KR102018609B1 - 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 혈청을 포함하고 있지 않으므로 감염 등의 위험 없이 안전하게 사용될 수 있으며, 또한 유래 또는 종류에 상관없이 모든 세포 또는 조직의 동결보존 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물{A composition for cells or tissues cryopreservation comprising culture media from mesenchymal stem cells}
본 발명은 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
세포, 조직 또는 장기 등의 동결보존은 세포치료제 등의 신약 개발 및 난치병/불치병 치료, 장기 이식 등 여러 가지 활용도 측면에서 매우 중요하다. 특히 줄기세포의 경우, 현재까지도 치료가 불가능하거나 어려운 불치병 및 난치병 치료에 크게 기여할 것으로 기대되고 있으며, 이를 이용한 세포치료제는 가장 유망한 차세대 바이오의약품 분야로 많은 연구개발 및 임상이 진행되고 있다. 이에, 그 원천이 되는 다양한 종류의 세포를 안전하고 효율적인 방법으로 냉동보존하는 것이 필수적이며, 특히 면역거부반응을 최소화하기 위해서 자신의 줄기세포를 일정 기간 보관한 후 사용하는 경우도 있는바, 세포를 손상 없이 동결보존하는 것이 더욱 중요한 문제로 대두되고 있다.
그러나, 현재까지는 치료 목적으로 바로 사용할 수 있을 정도의 품질로 세포를 다량으로 안전하게 보관할 수 있는 방법이 명확하게 확립되지 않은 실정이다. 특히, 줄기세포는 다른 성체세포들과는 달리 냉동 보관 후 해동하였을 때 쉽게 사멸하거나 분화하는 경향이 커지며, 동결보존 후 해동된 줄기세포는 계대배양과정 중에 쉽게 분화하는 특성을 갖게 된다고 알려져 있다. 따라서, 줄기세포의 냉동보존방법은 이전에 확립된 배아 보존방법을 응용하여 적용하고 있으나, 일반배아의 경우 80% 이상에 달하는 생존율을 나타내지만 이를 줄기세포에 적용하는 경우 생존율이 10% 정도에 그치고 있어, 인간 줄기세포에 적합한 새로운 동결보존 방법의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 세포의 동결보존에는 일반적으로 우태아혈청(Fetal Bovine Serum) 등의 이종 유래 단백질을 포함하는 조성물을 사용하고 있다. 그러나, 동물 유래의 혈청을 사용하는 경우 배양과정 중에 세포들이 동물 유래 바이러스나 광우병과 같은 감염성 프리온 등에 감염될 우려가 있으며, 세포 배양 시에 오염원으로 작용하여 다양한 독소(toxin)를 생성하여 세포 배양을 억제하거나 세포 표면의 변형을 유발하기도 한다. 또한, 고가의 혈청은 조성물의 가격을 상승시키며, 생산 배치마다 성분 차이가 존재하여 생물학적 동등성을 확보하기 어려운 문제가 있다.
이를 극복하기 위해, 재조합 인간 혈청 알부민 등을 사용하여 세포 동결보존용 조성물을 제조하기 위한 노력이 수행되었으며(한국 등록특허공보 제10-1407355호), 우태아혈청 대신에 인간 혈청을 사용해보려는 시도가 있었으나(Transplantation. 2000 Dec 27;70(12):1780-7.), 이는 줄기세포의 증식능력 또는 분화능력을 저하시키거나 오히려 촉진시키는 등 줄기세포가 가지고 있던 본연의 특성이 변형되는 문제점이 발생하였다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 해동 후에도 세포의 특성을 변형시키지 않는 안전한 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물을 개발하고자 예의 노력연구한 결과, 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 함유하는 배양액을 포함하는 조성물에서 동결보존된 세포는 해동 후에도 우수한 생존율, 증식율 또는 단백질 분비능을 나타냄을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태로서 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 인간 중간엽 줄기세포 배양액, 구체적으로 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 배양액을 이용하면 인간 또는 동물 유래의 다양한 종류의 세포 또는 조직들을 손상 없이 장기간 동결보존할 수 있음을 확인하였다.
일반적으로, 기존의 세포 또는 조직의 동결 방법으로는 우태아혈청(FBS)을 이용하였으나, 혈청 성분은 동물 유래 바이러스 또는 감염성 프리온(prion) 등의 감염 우려가 있으며, 또한 동결보존 후 해동된 세포의 생존율이 낮다는 단점이 있었다. 본 발명은 상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액이 FBS를 대체할 수 있음을 확인하여, 상술한 기술적 한계를 극복하였다.
본 발명의 용어, "동결보존(cryopreservation)"은 동결을 통해 장기간에 걸쳐 세포 또는 조직을 안정하게 유지시키는 것을 의미한다. 세포는 일반적으로 배양에서 만 개 중에 한 개 정도의 비율로 돌연변이가 일어나고 있으며, 장기간에 걸쳐 세포의 계대를 계속하면, 본래의 세포 집단과는 다른 세포 집단으로 변하고, 심하게는 세포가 가진 특정 기능이 계대 배양에 의해 소실되는 경우도 있다. 또한, 계대배양 중 마이코플라스마 등에 감염될 수도 있다. 이러한 문제점으로 인하여 세포 또는 조직의 고유한 특성이 소실되기 전에 이를 동결시켜 보존하고, 필요 시에 꺼내어 사용할 수 있도록 또는 조직의 동결 보존을 수행한다. 특히, 줄기세포의 경우 치료제로 이용하기 위해서는 필요한 상황에 건강한 줄기세포를 즉시 사용할 수 있어야 하므로, 줄기세포를 효과적으로 동결보존하기 위한 방법이 특히 필요하다.
본 발명의 용어, "중간엽 줄기세포"는 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 지방, 양수 등 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 구체적으로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 양수 또는 양막 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 인간을 포함한 포유류에서 유래한 것일 수 있다. 따라서, 인간을 포함한 포유류 중간엽 줄기세포의 배양액 또한 본 발명의 인간 중간엽 줄기세포의 배양액과 동일한 목적으로 활용이 가능할 것이다.
본 발명의 용어, "배양액"(culture media)은 인비트로(in vitro) 상에서 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하며, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 조성물에 포함되는 배양액은 인간 중간엽 줄기세포의 배양에 사용한 것일 수 있다.
또한, 상기 배양액은 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있는데, 예로서 완전한 둘베코 변형 이글 배지(complete Dulbecco's modified eagle medium, cDMEM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지(α-MEM), 맥코이스(McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지(eagle's basal medium), CMRL(Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우(Glasgow) 최소필수 배지, 햄스(Ham's) F-12 배지, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠(Liebovitz') L-15 배지, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 및 이들의 혼합 배지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로 완전한 둘베코 변형 이글 배지(cDMEM)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명의 목적상 상기 배양액은 무혈청 배지(serum-free media)일 수 있다. 일반적으로, 혈청은 생체 외에서 세포를 배양하는 경우 배양 배지에 필수적으로 첨가되는데, 전술한 바와 같이 혈청 성분은 동물 유래 바이러스 또는 감염성 프리온 등의 감염 우려가 있으므로, 본 발명의 조성물은 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질"은 인간 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 인간 중간엽 줄기세포 유래의 성장인자 또는 사이토카인을 포함할 수 있으며, 상기 단백질의 총 농도는 BCA 측정법으로 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖일 수 있다.
구체적으로, 상기 단백질은 AR, BDNF, bFGF, BMP-4, BMP-5, BMP-7, b-NGF, EGF-R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-1, Insulin, MCSF, MCSF-R, NGF-R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF, SCF-R, TGF-α, TGF-β1, VEGF, VEGF-R3, ICAM-1, G-CSF, IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, TNFβ, TNF-R1 또는 TNF-R11를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "AR"(androgen receptor)은 안드로겐 수용체로서 안드로겐 호르몬, 테스토스테론 또는 디하이드로 테스토스테론과 결합하여 활성화되는 핵 수용체의 일종이다. 유전자 발현을 조절하는 DNA 결합 전사 인자로서 기능하며, 남성 성 표현형의 개발과 유지에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "BDNF"(Brain-derived neurotrophic factor)는 뇌 유래 신경 영양 인자로서, 중추 신경계와 말초 신경계의 특정 뉴런에 작용하여 기존 뉴런의 생존을 돕고 새로운 뉴런과 시냅스의 성장과 분화를 촉진하는 역할을 수행한다.
본 발명의 용어, "BMP-4"(Bone morphogenetic protein 4)는 TGF-β 슈퍼 패밀리의 일부인 뼈 형태 형성 단백질의 일종이다. 뼈와 연골 발달, 특히 치아와 사지 발달 및 골절 회복에 관여한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "BMP-5"(Bone morphogenetic protein 5)는 TGF-β 슈퍼 패밀리의 일종으로, 뼈와 연골 발달을 유도하는 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "BMP-6"(Bone morphogenetic protein 6)은 TGF-β 슈퍼 패밀리의 일종으로, 뼈와 연골의 성장을 유도하며, 중간엽 줄기세포에서 골 형성 인자의 발현을 유도한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "BMP-7"(Bone morphogenetic protein 7)은 TGF-β 슈퍼 패밀리의 일종으로, 다른 뼈 형태 형성 단백질(BMP family)과 마찬가지로 뼈와 연골의 성장을 유도하며, 중간엽 줄기세포가 뼈 도는 연골로 전환되는데 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "b-NGF"(beta-Nerve growth factor)는 신경 영양 인자 및 신경 펩타이드로서, 특정 표적 뉴런의 성장, 유지, 증식 및 생존 조절에 주로 관여한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "bFGF"(Fibroblast growth factor 2)는 세포의 생존, 세포분열, 신생혈관형성(angiogenesis), 세포 분화 및 세포 이주 조절에 중요한 역할을 담당하며 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "EGF-R(Epidermal growth factor receptor)"은 상피세포성장인자 수용체로서, 타이로신 키나제로 작용한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "FGF-4"(Fibroblast growth factor 4)는 FGF 패밀리에 속하는 단백질로서, 발달 단백질, 성장 인자, 미토겐으로 작용하며, 배아 발달, 세포 증식, 세포 분화 조절에 중요하게 작용한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "FGF-7"(Fibroblast growth factor 7)은 FGF 패밀리에 속하는 단백질로서, 각질 형성세포(keratinocytes)의 성장인자로 작용하고, 정상적인 상피세포(epithelial cells) 증식에 작용하며, 또한 상피 형성, 상처의 재상피화, 모발 발달, 폐 기관 형성에 중요하게 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "GDF-15"(Growth/differentiation factor 15)는 TGF-슈퍼패밀리에 속하는 단백질로서, TGF-PL, MIC-1, PDF, PLAB, PTGFB라고도 알려져 있다. 손상된 조직에서, 질병 과정 동안 염증성 및 세포사멸 경로를 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "GDNF"(Glial cell-derived neurotrophic factor)는 뉴런의 생존을 촉진하는 단백질로서, 도파민성 운동 뉴런(motor neuron)의 생존을 지원하는 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "HGF"(Hepatocyte growth factor)는 간세포 증식인자로서 여러 종류의 중간엽 세포(mesenchymal cells)로부터 분비되는 단백질을 의미한다. 세포증식 촉진활성, 세포운동성 촉진활성, 상피형태형성 유도활성 등이 있으며 신경영양인자 및 혈관신생인자로 작용한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IGFBP-1"(Insulin-like growth factor-binding protein 1)은 인슐린 유사 성장인자 결합단백질로서, IGF의 반감기를 연장하여 세포 배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 하며, 또한 세포의 이동 (migration)을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IGFBP-2"(Insulin-like growth factor-binding protein 2)는 인슐린 유사 성장인자 결합단백질을 의미한다.
본 발명의 용어, "IGFBP-3"(Insulin-like growth factor-binding protein 3)는 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질로서, IGFALS(insulin-like growth factor acid-labile subunit)와 결합체를 형성하여 혈장을 순환하며, IGF의 반감기를 연장하여 세포배양 시 성장 촉진 효과를 자극하는 작용을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IGFBP-4"(Insulin-like growth factor-binding protein 4)는 IGF와 결합하여 당화 및 비당화 형태로 혈장 내를 순환하며, IGF의 반감기를 연장하여 세포배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IGFBP-6"(Insulin-like growth factor-binding protein 6)는 단백질의 세포 표면 수용체와 IGF가 상호작용을 하여 결합하며, IGF의 반감기를 연장하여 세포배양에서 IGF의 성장 촉진 효과를 저해 또는 자극하는 작용을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IGF-1"(Insulin-like growth factor 1)은 인슐린 유사 성장인자로서 소마토메딘 C(somatomedin C)로도 불린다. 인슐린과 분자 구조가 유사하며, 어린시절의 성장에 중요한 역할을 수행하고, 성인에서도 동화 작용 효과를 지속한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "Insulin"은 혈액에서 지방, 간 및 골격 근육 세포로 포도당의 흡수를 촉진함으로써 탄수화물, 지방 및 단백질의 신진 대사를 조절하는 호르몬 단백질을 의미한다.
본 발명의 용어, "MCSF(Macrophage colony-stimulating factor)"는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)가 대식세포 또는 다른 관련 세포로 분화하는데 영향을 미치는 단백질을 의미하며, 진핵 세포에서 바이러스 감염에 대응하여 생산되며, 태반 발달과 관련이 있다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MCSF-R"(macrophage colony-stimulating factor)는 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor 1; CSF1)의 수용체 단백질을 의미한다.
본 발명의 용어, "NGF-R"(nerve growth factor receptor)는 신경 영양 인자(neurotrophins)에 특이적으로 결합하는 성장 인자 수용체 단백질을 의미한다.
본 발명의 용어, "NT-3"(Neurotrophin-3)는 신경영양인자로서 특히 뇌 및 말초 조직에 존재하며, 신경발생(neurogenesis)의 촉진 및 조절에 기여하는 단백질을 의미한다. 또한, 내장 감각 신경세포 및 고유수용성 감각 신경세포의 생존을 증진시키며, 모발 주기 중 퇴행기에서 FGF5, TGF-1 등과 함께 발현되는 특징을 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "NT-4"(Neurotrophin-4)는 신경영양인자로서, TrkB 수용체 티로신 키나아제를 통해 신호를 전달한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "OPG"(Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B)는 오스테오프로테그린(Osteoprotegerin, OPG) 및 오스테오칼스토제네시스 억제 인자(OCIF)로도 알려져 있다. 골 파괴(골조직 흡수, osteoclastogenesis)에 대하여 상쇄 기능을 수행하며, 생체 외에서 파골세포(osteoclasts)의 활성을 저해하고 파골세포의 세포사멸을 촉진한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "PDGF-AA"(Platelet-derived growth factor subunit A)는 태아 발달, 세포 증식, 세포 이동, 생존, 주화성 등의 조절에 중요한 역할을 담당하는 성장인자를 의미한다. 중간엽 기원의 세포에 대하여 미토겐(mitogen)으로 작용하며 상처 치유에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "PIGF"(Placenta growth factor)는 태반증식인자로서, 신생혈관생성, 내피세포 성장, 증식 및 이동의 자극 및 활성화에 작용하는 성장인자로 작용한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "SCF"(Stem cell factor)는 줄기세포인자로서 c-KIT 수용체(CD117)에 결합하는 사이토카인을 의미한다. 막통과 단백질(transmembrane protein) 또는 수용성 단백질(soluble protein)로서 존재할 수 있으며, 조혈(혈액 세포의 형성), 정자 형성 및 멜라닌 생성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "SCF-R"(Stem cell factor receptor)는 KIT 또는 C-kit 수용체로도 불리는 줄기세포인자 수용체 단백질로서, 줄기세포인자에 결합하며, 조혈 줄기세포뿐만 아니라 다른 세포 유형에서도 발현된다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "TGF-α"(Transforming growth factor alpha)는 표피 성장 인자(EGF) 계열의 일종이며, 세포 증식, 분화 및 발달을 위한 신호 전달 경로를 활성화시키는 표피 성장인자 수용체의 리간드로, 분열촉진(mitogenic) 폴리펩타이드로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "TGF-β1"(Transforming growth factor-β1)은 다른 성장 인자들을 양성적 및 음성적으로 조절하며 수많은 세포 타입들에 대하여 세포 증식, 분화, 여러 기능들을 조절하는 복합기능을 갖는 단백질을 의미한다. 골모세포의 골 형성 등을 자극함으로써 골 재형성에 대하여 중요한 역할을 하며 상처 치유에 중요한 역할을 한다. 또한, 면역계 조절에 중요하며 대부분의 면역세포가 TGF-β1을 분비하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "VEGF"(Vascular endothelial growth factor)는 발달 단백질, 성장 인자, 미토겐으로서 신생혈관생성, 혈관생성, 내피세포 성장을 활성화하는데 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 내피세포 증식을 유도하고 세포 이동을 촉진하고 세포사멸을 저해하고 혈관 투과성을 증진시키는 역할을 담당한다.
본 발명의 용어, "VEGF-R3"(Transforming growth factor alpha receptor 3)는 VEGF의 수용체 단백질로서, VEGF와 결합한 수용체 복합체는 내피 세포(endothelial cells; 혈관)에서 VEGF 신호 전달 활성을 증가시킨다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "ICAM-1"(Intercellular Adhesion Molecule 1)은 세포 간 부착분자로서 염증 세포 부착과 이동에 관여하는 염증단백질의 일종이다. 혈관 안쪽세포의 구조적 변화를 유도하며 면역 시스템 세포를 변환시킨다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "G-CSF"(Granulocyte-colony stimulating factor)는 골수를 자극함으로써 과립구와 줄기세포를 생산하여 혈류로 방출시키는 당 단백질로서, 호중구 전구체 및 성숙한 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IL-1α"(Interleukin 1 alpha)는 활성화된 대식세포, 호중구, 상피 세포 및 내피 세포에 의해 생성되는 사이토카인을 의미한다. 대사 작용, 생리 작용, 조혈 작용을 가지며 면역 반응의 조절에 중심적인 역할을 한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IL-2"(Interleukin-2)는 면역계 사이토카인 신호 전달 분자의 일종으로, 백혈구(백혈구, 또는 림프구)의 활동을 조절하는 단백질이다. 미생물 감염에 대한 신체의 자연적 반응에 관여하며, 자기(self) 또는 비자기(non-self) 물질을 구별하는 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IL-5"(Interleukin-5)는 B 세포의 성장을 자극하고 면역 글로불린의 분비를 증가시키는 역할을 수행하며, 호산구(eosinophil) 활성화의 주요 매개자로 작용한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IL-6"(Interleukin 6)는 베타(beta) 세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하며, 근육세포의 역할을 하고 골수세포를 형성하는 단백질이다.
본 발명의 용어, "IL-8"(Interleukin-8)은 호중구 또는 과립구가 있는 표적 세포에서 주화성(chemotaxis)을 일으켜 이들을 감염 부위로 이동시키며, 식균작용을 유도하는 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "IL-11"(Interleukin 11)은 B 림프구의 분화, 조혈간세포의 증식 및 분화, 거핵구의 증식 및 성숙, 조혈계에 관한 작용 등에 영향을 미치는 단백질로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MCP-1"(monocyte chemoattractant protein- 1)은 CC 케모카인으로서 단핵구, 림프구, 호염구 등을 선택적으로 유도하며, 염증성 신질환의 병태생리에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MIG"(gamma interferon)는 인터페론(interferon) 타입 II 클래스의 구성원 단백질로서, 이량체화된 용해성 사이토카인을 의미한다. 바이러스성, 일부 세균성 및 원충 감염에 대한 선천 및 적응(adaptive) 면역에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MIP-1a"(Macrophage Inflammatory Proteins 1a)는 CCL3으로도 명명되는 대식세포 염증성 단백질로서, 감염과 염증에 대한 면역 반응에 결정적인 역할을 수행한다. 또한, 섬유모세포 및 대식세포로부터 IL-1, IL-6 및 TNF-α와 같은 다른 전염증성 사이토카인의 합성 및 방출을 유도한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MIP-b"(Macrophage Inflammatory Proteins b)는 대식세포 염증성 단백질의 일종으로, 감염과 염증에 대한 면역 반응에 결정적인 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "MIP-d"(Macrophage Inflammatory Proteins d)는 대식세포 염증성 단백질의 일종으로, 감염과 염증에 대한 면역 반응에 결정적인 역할을 수행한다고 알려져 있다.
본 발명의 용어, "TIMP-1"(TIMP metallopeptidase inhibitor 1)은 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinases)의 구성단백질로서, MMP(Matrix metalloproteinases)의 억제제 역할을 하며, 세포 사멸을 막는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, "TIMP-2"(TIMP metallopeptidase inhibitor 2)는 TIMP의 구성단백질로서, MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)에 의해 멜라노사이트 세포를 조절하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 상기 인간 중간엽 단백질을 포함하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 5 내지 50%(v/v), 구체적으로 18 내지 22%(v/v), 가장 구체적으로 20%(v/v)로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물이 전술한 비율로 상기 배양액을 포함할 때 세포 또는 조직의 동결보존 효과가 증대되며, 이보다 낮거나 높은 비율로 포함하는 경우에는 해동 후 세포 또는 조직의 생존율이 감소되며, 세포 고유의 특성이 변질되는 단점이 있다.
본 발명의 조성물은 동결보존이 필요한 모든 세포 또는 조직에 적용될 수 있다.
즉, 상기 조성물은 세포 또는 조직의 유래 또는 종류 등에 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 구체적으로, 인간 또는 동물 유래의 세포 또는 조직에 사용될 수 있다. 세포의 경우, 분화되지 않은 줄기세포 또는 분화된 세포에 사용될 수 있으며, 난자, 정자 등의 생식세포 또는 다양한 체세포 등에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 조직의 경우, 상피조직, 결합조직, 연골조직, 골조직, 근육조직, 신경조직 등의 다양한 조직에 사용될 수 있으며, 나아가 장기에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 다양한 성장인자 또는 사이토카인으로 구성된 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질이 포함된 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하였으며(실시예 1), 상기 배양액을 포함하는 조성물을 사용하여 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 또는 마우스 유래 난소세포를 동결보존하는 경우, 해동 후 세포의 생존율, 증식율 및 단백질 분비능이 기존의 FBS를 사용한 동결보존 방법 및 시판되는 동결 보존액(CYRO-GOLD)을 이용한 경우보다 우수하며, 상기 배양액을 20%로 포함하는 조성물을 사용하는 경우에 세포 보존 효과가 최대가 됨을 확인하였다(도 1 내지 7).
이는, 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 본 발명의 조성물은 세포 또는 조직의 동결보존 용도로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 생산하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 목적상, 상기 배양액을 생산하는 단계는 (a) 인간 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계; (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계를 포함함으로써, 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 최대로 수득할 수 있다.
이때, 상기 단계들은 대한민국 특허등록 제10-1566450호에 기재된 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량생산방법에 포함되는 것으로서, 상기 대한민국 특허등록 제10-1566450호의 방법은 본 발명의 범주에 포함된다.
구체적으로, 단계 (a)는 인간 중간엽 줄기세포를 적절한 수로 분주하여 접종하는 단계로서, 특히 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계이다. 접종하는 세포의 밀도가 세포로부터 분비되는 단백질의 종류 및 양을 달라지게 할 수 있는바, 본 발명에서는 상기 단백질을 최대로 생산할 수 있는 세포의 밀도를 이용하였다.
본 발명에서 접종되는 세포의 밀도는 18,000 내지 22,000 세포/cm2, 구체적으로 19,000 내지 20,000 세포/cm2, 가장 구체적으로 20,000 세포/cm2 밀도일 수 있다.
다음으로, 단계 (b)는 인간 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계이다. 동물 유래인 혈청은 면역반응을 유발하거나 특정 질병의 발병 원인이 될 수 있는 위험성을 가지고 있으므로, 혈청을 포함한 배지에서 배양된 세포 또는 세포 배양액을 인간에 적용하는 것에 대하여 부작용의 가능성이 계속 지적되고 있는 실정이며, 임상을 진행하는데 있어서도 어려움이 있다. 이에, 본 발명에서는 인체에 적용될 경우 안전한 세포 배양액을 수득하기 위하여 인간 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하였다.
마지막으로, 단계 (c)는 상기 인간 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 114 내지 126시간 경과한 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계이다. 시간에 따라 세포에서 분비되는 단백질의 종류 및 양이 달라질 수 있고, 배양액 내에 존재하는 단백질의 함량도 달라질 수 있는바, 본 발명에서는 상기 단백질을 최대로 생산할 수 있는 배양 시간을 이용하였다.
본 발명에서 줄기세포를 배양하는 시간은 114 내지 126시간, 구체적으로 117 내지 123시간 일 수 있고, 가장 구체적으로 120시간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인간 중간엽 줄기세포를 DMEM/F12 무혈청 배지에 20,000 세포/㎠로 접종한 후 120시간 동안 배양하였고, 상기 줄기세포의 배지에서 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 수거하였다(실시예 1). 또한, 상기 단백질을 함유하는 배양액을 20%로 포함하는 조성물을 사용하여 세포를 동결보존하면, 해동 후 상기 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 또는 마우스 유래 난소세포의 보존 효과가 최대가 됨을 확인하였다(도 1 내지 7).
이는, 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 본 발명의 조성물은 세포 또는 조직의 동결보존 용도로서 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 조성물은 혈청을 포함하고 있지 않으므로 감염 등의 위험 없이 안전하게 사용될 수 있으며, 또한 유래 또는 종류에 상관없이 모든 세포 또는 조직의 동결보존 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 동결보존된, 인간 중간엽 줄기세포의 해동 후 생존율을 비교한 그래프이다. 대조군 1은 20% FBS를 포함하는 조성물, 대조군 2는 시중의 동결보존용 조성물 CYRO-GOLD를 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질(Human Protein Complex from Human Mesenchymal Stem Cell, 이하 hPC)을 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 동결보존된, 인간 중간엽 줄기세포의 해동 후 세포 증식율을 비교한 그래프이다. 대조군 1은 20% FBS를 포함하는 조성물, 대조군 2는 시중의 동결보존용 조성물 CYRO-GOLD를 의미한다. 대조군 1은 상기 단백질 대신에 20% FBS를 포함하는 조성물, 대조군 2는 시중의 동결보존용 조성물 CYRO-GOLD를 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 동결보존된, 인간 중간엽 줄기세포의 해동 후 단백질 분비능을 비교한 그래프이다. 대조군은 20% FBS를 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 -80℃에서 동결보존된, CHO-K1 세포의 해동 후 생존율을 비교한 그래프이다. 대조군은 20% FBS를 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 -80℃에서 동결보존된, CHO-K1 세포의 해동 후 증식율을 비교한 그래프이다. 대조군은 20% FBS를 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 -196℃에서 동결보존된, CHO-K1 세포의 해동 후 증식율을 비교한 그래프이다. 대조군은 20% FBS를 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 동결보존용 조성물로 -196℃ 또는 -80℃에서 동결보존된, CHO-K1 세포의 해동 후 생존율을 비교한 그래프이다. 대조군은 20% FBS를 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 본 발명의 조성물은 hPC를 함유하는 배양액을 5 내지 50% 포함하도록 제조하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 인간 중간엽 줄기세포 배양액 및 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 제조
실시예 1-1. 줄기세포의 배양 조건 확립
세포 또는 조직의 동결 보존용 조성물을 제조하기 위하여, 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 이용하였으며, 상기 배양액에는 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질(Human Protein Complex from Human Mesenchymal Stem Cell, 이하 hPC)이 포함되도록 하였다.
먼저, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cells, INVITROGEN, Cat. # R7788-110), 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7500), 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umblical Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7530), 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포(Human amniotic fluid derived cell, ANGIOCRINE, cat.# hAmnio-01) 또는 인간 양막 유래 중간엽 줄기세포(Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell, SCIENCELL, Cat.# 7501)를 이용하였다.
구체적으로, 대한민국 특허등록 제10-1566450호에 기재된 중간엽 줄기세포 유래 단백질의 대량생산방법을 이용하여 본 발명의 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하였다. 상기 대한민국 특허등록 제10-1566450호의 방법은 본 발명의 범주에 포함된다. 간략하게, 상기 인간 중간엽 줄기세포들에서 선택한 1종의 줄기세포를 DMEM/F12 무혈청 배지에 20,000 세포/㎠로 접종한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 120시간 동안 배양하였다.
이후, 상기 줄기세포의 배양액에서 hPC를 수거하였으며, BCA 측정법으로 단백질의 농도를 정량한 결과, 배양액 내 포함된 hPC의 농도는 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖임을 확인하였다.
실시예 1-2. 배양액 내 함유된 단백질의 종류 확인
상기 실시예 1-1을 통해 생산한, 인간 중간엽 줄기세포 배양액 내에 포함된 단백질의 종류를 확인하기 위하여, 항체 어레이 키트(Signaling Explorer Antibody Array, Fullmoon BioSystems사, Cat. No. SET100)를 이용하여 정성분석을 수행하였다.
그 결과, hPC을 구성하고 있는 단백질들은 FGF-7, IGF-1, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, MCSF-R, NT-4, TGF-β1, bFGF, EGF-R, GFG-4, GDF-15, HGF, NT-3, OPG, PDGF-AA, PIGF, VEGF, AR, BDNF, BMP-4, BMP-5, BMP-7, b-NGF, GDNF, GH, Insulin, NGFR, SCF, SCFR, TGF-α, VEGFR3, VEGF-D, G-CSF, ICAM-1, IL-1a, IL-2, IL-5, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MCSF, MIG, MIP-1a, MIP-1b, MIP-1d, RANTES, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, TNF-β, TNFR1 및 TNFRII 등의 성장인자 또는 사이토카인임을 확인하였다.
실시예 2. 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 제조
상기 실시예 1을 통해 생산한 hPC를 포함하는 배양액을 이용하여, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물을 제조하였다.
구체적으로, 하기 표 1에 기재한 바와 같이, DMSO 10%; 40 내지 85%의 cDMEM; 및 hPC 함유 배양액 5 내지 50%를 포함하도록 조성물을 제조하였다. 대조군으로는 일반적으로 사용되는 방법인 10% DMSO, 20% FBS 및 70% cDMEM을 포함하도록 조성하였고(대조군 1), 시판되는 동결보존용 조성물 "CYRO-GOLD"(대조군 2)를 사용하였다. 이때, 상기 조성물의 최종 부피는 1 ㎖로 조정하였다.
종류 동결 보존액 조성물
대조군 1 DMSO 10% + cDMEM 70% + FBS 20%
대조군 2 CYRO-GOLD (Revive Organtech, Cat. #10003)
시험군 1(5%) DMSO 10% + cDMEM 85% + hPC 함유 배양액 5%
시험군 2(10%) DMSO 10% + cDMEM 80% + hPC 함유 배양액 10%
시험군 3(15%) DMSO 10% + cDMEM 75% + hPC 함유 배양액 15%
시험군 4(20%) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20%
시험군 5(30%) DMSO 10% + cDMEM 60% + hPC 함유 배양액 30%
시험군 6(40%) DMSO 10% + cDMEM 50% + hPC 함유 배양액 40%
시험군 7(50%) DMSO 10% + cDMEM 40% + hPC 함유 배양액 50%
실시예 3. 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 인간 세포 보존 효과 확인
실시예 3-1. 세포 생존율(cell viability) 확인
상기 실시예 2를 통해 제조한 조성물의 인간 세포 동결보존 효과를 확인하기 위하여, 세포의 생존율을 측정하였다.
먼저, 동일한 계대의 인간 양수 유래 중간엽 줄기세포 1×106개를 상기 조성물이 들어있는 바이알(vial)에 넣고, -80℃ 초저온냉동고에 2주간 보관하였다. 이후, 상기 세포를 해동하여 이의 생존율을 측정하였다.
구체적으로, 냉동 보관된 상기 바이알을 37℃ 항온 수조에 넣어 세포를 녹였다. 이를 10 ㎖ 성장 배지에 옮긴 후, 1,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 수득하였다. 상기 펠렛에 10 ㎖ 성장 배지를 첨가한 뒤, 이 중 20 ㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 0.4 % 트리판 블루(trypan blue) 20 ㎕를 추가로 넣은 뒤 혼합하였다. 이후, 혈구계산판(hemocytometer)에 상기 용액 10 ㎕를 넣고 현미경(40배)을 통해 세포의 수를 측정하였다. 이때, 트리판 블루로 염색된 죽은 세포의 수를 먼저 세고, 염색되지 않은 살아있는 세포의 수를 세었다. 혈구계산판의 모눈 4개 구역에 위치한 세포의 수를 모두 센 이후, 모눈 1칸당의 수로 평균 내었다. 이후, 다음의 공식에 따라 살아있는 세포 수를 계산하였다: 살아있는 세포 = 모눈 1칸의 살아있는 세포 수 × 2 × 104 × 세포 용액 부피. 또한, 다음의 공식에 따라 세포 생존율(cell viability)을 계산하였다: 세포 생존율 = 살아있는 세포 수/(살아있는 세포 수 + 죽은 세포수) × 100.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법(대조군 1)으로 보관된 중간엽 줄기세포는 평균 86.45%의 세포 생존율을 보이는 반면, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 모두 약 89 내지 94%의 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, hPC 함유 배양액을 각각 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 포함한 시험군 1 내지 7에서는 각각 평균 약 90.21%, 89.51%, 90.44%, 93.21%, 93.16%, 92.68% 또는 92.19%의 세포 생존율을 나타내며, 이는 약 93.97%의 생존율을 나타내는 상업적으로 판매되는 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD(대조군 2)와 유사한 효과임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액 또는 상업적인 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD와 유사하거나 더 우수한 세포 생존 효과를 나타내는바, 이들을 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-2. 세포 증식율 (cell proliferation) 확인
상기 실시예 2를 통해 제조한 조성물의 인간 세포 동결보존 효과를 확인하기 위하여, 세포의 증식율을 측정하였다.
먼저, 동결보관 후 해동된 중간엽 줄기세포 1×106개를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco, Austria origin)과 100 ㎕/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco)을 포함하는 DMEM(Low Glucose, Welgene)이 포함된 T75 플라스크에 접종하였다. 이후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 3일간 배양하고, 플라스크에 70 내지 90% 정도로 세포가 증식했을 때 1:3 비율로 2회 계대배양을 실시하여 세포의 증식율을 비교하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 상업적으로 판매되는 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD(대조군 2)에서 보관된 중간엽 줄기세포는 약 70%의 세포 생존율을 보이는 반면, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 이와 유사하거나 더 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 특히, hPC 함유 배양액을 20% 또는 50%로 포함하는 시험군 4 또는 7에서는 세포 생존율이 각각 105.80% 및 108.21%로서, 이는 약 100%의 증식율을 나타내는 FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법(대조군 1)보다도 우수한 효과임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액 또는 상업적인 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD와 유사하거나 더 우수한 세포 증식 효과를 나타내는바, 이들을 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-3. 단백질 분비능 확인
상기 실시예 2를 통해 제조한 조성물의 인간 세포 동결보존 효과를 확인하기 위하여, 세포의 단백질 분비능을 측정하였다.
먼저, 상기 실시예 3-2의 방법에 따라 계대배양된 중간엽 줄기세포를 20,000 세포/㎠의 밀도로 DMEM/F12 무혈청 배지에 첨가하였고, 120시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 내 포함된 중간엽 줄기세포 분비 단백질의 총 함량을 BCA 정량법을 이용하여 정량 및 비교하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법(대조군 1)으로 보관된 중간엽 줄기세포로부터 분비된 총 단백질 함량은 약 50.78 ㎍/㎖인 것에 비하여, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 이와 유사하거나 더 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 특히, hPC 함유 배양액을 20%로 포함하는 시험군 4에서 분비된 총 단백질 함량은 약 53.91 ㎍/㎖로서, 이는 약 52.52 ㎍/㎖의 생존율을 나타내는 상업적으로 판매되는 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD(대조군 2)보다도 우수한 효과임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액 또는 상업적인 세포 동결 보존액인 CYRO-GOLD와 유사하거나 더 우수한 세포 동결보존 효과를 나타내는바, 이들을 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 동물 세포 보존 효과 확인
실시예 4-1. 세포 생존율 확인
상기 실시예 2를 통해 제조한 조성물의 동물 세포 동결보존 효과를 확인하기 위하여, 세포의 생존율을 측정하였다.
먼저, 동일한 계대의 CHO-K1 세포(Chinese Hamster Ovary Cell, KCLB Cat. No. #10061) 1×106개를 상기 조성물이 들어있는 바이알에 넣고, -80℃ 초저온냉동고에 2주간 보관하였다. 이후, 상기 세포를 해동하여 상기 실시예 3-1의 방법에 따라 생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법(대조군)으로 보관된 CHO-K1 세포는 약 68.66%의 세포 생존율을 보이는 반면, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 모두 약 84 내지 92%의 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, hPC 함유 배양액을 각각 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 포함한 시험군 1 내지 7에서는 각각 평균 약 86.96%, 84.82%, 88.31%, 91.95%, 89.74%, 89.49% 또는 88.03%의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액보다 더 우수한 세포 생존 효과를 나타내는바, 이를 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-2. 세포 증식율 확인
상기 실시예 2를 통해 제조한 조성물의 동물 세포 동결보존 효과를 확인하기 위하여, 세포의 증식율을 측정하였다.
먼저, 해동된 중간엽 줄기세포 1×106개를 10% 우태아혈청과 100 ㎕/㎖ 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM이 포함된 T75 플라스크에 접종하였다. 이후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 5일간 배양하고, 플라스크에 70 내지 90% 정도로 세포가 증식했을 때 1:5 비율로 2회 계대배양을 실시하여 세포의 증식율을 비교하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법(대조군 1)으로 보관된 CHO-K1 세포는 약 100%의 세포 생존율을 보이는 반면, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 모두 약 110% 이상의 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, hPC 함유 배양액을 각각 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 포함한 시험군 1 내지 7에서는 각각 평균 약 124.88%, 128.88%, 119.39%, 131.13%, 108.37%, 121.89% 또는 116.89%의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다.
특히, 도 6에서 볼 수 있듯이, CHO-K1 세포가 -196℃의 초저온상태에서 보관되더라도, 본 발명의 조성물에서 보관된 세포는 모두 약 110% 이상의 높은 생존율을 나타내며, 이는 약 100%의 생존율을 나타내는 기존의 동결 보존 방법(대조군 1)보다도 우수한 효과임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 동결보존용 조성물은 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액보다 더 우수한 세포 증식 효과를 나타내는바, 이를 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 장기 동결보존에 따른 생존율 비교
상기 실시예 2를 통해 제조한 세포 동결보존용 조성물의 효과를 검증하기 위하여, 세포를 2 내지 6개월 동안 장기간 보관한 이후, 이의 생존율을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3, 4-1 및 4-2를 통해, 세포 동결보존용 조성물은 hPC 함유 배양액을 20% 포함하는 경우에 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인함에 따라, 상기 조성물은 hPC 함유 배양액을 20% 포함하도록 제조하였다. 이후, 동일한 계대의 CHO-K1 세포 1×106개를 상기 조성물 1 ㎖이 포함된 동결 보관용 바이알에 넣어 각각 -196℃ 또는 -80℃에서 2 내지 6개월 동안 보관한 후, 해동하여 세포 생존율을 측정, 비교하였다. 이때, 각 보관 조건은 하기 표 2에 기재하였다.
종류 동결 보존액 조성물 및 방법
대조군 (2개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + FBS 20% (-196℃)
시험군 1(2개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-196℃)
시험군 2(2개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-80℃)
대조군 (4개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + FBS 20% (-196℃)
시험군 1(2개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-196℃)
시험군 2(2개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-80℃)
대조군 (6개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + FBS 20% (-196℃)
시험군 1(6개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-196℃)
시험군 2(6개월) DMSO 10% + cDMEM 70% + hPC 함유 배양액 20% (-80℃)
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, FBS를 사용한 기존의 동결 보존 방법으로 -196℃에서 보관된 세포(대조군)는 2, 4 또는 6개월 이후에 각각 평균 약 82.29%, 81.62%, 80.16%의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다. 이와 비교하여, hPC 함유 배양액을 20%로 포함하는 본 발명의 동결보존 조성물로 -196℃에서 보관된 세포(시험군 1)는 2, 4 또는 6개월 이후에 각각 평균 약 80.88%, 80.36%, 80.16%의 유사한 세포 생존율을 나타내며, 특히 -80℃에서 보관된 세포(시험군 2)는 2, 4 또는 6개월 이후에 각각 평균 약 89.02%, 88.12% 또는 87.36%의 현저하게 높은 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물은 장기간의 동결보관 시에도 기존의 FBS를 사용한 세포 동결보존액과 유사하거나 더 우수한 효과를 나타내는바, 이를 대체하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물로서, 상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액은 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 것이며, 상기 단백질은 AR, BDNF, bFGF, BMP-4, BMP-5, BMP-7, b-NGF, EGF-R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-1, Insulin, MCSF, MCSF-R, NGF-R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF, SCF R, TGF-α, TGF-β1, VEGF, VEGF-R3, ICAM-1, G-CSF, IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, TNFβ, TNF-R1 및 TNF-R11인 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 제대혈, 양수 또는 양막 유래인 것인, 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 총 농도는 BCA 측정법으로 30 ㎍/㎖ 내지 70 ㎍/㎖인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 배양액을 5 내지 50%(v/v)로 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 인간 또는 동물 유래인 것인, 조성물.
  8. 인간 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 포함하는 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 생산하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 제조방법으로서, 상기 단백질은 AR, BDNF, bFGF, BMP-4, BMP-5, BMP-7, b-NGF, EGF-R, FGF-4, FGF-7, GDF-15, GDNF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-6, IGF-1, Insulin, MCSF, MCSF-R, NGF-R, NT-3, NT-4, OPG, PDGF-AA, PIGF, SCF, SCF R, TGF-α, TGF-β1, VEGF, VEGF-R3, ICAM-1, G-CSF, IL-1α, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-11, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-b, MIP-d, TIMP-1, TIMP-2, TNFα, TNFβ, TNF-R1 및 TNF-R11인 것인, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 중간엽 줄기세포 배양액을 생산하는 단계는 하기 단계를 포함하는 것인, 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물의 제조방법:
    (a) 인간 중간엽 줄기세포를 18,000 내지 22,000 세포/cm2의 밀도로 접종하는 단계;
    (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 배양 114 내지 126시간 경과 후 줄기세포 배양액을 수득하는 단계.
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