BRPI0613284A2 - métodos de aceleração de cicatrização de ferida - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE ACELERAçãO DE CICATRIZAçãO DE FERIDA. São fornecidos métodos de aceleração e/ou melhora da cicatrização de ferida em um sujeito pela administração do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

Description

"MÉTODOS DE ACELERAÇÃO DE CICATRIZAÇÃO DE FERIDA"

Este pedido reivindica prioridade para e benefício do PedidoProvisório dos Estados Unidos Série No. 60/691.909, depositado em 17 dejunho de 2005, e Provisório dos Estados Unidos Série No. 60/794.008,depositado em 21 de abril de 2006, as especificações destes são integralmenteincorporadas ao presente.

Campo Da Invenção

A invenção relaciona-se aos métodos de aceleração ou melhorada cicatrização de ferida pela administração do fator de crescimento endotelialvascular (VEGF).

Antecedentes Da Invenção

Cicatrização de ferida é um processo complexo, que envolve umafase inflamatória, uma fase de formação de tecido de granulação e uma fase deremodelação de tecido. Singer e Clark, Cutaneous Wound Healing, N. Engl. J.Med. 341:738-46 (1999). Estes eventos são acionados por citocinas e fatoresde crescimento que são liberados no local da lesão. Muitos fatores podemcomplicar ou interferir na cicatrização normal adequada. Por exemplo, taisfatores incluem idade, infecção, nutrição deficiente, imunossupressão,medicações, radiação, diabete, doença vascular periférica, enfermidadesistêmica, tabagismo, estresse, etc.

Para pacientes com diabetes, que é uma doença crônica,debilitante que irá afetar aproximadamente 20 milhões de pessoas nos EstadosUnidos em 2005, o desenvolvimento de uma úlcera diabética do pé (tambémreferida como uma ferida) é uma complicação comum. Uma úlcera crônica édefinida como uma ferida que não progride por um processo de restauraçãoordenada e oportuna para produzir integridade anatômica e funcional (ver, porexemplo., Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of woundsand evaluation of healing, Arch. Dermatol 130:489-93 (1994)). Pela suanatureza, a úlcera diabética do pé é uma ferida crônica (American DiabetesAssociation, Consensus development conference on diabetic foot wound care,Diabetes Care, 22(8): 1354-60 (1999)). Devido à pele servir como uma barreiraprimária contra o meio-ambiente, uma ferida refratária pode ser catastrófica,uma maior deficiência (incluindo perda dos membros) e pode até causar amorte. Ulceração do pé é precursora de aproximadamente 85% dasamputações das extremidades inferiores em pessoas com diabetes. Ver, porexemplo, Apelqvist, et ai, What is the most effective way to reduce incidence ofamputation in the diabetic foot? Diabetes Metab Res. Rev., 16(1 Suppl.): S75-S83 (2000).

Foi reportado que existem mais de trinta milhões de feridascutâneas que requerem anualmente intervenções nos Estados Unidos. Ver,por exemplo, Tonnesen et ai., Angiogenesis in Wound Heaiing JiD SymposiumProceedings 5(1):40-46 (2000). As terapias atuais para tratamento de feridasnão tiveram muito êxito devido sua eficácia desapontante e seu custo. Dessaforma, existe uma necessidade em aumentar e otimizar as terapias decicatrização para sujeitos. A presente invenção remete a estas e outrasnecessidades, como será aparente sob revisão das seguintes divulgações.

Descrição Resumida Da Invenção

São fornecidos métodos para acelerar a cicatrização de feridas,por exemplo, aguda (tal como queimadura, ferida cirúrgica, etc) ou crônica (talcomo, uma úlcera diabética, uma úlcera de pressão, uma úlcera de decúbito,uma úlcera venosa), ou normal. São também fornecidos métodos paramelhorar a cicatrização de feridas junto com a redução da quantidade derecorrências de úlceras com a administração do fator de crescimento endotelialvascular (VEGF). Métodos incluem, por exemplo, um método de aceleração decicatrização de feridas em um sujeito, onde um método compreendeadministrar uma quantidade efetiva de VEGF a uma ferida, onde aadministração da quantidade efetiva de VEGF acelera a cicatrização da feridamais que 50%, igual ou mais que 60%, igual ou mais que 70%, igual ou maisque 74%, igual ou mais que 75%, igual ou mais que 80%, igual ou mais que85%, igual ou mais que 90%, igual ou mais que 95%, igual ou mais que 100%,igual ou mais que 110% ou mais, quando comparado a um controle. Umcontrole inclui, mas não está limitado a, por exemplo, um sujeito ao qual não éadministrado o tratamento, ou um sujeito ao qual é administrado umaquantidade subterapêutica do VEGF, ou um sujeito ao qual é administradooutro tratamento para ferida, ou um sujeito ao qual é administrado um placebo,tanto com ou sem Bons Cuidados Com a Ferida (GWC), ou um sujeito ao qualé administrado GWC sozinho. GWC pode incluir, mas não está limitado a, porexemplo, debridamento, limpeza/curativo, alívio da pressão, controle dainfecção e/ou combinações destes. Em uma realiazação, um método deaceleração de cicatrização de ferida em um sujeito humano incluiadministração de uma quantidade efetiva de VEGF a uma ferida, em que aadministração da quantidade efetiva de VEGF acelera a cicatrização de feridamais que 60% quando comparado a um controle e em que a ferida estápresente no sujeito por aproximadamente 4 semanas ou mais antes daadministração da quantidade efetiva de VEGF. Em uma realiazação, ummétodo de aceleração de cicatrização de ferida em um sujeito humano incluiadministração de uma quantidade efetiva de rhVEGF165 a uma feridadiabética, em que a administração da quantidade efetiva de rhVEGF165acelera a cicatrização de ferida mais que 60% quando comparado a umcontrole. Em certas realizações, um agonista do VEGFR pode ser usado nolugar de, ou com VEGF nos métodos.

A avaliação da cicatrização de ferida pode ser determinada, porexemplo, pela % de redução na área da ferida, ou completo fechamento daferida. A área da ferida pode ser determinada pela análise quantitativa, porexemplo, medições da área da ferida, traçados planimétricos da ferida, etc. Ocompleto fechamento da ferida pode ser determinado, por exemplo, porfechamento da pele sem drenagem ou necessidade de curativo. Fotografias daferida, exames clínicos da ferida, etc. podem também ser usados para avaliar acicatrização de ferida. A aceleração da cicatrização de ferida pode serexpressa em termos de % de aceleração ou expressa em termos de umaRazão de Perigo pelo tempo de cicatrização (por exemplo, VEGF versa umcontrole, por exemplo, um placebo), etc. Em certas realizações da invenção, aRazão de Perigo (HR) é maior ou igual a 1,75, ou maior ou igual a 1,8, oumaior ou igual a 1,85, ou maior ou igual a 1,87, ou maior ou igual a 1,9, oumaior ou igual a 1,95, ou maior ou igual a 1,98, ou maior ou igual a 2,0, oumaior ou igual a 2,1 ou mais.

Em uma realização, a ferida também compreende uma infecção.Em outra realização, a ferida é uma ferida isquêmica. Em uma realização, aárea da ferida antes do tratamento é de aproximadamente 0,4 cm2 ou mais, ouaproximadamente 1,0 cm2 óu mais, ou entre aproximadamente 1,0 cm2 eaproximadamente 10,0 cm2, ou entre aproximadamente 1,0 cm2 eaproximadamente 6,5 cm2, ou entre aproximadamente 1,0 cm2 eaproximadamente 5,0 cm2. Em uma realização adicional, a área da ferida édeterminada antes do tratamento com VEGF, mas após debridamento. Emuma realização, a ferida está presente no sujeito por aproximadamente 4semanas ou mais, ou aproximadamente 6 semanas ou mais, antes daadministração do VEGF. Em certos aspectos da invenção, o sujeito está ou foisubmetido a um tratamento, onde o tratamento atrasa ou fornece cicatrizaçãoineficaz da ferida. Em outra realização, o sujeito possui uma condiçãosecundária, em que a condição secundária atrasa ou fornece cicatrizaçãoineficaz da ferida. Em ainda uma realização adicional, a condição secundária édiabetes.Em uma realização, o VEGF administrado é VEGFi6S (porexemplo, VEGF recombinante humano (por exemplo, VEGF16S humano)). Emuma realização, o VEGF é administrado de forma tópica. Em certasrealizações, o VEGF é administrado em combinação com outros fatores queaceleram a cicatrização de ferida (por exemplo, agente ou fator angiogênico,agente ou procedimento de cicatrização, fator de crescimento, etc.). O VEGFpode ser formulado, por exemplo, em uma formulação de liberação lenta, umaformulação em gel, uma bandagem ou curativo, etc. Em certas realizações, osujeito é um humano. Em uma realização, a quantidade efetiva do VEGFadministrado é de aproximadamente 20 pg/cm2 a aproximadamente 250pg/cm2. Em certas realizações, a quantidade efetiva administrada é deaproximadamente 24 pg/cm2 ou 24 pg/cm2. Em certas realizações, aquantidade efetiva administrada é de aproximadamente 72 pg/cm2 ou 72pg/cm2. Em certas realizações, a quantidade efetiva administrada é deaproximadamente 216 pg/cm2 ou 216 pg/cm2. Em uma realização, aquantidade efetiva do VEGF administrado é de 20 pg/cm2 a 250 pg/cm2. Emcertas realizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente24 pg/cm2 a aproximadamente 216 pg/cm2, ou 24 pg/cm2 a 216 pg/cm2. Emcertas realizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente24 pg/cm2 a aproximadamente 72 pg/cm2, ou 24 pg/cm2 a 72 pg/cm2. Emcertas realizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente72 pg/cm2 a aproximadamente 216 pg/cm2, ou 72 pg/cm2 a 216 pg/cm2. Emcertas realizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente216 pg/cm2 a aproximadamente 250 pg/cm2, ou 216 pg/cm2 a 250 pg/cm2.

A administração da quantidade efetiva do VEGF pode ser diáriaou opcionalmente poucas vezes por semana, por exemplo, pelo menos duasvezes por semana, ou pelo menos três vezes por semana, ou pelo menosquatro vezes por semana, ou pelo menos cinco vezes por semana, ou pelomenos seis vezes por semana. Em uma realização, o VEGF é administradopor pelo menos seis semanas, ou mais que seis semanas, ou pelo menos dozesemanas, ou até completar o fechamento da ferida (por exemplo, o qual podeser determinado pelo fechamento da pele sem drenagem ou necessidade decurativo). Em uma realização, o VEGF é administrado por menos que 20semanas por curso de tratamento.

Métodos da invenção também incluem um método de melhora decicatrização de ferida em uma população de sujeitos. Por exemplo, um métodocompreende administração de uma quantidade efetiva de VEGF para umaferida de um sujeito da população, onde a administração da quantidade efetivado VEGF resulta em mais que 10% (ou mais que 12%, ou 14%, ou 15%, ou17%, ou 20%, ou 25%, ou 30%, ou 33%, ou 35%, ou 40%, ou 45%, ou 50% oumais) de melhora na cicatrização de ferida na população comparado a umapopulação controle. Por exemplo, uma população controle inclui, mas não estálimitado a, por exemplo, sujeitos aos quais não é administrado o tratamento,sujeitos aos quais é administrado uma quantidade subterapêutica do VEGF, ousujeitos aos quais é administrado outro tratamento para ferida, ou sujeitos aosquais é administrado um placebo, tanto com ou sem Bons Cuidados Com aFerida (GWC), ou sujeitos aos quais é administrado GWC sozinho. Em umarealização, a melhora da cicatrização de ferida é avaliada pela completacicatrização da ferida. Em certas realizações da invenção, a população incluisujeitos com cicatrização de ferida prejudicada. Em uma realização, apolulação é de pacientes diabéticos com feridas crônicas, por exemplo, poraproximadamente 4 semanas ou mais antes do tratamento.

Métodos para redução de recorrência de úlceras são tambémfornecidos pela invenção. Por exemplo, um método que compreendeadministrar uma quantidade efetiva do VEGF a uma úlcera, onde a incidênciada formação da úlcera é reduzida com a administração do VEGF comparado aum controle. Por exemplo, um controle inclui, mas não está limitado a, porexemplo, um sujeito ao qual não é administrado o tratamento, ou um sujeito aoqual é administrado uma quantidade subterapêutica do VEGF, ou um sujeito aoqual é administrado outro tratamento para ferida, ou um sujeito ao qual éadministrado um placebo, tanto com ou sem Bons Cuidados Com a Ferida(GWC), ou um sujeito ao qual é administrado GWC sozinho.

Breve Descrição Das Figuras

Fig. 1 ilustra um desenho do estudo, por exemplo, 2763g do VGF,para administração do rhVEGF para o tratamento de feridas diabéticas.

Fig. 2 ilustra uma curva de resposta de dose da adição dorhVEGF em um modelo de ferida de orelha isquêmica de coelho no dia 14.

Fig. 3 ilustra uma curva de resposta de dose da adição dorhVEGF em um modelo de camundongo diabético no dia 8.

Descrição Detalhada Da Invenção

Definições

Antes da descrição da invenção em detalhes, deve-se entenderque esta invenção não está limitada a composições específicas ou sistemasbiológicos, que podem, é claro, variar. Entende-se também que a terminologiausada no presente é somente para os propósitos das realizações específicasdescritas, e não tem a intenção de ser limitante. Como usado nestaespecificação e nas especificações anexas, as formas no singular "um", "uma"e "o/a" incluem os plurais referentes, a menos que o conteúdo claramente ditede outra forma. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma molécula"opcionalmente inclui uma combinação de duas ou mais tais moléculas, e ossimilares.

O termo "VEGF" (também referido como VEGF-A) como usado nopresente refere-se a uma proteína fator de crescimento celular endotelial. Otermo "VEGF humano" (também referido como VEGF-A humano) como usadono presente refere-se ao fator de crescimento endotelial vascular humano de165 aminoácidos, e fatores de crescimento endotelial vascular relacionados de121, 145, 183, 189 e 206 aminoácidos (e outras isoformas), como descrito porLeung et al„ Science 246:1306 (1989), e Houck et al., Mol. Endocrín. 5:1806(1991) junto com formas processadas e alélicas destes fatores de crescimento.

Um polipeptídeo de "seqüência nativa" compreende umpolipeptídeo que possui a mesma seqüência de aminoácido em relação àqueladerivada da natureza. Dessa forma, um polipeptídeo de seqüência nativa podeter a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo de ocorrência natural dequalquer mamífero. Tal polipeptídeo de seqüência nativa pode ser isolado danatureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. Otermo "polipeptídeo de seqüência nativa" especificamente engloba formastruncadas ou secretadas de ocorrência natural do polipeptídeo (por exemplo,uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural(por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas dopolipeptídeo de ocorrência natural.

Um polipeptídeo "variante" significa um polipeptídeo ativobiologicamente que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácido com a seqüência do polipeptídeo nativo correspondente oufragmento deste. Tais variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos em queum ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou deletados, no N ouC- terminal do polipeptídeo. Geralmente, um variante terá pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de aminoácido ou pelo menos cerca de 90%de identidade de seqüência de aminoácido, ou pelo menos cerca de 95% oumais de identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência dopolipeptídeo nativo ou fragmento deste. Análogos ou variantes são definidoscomo moléculas em que a seqüência de aminoácido, glicosilação ou outracaracterística do VEGF nativo foi modificada de forma covalente ou nãocovalente.

O termo uVEGF variante" como usado no presente refere-se a umvariante como descrito acima e/ou um VEGF que inclui uma ou mais mutaçõesde aminoácido na seqüência VEGF nativa. Opcionalmente, uma ou maismutações de aminoácido incluem substituição(ões) de aminoácido. VEGF evariantes deste para uso na invenção podem ser preparados por umavariedade de métodos bem conhecidos na técnica. Seqüências de aminoácidovariantes de VEGF podem ser preparadas por mutações no DNA do VEGF.Tais variantes incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições deresíduos dentro da seqüência de aminoácido do VEGF, por exemplo, umaseqüência de aminoácido humana codificada pelo ácido nucléico mostrada nas,patentes 5.332.671; 5.194.596 ou 5.240.848. Qualquer combinação dedeleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção finalque possui a atividade desejada, por exemplo, atividade de VEGF, tal comoaceleração na cicatrização de ferida. As mutações que serão feitas no DNAque codifica a variante não devem colocar a seqüência fora do quadro deleitura e preferivelmente não irão criar regiões complementares que poderiamproduzir estrutura de mRNA secundária. Patente EP 75.444A. VEGF variantespodem ser avaliadas para atividade de VEGF, por exemplo, por um teste deproliferação celular. Por exemplo, um teste de proliferação celular incluiaumento da extensão de crescimento e/ou reprodução da célula, relativo a umcélula não tratada ou um célula tratada reduzida tanto in vitro como in vivo. Umaumento na proliferação celular na cultura celular pode ser detectado pelacontagem do número de células antes e após exposição a uma molécula deinteresse. A extensão da proliferação pode ser quantificada via examemicroscópico do grau de confluência. A proliferação celular pode também serquantificada usando-se o teste de incorporação de timidina.

Os VEGF variantes opcionalmente são preparados pormutagênese sítio dirigida de nucleotídeos no DNA que codifica o VEGF nativoou técnicas de exposição por fago, produzindo com isso DNA que codifica ovariante e posteriormente expressando o DNA na cultura celular recombinante.

Enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência deaminoácido é pré-determinado, a mutação por si mesma não precisa ser pre-determinada. Por exemplo, para otimizar o desempenho de uma mutação emum dado sítio, mutagênese randômica pode ser conduzida no códon ou regiãoalvo e os VEGF expressados são selecionados para a combinação maisadequada para a atividade desejada. Técnicas para fazer mutações desubstituição em sítios pré-determinados no DNA que possui uma seqüênciaconhecida são bem conhecidas, tais como, por exemplo, mutagêneses sítioespecíficas. A preparação dos VEGF variantes descrita no presente pode seralcançada por técnicas de exposição por fago, tais como aquelas descritas napublicação PCT documento WO 00/63380.

Após tal clone ser selecionado, a região da proteína mutada podeser removida e colocada em um vetor apropriado para produção de proteína,geralmente um vetor de expressão do tipo que pode ser empregado paratransformação de um hospedeiro apropriado.

Deleções de seqüência de aminoácido geralmente variam deaproximadamente 1 a 30 resíduos, opcionalmente 1 a 10 resíduos,opcionalmente 1 a 5 resíduos ou menos, e tipicamente são próximos.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões aminoe/ou carboxi-terminal de um resíduo a polipeptídeos de comprimentoessencialmente irrestrito, assim como inserções dentro da seqüência deresíduos de aminoácido simples ou múltiplo. Inserções dentro da seqüência(isto é, inserções dentro da seqüência VEGF nativa) podem variar geralmentede aproximadamente 1 a 10 resíduos, opcionalmente 1 a 5, ou opcionalmente 1a 3. Um exemplo de uma inserção terminal inclui uma fusão de uma seqüênciasinal, heteróloga ou homóloga à célula hospedeira, ao N-terminal para facilitara secreção de hospedeiros recombinantes.

VEGF variantes adicionais são aqueles em que pelo menos umresíduo de aminoácido no VEGF nativo foi removido e um resíduo diferente foiinserido em seu lugar. Tais substituições podem ser feitas de acordo com aquelasmostradas na Tabela 1. VEGF variantes podem também compreenderaminoácidos não naturais como descrito no presente.

Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com suassimilaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L.Lehninger, em Biochemistry, segunda edição., páginas 73-75, WorthPublishers, Nova York (1975)):

(1) não polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W)1 Met (M)

(2) polar não carregada: Gly (G)1 Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N)1 Gln

(Q)

(3) acídica: Asp (D), Glu (E)

(4) básica: Lys (K), Arg (R), His(H)

Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem serdivididos em grupos baseado em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) acídica: Asp, Glu;

(4) básica: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro;

(6) aromática: Trp1 Tyr, Phe.

Tabela 1

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"Resíduos de aminoácido de ocorrência natural" (isto é,aminoácidos codificados pelo código genético) podem ser selecionados dogrupo que consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácidoaspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina(GIy); histidina (His); isoleucina (lie): Ieucina (Leu); Iisina (Lys); metionina (Met);fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp);tirosina (Tyr) e valina (Vai). Um "resíduo de aminoácido que não ocorrenaturalmente" refere-se a um resíduo diferente daqueles resíduos deaminoácido que ocorrem naturalmente listados acima, os quais são capazes deligar-se covalentemente a resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) em umacadeia de polipeptídeo. Exemplos de resíduos de aminoácido que não ocorrenaturalmente incluem, por exemplo, norleucina, ornitina, norvalina, homoserinae outros resíduos de aminoácidos análogos, tais como aqueles descritos emEllman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) e publicações de pedido depatente US 20030108885 e 20030082575. Resumidamente, estesprocedimentos envolvem ativação de um supressor tRNA com um resíduo deaminoácido que não ocorre naturalmente seguido por transcrição e tradução doRNA in vitro ou in vivo. Ver, por exemplo, publicações de pedido de patenteUS 20030108885 e 20030082575; Noren et al. Science 244:182 (1989) eEllman et ai, acima.

"Porcentagem (%) de identidade de seqüência aminoácido" nopresente é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em umaseqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em umaseqüência selecionada, após alinhamento das seqüências e introdução degaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade deseqüência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parteda identidade de seqüência. Alinhamento para os propósitos de determinaçãoda porcentagem de identidade de seqüência de aminoácido pode seralcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, porexemplo, usando-se programas de computador disponíveis publicamente taiscomo os programas BLAST1 BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign(DNASTAR). Esses técnicos no assunto podem determinar parâmetrosapropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmosnecessários para alcançar o máximo alinhamento sobre o comprimento totaldas seqüências sendo comparadas. Para os propósitos no presente, noentanto, valores de % de identidade de seqüência de aminoácido são obtidoscomo descrito abaixo pelo uso do programa de computador de comparação deseqüência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüênciaALIGN-2 foi autorado pela Genentech, Inc. e foi depositado com documentaçãode usuário no US Copyright Office, Washington, DC, 20559, registrado sob USCopyright Registration No.TXU510087, e está publicamente disponível pormeio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX,preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação deseqüência são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Para os propósitos no presente, a % de identidade de seqüênciade aminoácido de uma dada seqüência de aminoácido A a, com, ou emcomparação a uma dada seqüência de aminoácido B (que podealternativamente ser formulada como uma dada seqüência de aminoácido Aque possui ou compreende uma certa % de identidade de seqüência deaminoácido idêntica a, com, ou em comparação a uma dada seqüência deaminoácido B) é calculada como segue:

100 vezes a fração X/Y

onde X é o número de resíduos de aminoácido conseguidos como partidasidênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 nessealinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos deaminoácidos em B. Será apreciado que onde o comprimento da seqüência deaminoácido A não é igual ao comprimento da seqüência de aminoácido B1 a %da identidade de seqüência de aminoácido de A para B não seja igual a % daidentidade de seqüência de aminoácido B para A.

O termo "receptor do VEGF" ou "VEGFR" como usado nopresente refere-se a um receptor celular para VEGF, comumente um receptorde superfície celular encontrado nas células endoteliais vasculares, comotambém variantes destes que mantêm a habilidade para se ligar ao VEGF.

O termo "agonista do VEGFR" refere-se a uma molécula que podeativar um receptor do VEGF e aumentar sua expressão. Agonistas do VEGFRincluem, mas não são limitados a, por exemplo, agonistas Iigantes de umVEGFR, variantes do VEGF, anticorpos e fragmentos ativos. VEGF é umagonista do VEGFR, mas no presente está listado e referido separadamente.

O termo "anticorpo anti-VEGFR" é um anticorpo que se liga ao VEGFR comafinidade e especificidade suficiente. Em uma realização, o anticorpo agonistaanti-VEGFR da invenção pode ser usado como um agente terapêutico notratamento de feridas. Em outra realização, um VEGF variante pode ser usadocomo um agente terapêutico no tratamento de feridas.

O termo "anticorpo" é usado no senso mais amplo e incluianticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimentototal), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorposmultiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos deanticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.[0002] A menos que indicado de outra forma, a expressão "anticorpomultivalente" é usada para denotar um anticorpo que compreende três ou maissítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente é tipicamenteengenheirado para ter três ou mais sítios de ligação de antígeno e geralmentenão é um anticorpo IgM ou IgA de seqüência nativa.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem somente uma porção deum anticorpo intacto, geralmente incluindo um sítio de ligação de antígeno doanticorpo intacto e dessa forma mantendo a habilidade de ligação ao antígeno.Exemplos de fragmentos de anticorpo englobados pela presente definiçãoincluem: (i) o fragmento Fab, que possui domínios VL1 CL, VH e CH1; (ii) ofragmento Fab', que é um fragmento Fab que possui um ou mais resíduoscisteína no C-terminal do domínio CH1; (iii) o fragmento Fd que possuidomínios VH e CH1; (iv) o fragmento Fd' que possui domínios VH e CH1 e umou mais resíduos cisteína no C-terminal do domínio CH1; (ν) o fragmento Fvque possui os domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; (vi) ofragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste de umdomínio VH; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab*)2, um fragmentobivalente que inclui dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte bissulfeto naregião de dobradiça; (ix) moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo,cadeia única Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); e Huston et al.,PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacorpos" com dois sítios de ligaçãode antígeno, que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH)conectados a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia dopolipeptídeo (ver, por exemplo, patente EP 404,097; documento WO 93/11161;e Hollinger et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi)"anticorpos lineares" que compreendem um par de segmentos acoplados (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com polipeptídeos de cadeia leve complementares,formam um par de regiões de ligação de antígeno (Zapata et al. Protein Eng.8(10):1057 1062 (1995); e patente US 5.641.870).

O termo "anticorpo monoclonal" como usado no presente refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmentehomogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a populaçãosão idênticos, exceto pela possível ocorrência natural de mutações que podemestar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais sãoaltamente específicos, sendo dirigidos contra um único antígeno. Além disto,em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluemanticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cadaanticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Omodificador "monoclonal" não será interpretado como requerendo produção doanticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorposmonoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podemser produzidos pelo método de hibridoma, primeiro descrito por Kohler et ai,Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNArecombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os "anticorposmonoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo em fagoque utilizam as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) e Marks et ai, J. Moi Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais no presente especificamente incluemanticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve éidêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivadosde uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasseespecífica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ouhomóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outraespécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, assim comofragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Nati Acad. Sei.USA 81:6851-6855 (1984)).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da regiãode estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduoscorrespondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou noanticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar odesempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreendersubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveiscorrespondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência deimunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá tambémcompreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) daimunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Paradetalhes adicionais, ver Jones et ai, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann etai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596(1992).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por umhumano e/ou foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazeranticorpos humanos como divulgado no presente. Esta definição de umanticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado quecompreende resíduos de ligação de antígeno não humanos. Anticorposhumanos podem ser produzidos usando-se técnicas conhecidas. Em umarealização, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fago, ondeesta biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan et al. NatureBiotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et ai PNAS (USA) 95:6157-6162(1998)); Hoogenboom e Winter1 J. Moi Biol., 227:381 (1991); Marks et ai, J.Moi. Bioi, 222:581 (1991)). Anticorpos humanos podem também ser feitospela introdução de imunoglobulina humana local em animais transgênicos, porexemplo, camundongos em que os genes de imunoglobulina endógenos foramparcialmente ou completamente inativados. Sob desafio, é observadaprodução de anticorpo humano, que intimamente lembra aquela vista emhumanos em todos os aspectos, incluindo rearranjo de gene, montagem erepertório de anticorpo. Esta abordagem está descrita, por exemplo, naspatentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425,5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et ai.,BioiTechnoiogy 10: 779-783 (1992); Lonberg et ai, Nature, 368: 856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., NatureBiotechnoiogy 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnoiogy, 14: 826(1996); Lonberg e Huszar, intern. Rev. Immunoi, 13:65-93 (1995).Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado via imortalização delinfócito B humano que produz um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo(tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem serimunizados in vitro). Ver, por exemplo, Cole et ai., Monocionai Antibodies andCâncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et ai., J. immunoi, 147(1):86-95 (1991); e patente US 5.750.373.

Diabetes é uma doença crônica que afeta o metabolismo decarboidrato, gordura e proteína nos animais. Diabetes é a principal causa decegueira, insuficiência renal e amputações dos membros inferiores em adultose é um principal fator de risco para doenças cardiovasculares e derrame.

Diabetes mellitus tipo I (ou diabetes mellitus dependente deinsulina ("IDDM") ou diabetes juvenil) compreende aproximadamente 10% dototal de casos de diabetes. A doença é caracterizada por uma perdaprogressiva da função de secreção de insulina pelas células beta do pâncreas.Esta característica é também compartilhada pela diabetes não idiopática ou"secundária" que tem sua origem na doença pancreática. Diabetes mellitus tipoI está associada com os seguintes sinais ou sintomas clínicos, por exemplo,concentração elevada de glicose no plasma de forma persistente ouhiperglicemia; poliúria; polidipsia e/ou hiperfagia; complicações microvascularescrônicas tais como retinopatia, nefropatia e neuropatia; e complicaçõesmacrovasculares tais como hiperlipidemia e hipertensão que podem levar àcegueira, insuficiência renal crônica, amputação de membros e infarte domiocárdio.

Diabetes mellitus tipo Il (diabetes mellitus não dependente deinsulina ou NIDDM) é uma disfunção metabólica que envolve a desregulaçãodo metabolismo da glicose e prejudica a sensibilidade de insulina. Diabetesmellitus tipo Il usualmente se desenvolve na idade adulta e está associada coma incapacidade do corpo em utilizar ou fabricar insulina suficiente. Além disso,para a resistência à insulina observada nos tecidos alvo, pacientes que sofremde diabetes mellitus tipo Il possuem uma deficiência relativa à insulina, querdizer, os pacientes possuem níveis previstos de insulina mais baixos para umadada concentração de glicose no plasma. Diabetes mellitus tipo Il écaracterizada pelos seguintes sinais ou sintomas clínicos, por exemplo,concentração elevada de glicose no plasma de forma persistente ouhiperglicemia; poliúria; polidipsia e/ou hiperfagia; complicações microvascularescrônicas tais como retinopatia, nefropatia e neuropatia; e complicaçõesmacrovasculares tais como hiperlipidemia e hipertensão que podem levar àcegueira, insuficiência renal crônica, amputação de membros e infarte domiocárdio.

"Sujeito" para os propósitos da invenção refere-se a qualqueranimal. Geralmente, o animal é um mamífero. "Mamífero" para os propósitosda invenção refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero,incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e zoológico, esportes, ouanimais de estimação, tais como cachorros, cavalos, gatos, gado, ovelhas,porcos, etc. Tipicamente, o mamífero é humano.

O termo "acelerar a cicatrização de ferida" ou "aceleração dacicatrização de ferida" refere-se ao aumento na taxa de cicatrização, porexemplo, uma redução no tempo até ocorrer o fechamento completo da feridaou uma redução no tempo até uma % de redução na área que ocorre a ferida.

O termo "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamenteefetiva" refere-se a uma quantidade de uma droga efetiva para acelerar oumelhorar a cicatrização de feridas em um sujeito ou prevenir recorrência deuma úlcera em um sujeito. Uma dose terapêutica é uma dose que exibe umefeito terapêutico no sujeito e uma dose sub-terapêutica é uma dose que nãoexibe um efeito terapêutico no sujeito tratado.

Administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos adicionais inclui simultânea (concorrente) e administraçãoconsecutiva em qualquer ordém.

"Tratamento" refere-se a ambos os tratamentos, terapêutico eprofilático ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamentoincluem aqueles já com a doença, assim como aqueles em que a doença seráprevenida.

"Cicatrização de ferida" refere-se a uma condição que sebeneficiaria do tratamento com uma molécula da invenção.

Uma "ferida crônica" refere-se a uma ferida que não cicatriza.Ver, por exemplo, Lazarus et ai, Definitions and guidelines for assessment ofwounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Feridascrônicas incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, úlceras arteriais,úlceras diabéticas, úlceras venosas, etc. Uma ferida aguda pode sedesenvolver para uma ferida crônica. Feridas agudas incluem, mas não estãolimitadas a, feridas causadas por, por exemplo, lesão termal, trauma, cirurgia,amputação de câncer de pele extenso, infecções profundas fúngicas ebacterianas, vasculite, escleroderma, pênfigo, necrólise epidérmica tóxica, etc.Ver, por exemplo, Buford, Wound Healing and Pressure Sores,HealingWell.com, publicado em: 24 de outubro de 2001. Uma "ferida normal"refere-se a uma ferida que passa por uma restauração de cicatrização de feridanormal.

"Bons cuidados com a ferida" refere-se às etapas para cuidar deuma ferida. Por exemplo, práticas de bons cuidados com as feridas incluem,mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes, debridamento (porexemplo, cirurgia/corte, mecânico, autolítico ou químico/enzimático), limpeza(por exemplo, rotina de limpeza da ferida com, por exemplo, solução salina),curativo, alívio da pressão (por exemplo, descarregar a pressão dos pés),manutanção de um ambiente molhado da ferida, e/ou controle da infecção (porexemplo, pomada antibiótica ou pílula). Outras etapas opcionalmente incluem,adaptação do sujeito com calçados acolchoados confortáveis, suportenutricional, manutenção do controle de glicose no sangue, gerenciamento deoutros fatores de risco (por exemplo, peso, tabagismo), etc. GWC pode incluiruma ou mais destas práticas.

A expressão "trauma que afeta o endotélio vascular" refere-se aotrauma, tal como lesão aos vasos sangüíneos ou coração, incluindo a redevascular dos órgãos, à qual um animal ou humano, preferivelmente ummamífero e mais preferivelmente um humano, está sujeito. Exemplos de taltrauma incluem, feridas, incisões e úlceras, ou lacerações dos vasossangüíneos ou coração. Trauma inclui condições causadas por eventosinternos, como também aquelas que são impostas por um agente extrínsecoque pode ser melhorado pela promoção do crescimento celular endotelialvascular.Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento queestimula o desenvolvimento dos vasos sangüíneos, por exemplo, promove aangiogênese, crescimento endotelial, estabilidade dos vasos sangüíneos, e/ouvasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos, incluem, mas nãoestão limitados a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF, PIGF,família PDGF, fator hereditário de crescimento de fibroblasto (FGFs), IigantesTIE (Angiopoietinas), efrinas, ANGPTL3, ANGPTL4, etc. Também incluifatores, tais como hormônio do crescimento, fator I de cresciemento similar ainsulina (IGF-I), VIGF, fator de crescimento epidermal (EGF), CTGF e membrosdesta família, e TGF-cc e TGF-β. Ver/por exemplo, Klagsbrun e D1Amore,Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Toniniet al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por exemplo, Tabela 1 listando fatoresangiogênicos); e, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).

ClCATRIZAÇÃO DE FERIDA

A cicatrização de ferida é um processo complexo que envolve trêsfases principais: Inflamação, tecido de granulação e remodelação de tecido Nolocal da ferida existem muitos processos ocorrendo, por exemplo,migração/contração, produção de metaloproteases de matriz (MMP),proliferação e angiogênese. Há contração (diminuição da ferida),epitelialização (criação de novas células epiteliais) e deposição de tecidoconjuntivo com o objetivo de curar a ferida. Ver Singer & Clark, CutaneousWound Healing N. Engl. J. Med., 341:738-46 (1999). Um dos objetivos daterapia de cicatrização é promover a matriz de granulação, onde umsuprimento adequado de sangue é necessário. No entanto, fatores de risco,freqüentemente associados com estados da doença, (por exemplo, incluem,mas não estão limitados a, idade, infecção, nutrição deficiente,imunossupressão, medicações, radiação, diabetes, doença vascular periférica,enfermidade sistêmica, tabagismo, estresse, etc.) criam desafios para acicatrização de ferida.

Exemplos de alguns fatores de risco para úlcera do pé diabéticoincluem neuropatia periférica, que afeta ambas as funções, motora e sensorialdo pé, mobilidade limitada das articulações, deformidade dos pés, distribuiçãoanormal da pressão do pé, trauma secundário repetitivo e acuidade visualprejudicada. Ver, por exemplo, Boyko et a/., A prospective study ofrisk factorsfordiabetic foot ulcer, The SeaWe Diabetic Foot Study, Diabetes Care, 22:1036-42 (1999); e Apelqvist et ai., International consensus and practical guidelines onthe management and the prevention of the diabetic foot, International WorkingGroup on the Diabetic Foot., Diabetes Metab Res. Rev., 16(1 Suppl.): S84-S92(2000). Neuropatia sensorial periférica é um fator primário. Aproximadamente45%-60% de todas as ulcerações diabéticas são neuropáticas, enquanto maisde 45% possuem tanto componentes neuropáticos como sistêmicos. Com umpé insensível, o paciente é incapaz de perceber lesões repetitivas no pé,causadas por, por exemplo, calçados mal ajustados durante passeio eatividades diárias. Neuropatia, combinada com a biomecânica de caminharalterada, leva ao trauma cego e distribuição de altas cargas de estresseanormais para porções vulneráveis do pé, o que resulta na formação de calo eerosões cutâneas. Uma vez que uma úlcera é formada, freqüentemente reduza velocidade da cura, pode continuar a aumentar, fornecer uma oportunidadepara infecção sistêmica local e necessitar de cuidado médico e cirúrgicoabrangente para promover a cura.

Existem também desafios para criar terapias de proteínas paraacelerar a cicatrização de ferida, por exemplo, acelerar a cicatrização deferidas crônicas, por exemplo, úlceras do pé diabético. A área da ferida é umambiente hostil (enzimas proteolíticas, inibidores naturalmente produzidos daatividade de proteína junto com infecção sobreposta), onde freqüentemente noestado da doença (por exemplo, em diabetes) os fatores do hospedeiro estãoalterados (por exemplo, na diabetes existe expressão suprimida do VEGF,prejudicando a resposta do VEGF à hipoxia, metabolismo celular alterado,resposta imune/inflamatória suprimida, etc.). Por exemplo, baseado nosestudos in vitro, queratinócitos e fibroblastos de camundongos diabéticos(db/db) exibem defeitos seletivos de processos celulares essenciais para oreparo normal dos tecidos, e fibroblastos db/db mostram migração celularreduzida e alterações no fator de crescimento. Ver, por exemplo, Frank et aí.,Regulation of vascular endothelial growth factor expression in culturedkeratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing, J. BioLChem., 270:12607-13 (1995); e, Lerman et al, Cellular dysfunction in thediabetic fibroblast: Jmpairment in migration, vascular endothelial growth factorproduction, and response to hypoxia, Am. J. Pathol., 162:303-12 (2003).

São fornecidos no presente, métodos para acelerar e/ou melhorara cicatrização de feridas, pela administração de quantidade efetiva do VEGF ouum agonista do VEGF. Por exemplo, um método que compreende administraruma quantidade efetiva do VEGF a uma ferida de um sujeito, onde aadministração da quantidade efetiva do VEGF acelera a cicatrização de ferida.Métodos também incluem um método de melhora de cicatrização de ferida emuma população de sujeitos. Por exemplo, um método compreendeadministração de uma quantidade efetiva de VEGF para uma ferida de umsujeito da população, em que a administração da quantidade efetiva do VEGFresulta em mais que 10% (ou mais que 12%, ou 14%, ou 15%, ou 17%, ou20%, ou 25%, ou 30%, ou 33%, ou 35%, ou 40%, ou 45%, ou 50% ou mais) demelhora na cicatrização de ferida na população comparado a um controle.-{}-Métodos para redução de recorrência de úlceras são também fornecidos. Porexemplo, um método que compreende administrar uma quantidade efetiva doVEGF a uma úlcera, em que a incidência da recorrência da úlcera é reduzidacom a administração do VEGF comparado a um controle.

Métodos são também aplicáveis aos sujeitos que estão ou foramsubmetidos a um tratamento, onde o tratamento atrasa ou fornece cicatrizaçãoineficaz da ferida. Tratamentos podem incluir, mas não estão limitados a,medicações, radiação, tratamentos que resultam na supressão dos sistemasimunes, etc. Opcionalmente, um sujeito da invenção possui uma condiçãosecundária, em que a condição secundária atrasa ou fornece cicatrizaçãoineficaz da ferida. Condições secundárias incluem, mas não estão limitadas a,por exemplo, diabetes, doença vascular periférica, infecção, disfunções auto-imunes ou de colágeno-vascular, estados da doença que resultam nossistemas imunes suprimidos, etc.

A aceleração da cicatrização de ferida pode ser descrita pela %de aceleração da cicatrização de ferida e/ou uma Razão de Perigo Em certasrealizações, a administração de uma quantidade efetiva do VEGF a acelera acicatrização da ferida mais que 50%, igual ou mais que 60%, igual ou mais que70%, igual ou mais que 74%, igual ou mais que 75%, igual ou mais que 80%,igual ou mais que 85%, igual ou mais que 90%, igual ou mais que 95%, igualou mais que 100%, igual ou mais que 110% ou mais, quando comparado a umcontrole. Em certas realizações, a administração da quantidade efetiva doVEGF acelera a cicatrização de ferida entre mais que 60% e 110%, quandocomparado a um controle. Em certas realizações da invenção, a aceleração dacicatrização de ferida é descrita por uma Razão de Perigo (HR), que é igual oumaior que 1,75, ou é igual ou maior que 1,80, ou é igual ou maior que 1,85, oué igual ou maior que 1,95, ou é igual ou maior que 2,0, ou é igual ou maior que2,1, ou é igual ou maior que 2,2, ou é igual ou maior que 2,3 ou mais. Emcertas realizações, a aceleração da cicatrização de ferida é descrita por umaRazão de Perigo, que está entre 1,75 e 2,3.

Sujeitos da invenção possuem pelo menos uma ferida. A feridapode ser crônica, aguda ou normal. Em uma realização, a ferida sendo tratadaestá em um estágio de ferida 1A. Ver Estágios de Feridas na Tabela 2. Umaferida da invenção pode opcionalmente incluir uma infeção ou isquemia, ouinclui tanto uma infecção como isquemia. Em uma realização, a ferida é umaúlcera do pé diabético. Em uma realização, a ferida está presente no sujeitopor aproximadamente 4 semanas ou mais, ou aproximadamente 6 semanas oumais, antes da administração do VEGF.

Tabela 2

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A avaliação da cicatrização de ferida pode ser determinada, porexemplo, pela % de redução na área da ferida, ou completo fechamento daferida (por exemplo, medido pelo fechamento da pele sem drenagem ounecessidade de curativo). A área da ferida é avaliada antes, durante e depoisdo tratamento por métodos conhecidos para aqueles técnicos no assunto. Porexemplo, a avaliação pode ser determinada por, por exemplo, planimetriaquantitativa (ver, por exemplo, Robson et ai, Arch.JSurg 135:773-77 (2000)),fotografias, exames clínicos, etc. A área da ferida pode ser determinada antes,durante e depois do tratamento. Em uma realização, a área da ferida pode serestimada pela medida do comprimento, L, da ferida, o comprimento mais longode ponta a ponta em, por exemplo, cm, e a largura, W, a largura mais longa deponta a ponta perpendicular a L em, por exemplo, cm, e multiplicando LxWpara obter a área de superfície estimada (cm2). O tamanho da ferida paratratamento pode variar. Em uma realização da invenção, a área da ferida antesdo tratamento é de aproximadamente 0,4 cm2 ou mais, ou aproximadamente1,0 cm2 ou mais, ou entre aproximadamente 0,4 cm2 e aproximadamente 10cm2, ou entre aproximadamente 1 cm2 e aproximadamente 10 cm2, ou entreaproximadamente 1,0 cm2 e aproximadamente 6,5 cm2.ou entreaproximadamente 1 cm2 e aproximadamente 5 cm2, ou mais que 4,0 cm2. Aárea pode ser medida antes ou após debridamento.

VEGF

Uma quantidade efetiva de VEGF é administrada nos métodosfornecidos no presente para promover aceleração ou melhora na cicatrizaçãode ferida. A família do gene VEGF, na qual VEGF é um membro, é aquela dosreguladores chave do desenvolvimento do sistema vascular. A família do geneVEGF inclui VEGF-A1 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e fator decrescimento placentário (PIGF). Ver, por exemplo, Ferrara, Role of Vascularendothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis:therapeutic implications, Sem Oncol., 29(suppl 16): 10-14 (2002); e, Veikkola eAlitalo, VEGFs receptors and angiogenesis Semin Câncer Bioi 9:211-220(1999). VEGF-A, também conhecido como VEGF, é o principal regulador daangiogênese normal incluindo cocatrização normal de ferida, cicatrização deosso e angiogênese anormal, tal como proliferação vascular em tumores edisfunções oftalmológicas (por exemplo, degeneração relativa à idade,retinopatia diabética). Ver, por exemplo, Ferrara, Vascular Endothelial GrowthFactor:_Basic Science and Clinicai Progress, Endocrine Reviews 25(4): 581-611(2004); Ferrara e Henzel, Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem, BiophysRes Comm 161:851-58 (1989); e Leung et a/., Vascular endothelial growthfactor is a secreted angiogenic mitogen, Science 246:1306-9 (1989). Estádentro do escopo da invenção o uso de VEGF variantes que possuem atividadedo VEGF e agonistas dos receptores VEGF1 por exemplo, agonistas doVEGFR1 e/ou VEGFR2, no lugar de ou junto com o VEGF.

Existe VEGF humano em pelo menos seis isoformas (VEGF121,VEGF145, VEGFi65, VEGF183, VEGF189, and VEGF2Oe) que surgem da junçãoalternativa do mRNA de um único gene organizado em 8 exons localizados nocromossomo 6 (ver, por exemplo, Ferrara N, Davis Smyth T. Endocr Rev 18:1-22 (1997); e, Henry e Abraham1 Review of Preclinical and Clinicai Results withVascular Endothelial Growth Factors for Therapeutic Angiogenesis, CurrentInterventional Cardiology Reports, 2:228-241 (2000)). Ver também, patentesUS 5.332.671 e 6.899.882. Em uma realização, o VEGF165 é administrado nosmétodos da invenção. Tipicamente, é utilizado VEGF165 humano (por exemplo,VEGF165 recombinante humano). VEGF165, a isoforma mais abundante é umaglicoproteína covalente dimérica básica, com ligação de heparina e uma massamolecular de -45.000 daltons (/d). O homodímero VEGF165 consiste de duascadeias de 165 aminoácidos. A proteína possui dois domínios distintos: umdomínio de ligação de receptor (resíduos 1-110) e um domínio de ligação deheparina (resíduos 110-165). Os domínios são estabilizados por sete pontesbissulfeto, e os monômeros são ligados por duas pontes bissulfeto entrecadeias para formar o homodímero nativo. VEGF121 é desprovido de domíniode ligação de heparina (ver, por exemplo, patente US 5.194.596), enquantoque VEGF189 (ver, por exemplo, patente US. 5.008.196; 5.036.003; e5.240.848) e VEGF2Oe são isolados na matriz extracelular. Ver, por exemplo,Ferrara VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors, Nature Rev.Câncer 2:795-803 (2002).

Os efeitos biológicos do VEGF são mediados pelos receptorestirosina quinase de alta afinidade. Agonistas dos receptores VEGF podem serusados nos métodos da invenção. Os receptores tirosina quinase VEGF,VEGFR1 e VEGFR2, foram identificados (Shibuya et al. Oncogene 5:519-24(1990); Matthews et ai, Proc Natl Acad Sci USA 88:9026-30 (1991); Termanet ai, Oneogene 6:1677-83 (1991); Terman et al. Biochem Biophys ResCommun 187:1579-86 (1992); de Vries et ai, Science 255:989-91 (1992);Millauer et al. Cell 72:835^6 (1993); e, Quinn et al. Proc Natl Acad Sci USA90:7533-7 (1993)). VEGFR1 possui a mais alta afinidade para VEGF, com umKd de ~10-20 pM (de Vries et ai, Science 255:989-91 (1992)), e VEGFR2possui de certa forma baixa afinidade para VEGF, com um Kd de -75-125 pM(Terman et al., Oncogene 6:1677-83 (1991); Millauer et al. Cell 72:835-46(1993); e, Quinn et ai Proc Natl Acad Sci USA 90:7533-7 (1993)). Um terceiroreceptor tirosina quinase, VEGFR3 foi identificado, o qual está envolvido naregulação da engiogênese linfática. VEGFR3 é um receptor para VEGF-C eVEGF-D, que também pode se ligar ao VEGFR2. Estes receptores consistemde um domínio extracelular (incluindo sete regiões similares a imunoglobulina,uma região de transmembrana) e um domínio intracelular que contémelementos relacionados às vias tirosina quinase. VEGF-B e PIGF se liga aoVEGFR1 mas não ao VEGFR2. VEGF165 também se liga ao neuropilin-1, umreceptor que regula a orientação celular neuronal. Quando co-expressado comVEGFR2, neuropilin-1 aumenta a ligação do VEGFies ao VEGFR2 equimiotaxia mediada por VEGF. Outros estudos ligaram neuropilin 2 (NP2) aodesenvolvimento dos vasos linfáticos. Ver, por exemplo, Ferrara, VascularEndothelial Growth Factor: Basic Science and Clinicai Progress, End ocrineReviews, 254(4):581-611. Após ligação ao VEGF-A1 VEGFR2 passa porautofosforilação de tirosina que leva a subsequente angiogênese, aumento depermeabilidade vascular, mitogênese e quimiotaxia.

VEGF possui diversas funções biológicas, incluindo regulação daexpressão do gene VEGF sob condições hipóxicas (Ferrara N, Davis Smyth T.Endocr Rev 18:1-22 (1997)), atividade mitogênica para células endoteliaismicro e macrovasculares (Ferrara N, Henzel WJ. Biochem Biophys ResCommun 161:851-8 (1989); Leung etal., Science 246:1306-9 (1989); Connollyet al. J Clin Invest 84:1470-8 (1989a); Keck et al. Science 246:1309-12 (1989);Plouet et al., EMBO J 8:3801-6 (1989); Conn et al. Proc Natl Acad Sci USA87:2628-32 (1990); e Pepper et al., Exp Cell Res 210:298-305 (1994)), eindução da expressão de ativadores de plasminogênio e colagenase (Pepper etal., Biochem Biophys Res Commun 181:902-6 (1991)). Durante hipoxia, afator-1 que induz hipoxia (HIP-1) é regulado para cima e se liga à regiãopromotora do gene VEGF e ativa transcrição (ver, por exemplo, Wang et al.,Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulatedby cellular oxygen tension, PNAS USA 92:5510 (1995)). Outros fatores quepodem regular VEGF para cima incluem citocinas (IL-6) e outros EGF, PDGF,bFGF que incluem fatores de crescimento.

VEGF é produzido por uma ampla variedade de tipos celularesnormais (por exemplo, queratinócitos, plaquetas, macrófagos, fibroblastos,células da retina, células ovarianas) por todo o corpo junto com vários tipos detumores sólidos. Trabalhos realizados por diversos anos anterioresestabeleceram um papel chave do fator de crescimento endotelial vascular(VEGF) na regulação da angiogênese normal e anormal (Ferrara et al. Endocr.Rev. 18:4-25 (1997)). VEGF é um fator de crescimento necessário para avasculogênese embrionária, desenvolvimento de miócito cardíaco, (ver, porexemplo, Ferrara et al., Heterozygous embryonic Iethality induced by targetedinactivation ofthe VEGF gene, Nature 380:439-42 (1996)), formação normal deossificação encondral (ver, por exemplo, Gerber et al., VEGF coupleshypertrophic cartilage remodeling, ossification, and angiogenesis duríngenchondral bone formation, Nat. Med, 5:623-28 (1999)), restauração de tecido,e na fisiologia do trato reprodutivo feminino - crescimento folicular e a funçãoendócrina dos corpos lúteos são dependentes da proliferação de novoscapilares (ver, por exemplo, Phillips et al., Vascularendothelialgrowth factorisexpressed in rat corpus luteum, Endocrinology, 127:965-67 (1990)). Alémdisso, VEGF mostrou ser um mediador chave de neovascularização associadacom tumores e disfunções intra-ocular (Ferrara et al.) O VEGF mRNA ésuperexpressado pela maioria dos tumores humanos examinados (Berkman etal. J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown et al. Human Pathoi 26:86-91(1995); Brown et al. Câncer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J.Câncer. 73:931-934 (1996); e Dvorak et al. Am J. Pathoi 146:1029-1039(1995)).

VEGF é também conhecido como fator de permeabilidadevascular, baseado na sua habilidade para induzir escoamento vascular emmodelos animais. Ver, por exemplo, Senger et ai, Tumor cells secrete avascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid,Science 219: 983-89 (1983). Senger e colegas propuseram que um aumentona permeabilidade microvascular para proteínas é uma etapa crucial naangiogênese. Por exemplo, o escoamento induzido de proteínas do plasma eformação extracelular de gel de fibrina pode ser uma matriz suficiente paracrescimento celular endotelial; o papel de fatores de crescimento mitogênicopode ser estimular este processo. A angiogênese é também necessária parapermitir migração de leucócitos, fatores de crescimento e oxigênio durante aformação do tecido de granulação durante a cicatrização de ferida.

Na cicatrização de ferida, VEGF desempenha um papel essencialna indução de angiogêneses durante a cicatrização de feridas cutâneas. É ummitógeno potente para células endoteliais microvasculares dérmicas e éexpressado por queratinócitos de cicatrizaçào de feridas (Ver, por exemplo,Nissen et ai, Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activityduring the proliferative phase of wound healing, Am. J. Pathol., 152:1445-52(1998); Corral et ai, Vascular endothelial growth factor is more important thanbasic fibroblast growth factor during ischemic wound healing, Arch Surg.,134:200-5 (1999); Frank et ai., Regulation of vascular endothelial growth factorexpression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impairedwound healing. J. Biol. Chem., 270:12607-13 (1995); Ballaun et ai, Humankeratinocytes express the three major splice forms of vascular endothelialgrowth factor, J. Invest Dermatol., 104:7-10 (1995). Ele também age de umaforma parácrina em microvasos dérmicos, que levam ao aumento davascularização e formação de matriz de granulação. Ver também, Corral et ai,acima; e, Romano de Peppe, et ai, Adenovirus-mediated VEGF165 genetransfer enhances wound healing by promoting angiogenesis in CD1 diabeticmice, Gen Ther., 9:1271-7 (2002). Deficiências na restauração de tecido, porexemplo, cicatrização de ferida, etc., são vistas quando os níveis do VEGF eoutros fatores angiogênicos estão alterados. Ver, por exemplo, Howdieshell, etal, Antibody neutralization of vascular endothelial growth factor inhibits woundgranulation tissue formation, J. Surg. Res.96:173-82 (2001); Street et al.,Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promotingangiogenesis and bone tumover, PNAS USA, 99:9656-61 (2002); Tsou et ai,Retroviral delivery of dominant-negative vascular endothelial growth factorreceptor type 3 to murine wounds inhibits wound angiogenesis, Wound RepairRegen., 10:222-9 (2002); Frank et ai, Regulation of vascular endothelial growthfactor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impairedwound healing. J. Bioi Chem., 270:12607-13 (1995); e, Lerman et ai, Cellulardysfunction in the diabetic fibroblast:_impairment in migration, vascularendothelial growth factor production, and response to hypoxia, Am. J. Pathol.,162:303-12 (2003). Em alguns modelos animais, VEGF exógeno promoveucicatrização de ferida. Ver, por exemplo, Galliano et ai, Topical VascularEndothelial Growth Factor Accelerates Diabetic Wound Healing throughincreased angiogenesis and by Mobilizing and recruiting bone marrow-derivedcells, American Joumal of Pathology, 164 (6): 1935-1947 (2004); Romano dePeppe S et ai, Adenovirus-mediated VEGF165 gene transfer enhances woundhealing by promoting angiogenesis in CD1 diabetic mice, Gen Ther 9:1271-7(2002); e pedido de patente US 20030180259.

Como descrito acima, existem desafios para criar terapias comproteínas para acelerar cicatrização de ferida. Nós descrevemos no presenteuma pesquisa clínica de tratamento de úlceras com terapia de proteínarecombinante de VEGF que resulta na aceleração de cicatrização de ferida.Ver Exemplo 1, no presente.

Agentes Adicionais

Está dentro do escopo desta combinar terapia de VEGF com umou mais de, por exemplo, terapia de bons cuidados com a ferida (por exemplo,GWC), outras terapias novas ou convencionais (por exemplo, outros membrosda familía VEGF, fatores de crescimento tais como listados no presente, fatorde crescimento de nervos (NGF), fatores, agentes ou ativadores angiogênicospositivos, esteróides anabólicos, reposição de tecidos bioengenheirados (porexemplo, Apligraph®, Dermagraft™, etc.) oxigênio hiperbárico, terapia a vácuo)para aumento da atividade do VEGF, na aceleração e/ou melhora nacicatrização de ferida. Ver, por exemplo, Meier e Nanney, Emerging NewDrugs for Wound Repair, Expert Opin. Emerging Drugs (2006) 11(1):23-37.

As seis maiores famílias de fatores de crescimento (EGF, FGF,IGF, PDGF, TGF e VEGF) estão associadas com a cicatrização de feridas.Ver1 por exemplo, Nagai e Embil, Becaplermin:_recombinant platelet derívedgrowth factor, a new treatment for healing diabetic foot ulcers, Exprt Opin Biol.Ther 2:211-18 (2002). Exemplos de tais fatores de crescimento incluem fatorde crescimento derivado de plaqueta (PDGF-A, PDGF-B1 PDGF-C e PDGF-D),fator de crescimento I e Il derivado da insulina (IGF-I e IGF-II), fator decrescimento de fibroblasto ácido e básico (aFGF e bFGF), fator de crescimentode transformação alfa e beta (TGF-α e TGF-β (por exemplo, TGF-beta 1, TGFbeta 2, TGF beta 3)), fator de crescimento epidermal (EGF), e outros. Ver Id.Estes fatores de crescimento estimulam mitose de uma ou mais célulasenvolvidas na cicatrização de ferida e podem ser combinados com VEGF.

Outros fatores angiogênicos positivos que podem ser combinadoscom VEGF incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, HGF, TNF-a,angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992);Klagsbrun et al. Artnu. Rev. Physioi 53:217-239 (1991)), ativadores daangiogênese na Tabela 3, fatores angiogênicos e agentes descritos nopresente, etc.

Tabela 3

<table>table see original document page 36</column></row><table>Além disso, os seguintes agentes também podem ser combinadoscom tratamentos de cicatrização de ferida com VEGF, por exemplo, fator decrescimento derivado de plaqueta (PDGF) (por exemplo, Becaplermin(rhPDGF-BB) tais como Regranex ®; Johnson & Johnson (ver, por exemplo,patente US 5.457.093; 5.705.485; e, 5.427.778; Perry, BH et ai, A meta-analytic approach to an integrated summary of efficacy:_a case study ofbecamplemin gel., Cont. Clin. Trials 23:389-408 (2002)), agonistas do receptoradenosina-A2A (por exemplo, MRE0094 (King Pharmaceuticals)); fator decrescimento de queratinócito (KGF-2, repifermina (Human Genome Sciences));lactoferrina (LF) (Agennix, Inc.,); timosina beta-4 (Τβ4 (ReGeneRxBiopharmaceuticals)); peptídeo receptor de ativação derivado da trombina(TP508; Chrysalin ® (Chrysalis Biotechnology, Inc.)); vetor adenoviral que fatorde crescimento derivado de plaqueta (PDGF-B) (GAM501) (SelectiveGenetics); células tronco autólogas da medula óssea (BMSC) (ver, porexemplo, Badiavas & Falanga, Treatment ofchronic wounds with bone marrow-derived cells, Arch Dermatol, 139:510-16 (2003); e enxertos de tecidos vivosengenheirados (por exemplo, Apligraf, etc.). Agentes de úlcera antibióticos eanti-sépticos podem também ser combinados com administração do VEGF.Administração do VEGF pode também ser administrada junto com tratamentoimunossupressivo (por exemplo, terapia de radiação, quimioterapia) outratamento de câncer.

Não é necessário que tais agentes ou procedimentos de co-tratamento sejam incluídos por si mesmo nas composições desta invenção,embora isto seja conveniente quando tais agentes são proteináceos. Taismisturas são adequadamente administradas da mesma maneira e para osmesmos propósitos como o VEGF usado sozinho. A razão molar útil do VEGFpara tais fatores terapêuticos secundários é tipicamente 1:0,1-10, comaproximadamente quantidades equimolares em uma realização da invençãosendo usada.

Dosagem E Administração

Dosagens e concentrações de droga desejadas de composiçõesfarmacêuticas da invenção podem variar dependendo do uso específicoprevisto. A determinação da dosagem apropriada ou rota de administração ébem conhecida por médicos técnicos no assunto. Experimentos animaispodem fornecer uma orientação confiável para a determinação das dosesefetivas para terapia humana. A escala de doses efetivas entre espécies podeser realizada seguindo-se os princípios estabelecidos por Mordenti1 J. eChappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics em Toxicokineticsand New Drug Development, Yacobi et ai., Eds., Pergamon Press, Nova York1989, páginas 42-96. Exemplos de curvas de resposta de dose para VEGFadministrado em modelos de feridas animais podem ser vistos na Fig. 2, emque uma curva de resposta de dose para VEGF administrado para feridas deorelha isquêmica de coelho. Fig. 3 é uma curva de resposta de dose paraVEGF administrado para feridas de camundongos diabéticos. Para aprevenção ou tratamento da doença ou tipo de ferida, a dosagem apropriadado VEGF irá depender do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, aseveridade e curso da doença, se o agente é administrado para propósitospreventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente eresposta ao agente, e a discrição do médico. VEGF será formulado e dosadode modo consistente com as boas práticas médicas, levando-se em conta adisfunção específica a ser tratada, a condição clínica individual do paciente, olocal de entrega do VEGF, o método de administração e outros fatoresconhecidos pelo médico.

A dosagem a ser empregada é dependente dos fatores descritosno presente. Em certas realizações da invenção, dependendo do tipo eseveridade da condição do sujeito, aproximadamente 1 pg/kg a 50 mg/kg (porexemplo, 0,1-20 mg/kg) de VEGF e/ou um agente adicional, é uma dosagemcandidata para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou maisadministrações separadas ou por aplicação contínua. Orientações paradosagens específicas e métodos de entrega são fornecidos na literatura. Emuma realização, a quantidade efetiva do VEGF administrado é deaproximadamente 20 Mg/cm2 a aproximadamente 250 pg/cm2. Em certasrealizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente 24pg/cm2 ou 24 pg/cm2. Em certas realizações, a quantidade efetivaadministrada é de aproximadamente 72 pg/cm2 ou 72 pg/cm2. Em certasrealizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente 216pg/cm2 ou 216 pg/cm2. Em uma realização, a quantidade efetiva do VEGFadministrado é de 20 pg/cm2 a 250 pg/cm2. Em certas realizações, aquantidade efetiva administrada é de aproximadamente 24 pg/cm2 aaproximadamente 216 pg/cm2, ou 24 pg/cm2 a 216 pg/cm2. Em certasrealizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente 24pg/cm2 a aproximadamente 72 pg/cm2, ou 24 pg/cm2 a 72 pg/cm2. Em certasrealizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente 72pg/cm2 a aproximadamente 216 pg/cm2, ou 72 pg/cm2 a 216 pg/cm2. Emcertas realizações, a quantidade efetiva administrada é de aproximadamente216 pg/cm2 a aproximadamente 250pg/cm2, ou 216 pg/cm2 a 250 pg/cm2. Oagente é adequadamente administrado ao sujeito em uma vez ou sobre umasérie de tratamentos.

Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou maistempo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer umadesejada supressão dos sintomas da doença, por exemplo, fechamentocompleto da ferida, ou redução na área da ferida. No entanto, outros regimesde dosagem podem ser funcionais. Tipicamente, o médico irá administrar umamolécula(s) da invenção até alcançar uma dosagem que forneça o efeitobiológico necessário. A administração da quantidade efetiva do VEGF podeser diária ou opcionalmente poucas vezes por semana, por exemplo, pelomenos duas vezes por semana, ou pelo menos três vezes por semana, ou pelomenos quatro vezes por semana, ou pelo menos cinco vezes por semana, oupelo menos seis vezes por semana. Em uma realização, o VEGF éadministrado por pelo menos seis semanas, ou pelo menos cerca de dozesemanas, ou até completar o fechamento da ferida (por exemplo, o qual podeser determinado pelo fechamento da pele sem drenagem ou necessidade decurativo). Em certos aspectos da invenção, o VEGF é administrado por menosque 20 semanas. O progresso desta terapia da invenção é facilmentemonitorado por técnicas e testes convencionais.

A composição terapêutica da invenção é tipicamente administradade forma tópica ao sujeito. Em uma realização da invenção, o VEGF está emuma formulação de um gel tópico, por exemplo, em uma seringa ou recipientepré-preenchido. Em certas realizações, um agente terapêutico adicionai étambém administrado de forma tópica. Outras rotas de administração do VEGFe/ou agentes terapêuticos adicionais, podem também ser opcionalmenteusados, por exemplo, administrados por qualquer meio adequado, incluindo,mas não limitando a, administração parenteral, subcutânea, intraperitonial,intrapulmonar, intra cérebro-espinhal, subcutâneo, intra-articular, intrasinovial,intratecal, oral. Infusões parenterais incluem intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonial ou administração subcutânea.

Como descrito no presente, VEGF pode ser combinado com umou mais agentes ou procedimentos terapêuticos. A administração combinadainclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma formulaçãofarmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem. O uso demúltiplos agentes está também incluído na invenção. Por exemplo, o VEGFpode preceder, seguir, alternar com á administração do agente terapêuticoadicional, ou pode ser dado simultaneamente com este. Em uma realização,há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativossimultaneamente exercem suas atividades biológicas. Em um regime decombinação de terapia, as composições da invenção são administradas emuma quantidade terapeuticamente efetiva ou uma quantidade sinergísticaterapeuticamente. Como usado no presente, uma quantidadeterapeuticamente efetiva é tal que a co-administração do VEGF e um ou maisagentes terapêuticos, ou administração de um procedimento, resulte naredução ou inibição da doença ou condição alvo. Uma quantidade sinergísticaterapeuticamente é aquela quantidade do VEGF e um ou mais agentesterapêuticos, por exemplo, descritos no presente, necessários para acelerarsinergisticamente ou significantemente e/ou melhorar a cicatrização de ferida.

Composições Farmacêuticas

Formulações terapêuticas das moléculas da invenção, porexemplo, VEGF ou agentes terapêuticos adicionais combinados com VEGF,usados de acordo com a invenção são preparadas para armazenamento pelamistura de uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo, que possui o graudesejado de purificação com veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis,excipientes ou estabilizantes, (Remington's Pharmaceutical Sciences 16aedição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluçõesaquosas. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes não tóxicos parareceptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampõestais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindoácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como octadecildimetilbenzilcloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto debenzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos tais como metil oupropil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol);polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10resíduos); proteínas, tais como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas;polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais comoglicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol,trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons tais como sódio;complexos de metal (por exemplo, complexo proteína Zn); e/ou surfactantesnão-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Em certas realizações, as formulações a serem usadas paraadministração in vivo são estéreis. Isto é facilmente realizado por filtraçãoatravés de membrana de filtração estéril. A formulação pode ser armazenadana forma Iiofilizada ou como uma solução aquosa ou na forma de gel. O pHdas preparações VEGF pode ser de aproximadamente 5 a 9, embora valoresde pH mais altos ou mais baixos podem também ser apropriados em certoscasos. Deve-se entender que o uso de certos excipientes, veículos ouestabilizantes podem resultar na formação de sais do VEGF.

Os ingredientes ativos podem também ser colocados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulasde gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, emsistemas de distribuição coloidal de droga (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em RemingtorísPharmaceutical Sciences 16a edição, Osol1 A. Ed. (1980). Ver tambémJohnson et ai, Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda1 Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et ai, BioZTechnoIogyi 8:755-758 (1990); Cleland, "Designand Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems," em Vaccine Design: The Subunit andAdjuvant Approach, Powell e Newman1 eds, (Plenum Press: Nova York, 1995),páginas 439-462; documento WO 97/03692, documento WO 96/40072,documento WO 96/07399 e patente 5.654.010.

Tipicamente para cicatrização de ferida, VEGF é formulado paraentrega para local específico. Quando aplicado de forma tópica, o VEGF éadequadamente combinado com outros ingredientes tais como veículos e/ouadjuvantes. Não existem limitações na natureza de tais ingredientes, excetoque eles devem ser farmaceuticamente aceitáveis e eficazes para aadministração pretendida, e não podem degradar a atividade dos ingredientesativos da composição. Exemplos de veículos adequados incluem pomadas,cremes, géis, sprays ou suspensões, com ou sem colágeno purificado. Ascompisições também podem ser impregnadas em curativos estéreis, adesivostransdérmicos, emplastros e bandagens, opcionalmente na forma líquida ousemi-líquida. Uma matriz de cellulose/colágeno regenerada oxidável tambémpode ser usada, por exemplo, Promogran™ Matrix Wound Dressing ouPromogran Prisma Matrix™.

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm um polipeptídeoda invenção, no qual matrizes estão na forma de artigos modelados, porexemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberaçãocontínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919),copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilnão degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis talcomo o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímerosácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolido), polímero de ácido polilático-coglicólico (PLGA) e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros taiscomo acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitem liberaçãode moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas porperíodos de tempo mais curtos. Anticorpos quando encapsuladaspermanecem no corpo por um longo tempo, eles podem denaturar ou agregarcomo um resultado de exposição à umidade a 37°C, que resulta em uma perdade atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégiasracionais podem ser desenvolvidas para estabilização dependendo domecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação édescoberto como sendo de formação de ligação S-S intermolecular através deintercâmbio tio-bissuIfeto1 a estabilização pode ser alcançada por modificaçãode resíduos sulfidril, soluções ácidas de liofilização, controle da umidade doconteúdo, uso apropriado de aditivos, e desenvolvimento específico decomposições de matriz de polímero.

Para se obter uma formulação em gel, o VEGF formulado em umacomposição líquida pode ser misturado com uma quantidade efetiva de umpolissacarídeo solúvel em água ou polímero sintético tal como polietileno glicolpara formar um gel de viscosidade apropriada para ser aplicado topicamente.Os polissacarídeos que podem ser usados incluem, por exemplo, derivados dacelulose tais como derivados da celulose eterificado, incluindo alquil celuloses,hidroxialquil celuloses e alquil hidroxialquil celuloses, por exemplo,metilcelulose, hidroxietil celulose, carboximetil celulose, hidroxipropilmetilcelulose e hidroxipropil celulose; amido e amido fracionado; ágar; ácidoalgínico e alginatos; goma arábica; pululan; agarose; carragena; dextranos;dextrinas; frutanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanas;glicogênios; glucanos e biopolímeros sintéticos; como também gomas taiscomo goma xantana, goma guar, goma de alfarroba; goma arábica; goma detragacanto e goma karaya; e derivados e misturas destes. Em uma realizaçãoda invenção, o agente coagulador no presente é aquele que é, por exemplo,inerte em sistemas biológicos, não tóxicos, simples para preparar e/ou nãolíquido demais ou viscoso, e não irá desestabilizar o VEGF contido neste.

Em certas realizações da invenção, o polissacarídeo é umderivado de celulose eterificado, em outra realização é aquele que é bemdefinido, purificado e listado na USP, por exemplo, metilcelulose e os derivadosde hidroxialquil celulose, tais como hidroxipropil celulose, hidroxialquil celulosee hidroxipropil metil celulose. Em uma realização, metilcelulose é opolissacarídeo.

O polietilenoglicol útil para gelificação é tipicamente uma misturade polietilenoglicóis de baixo e alto peso molecular para obter a viscosidadeapropriada. Por exemplo, uma mistura de um polietilenoglicol de pesomolecular 400-600 com um de peso molecular 1500 seria efetivo para estepropósito quando misturado na razão apropriada para se obter uma pasta.

O termo "água solúvel" quando aplicado aos polissacarídeos epolietilenoglicóis tem a intenção de incluir soluções coloidais e dispersões. Emgeral, a solubilidade dos derivados de celulose é determinada pelo grau desubstituição de grupos éter, e os derivados estabilizantes úteis no presentedevem ter uma quantidade suficiente de tais grupos éter por unidade deanidroglicose na cadeia de celulose para fornecer os derivados solúveis emágua. Um grau de substituição de éter de pelo menos 0,35 grupo éter porunidade de anidroglicose é geralmente suficiente. Adicionalmente, osderivados de celulose podem estar na forma de sais de metal alquil, porexemplo, os sais Li, Na, K ou Cs.

Se metilcelulose é empregada no gel, por exemplo, compreendeaproximadamente 2-5%, ou aproximadamente 3%, ou aproximadamente 4% ouaproximadamente 5%, do gel e o VEGF está presente em uma quantidade deaproximadamente 100-2000 pg por ml de gel.

VEGF e/ou um agente adicional pode também ser administrado àferida por terapia gênica. Terapia gênica refere-se à terapia realizada pelaadministração de um ácido nucléico a um sujeito. Nas aplicações de terapiagênica, os genes são introduzidos nas células com o objetivo de alcançarsíntese in vivo de um produto genético terapeuticamente efetivo, por exemplo,para substituição de um gene defeituoso. "Terapia gênica" inclui ambas,terapia gênica convencional, onde um efeito durável é alcançado por umtratamento único e a administração dos agentes terapêuticos do gene, queenvolve administração única ou repetida de um DNA ou mRNAterapeuticamente efetivo. Os oligonucleotídeos podem ser modificados paraaumentar sua absorção, por exemplo, pela substituição de seus gruposfosfodiésteres por grupos não carregados. Para revisões gerais dos métodosda terapia gênica, ver, por exemplo, Goldspiel et ai. Clinicai Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev.Pharmacoi Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993);Morgan e Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); e May TIBTECH11:155-215 (1993). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologiade DNA recombinante que podem ser usados como descrito em Ausubel et aieds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; eKriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY.

Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução deácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se oácido nucléico é transferido em células cultivadas in vitro ou in vivo nas célulasdo hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácidonucléico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos,eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método deprecipitação de fosfato de cálcio, etc. As técnicas atuais de transferência degene in vivo preferidas incluem trsnfecção com vetores virais (tipicamenteretroviral) e transfecção mediada por Iipossomo de revestimento de proteína(Dzau et ai, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Por exemplo,técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo incluem transfecção comvetores virais (tais como adenovírus, vírus Herpes simplex I, lentivírus,retrovírus ou vírus adeno associados) e sistemas baseados em lipídeos(lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo são DOTMA,DOPE e DC-Chol, por exemplo). Exemplos de vetores virais úteis na terapiagênica podem ser encontrados em Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651(1994); Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg HumanGene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman e Wilson Curr. Opin. in Geneticsand Devei. 3:110-114 (1993); Bout et al. Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994);Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al. Cell 68:143-155(1992); Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); e Walsh et al. Proc.Soe. Exp. Bioi Med. 204:289-300 (1993).

Em algumas situações é desejável fornecer a fonte de ácidonucléico com um agente que atinge as células alvo de uma ferida, tal como umanticorpo específico para uma proteína de superfície de membrana celular ou acélula alvo, um Iigante para um receptor na célula alvo, etc. Onde Iipossomossão empregados, proteínas que se ligam a uma proteína de superfície demembrana celular associada com endocitose podem ser usadas para atingire/ou facilitar absorção, por exemplo, proteínas capsídeo ou fragmentos destastrópico para um tipo celular específico, anticorpos para proteínas que sofreminternalização em ciclos, e proteínas que atingem locais intracelulares eaumentam meia vida intracelular. A técnica de endocitose mediada porreceptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987); e Wagner etal., Proc. Nati Acad. Sei. EUA 87:3410-3414 (1990). Pararevisão de marcação de gene e terapia gênica atualmente conhecida verAnderson etal., Science 256:808-813 (1992).Modificações Covalentes Para Polipeptídeos Da Invenção

Modificações covalentes de um polipeptídeo da invenção, porexemplo, VEGF ou outros agentes poiipeptídicos terapêuticos adicionaiscombinados com VEGF, estão incluídos dentro do escopo desta invenção.

Eles podem ser feitos por síntese química ou por clivagem enzimática ouquímica do polipeptídeo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentesdo polipeptídeo são introduzidas na molécula por reação de resíduos deaminoácidos alvo do polipeptídeo com um agente de derivação que é capaz dereagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos N ou C terminais, ou pelaincorporação de um aminoácido modificado ou aminoácido não natural nacadeia de polipeptídeo em crescimento, por exemplo, Ellman et ai. Meth.Enzym. 202:301-336 (1991); Noren et al. Science 244:182 (1989); e, pedidosde patente US 20030108885 e 20030082575.

Resíduos cisteinil mais comuns são reagidos com a-haloacetatos(e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida,para fornecer carboximetil ou derivados carboxiamidometil. Resíduos cisteiniltambém são derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoi)propiônico, cloroacetil pfosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil bissulfeto, metil 2-piridil bissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, oo cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.

Resíduos de histidina são derivados pela reação comdietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente é relativamente específicopara a cadeia lateral de histidil. Para-bromofenacil brometo também éfunctional, a reação é tipicamente realizada em 0,1 M de cacodilato de sódioem pH 6,0.

Lisinil e resíuos amino-terminais são reagidos com anidridos deácido carboxílico ou succínico. A derivação com estes agentes possui efeito dereverter a carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados paraderivação de resíduos que contêm α-amino incluem imidoésteres tais comometil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidreto, ácidotrinitrobenzenosulfônico, O-metilisouréia, 2,4-pentanediona, e reação catalizadapor transaminase com glioxilato.

Resíduos arginil são modificados pela reação com um de diversosreagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclohexanediona e ninhidrin. A derivação de resíduos de arginina requer que areação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupofuncional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os gruposda lisina como também o grupo arginina épsilon-amino.

A modificação específica de resíduos tirosil pode ser feita, cominteresse específico na introdução de marcas espectrais nos resíduos tirosilpela reação com compostos aromáticos diazônio ou tetranitrometano. Maiscomumente, N-acetilimidizola e tetranitrometano são usados para formarespécies O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Resíduos tirosilsão tratados com iodo usando-se 125I ou 131I para preparar proteínas marcadaspara uso em radioimunoensaio.

Grupos laterais carboxil (aspartil ou glutamil) são seletivamentemodificados pela reação com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), onde ReR' sãodiferentes grupos alquil, tais como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso,resíduos aspartil e glutamil são convertidos para resíduos asparaginil eglutaminil pela reação com íons amônio.

Resíduos glutaminil e asparaginil são freqüentementedeamidados para os resíduos glutamil e aspartil correspondentes,respectivamente. Estes resíduos são deamidados sob condições neutras oubásicas. A forma deamidada destes resíduos caem dentro do escopo destainvenção.Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e Iisina1fosforilação de grupos hidroxil de resíduos seril ou treonil, metilação dos gruposα-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de histidina (T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., SãoFrancisco, páginas. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidaçãode qualquer grupo carboxil C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve glicosídeosacoplados quimicamente ou enzimaticamente a um polipeptídeo da invenção.Estes procedimentos são vantajosos já que eles não necessitam de produçãodo polipeptídeo em uma célula hospedeira que possui capacidades deglicosilação para glicosilação N ou O-ligadas. Dependendo do modo deacoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode ou podem ser anexados a (a)arginina e histidina, (b) grupos carboxyl livres, (c) grupos sulfidril livres taiscomo aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxil livres tais como aqueles deserina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como aqueles defenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estesmétodos estão descritos no documento WO 87/05330 publicado em 11 desetembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas.259-306(1981).

A remoção de qualquer componente carboidrato presente em umpolieptídeo da invenção pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente.Deglicosilação química requer exposição do polipeptídeo ao composto ácidotrifluormetanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resultana clivagem da maioria ou de todos os açúcares exceto a ligação de açúcar (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixando o polipeptídeointacto. Deglicosilação química está descrita por Hakimudddin, et ai, Arch.Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et ai, Anal.Biochem., 118:131(1981). Clivagem enzimática de componentes carboidratos, por exemplo, nosanticorpos, pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo eexoglicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth.Enzymol. 138:350(1987).

Outro tipo de modificação covalente de um polipeptídeo dainvenção compreende ligação do polipeptídeo a um de uma variedade depolímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol oupolipropilenoglicol, ou polioxialquileno das maneiras apresentadas nas patentesUS 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337.

Vetores. Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes

Os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos de formarecombinante, usando-se técnicas e materiais facilmente obtidos.

Para produção recombinante de um polipeptídeo da invenção, porexemplo, VEGF ou agentes polipeptídicos terapêuticos adicionais combinadoscom VEGF, ácido nucléico de codificação é isolado e inserido em um vetorreplicante para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão.Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmenteincluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüênciacontrole, uma seqüência sinal, uma replicação de origem, um ou mais genesmarcadores, um elemento enhancer, um promotor, e uma seqüência determinação de transcrição.

O termo "seqüências controle" refere-se à seqüências de DNAnecessárias para a expressão de uma seqüência de codificaçãooperacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. Asseqüências controle que são adequadas para procariontes, por exemplo,incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio deligação de ribossomo. Células eucariontes são conhecidas por utilizarpromotores, sinais de poliadenilação, e enhancers.

Ácido nucléico está "operacionalmente ligado" quando é colocadoem uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Porexemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório estáoperacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se este é expressadocomo uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; umpromotor ou enhancer está operacionalmente ligado a uma seqüência decodificação se afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação deribossomo está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação seestá posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente,"operacionalmente ligado" significa que as seqüências de DNA sendo ligadassão adjacentes, e, no caso de um líder secretório, adjacentes e na fase deleitura. No entanto, enhancers não têm que ser adjacentes. A ligação érealizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios nãoexistem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são usadosde acordo com as práticas convencionais.

O DNA que codifica o polipeptídeo da invenção é facilmenteisolado e/ou sequenciado usando-se procedimentos convencionais. Porexemplo, um DNA que codifica VEGF é isolado e sequenciado, por exemplo,pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarespecificamente ao gene que codifica VEGF. Uma molécula de ácido nucléico"isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada depelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com que ela égeralmente associada na fonte natural de ácido nucléico do polipeptídeo. Umamolécula de ácido nucléico isolada é diferente da forma ou configuração que éencontrada na natureza. Moléculas de ácido nucléico são então distintas dasmoléculas de ácido nucléico que existem nas células naturais. No entanto,uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléicocontida nas células que normalmente expressam o polipeptídeo onde, porexemplo, a molécula de ácido nucléico está em um local do cromossomodiferente daquele das células naturais.

Componente Seqüência Sinal

Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos de formarecombinante não somente diretamente, mas também como uma fusão dopolipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüênciasinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência sinal heterólogaselecionada tipicamente é aquela que é reconhecida e processada (isto é,clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para célulashospedeiras procariontes que não reconhecem e processam a seqüências sinaldo polipeptídeo, a seqüência sinal é substituída por uma seqüência sinalprocarionte selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina,penicilinase, Ipp, ou líderes enterotoxina Il estáveis ao calor. Para a secreçãoda levedura a seqüência sinal pode ser substituída, por exemplo, por um líderinvertase da levedura, líder fator α (incluindo Saccharomyces e líderes fator αKluyveromyces), ou líder fosfatase ácida, o líder glucoamilase C. albicans, ou osinal descrito no documento WO 90/13646. Em expressão de células demamíferos, a seqüência sinal de mamíferos assim como líderes secretóriosvirais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado no quadro de leiturapara o DNA que codifica o polipeptídeo da invenção.

Componente Origem De Replicação

Ambos, vetores de expressão e vetores de clonagem contêm umaseqüência de ácido nucléico que permite ao vetor replicar-se em uma ou maiscélulas hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem estaseqüência é a que permite ao vetro replicar-se independentemente do DNAcromossômico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüênciasreplicantes independentes. Tais seqüências são bem conhecidas para umavariedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídiopBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem doplasmídio 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma,adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células demamíferos. Por exemplo, o componente de origem de replicação não énecessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 podetipicamente ser usada somente porque esta contém o promotor inicial).

Seleção Do Componente Gene

Vetores de expressão e clonagem podem conter uma seleção degene, também designado como um marcador selecionável. Seleção típica degenes codifica proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b)complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos nãodisponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que sãosucessivamente transformadas com um gene heterólogo produzem umaproteína que confere resistência à droga e dessa forma sobrevive ao regime deseleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácidomicofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para ascélulas de mamíferos são aqueles que são capazes de identificar célulascompetentes para ocupar o ácido nucléico do anticorpo, tal como DHFR,timidina quinase, metalotioneína-l e -II, tipicamente genes da metalotioneína deprimatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com a seleção de genesDHFR são as primeiras identificadas por cultivo de todos os transformantes emum meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivode DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tipo selvagem éempregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês (CHO) deficientena atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmentehospedeiros tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam um polipeptídeo dainvenção, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável talcomo aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) pode ser selecionado porcrescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para omarcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo,canamicina, neomicina, ou G418. Ver patente US 4.965.199.

Uma seleção de gene adequada para uso em leveduras é o genetrp1, presente no plasmídio de levedura YRp7 (Stinchcomb et ai, Nature,282:39 (1979)). O gene f/p1 fornece um marcador de seleção para umalinhagem mutante desprovida da habilidade de crescimento em triptofano, porexemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 Jones, Genetics, 85:12 (1977). Apresença da lesão f/p7 no genoma da célula hospedeira de levedura entãofornece um ambiente efetivo para detecção da transformação pelo crescimentona ausência de triptofano. De maneira similar, linhagens de leveduradeficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas porplasmídeos conhecidos que produzem o gene Leu2.

Além disso, vetores derivados do plasmídeo pKD1 circular de 1,6μm podem ser usados para transformação de leveduras Kluyveromuces.Alternativamente, um sistema de expressão para produção em grande escalade bezerro chymosin foi relatado por K.lactis. Van den Berg, Bio/Technology,8:135 (1990). Vetores de expressão multi cópias estáveis para secreção desoro de albumina humano recombinante maduro por linhagens industriais deKluyveromyces foram também divulgados. Fleer et ai, Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

Componente Promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm umpromotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e estáoperacionalmente ligado ao ácido nucléico que codifica um polipeptídeo dainvenção. Promotores adequados para o uso em hospedeiros procariontesincluem o promotor phoA, β-lactamase e os sistemas promotores lactose,fosfatase alcalina, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridostal como o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianosconhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianostambém irão conter uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D) operacionalmenteligada ao DNA que codifica o polipeptídeo da invenção.

Seqüências promotoras são conhecidas para eucariontes.

Virtualmente todos os genes eucariontes têm uma região rica em AT localizadaaproximadamente de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição éiniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante do inícioda transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode serqualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontesestá uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli Aà extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas estas seqüências sãoadequadamente inseridas em vetores de expressão eucariontes.

Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso comleveduras hospedeiras para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimasglicolíticas, tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase,hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofructoquinase, glicose-6-fosfatoisomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase,fosfoglicose isomerase e glicoquinase.Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveisque possuem vantagens adicionais de transcrição controlada pelas condiçõesde crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, iso-citocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativa associada com metabolismodo nitrogênio, metalotionein, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimasresponsáveis pela utilização de maltose e galactose . Vetores e promotoresadequados para uso na expressão em levedura estão também descritos napatente EP 73.657. Enhancers de levedura usados com promotores delevedura são também vantajosos.

Transcrição de polipeptídeos da invenção a partir de vetoresem células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos de genomas de vírus tal como vírus polioma, vírusfowlpox, adenovírus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino,vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus dahepatite-B e vírus Simian 40 (SV40), de promotores heterólogos demamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotorimunoglobulina, de promotores heat-shock, tais promotores fornecidos sãocompatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

Os promotores primários e terminador do vírus SV40 sãoconvenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que tambémcontém a origem de replicação viral SV40. O promotor primário imediato de umcitomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento derestrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em mamíferoshospedeiros usando-se o vírus papiloma bovino como um vetor é divulgado napatente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema está descrita na patenteUS 4.601.978. Ver também Reyes et ai, Nature 297:598-601 (1982) naexpressão do cDNA de β-interferon humano em células de camundongo sob ocontrole de um promotor timidina quinase do vírus herpes simplex.Alternativamente, a terminação longa do Vírus do Sarcoma de Rous repetidapode ser usada como promotor.

Componente Elemento Enhancer

Transcrição de DNA que codifica um polipeptídeo desta invençãopor eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentada pela inserção deuma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüências enhancer são agoraconhecidas por meio de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, poderá ser usado um enhancer a partirde um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 noúltimo lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotorinicial citomegalovírus, o enhancer polioma no último lado da replicação deorigem e enhancers adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)nos elementos enhancing para ativação de promotores eucariontes. Oenhancer pode ser unido no vetor na posição 5' ou 3' para a seqüência decodificação do polipeptídeo, mas está geralmente localizado em um sítio 5' dopromotor.

Componente Terminação Da Transcrição

Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes(leveduras, fungos, insetos, vegetais, animais, humanas ou células nucleadasde outros organismos multicelulares) irão também conter seqüênciasnecessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA.

Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e,ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs de eucariontes ou virais. Estas regiõescontêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadeniladosna porção não traduzida do mRNA que codifica o polipeptídeo da invenção. Umcomponente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação dohormônio de crescimento bovino. Ver documento WO 94/11026 e o vetor deexpressão divulgado no presente.Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão deDNA que codifica os polipeptídeos da invenção nos vetores no presenteincluem células procariontes, leveduras ou eucariontes superiores descritasacima. Procariontes adequados para este propósito incluem eubactérias, taiscomo organismos Gram-negativo ou Gram-positivo, por exemplo,Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo., E. coli, Enterobacter,Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonellal por exemplo., Salmonellatyphimuríum, Serratia, por exemplo., Serratia marcescans, e Shigella, assimcomo Bacilli tais como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo., B.Iicheniformis 41P divulgadas em DD 266,710 publicado em 12 de abril de1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Tipicamente, ohospedeiro de clonagem E coli é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outraslinhagens tais como E. coli Β, E coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110(ATCC 27.325) são adequadas. Estes exemplos são mais ilustrativos do quelimitantes.

Além disso, para procariontes, micróbios eucariontes tal comofungo filamentoso ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressãoadequados para vetores que codificam polipeptídeos da invenção.Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de padaria, é o maiscomumente usado entre os microorganismos hospedeiro eucariontes inferiores.No entanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e linhagens sãocomumente disponíveis e úteis no presente, tais como Schizosaccharomycespombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, por exemplo, K. lactis, K.fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K.thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa;Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungosfilamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penicillium,Tolypocladium e Aspergillus tais como A. nidulans e A. Niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão depolipeptídeos glicosilados da invenção são derivadas de organismosmulticelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetaise de inseto. Muitas linhagens baculovirais e variantes e células hospedeiras deinseto permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodopterafrugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito),Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas.Uma variedade de linhagens virais para transfecção está publicamentedisponível, por exemplo, variante L-1 de Autographa califomia NPV e linhagemBm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser usados como o vírus nopresente de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecçãode células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão,milho, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser também utilizadas comohospedeiros.

No entanto, o interesse em células de vertebrados temaumentado, e a propagação de células na cultura (cultura de tecido) tornou-seum procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira demamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al.,J. Gen Viroi 36:59 (1977))células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCCCCL 10); células ovarianas de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo(TM4, Mather, Biol Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco(CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76,ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA1 ATCC CCL2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de ratobúfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCCCCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário decamundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai, AnnalsN.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e umalinhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores deexpressão ou clonagem descritos acima para produção do polipeptídeo dainvenção e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado comoapropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar osgenes que codificam as seqüências desejadas.

Cultura De Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir polipeptídeos dainvenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meioscomercialmente disponíveis tais como F10 deHam (Sigma), Meio EssencialMínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle deDulbecco ((DMEM), Sigma), meio de crescimento normal para hepatócitos(Cambrex), meio de crescimento normal para pré-adipócitos (Cambrex), etc.são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disto, qualquer dosmeios descritos em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal.8/oc/?em. 102:255 (1980), patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762;4.560.655; ou 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195;ou na patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para ascélulas hospedeiras. Quaisquer destes meios podem ser suplementados comonecessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais comoinsulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermal), sais (tais comocloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES),nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como drogaGENTAMYCIN™), elementos traço (definido como componentes inorgânicosusualmente presentes na concentração final na taxa micromolar) e glicose ouuma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário podetambém ser incluído na concentração apropriada que seriam conhecidas paraaqueles técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura,pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeiraselecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto.

Purificação De Polipeptídeo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, um polipeptídeo dainvenção, por exemplo, VEGF ou agente polipeptídico terapêutico adicional queé combinado com VEGF, pode ser produzido intracelularmente, no espaço doperiplasma ou diretamente secretado em um meio. Polipeptídeos da invençãopodem ser recuperados e/ou isolados do meio de cultura ou de célulashospedeiras lisadas. Um polipeptídeo "isolado" é aquele que foi identificado eseparado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural.

Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais quepoderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o polipeptídeo, epodem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em certas realizações, o polipeptídeo será purificado (1) paramais que 95% por peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, oumais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de umsequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por FAGO-SDSsob condições de redução ou não redução utilizando-se Coomassie blue ousilverstain. O polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ dentro de célulasrecombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural dopolipeptídeo não esteja presente. Geralmente, no entanto, polipeptídeo isoladoserá preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Vários métodos de purificação de proteína podem serempregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, porexemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, ProteinPurífication: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nova York (1982). Asetapas de purificação selecionadas irão depender, por exemplo, da natureza doprocesso de produção usado e o polipeptídeo específico da invençãoproduzido. Se ligado à membrana, polipeptídeos da invenção podem serliberados da membrana usando-se uma solução detergente adequada (porexemplo, Triton-Xl 00) ou por clivagem enzimática. Células empregadas naexpressão de um polipeptídeo da invenção podem ser rompidas por váriosmeios físicos ou químicos, tal como ciclo de congelamento-descongelamento,sonicação, rompimento mecânico ou agentes de Iise celular. Osprocedimentos seguintes são procedimentos de purificação adequadosexemplares: por fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação emetanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia deheparina, cromatografia em SEPHAROSE™ ou em resina de troca aniônica oucatiônica, (tal como uma coluna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.);chromatotocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio, filtraçãoem gel, por exemplo, Sephadex G-75, colunas de proteínas A Sefarose pararemover contaminantes tal como IgG, e colunas de metais quelados para ligarformas de epitopo marcadas de polipeptídeos da invenção.

Por exemplo, uma composição VEGF preparada a partir decélulas pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia de heparina,eletroforese em gel e diálise. Outras técnicas para purificação de proteínaestão também disponíveis.

Artigos De Fabricação

Em outra realização da invenção, são fornecidos artigos defabricação que contêm materiais úteis para os métodos e tratamento de feridasdescritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente, um rótulo euma bula. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos,seringas, curativos, bandagens, etc. Os recepientes podem ser formados deuma variedade de materiais tais como vidro, plástico, nylon, algodão, poliéster,etc. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condiçãoe pode ter uma porta de acesso estéril ou pode ser um tubo com múltiplasdosagens ou pode ser uma seringa com indicações de quantidades medidas doagente ativo. Pelo menos um agente ativo na composição está incluído norecipiente. Um rótulo no recipiente ou associado a este indica que acomposição é usada para acelerar ou melhorar a cicatrização da ferida. Oartigo de fabricação pode, além disso, compreender um segundo recipiente quecompreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salinanormal, solução salina fosfato tamponada, solução de Ringer, solução dextroseou solução em gel. Pode, além disso, incluir outros materiais comerciaisdesejáveis do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes,filtros, curativos, bandagens, aplicadores, gazes, oclusão, oclusõessemipermeáveis, depressores de língua, agulhas e seringas. Opcionalmente, éincluído um conjunto de instruções, geralmente instruções escritas, que serelacionam ao uso e dosagem do VEGF para administração para a feridadescrita no presente. As intruções incluídas com o kit geralmente inclueminformações para dosagem, programação de dosagem e rota de administraçãopara o tratamento da disfunção. Os recipients de VEGF podem ser dose única,embalagens volumosas (por exemplo, embalagens multi-dose) ou subunidadesde dose.

A especificação é considerada suficiente para permitir a umtécnico no assunto praticar a invenção. Realmente, várias modificações dainvenção além daquelas mostradas e descritas no presente irão tornar-seaparentes para aqueles técnicos no assunto da descrição anterior e caemdentro do escopo das reivindicações anexadas.

Exemplos

Deve-se entender que os exemplos e realizações descritas nopresente são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações oumudanças em consideração a estas serão sugeridas para pessoas técnicas noassunto e devem ser incluídas dentro do espírito e limite deste pedido e escopodas reivindicações anexas.

Exemplo 1

Vegf Tópico Na Cicatrizacão De Ferida No Estudo Clínico De VGF2763g

Um estudo clínico duplo cego (por exemplo, farmacêutico nãocego, MD cego e paciente cego) foi realizado para determinar se a aplicaçãotópica de VEGF poderia promover cicatrização de ferida em sujeitos humanoscom ulcerações diabéticas. Ver Tabela 4 para um gráfico de linha de base decaracterísticas da doença dos pacientes no estudo para adminsitração derhVEGF (referido no presente como "Telbermin") para o tratamento de feridasdiabéticas. O desenho do estudo está indicado na Fig. 1.

Tabela 4

Características De Linha De Base Da Doença

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* Um sujeito tratado com placebo foi excluído do resumo devido à falta de umvalor de glicose f Um sujeito tratado com telbermina foi excluído do resumodevido à falta do valor HbA1C. $ Dois sujeitos tratados com placebo nãotiveram avaliações planimétricas de linha de base.

24 pacientes tratados com placebo completaram a fase detratamento e 22 completaram a fase de observação. 27 pacientes tratadoscom telbermina (VEGF recombinante tópico) completaram a fase de tratamentoe 22 completaram a fase de observação. Pacientes com diabetes melitus I ouII (Ale hemoglobina glicosilada, controlada (HbAIc) < 12%) com área de úlceradebridada >0,4 cm2 e < 4,0 cm2 no dia 1 que eram feridas superficiais (porexemplo, no UT estágio 1a (sem osso, músculo, tendão), ver Tabela 2) foramtratados com ambos, VEGF ou um placebo 3 vezes por semana por 6 semanas(18 doses totais). O tratamento foi a cada 48 horas (+/- 24 horas), mas nãomais do que 3 doses por semana. A quantidade de VEGF por tratamento foi 72pg/cm2. O VEGF foi preparado no local. 0,22 ml do VEGF (5mg/ml) ou doPlacebo (tampão veículo) foi removido do frasco e adicionado aaproximadamente 5% de metilcelulose (por exemplo, 4,7%) (por exemplo,Methocel A4M premium metilcelulose (The Dow Chemical Company; Midland,Ml) formulação em 5mM de tampão succinato, pH 5,0. O VEGF ou Placebo e ogel foram misturados por 2 horas, o que aumentou a viscosidade e reduziu aperda de material de dosagem quando aplicado. Um gel final de 0,06% deVEGF (gel final de 3% de metilcelulose) em 5 mM, pH 5,0 tampão succinato(com, por exemplo, a 1,8 mg/ml de VEGF, 0,0036% de polisorbato 20 e 100mM de trealose desidratada) foi a dosagem final de material. A dosagem finalde material foi aplicada com uma seringa de 1,0 ml de tuberculina, porexemplo, preenchida com 0,6 mL de dosagem final de material.

Tipicamente, a úlcera era uma úlcera crônica. A duração daúlcera era maior ou igual a 4 semanas até menor que 6 meses antes dotratamento. Não houve infecção ativa e o sujeito teve um membro perfundido:índice tornozelo-braquial (ABI) > 0,6 e menor ou igual a 1,2 no estudo do pé.Durante o tratamento, os dois grupos VEGF ou placebo, tiveram boa prática decicatrização de ferida e avaliações semanais, por exemplo, exames clínicos,reconstituição planimétrica e/ou fotografias de 35-mm (por exemplo, Food andDrug Administration (FDA) Guidance for Industry 2 000, Chronic CutaneousUlcer and Bum Wounds-Developing Products for Treatment1 Junho 2000).

A meta a ser alcançada foi de incidência de fechamento de feridacompleto, que inclui fechamento da pele sem drenagem ou necessidade decurativo, (por exemplo, avaliado nos 3 meses seguintes ao fechamento) ecicatrização de ferida acelerada, onde a taxa reflete uma diminuição de temposignificante clinicamente até, por exemplo, ocorrer fechamento completo, e umtempo para análise do evento (por exemplo, tempo para completo fechamento).A meta de eficácia primária foi a porcentagem de redução na área total desuperfície de úlcera no Dia 43 (até o Dia 49) a partir da linha de basedeterminada pela análise quantitativa de reconstituições planimétricas daúlcera. Metas de eficácia secundária incluíram: Porcentagem de redução naárea total de superfície de úlcera no Dia 29 e Dia 84 comparado com linha debase (por exemplo, valor do Dia 1), incidência de cicatrizações completas deúlcera nos Dias 29, 43 e 84, tempo (por exemplo, dias) para completacicatrização de úlcera, tempo (por exemplo, dias) para recorrência de formaçãode úlcera para sujeito com cicatrização de úlcera completa antes do final dotratamento, incidência de área total de superfície de úlcera (> 15%) comparadocom linha de base, incidência de estágio de úlcera avançado (por exemplo, >UT 1a), e perfusão microcirculatória da camada de úlcera nos Dias 1, 8, 22 e 43.

Questões de segurança monitoradas envolvidas na hipotensãoclinicamente significante (por exemplo, definida como uma queda de > 35mmHg na pressão sangüínea sistólica relativa à pré-dose em 60 minutos apósa aplicação de cada dose de estudo da droga durante a primeira semana detratamento (dias 1, 3 e 5), infecção de úlcera clinicamente significante (porexemplo, definido pela descarga aumentada e exudatos malcheirosos daúllcera, febre (temperatura > 38,6°C), e uma contagem de glóbulos brancos(WBC) > 10.000μΙ_), produção de anticorpos anti-VEGF, etc. A pressãosangüínea foi medida antes de cada dose e 60 minutos após cada dosedurante a primeira semana.

O volume total de gel aplicado para cada tratamento é de 0,12-0,48 mL (72 pg-288 pg de VEGF). A quantidade de gel aplicada foi baseadanas medidas da ferida (LxW), onde L é o comprimento mais longo de ponta aponta em cm e W é a largura mais longa de ponta a ponta perpendicular a Lem cm (LxW=área estimada de superfície (cm2)). Por exemplo, o gel éaplicado pelo uso de um depressor de língua, onde a quantidade de gelaplicada sobre a superfície completa da úlcera, era de uma densidade de1/16". A ferida é coberta com barreira estéril semi-permeável (por exemplo,filme curativo Adaptec) e envolvida com gaze (por exemplo, Kerlix). Notratamento seguinte, o curativo é removido e a úlcera gentilmente irrigada comsolução salina estéril normal. A superfície da úlcera é medida novamente, adose apropriada de gel é aplicada e a úlcera é reparada.Resultados: VEGF tópico parece ser seguro e bem tolerado. Aincidência de eventos adversos foi comparada entre grupos de tratamento(grupos talbermina e placebo). Nenhum evento adverso ou evento sérioobservado foi atribuído à droga do estudo. Dois pacientes interromperam oestudo devido a eventos adversos sérios (1 no grupo telbermina -+úlcera depele infactada, 1 no grupo placebo-»infecção localizada). Houve um pacienteno grupo telbermina que morreu 4 dias após seguir o último tratamento, mas amorte não foi atribuída à droga do estudo. Nenhum caso de hipotensãoclinicamente significante forai observado em ambos os grupos de tratamento.

Os dados sugerem evidência de atividade biológica. Nenhumsinal de segurança foi observado em um estudo que teve tamanhos pequenosde úlcera que eram UT estágio 1a. Ver Tabela 5 para um resumo dosresultados para % média de redução na área de ferida, % de sujeitos comcicatrização completa e tempo para cicatrização. Nos sujeitos diabéticostratados com VEGF por 6 semanas a 3 vezes por semana, a polulação desujeitos mostrou uma melhora de 14-25% na cicatrização completa da feridaapós 6 semanas com VEGF comparado ao placebo. O estudo mostrou queVEGD teve aceleração de cicatrização de -75 a 100% mais rápida que oplacebo. Ver Tabela 6, que ilustra o tempo para a primeira cicatrizaçãocompleta da úlcera em pacientes tratados com Telbermina (rhVEGF) ouplacebo. O tempo para cicatrização completa da úlcera foi acelerado empacientes tratados com VEGF, por exemplo, tempo para cicatrização completa(25° percentil) foi de 32,5 dias contra 43,0 dias.

Tabela 5

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1 Sujeitos de eficácia avaliável (especificados antes de unblinding):

Violadores de protocolos principais removidos

Sujeitos que perderam 3 doses consecutivas-censuraram na última dosagemdisponível.

Sem LOCF (dados perdidos não imputados)Valor de 2p: Teste de soma de grau Wilcoxonvalor de 3 p: Teste exato de Fisher.valor de4 p: Teste de Log-Rank*análise planimétrica quantitativa-método de avaliação

Tempo para cicatrização completa* Placebo (N=26) Telbermina (N=29)25° percentil, dia 43,0 32,550° percentil, dia ND 58,0

ND = não detectável

* Estimado usando-se o método de Kaplan Meier

Para os sujeitos que alcançaram cicatrização completa da úlcera,a recorrência de formação de úlcera foi avaliada entre o tempo da primeiracicatrização completa da úlcera e a finalização do tempo de estudo ouinterrupção. Dos sujeitos de segurança avaliável que alcançaram cicatrizaçãocompleta da úlcera, 26,7% dos sujeitos tratados com telbermina (4 a 15) e33,35 dos sujeitos tratados com placebo (3 de 9) tiveram uma recorrência deformação de úlcera (valor de ρ log-rank- 0,57). A razão de perigo derecorrência de formação de úlcera para sujeitos tratados com telberminacomparado com sujeitos tratados com placebo foi 0,63 (95% Cl: 0,13, 3,15).

Exemplo 2

Vegf Tópico Na Cicatrizacão De Ferida

Sujeitos, por exemplo, pacientes com diabetes melitus I ou II, comuma área de úlcera estimada após corte de debridamento, por exemplo, >1,0cm2 e < 6,5 cm2 no início do tratamento, são tratados com VEGF recombinanretópico (por exemplo, formulação em gel) diariamente por 12 semanas (para umtotal de até 84 doses) total ou até fechamento completo da ferida (por exemplo,fechamento da pele sem drenagem ou necessidade de curativo), que já vemantes. Sujeitos podem ser observados por 12 semanas ou mais após a fase detratamento. Sujeitos recebem tanto 24 pg/cm2, 72 pg/cm2, como 216 pg/cm2 deVEGF em cada tratamento diário. A área de superfície de úlcera (cm2) éestimada, por exemplo, pela medida do comprimento (L(cm)) mais longo deponta a ponta da úlcera e a largura (W(cm)) é obtida pela medida de um eixomais longo de ponta a ponta perpendicular ao comprimento. A área desuperfície estimada é então IxW. O tratamento pode ser avaliado pela medidado perímetro da área da úlcera via reconstituição, reconstituições de análiseplanimétrica da margem da úlcera, fotografias, exames clínicos, etc. O VEGFaplicado será de 1,8, 0,6 e 0,2 mg/ml de VEGF, 3% de metilcelulose (porexemplo, Methocel A4M premium metilcelulose (The Dow Chemical Company;Midland, Ml), em 5 mM, pH 5,0 de tampão succinato (com, por exemplo, a 1.8mg/ml de VEGF , 0,0036% de polisorbato 20 e 100 mM de trealosedesidratada).

A especificação é considerada suficiente para permitir a umtécnico no assunto praticar a invenção. Entende-se que os exemplos erealizações descritas no presente são somente para propósitos ilustrativos.Realmente, várias modificações da invenção além daquelas mostradas edescritas no presente irão tornar-se aparentes para aqueles técnicos noassunto da descrição anterior e caem dentro do escopo das reivindicaçõesanexadas.

Claims (25)

1. MÉTODO DE ACELERAÇÃO DE CICATRIZAÇÃO DEFERIDA, em um sujeito o método compreende administração de umaquantidade efetiva do VEGF em uma ferida, em que a administração daquantidade efetiva do VEGF acelera a cicatrização de ferida mais que 60%quando comparado a um controle.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aaceleração de cicatrização de ferida é igual ou maior que 74% quandocomparado ao controle.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aaceleração de cicatrização de ferida é avaliada pela % de redução na área daferida.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, em que áreada ferida é de aproximadamente 0,4 cm2 ou mais antes do tratamento.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, em que áreada ferida é de aproximadamente 1,0 cm2 ou mais antes do tratamento.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aaceleração de cicatrização de ferida é avaliada pela taxa de cicatrizaçãocompleta de ferida.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aferida é uma úlcera do pé diabético.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aquantidade efetiva do VEGF é administrada pelo menos três vezes porsemana.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aquantidade efetiva do VEGF é administrada pelo menos por seis semanas.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aquantidade efetiva do VEGF é administrada até existir fechamento completo daferida.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que oVEGF é VEGFi65.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 11, em queo VEGF é VEGF recombinante humano.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aadministração é tópica.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que oVEGF está em uma formulação para administração tópica.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aferida é uma ferida crônica.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aferida é uma úlcera de pressão, uma úlcera de decúbito, uma úlcera venosa,uma queimadura, uma ferida cirúrgica ou uma ferida ou normal.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osujeito está ou foi submetido a um tratamento, onde o tratamento atrasa oufornece cicatrização ineficaz da ferida.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osujeito possui uma condição secundária, em que a condição secundária atrasaou fornece cicatrização ineficaz da ferida.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, em que acondição secundária é diabetes.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que aquantidade efetiva do VEGF é de aproximadamente 20 pg/cm2 aaproximadamente 250 pg/cm2.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que aquantidade efetiva do VEGF é de aproximadamente 24 pg/cm2.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que aquantidade efetiva do VEGF é de aproximadamente 72 pg/cm2.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que aquantidade efetiva do VEGF é de aproximadamente 216 pg/cm2.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que osujeito é humano.

25. MÉTODO DE ACELERAÇÃO DE CICATRIZAÇÃO DEFERIDA, em um sujeito humano o método compreende administração de umaquantidade efetiva do VEGF a uma ferida, em que a administração daquantidade efetiva do VEGF acelera a çicatrização de ferida mais que 60%quando comparado a um controle e em que a ferida está presente no sujeitopor aproximadamente 4 semanas ou mais antes da administração daquantidade efetiva do VEGF.