TW201603822A - 含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體，其中該膠原蛋白與該透明質酸的重量比介於0.01：1至100：1之間。

Description

含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體
本發明係關於一種含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體。
在治療退化性疾病中，幹細胞療法被視為是一種相當有希望的方法。然而，將幹細胞保留在病患體內的植入位置(implantation site)並且維持其存活度以實現組織修復仍具有一定的挑戰性。因此，研發一種介質(例如細胞組織膠體)，使幹細胞伴隨著高存活度地移植於特定位置為目前相關產學界亟需達到的重要目標之一。
傷口癒合是一種對組織損傷的自然修復反應。癒合是由細胞一連串複雜的交互作用而產生，使受傷皮膚的抗拉強度能重鋪(resurfacing)、重建(reconstitution)和修復(restoration)。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的傷口需要更長的時間進行癒合。
因此，本發明提供一種含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體，其中以整體重量為基礎，該膠原蛋白與該透明質酸的比例介於0.01：1與100：1之間，例如0.05-100：1、1-50：1、100：1、75：1、50：1、30：1、25：1、15：1、10：1、5：1、1：1、0.5：1、0.2：1或0.1：1。該透明質酸的濃度可為0.001mg/ml至100mg/ml(例如：0.01至1mg/ml、0.5至100mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、75mg/ml或100mg/ml)，而該膠原蛋白的濃度可為0.001mg/ml 至100mg/ml(例如，1-100mg/ml、10-100mg/ml、100mg/ml、75mg/ml、50mg/ml、30mg/ml、25mg/ml、15mg/ml、10mg/ml或5mg/ml)。舉例來說，膠原蛋白的濃度介於0.1mg/ml至100mg/ml，而透明質酸的濃度為0.01mg/ml至35mg/ml。在一實施例中，膠原蛋白的濃度介於3mg/ml至40mg/ml(例如6mg/ml或9mg/ml)，而透明質酸的濃度為0.2mg/ml至20mg/ml。在另一實施例中，透明質酸的濃度為0.5至100mg/ml，而膠原蛋白的濃度為5至50mg/ml。
本發明的細胞組織膠體可進一步包含可供細胞生長的營養素(例如一細胞培養基或一維他命)、生物活性劑、一個或多個基質要素以及/或幹細胞。該生物活性劑可為一生長因子，例如上皮生長因子(epidermal growth factor)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor)、血小板衍生性生長因子(platelet-derived growth factor,F1DGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)、神經生長因子(nerve growth factor)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、細胞聚落刺激因子(colony-stimulating factor)、幹細胞因子(stem call factor)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)、顆粒球細胞聚落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor)、顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、膠質衍生神經營養因子(glial-derived neurotropic factor)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、內皮單核細胞活化多胜肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、上皮中性粒細胞活化胜肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein)、大腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)。該基質要素包括，但不限於：明膠(gelatin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、細胞黏合素(tenacin)、層黏蛋白(laminin)、玻璃連接蛋白(vitronectin)、多胜肽(polypeptides)、硫酸肝素(heparan sulfate)、軟骨素(chondroitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、角質素(keratan)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、鹿角菜膠(carrageenan)、肝素(heparin)、幾丁質(chitin)、幾丁聚糖(chitosan)、褐藻膠(alginate)、瓊脂糖(agarose)、瓊脂(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羧基甲基纖維素(carboxyl methyl cellulose)以及肝醣(glycogen)。當該細胞組織膠體含有明膠時，明膠的濃度可介於0.01mg/ml至100mg/ml之間(例如1mg/ml)。較佳的，於該含有明膠的細胞組織膠體中，該膠原蛋白以及該透明質酸的濃度分別介於6mg/ml至40mg/ml之間以及0.2mg/ml至20mg/ml之間。
本發明亦提供一種輸送細胞(例如幹細胞)至一受體的方法，包含(i)提供一含有上述該細胞組織膠體的細胞植入體，使細胞生長於該細胞組織膠體中；以及(ii)將該細胞植入體置於受體內的某一位置。此外，使用該細胞組織膠體製備一種用於細胞輸送的細胞植入體的方法也屬於本發明的範疇。
本發明之細胞組織膠體可用於一個體的傷口中，以治療或促進傷口癒合。
下文特舉一些實施例作本發明的詳細說明。本發明之其他目的或特徵將呈現於下述實施例及申請專利範圍中。
第1圖顯示不同配比的細胞組織膠體對細胞增生的影響。第1A圖為各種細胞組織膠體對於活化的HL-60細胞的增生效果。第1B圖為各種細胞組織膠體對於RAW 264.7細胞的增生效果。第1C圖為各種細胞組織膠體對於NIH3T3細胞的增生效果。
第2圖顯示不同配比的細胞組織膠體對發炎細胞的影響。第2A圖為各種細胞組織膠體對於活化的HL-60細胞的影響。第2B圖為各種細胞組織膠體對於U937細胞的影響。
第3圖顯示不同分子量之透明質酸對細胞趨化作用的影響。第3A圖為各透明質酸對於活化的HL-60細胞的趨化作用結果。第3B圖為各透明質酸對於RAW 264.7細胞的趨化作用結果。
第4圖顯示不同濃度及不同分子量之透明質酸(HA)對TGF-β1、TGF-β2與TGF-β3表現的影響。
第5圖顯示各種細胞組織膠體對傷口癒合的影響。第5A圖為不同的處理天數下，傷口癒合的狀況。第5B圖為不同的處理天數下，傷口大小的改變。
第6圖顯示在傷口植入各細胞組織膠體後1個月(第6A圖)及2個月(第6B圖)的組織切片。
第7圖顯示各細胞組織膠體對糖尿病患者之傷口癒合的影響。第7A圖為不同的處理天數下，傷口癒合的狀況。第7B圖為不同的處理天數下，傷口大小的改變。
第8圖顯示豬傷口的矩陣模式。
第9圖顯示在各細胞組織膠體處理下，豬傷口的癒合情況。
第10圖顯示豬的傷口在細胞組織膠體處理後2個月(第10A圖)及6個月(第10B圖)的結果。
第11圖顯示在不同處理下，豬傷口癒合情況。
第12圖顯示膠原蛋白(第12A圖)與透明質酸(第12B圖)對幹細胞增生的影響。
本發明係關於一種含有膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體，該膠原蛋白與該透明質酸的重量比例介於0.01：1與100：1之間(例如：0.05-100：1、1-50：1、100：1、75：1、50：1、30：1、25：1、15：1、10：1、5：1、1：1、0.5：1、0.2：1或0.1：1)，且該細胞組織膠體可選擇性地包括一個或多個其他成分，例如基質要素、生物活性劑以及可供細胞生長的營養素。
膠原蛋白
任何自然產生的膠原蛋白或具有其功能性的膠原蛋白變異體均可被用來製備本發明之細胞組織膠體。目前已經發現至少有28種帶有不同遺傳訊息的膠原蛋白。膠原蛋白可以從富含膠原蛋白的組織(例如皮膚、肌腱、韌帶及人類或動物的骨頭)中單獨分離或純化出來。分離及純化膠原蛋白的方法為本領域技術人員皆知的方法，亦可參見所附的文獻：美國第5,512,291號專利、美國第2004/0138695號專利、Methods in Enzymology,vol.82,pp.33-64,1982、The Preparation of Highly purified Insoluble Collagen,Oneson,I.,et al.,Am.Leather Chemists Assoc.,Vol.LXV,pp.440-450,1970以及美國第6,090,996號專利。膠原蛋白也可通過重組技術，如Advanced Tissue Sciences(La Jolla,Calif.)所述的重組 技術製備而成，或市售購得，例如Fibergen或South San Francisco,Calif.。
以下利用一實例進行說明。將小牛的深屈肌腱移除脂肪與筋膜(fascia)後，用水清洗並冷凍，之後切成數個厚度均為0.5毫米的肌腱薄片。取適量的肌腱薄片置入50毫升的水中，於室溫下進行第一次萃取，所需時間為24小時。將水溶性部份去除後，將肌腱薄片置入一酸性溶液(例如0.2N鹽酸溶液)中，於一適當溫度下(例如室溫下)進行一段時間(例如12至24小時)的萃取，隨後將酸性溶液去除，並以水沖洗該等肌腱薄片以去除殘留的酸。經沖洗後的肌腱薄片再置入一鹼性溶液中(例如0.75M氫氧化鈉溶液)於一適當溫度下(例如室溫下)進行一段時間(例如12至24小時)的萃取，然後將鹼性溶液去除後，再以水清洗肌腱薄片直至殘留的鹼完全去除。之後，此肌腱薄片以一酸性溶液(例如0.1N鹽酸溶液)調整其pH值為4至7(例如PH值為5)。隨後將肌腱薄片以醇類溶劑(例如異丙醇)於室溫下進行脫脂一段時間(例如16小時)，輕輕將萃取劑倒出，然後再以醇類溶劑(例如異丙醇)於適當溫度下(例如室溫下)進一步進行萃取一段時間(例如12小時至24小時)，以形成一含膠原蛋白的溶液，該含膠原蛋白的溶液置於一乾淨的無菌操作台中風乾而形成膠原蛋白粉末。該膠原蛋白粉末可分散於一酸性溶液(例如0.5M或0.25M醋酸水溶液)中形成一混合物，且存在一蛋白質水解酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)，並於4℃下培養一段時間。所述混合物經由100目的不銹鋼篩網過濾後，於5%氯化鈉溶液中沉澱；膠原蛋白沉澱物可再度溶解於前述的酸性溶液中而形成膠原蛋白溶液，並且經由100目的不銹鋼篩網過濾以去除其中的不溶物，而後將該膠原蛋白溶液於蒸餾水中進行透析以去除其中的酸類。
透明質酸
本發明所述“透明質酸(hyaluronan)”係指存在於自然界中、具有陰離子且未經硫酸化的葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，其包含N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)及其衍生物之雙醣分子重複單元。自然存在的透明質酸(也可稱之為玻尿酸)可以利用現有的技術從天然的物質中分離出來，例如鏈球菌的莢膜、雞冠、軟骨、關節液、臍帶、皮膚組織以及眼睛的玻璃體，可參考如Guillermo Lago et al.Carbohydrate Polymers 62(4)：321-326,2005以及Ichika Amagai et al.Fisheries Science 75(3)：805-810,2009等文獻。除此之外，透明質酸亦可為市售產品，例如Genzyme Corporation、Lifecore Biomedical LLC以及Hyaluron Contract Manufacturing。
天然透明質酸的衍生物包括，但不限於：透明質酸酯(hyaluronan esters)、經己二酸二醯肼修飾的透明質酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、透明質酸胺產物(hyaluronan amide products)、交聯透明質酸(cross-linked hyaluronic acid)、琥珀酸半酯(hemiesters of succinic acid)或其重金屬鹽類的透明質酸、部分或整體的透明質酸酯、硫化透明質酸(sulphated hyaluronic acid)、N-硫化透明質酸(N-sulphated hyaluronic acid)、以及經胺基或二胺基修飾的透明質酸。上述物質可通過對一個或多個以上的官能基(例如：羧基、氫氧基、還原端基團、N-乙醯基)進行化學修飾而獲得。其中，對羧基進行修飾的方式可通過酯化反應或經過碳二亞胺(carbodiimide)及雙醯肼(bishydrazide)等中間物的反應達成；氫氧基的修飾包括，但不限於：硫酸化反應、酯化反應、異脲偶合(isourea coupling)反應、溴化氰活化(cyanogen bromide)反應、過碘酸鹽氧化(periodate oxidation)反應；對還原端基團進行修飾可通過還原胺化反應(reductive amination)達成，亦可連結一磷脂(phospholipid)、一染料(例 如：螢光基團或發色基團)或一適用於製備親和性基質的試劑。天然透明質酸的衍生物可通過使用交聯劑進行交聯反應，或者可通過內酯化(internal esterification)、光交聯反應(photo cross-linking)或表面電漿處理(surface plasma treatment)。所述交聯劑例如：雙環氧化物(bisepoxide)、二乙烯基碸(divinyl sulfone)、碳二亞胺(biscarbodiimide)、小型同質雙功能連結劑(small homobifunctional linker)、甲醒、環己基異氰化物(cyclohexyl isocyanide)以及離胺酸醚酯、金屬陽離子、醯肼交聯反應或其混合物。。
用於細胞生長的營養素
所述“營養素(nutrient)”是指細胞生長的必要營養來源，其可以是氨基酸、維生素、礦物質、碳源(如葡萄糖)、脂肪酸或其混合物。於一實例中，本發明的細胞組織膠體中所使用的營養素為細胞培養基，該細胞培養基例如：MEM培養基(Minimum Essential Medium)、BME培養基(Basal Medium Eagle)、DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)，Ham’s F-10培養基(Ham’s Nutrient Mixtures F-10)、Ham’s F-12培養基(Ham’s Nutrient Mixtures F-12)、M199培養基(Medium 199)、RPMI培養基、Ames培養基、BGJb培養基(修改Fitton-Jackson)、Click培養基、CMRL-1066培養基、Fischer培養基、GMEM培養基(Glascow Minimum Essential Medium)、IMDM培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、L-15培養基、McCoy’s 5A培養基(McCoy’s 5A Modified Medium)、NCTC培養基、Swim’s S-77培養基、Waymouth培養基或William’s Medium E培養基。
生物活性劑
任何增進細胞存活力、促進細胞增生或誘導細胞分化的試劑(例如：胜肽、多胜肽、寡糖、多糖或小分子)均可用於製備本發明的細胞組織膠體。於一實例中，該生物活性劑為生長因子，如上皮生長因子(epidermal growth factor)、 纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor)、血小板衍生性生長因子(platelet-derived growth factor)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)、神經生長因子(nerve growth factor)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)、細胞菌落刺激因子(colony-stimulating factors)、幹細胞因子(stem cell factor)、血清素(serotonin)、溫韋伯式因子(von Willebrand factor)、轉化生長因子(transforming growth factor)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)、顆粒球細胞菌落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor)、顆粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor)、膠質衍生神經營養因子(glial derived neurotrophic factor)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、內皮單核細胞活化多胜肽(endothelial monocyte activating polypeptide)、上皮中性粒細胞活化胜肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins)、大腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)。在另一實例中，該生物活性劑可為細胞激素(cytokine)或趨化激素(chemokine)，其包含但不限於：介白素-2(IL-2)、胸表達趨化素(breast-expressed chemokine，如BRAK)、腎表達趨化素(kidney-expressed chemokine，如CXCL14)。該生物活性劑亦可為細胞分化因子，如甲氟烯素(dexamethasone)、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、抗壞血酸-2-磷酸(ascorbic acid-2-phosphate)、維生素A酸(retinoic acid)、脯氨酸(proline)、胰島素(insulin)、運鐵蛋白(transferrin)、亞硒酸(selenous acid)、亞麻油酸(linoleic acid)、小牛血清蛋白(bovine serum albumin)以及轉化生長因子-β3(TGF-β3)。於一較佳的實施例中，該細胞分化因子為一化合物。其中， 可參見美國第5,908,784號專利，該化合物可促進間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)的軟骨生成作用(chondrogenesis)；而該化合物若為甲氟烯索(dexamethasone)、維生素C(ascorbic acid)及β-甘油磷酸酯(β-glycerol phosphate)時，則可促進骨生成作用(osteogenesis)；該化合物若為胰島素、異丁基-甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl xanthine)、甲氟烯索(dexamethasone)及吲哚美洒辛(indomethacin)時，則可促進脂肪生成作用(adipogenesis)；該化合物若為活化素A(activin-A)及骨形成蛋白-4(BMP-4)時，則可促進心肌分化作用(cardiomyogenic differentiation)；該化合物若為內皮細胞基礎培養基(EBM-2)、甲氟烯素(dexamethasone)及血管內皮生長因子(VEGF)時，則可促進內皮細胞分化作用(endothelial cell differentiation)；該化合物若為血小板衍生性生長因子-BB(PDGF-BB)時，則可促進平滑肌細胞分化作用(smooth muscle cell differentiation)；該化合物若為鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、上皮細胞生長因子(epithelial growth factor,EGF)、B27營養補給物、二甲基亞碸(DMSO)、丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole)、氟斯柯林(forskolin)、丙戊酸(valproic acid)、氯化鉀、K252a蛋白及N2營養補給物(N2 supplement)，則可促進神經誘導機制(neural induction)；該化合物若為甲氟烯素(dexamethasone)、肝細胞生長因子(HGF)、纖維母細胞生長因子-4(FGF-4)時，則可促進內胚層品系分化作用(endodermal lineage differentiation)。該生物活性劑亦可是一種中草藥或是中草藥內部的活性成分。
基質要素
所述基質要素為一種輔助細胞維持在植入位置的化合物，其可以是一種於細胞外基質中發現的胞外因子(extracellular factor)。該基質要素例如，但不限於：明膠(gelatin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、細 胞黏合素(tenacin)、層黏蛋白(laminin)、玻璃連接蛋白(vitronectin)、多胜肽、硫酸肝素(heparan sulfate)、軟骨素(chondroitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、角質素(keratan)、硫酸角質素(keratan sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、鹿角菜膠(carrageenan)、肝素(heparin)、幾丁質(chitin)、幾丁聚糖(chitosan)、褐藻膠(alginate)、瓊脂糖(agarose)、瓊脂(agar)、纖維素(cellulose)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxyl methyl cellulose)、肝醣(glycogen)及其衍生物。此外，該基質要素可以是纖維蛋白(fibrin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、凝血酶(thrombin)、多聚谷氨酸(polyglutamic acid)、合成聚合物(如丙烯酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸-乙醇酸)或交聯劑(如京尼平(genipin)、戊二醛、甲醛、環氧化合物)。較佳地，於本發明細胞組織膠體中，該基質要素具有較高的分子量，使膠體的黏度增加。
賦形劑
本發明之細胞組織膠體可包括一或多個藥學上可接受之賦形劑，以提供潤滑和保濕。本發明之賦形劑也可作為乳液，可結合並平順上皮層，有助於淺層的傷口癒合癒合。
卵磷脂、凡士林及甘油為示例性的賦形劑，皆可被包含在本發明之細胞組織膠體中。其它習知的賦形劑亦可添加於本發明之細胞組織膠體中。
內嵌細胞的組織膠體的製備
本發明所述組織膠體可通過將前述各成分以一理想的重量比例混合，並將該混合物置於適當的環境中以形成膠體。為了製備一內部嵌埋有細胞的膠體，可先將細胞與上述該等成分混合，再進一步形成膠體，其中細胞可為哺乳類動物(例如：牛、豬、老鼠、馬、狗、貓、綿羊、猴子及人類)體內獲得的細胞。該細胞包括，但不限於：胎盤幹細胞(placenta-derived stem cells)、骨髓幹細胞(bone marrow-derived stem cells)、基質細胞(stromal cells，如脂肪衍生基質細胞(adipose-derived stromal cells))、間葉幹細胞、組織先驅細胞(tissue progenitor cells)、胚細胞(blast cells)或纖維母細胞(fibroblasts)。
藉此，該細胞組織膠體則可製備完成且其內部嵌埋有細胞，該細胞組織膠體可植入一理想的位置以實現組織修復及其他醫療上的用途。
傷口癒合
本發明之細胞組織膠體，無論是否有內嵌細胞，皆可用於治療或促進傷口癒合(例如：皮膚傷口)。細胞組織膠體可應用於傷口，例如部分地、基本地或完全地覆蓋傷口。特別是，該細胞組織膠體可用於治療糖尿病患者的傷口。所述傷口可為淺傷口(shallow wound)、局部傷口(partial wound)或全層傷口(full-thickness wound)。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中所揭示之每一技術特點可以相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般實例。
相信本技術領域的人員可根據以上描述，使本發明充分的利用，而無需進一步詳盡說明。以下所舉實施例僅作為範例，並非用於限制本發明。本文所引用的公開資料，皆以文獻方式併入於本發明中。
【實施例】
1.含有膠原蛋白及透明質酸的組織膠體中的幹細胞存活度
從人類足月胎盤(full-term human placentas)獲得的絨毛膜絨毛(chorionic villi)，經由機械方式切碎後，以膠原蛋白酶處理，而得到含有胎盤間葉幹細胞的材料。該含有胎盤間葉幹細胞的材料分別依序由孔徑為300μm、100μm、 37μm的篩網過篩，然後以percoll密度梯度離心法(percoll density gradient centrifugation)收集幹細胞。將該幹細胞懸浮於內含有2倍低量葡萄糖且添加有20%胎牛血清以及200U/ml紫菌素(gentamycin)的DMEM培養基(購自Gibco BRL,Life Technologies)中，使其濃度為105-107細胞/每毫升，並以不同量的透明質酸混合以形成一懸浮液。將自豬皮中取得的膠原蛋白溶解於0.01N鹽酸溶液中以形成一具有pH 4至pH 7的膠原蛋白溶液。該膠原蛋白溶液與該幹細胞懸浮液以相等體積混合以形成混合溶液，該混合溶液可含有6mg/ml的膠原蛋白以及0.05mg/ml、0.2mg/ml或0.5mg/ml的透明質酸，或者含有9mg/ml膠原蛋白以及0.2mg/ml透明質酸。實驗過程中使用具有等量幹細胞數目且分別含有6mg/ml以及9mg/ml膠原蛋白的混合溶液作為對照組。上述混合溶液均置於37℃的培養箱培養30分鐘，使其內部的膠原蛋白開始進行固化，以形成一內嵌幹細胞的組織膠體。該組織膠體於37℃下且流通有5%二氧化碳的環境中進行培養，所需培養天數最多14天。通過錐藍染色法(trypan blue staining)於不同時間(如培養第1天、培養第7天及培養第14天)測量其細胞存活度，測試結果如下表一所示。
由表一可知，對於維持幹細胞於該組織膠體中生長時的存活度，膠原蛋白與透明質酸在該組織膠體的重量比例是極為重要的。
2.含有膠原蛋白、透明質酸及明膠的組織膠體中的幹細胞存活度
將實施例1所述的幹細胞懸浮液及膠原蛋白溶液以等體積比例混合，並於混合液中加入2mg/ml或10mg/ml的明膠以形成內嵌幹細胞的組織膠體，其中膠原蛋白、透明質酸及明膠的最終濃度如表二所示。
該組織膠體係於37℃下且流通有5%二氧化碳的環境中進行培養，所需培養天數最多14天。接著藉由錐藍染色法(trypan blue staining)於不同時間(如培養第1、7及14天)測量其細胞存活度，測試結果如下表二所示。
3.含膠原蛋白及透明質酸的組織膠體對細胞生長的影響
已知以1.3%的二甲基亞碸(DMSO)活化HL-60細胞7天，會使該細胞類似於活化的人類嗜中性球，具有CD11b及CD32的表現。因此在此實施例中，使用活化的HL-60細胞來研究細胞組織膠體對嗜中性球生長的影響。在96孔盤中，將每孔加入1x104活化的HL-60細胞，並培養於含有各種細胞組織膠體的RPMI 1640培養基中。結果請參照第1A圖，其中實驗組1為含有50mg/mL膠原蛋白及0.5mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為100：1)，實驗組2為含有50mg/mL膠原蛋白及1mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為50：1)，實驗組3為含有50mg/mL膠原蛋白及5mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為10：1)，實驗組4為含有50mg/mL膠原蛋白及10mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為5：1)，實驗組5為含有50mg/mL膠原蛋白及50mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為1：1)，實驗組6為含有10mg/mL膠原蛋白及1mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為10：1)，實驗組7為含有10mg/mL膠原蛋白及10mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為1：1)，實驗組8為含有10mg/mL膠原蛋白及50mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為0.2：1)，實驗組9為含有10mg/mL膠原蛋白及100mg/mL透明質酸(即膠原蛋白與透明質酸比為0.1：1)。。
已知小鼠巨噬細胞株RAW 264.7會表現巨噬細胞F4/80，因此可用來研究細胞組織膠體對巨噬細胞生長的影響。在96孔盤中，將每孔加入3x103 RAW 264.7細胞，並培養於含有各種細胞組織膠體的DMEM-10% FBS培養基，結果請參照第1B圖，圖中實驗組1-9其膠原蛋白與透明質酸的含量如第1A圖所示。
NIH-3T3纖維母細胞可代表組織基質層的細胞，因此使用NIH-3T3纖維母細胞研究細胞組織膠體對纖維母細胞生長的影響。在96孔盤中，將每孔加入2x103 NIH-3T3纖 維母細胞，並培養於含有各種細胞組織膠體的DMEM-10%FBS培養基，結果請參照第1C圖，圖中實驗組1-9其膠原蛋白與透明質酸的含量如第1A圖所示。
上述細胞在含有5%CO2的37℃培養箱中培養3至5天後，將細胞離心、破碎以露出細胞核，並以Hoechst 33258進行染色。接著在365nm及460nm下，用SpectraMax M2e Multi-Mode Microplate偵測儀偵測螢光強度，該螢光強度與細胞數量成正比。
試驗結果顯示，在長時間下，即第5天以後，細胞膠體中的透明質酸會稍微地抑制嗜中性球的增生，然而對巨噬細胞皆沒有顯著影響。此外，含不同比例的膠原蛋白與透明質酸之細胞組織膠體，皆可在第3天及第5天促進纖維母細胞的增生。此結果意味細胞組織膠體對於傷口癒合的過程中具有正向影響。
4.含膠原蛋白及透明質酸的組織膠體對發炎細胞生長的影響
為了分析組織膠體中的透明質酸對於人類嗜中性球及巨噬細胞的生長影響，因此分別使用活化的HL-60細胞及U937細胞進行分析。其中人類前骨髓性HL-60細胞(Human promyelocytic HL-60 cells)在DMSO處理7天後具有嗜中性球的特徵，而U937細胞經一些可溶性物質的刺激而成熟及分化，使其具有巨噬細胞的形態和特徵。
在24孔盤中，將含有不同比例的膠原蛋白及透明質酸之細胞組織膠體分別添加至1mm矽環的中間。然後將活化的HL-60細胞及U937細胞分別置於矽環的外側。當細胞組織膠體凝膠化且細胞貼附後，將矽環移除，使細胞能穿過1mm的直徑，朝向細胞組織膠體移動。在第1、3、5天，將細胞組織膠體以4%三聚甲醛進行固定，接著使用DAPI以免疫螢光法進行細胞核染色，再利用全景掃描顯微鏡計算細胞數。
請參照第2圖，其中控制組為含50mg/mL膠原蛋白的細胞組織膠體，實驗組10為含50mg/mL膠原蛋白和5mg/mL phorbol myristate acetate(PMA)的細胞組織膠體，實驗組11為含50mg/mL膠原蛋白和5mg/mL透明質酸的細胞組織膠體。實驗結果證明含有透明質酸的細胞組織膠體在早期可促進嗜中性球和巨噬細胞移動。由此可知，含透明質酸之細胞組織膠體對於促進傷口癒合的過程具有正向影響。
5.透明質酸的趨化作用
在本實施例中，使用3μm膜孔的Boyden腔室來分析透明質酸對人類嗜中性球的趨化作用。將每孔含有1x105活化的HL-60細胞置於上腔，並將10nM fMLP(formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine；f-Met-Leu-Phe)或1mg/mL不同分子量的透明質酸置於下腔。
另外，使用5μm膜孔的Boyden腔室來分析透明質酸對巨噬細胞的趨化作用。將每孔含有5x105RAW 264.7細胞置於上腔，並將1μg/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)或1mg/mL不同分子量的透明質酸置於下腔。
細胞培養4或6小時後，以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)將細胞固定於膜上，並以棉花棒分離之。利用DAPI將細胞進行染色，並以光學顯微鏡進行定量。
請參考第3A、3B圖，實驗結果顯示不同分子量的透明質酸對於活化的嗜中性球具有顯著的趨化作用。分子量大於780kDa的透明質酸可吸引細胞移動。由於嗜中性球在清潔傷口上扮演很重要的角色，這些實驗結果顯示含有透明質酸的細胞組織膠體對於傷口癒合具有正向效果。
6.透明質酸對TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的影響
活化的HL-60細胞培養於含有不同分子量及濃度之透明質酸(HA)的RPMI培養基中。在培養3天後，使用適當的引子(primer)及探針(probe)以即時聚合酶鏈鎖反應 (quantitative real time polymerase chain reaction)分析TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表現，其中mRNA的相對表現量是以GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase))的表現來進行標準化。Roche Universal Probe Library system用於專一性的偵測每個基因的表現，而t-test用來進行顯著性分析。
請參考第四圖，與控制組的表現量相比，向下調控以#表示，向上調控則以*表示，其中#為p<0.05、##為p<0.005、###為p<0.001，*為p<0.05、**為p<0.005、***為p<0.001。實驗結果顯示透明質酸的存在下，會抑制嗜中性球表現TGF-β1，並促進TGF-β3的表現。已有文獻(Shah M,Foreman D,Ferguson M.,J Cell Sci 1995；108：985-1002)指出，在皮膚傷口中，中和TGF-β1與TGF-β2的表現或增加TGF-β3的表現，不僅可促進新皮(neodermis)建構，且可減少疤痕的生成。實驗結果顯示本發明含透明質酸的細胞組織膠體具有較佳的癒合效果並能降低疤痕的產生。
7.細胞組織膠體對傷口癒合的影響
建立一老鼠皮膚創傷模型，其中將直徑8mm的O型環縫於厚度6mm的環狀傷口外，以避免傷口縮合。此模型的優點是，再上皮化(re-epithelialization)及肉芽組織的形成會參與其中，使傷口癒合形式較接近於人類皮膚的傷口癒合，而不僅是囓齒類動物在傷口癒合過程中具有高度收縮。
在FVB老鼠的背部皮膚上產生4個傷口。除了控制組(開放式傷口)外，在各傷口處植入不同配方的細胞組織膠體，其中膠原蛋白組為含39.5mg/mL的膠原蛋白，透明質酸組為含35mg/mL的透明質酸，實驗組12為含39.5mg/mL的膠原蛋白及3mg/mL的透明質酸，實驗組13為含39.5mg/mL的膠原蛋白及20mg/mL的透明質酸，本實施例中所使用的透明質酸皆為1500kDa。所有傷口均貼上醫療用敷料(Tegaderm®)以防止感染。每2至3天觀察傷口癒合情形， 並描繪傷口邊緣，請參照第5A圖。在傷口癒合過程中，各時間點的傷口大小用Image J軟體計算之，結果請參照第5B圖。
如第5B圖所示，在第6天時，未處理的傷口(即控制組)，有78%的面積仍未癒合，而傷口在經由含有膠原蛋白及透明質酸的細胞組織膠體處理後(即實驗組12和實驗組13)，僅小於40%的面積未癒合。此結果顯示細胞組織膠體可加速小鼠全層傷口的癒合(full-thickness skin wounds)。
傷口處理後的第1個月及第2個月結束時，從中取出新的組織進行組織學分析，請參考第6A、6B圖，其中控制組為未經任何處理的開放式傷口，膠原蛋白組為含39.5mg/mL的膠原蛋白，透明質酸組為含35mg/mL的透明質酸，實驗組12為含39.5mg/mL的膠原蛋白及3mg/mL的透明質酸。實驗結果證實，經細胞組織膠體處理後的傷口，在第1個月(第6A圖)結束前可恢復成全厚度基質層，且在第2月(第6B圖)結束時所增生的組織與周邊正常皮膚非常類似，含膠原蛋白與透明質酸的細胞組織膠體對於傷口的基質層(stromal layer)恢復結果與僅含透明質酸的細胞組織膠體或含膠原蛋白的細胞組織膠體非常不同。
8.細胞組織膠體對糖尿病患者傷口癒合的影響
將FVB老鼠連續5天於腹腔中注射低劑量(50mg/kg)的鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，用以誘發小鼠發生糖尿病。於一週後，若連續2天皆能偵測到小鼠的血糖高於250mg/dl，即定義為糖尿病小鼠。
所有的動物試驗皆已獲得實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)的同意。於小鼠背部皮膚產生直徑6mm的全層傷口，並將直徑8mm的O型環縫於傷口外，以避免傷口過度收縮。將傷口用不同組成的細胞組織膠體處理後，貼上醫療用敷料(Tegaderm®)以防止傷口感染。在傷口癒合過程中，各時間點的傷口大小 用Image J軟體計算之，結果請參考第7A、7B圖，其中控制組為未經任何處理的開放式傷口，實驗組13為含50mg/ml膠原蛋白、5mg/ml透明質酸與4mg/ml新黴素(neomycin)，實驗組14為含37.4mg/mL膠原蛋白與35mg/mL透明質酸。。
由實驗結果顯示，控制組的正常皮膚需13天的癒合時間，而在糖尿病小鼠的6mm傷口，其癒合時間需要1個月。在糖尿病小鼠的傷口植入不同組成的細胞組織膠體(含20mg/mL或50mg/mL膠原蛋白及1、5、10、20、30或50mg/mL透明質酸)後，於第18天至第25天可觀察癒合情形。此外，若植入進一步含有維生物B及維生素C的細胞組織膠體，糖尿病小鼠的傷口在第12天至第20天有癒合現象，顯示具有加快傷口癒合的功效。
9.細胞組織膠體對於豬傷口癒合的影響
豬傷口以矩陣模式顯示，用以觀察細胞組織膠體對豬傷口癒合的影響。在此實施例中，使用2個月大的蘭嶼豬，且所有的研究皆已獲得實驗動物照護及使用委員會的同意。
請參考第8圖，在豬的側面或背部產生至少20個全層傷口並於傷口中分別加入各種不同組成的細胞組織膠體，用於分析細胞組織膠體對豬傷口癒合的影響。所有的傷口皆貼上醫療用敷料(Tegaderm®)以防止傷口感染。於每2至3天觀察豬傷口癒合情形，並描繪傷口邊緣。在傷口癒合過程中，各時間點的傷口大小用Image J軟體計算之。
在產生傷口後第3天，可在皮下脂肪層觀察到纖維母細胞，但其細胞數目並不多，且在各傷口之間並無明顯差異。在產生傷口後第5天，纖維母細胞增生並朝向肉芽組織移動。儘管在第5天，纖維母細胞與各傷口之上皮層距離仍很遠，但纖維母細胞的數量與其移動距離皆與細胞組織膠體的透明質酸含量成正比，結果如下表三。
在豬傷口植入表三中各組別的細胞組織膠體後，於第18天可觀察到皮膚增生的現象，請參考第9圖，圖中所有的傷口皆被新生的上皮細胞所包覆，為了後續傷口癒合，在各矩形傷口中的肉芽組織被移除，即為圖中黑色區域。相較於控制組，各種組成的細胞組織膠體皆可促進豬傷口癒合形成。
請參考第10A圖，其中實驗組20係含40mg/mL膠原蛋白、4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑之卵磷脂和甘油，實驗組21係含40mg/mL膠原蛋白、5mg/mL透明質酸、4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑之卵磷脂和甘油，，在植入細胞組織膠體後第2個月，與控制組(具有開放式傷口)相比，實驗組21具有良好的癒合效果，其與正常組的皮膚相似。值得注意的是，在植入細胞組織膠體後第6個月，傷口的上皮細胞層，其厚度及組織學特徵皆與正常皮膚相似，如第10B圖。細胞外基質的結構，包括膠原纖維和彈力蛋白，以及在基質層內細胞的數量及分佈皆與正常皮膚類似。
此外，各種組成的細胞組織膠體對於傷口癒合的效果亦藉由在豬傷口的矩陣模式中進行分析。各種細胞組織膠體的組成包括：實驗組22為含68mg/mL膠原蛋白、5mg/mL透明質酸及4mg/mL新黴素；實驗組23為含35mg/mL膠原蛋白、3mg/mL透明質酸及4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑之卵磷脂和甘油；實驗組24為含35mg/mL膠原蛋白、20mg/mL透明質酸及4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑之卵磷脂和甘油；實驗組25為含35mg/mL膠原蛋白、10mg/mL透明質酸及4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑之卵磷脂和甘油；實驗組26為含35mg/mL膠原蛋白與5mg/mL透明質酸及4mg/mL新黴素，以及加入作為賦形劑的卵磷脂和甘油。
從傷口的中心切開，以獲得傷口的橫切片，該橫切片包括相鄰未受傷害的皮膚和深層的肌肉組織，接著以福 馬林緩衝溶液固定並以石蠟包埋。接著以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin)將切片進行染色，並透過光學顯微鏡觀察。進一步以Masson's and Verhoff's進行染色，用來分析新基質(neomtrix)的再生、組織結構和彈性纖維的形成，以評估癒合的效果。
在植入細胞組織膠體後6個月，實驗組22-26的新基質結構與正常組的皮膚沒有顯著的差異，如第11圖所示，然而控制組(開放式傷口)有較細的膠原纖維，此與正常組的皮膚比較有明顯差異。
若傷口為淺層的皮膚傷口，所添加的賦形劑，能讓細胞組織膠體像乳液一樣，使肌膚平滑。而在實驗組22-26中，其傷口癒合結果在組織學上沒有顯著的差異。
10.淺層皮膚傷口
為了分析細胞組織膠體對於淺層皮膚傷口的癒合效果，將以下成分與賦形劑混合，成分包括：30mg/mL膠原蛋白、1500kDa不同濃度(5、10、20、30mg/mL)的透明質酸、含有或不含有維生素、含有或不含有生長因子的(5、10、20、30mg/mL)，以及抗生素(如4mg/mL新黴素)，或抗微生物胜肽(如pexiganan或其衍生物)，以製備含不同成分的細胞組織膠體。舉例來說，將上述細胞組織膠體的成分與甘油及卵磷脂混合後，將pH值調整使其介於弱酸性至中性，持續攪拌直到均勻的膠體形成為止。當細胞組織凝膠施於皮膚上時，該凝膠能附著在皮膚表面。
當該細胞組織膠體施用於全層傷口時，所添加的賦形劑不會促進癒合的速度，但可使傷口維持在一濕潤且含油的狀態。此種配方的細胞組織膠體適合局部傷口或第1期的傷口癒合，如下表四。
11.幹細胞的增生
將源自胎盤的間葉幹細胞(Placenta derived mesenchymal stem cells)與含膠原蛋白或含透明質酸的細胞組織膠體一起培養。如第12A、12B圖所示，隨著處理天數的增加，含膠原蛋白的細胞組織膠體及含透明質酸的細胞組織膠體皆有利於幹細胞的增生，此外，細胞組織膠體中透明質酸的含量增加亦顯示能促進幹細胞的增生。由此實驗結果顯示，細胞組織膠體有助於細胞生長，並且可應用於再生醫學領域中。
12.其它實施例
本發明所揭露的所有特徵可以以任何結合方式實現。本發明所揭露的每一個特徵可以用相同、均等或具有相似目的之取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一個特徵僅只是一個種類的均等物或具相似特徵的一實施例而已。
本領域所屬技術人員，將可輕易由本發明所揭露的內容中瞭解到本發明的特徵，且在不偏離本發明的精神與範圍下，當可在此進行各種改變、取代以及修正，使其能適應各種條件及用途。因此，其他實施例亦落于本發明權利要求書所要求保護的範圍之內。

Claims (20)

  1. 一種細胞組織膠體，包含一膠原蛋白及一透明質酸，其中該膠原蛋白及該透明質酸的重量比介於0.01：1至100：1之間。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體，其中該透明質酸的濃度為0.001mg/ml至100mg/ml。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之細胞組織膠體，其中該透明質酸的濃度為0.01mg/ml至40mg/ml。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體，其中該膠原蛋白的濃度為0.001mg/ml至100mg/ml。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體，其中該膠原蛋白的濃度為0.1mg/ml至100mg/ml，且該透明質酸的濃度為0.01mg/ml至35mg/ml。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之細胞組織膠體，其中該膠原蛋白的濃度為3mg/ml至40mg/ml，且該透明質酸的濃度為0.2mg/ml至20mg/ml。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體，其進一步包含一營養素及一生物活性劑。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之細胞組織膠體，其中該生物活性劑係選自由上皮生長因子(epidermal growth factor)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor)、血小板衍生性生長因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)、神經生長因子(nerve growth factor)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)、細胞聚落刺激因子(colony-stimulating factor)、幹細胞因子(stem call factor)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)、顆粒球細胞聚落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor)、顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、膠質衍生神經營養因子(glial-derived neurotropic factor)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、內皮單核細胞活化多胜肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、上皮中性粒細胞活化胜肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein)、大腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)所組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之細胞組織膠體，其進一步包含一幹細胞。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體，其進一步包含一個或多個基質要素，該基質要素選自由明膠、纖維連接蛋白、彈性蛋白、細胞黏合素(tenacin)、層黏蛋白、玻璃連接蛋白、多胜肽、硫酸肝素、軟骨素、硫酸軟骨素、角質素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、鹿角菜膠、肝素、幾 丁質、幾丁聚糖、褐藻膠、瓊脂糖、瓊脂、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素及肝醣所組成之群組。
  11. 如申請專利範圍第6項所述之細胞組織膠體，其進一步包含一營養素及一生物活性劑。
  12. 一種治療一患者傷口的方法，包括給予該患者傷口如申請專利範圍第1項所述之細胞組織膠體。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該膠原蛋白與該透明質酸的重量比介於1：1至50：1之間。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該膠原蛋白的濃度為1mg/ml至100mg/ml，且該透明質酸的濃度為0.5mg/ml至100mg/mL。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該細胞膠體進一步包含一營養素及一生物活性劑。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該生物活性劑係選自由上皮生長因子(epidermal growth factor)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor)、血小板衍生性生長因子(platelet-derived growth factor,F1DGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)、神經生長因子(nerve growth factor)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、細胞聚落刺激因子(colony-stimulating factor)、幹細胞因子(stem call factor)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)、顆粒球細 胞聚落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor)、顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、膠質衍生神經營養因子(glial-derived neurotropic factor)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor)、內皮單核細胞活化多胜肽(endothelial-monocyte activating polypeptide)、上皮中性粒細胞活化胜肽(epithelial neutrophil activating peptide)、紅血球生成素(erythropoietin)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein)、大腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor)、BRAK、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)所組成之群組。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該營養素為一維生素、礦物質、碳源或脂肪酸。
  18. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該細胞組織膠體進一步包含一藥學上可接受之賦形劑。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該賦形劑選自由卵磷脂或甘油所組成之群組。
  20. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該患者為一糖尿病患者。
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