV(图2-3A)。

使用DNA限制酶NdeI和KpnI，将修饰的MBP-TEV基因克隆至蛋白-表达载体pNKmut质粒(韩国专利第10-0985746号)。

回收含有MBP-TEV融合构建体的pNKmut质粒，并用DNA限制酶BamHI和KpnI消化以移除内部的TEV基因。另一方面，使用SEQ ID.NO.5和12作为引物，按照上述实施例1-1所述的PCR方法获得HPf基因。将所得的HPf基因用BamHI和KpnI消化，然后将其插入至用BamHI-KpnI消化的含有MBP的pNKmut质粒，以获得具有如SEQ ID.NO.24所示序列的MBP(TEVc)-HPf融合蛋白-表达质粒(图2-3B)。

通过使用TEV识别位点，将MBP及其偶联的HPf质粒转化至大肠杆菌发酵宿主RZ4500(Biotechnology Institute,Korea University, S.Korea)、BL21(DE3)pLyS(Novagen,USA)和RosettaBlue(DE3) (Novagen,USA)细胞系。使用SDS-PAGE确认各转化株的 MBP(TEVc)-HPf融合蛋白表达。结果表明，BL21(DE3)pLyS转化株在大肠杆菌中显示最高的MBP(TEVc)-HPf融合蛋白表达水平(图3- 3)。

为了表达偶联至HGH(人生长激素)基因的HPf融合构建体，使用HGH基因作为模板(DNA-序列ID:NM_000515.3)以及SEQ ID.NO. 13和14作为引物，按照实施例1-1所述相同的PCR方法进行PCR 以获得HGH基因。

用DNA限制酶NdeI和BamHI消化MBP(TEVc)-HPf融合蛋白- 表达质粒和通过PCR获得的HGH基因，然后通过置换将HGH克隆进入MBP缺失的质粒，产生包含如SEQ ID.NO.25所示序列的 HGH(TEVc)-HPf融合蛋白-表达质粒(图2-4)。将克隆的HGH(TEVc)- HPf融合蛋白-表达质粒转化至RZ4500大肠杆菌细胞系 (Biotechnology Institute,Korea University,S.Korea)进行大规模发酵。观察到表达了大量融合蛋白(图3-4A)。经确认HGH(TEVc)-HPf融合蛋白在大肠杆菌中表达为内含体形式(图3-4B)。

图3-4B的每个株系的解释/描述。

1：RZ4500株(阴性对照组)；2：HGH(TEVc)-HPf-过表达大肠杆菌菌株；3：声处理的匀浆化HGH(TEVc)-HPf-过表达大肠杆菌；4：将声处理匀浆化大肠杆菌离心得到的上清；5：将通过洗涤溶液重悬的内含体离心所收集的上清。

在大肠杆菌中尝试表达完整HSP90a蛋白(732个氨基酸)。使用含有完整HSP90a基因(完整编码区，DNA-序列ID:NM_001017963) 的EST(表达序列标签，克隆ID:IRCMP5012A0834D)克隆的作为模板以及SEQ ID.NO.16和17作为引物，按照上述实施例1-1所述相同的方法进行PCR，获得完整HSP90a基因的部分羧基端片段(图2-5 A)。使用DNA限制酶NdeI和KpnI，将所述完整HSP90a的部分羧基端片段亚克隆进质粒pNKmut(韩国专利第10-0985746号)蛋白-表达载体。为了完成将完整HSP90a基因亚克隆，采用EST克隆作为模板以及SEQ ID.NO.15和16作为引物，按照上述实施例1-1所述相同的方法进行另一PCR(图2-5A)。将所得的PCR产物引入至用NdeI DNA限制酶消化的含有HSP90a的c-末端部分的质粒位点，使得构建编码如SEQ ID.NO.26所示的HSP90a序列的完整HSP90a蛋白表达质粒(图2-5B)。

DNA测序分析了它们的序列，确认其与TRX、MBP、hGH和 HPf的原始序列具有100％同一性。将所述重组cDNA构建体表达于 RZ4500细胞系(Biotechnology Institute,KoreaUniversity,S.Korea)、 BL21(DE3)pLyS(Novagen,USA)和RosettaBlue(DE3)(Novagen,USA) 以获得转化株，然后将其于37℃于5ml LB(Luria-Bertani)培养基中培养l6hr。

用SDS-PAGE分析表达的HPf、TRX(NGc)-HPf、TRX(TEVc)- HPf、MBP(TEVc)-HPf和hGH(TEVc)-HPf的蛋白量，这些结果再次确认了TRX(TEVc)-HPf基因在BL21(DE3)pLyS中的优异表达。因此，证明了该转化株大规模产生重组TRX(TEVc)-HPf融合蛋白(图3- 1、3-2、3-3和3-4)。

实施例2.通过免疫印迹确认重组HPf蛋白的表达

为了进一步确认实施例1所述表达的重组蛋白是否是HPf并源自HSP90a，进行了免疫印迹(图4)。

将表达重组HPf、TRX(TEVc)-HPf、HGH(TEVc)-HPf和完整 HSP90a基因的转化株通过摇动于37℃含有氨苄青霉素的5ml LB培养基中培养16小时。将培养物离心并用SDS-PAGE分析样品。分析所得的电泳凝胶，首先，于12V电泳150min将凝胶上的蛋白转移至 PVDF滤膜(Millipore,USA)。一旦转移完成，则将所述滤膜浸没于封闭缓冲液(10％脱脂奶和0.02％Tween 20和Tris盐缓冲液)中1小时，以抑制任何非特异性结合。然后在室温下将所述PVDF滤膜在含有 HPf特异性抗体(兔抗-HSP90抗体,CalbioChem,USA)的溶液中浸没 90min。通过在洗涤缓冲液(0.02％Tween 20和Tris盐缓冲液)中洗涤所述滤膜3次10min去除非特异性结合。随后将二级抗体羊抗-免疫球蛋白抗体(连接有HRP,KOMA,Korea)加入至反应溶液中并孵育1 小时，然后用洗涤缓冲液将所述滤膜洗涤3次。通过用化学发光最终染色，LAS-4000(Fuji,Japan)免疫印迹结果再次确认所表达的蛋白为 HPf。如图4A所示，仅重组HPf和重组TRX(TEVc)-HPf蛋白被所示抗体识别，确认了它们的同一性。HGH(TEVc)-HPf和完整HSP90a 重组蛋白也被特异性抗体抗-HSP90a识别(图4B)。

实施例3.HPf的大规模制备

将用实施例1所述的含有HPf基因的载体构建体TRX(TEVc)- HPf转化的宿主细胞系RX4500，用于确定所述重组蛋白的最大表达的最佳条件。具体地，将上述RZ4500转化株培养于1升烧瓶中，最初于7升发酵罐(FMT-07/C-B,Fermentec,Korea)，逐渐增加至最终50 L发酵罐(FMT-50,Fermentec,Korea)。50升发酵罐中的培养物混合物含有以下表2中的组分。

[表2]制备重组TRX(TEVc)-HPf蛋白的发酵混合物

化合物	％(W/V)
		NaHPO<sub>4</sub>	0.7
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.3
		NH<sub>4</sub>Cl	0.1
NaCl	0.05
		NaNO<sub>3</sub>	0.1
酵母提取物	4
		甘油	2
水	至100
		pH	7.2

将用TRX(TEVc)-HPf转化的1ml RZ4500制备的种子培养物(甘油母液)添加至500ml LB培养基(pH 7.4)，在2升烧瓶中于37℃摇动培养6小时，直至OD600达0.5至0.6。对于50升发酵罐，通过将种子培养物与培养基按1:100的比例混合制备亚培养物。

随着培养时间的增加，在50升培养物中溶解氧的浓度逐渐降低。15小时后，培养物中保留的溶解氧的浓度为添加种子培养物后立即测量的浓度的10％(图5)。此时将100-200ml热压处理的100％甘油加入至培养物中，以便为宿主细胞补充碳源。

在15小时的发酵过程中，每小时将部分培养物取样，分析pH 值、溶解氧和O.D.值，以确定宿主细胞的生长曲线(图5)。当O.D.值到达35-40时终止发酵。还用SDS-PAGE分析部分培养物并用考马斯亮蓝染色。

随后，使用密度计(Total Lab Quant,Totallab,USA)通过测量相对于预定浓度BSA(牛血清白蛋白，Sigma,USA)的培养物蛋白浓度，以定量表达水平。重组蛋白浓度为1g/L。

实施例4.HPf蛋白的纯化和优化

使用匀浆器将从大量发酵收获的重组细胞匀浆，并用超速离心机 (Hanil,Korea)在0.5％Triton X-100中洗涤。通过在移除上清后收集沉淀物来收集内含体。然后，将其溶解于25mM NaOH，用1％乙酸使其复性并离心。仅收集上清以去除杂质。贯穿所述纯化步骤，移除部分溶液以通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝进行分析。

如图6所示，HPf被表达为宿主细胞的内含体中而非在胞质中 (泳道4和5)的TRX(TEVc)-HPf。在用NaOH变性和用乙酸复性(泳道 7)的过程中其蛋白结构保持完整。随后，加入TEV蛋白酶 (TRX(TEVc)-HPf:蛋白酶＝10:1)并于4℃孵育24小时，以从 TRX(TEVc)-HPf嵌合蛋白分离HPf。如泳道8-11所示，通过SDS- PAGE确认了用TEV蛋白酶对该嵌合体的切割。通过凝胶过滤层析 (GFC)分离所述HPf蛋白。

图6的电泳泳道的结果显示的蛋白：1.标记物蛋白；2.感受态细胞(阴性对照)；3.完整的细胞裂解物；4.匀浆后的上清级分(胞质级分)；5.匀浆后得到的球块(内含体级分)；6.洗涤球块后的上清；7. 溶解的内含体；8-11.用TEV蛋白酶处理的溶解的内含体。通过HPLC和SDS-PAGE测量，纯化的HPf的纯度为>95％。纯化后产率测定为0.1-0.2g/L(图7)。

实施例5.通过MALDI-TOF分析HPf

为了确保来自最终纯化步骤的HPf蛋白源自HPS90a，进行了 MALDI-TOF分析(Voyager-DE STR,Applied BioSystems,USA)。将纯化的HPf电泳后(图7b)，用锋利的剃刀将对应于HPf的条带从凝胶切离。然后将所述凝胶浸没于0.1M(NH₄)HCO₃溶液中1hr。去除上清后，将所述凝胶转移至0.1M(NH₄)HCO₃溶液中的50％乙腈1hr，然后于100％乙腈中15分钟。然后通过将凝胶与25mM(NH₄)HCO₃中的蛋白测序级胰蛋白酶(Promega,USA)于37℃混合16小时，进行在凝胶胰蛋白酶消化。随后，加入含有60％乙腈的5％TFA溶液，以终止该反应，并将该混合物离心。回收上清以通过MALDI-TOF分析确定其分子量。根据使用蛋白质量数据库的分析，纯化的蛋白HPf 是HSP90a的片段(图8)。

实施例6-1.HPf粒径的分析

为了制备用于药用/化妆用制剂的纳米脂质体包封的HPf，使用电泳光散射分光光度计ELS-8000测量HPf粒径。

将来自最终纯化步骤的HPf于pH 7.2的磷酸盐缓冲液中稀释至1 mg/ml(或更高浓度)，使用ELS 8000测定光散射强度、颗粒的重量和数目。如图9-1 A至 图 9-1 C所示，所测得的粒径为约10-14nm。根据使用软件UCSF Chemera程序的分析，HPf单体三维结构的直径为约4.4 nm。

因HPf易于在溶液中寡聚体化，单体和溶液中的HPf的大小可能不同，通过凝胶过滤层析测量其在溶液中的大小。结果显示HPf 的峰紧随蓝色葡聚糖(Blue Dextran)(200kDa,Sigma-Aldrich,USA)，表明了HPf在溶液中没有以寡聚体形式存在(图9-1D)。

实施例6-2.通过电子显微镜分析HPf蛋白大小

使用透射电子显微镜(EF-TEM；Energy Filtering-Transmission ElectronMicroscope,KB SI,Korea)分析HPf蛋白颗粒的大小和图像。用2.5％戊二醛和4％多聚甲醛溶液完成第一固定过程，再用磷酸盐缓冲液洗涤。然后用1％的四氧化锇完成第二固定过程，并从60％乙醇开始，逐级升高至70％、80％、90％、95％和100％进行脱水步骤。用环氧树脂包埋后，用薄片切片机制备样品切片。制备用于切片平台的网格，进行电子染色步骤后观察样品(图9-2)。

实施例7.使用皮肤细胞系评估HPf的安全性

为了测定HPf应用于人类是否安全，将人表皮细胞系(HaCaT) (Schoop,VeronikaM.,Journal of Investigative Dermatology.,112(3): 343-353,1999)和真皮细胞系(HEF)(CRL-7039,ATCC,USA)与HPf一起孵育。用于测试毒性的HPf浓度是Regeron公司生产和销售的化妆品中所用表皮生长因子浓度的10-100倍(1-10μg/ml EGF用于 Clairesome-EF产品系)。具体地，将每个细胞系的2～10×10³个细胞接种于96孔板，并培育在含有10％FBS(胎牛血清白蛋白，Hyclone, USA)的DMEM培养基(Hyclone,USA)中。将HPf以0、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、50和100μg/ml浓度加入至每种细胞，并于37℃在CO₂培养箱中培养所述平板1周。将10μl培养基与5mg/ml MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基溴化四唑， Sigma-Aldrich,USA)混合并于37℃在CO₂培养箱中培养4小时，测量细胞的生长率(％)。将难溶的MTT沉淀溶解于10％Triton X-100和 0.1N HCl后，使用分光光度计SpectraMAX 190(Molecular Device, USA)于595nm测量OD值。培养24小时后，与100μg/ml的HPf混合的细胞保持了90％存活率(图10A)，培育7天后为85％存活率(图 10B)。该结果表明HPf可安全地用作化妆用和药用成分。

实施例8.HPf在水溶液中的稳定性

为了发现如何防止HPf在水溶液中的物理/化学不稳定性和失去生物活性，将HPf溶解于pH 7.2磷酸盐缓冲液或保持在凝胶状态下测量HPf的稳定性。通过混合以下化合物制备用于该分析的凝胶。注意设法排除任何影响HPf蛋白稳定性的潜在干扰因素。

[表3]用于评估HPf稳定性的凝胶组成

化合物	含量(％)
		KOH	0.28
卡波姆	0.4
		甘油	10
苯氧乙醇	0.6
		HPf	1mg/ml
水	88.72

按如下评估稳定性：首先，将HPf在磷酸盐缓冲液中稀释至10 μg/ml，或在凝胶状态下测试时稀释至1mg/ml。使溶液或凝胶处在 4℃或37℃为期一个月。从实验第一天起的第3、7、14和30天采集的样品，用考马斯亮蓝和SDS-PAGE分析蛋白的含量和/或变性。用密度计(TotalLabQuant,Totallab,USA)测量蛋白的稳定性。如图11 所示，HPf保持在磷酸盐缓冲液中或在凝胶状态于4℃或37℃为期一个月始终是稳定的。

实施例9.使用细胞系模型评估HPf治疗特应性皮炎的效力(HPf 通过抑制脱粒作用的抗炎效果)

由IgE介导的肥大细胞脱粒作用是特应性皮炎的典型症状之一。为了评估HPf的抗炎效果，使用嗜碱性细胞系RBL-2H3(CRL-2256, ATCC,USA)测量HPf抑制β-己糖胺酶(脱粒作用的生物标记物)分泌的活性。首先，将2.5×10⁵RBL-2H3细胞接种至48孔板的每个孔中，于37℃在CO₂培养箱中培养3小时。添加IgE至1.0μg/ml并培养24小时以使细胞敏化。然后用HBS(HEPES缓冲盐水)洗涤所述细胞4次以去除未结合的IgE。用800～1000ng/2,4-二硝基苯半抗原-人血清白蛋白(DNP-HSA,Biosearch Technologies,USA)处理以刺激细胞。然后将50μl的上清与200μl含1mM p-硝基苯基N-乙酰β-葡糖胺的0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)混合并保持1小时。添加500μl 0.05M碳酸钠缓冲液(pH10)以终止该反应。使用分光光度计于405nm 测量OD值。结果表明(图12)，与对照(用PBS处理)的抑制效果相比，100μg/ml HPf抑制了60％的β-己糖胺酶分泌。这表明HPf通过抑制β-己糖胺酶分泌来抑制脱粒作用，而能够明显缓解特应性皮炎的症状。

实施例10.使用动物模型评估HPf治疗特应性皮炎的效力

10-1)对伤口愈合的效果

通过局部施用150μl的0.15％2.4-二硝基氟苯(DNFB)(溶解于丙酮:橄榄油＝3:1)每周一次达4周，在NC/Nga小鼠的皮肤上诱导特应性皮炎。按照如下测量HPf的伤口愈合效果：首先，将小鼠分为两组；一组接受局部施用100μl的HPf每周三次达4周，而对照组没有接受HPf。(参见图13A的处理方案)。通过裸眼确定皮肤损伤程度 (伤口)(图13B)，而通过真皮组织染色来测量免疫细胞浸润和其恢复 (图14)。将用于局部施用的含有或不含HPf的组合物制备成凝胶，以使得HPf保留在所应用的区域。

[表4]用于评估HPf治疗特应性皮炎的效力的凝胶的组成。

整个动物测试时期，DNFB除了诱导特应性皮炎外未诱导其他皮肤病症。局部施用DNFB至Nc/Nga小鼠剥离了皮肤的背部诱导了由于受伤引起的角质层分离和炎症(图13B-2)。处理4周后，处理组，即接受DNFB+HPf的组(图13B-4)，的皮肤显示几乎无伤口并有轻微的角化病痕迹，而对照组显示了严重的伤口并有可见的炎症迹象和严重角化病(图13B-3)。这些结果表明了HPf缓解特应性皮炎症状的效力。

10-2)HPf对于伤口愈合和抑制免疫细胞浸润至受特应性皮炎影响的皮肤区域的 效果如动物模型中所示

为了进一步评估HPf对有特应性皮炎的Nc/Nga小鼠的伤口愈合能力，处理后4周切割下一小块皮肤并用H&E(苏木精&伊红)染色 (图14)。在仅接受DNFB的组(图14A-2,14B-2)或没有用HPf处理的对照组(图14A-3,14B-3)，结果显示有明显的角质层分离；而在用 HPf处理的组的皮肤损伤为最小的(图14A-4,14B-4)(参见表4的用于对照组的组分)。已知特应性皮炎引起免疫细胞浸润至受影响的区域附近，因为其倾向于分泌各种趋化性细胞因子。根据H&E染色实验，在仅接受DNFB的组和没有用HPf处理的对照组显示了免疫细胞浸润(图14A-2、14B-2和14A-3、14B-3)，而在用HPf处理的组该浸润为最小(图14A-4、14B-4)。该结果有力地表明HPf能够抑制过度的免疫细胞浸润至受影响的区域，并能够使伤口愈合。

实施例11.HPf对皮肤细胞分化的效果

使用人表皮细胞系HaCaT(Schoop,Veronika M,Journal of InvestigativeDermatology.,112(3):343-353)和纤维母细胞细胞系CCD- 986sk(SCRL-1947,ATCC,USA)评估HPf对角化细胞和纤维母细胞的细胞分化的效果。用HPf(100μg/ml)处理每个细胞系24小时后，提取RNA并进行qRT-PCR(SYBR-Green)。

具体地，将0.3×10⁶个细胞/ml接种于6孔板，将其在含有10％FBS的DMEM(Hyclone,USA)中于37℃在CO₂培养箱培养至细胞达到70-80％汇合。用HPf处理上述细胞达到100μg/ml的最终浓度并培养24小时。去除上清后，加入1ml TRizol溶液(InvitrogenUSA)以溶解所述细胞。然后，加入200μl氯仿后蜗旋10秒，并以12,000×g (Centrifuge5418,Eppendorf,USA)离心15分钟。将上清收集到新的E 管中且与0.5ml异丙醇混合后，再离心10分钟以沉淀总RNA。70％乙醇洗涤总RNA一次，然后溶解于无RNA酶和DNA酶的水中。将该纯化的RNA用于构建cDNA文库。用Omniscript逆转录试剂盒 (Qiagen,U.S.A.)按照生产商的手册中提供的指导来合成cDNA。

首先，将所述总RNA 1μg、1倍RT缓冲液、dNTP混合物、寡聚-dT引物、RNA酶抑制剂和Omniscript逆转录酶混合，然后加入无 RNA酶和DNA酶的水以调整体积至20μl，再将其于37℃孵育60 分钟以获得cDNA。

通过RT-PCR(LightCycler 480,Roche,USA)测定代表细胞分化的程度的标记物基因表达水平，如角蛋白10(KRT10)、转谷胺酰胺酶1 (TGM1)和外皮蛋白(IVL)。用于RT-PCR的引物的序列如表5所示。用于RT-PCR的试剂为购自应用生物系统(Applied Biosystem)公司的 SYBR Green PCR Master Mix。按如下开始PCR：95℃变性10秒，然后60℃退火10秒，以及72℃扩增10秒。该循环重复45次。

在RT-PCR的最后循环时进行熔解曲线分析，以确认不存在非特异性条带。用ddCt算法(Δ-Δ-Ct)分析了RT-PCR产物，结果如图15 所示。它们表明当用HPf处理HaCaT细胞时，针对细胞分化的标记物基因表达水平是对照细胞的20-250倍(图15A)。在CCD986-sk细胞的情况下，当用HPf处理时，标记物基因表达水平是对照细胞的 20倍(图15B)。

这些结果表明，HPf在控制皮肤细胞分化中起着重要的作用，因此可有效地用作伤口愈合药物和/或化妆品的活性成分。

[表5]用于RT-PCR的引物序列

实施例12.HPf对体外皮下脂肪细胞分化的效果

皮下脂肪细胞分泌恰当地维持其结构所需的各种因子，并包含尚未分化的细胞如前脂肪细胞和脂肪干细胞。我们进行实验以发现HPf 是否可促进或抑制脂肪细胞分化。用HPf(100μg/ml)或用PBS(pH 7.2)为对照处理3T3-L1细胞系(CL-173,ATCC,USA)后，用油红O染色细胞以测定HPf对脂肪细胞分化的效果。如图16所示，我们在该研究领域首次证明，用HPf处理的细胞与对照细胞相比表现出降低了40％的脂肪细胞分化。

实施例13.用人造皮肤评估HPf改善皮肤状况的效果

本发明人使用与人皮肤具有极类似3D结构的人造皮肤，研究了 HPf在皮肤调理上的效果。使用Neoderm ED产品(TEGO Cell Science Inc.,Korea)按照生产商提供的方案进行3D人造皮肤培养。Neoderm ED产品具有类似人的表皮和真皮组织结构，因此被频繁用于研制用于皮肤的新药以及化妆品。

胶原蛋白基质和纤维母细胞与细胞培养容器表面上的培养基一起生长后，将角化细胞接种至该表面并培养4天，以获得单层细胞。通过把所述细胞暴露于空气中16-20天来诱导单层真皮细胞。随后用 100μg/ml HPf或用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)处理所述真皮层7天，然后将所述表皮和真皮用H&E染色。图17表明在对照组(图17A-C1-C3) 和HPf处理组(图17B-H1-H4)中表皮层的厚度没有变化；而与对照组相比，HPf处理组的真皮层厚度显示增加为2倍。该结果清楚表明 HPf促进细胞分化和真皮层生长，暗示主要皮肤组织成分如胶原蛋白和弹性蛋白的表达可能由HPf诱导。因此，我们提出HPf可用作改善皱纹或弹性，以及研制改善皮肤状况的化妆品的活性成分。

实施例14.HPf对抑制黑色素生物合成的效果

检测HPf对黑色素生物合成的抑制效果，以测定HPf是否可有效用于皮肤增白。用HPf(100μg/ml)或PBS处理B16F10细胞系 (CRL-6475,ATCC,USA)48小时后。如图18所示通过MTT分析测量细胞存活率和黑色素生物合成。将100μg/ml HPf加入至培养物，相比对照组降低70％的黑色素生物合成，表明HPf对皮肤增白有强烈效果。在安全测试中，100μg/ml HPf没有影响细胞的存活，表明 HPf在该浓度无毒性。

实施例15.制备Lipo-HPf(包封于纳米脂质体中的HPf)

以下材料用于制备Lipo-HPf：大豆卵磷脂(Shindongbang Inc., Korea)作为磷脂、Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH&Co.KG)、Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH&Co.KG)或Emultop(Degussa TexturantSystems Deutschland GmbH&Co.KG)。

将高压匀浆器(最大输出5L/hr,最高压力1200bar,型号HS- 1002；生产商HwasungMachinery Co.,Ltd.,South Korea)的热交换器置于冰水中，使得匀浆器出口的温度不超过30℃。同时用蒸馏水洗涤匀浆器内侧以备操作。然后，将HPf以1mg/ml的浓度溶解于缓冲液(20mM NaH₂P0₄pH 6.5-7.5,1mM EDTA)，以10w/v％的比率加入磷脂，并充分水合和搅拌。于室温和0bar的低压下使搅拌的溶液通过匀浆器3次或更多次。向通过了匀浆器的溶液中加入磷脂至 14w/v％的比率，并充分水合和搅拌。于100bar下使搅拌的溶液通过匀浆器3次或更多次。然后，向该溶液中加入磷脂至18w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于200bar下通过匀浆器3次或更多次。然后，向该溶液中加入磷脂至20w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于300bar下通过匀浆器3次或更多次。然后，向该溶液中加入磷脂至22w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于400bar下通过匀浆器3次或更多次。然后，向在400bar条件下通过了匀浆器的溶液中加入磷脂至24w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于500bar下通过匀浆器3次或更多次。然后，向在500bar条件下通过了匀浆器的溶液中加入磷脂至26w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于600bar 下通过匀浆器3次或更多次。然后，向在600bar条件下通过了匀浆器的溶液中加入磷脂至28w/v％的比率，并充分水合和搅拌，并于 700bar下通过匀浆器3次或更多次。然后，该溶液在800bar下通过匀浆器3次或更多次，然后以15,000×g离心30分钟。然后使上清液通过凝胶色谱分析(GE Healthcare,USA)以去除没有被脂质体包封的 HPf，从而制备含有HPf的脂质体(Lipo-HPf)液体制剂。

对于局部制剂，预期该产品将包括的有效剂量估计为约100 ng/ml至约1mg/ml各种HPf多肽、多肽片段或它们的混合物。

已描述了本发明的具体实施例，应理解在本发明的发明本质之内的其变型和修改对本领域技术人员来说将是显而易见的。本发明的范围并不意图受限于在所述实施例中所提供的实施方案。本发明的范围由所附权利要求书及其等同确定。

序列表

序列I.D.No.1-HPf的氨基酸序列

Glu Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu SerGlu Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu GluLys Lys AspGly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu LeuAsn LysThr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu TyrGly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys HisPhe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Leu Leu Phe Val Pro Arg Arg AlaPro Phe Asp

序列I.D.No.2-HSP90a的完整氨基酸序列

MetProGluGluThrGlnThrGlnAspGlnProMetGluGluGluGluValGluThrPheAlaPheGlnAlaGlu IleAlaGlnLeuMetSerLeuIleIleAsnThrPheTyrSerAsnLysGluIlePheLeuArgGluLeuIleSerAsn SerSerAspAlaLeuAspLysIleArgTyrGluSerLeuThrAspProSerLysLeuAspSerGlyLysGluLeu HisIleAsnLeuIleProAsnLysGlnAspArgThrLeuThrIleValAspThrGlyIleGlyMetThrLysAlaAsp LeuIleAsnAsnLeuGlyThrIleAlaLysSerGlyThrLysAlaPheMetGluAlaLeuGlnAlaGlyAlaAsp IleSerMetIleGlyGlnPheGlyValGlyPheTyrSerAlaTyrLeuValAlaGluLysValThrValIleThrLys HisAsnAspAspGluGlnTyrAlaTrpGluSerSerAlaGlyGlySerPheThrValArgThrAspThrGlyGlu ProMetGlyArgGlyThrLysValIleLeuHisLeuLysGluAspGlnThrGluTyrLeuGluGluArgArgIle LysGluIleValLysLysHisSerGlnPheIleGlyTyrProIleThrLeuPheValGluLysGluArgAspLysGlu ValSerAspAspGluAlaGluGluLysGluAspLysGluGluGluLysGluLysGluGluLysGluSerGluAsp LysProGluIleGluAspValGlySerAspGluGluGluGluLysLysAspGlyAspLysLysLysLysLysLys IleLysGluLysTyrIleAspGlnGluGluLeuAsnLysThrLysProIleTrpThrArgAsnProAspAspIleThr AsnGluGluTyrGlyGluPheTyrLysSerLeuThrAsnAspTrpGluAspHisLeuAlaValLysHisPheSer ValGluGlyGlnLeuGluPheArgAlaLeuLeuPheValProArgArgAlaProPheAspLeuPheGluAsn ArgLysLysLysAsnAsnIleLysLeuTyrValArgArgValPheIleMetAspAsnCysGluGluLeuIlePro GluTyrLeuAsnPheIleArgGlyValValAspSerGluAspLeuProLeuAsnIleSerArgGluMetLeuGln GlnSerLysIleLeuLysValIleArgLysAsnLeuValLysLysCysLeuGluLeuPheThrGluLeuAlaGlu AspLysGluAsnTyrLysLysPheTyrGluGlnPheSerLysAsnIleLysLeuGlyIleHisGluAspSerGln AsnArgLysLysLeuSerGluLeuLeuArgTyrTyrThrSerAlaSerGlyAspGluMetValSerLeuLysAsp TyrCysThrArgMetLysGluAsnGlnLysHisIleTyrTyrIleThrGlyGluThrLysAspGlnValAlaAsn SerAlaPheValGluArgLeuArgLysHisGlyLeuGluValIleTyrMetIleGluProIleAspGluTyrCysVal GlnGlnLeuLysGluPheGluGlyLysThrLeuValSerValThrLysGluGlyLeuGluLeuProGluAspGlu GluGluLysLysLysGlnGluGluLysLysThrLysPheGluAsnLeuCysLysIleMetLysAspIleLeuGlu LysLysValGluLysValValValSerAsnArgLeuValThrSerProCysCysIleValThrSerThrTyrGly TrpThrAlaAsnMetGluArgIleMetLysAlaGlnAlaLeuArgAspAsnSerThrMetGlyTyrMetAlaAla LysLysHisLeuGluIleAsnProAspHisSerIleIleGluThrLeuArgGlnLysAlaGluAlaAspLysAsn AspLysSerValLysAspLeuValIleLeuLeuTyrGluThrAlaLeuLeuSerSerGlyPheSerLeuGluAsp ProGlnThrHisAlaAsnArgIleTyrArgMetIleLysLeuGlyLeuGlyIleAspGluAspAspProThrAla Asp Asp Thr Ser Ala Ala Val Thr Glu Glu Met Pro ProLeu Glu Gly Asp Asp Asp Thr Ser Arg Met Glu Glu Val Asp

序列I.D.No.3-HPf的碱基序列

序列I.D.No.4-PCR引物HPf-up的碱基序列

GAGACATATGGAAGAAAAGGAAGACAAAGAAGAAGAA

序列I.D.No.5-PCR引物HPf-dn的碱基序列

TATAGGTACCTTAATCAAAAGGAGCACGTCGTGGGACA

序列I.D.No.6-PCR引物HPfΔC1-dn的碱基序列

GGGGTACCTCATTCCAACTGTCCTTCAACTGAA

序列I.D.No.7-PCR引物HPfΔC2-dn的碱基序列

GGGGTACCTCAATCTTCCCAGTCATTGGTCAAG

序列I.D.No.8-PCR引物TRX-up的碱基序列

TTAATTCATATGAGCGATAAAATTATTCACC

序列I.D.No.9-PCR引物TRX-NGc-dn的碱基序列

ACCGTTTTTGAACAGCAGC

序列I.D.No.10-PCR引物TRX-TEVc-dn的碱基序列

CTGGAAGTACAGGTTTTCGGATCCATTACCGTTTTTGAACAGCAGCAG

序列I.D.No.11-PCR引物HPf-NGc-up的碱基序列

GCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGAAAAGGAAGACAAAGAAGAAGAA

序列I.D.No.12-PCR引物HPf-TEVc-up的碱基序列

GGATCCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTGAAGAAAAGGAAGACAAAGAAGAAGAA

序列I.D.No.13-PCR引物HGH-Nde-up的碱基序列

GAGACATATGTTCCCGACCATCCCGCTGTCT

序列I.D.No.14-PCR引物HGH-7His-dn的碱基序列

TTTCGGATCCAGAACCATGATGATGGTGATGATGATGACCGAAGCCACAGCTGCCCTC

序列I.D.No.15-PCR引物HSP90(完整)-up的碱基序列

GAGACATATGCCTGAGGAAACCCAGACCCAGACCC

序列I.D.No.16-PCR引物HSP90(完整)-dn的碱基序列

TATAGGTACCTTAGTCTACTTCTTCCATGCGTGAT

序列I.D.No.17-PCR引物HSP90-5p(mid)的碱基序列

ACTGGCGGAAGATAAAGAGAA

序列I.D.No.18-TRX(NGc)的碱基序列

序列I.D.No.19-TRX(TEVc)的碱基序列

序列I.D.No.20-HPfΔC1的氨基酸序列

Glu Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu SerGlu Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu GluLys Lys AspGly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu LeuAsn LysThr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu TyrGly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys HisPhe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu

序列I.D.No.21-HPfΔC2的氨基酸序列

Glu Glu Lys Glu Asp Lys Glu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu SerGlu Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu Glu Glu GluLys Lys AspGly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys Tyr Ile Asp Gln Glu Glu LeuAsn LysThr Lys Pro Ile Trp Thr Arg Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu TyrGly Glu Phe Tyr Lys Ser Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp

序列I.D.No.22-HPfΔC1的碱基序列

序列I.D.No.23-HPfΔC2的碱基序列

序列I.D.No.24-MBP(TEVc)-HPf的碱基序列

序列I.D.No.25-HGH(TEVc)-HPf的碱基序列

序列I.D.No.26-HSP90a完整CDS的碱基序列

序列I.D.No.27-TEV蛋白酶识别序列

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

序列I.D.No.28-KRT10的PCR有义引物的碱基序列

GGTGGGAGTTATGGAGGCAG

序列I.D.No.29-KRT10的PCR反义引物的碱基序列

CGAACTTTGTCCAAGTAGGAAGC

序列I.D.No.30-TGM1的PCR有义引物的碱基序列

CATCAAGAATGGCCTGGTCT

序列I.D.No.31-TGM1的PCR反义引物的碱基序列

CAATCTTGAAGCTGCCATCA

序列I.D.No.32-IVL的PCR有义引物的碱基序列

TCCTCCAGTCAATACCCATCAG

序列I.D.No.33-IVL的PCR反义引物的碱基序列

CAGCAGTCATGTGCTTTTCCT

序列I.D.No.34-合成的6×His标签

His His His His His His

序列I.D.No.35-合成的7×His标签

His His His His His His His

参考文献

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Claims (17)

1.脂质体包封的多肽组合物，其包含由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽，或它们的组合。

2.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述脂质体是纳米脂质体，其粒径为50-500nm。

3.如权利要求2所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述纳米脂质体的粒径为50-350nm。

4.如权利要求3所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述纳米脂质体的粒径为100-250nm。

5.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述多肽是由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽。

6.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述多肽是由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽。

7.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述多肽是由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽和由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽的组合。

8.制备脂质体包封的多肽组合物的方法，其中所述多肽组合物包含脂质体包封的由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽，或它们的组合，所述方法包括：

(a)将能够形成脂质体的磷脂与由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，或由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽溶解于缓冲盐水溶液，所述磷脂包含蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂；以及

(b)使所述水溶液通过高压匀浆器，同时随着通过次数增加逐渐增加磷脂含量和高压匀浆器压力，以提供含有由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽，或它们的组合的脂质体包封的多肽组合物。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述脂质体包封的多肽是由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述脂质体包封的多肽是由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述脂质体包封的多肽是由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽和由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽的组合。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述脂质体包封的多肽组合物是纳米脂质体包封的多肽组合物。

13.用于治疗皮肤状况的包含脂质体包封的多肽组合物的局部制剂，其中所述多肽组合物包含由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽，或它们的组合，所述皮肤状况是特应性皮炎、皱纹、暗斑、皮肤弹性或皮肤老化，其中所述组合物包含浓度为100ng/ml至1mg/ml的由SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列组成的多肽，或由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽。

14.用于治疗皮下脂肪积聚的包含脂质体包封的多肽组合物的局部制剂，其中所述多肽组合物包含由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽，或它们的组合，其中所述组合物包含浓度为100ng/ml至1mg/ml的由SEQID NO:20所示的氨基酸序列组成的多肽，或由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的多肽。

15.脂质体包封的多肽组合物在制备用于治疗皮肤状况的制剂中的用途，其中所述多肽组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HSP90a，由SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列组成的HPf多肽，由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的HPfΔC1多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的HpfΔC2多肽，或它们的组合，其中所述皮肤状况是特应性皮炎或暗斑。

16.脂质体包封的多肽组合物在制备用于治疗皮肤状况的制剂中的用途，其中所述多肽组合物包含由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的HPfΔC1多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的HpfΔC2多肽，或它们的组合，其中所述皮肤状况是皱纹、皮肤弹性或皮肤老化。

17.脂质体包封的多肽组合物在制备用于治疗以下疾病的制剂中的用途：肥胖症、脂肪团、伴有溃疡的下肢静脉曲张、下半身水肿、静脉曲张、皮肤变色、静脉湿疹、硬皮症、炎性血栓、皮肤溃疡或慢性疼痛，所述脂肪团、伴有溃疡的下肢静脉曲张、下半身水肿、静脉曲张、皮肤变色、静脉湿疹、硬皮症、炎性血栓、皮肤溃疡和慢性疼痛是肥胖症导致的，其中所述多肽组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的HSP90a，由SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列组成的HPf多肽，由SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成的HPfΔC1多肽，由SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列组成的HpfΔC2多肽，或它们的组合。

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