CN104623669A

CN104623669A - 含细胞因子溶液的新组合物

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Publication number: CN104623669A
Application number: CN201510004873.4A
Authority: CN
Inventors: V.S.马歇尔; C.A.斯密斯; C.J.特朗博尔; G.L.辛; L.O.帕拉迪诺
Original assignee: Stemnion LLC
Current assignee: Stemnion LLC
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2015-05-20
Also published as: US20090054339A1; US20120322731A1; US20150025007A1; US20130302307A1; US20120238495A1; US8088732B2; US8822415B2; US20120101036A1; US8530418B2; US8198239B2; CN101815531B; US8283316B2; US20120225815A1; WO2009025730A1; US8318672B2; EP2185197B1; US20120225048A1; US9173927B2; US8058066B2; US8278417B2

Abstract

本发明涉及含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“CFS”组合物)，包括持续释放的含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“SR-CFS”组合物)；制备这样的新组合物的方法；以及所述组合物的用途。

Description

含细胞因子溶液的新组合物

相关专利申请的交叉引用

依据35USC§119(e)，本申请要求以2007年8月22日提交的美国临时申请60/965,707和2008年4月30日提交的美国临时申请61/125,960为优先权基础，这两项临时申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本发明的技术领域涉及含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“CFS”组合物)，包括持续释放的含细胞因子溶液的新组合物(在本文中称为“SR-CFS”组合物)；制备这样的新组合物的方法；以及所述组合物的用途。

背景技术

已经在许多不同的疾病、障碍和损伤的治疗中评估了许多单独的细胞因子和生长因子的治疗效用。不幸的是，其结果仅部分地令人振奋。例如，PDGF-BB已被证明可用于治疗糖尿病足溃疡；GM-CSF在欧洲上市，用于治疗静脉性溃疡和糖尿病足溃疡；HGH(人生长激素)在美国上市，用于小儿烧伤。失败事件包括BDNF、CNTF和IGF-1，已经在被设计来测试其治疗ALS的有效性的临床研究中对它们进行了评估，每个的结果都令人失望；TGFβ2在静脉性溃疡的2期研究中没有成功；IGF-1和PDGF的组合疗法在糖尿病足溃疡治疗中没有成功。

虽然不清楚为什么有这么多单独的细胞因子和生长因子在临床中失败，但是一个理论是所给予的蛋白剂量是非生理性的，即这些剂量远高于正常出现在体内的生理水平。同时，由于细胞因子和生长因子在一个给定的生理状况下的复杂相互作用，仅施用一种因子(特别是异常高水平的因子)无法重现所述生理状况，并且事实上可能会严重干扰其微妙的平衡。

综合它们在临床中有限的成功，细胞因子和生长因子以及其他基于蛋白的治疗剂通常比其他药物更难以给予患者。由于蛋白的有效性与其形状有关，基于蛋白的治疗剂不能经受可能引起其中包含的一种或多种蛋白解折叠或变性的条件。因此，在基于蛋白的治疗剂的制备、存储和给药方面需要特别小心。

除了避免任何的蛋白变性之外，经常还需要能够控制随时间给予患者的蛋白量。这有助于避免患者中的蛋白浓度达到不希望的高或低，或者距希望的水平偏差太多，而是有助于将患者中的所述治疗剂维持在稳定水平。为满足这一点，已经开发出或者正在开发许多治疗剂(包括基于蛋白的治疗剂)的持续释放制剂。基于蛋白的持续释放治疗剂可通过多种方法进行给药，所述方法包括但不限于片剂或胶囊剂的口服递送、粉剂的吸入、植入、整合至基质中，或者装入胶囊的治疗剂的局部外用，蛋白从该治疗剂中随时间逐渐释放。

这些持续释放制剂的制备方法是不同的。一种方法包括将蛋白与有机溶剂相混合。例如，粉末制剂可通过将蛋白和有机溶剂的混合物喷雾至液氮中进行制备。另一种方法涉及将蛋白与可生物侵蚀/可生物降解聚合物溶于有机溶剂所得到的溶液相混合，从而通过凝固所述混合物而形成包含所述蛋白和所述聚合物的微粒。在又一种方法中，可将蛋白、粉化制剂或微粒与有机溶剂混合，以产生可注射至患者体内或外部施用的液体剂或凝胶剂。不幸的是，使用有机溶剂的缺点是它们有引起蛋白变性的倾向。

添加剂已被用于在存在变性有机溶剂的情况下稳定蛋白。这些添加剂包括表面活性剂(参见美国专利5,096,885)、氨基酸(参见美国专利4,297,344)、多元醇(参见美国专利5,589,167)、天然聚合物(参见WO 8903671)、合成聚合物(参见Pharm.Res.8:285291,1991)和金属(参见美国专利6,191,107B1)，这些文献的每一篇均通过引用的方式纳入本文。

迄今为止，尚没有这样的基于蛋白的治疗剂(即细胞因子和生长因子)，即所述治疗剂能有效地重现或模拟在健康状态以及疾病或受伤状态的体内天然出现的生理相关细胞因子和生长因子的复杂组合和生理水平。现有的每种基于蛋白的治疗剂的给药剂量均比体内正常出现的细胞因子或生长因子的水平高许多倍。另外，至今无人能以生理水平给予这些生理相关的细胞因子和生长因子。此外，至今无人能以持续释放制剂的形式以生理水平给予这些生理相关的细胞因子和生长因子。因此，申请人在本文中首次提出了本发明，其目标是满足这样的未被满足的医学需求，即以生理水平提供生理相关的生长因子和细胞因子(CFS组合物)，在一些情况下，使用一种持续释放的制剂(SR-CFS组合物)以生理水平递送这些生理相关的生长因子和细胞因子。

发明内容

本发明的目标是，提供含细胞因子溶液(CFS)的新组合物，所述组合物可对出现于生物学状况中的这些细胞因子和生长因子的复杂且独特的组合和生理水平进行重现。本发明的另一目标是提供持续释放的含细胞因子溶液(SR-CFS)的新组合物，所述组合物含有天然出现于生物学状况中的所述细胞因子和生长因子的复杂且独特的组合和生理水平。由于所述细胞因子的存在水平与出现于体内的生理水平相当，它们最适合在需要介入的治疗应用中使用，以支持、启动、代替、加速又或影响疾病和/或损伤的治疗和/或愈合中涉及的生化过程和生物过程。对于SR-CFS组合物，细胞因子随时间缓慢释放，以提供持续稳定生理水平的这些因子，以优化愈合和/或恢复。

除了本发明描述的所述新CFS组合物外，本发明的目标还在于提供用于制备所述新CFS组合物和SR-CFS组合物的方法及所述组合物的治疗用途，所述方法包括合并源自细胞的组合物(即合并的ECS组合物和合并的ACCS组合物)。

源自细胞的合并组合物具有数种重要性质和特征，包括与非合并组合物相比，降低了治疗效果所必需的生理相关细胞因子水平的变异性。所述细胞因子的存在水平与出现于体内的生理水平相当，因此最适合在需要介入的治疗应用中使用，以支持、启动、代替、加速又或影响疾病和/或损伤的治疗和/或愈合中涉及的生化过程和生物过程。本文描述的将源自细胞的组合物合并以降低变异性的新方法有这样的效果，即：使得每个合并物中的分泌因子的水平优化，从而实现其全部治疗潜力。除了这种合并组合物的治疗价值之外，所述将样品合并以降低非合并的组合物与组合物之间的变异性的方法也具有重要的商业优势，即：可以通过使非合并组合物因不满足产品规格而被淘汰的情况最少从而提高产率，其结果是降低生产成本并增加收益。

因此，本发明的第一方面是一种源自胚外细胞的细胞因子溶液的组合物，包含生理浓度的a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少一种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在另一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少两种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在另一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少三种因子；以及b)至少一种MMP抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述MMP抑制剂选自TIMP-1和TIMP-2。在又一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF和TIMP-1。在又一个实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF和TIMP-2。在一个具体的实施方案中，所述第一方面的组合物包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和TIMP-2。

本发明的第二方面是这样的，即其中所述源自胚外细胞的细胞因子溶液为源自羊膜的细胞因子溶液。在第二方面的一个具体实施方案中，所述源自羊膜的细胞因子溶液包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和TIMP-2。

本发明的第三方面是一种持续释放组合物，所述组合物包含第一方面的源自胚外细胞的细胞因子溶液或第二方面的源自羊膜的细胞因子溶液。

本发明的第四方面是一种制备源自羊膜的细胞因子溶液的方法，包括a)从胎盘羊膜分离羊膜上皮细胞，b)从所述羊膜上皮细胞选取AMP细胞，c)培养所述AMP细胞直至它们汇合，d)更换培养基，e)在所述培养基中培养所述细胞，以及f)收集步骤e)的培养基以得到源自羊膜的细胞因子溶液。在第四方面的一个具体实施方案中，将步骤(f)重复多次，并将每个步骤(f)中得到的源自羊膜的细胞因子溶液合并以形成合并的源自羊膜的细胞因子溶液。

本发明的第五方面是通过第四方面的方法制备的源自羊膜的细胞因子溶液。在一个实施方案中，第五方面的源自羊膜的细胞因子溶液是这样的，即其中所述溶液包含生理浓度的因子VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和/或TIMP-2。在本发明组合物的一些实施方案中，VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL。

本发明的第六方面是一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本由生理浓度的以下成分组成的治疗组分：a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的一种或多种因子，b)至少一种MMP抑制剂；以及c)载体，其中VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。在第六方面的一个实施方案中，所述MMP抑制剂为TIMP-1和/或TIMP-2，并且TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL。第六方面的另一个实施方案含有基本上由生理浓度的以下成分组成的治疗组分：a)VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF，b)TIMP-1和/或TIMP-2；以及c)载体；其中VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。

本发明的第七方面是一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本上由选自以下的组合物组成的治疗组分和载体：组合物A：VEGF和TIMP-1；组合物B：VEGF、血管生成素和TIMP-1；组合物C：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物D：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物E：VEGF和TIMP-2；组合物F：VEGF、血管生成素和TIMP-2；组合物G：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物H：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物I：VEGF、TIMP-1和TIMP-2；组合物J：VEGF、血管生成素、TIMP-1和TIMP-2；组合物K：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；组合物L：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物M：血管生成素和TIMP-1；组合物N：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物O：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物P：血管生成素和TIMP-2；组合物Q：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物R：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物S：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物T：PDGF-BB和TIMP-1；组合物U：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物V：PDGF-BB和TIMP-2；组合物W：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物X：PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；以及组合物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；其中VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2为：VEGF约5.0-16ng/mL、血管生成素约3.5-4.5ng/mL、PDGF约100-165pg/mL、TGFβ2约2.5-2.7ng/mL、TIMP-1约0.68μg/mL、TIMP-2约1.04μg/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。

本发明的第八方面为一种包含第六和第七方面的组合物的持续释放组合物。

本发明的第九方面是还包含这样的药剂的第八方面的持续释放组合物，即该药剂能够实现所述源自胚外细胞的细胞因子溶液的持续释放，其中所述药剂选自聚合物、聚合物混合物、透明质酸颗粒、微囊化材料或纳米颗粒。

本发明的第十方面是一种制备持续释放组合物的方法，包括这样的步骤，即将含细胞因子溶液的组合物与能够实现含细胞因子溶液的组合物持续释放的药剂相结合。

本发明的第十一方面是通过第十方面的方法制备的持续释放组合物。本发明的第十二方面是包含本发明第一至第九以及第十一方面中任一方面的组合物的药物组合物。

定义

本文中定义的“分离的”是指将材料从其原始环境取出，因此是“通过手工”从其天然状态改变而来的。

本文使用的术语“蛋白标记物”是指细胞或在一些情况下特定细胞类型的质膜的任何蛋白分子特征。

本文使用的“富集的”是指，通过从混合物中消除不需要的材料或者选择并分离需要的材料(即从其中并非所有细胞都表达特定细胞标记物的异质细胞群中分离出具有所述标记物的细胞)，选择性浓缩一种或多种材料或者增加一种或多种材料的量。

本文使用的术语“基本上纯化的”是指就一种具体标记物或标记物的组合而言，细胞群基本上是同质的。基本上同质是指就一种具体标记物或标记物的组合而言至少90％，优选95％同质。

本文使用的术语“胎盘”是指早产胎盘和足月胎盘二者。

本文使用的术语“全能细胞”将具有如下含义。在哺乳动物中，全能细胞具有变成成体中任何细胞类型的潜能；变成胚外膜(例如胎盘)的任何细胞类型的潜能。全能细胞为受精卵及其卵裂产生的大致最初4个细胞。

本文使用的术语“全能干细胞(pluripotent stem cell)”将具有如下含义。全能干细胞是真正的干细胞，具有形成任何体内分化细胞的潜能，但不能形成源自滋养层的胚外膜的组分。羊膜发育自上胚层，而非滋养层。迄今为止已确认了3种类型的全能干细胞：胚胎干(ES)细胞(在灵长类中还可为全能细胞)、胚胎生殖(EG)细胞和胚胎癌(EC)细胞。这些EC细胞分离自畸胎癌，畸胎癌是一种有时出现在胎儿生殖腺中的肿瘤。与其他两种不同，它们通常是非整倍体。

本文使用的术语“多能干细胞(multipotent stem cell)”是真正的干细胞，但仅能分化成有限数量的类型。例如，骨髓中含有这样的多能干细胞，即它们能生成所有的血细胞，但不能分化成其他细胞类型。

本文使用的术语“胚外组织”是指位于胚胎体之外参与胚胎的保护、营养、废物去除等的组织。胚外组织在分娩时被丢弃。胚外组织包括但不限于羊膜、绒毛膜(包含脐带和血管的滋养层和胚外中胚层)、卵黄囊、尿囊和羊水(包括其中含有的所有组分)。胚外组织及源自其的细胞具有与发育中的胚胎相同的基因型。

本文使用的术语“胚外细胞因子分泌细胞”或“ECS细胞”是指源自胚外组织、具有以下特征的细胞群：以生理相关的短暂方式向细胞外空间或者向周围培养基中分泌生理相关细胞因子的独特结合物，并且所述细胞未曾在存在任何源自动物的产物情况下被培养，从而使得这些细胞以及源自其的细胞产物适合在人临床上应用。在一个实施方案中，所述ECS细胞分泌选自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2的至少一种细胞因子，以及至少一种MMP抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述MMP抑制剂选自TIMP-1和TIMP-2。在另一个实施方案中，所述ECS细胞分泌选自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2的一种以上细胞因子，以及一种以上MMP抑制剂。在一个具体的实施方案中，所述MMP抑制剂选自TIMP-1和TIMP-2。在一个优选的实施方案中，所述ECS细胞分泌细胞因子VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2以及MMP抑制剂TIMP-1和/或TIMP-2。在所述独特的结合物中，所述一种细胞因子或多种细胞因子的生理范围如下：VEGF约5.0-16ng/mL，血管生成素约3.5-4.5ng/mL，PDGF约100-165pg/mL，TGFβ2约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1约0.68μg/mL，TIMP-2约1.04μg/mL。所述ECS细胞任选地可表达胸腺素β4。ECS细胞可选自本申请和以下专利文献中描述的细胞群和组合物：US2003/0235563、US2004/0161419、US2005/0124003、美国临时申请60/666,949、60/699,257、60/742,067、60/813,759、美国申请11/333,849、美国申请11/392,892、PCTUS06/011392、US2006/0078993、PCT/US00/40052、美国专利7,045,148、US2004/0048372和US2003/0032179，这些专利文献的内容通过引用的方式全文纳入本文。

本文使用的术语“源自羊膜的多能祖细胞”或“AMP细胞”是指源自羊膜的上皮细胞的特定ECS细胞群。除了ECS细胞的上述特征外，AMP细胞还具有如下的特征。它们都未曾在存在任何源自动物的产物的情况下被培养，从而使得它们以及源自其的细胞产物适合在人临床上应用。它们不需要饲养层即可生长，不表达蛋白端粒末端转移酶并且是非致瘤的。AMP细胞不表达造血干细胞标记物CD34蛋白。在该群中不存在CD34阳性细胞，表明该隔离群未被造血干细胞例如脐带血或胚胎成纤维细胞污染。几乎100％的细胞都可与低分子量细胞角蛋白的抗体反应，证实了它们的上皮性质。新鲜分离的AMP细胞不与干细胞/祖细胞标记物c-kit(CD117)和Thy-1(CD90)的抗体反应。多种用于从足月胎盘或早产胎盘得到细胞的方法是本领域中已知的(参见，例如US 2004/0110287；Anker et al.,2005,Stem cells 22:1338-1345；Ramkumar et al.,1995,Am.J.Ob.Gyn.172:493-500)。然而，本文使用的方法可提供改良的组合物和细胞群。AMP细胞以前被描述为“源自羊膜的细胞”(参见美国临时申请60/666,949、60/699,257、60/742,067、美国临时申请60/813,759、美国申请11/333,849、美国申请11/392,892和PCTUS06/011392，上述文献的每一篇均通过引用的方式全文纳入本文)。

术语“无动物的”在述及本文所述的某些组合物、生长条件、培养基等时是指除临床级的人材料例如重组产生的人蛋白外，无源自动物的材料例如动物血清用于所述这些组合物或方法的制备、生长、培养、增殖、存储或配制中。

术语“无血清”在述及本文描述的某些组合物、生长条件、培养基等时是指，无源自动物(即无非人)的血清用于所述这些组合物或方法的制备、增殖、培养、扩大、保存或配制中。

术语“增殖的”在述及细胞组合物时是指与使用以前的方法得到的细胞群相比，细胞群具有显著更高的细胞浓度。例如，在5次传代后，AMP细胞的增殖组合物中每克羊膜组织的细胞水平比原代培养物中的细胞数目高至少50倍，上至150倍，相比较而言，使用以前的方法时这些细胞增加约20倍。在另一个实例中，在3次传代后，AMP细胞的增殖组合物中每克羊膜组织的细胞水平比原代培养物中的细胞数目高至少30倍，上至100倍。因此，“增殖的”群的每克羊膜组织的细胞数目比以前的方法提高至少2倍，上至10倍。术语“增殖的”仅涵盖这样的情况，即人介入其中以提高细胞数目。

本文使用的术语“传代”是指这样的细胞培养技术，即其中将在组织培养容器中生长达到汇合或将要达到汇合的培养物中的细胞从所述容器取出，以新鲜培养基稀释(即以1:5稀释)，并放置于新的组织培养容器中以使它们继续生长和存活。例如，从所述羊膜分离的细胞被称为原代细胞。通过在本文描述的生长培养基中培养来在培养物中使这种细胞增殖。当将这种原代细胞进行传代培养时，每一轮传代培养被称为一个世代。本文使用的“原代培养物”是指新鲜分离的细胞群。

本文使用的“条件培养基”是指特定细胞或细胞群已在其中培养、随后被除去的培养基。将细胞培养在培养基中时，它们可分泌对其他细胞提供支持或者影响其他细胞行为的细胞因子。这种因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白、小泡、抗体、趋化因子、受体、抑制剂和颗粒。含细胞因子的培养基是所述条件培养基。制备条件培养基的方法的实例记载于美国专利6,372,494，它通过引用的方式全文纳入本文。如本文使用的，条件培养基还指从条件培养基或者从包括AMP细胞的ECS细胞回收和/或纯化的组分，例如蛋白。

本文使用的术语“含细胞因子溶液”或“CFS”组合物是指这样的组合物，即该组合物具有生理浓度的选自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2的一种或多种因子以及至少一种MMP抑制剂。合适的MMP抑制剂的实例包括但不限于TIMP-1和TIMP-2。CFS组合物包括源自ECS细胞的条件培养基、源自羊膜的细胞因子溶液组合物(见下文的定义)、生理性细胞因子溶液组合物(见下文的定义)和这些CFS组合物的持续释放制剂。

本文使用的术语“源自羊膜的细胞因子溶液”或“ACCS”是指源自AMP细胞或增殖的AMP细胞的条件培养基。源自羊膜的细胞因子溶液或ACCS以前被称为“源自羊膜的细胞因子悬液”。

本文使用的术语“生理性细胞因子溶液”或“PCS”组合物是一种非细胞来源并且具有生理浓度以下成分的组合物：选自VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2的一种或多种因子以及至少一种MMP抑制剂。合适的MMP抑制剂的实例包括但不限于TIMP-1和TIMP-2。

本文使用的术语“悬液”是指含分散的组分即细胞因子的液体。所述分散的组分可以完全溶解、部分溶解、悬浮或者分散于液体中。合适的液体包括但不限于水、渗透溶液例如盐溶液和/或糖溶液、细胞培养基以及其他水溶液或非水溶液。

本文使用的术语“裂解产物”是指裂解细胞例如AMP细胞并任选除去细胞碎片(如细胞膜)时得到的组合物。实现这一点可通过机械方式、通过冻融、通过超声、通过使用洗涤剂例如EDTA、或者通过使用例如透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶的酶消化。

本文使用的术语“生理的”或“生理水平”是指物质在生命体系中存在的、并且与生化过程和/或生物过程正确发挥功能有关的水平。

本文使用的术语“合并的”是指多种组合物，这些组合物已被合并以形成一种具有比非合并的组合物更加恒定或更加一致的特征的新组合物。例如，合并的ACCS具有比非合并的ACCS更加恒定或更加一致的特征。合并的组合物的实例包括“SP合并物”(多于一份ACCS收集物/胎盘)、“MP1合并物”(一份ACCS收集物/胎盘，多个胎盘)、“MP2合并物”(多于一份ACCS收集物/胎盘，多个胎盘)。

本文使用的术语“基底”是指细胞附着于其上、在其上生长和/或在其上迁移的表面上的确定涂层。本文使用的术语“基质”是指细胞生长于其中或其上的组分可确定或不确定的物质。基质包括生物物质和非生物物质二者。本文使用的术语“支架”是指细胞生长于其中或其上的三维(3D)结构(基底和/或基质)。支架可由生物组分、合成组分或上述二者的组合构成。再者，支架可以是由细胞形成的天然结构或者是人工形成的结构。另外，支架可包含在合适条件下具有生物活性的组分。

本文使用的术语“一种细胞产物”或“多种细胞产物”是指由细胞制备并分泌的任何物质和全部物质，包括但不限于蛋白因子(即生长因子、分化因子、移植因子、细胞因子、形态发生素)、蛋白酶(即以促进内源细胞分层)、蛋白酶抑制剂、细胞基质组分(即纤连蛋白等)。

术语“治疗有效量”是指达到所需生理效应(即加速伤口愈合)需要的治疗剂的量。

本文使用的术语“可药用的”是指构成制剂的除所述治疗剂外的组分适合给予本发明待治疗患者。

本文使用的术语“治疗组分”是指在将所述组合物给予受试者时发挥治疗效果的所述组合物的组分。

本文使用的术语“治疗性蛋白”包括多种生物活性蛋白，包括但不限于生长因子、酶、激素、细胞因子、细胞因子抑制剂、凝血因子、肽生长和分化因子。

本文使用的术语“组织”是指联合起来行使具体功能的相似分化细胞的聚集物。

本文使用的术语“一(a)”或“一种(an)”是指一种或多种；至少一种。

本文使用的术语“附加的”是指共同地、一起、另外地、相结合地等。

本文使用的术语“共同给药”可包括同时或序贯给予两种或多种药剂。

本文使用的术语“药剂”是指一种活性剂或非活性剂。术语“活性剂”是指当给予受试者时能够具有生理作用的药剂。活性剂的非限制性实例包括生长因子、细胞因子、抗生素、细胞、来自细胞的条件培养基等。术语“非活性剂”是指在给药时没有生理作用的药剂。这种药剂也被称为“可药用赋形剂”。非限制性实例包括延时释放胶囊等。

术语“肠胃外给药”和“肠胃外给予”是本领域公认的，并指非肠内给药和局部给药的给药方式，所述给药方式是通常通过注射并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、脑内和胸骨内注射或注入。

本文使用的术语“持续释放”、“延长释放”、“延时释放”、“控制释放”或“连续释放”是指这样的药剂-----通常为治疗剂或药物，即该药剂配制成可缓慢地溶解且随时间释放。

本文使用的术语“可生物侵蚀的”或“生物侵蚀”是指导致物质崩解的物理过程(即解体)和化学过程(即化学键断裂)的结合。

本文使用的术语“可生物降解的”或“生物降解”是指生物剂(即酶、微生物或细胞)可造成物质崩解。

本文使用的术语“可生物再吸收的”或“可生物吸收的”通过细胞活性(即吞噬作用)除去崩解产物。

本文使用的术语“纳米颗粒”是指直径小于100nm的颗粒，所述颗粒与相同材料的更大颗粒相比呈现新的或增强的依赖于大小的性质。

本文使用的术语“疗法”、“治疗”或“进行治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病或病症的任何治疗，包括：(a)防止易患所述疾病或病症但尚未确诊的受试者罹患所述疾病或病症；(b)抑制所述疾病或病症，即阻止其发展；(c)减轻和/或改善所述疾病或病症，即引起所述疾病或病症消退；或者(d)治愈所述疾病或病症，即终止其发展或进展。本发明方法所治疗的受试群包括患有不希望的病症或疾病的受试者，以及处于发生所述病症或疾病的风险中的受试者。

本文使用的“伤口”是由任何原因引起的正常解剖结构(内部解剖结构和/或外部解剖结构)的任何破裂，包括但不限于创伤性损伤，例如机械损伤(即挫伤、刺入)、热损伤、化学损伤、电损伤、辐射损伤、冲撞损伤和割伤；选择性损伤，例如外科手术及产生的切口疝、瘘等；急性伤口、慢性伤口、感染伤口和无菌伤口，以及与疾病状态相关的伤口(即糖尿病神经病变溃疡、肠胃道溃疡或泌尿生殖道溃疡)。伤口是动态的，愈合过程是需要一系列完整的和相互关联的细胞过程的连续过程，所述细胞过程开始于受伤之时，继续至最初的伤口闭合之后，终止于产生稳定的瘢痕之时。这些细胞过程受体液物质的介导或调节，所述体液物质包括但不限于细胞因子、淋巴因子、生长因子和激素。根据本发明，“伤口愈合”是指通过一些形式的干涉改善组织修复的自然细胞过程和体液物质，使得愈合更快和/或所形成的愈合区域瘢痕更小和/或受伤区域具有接近于未损伤组织的组织强度和/或受伤组织获得一定程度的功能恢复。

本文使用的术语“伤口愈合标准动物模型”是指本领域公认的任何伤口愈合动物模型，其中本发明组合物表现出以加速伤口愈合来衡量的有效性。合适模型的非限制性实例记载于Hayward PG,Robson MC:Animal models of wound contraction.InBarbul A,et al:Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair:Normal and Chronic Wounds.John Wiley & Sons,New York,1990；DelBecarro,et al:The use of specific thromboxane inhibitors to preserve the dermal microcirculation afterburning.Surgery 87:137-141,1980；Robson,et al:Increasing dermal perfusion afterburning by decreasing thromboxane production.J Trauma 20:722-725,1980；Polo,et al:An in vivo model of human proliferative scar.J Surg Res 74:187-195,1998。本领域技术人员知晓其他合适的模型。

具体实施方式

根据本发明，本领域技术人员有能力采用常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整解释。参见，例如Sambrook et al,2001,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"；Ausubel,ed.,1994,"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III；Celis,ed.,1994,"Cell Biology:A LaboratoryHandbook"Volumes I-III；Coligan,ed.,1994,"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III；Gait ed.,1984,"Oligonucleotide Synthesis"；Hames & Higgins eds.,1985,"Nucleic Acid Hybridization"；Hames & Higgins,eds.,1984,"Transcription AndTranslation"；Freshney,ed.,1986,"Animal Cell Culture"；IRL Press,1986,"ImmobilizedCells And Enzymes"；Perbal,1984,"A Practical Guide To Molecular Cloning"。

如果给出数值范围，应理解为，本发明中涵盖在所述范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另外明确指出，否则这些中间值之间间隔下限单位的十分之一)，以及所述范围中任何其他规定值或中间值。本发明还涵盖可独立地包含于这些较小范围中的较小范围的上下限，这些上下限受制于所述范围内任何专门排除的端值。如果所述范围包含一个或两个端值，则不包括这些所包括端值中任一个或两个的范围同样被包括在本发明中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。尽管任何与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或检验本发明，但是下面将描述优选的方法和材料。

应注意，在本文中和随附的权利要求书中，除非上下文中明示，否则单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数指代对象。

获得并培养细胞

ECS细胞-----用于从胚外组织分离细胞的多种方法记载本领域中，所述细胞随后可用于产生本发明的ECS细胞(参见，例如US2003/0235563；US2004/0161419；US2005/0124003；美国临时申请60/666,949、60/699,257、60/742,067、60/813,759；美国申请11/333,849；美国申请11/392,892；PCTUS06/011392；US2006/0078993；PCT/USOO/40052；美国专利7,045,148；US2004/0048372和US2003/0032179)。

鉴定ECS细胞-----一旦分离了胚外组织，就需要鉴定所述组织中哪些细胞具有ECS细胞相关特征(见上文的定义)。例如，对细胞向胞外空间或周围培养基中分泌独特的细胞因子结合物的能力进行测定。合适的细胞为那些其中所述一种或多种细胞因子以以下生理范围存在的细胞：VEGF约5.0-16ng/mL，血管生成素约3.5-4.5ng/mL，PDGF约100-165pg/mL，TGFβ2约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1约0.68μg/mL，TIMP-2约1.04μg/mL。所述细胞任选地可分泌胸腺素β4。

AMP细胞-----在一个具体的实施方案中，AMP细胞的组合物使用以下步骤进行制备：a)从胎盘收集羊膜，b)从所述羊膜离解羊膜上皮细胞，c)从所述羊膜上皮细胞分离AMP细胞，d)在添加有天然来源的或重组产生的人蛋白的基础培养基中培养所述AMP细胞；以及任选地d)使用另外的添加剂和/或生长因子进一步增殖所述细胞。详情描述于美国公开文本2006-0222634-A1中，该公开文本通过引用的方式纳入本文。

AMP细胞按如下条件进行培养：将所述AMP细胞培养于基础培养基中。这种培养基包括但不限于Epilife(Cascade Biologicals)、Opti-pro、VP-SFM、IMDM、Advanced DMEM、K/O DMEM、293SFMⅡ(均由Gibco、Invitrogen生产)、HPGM、Pro 293S-CDM、Pro 293A-CDM、UltraMDCK、UltraCulture(均由Cambrex生产)、Stemline I和StemlineⅡ(均由Sigma-Aldrich生产)、DMEM、DMEM/F-12、Ham'sF12、M199和其他等同的基础培养基。这种培养基可任选地包含临床级的人蛋白或者补加有人临床级蛋白。本文使用的“人蛋白”是天然产生的蛋白或使用重组技术产生的蛋白。在一些具体实施方案中，“人蛋白”还包括包含人蛋白的人体液或者其衍生物或制品，例如人血清或羊水。

在一个最优选的实施方案中，使用无动物产物的体系培养所述细胞，以避免外源性污染。在该实施方案中，培养基为Stemline I或Ⅱ、Opti-pro、IMDM或者DMEM，并任选地补加有浓度最高达10％的临床级人白蛋白。在优选的实施方案中，所述培养基除了是非动物性的之外，还是无血清的。

任选地，可使用其他的因子。在一个实施方案中，使用浓度为0-1μg/mL的表皮生长因子(EGF)。在一个优选的实施方案中，所述EGF浓度为大约10ng/mL。可使用的其他生长因子包括但不限于TGFα或TGFβ(5ng/mL；范围为0.1-100ng/mL)、激活素A、霍乱毒素(优选约0.1μg/mL的水平；范围为0-10μg/mL)、转铁蛋白(5μg/mL；范围为0.1-100μg/mL)、成纤维细胞生长因子(bFGF 40ng/mL(范围为0-200ng/mL)、aFGF、FGF-4、FGF-8(范围均为0-200ng/mL))、骨形态生成蛋白(即BMP-4)或已知可增强细胞增殖的其他生长因子。所有补加物都是临床级的。

生成含细胞因子溶液的条件培养基

生成ECS条件培养基-----按照下文中针对ACCS的描述进行，不同之处是使用ECS细胞。

生成ACCS-----本发明的AMP细胞可用于生成ACCS。在一个实施方案中，如本文所述分离AMP细胞，并以1×10⁶个细胞/mL接种至装有5-30mL培养基、优选10-25mL培养基并且最优选约10mL培养基的T75烧瓶中。将所述细胞培养至汇合，更换培养基，在一个实施方案中，在汇合后1天收集ACCS。在另一个实施方案中，更换培养基并且在汇合后2天收集ACCS。在另一个实施方案中，更换培养基并且在汇合后4天收集ACCS。在另一个实施方案中，更换培养基并且在汇合后5天收集ACCS。在一个优选的实施方案中，更换培养基并且在汇合后3天收集ACCS。在另一个优选的实施方案中，更换培养基并且在汇合后3、4、5、6或更多天收集ACCS。本领域技术人员应理解，本发明的方法还考虑到了用于从AMP细胞培养物收集ACCS的其他实施方案，例如使用其他组织培养容器包括但不限于细胞工厂、烧瓶、中空纤维或悬浮培养容器，或者从亚汇合的和/或活跃增殖的培养物收集ACCS。本发明还考虑到了在收集所述ACCS后将其深冷藏。本发明还考虑到了在收集所述ACCS后将其冻干。本发明还考虑在收集所述ACCS后将其配制用于持续释放。还考虑到了ACCS生产的规模化，以生成足够的产物用于临床试验及用于市售。本领域技术人员熟知深冷藏、冻干和持续释放制剂的方法。

本发明还考虑到了在使用前以合适的稀释剂稀释CFS组合物例如ACCS和合并的ACCS。合适的稀释剂包括但不限于生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液、细胞培养基、条件细胞培养基、水等。这种稀释度可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:100等。另外，稀释度可低于1:2(即1:1、1:0.5等)。所需的合适稀释度将取决于拟定目的，因此将需要由本领域技术人员根据经验确定。

本发明的CFS组合物(包括ACCS、合并的ACCS、PCS等)的特征在于，对生理相关细胞因子进行分析发现其生理相关范围分别为：VEGF约5-16ng/mL，血管生成素约3.5-4.5ng/mL，PDGF约100-165pg/mL，TGFβ2约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1约0.68μg/mL，TIMP-2约1.04μg/mL。任选地检测ACCS和合并的ACCS中是否存在胸腺素β4。

生成生理性细胞因子溶液(PCS)组合物

非源自细胞形式的ACCS(本文中称作生理性细胞因子溶液(“PCS”))组合物通过以下方式生成：在载体中合并生理水平的VEGF、血管生成素、PDGF、TGFβ2中的一种或多种以及一种或多种MMP抑制剂(即TIMP-1和/或TIMP-2)。任选地，所述PCS包含胸腺素β4。这些细胞因子的生理水平与在ACCS中出现的生理水平相同。合适的载体包括但不限于生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液、细胞培养基、条件细胞培养基、水等。这样的组合物适合于深冷藏、冻干、持续释放制剂、规模化等。本发明考虑到，可生产PCS使其包含的因子的浓度水平比在ACCS中出现的浓度水平高，并且可随后在使用前以合适的稀释剂将它稀释。合适的稀释剂包括但不限于生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液、细胞培养基、条件细胞培养基、水等。这种稀释度可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:100等。另外，这类稀释度可低于1:2(即1:1、1:0.5等)。所需的合适的稀释度将取决于拟定目的，因此将需要由本领域技术人员根据经验确定。

本发明的组合物可根据其拟定目的以多种方式制备。例如，组合物可以是含本发明的药剂(即ACCS、合并的ACCS和PCS)的液体。液体组合物还包括凝胶。所述液体组合物可以是水性的，或者是软膏剂、油剂、乳膏的形式。还可以适合喷雾施用或者气雾施用的方式配制所述液体组合物。

有用的水性悬液可包含一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物如纤维素聚合物以及不溶于水的聚合物如交联的含羧基聚合物。本发明的水性悬液或溶液/悬液优选地是粘稠的或粘附性的，甚至更优选地是粘稠的和粘附性的。

持续释放组合物

所述CFS组合物(包括但不限于ACCS、合并的ACCS和PCS)可配制为持续释放的CFS组合物(在本文中称为“SR-CFS”)。本领域技术人员熟知制备治疗剂(包括基于蛋白的治疗剂如ACCS、合并的ACCS或PCS)的持续释放组合物的方法。

SR-CFS(包括但不限于SR-ACCS和SR-PCS)可由本文中所述的任一方法制备。例如，多泡脂质体制剂技术可用于蛋白和肽治疗剂的持续释放。Qui,J.等人(ACTAPharmacol Sin,2005,26(11):1395-401)描述了用于配制持续释放的干扰素α-2b的这一方法。Vyas,S.P.等人(Drug Dev Ind Pharm,2006,32(6):699-707)描述了在多泡脂质体中包封聚乙二醇化干扰素α。ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于多泡脂质体持续释放制剂中。

纳米颗粒技术也可用于制备SR-CFS。例如，Packhaeuser,CB.等人(J ControlRelease,2007,123(2):131-40)描述了基于装载胰岛素的二烷基氨基烷基-胺-聚(乙烯醇)-g-聚(丙交酯共乙交酯)纳米颗粒的可生物降解的肠胃外贮藏系统，并得出这样的结论，即基于纳米颗粒的贮藏体为用于针对生物活性大分子(即蛋白)设计控制释放装置的合适候选物。Dailey,L.A.等人(Pharm Res 2003,20(12):2011-20)描述了基于支化聚合物DEAPA-PVAL-g-PLGA的无表面活性剂的可生物降解纳米颗粒用于气溶胶疗法，并得出这样的结论，即DEAPA-PVAL-g-PLGA为多能药物递送系统。ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于基于纳米颗粒的持续释放制剂。

基于聚合物的持续释放制剂也是非常有用的。Chan,Y.P.等人(Expert OpinDrug Deliv,2007,4(4):441-51)提供了Medusa系统(Flamel Technologies)的综述，所述Medusa系统用于持续释放的蛋白和肽疗法。迄今为止，Medusa系统已在动物模型(大鼠、狗、猴子)中以及在肾癌(IL-2)患者和丙型肝炎(IFN-α(2b))患者的临床试验中应用于皮下注入IL-2和IFN-α(2b)。Chavanpatil,M.D.等人(Pharm Res,2007,24(4):803-10)描述了表面活性剂聚合物纳米颗粒，作为用于水溶性分子的持续且增强细胞递送的新平台。Takeuchi,H.等人(Adv Drug Deliv Res,2001,47(l):39-54)描述了用于肽药物递送的粘附性纳米颗粒系统，其包含脂质体和聚合物纳米颗粒。Wong,H.L.等人(Pharm Res,2006,23(7):1574-85)描述了新的聚合物-脂质杂合系统，该系统已被证明可提高多柔比星对多药物抗性乳腺癌细胞的细胞毒性。CFS组合物，包括但不限于ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于上述持续释放制剂方法中。

另外，本领域技术人员熟悉的其他持续释放方法，虽然未在本文中具体地描述，也适合与所述CFS组合物一块使用。

包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS(包括合并的ACCS)和SR-PCS的CFS组合物的药物组合物

本发明提供了CFS组合物和可药用载体的药物组合物。术语“可药用”是指由美国联邦政府或州政府的管理机构批准或者在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍公认的针对用于动物、尤其是用于人的药典中列出。术语“载体”是指与所述组合物一块给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、磨粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。根据需要，所述组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等的形式。合适的药物载体的实例由E.W.Martin记载于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中，并且还被本领域技术人员熟悉的其他人记载。

本发明的药物组合物可配制为中性形式或盐形式。可药用的盐包括那些用游离氨基形成的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、酒石酸盐等，以及那些用游离羧基形成的盐，例如钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁盐、异丙胺盐、三乙胺盐、2-乙氨基乙醇的盐、组氨酸盐、普鲁卡因盐等。

含包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS(包括合并的ACCS)和SR-PCS的CFS组合物的治疗试剂盒

本发明还提供了一种生产制品，包括包装材料和包含在所述包装材料中的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含CFS组合物。所述包装材料包含一个标签或药物说明书，其标明内含的CFS组合物可用于治疗性应用，例如用于伤口愈合

包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS(包括合并的ACCS)和SR-PCS的CFS组合物的制剂、剂量和给药

可将包含CFS组合物的组合物给予一名受试者以提供多种细胞功能或组织功能，例如以加速伤口愈合。本文使用的“受试者”可以指人或非人动物。

这样的组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体(任选地包含赋形剂和辅剂)以任何常规的方式配制。合适的制剂取决于所选择的给药途径。所述组合物可以与其治疗用途的书面说明书一块包装。所述组合物还可在一种或多种生理上可接受的载体中给予所述接受者。用于CFS组合物的载体可包括但不限于溶液：生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含生理浓度的盐混合物的乳酸盐林格溶液或细胞培养基

另外，本领域技术人员可容易地确定用于具体的目的合适的CFS组合物剂量。优选的剂量范围是每平方厘米施用面积约0.1至1000微克。其他优选的剂量范围为1.0至50.0微克/施用面积。在一个特别优选的实施方案中，已经发现相对少量的CFS组合物在治疗上是有用的。这种治疗效用的一个例证是ACCS(包括合并的ACCS)加速伤口愈合的能力(详见美国公开2006/0222634和美国公开2007/1231297，每篇通过引用的方式纳入本文)。本领域技术人员还应了解，给药的剂量数目也需要基于例如被治疗疾病、病症或损伤的严重度和类型根据经验确定。例如，在一个优选的实施方案中，一个剂量足以具有治疗效果(即加速伤口愈合)。其他优选的实施方案为实现治疗效果而考虑2个、3个、4个或更多个剂量。

本领域技术人员应了解，优选的剂量为在对其有需要的患者中产生治疗效果例如加速伤口愈合的剂量(治疗有效量)。当然，所述CFS组合物的合适剂量需要基于多个变量在使用时根据经验确定，所述变量包括但不限于被治疗的损伤、障碍或病症的严重度和类型；患者的年龄、体重、性别、健康状态；正给予所述患者的其他药剂和治疗；等等。本领域技术人员还应了解，给药的剂量数目(剂量方案)还需要基于例如被治疗的损伤、障碍或病症的严重度和类型根据经验确定。另外，本领域技术人员还应了解，给药频率需要基于例如被治疗的损伤、障碍或病症的严重度和类型根据经验确定。在一些实施方案中，每天给予一个剂量，持续给定的天数(即每天一次持续7天，等)。在另一些实施方案中，1天中(每4小时等)可给予多个剂量。本发明还考虑每天多个剂量，持续多天。

在本发明的另一些实施方案中，至少一种另外的药剂可与所述CFS组合物结合。这样的药剂可与本发明的CFS组合物协同地作用，以增强治疗效果。这样的药剂包括但不限于生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体、抑制剂、抗生素、免疫抑制剂、类固醇、抗真菌剂、抗病毒剂或其他细胞类型(即干细胞或干细胞样细胞，例如AMP细胞)。非活性剂包括载体、稀释剂、稳定剂、胶化剂、递送载体、ECM(天然的及合成的)、支架等。如果所述CFS组合物与其他药物活性剂结合给药，则可以仅需要较少量的CFS组合物即可具有治疗效果。

CFS组合物可通过注入至受试者的靶位点来给药，优选地经递送装置例如管如导管注射。在一个优选的实施方案中，所述管另外包含针头，例如注射器，通过该针头可将所述CFS组合物导入至受试者中的所需位置。向受试者给予所述CFS组合物的具体的非限制性实例还包括通过以下方式给药：皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、心内注射、皮内注射、鞘内注射、脑膜外注射、腹膜内注射或脑内注射。本发明的方法还考虑到了输注(即脑膜下输注、鞘内输注或脑内输注)。如果是静脉内给药，可制备一种可注射的液体悬液，并通过连续滴注或作为一次推注给药。在一些情况下，使用输液泵给予所述CFS组合物可能是合适的。

对给予CFS组合物的时间进行确定将取决于被治疗的疾病、障碍或损伤的类型和严重度。在一个实施方案中，在诊断或损伤后尽可能快地给予所述CFS组合物。在另一个实施方案中，在诊断或损伤后不止一次给予所述CFS组合物。在某些实施方案中，如果需要手术，在手术时给予所述CFS组合物。在另一些实施方案中，在手术时和手术后给予所述CFS组合物。这种手术后给药可采取单次给药形式或多次给药形式。

还可将CFS组合物以不同的形式插入至递送装置如注射器中。例如，所述CFS组合物可以是这类递送装置中所包含的溶液的一部分。本文使用的术语“溶液”包括可药用的载体或稀释剂。可药用的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这些载体和稀释剂的使用在本领域中是熟知的。所述溶液优选地是无菌的，并且流动性达到易于注射的程度。优选地，所述溶液在制造和保存的条件下是稳定的，并且任选地可通过使用例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，进行抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用的防腐处理。本发明的溶液可通过将所述CFS组合物整合至可药用的载体或稀释剂中，以及在需要时至上文列举的其他成分中来制备。

CFS组合物可全身给药(例如经静脉内)、局部给药(例如在手术中通过观察直接施用)或外用。为了进行这些给药，所述组合物为可注射的液体悬液制品形式或者为这样的生物相容介质形式，即该介质可以液体形式注射并在受损组织部位变成半固体。还可使用可控制的内窥镜递送装置。

所述CFS组合物可整合或植入其中的支持性基质包括这样的基质，即这些基质是接受者相容的并且可降解成对所述接受者无害的产物。

这种基质的实例是天然的和/或合成的可生物降解基质。天然的可生物降解基质包括血浆凝块(例如来自哺乳动物)、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白基质。合适的合成基质材料必须是生物相容的，以排除免疫并发症。它还必须是可再吸收的。所述基质应能够被构造成多种形状，并应具有足够强度以防止在植入时坍塌。最近的研究表明，由聚乙醇酸制成的可生物降解的聚酯聚合物符合所有这些标准(Vacanti,et al.J.Ped.Surg.23:3-9(1988)；Cima,et al.Biotechnol.Bioeng.38:145(1991)；Vacanti,et al.Plast.Reconstr.Surg.88:753-9(1991))。其他合成的可生物降解的支持基质包括合成的聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。合成聚合物的另一些实例以及将组合物整合或植入这些基质的方法也是现有技术中已知的。参见，例如美国专利4,298,002和5,308,701。

生物可降解的聚合物基质的一个优点是，可将CFS组合物直接整合至所述支持基质中，使得它可在体内随着所述支持基质降解而缓慢释放。除所述CFS组合物外，还可以将包括以下物质的其他因子整合至所述基质中或者与所述基质结合提供：营养素、生长因子、诱导分化或去分化(即引起分化的细胞失去分化特征并获得诸如增殖和更一般性功能的特征)的诱导剂、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、消退因子、增强或允许淋巴网络或神经纤维向内生长的生物活性化合物、透明质酸、购自提供商诸如Collaborative Research和Sigma Chemical Co.的药物(其为本领域技术人员已知的并且是市售的，同时带有关于多少量构成有效量的说明书)、生长因子如表皮生长因子(EGF)以及肝素结合的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。类似地，可合成含肽如附着肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物，用于形成基质(参见，例如美国专利4,988,621、4,792,525、5,965,997、4,879,237和4,789,734)。

在另一个实例中，可将所述CFS组合物整合至凝胶基质(例如来自UpjohnCompany的Gelfoam)中。已经开发了多种包封技术(例如Lacy et al.,Science254:1782-84(1991)；Sullivan et al.,Science 252:718-712(1991)；WO 91/10470；WO91/10425；美国专利5,837,234；美国专利5,011,472；美国专利4,892,538)。在涉及直接物理触及病态或损坏组织的开放式手术过程中，所述CFS组合物递送制品的全部所述形式都是可选的。可间断地重复给予这些组合物，直至达到所需的治疗效果，即加速伤口愈合。

待使用的三维基质为提供支架以引导组织愈合和形成过程的结构化基质。支架可采取的形式包括纤维、凝胶、织物、海绵状片层和使用复杂的固体自由成型建造(SFFF)方法建造的有孔和通道的复杂3-D结构。本文使用的术语“支架”是指三维(3D)结构(基底和/或基质)。它可由生物组分、合成组分或上述两者的结合构成。此外，它可天然地由细胞构建或者是人工构建的。另外，所述支架可包含在适当条件下有生物活性的组分。所述支架的结构可包括网状物、海绵，或者可从水凝胶形成。

对所述支架进行设计和构建以形成三维基质是最重要的。所述基质应该是易弯曲的、无毒的、可注射多孔模板，用于血管向内生长。所述孔应使血管向内生长。这些通常是约100-300微米的互联孔，即具有100-300微米的间隙空间，但可使用较大的开口。所述基质应被定形以使表面积最大化，以使营养物、气体和生长因子足够地扩散。在此时，相对耐压缩的多孔结构是优选的，但已经证明即使所述基质的典型六个面中有一个或两个面被压缩，所述基质仍能有效地使组织生长。

所述聚合物基质可被制成易弯曲的或坚硬的，取决于所需的最终形式、结构和功能。例如，为了修复缺损，在植入期间，将所述易弯曲的纤维垫切割约等于整个缺损的大小，然后根据需要将之放到外科手术产生的缺损处。使用纤维基质的一个优点是，在植入时容易使所述结构重定形或重排。

本发明还提供了CFS组合物与上述支持基质的任一种以及源自羊膜的膜的结合递送。这样的膜可作为本发明所述用于回收AMP细胞的方法的副产物得到，或者通过例如以下文献描述的其他方法得到：美国专利6,326,019，其中描述一种用于制备、保存和使用来自人羊膜的外科移植物的方法；US 2003/0235580，它描述了重建的和重组的羊膜用于向宿主中的部位持续递送治疗分子、蛋白或代谢产物；U.S.2004/0181240，它描述了覆盖组织表面的羊膜，所述羊膜可防止粘附、排除细菌或抑制细菌活性，或者促进愈合或组织生长；以及美国专利4,361,552，它涉及交联羊膜的制备以及所述羊膜在治疗烧伤和伤口的方法中的用途。根据本发明，CFS组合物可整合至这些膜之中。

包括但不限于ACCS、合并的ACCS、PCS、SR-ACCS(包括合并的ACCS)和SR-PCS的CFS组合物的示例性治疗用途

伤口愈合-----本发明的CFS组合物可有效地加速多种原因引起的伤口的伤口愈合，所述原因包括但不限于切割损伤、压迫损伤、热损伤、辐射损伤、刺入损伤、冲击损伤、急性损伤、慢性损伤、感染损伤和无菌损伤。本发明是基于这样的发现，即CFS组合物可加速所有伤口类型的伤口愈合过程，特别是当外部给药时，即给药至伤口部位的表面时。使用CFS组合物时，所有伤口类型——机械的或热的、急性的或慢性的、感染的或无菌的——与使其自然愈合的类似伤口相比或者与以现有方法治疗的类似伤口相比，都可发生更快速地愈合。本发明意义上的治疗剂的“治疗有效量”将由患者的主治医师或主治兽医确定。这样的量可由本领域普通技术人员容易地确定，并且当依照本发明给药时能够加速伤口愈合。影响治疗有效量的因素包括所用治疗剂的比活性、伤口类型(机械的或热的，全厚度的或部分厚度的，等等)、伤口的大小、伤口深度(如果是全厚度的)、有无感染、从施以损伤起过去的时间，患者的年龄、身体状况、其他疾病状态的存在情况和营养状况。另外，患者可能正使用的其他药物将会影响待给予治疗剂的治疗有效量的确定。

实施例

给出下列实施例是为了为本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物和方法的完整公开和描述，非旨在限制本发明人所认为的本发明的范围。已努力确保所使用的数字(如量、温度等)的精确度，但是还是应该考虑到某些实验错误和误差。除非另外指出，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或约为大气压。

实施例1：制备AMP细胞组合物

AMP细胞的回收-----使用离解剂PXXⅢ和胰蛋白酶从起始羊膜离解AMP细胞。羊膜的平均重量为18-27g。对于从每g羊膜回收的细胞数目，以PXXⅢ离解为10-15×10⁶个，以胰蛋白酶离解为5-8×10⁶个。

获得所选择的AMP细胞的方法：将从羊膜分离的细胞立即铺板。在培养基中约2天后，除去非附着细胞，保留附着细胞。这种向塑料组织培养容器的附着是用于得到所需AMP细胞群的选择方法。附着和非附着AMP细胞似乎具有相似的细胞表面标记表达谱，但附着细胞具有更大的生存力，是所需的细胞群。培养附着的AMP细胞，直至它们达到约120000-150000细胞/cm²。在这时，培养物汇合。合适的细胞培养物将在约5-14天达到该细胞数目。符合该标准是AMP细胞的增殖能力的指示，不符合该标准的细胞不被选择用于进一步的分析和使用。一旦AMP细胞达到约120000-150000细胞/cm²，将它们收集并深冷藏。该收集时间点被称为p0。

实施例2：生成ACCS

本发明的AMP细胞可用于生成ACCS，包括合并的ACCS。如上述分离AMP细胞，并以约1×10⁶细胞/mL接种至装有约10mL培养基的T75烧瓶中。将细胞培养至汇合，更换培养基并在汇合后3天收集ACCS。本领域技术人员应了解，本发明的方法还考虑到了从汇合培养物收集ACCS的其他实施方案，例如使用其他组织培养容器包括但不限于细胞工厂、烧瓶、中空纤维或悬浮培养装置等(参见上文详述)。本发明还考虑在收集所述ACCS后将其深冷藏，冻干或者配制用于持续释放。还考虑到了在不同时间点收集ACCS(参见上文详述)。

实施例3：生成合并的ACCS

ACCS的获得基本如上述。在一些实施方案中，从源自一个胎盘的AMP细胞培养物中多次收集ACCS，并将这样的多份ACCS收集物合并在一块。这样的合并物被称为“SP合并物”(多于一份ACCS收集物/一个胎盘)。在另一个实施方案中，AMP细胞培养物源自数个胎盘，即来自5个或10个胎盘。将来自每个胎盘的AMP细胞培养，从每个培养物收集一份ACCS收集物，然后将它们都合并在一块。这样的合并物称为“MP1合并物”(一份ACCS收集物/胎盘，多个胎盘)。在又一实施方案中，AMP细胞培养物源自数个胎盘，即来自5个或10个胎盘。将来自每个胎盘的AMP细胞培养，从每个AMP细胞培养物收集多于一份ACCS收集物，然后合并在一块。这样的合并物称为“MP2合并物”(多于一份ACCS收集物/胎盘，多个胎盘)。

实施例4：使用ELISA检测非合并的和合并的ACCS中的细胞因子

对来自于获自10个不同胎盘的AMP细胞的ACCS进行本领域技术人员熟知的标准ELISA。除了单独测定每个ACCS样品外，还测试合并的ACCS样品，以确定样品之间ELISA结果的变异性是否减少。按照上文所述得到ACCS。按如下进行制备合并物：合并物1包含来自胎盘1-5的ACCS，合并物2包含来自胎盘6-10的ACCS，合并物3包含来自胎盘1-10的ACCS。另外对SP、MP1、MP2合并物进行了ELISA。

实施例5：生成PCS组合物

如下的PCS组合物是通过将标明的细胞因子或因子以生理水平结合于一种载体中而产生：

组合物A：VEGF和TIMP-1

组合物B：VEGF、血管生成素和TIMP-1

组合物C：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1

组合物D：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1

组合物E：VEGF和TIMP-2

组合物F：VEGF、血管生成素和TIMP-2

组合物G：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2

组合物H：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2

组合物I：VEGF、TIMP-1和TIMP-2

组合物J：VEGF、血管生成素、TIMP-1和TIMP-2

组合物K：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2

组合物L：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2

组合物M：血管生成素和TIMP-1

组合物N：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1

组合物O：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1

组合物P：血管生成素和TIMP-2

组合物Q：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2

组合物R：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2

组合物S：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2

组合物T：PDGF-BB和TIMP-1

组合物U：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1

组合物V：PDGF-BB和TIMP-2

组合物W：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2

组合物X：PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2

组合物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2

组合物A-Y任选地包含胸腺素β4。本领域技术人员应了解，在一些实施方案中，其他MMP抑制剂(即TIMP-3、TIMP-4或合成的MMP抑制剂)可能是合适的(J.Frederick Woessner,Jr.,J.Clin.Invest.108(6):799-800(2001)；Brew,K.,et al,Biochim Biophvs Acta.2000Mar 7；1477(1-2):267-83)。

将VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2以如下的生理水平加入：VEGF约5.0-16ng/mL、血管生成素约3.5-4.5ng/mL、PDGF约100-165pg/mL、TGFβ2约2.5-2.7ng/mL、TIMP-1约0.68μg/mL、TIMP-2约1.04μg/mL。VEGF可获自Invitrogen，货号#PHG0144、PHG0145、PHG0146、PHG0141或PHG0143；血管生成素可获自R&D Systems，货号#265-AN-050或265-AN-250；PDGF-BB可获自Invitrogen，货号#PHG0044、#PHG0045、#PHG0046、#PHG0041、#PHG0043；TGFβ2可获自Invitrogen，货号#PHG9114；TIMP-1可获自R&D Systems，货号#970-TM-010；TIMP-2可获自R&D Systems，货号#971-TM-010。将VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2加入至一种载体中，所述载体例如生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液、细胞培养基、水或本领域技术人员已知的其他合适水性溶液。

在用于伤口愈合的标准动物模型中测试PCS组合物，以评价活性(参见上文对用于伤口愈合的标准动物模型的定义)。

实施例6：生成持续释放的CFS组合物

SR-CFS组合物如SR-ACCS(包括合并的ACCS)或SR-PCS是通过以下方式产生：将CFS组合物与本文所述的(参见具体实施方式)或本领域技术人员熟知的任一持续释放制剂技术相结合。

实施例7：ACCS在慢性伤口愈合的动物模型中的效应

将本领域公认的慢性肉芽伤口动物模型用于研究ACCS对慢性伤口愈合的效应(Hayward PG,Robson MC:Animal models of wound contraction.In Barbul A,et al:Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair:Normal andChronic Wounds.John Wiley & Sons,New York,1990.)。

结果：ACCS有效地使组织细菌生物负荷未增殖。ACCS使得肉芽伤口的愈合加速，显著快于未处理的感染对照组。

实施例8：CFS组合物PCS、SR-ACCS和SR-PCS在慢性伤口愈合动物模型中的应用

将本领域公认的慢性肉芽伤口动物模型(Hay ward PG,Robson MC:Animalmodels of wound contraction.In Barbul A,et al:Clinical and Experimental Approachesto Dermal and Epidermal Repair:Normal and Chronic Wounds.John Wiley & Sons,NewYork,1990)用于研究本发明的CFS组合物PCS、SR-ACCS或SR-PCS对慢性伤口愈合的效应。

在不背离本发明的主旨和基本属性的前提下，可以其他具体方式实施本发明。任何等价实施方案均旨在被涵盖于本发明的范围内。实际上，从前述说明，除本文中显示和描述的那些之外，对本发明的多种改变对于本领域的技术人员而言是显而易见的。这样的改变也旨在落在随附权利要求的范围内。

在说明书全文中引用了多篇出版物。每篇出版物均旨在以引用的方式全文纳入本说明书。

Claims

1.一种源自胚外细胞的细胞因子溶液组合物，包含生理浓度的：

a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少一种因子；以及

b)选自TIMP-1和TIMP-2的至少一种MMP抑制剂。

2.权利要求1的组合物，其中所述MMP抑制剂为TIMP-1和/或TIMP-2。

3.权利要求1的组合物，包含生理浓度的：

a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少两种因子；以及

b)至少一种MMP抑制剂。

4.权利要求1的组合物，包含生理浓度的：

a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的至少三种因子；以及

b)至少一种MMP抑制剂。

5.权利要求1的组合物，包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF和TIMP-1。

6.权利要求1的组合物，包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF和TIMP-2。

7.权利要求1的组合物，包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和TIMP-2。

8.权利要求1-7的组合物，其中所述含细胞因子溶液组合物是源自羊膜的细胞因子溶液。

9.权利要求8的组合物，其中所述源自羊膜的细胞因子溶液包含生理浓度的VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和TIMP-2。

10.一种持续释放组合物，包含权利要求1的源自胚外细胞的细胞因子溶液。

11.权利要求10的持续释放组合物，其中所述源自胚外细胞的细胞因子溶液是源自羊膜的细胞因子溶液。

12.一种制备源自羊膜的细胞因子溶液的方法，包括：

a)从胎盘羊膜分离羊膜上皮细胞，

b)从所述羊膜上皮细胞选取AMP细胞，

c)培养所述AMP细胞直至它们汇合，

d)更换培养基，

e)在所述培养基中培养所述细胞，以及

f)收集步骤(e)的培养基以得到源自羊膜的细胞因子溶液。

13.权利要求12的方法，其中将步骤(f)重复多次，并将每个步骤(f)中得到的源自羊膜的细胞因子溶液合并以形成合并的源自羊膜的细胞因子溶液。

14.由权利要求13的方法制备的源自羊膜的细胞因子溶液。

15.权利要求14的源自羊膜的细胞因子溶液，其中所述溶液包含生理浓度的因子VEGF、TGFβ2、血管生成素、PDGF、TIMP-1和/或TIMP-2。

16.权利要求1-10、14和15的组合物，其中VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL。

17.一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本由生理浓度的以下成分组成的治疗组分：

a)选自VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF的一种或多种因子，

b)至少一种MMP抑制剂；以及

c)载体，其中VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。

18.权利要求17的组合物，其中所述MMP抑制剂为TIMP-1和/或TIMP-2，并且TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL。

19.权利要求17的组合物，含有基本由生理浓度的以下成分组成的治疗组分：

a)VEGF、TGFβ2、血管生成素和PDGF，

b)TIMP-1和/或TIMP-2；以及

c)载体，其中VEGF的生理浓度为约5.0-16ng/mL，血管生成素的生理浓度为约3.5-4.5ng/mL，PDGF的生理浓度为约100-165pg/mL，TGFβ2的生理浓度为约2.5-2.7ng/mL，TIMP-1的生理浓度为约0.68μg/mL，TIMP-2的生理浓度为约1.04μg/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。

20.一种生理性细胞因子溶液的组合物，含有基本上由选自以下的组合物组成的治疗组分和载体：组合物A：VEGF和TIMP-1；组合物B：VEGF、血管生成素和TIMP-1；组合物C：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物D：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物E：VEGF和TIMP-2；组合物F：VEGF、血管生成素和TIMP-2；组合物G：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物H：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物I：VEGF、TIMP-1和TIMP-2；组合物J：VEGF、血管生成素、TIMP-1和TIMP-2；组合物K：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；组合物L：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物M：血管生成素和TIMP-1；组合物N：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物O：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物P：血管生成素和TIMP-2；组合物Q：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物R：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物S：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物T：PDGF-BB和TIMP-1；组合物U：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物V：PDGF-BB和TIMP-2；组合物W：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物X：PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；及组合物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；其中VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2为：VEGF约5.0-16ng/mL、血管生成素约3.5-4.5ng/mL、PDGF约100-165pg/mL、TGFβ2约2.5-2.7ng/mL、TIMP-1约0.68μg/mL、TIMP-2约1.04μg/mL，并且其中所述载体为生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液或细胞培养基。

21.一种持续释放组合物，包含权利要求17-20的组合物。

22.权利要求21的持续释放组合物，还包含能够实现所述源自胚外细胞的细胞因子溶液的持续释放的药剂，其中所述药剂选自聚合物、聚合物混合物、透明质酸颗粒、微囊化材料或纳米颗粒。

23.一种制备持续释放组合物的方法，包括步骤：将含细胞因子溶液的组合物与能够实现含细胞因子溶液的组合物持续释放的药剂相结合。

24.一种由权利要求23的方法制备的持续释放组合物。

25.一种含有权利要求1-10和14-24任一项的组合物的药物组合物。