KR102536863B1 - 양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 동물의 정액 동결보호용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 동물의 정액 동결보호용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 동결보호제 및 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 정액 동결보호용 조성물에 관한 것이다.

Description

양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 동물의 정액 동결보호용 조성물 및 이의 제조방법{A Composition for semen cryoprotectant of animal including amniotic membrane derived stem cell-conditioned media and method of making thereof}
본 출원은 양막유래 줄기세포-조정배지(amniotic membrane derived stem cell-conditioned media, AMS-CM) 및 동결보호제를 포함하는 동물의 정액 동결용 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
동결보호(또는 동결보존)기술은 개량, 증식, 우수한 개체의 유지와 멸종 위기종 보존, 인공수정(artificial insemination, AI) 등에 사용되는 기술이다.
특히, 정자의 동결보호는 가축의 번식 및 품종 보존 등에 유용하다.
현재까지 정자의 동결보존에 사용되는 물질은 DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤(Glycerol), 수크로즈(sucrose), 메탄올(methanol), 글루코스(glucose), 프롤린(proline), 갈락토스(galactose), 락토스(lactose), 베타인(betaine), 프록토스(fructose) 등이 있다. 이러한 물질들은 강한 독성, 높은 점성, 동결-해동(freezing-thawing)시 세포의 손상 방지 효과가 미흡한 점 등의 다양한 문제점이 존재한다.
더군다나, 정자는 동결과 융해 과정을 거치는 동안 죽거나 운동성이 감소하여 융해 후 정자의 질(quality)이 신선정액의 질보다 낮은 문제가 해결되지 않고 있기에 정액동결 기술 개발 연구의 중요성이 꾸준히 제기되어 왔다.
따라서, 정자의 운동성, 생존성을 향상시킬 수 있는 정액동결 기술의 개발이 필요하다.
한편, 한국등록특허 제10-2058338호에는 '중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0320588호에는 '개 정액 냉동용 조성물, 이를 이용한 개 정액 냉동방법 및이 냉동된 정액을 이용한 인공수정 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보존제를 포함하는 동물의 정액 동결보존용 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.
1. 한국등록특허 제10-2058338호 2. 한국등록특허 제10-0320588호
본 출원의 일 과제는, 동결보호제 및 양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 동물의 정액 동결보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 동물의 정액동결 후 해동된 정자의 운동성, 생존성, 막 보존성, 미토콘드리아 활성이 향상될 수 있는 동물의 정액 동결용 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 동결보호제 및 양막유래 줄기세포-조정배지(amniotic membrane derived stem cell-conditioned media, AMS-CM)를 포함한 정액 동결용 조성물이 제공된다.
상기 조성물은,
적어도 하나 이상의 동결보호제; 및
아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin)을 포함하는 양막유래 줄기세포-조정배지(ASC-CM, amniotic membrane derived Stem Cell-conditioned media);
를 포함하고,
상기 ASC-CM는 양막유래 줄기세포를 배양한 배양액이고,
이 때, 상기 ASC-CM은 양막유래 줄기세포를 포함하고 있지 않는 조성물이 제공된다.
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 다른 양태에 의하면, 상기 정액 동결용 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
상기 방법은,
양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;
상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계; 및
상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 혼합하는 단계;
를 포함하고,
이 때, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지가 상기 조성물 최종 중량에 대하여 5% 내지 15% 포함되는 정액 동결용 조성물 제조방법이 제공된다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면 동물의 정액을 동결할 수 있는 조성물을 제공할 수 있게 된다. 특히, 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 포함하는 조성물을 제공할 수 있게 된다.
둘째, 본 출원에 의해 제공되는 상기 조성물에 포함되는 양막유래 줄기세포-조정배지를 최적함량으로 포함시킴으로써, 정자의 생존성, 운동성, 세포막 온정성이 향상되는 효과를 제공할 수 있게 된다.
셋째, 본 출원에 의해 제공되는 상기 조성물을 이용한 동물의 정액동결방법을 제공할 수 있게 된다.
넷째, 본 출원에 의해 제공되는 정액동결방법으로 동물의 우수한 개체의 유지와 멸종 위기종 보존에 도움을 줄 수 있게 된다.
도 1은 양수줄기세포(amniotic fluid-derived stem cells, AFSCs) 및 양막줄기세포(amniotic stem cells, ASCs)의 주요 단백질에 관한 도면이다.
도 2는 세포막 온전성 분석을 위해 Hypo-osmotic swelling test 후 현미경으로 관찰한 정자를 나타낸 도면이다.
도 3은 Computer assisted sperm analyzer(CASA)를 이용한 정자의 운동능 분석 parameters 모식도를 나타낸 도면이다.
도 4는 개과 동물의 양막유래 중간엽줄기세포(canine amniotic membrane membrane derived mesenchymal stem cell, cAMSC)의 유세포 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 cAMSC의 다능성 유전자의 발현을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 대조군과 10% cAMSC-CM처리군에서 이동성 및 비이동성 정자의 비율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 대조군과 10% cAMSC-CM처리군에서 정자의 미토콘드리아 활성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다.
본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
0. 용어 정의
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
기본 배지(basal media)
본 출원에서 사용되는 용어 "기본 배지(basal media)"는 조정 배지 수득에 필요한 세포를 배양할 때 사용되는 배지를 의미한다. 그래서 상기 기본 배지는 세포의 성장 및 증식에 필요한 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질, 지질, 미네랄, 성장인자, 혈청, 항생제 등이 포함된 배지를 의미한다. 이 때, 세포의 종류에 따라 각 성분을 선택적으로 가감할 수 있다. 또한, 시중에 판매되는 배지(media 또는 medium)만을 이용하거나 또는 혈청이나 항생제 등이 추가된 배지도 기본 배지로 해석하도록 한다.
조정 배지(conditioned media, CM)
본 출원에서 사용되는 용어 "조정 배지(conditioned media)"는 세포를 상기 기본 배지에 일정기간 동안 배양한 뒤, 원심분리, 필터 등의 방법을 이용하여 세포를 제외한 배양액을 의미한다. 이 때, 조정 배지에는 세포의 성장 및 증식에 필요한 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질, 지질, 미네랄뿐만 아니라, 세포가 배양 과정 중에 분비하는 성장인자, 세포외기질 성분, 항산화 물질, 대사산물 등이 포함되어 있다. 용어 조정 배지는 본 출원에서 약어 CM으로 기재하기도 한다.
정액(semen)
본 출원에서 사용되는 용어 "정액(semen)"은 동물의 수컷이나 자웅 동체인 동물의 생식샘(gonad) 또는 기타 생식기에서 분비되는 체액으로 정자(sperm)를 포함하고 있는 액체를 의미한다. 정액은 체내에 고환, 정낭, 전립샘 등을 포함하고 있으며, 정자는 고환에서 만들어진다.
동결보존(Cryopreservation)
본 출원에서 사용되는 용어 "동결보존(Cryopreservation)"은 세포 내 모든 생리 및 생화학적 반응의 속도를 느리게 하거나 차단한 상태의 세포를 장기간 보존하는 것을 의미한다. 동결 보존된 세포는 필요시 해동하여 사용할 수 있다. 용어 동결보존제는 동결보존에 사용되는 물질을 의미한다. 용어 동결보존은 동결보호, 동결, 냉동보존과 동일한 의미로 해석하도록 한다.
약
본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량, 길이 및 기타의 함량에 대해 특징이 정확하지 않거나 또는 정확할 필요가 없으며, 필요한 경우 허용 한계, 전환 인자, 반올림, 측정 오차 등 그리고 당업자에게 공지된 기타의 요인을 반영하는 대략적일 수 있거나 또는/및 이보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다는 것을 의미한다.
포함
본 출원에서 사용되는 용어 "포함"은 개시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 물질, 구성요소 내에 적어도 하나의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 물질, 구성요소를 포함하는 것을 의미한다. 용어 포함은 함유와 동일한 의미로 해석하도록 한다.
약어
본 출원에서 사용되는 용어들은 다음과 같은 약어로 사용될 수 있다.
조정배지(conditioned media): CM
양막유래 줄기세포(amniotic membrane derived stem cell): ASC
양막유래 중간엽줄기세포(amniotic membrane derived mesenchymal stem cell): AMSC
양막유래 줄기세포-조정배지: ASC-CM
양막유래 중간엽줄기세포-조정배지: AMSC-CM
종래 동물의 정액 동결보존 기술의 한계점
일반적으로 동결보존시, 초저온 냉동법(ultra freezing)이 주로 사용되고 있으며, 동결보호제는 DMSO, glycerol, sucrose 등이 사용되고 있으나, 다음과 같은 한계점이 있다.
i) 동결보호제의 강한 독성, 높은 점성으로 인해, 세포의 손상 방지 효과가 미흡한 문제점이 있다.
종래 사용되는 glycerol, DMSO(dimethyl sulfoxide), 프로판디올(prophandiol), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 등의 동결 보호제는 생리적으로 독성이 있다. 이러한 독성은 해동된 세포가 배양되거나 수용자 체내로 주입된 후 게놈 변이 등의 손상을 포함하여 세포의 생존률 및/또는 기능을 악화시켜 세포의 손상을 발생시키는 문제가 있다.
ii) 동결-해동(freezing-thawing)시 신선한 정자(fresh sperm)에 비해 운동력, 생존력, 세포막 온전성, 수정능 등이 감소하는 문제점이 있다.
종래 사용되는 동결보호제를 이용한 초저온 냉동법으로 동물의 정액 동결 후 해동을 하면, 삼투압의 차이, 저온 스트레스 등에 의해 정자는 손상을 받을 뿐만 아니라, 신선한 정자(fresh sperm)에 비해 운동력, 생존력, 세포막 온전성, 수정능 등이 감소하는 문제가 있다.
본 출원은 상기 문제점들을 해결하기 위해 양막유래 줄기세포-조정배지를 이용한다. 특히, 기존의 기술들이 가지는 동물의 정액 동결-해동시, 정자의 운동력, 생존력, 세포막 온전성 등이 감소하는 문제를 양막유래 줄기세포-조정배지를 사용함으로써 해결하고자 하였다.
본 출원의 기술적 특징
i)양막유래 줄기세포를 이용하기 때문에, 정액의 동결보존시 정자의 생식능에 도움을 줄 수 있다.
한국등록특허 제10-2058338호에는 '중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물'이 개시되어 있다. 해당 특허에는 지방에서 유래된 줄기세포를 이용하는데 반해, 본 출원은 양막에서 유래된 줄기세포를 이용한다. 다양한 줄기세포들 중에서도 본 출원과 같이 태반에서 수득하는 양막 내의 줄기세포를 이용하는 경우, 지방에서 유래된 줄기세포에 비해 상대적으로, 정자의 생식능에 도움을 줄 수 있는 장점이 있다.
ii) 양막유래 줄기세포-조정배지를 사용하기 때문에, 줄기세포가 분비하는 다양한 산물들이 더 포함되어 있다.
양막유래 줄기세포-조정배지를 사용하는 경우, 줄기세포를 배양하는 동안 줄기세포가 분비하는 다양한 물질들을 포함하고 있는 특징이 있다. 그래서 동물의 정액 동결보존 시, 정자의 운동력, 생존력, 세포막 온전성 등이 감소하는 것을 방지해주는 장점이 있다.
이하에서, 상기의 특징을 가진 본 출원인 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 포함하는 정액 동결 보호용 조성물을 제조하는 방법 및 이의 조성물에 대해 보다 자세하게 설명한다.
본 출원의 일 태양은 "양막" 유래 줄기세포 배양액을 이용하는 것을 특징으로 한다.
양막유래 줄기세포(amniotic membrane derived stem cell, ASC)의 특징
양막(amniotic membrane)은 태반의 가장 안쪽과 맞닿아 있는 막이다. 양막은 양막상피세포(amniotic epithelial cells), 세포가 없는 중간 기저막층, 중간엽 줄기세포가 풍부하고 융모막과 맞닿아 있는 중간엽세포층으로 구성되어 있다. 양막은 다양한 성장인자와 항염증 물질들이 풍부한 조직이다.
줄기세포는 미분화 세포로, 자가복제능력 및 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포를 의미한다.
본 출원의 양막유래 줄기세포는 출산 후 폐기되는 조직인 양막으로부터 수득할 수 있기 때문에, 윤리적인 문제를 피하면서 줄기세포를 얻기 위해 침습적인 시술을 수행할 필요가 없는 장점이 있다.
또한, Transcriptomics 분석에 따르면, 양막유래 줄기세포에서 모체태반 간 면역적응 조절에 관여하는 유전자들, 전사인자, 대사효소 등의 발현이 양수줄기세포, 골수줄기세포에 비해 높았다는 연구결과가 있다(Roubelakis et al., 2012; 도 1).
상기 양막유래 줄기세포는 특이적 마커를 발현 또는 미발현하는 특성을 가지고 있다.
상기 특이적 마커는 표면마커(surface marker) 또는 분화마커일 수 있다.
상기 표면마커(surface marker)는 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD34, CD45, CD31, CD14, CD117 등이다. 이 때, CD는 cluster of differentiation의 약어이다.
상기 CD29, CD44 및 CD90는 지방, 골수, 제대혈 유래 간엽 줄기세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다(Stem Cells 2006, 24, 1294-1301;, Mol. Cell Biochem. 2011, 357, 331-341).
상기 CD34 및 CD45는 조혈모 줄기세포와 관련된 것으로 알려져 있다(Cell Biol. Int. 2005, 29, 654-661;, Mol. Cells 2011, 32, 181-188).
상기 양막유래 줄기세포는 CD34, CD45는 낮게 발현되고, CD29, CD44 및 CD90는 높게 발현될 수 있다.
상기 분화마커는 옥타머 바인딩 전사 인자 3/4(octamer-binding transcription factor 3/4, Oct3/4), 옥타머 바인딩 전사인자 4(octamer-binding transcription factor 4, Oct-4), 나노그(Nanog), 성별 결정 영역 Y-box 2(sex determining region Y-box 2, Sox2), 단계 특이적 배아항원 3(Stage-specific embryonic antigen 3, SSEA-3), 단계 특이적 배아항원 4(Stage-specific embryonic antigen 4, SSEA-4), T 세포 수용체 알파 로커스 1-60 (T cell receptor alpha locus 1 -60, TRA-1-60), T 세포 수용체 알파 로커스 1-81(T cell receptor alpha locus 1 -60, TRA-1-81), 베타 3 튜불린(Beta-3 tubulin), 포크헤드 박스 단백질 A2(Forkhead box protein A2, FOXA2), 스무스 알파 육종 액틴(smooth-α-sarcomeric actin, ASMA) 등이다.
상기 Oct3/4, Nanog 및 Sox2는 전분화능을 조절하는 인자로 알려져 있다.
상기 양막유래 줄기세포는 Oct3/4, Nanog 및 Sox2를 발현할 수 있다.
1. 양막유래 줄기세포-조정배지 제조방법
본 출원의 일 태양은 상기 양막유래 줄기세포를 배양한 배양액인 양막유래 줄기세포-조정배지(amniotic membrane derived Stem Cell-conditioned media, ASC-CM)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지를 제조하는 방법은,
양막유래 줄기세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계;
를 포함한다.
상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;는 양막유래 줄기세포를 증식하도록 하게 하는 것이다.
상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;는 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계; 및 상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포를 계대배양하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포는 시중에 파는 제품으로부터 수득하거나 또는 실험자가 동물로부터 양막을 수득하여 이로부터 양막유래 줄기세포를 수득할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 양막유래 줄기세포의 양막은 인간을 포함한 포유류의 양막일 수 있다.
예를 들어, 상기 포유류는 개, 말, 소, 토끼, 너구리, 여우, 사슴, 양, 당나귀, 돼지, 침팬지, 원숭이 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 본 출원의 양막유래 줄기세포는 개과 동물의 양막유래 줄기세포일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 양막유래 줄기세포는 개의 양막유래 줄기세포일 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포는 양막유래 상피줄기세포, 양막유래 중간엽 줄기세포(amniotic membrane derived mesenchymal stem cell, AMSC)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 본 출원의 양막유래 줄기세포는 양막유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포는 시중에 파는 제품을 해동하여 양막유래 줄기세포를 수득할 수 있다.
상기 해동은 항온수조를 이용하여 해동하여 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
이 때, 선택적으로, 냉동된 세포 바이알에 포함된 동결보존제를 제거하기 위해 항온수조에서 해동 후 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 양막유래 줄기세포는 임신한 동물로부터 수득한 태반 또는 안락사 과정 중 폐기되는 태반으로부터 실험자가 양막유래 줄기세포를 수득할 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계;는 양막유래 줄기세포-조정배지 수득에 필요한 세포를 성장 및 증식시키기 위해 기본배지에 배양하는 것이다.
상기 기본배지는 상기 양막유래 줄기세포의 종류에 따라 결정될 수 있다.
상기 기본배지는 상기 양막유래 줄기세포의 성장 및 증식에 필요한 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질, 지질, 미네랄, 항생제 등을 포함할 수 있다.
상기 당은 세포의 성장에 필요한 것으로, 예를 들어 글루코스(Glucose), 말토오스(Maltose), 프록토스(fructose) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 아미노산은 세포의 성장에 필요한 것으로, 예를 들어 글리신(Glycine), 아르기닌(Arginine), 시스틴(Cystine), 글루타민(Glutamine), 히스티딘(Histidine), 류신(Leucine), 이소류신(Isoleucine), 리신(Lysine), 메티오닌(Methionine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 세린(Serine), 트레오닌(Threonine), 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 발린(Valine) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 비타민은 세포의 성장에 필요한 것으로, 예를 들어 염화콜린(Choline chloride), 엽산(Folic Acid), D- 칼슘 판토텐산(D-Calcium pantothenate), 나이아신 아마이드(Niacinamide), 피리독신 염산염(Pyridoxine hydrochloride), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민 염산염(Thiamine hydrochloride), i-이노시톨(i-Inositol) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 무기질은 세포의 성장에 필요한 것으로, 예를 들어 염화칼슘(Calcium Chloride, CaCl2), 질산철(Ferric Nitrate), 황산 마그네슘(Magnesium Sulfate, MgSO4), 염화 칼륨(Potassium Chloride, KCl), 탄산수소나트륨(Sodium Bicarbonate, NaHCO3), 염화 나트륨(Sodium Chloride, NaCl), 모노나트륨 인산염(Sodium Phosphate monobasic, NaH2PO4-H2O) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 항생제는 세포 배양시 박테리아(bacteria), 진균류(fungi), 마이코 플라즈마(mycoplasma), 이스트(yeasts) 등에 의한 오염을 막아주는 것으로, 예를 들어 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 기본배지는 시중에 파는 제품일 수 있다.
예를 들어, 시중에 파는 제품은 BME(Basal medium Eagle's), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), RPMI(Rosewell Park Menorial Institute), MEM(Minimum essential medium), RCMEP등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 본 출원의 상기 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계;는 RCMEP로 양막유래 줄기세포를 배양하는 것일 수 있다.
상기 기본배지는 시중에 파는 제품에 혈청, 항생제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 혈청은 FBS(Fetal bovine serum), BSC(Bovine calf serum) 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 항생제는 Penicillin, Streptomycin, kanamycin 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계;는 상기 양막유래 줄기세포가 증식하여 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 밀집(컨플루언시, Confluency)이 된 상태일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 양막유래 줄기세포의 배양기간(즉, 세포의 증식기간)은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포를 계대배양하는 단계;는 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포의 세포 밀집도가 세포배양 용기 전체의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 등이 되었을 때, 주기적으로 새로운 세포배양 용기와 새로운 기본배지를 이용하여 교체하는 것이다. 이는 세포의 과증식으로 인한 세포사멸을 방지하고, 대(passage)를 이어가기 위함이다.
상기 양막유래 줄기세포를 계대배양하는 단계;는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 마다 주기적으로 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 계대배양시, 주기적으로 기본배지와 동일한 또는 상이한 것을 사용할 수 있다.
예를 들어, 첫번째 계대배양시에는 혈청과 항생제가 포함된 기본배지를 사용하고, 두번째 계대배양시에는 혈청이 포함되지 않는 기본배지를 사용할 수 있다.
구체적인 예를 들어, 양막줄기세포를 항생제 및 혈청이 포함된 RPMI 배지로 1 내지 2회 계대배양한 후, 3회째에는 혈청이 포함되지 않은 RPMI 배지로 계대배양할 수 있다.
다른 구체적인 예를 들어, 양막줄기세포를 RPMI 배지로 첫번째 계대배양한 후, 두번째 계대배양시에는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.
또한, 상기 계대배양시 트립신(trypsin), 완충용액 등을 이용한 통상적인 계대배양 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
추가적으로, 양막유래 줄기세포의 특성을 분석하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 이는 상기 과정 중간 또는/및 마지막에 필요시, 양막유래 줄기세포의 특성을 분석하여, 최종적으로 수득한 줄기세포가 목적하는 줄기세포인지의 여부를 확인하기 위해 수행될 수 있다.
상기 특성은 줄기세포의 유래, 줄기세포의 종류, 줄기세포의 다능성(pluripotent), 미분화 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 양막유래 줄기세포의 특성을 분석하는 단계;는 마커(marker)의 발현여부를 확인하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 줄기세포의 유래는 표면마커 (surface marker)인 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD34, CD45, CD31, CD14, CD117 등의 발현여부로 확인할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
다른 예를 들어, 줄기세포의 다능성은 분화와 관련된 마커인 Oct3/4, Oct-4, Nanog, Sox2, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Beta-3 tubulin, FOXA2, ASMA 등의 발현여부로 확인할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 마커의 발현여부는 플로우 사이토미터를 사용한 FACS법, 목적하는 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 칼럼법 등으로 수행할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원에서는 일 실시예로, 개의 양막유래 중간엽줄기세포의 표현형(phenotype) 특성 즉, 줄기세포의 유래를 FACS를 이용하여 확인하였다(도 4).
도 4의 결과를 통해, 본 출원의 개과 동물의 양막유래 중간엽줄기세포는 조혈모 줄기세포와 관련된 CD34, CD45는 낮게 발현되었고, 지방, 골수 및 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 관련된 CD29, CD44 및 CD90는 높게 발현된 것을 알 수 있다.
또한, 본 출원의 다른 실시에로, 개의 양막유래 중간엽줄기세포의 다능성 유전자 발현을 qPCR을 이용하여 확인하였다(도 5).
도 5의 결과를 통해, 본 출원의 개과 동물의 양막유래 중간엽줄기세포는 중간엽 줄기세포의 자가재생, 다능성 결정 및 세포의 미분화 상태 유지에 필수적인 인자인 Oct3/4, Nanog 및 Sox2이 발현함을 알 수 있다.
도 4 및 5의 결과들을 통해, 본 출원의 줄기세포는 양막유래이며, 특히 중간엽줄기세포임을 확인할 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계; 또는/및 상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포를 계대배양하는 단계;를 수행하면, 배양액에서 증식한 양막유래 줄기세포를 수득할 수 있다.
상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계;는 상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 과정에서 양막유래 줄기세포가 분비하는 다양한 물질까지 포함하고 있는 조정배지를 수득하는 것이다. 이 때, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 세포를 제외한 배양액을 의미한다.
다시 말해, 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포의 양막유래 줄기세포를 제거한 배양액만을 수득하는 것이다. 그래서 양막유래 줄기세포가 상기 기본배지 등에서 증식하는 동안 대사산물, 세포외기질 성분, 성장인자 등을 분비하면서 세포증식 과정이 일어나 이러한 다양한 물질들이 기본배지 내에 포함되어 있는 배양액만을 수득하는 것이다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지를 수득하기 전에, 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포를 영양결핍(starvation)시키는 단계;를 추가적으로 더 수행할 수 있다.
상기 영양결핍은 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 위한 목적으로 또는 혈청 인자(serum factor)를 배제하기 위한 목적으로 수행될 수 있다.
상기 배양된 양막유래 줄기세포를 영양결핍(starvation)시키는 단계;는 세포배양 용기에서 증식한 양막유래 줄기세포의 배양액을 무혈청 배지(serum free media)로 교체하여 배양함으로써 수행될 수 있다.
이 때, 상기 무혈청 배지에 양막유래 줄기세포를 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지를 수득하기 위해, 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포의 배양액을 원심분리 또는 필터를 하여 수득할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 원심분리 또는 필터 등은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 등 반복하여 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포의 배양액을 원심분리 또는 필터를 수행하면 양막유래 줄기세포를 제외한 양막유래 줄기세포-조정배지를 수득할 수 있다.
상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포의 배양액을 원심분리 또는 필터를 수행하면 양막유래 줄기세포 뿐만 아니라, 데브리스(debris)도 제거될 수 있다. 이 때, 상기 데브리스는 죽은 세포, 부스러기 등일 수 있다
일 실시예로, 본 출원의 상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계;는 상기 배양액을 원심분리 및 필터하여 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득할 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계의 결과물인 양막유래 줄기세포를 배양한 배양액을 원심분리 또는 필터를 하면, 양막유래 줄기세포가 세포증식 동안 분비한 다양한 물질들을 포함하는 양막유래 줄기세포-조정배지를 수득할 수 있다.
상기에서 수득한 양막유래 줄기세포-조정배지는 동결보호제를 더 포함하여, 정액 동결보존을 위한 용도로 사용될 수 있다.
2. 정액 동결보호용 조성물
본 출원의 다른 태양은 상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 포함하는 정액 동결보호용 조성물에 관한 것이다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지를 수득하기 위해 사용되는 양막유래 줄기세포는 다양한 동물로부터 수득할 수 있고, 이를 동종동물(양막유래 줄기세포를 수득한 것과 동일한 동물) 또는 이종동물의 정액을 동결보호하는데 사용될 수 있을 것이다.
특히, 중간엽줄기세포는 면역원성이 적기 때문에, 상기에서 설명한 바와 같이 동종동물 또는 이종동물의 정액을 동결보호가 가능하다.
즉, 본 출원의 정액 동결보호용 조성물은 예를 들어, 개의 양막유래 줄기세포-조정배지를 이용하여 개의 정액 동결 보호용 조성물로 이용할 수 있다. 뿐만 아니라, 다른 예를, 소의 양막유래 줄기세포-조정배지를 이용하여 개의 정액 동결 보호용 조성물로 이용할 수 있다.
상기 정액은 인간을 포함한 포유류의 정액일 수 있다.
예를 들어, 상기 포유류는 개, 말, 소, 토끼, 너구리, 여우, 사슴, 양, 당나귀, 돼지, 침팬지, 원숭이 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 본 출원의 상기 정액 동결보호용 조성물은 개과 동물의 정액 동결 보호용 조성물일 수 있다.
양막유래 줄기세포-조정배지
상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 세포의 성장 및 증식에 필요한 당, 아미노산, 각종 영양물질, 무기질, 지질, 미네랄, 항생제뿐만 아니라, 양막유래 줄기세포 배양 과정 중에 분비하는 성장인자, 세포외기질 성분, 항산화 물질, 대사산물 등이 포함될 수 있다.
상기 세포의 성장 및 증식에 필요한 물질에 대한 설명은 위에서 설명한 바와 동일하다.
상기 성장인자는 오스테오넥틴(Secreted protein acidic and cysteine rich/Osteonectin, SPARC), 혈청 알부민(Serum albumin), 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질 7(Insulin like growth factor binding protein 7, IGFBP7), 알파 2-HS 당단백질(Alpha 2-HS glycoprotein, AHSG), 피브로넥틴(fibronectin), 페튜인 B(Fetuin B), 셀룰러 커뮤니케이션 네트워크 인자 2(Cellular communication network factor 2, CCN2), Fms 관련 티로신 키나아제 1(Fms related tyrosine kinase 1, FLT1) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포외기질 성분은 오스테오넥틴(Secreted protein acidic and cysteine rich/Osteonectin, SPARC), 루미칸(Lumican), 폴리스타틴 유사 1(Follistatin like 1, FSTL1), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, Collagen alpha-1(I) chain, COL3A1), 엘쥐에이엘에스3비피(LGALS3BP), 더마토폰틴(Dermatopontin), 콜라겐 알파 2 체인(Collagen alpha-2(I) chain, COL1A2), 트롬보스폰딘 1(Thrombospondin 1), 바이글라이칸(Biglycan), 콜라겐 타입 5 알파 2 체인(Collagen type V alpha 2 chain, Collagen type V alpha 1 chain, COL5A2), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1), 라미닌 서브유닛 알파 3(Laminin subunit alpha 3)등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 항산화 물질은 혈청 알부민(Serum albumin), 아포 E 지단백(Apolipoprotein E), 티오레독신(Thioredoxin), 엘오씨102154317(LOC102154317), 페리틴(Ferritin), 디코린(Decorin), A2M 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 세포 대사와 관련된 물질은 아포 E 지단백(Apolipoprotein E), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 비타민 D 결합 단백질(vitamin D binding protein, GC), 플라스미노겐 활성인자(Plasminogen activator, urokinase receptor, PLAUR), 알파태아단백(Alpha-fetoprotein, AFP), 이와츠(YWHAZ), 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I), 엘오씨477072(LOC477072), 헤모글로빈 서브유닛 베타(Hemoglobin subunit beta), 리보핵단백질을 포함하는 SAP 도메인(SAP domain containing ribonucleoprotein, SARNP), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 엘오씨475521(LOC475521), 성장 억제 특정 2(Growth arrest specific 2, GAS2), 후각 수용체(Olfactory receptor), 리소좀 단백질 막 횡단 4 베타(Lysosomal protein transmembrane 4 beta, LAPTM4B), 트로포미오신(Tropomyosin 1), 아넥신 A2(Annexin A2), 세르핀 패밀리 A 멤버 7(Serpin family A member 7), 세르핀 패밀리 F 멤버 1(Serpin family F member 1), 신경 성장 인자 수용체(Nerve growth factor receptor, NGFR), 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 관련 단백질 1(Mitogen-activated protein kinase associated protein 1, MAPKAP1), 세르핀 패밀리 C 멤버 1(Serpin family C member 1), 지엔에프385C(ZNF385C), 취약 X 정신 지체 1(Fragile X mental retardation 1, FMR1), 칼륨 칼슘 활성화 채널 서브패밀리 N 멤버 2(Potassium calcium-activated channel subfamily N member 2, KCNN2), 오토안코린(Otoancorin) 난독증 관련 단백질(Dyslexia-associated protein, KIAA0319), Rho 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 40(Rho guanine nucleotide exchange factor 40, ARHGEF40), 아데닐레이트 사이클라제 10(Adenylate cyclase 10, ADCY10), 3B를 포함하는 피브로넥틴 III 형 도메인(Fibronectin type III domain containing 3B, FNDC3B), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA), 징크 핑거 단백질142(Zinc finger protein 142), (Ryanodine receptor 1, RYR1) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 중간 섬유 관련 물질은 케라틴 10(Keratin 10, Keratin, type I cytoskeletal 10), 케라틴 1(Keratin 1, Keratin, type II cytoskeletal 1), 케라틴 14(Keratin 14), 비멘틴(Vimentin), 케라틴 75(Keratin 75), 케라틴 5(Keratin 5), 케라틴 6A(Keratin 6A), 케라틴 42(Keratin 42), 케라틴 4(Keratin 4), 케라틴 9(Keratin 9), 케라틴 24(Keratin 24), 케라틴 2(Keratin 2, Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal), 케라틴 78(Keratin 78), 케라틴 72(Keratin 72) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 효소 관련 물질은 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase, MDH1), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), ATP 신타제 서브유닛 d(ATP synthase subunit d, mitochondrial, ATP5PD), 니코티 네이트-뉴클레오티드 디포스포릴라제(Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase [carboxylating], QPRT), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), TBK1 결합 단백질 1(TBK1 binding protein 1, TBKBP1), 단백질 포스파타제 1 조절자 서브유닛(Protein phosphatase 1 regulatory subunit, PPP1R12C), 아데닐릴 시클라제 10(Adenylate cyclase 10, ADCY10), 시트론 rho-상호작용 세린/트레오닌 키나아제(Citron rho-interacting serine/threonine kinase, CIT), DNA-의존 단백질 키나아제 촉매 서브유닛(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit, PRKDC) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 양막유래 줄기세포-조정배지는 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin)을 필수성분으로 포함한다.
이 때, 상기 아포지단백(Apolipoprotein)은 아포 E 지단백(Apolipoprotein E) 또는/및 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I) 일 수 있다. 또한, 상기 알부민(albumin)은 혈청 알부민(serum albumin)일 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 추가로 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA) 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 아포지단백(Apolipoprotein) 중 특히, 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I)은 정자의 능력(sperm capacitation)과 운동성(motility)에 관여하고, 아포 E 지단백(Apolipoprotein E)은 항산화 활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Mol Vis. 2007 Sep 18;13: 1711-21).
상기 티오레독신(thioredoxin)은 항산화 작용 및 생식 능력에 중요한 물질로 알려져 있다(Eur J Biochem. 2000 Oct;267(20):6102-9;, Cell Growth Differ . 1995 Dec;6(12):1643-50;, Fertil Steril . 1996 Dec;66(6):1012-7).
상기 혈청 알부민(serum albumin)도 생식 능력 향상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Cryobiology. 1993 Aug;30(4):423-31). 또한, 동결보존 후 해동시, 운동성을 강화하고 정자 형태를 보호하고 원형질막, 첨체 및 DNA의 완전성을 보호하는 것으로 알려져 있다(Acta Vet. Brno 2007, 76, 383-390;, Cryobiology . 2013 Aug;67(1):1-6).
상기 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1)는 금속단백질분해효소를 억제하고, 이는 다양한 세포들의 세포 증식을 촉진할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 세포사멸을 방지하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB)은 세포의 세포질에서 가교 네트워크(cross-linked networks)를 형성하는 필라멘트를 생성한다. 액틴은 세포 운동성(cell motility) 및 수축(contraction) 등에 관여한다. 또한, 액틴은 유전자 전사 및 손상된 DNA 복구를 조절하는 것으로 알려져 있다.
상기 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA)는 APAF1의 발현을 조절하는 것으로, 스트레스가 유발된(stress-induced) 세포 사멸 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 UACA는 세 가지 경로인, apoptosome 상향 조절(up-regulation), LGALS3/galectin-3 하향 조절(down-regulation) 및 NF-kappa-B 비활성화를 조절하여 세포사멸을 촉진한다. 또한, 이소액틴 역학을 조절하여 세포성장 및 운동성(motility)에 필요한 형태학적인 변화를 조절한다. 뿐만 아니라, UACA는 ARF6와 상호 작용(interaction)하여 손상 후 세포의 형태와 운동성을 조절할 수 있다.
특히, 상기 양막유래 줄기세포가 양막유래 중간엽 줄기세포일 경우, 중간엽줄기세포의 특성상 엑소좀을 더 분비할 수 있다.
상기 엑소좀은 소포체의 일종으로 내부에 단백질, 지질, 핵산 등 다양한 종류의 물질을 포함하고 있어 세포간 정보전달에 중요한 역할을 한다.
그래서 양막유래 중간엽줄기세포-조정배지는 양막유래 중간엽줄기세포가 분비하는 성장인자, 세포외기질 성분, 항산화 물질, 대사산물뿐만 아니라 엑소좀을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 엑소좀 내부 또는 엑소좀이 분비하는 다양한 성장인자, 단백질, 지질, 핵산 등을 더 포함할 수 있다.
상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 인간을 포함한 포유류의 양막에서 유래한 줄기세포에서 수득된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 포유류는 개, 말, 소, 토끼, 너구리, 여우, 사슴, 양, 당나귀, 돼지, 침팬지, 원숭이 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예에서, 본 출원의 상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지일 수 있다.
예를 들어, 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin)을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA)을 포함할 수 있다.
다른 예를 들어, 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 케라틴 10(Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin10) 케라틴 1(Keratin, type II cytoskeletal 1, Keratin 1), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, COL3A1), 티오레독신(Thioredoxin), 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 이와츠(YWHAZ), LOC477072, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), 콜라겐 알파 1 체인(Collagen alpha-1(I) chain, COL1A1), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 케라틴 78(Keratin 78, KRT78), LOC475521, 케라틴 72(Keratin 72, KRT72), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 아넥신 A2(Annexin A2, ANXA2), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1)을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 케라틴 10(Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin10) 케라틴 1(Keratin, type II cytoskeletal 1, Keratin 1), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, COL3A1), 티오레독신(Thioredoxin), 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 이와츠(YWHAZ), LOC477072, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), 콜라겐 알파 1 체인(Collagen alpha-1(I) chain, COL1A1), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 케라틴 78(Keratin 78, KRT78), LOC475521, 케라틴 72(Keratin 72, KRT72), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 아넥신 A2(Annexin A2, ANXA2), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1), 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 알부민(albumin), 티오레독신(thioredoxin) 을 포함할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 개과 동물의 양막유래 줄기세포-조정배지는 케라틴 10(Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin10) 케라틴 1(Keratin, type II cytoskeletal 1, Keratin 1), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, COL3A1), 티오레독신(Thioredoxin), 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 이와츠(YWHAZ), LOC477072, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), 콜라겐 알파 1 체인(Collagen alpha-1(I) chain, COL1A1), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 케라틴 78(Keratin 78, KRT78), LOC475521, 케라틴 72(Keratin 72, KRT72), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 아넥신 A2(Annexin A2, ANXA2), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1), 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 알부민(albumin), 티오레독신(thioredoxin), 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA)을 포함할 수 있다.
상기 정액 동결보호용 조성물에 포함된 ASC-CM은 정자의 다양한 특성을 향상시킬 수 있다.
상기 다양한 특성은 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 ASC-CM이 정자의 다양한 특성을 향상시킬 수 있는 것은 ASC-CM내에 양막유래 줄기세포가 분비한 다양한 물질들이 포함되어 있기 때문일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 개의 양막유래 중간엽 줄기세포-조정배지의 단백질 분석 결과를 [표 2]에 도시하였다
실시예 1-3의 표 2를 통해, 본 출원의 개의 양막유래 중간엽 줄기세포-조정배지 내에 아포 E 지단백(Apolipoprotein E), 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 혈청 알부민(serum albumin), 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA) 등이 포함되어 있음을 알 수 있다.
이를 통해, 본 출원의 개과 동물의 정액 동결보호용 조성물에 포함되어 있는 개의 양막유래 줄기세포-조정배지에 정자의 운동성, 생존성, 막 온전성, 등에 관여하는 아포 E 지단백(Apolipoprotein E), 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 혈청 알부민(serum albumin), 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA) 등이 포함되어 있음으로써,
개과 동물의 정액 동결시, 정자의 운동성, 생존성, 막 온전성, 미토콘드리아 활성 등에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다.
동결보호제
상기 동결보호제는 세포의 고유한 형태, 특성 등을 유지하면서 세포를 보호할 수 있는 물질로, 동결보호시 사용된다.
동결보존의 원리는 세포의 고유한 형태, 특성 등 유지하면서 내부의 수분을 동결보호제(cryoprotectant)의 삼투압 원리를 이용하여 점진적으로 제거하고, 이로 인해 얼음 결정을 최소화하여 세포를 보호하는 것이다.
상기 동결보호제는 원정액(희석되지 않은 원액)이 희석액, 항산화제 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 희석액은 원정액을 희석할 수 있는 물질을 의미한다.
상기 희석액은 난황, 글리세롤, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 증류수 등을 포함하는 완충액이 될 수 있으나 이에 제한하지 않는다. 또한, 이들 각 성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.
상기 항산화제는 세포내에서 발생되는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 흡착하여 제거할 수 있는 물질을 의미한다. 정자를 동결보존하기 위하여, 체외에서 작업할 경우에는 체내보다도 높은 농도의 산소에 노출되기 때문에, 과량의 활성산소가 생성되고, 생성된 활성산소는 산화성 스트레스를 유발하여, 미토콘드리아의 호흡 억제, 세포막의 유동성 감소, 각종 효소의 불활성화 및 DNA와 RNA의 손상 등의 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 항산화제는 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, β-ME), 글루타치온(Glutathione, GSH), 아스코르브산(ascorbic acid), 비타민 E, 베타카로틴, 라이코펜, 코엔자임 Q-10(coenzyme Q-10), 셀레늄, 크롬, 마그네슘 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 동결보호제는 증류수(distilled water), 트리스(히드록시메틸)아미노메테인(tris (hydroxymethyl) aminomethane), 시트르산(citric acid), 프록토스(fructose), 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate), 난황(egg yolk), 글리세롤(glycerol)을 포함할 수 있다.
일 실시예로, 상기 동결보호제는 54% 트리스-익스텐더 1:1(v/v) - 증류수(distilled water), 트리스(히드록시메틸)아미노메테인(tris (hydroxymethyl) aminomethane) 24 g/L, 시트르산(citric acid) 14 g/L, 프록토스(fructose) 8 g/L, 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate) 0.15 g/L; pH 6.6, 290 mOsm - 40% (v/v) 난황(egg yolk), 6% (v/v) 글리세롤(glycerol)을 더 포함할 수 있다.
일 실시예로, 본 출원의 정액 동결용 조성물은,
적어도 하나 이상의 동결보호제; 및
아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin)을 포함하는 양막유래 줄기세포-조정배지(ASC-CM, amniotic membrane derived Stem Cell-conditioned media);
를 포함하고,
상기 ASC-CM는 양막유래 줄기세포를 배양한 배양액이고,
이 때, 상기 ASC-CM는 양막유래 줄기세포를 포함하고 있지 않는 것을 특징으로 하는 조성물일 수 있다.
본 출원의 정액 동결보호용 조성물은 일 구체예에서, 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin), 난황(egg yolk), 글리세롤(glycerol)을 포함할 수 있다.
이 때, 정액 동결보호용 조성물은 다른 구체예에서, 케라틴 10(Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin10) 케라틴 1(Keratin, type II cytoskeletal 1, Keratin 1), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, COL3A1), 티오레독신(Thioredoxin), 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 이와츠(YWHAZ), LOC477072, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), 콜라겐 알파 1 체인(Collagen alpha-1(I) chain, COL1A1), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 케라틴 78(Keratin 78, KRT78), LOC475521, 케라틴 72(Keratin 72, KRT72), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 아넥신 A2(Annexin A2, ANXA2), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1)을 더 포함할 수 있다.
또한, 정액 동결보호용 조성물은 또 다른 구체예에서, 증류수(distilled water), 트리스(히드록시메틸)아미노메테인(tris (hydroxymethyl) aminomethane), 시트르산(citric acid), 프록토스(fructose), 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate), 난황(egg yolk), 글리세롤(glycerol)를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 정액 동결보호용 조성물은 정액 동결에 있어서, 삼투압의 차이, 저온 스트레스 등에 의해 정자의 손상을 최소화 또는/및 정액의 동결-융해시 신선한 정자(fresh sperm)에 비해 운동력, 생존력, 세포막 온전성, 수정능 등이 감소하지 않게 양막유래 줄기세포-조정배지 또는/및 동결보호제를 적정 농도, 비율 등으로 포함될 수 있다.
정액동결시 정액 동결보호용 조성물의 구성과 농도, 비율 등이 정자의 특성(예를 들어, 운동성, 생존능 등)을 유지하는데 중요하게 작용할 수 있다.
예를 들어, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지(ASC-CM)는 상기 정액 동결보호용 조성물의 최종 중량에 대해 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 포함될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 본 출원의 상기 ASC-CM은 상기 정액 동결보호용 조성물의 최종 중량에 대해 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, 75%, 100% 포함될 수 있다.
구체적인 실시예로, 본 출원의 상기 ASC-CM은 상기 정액 동결보호용 조성물의 최종 중량에 대해 5% 내지 15% 포함될 수 있다.
더욱 구체적인 실시예로, 본 출원의 상기 ASC-CM은 상기 정액 동결보호용 조성물의 최종 중량에 대해 10% 포함될 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제는 5:95, 10:90, 15:75, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 실시예로, 개과 동물의 ASC-CM은 상기 정액 동결보호용 조성물 내에 어느 정도의 중량으로 포함되어야 정자의 특성을 향상시킬 수 있는지 확인한 결과가 실시예 2에 기재되어 있다.
실시예 2를 통해, 고농도(25%, 50%, 75%, 100%)의 ASC-CM을 포함하는 정액 동결보호용 조성물에 비해, 저농도(5%, 10%, 15%)의 ASC-CM을 포함하는 정액 동결보호용 조성물에서 정자의 운동성 및 생존성 등이 향상됨을 알 수 있다.
특히, 저농도 그룹 중에서도 10%의 ASC-CM이 포함된 정액 동결보호용 조성물을 이용하였을 때, 정자의 운동성 및 생존성 등에 가장 효과적임을 알 수 있다.
또한, 상기 10%의 ASC-CM이 포함된 조성물을 이용하여 개과 동물의 정액을 동결한 뒤 해동(또는 융해)한 정자는 정액을 동결한 뒤 융해한 정자보다 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성 등이 개선되는 효과가 발생될 수 있음을 실시예 3을 통해 알 수 있다.
이러한 개선 효과는, 상기 조성물 내에 있는 양막유래 줄기세포-조정배지에 양막유래 줄기세포가 분비하는 물질이 포함되어 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성 등에 영향을 미쳐 정액을 동결한 뒤 융해하더라도 정자의 다양한 특성을 감소시키지 않게 하는 것일 수 있다.
따라서, 본 출원 실시예 2 및 3을 통해 상기 조성물 최종 중량에 대하여 양막유래 줄기세포-조정배지가 10% 포함되었을 때, 개과 동물의 정액동결보호제로써 동결-융해 또는 냉장된 개의 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성 등이 향상되는 것을 알 수 있다.
구체적으로, 상기에서 설명한 양막유래 줄기세포-조정배지 내에 다양한 단백질 중, 정자의 운동성, 생식능력, 첨체 온전성, 막 보존성 등에 관여하는 아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin) 등과 같은 물질들이 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성 등이 영향을 미쳐 향상되는 것일 수 있다.
상기 정액 동결 보호용 조성물은 동결 보호용 용기를 더 포함하여 정액 동결용 키트로 제공될 수 있다.
상기 동결 보호용 용기는 동결보호용 튜브, 바이알 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 정액 동결보호용 조성물은 정액 동결방법에 사용될 수 있다.
상기 정액 동결방법은 정액을 상기 정액 동결보호용 조성물로 동결하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 정액은 음경수압법, 수지마찰법 등으로 수득할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 동결은 액체질소를 이용하는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
3. 정액 동결보호용 조성물 제조방법
본 출원의 또 다른 태양은 상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 포함하는 정액 동결보호용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 정액 동결보호용 조성물을 제조하는 방법은,
양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;
상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계; 및
상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 혼합하는 단계;
를 포함한다.
상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계;
에 대한 설명은 앞에서 설명한 바와 동일하다(1. 양막유래 줄기세포- 조정배지 제조방법 참조).
상기 양막유래 줄기세포-조정배지(ASC-CM) 및 동결보호제를 혼합하는 단계;는 정액 동결보호시, 동결보호제만을 사용하였을 때 독성 등으로 인한 정자의 손상을 최소화하고자 하기 위함이며, 나아가 정자의 동결-해동 후, 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성이 신선한 정자(fresh sperm)에 비해 감소되지 않도록 하기 위해 적정하게 혼합하는 과정이다.
상기 혼합시, 상기 동결보호제 및 상기 ASC-CM를 혼합하는 순서는 제한하지 않는다.
또한, 상기 혼합하는 단계;에 상기 동결보호제 및 상기 ASC-CM의 혼합이 잘 되도록 도와주는 물질을 추가적으로 더 포함하거나 또는 정자의 다양한 특성을 향상시킬 수 있는 물질을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 혼합하는 단계;는 상기 동결보호제 및 상기 ASC-CM의 혼합이 잘 되도록 도와주는 장치를 이용하여 혼합할 수 있다.
상기 혼합시 상기 동결보호제 또는/및 상기 ASC-CM을 특정비율, 농도 등으로 혼합될 수 있다.
상기 특정비율, 농도 등에 대한 설명은 앞에서 설명한 바와 동일하다(2. 정액 동결보호용 조성물 참조).
예를 들어, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지가 상기 조성물 최종 중량에 대하여 5% 내지 15% 포함될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 정액 동결용 조성물은 동결보호제만을 사용하는 종래기술에 비해, i)동결보호제와 양막유래 줄기세포가 분비하는 물질을 포함하고 있는 양막유래 줄기세포-조정배지를 혼합한 정액 동결용 조성물로서, 상대적으로 독성이 적고, ii)나아가 정자의 동결-해동 시, 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성이 향상된다는 점에서 종래 기술과는 차별성을 가진다.
[발명의 실시를 위한 형태]
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
달리 명시하지 않는 한, 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
실험 디자인
실험 1: cAMSC의 특성 분석
유세포 분석 및 다능성 유전자 발현의 확인을 통해, cAMSC의 특성을 분석하였다.
실험 2: cAMSC-CM의 농도변화에 따른 정자 운동 매개 변수 및 생존력 평가
실험 1에서 분석한 cAMSC으로 CM을 제조하여, 이의 농도변화에 따른 정자 운동 매개 변수 및 생존력을 평가하여 cAMSC-CM의 최적 농도를 탐색하였다.
실험 3: 최적농도의 cAMSC-CM을 이용한 개 정액 동결보존 효과 평가
실험 2에서 분석된 최적농도의 cAMSC-CM을 이용하여, 개 정액 동결보존 효과를 확인하였다.
실험재료 및 방법
세포 배양(cell culture)
개 양막 유래 중간엽 줄기세포(cAMSC)와 그 배양액은 Naturecell Co., Ltd., Seoul, Korea에서 구입하였다. 간략히 설명하면, cAMSC는 혈청과 항생제를 넣은 RCMEP 배지(Stem Cell Research Center, Biostar, Seoul, Korea)를 사용하여 조직을 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2를 가지는 환경에서 배양되었다. cAMSC의 특성분석에 사용된 세포는 90% confluency에서 계대 2까지 배양하였고, 개 양막 유래 중간엽 줄기 세포-조정배지(cAMSC-CM)를 만드는 데 사용된 세포는 계대 3까지 배양하였다.
동결되어 있는 개 양막 유래 중간엽 줄기세포 해동
개 양막 유래 중간엽 줄기세포를 액체질소탱크에서 꺼내어 37
Figure 112020126893050-pat00001
로 유지되는 항온수조에서 녹인 후 15 ml 튜브에서 RPMI 배지(양막줄기세포 조정 배지; ㈜네이처셀) 9 ml과 혼합하였다. 튜브를 원심분리기에 넣고 1000 rpm에서 3 분간 원심분리하였다.
원심분리한 튜브의 상층액을 버리고 RPMI 배지 5 ml을 첨가하여 마이크로피펫으로 섞어주었다. 튜브를 원심분리기에 넣고 1500 rpm에서 2 분간 원심분리하였다. 원심분리한 튜브의 상층액을 버리고 RPMI 배지를 첨가하여 섞어주었다.
달리 명시되지 않는 한 모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich (미국 미주리 주 세인트 루이스)에서 구입하였다.
개 양막 유래 중간엽 줄기세포 배양
양막줄기세포는 배양접시 위에서 부착하여 배양되었고, 39
Figure 112020126893050-pat00002
2 배양기에서 배양하였다. 배지교환은 약 24시간 간격으로 이루어졌다. 배지교환을 위하여 PBS(phosphate buffered saline; Gibco) 용액으로 dish를 세척하였고, 다시 RPMI 배지를 넣어주었다.
개 양막 유래 중간엽 줄기세포 계대배양
배양된 개 양막줄기세포를 계대배양하기 위해, 배양기에서 배양접시를 꺼내서 상층액을 제거하였다. PBS(phosphate buffered saline; Gibco) 용액으로 dish를 세척하였다. dish에 trypsin(Gibco)을 넣고 2분 30초 간 37
Figure 112020126893050-pat00003
배양기에 넣었다. 배양기에서 꺼낸 후 현미경으로 세포가 dish에서 떨어졌는지를 확인하였다. dish에 trypsin과 동량의 RPMI 배지를 넣어주었다. dish 내용물을 모두 튜브로 옮기고 1500 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 RPMI 배지를 넣어 펠렛을 풀어준 뒤 1500 rpm으로 2 분간 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고 RPMI 배지를 넣어 펠렛을 풀어준 뒤 dish에 적정량의 혼합물을 옮긴 뒤 배양기에서 배양하였다.
유세포 분석(Flow Cytometric Analysis)
cAMSC의 면역표현형(immunophenotype)을 결정하기 위해, Fluorescence-activated cell sorting (FACS)을 사용하였다.
세포를 세포를 인산염이 함유된 완충용액(PBS; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 2회 세척하였다. 이후, TrypLE-Express (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 부착된 세포를 떼어냈다. 세포를 PBS (Thermo Fisher Scientific)로 2회 세척하고 세포 카운팅(cell counting)하여 96웰 플레이트 (1Х105 cells/100 μL per well)에 나누어 담았다.
각 웰에서 5μL의 fluorochrome-접합(conjugated) 항체 또는 fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 phycoerythrin (PE)이 포함된 이소 타입 대조 항체
-CD29 모노클로날 항체-PE (Invitrogen, CA, Carlsbad, USA), CD44 모노클로 날 항체 -FITC, CD90 (Thy-1) 모노클로날 항체-PE, CD34 모노클로날 항체-PE, CD45 모노클로날 항체-FITC, Rat IgG2a kappa Isotype Control-FITC, Rat IgG2b kappa Isotype Control-PE, Mouse IgG1 kappa Isotype Control-PE, Rat IgG2b kappa Isotype Control-FITC(eBioscience, CA, San Diego, USA)-
를 세포 현탁액에 분취하여 추가하였다.
이를 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 원심분리(1500rpm / 3분)하여 PBS로 2회 세척하였다. 세포는 5mL의 PBS가 있는 둥근 튜브에 옮겨 FACSCalibur??를 사용하여 분석하였다. Cell Quest 소프트웨어 (BD Biosciences, CA, San Jose, USA)를 사용하여 CD (Cluster of Dierentiation) 마커 백분율을 계산하였다. 각 항체에 대해 10,000 개의 세포를 사용하였다.
정량적 중합효소 연쇄반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)
다능성(Pluripoten) 유전자 발현은 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR)로 확인하였다.
요약하면, cAMSC의 계대 2에서 RNeasy Mini 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용 RNA를 추출하였다.
이후, DiaStar 2X RT Pre-Mix (Solgent, Daejeon, Korea)와 Random Hexamers (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 RNA 역전사(reverse transcription)로 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA를 PCR로 증폭하고 Agilent ariaMX Real-Time PCR (Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다.
qPCR에 사용되는 프라이머는 다음과 같다(표 1).
Gene Primer Sequence
(5＇-3＇) 		Product size(bp) Temperature
(℃) 		NCBI Accession
No.
β-ACT Forward GCTACGTCGCCCTGGACTTC
(SEQ ID No. 1)		 86 60 AF021873.2
Reverse GCCCGTCGGGTAGTTCGTAG
(SEQ ID No. 2)
Oct3/4 Forward CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGA
(SEQ ID No. 3)		 114 60 XM_538830
Reverse CCACACTCGGACCACATCCTTC
(SEQ ID No. 4)
Sox2 Forward CAGACCTACATGAACGGCTCGC
(SEQ ID No. 5)		 147 60 XM_005639752
Reverse CCTGGAGTGGGAGGAGGAGGTA
(SEQ ID No. 6)
Nanog Forward GAATAACCCGAATTGGAGCA
(SEQ ID No. 7)		 125 60 XM_022411387
Reverse AGTTGTGGAGCGGATTGTTC
(SEQ ID No. 8)
β-ACT은 내인성 대조군(endogenous control)으로 사용하였다. 겔 전기 영동을 위해 각 real-time PCR 산물 10μL를 웰에 넣고 20분 동안 1% 아가로스 겔 전기 영동을 실시하였다.
조정 배지 준비(Conditioned Medium Preparation)
cAMSC는 계대 3에서 80% confluency에 도달할 때까지 배양 배지에서 유지되었습니다. 배양 배지를 혈청이 없는 Dulbecco's Modified Eagle Medium로 교체하여, 세포를 영양결핍(cell starvation) 시켰습니다.
48시간 후, CM을 회수하고 죽은 세포 등 조정배지 내 데브리스(debris)를 제거하기 위하여 회수한 상층액을 원심분리(2000g / 30분)하고 0.22m 필터로 여과하였다. 수득한 CM은 나누어서 -80℃에 보관하였다. 사용 직전에 37℃ 항온수조에서 해동 후 사용하였다.
정액 수득을 위한 동물(Animal Use for Semen Collection)
연구에 사용된 모든 개는 개별 케이지에 보관하였다. 개들은 상업적인 성인 건조 식품을 먹였고, 물은 무제한으로 제공하였다.
모든 실험과 연구는 서울대학교 기관 동물 관리 위원회(IACUC)에서 발간한 "실험 동물 관리 및 사용 가이드"(승인 번호: SNU-180731-2-1 및 SNU-200409-3)의 권고 사항에 따라 수행하였다. 비글 개에서 일주일에 두 번 수압법(digital manipulation)을 사용하여 정액을 얻었으며, 사정의 두 번째 부분만 수집하여 이용하였다.
80 % 이상의 운동성 및 최소 4/5의 질량 운동성 (0-5 척도)을 가진 것만 선택하여, 적절한 농도(>300 Х 106 sperm/mL)로 샘플을 수득하였다.
5마리의 수컷으로부터 수컷당 1회의 사정을 얻었고, 합친 정액을 사용하여 4개의 독립적인 반복을 수행하였다.
정액 동결(Semen Cryopreservation)
모아진 정액을 Tris-extender로 희석, 세척 및 원심 분리하였다.
먼저 모아진 정액을 Tris-extender 1 : 1 (v / v)-증류수, 트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 24g / L, 시트르산 14g / L, 과당 8g / L, 카나마이신 설페이트 0.15g / L로 희석했습니다. ; pH 6.6, 290 mOsm-700g에서 1 분 동안 원심 분리하였다.
모아진 정액을 Tris-extender 1:1 (v/v)
― 증류수(distilled water), tris (hydroxymethyl) aminomethane 24 g/L, citric acid 14 g/L, fructose 8 g/L, kanamycin sulfate 0.15 g/L; pH 6.6, 290 mOsm ―
으로 희석했고, 이를 원심분리(700Х g, 1분)하였다. 상층액을 수집하고 원심분리(500g / 5분)하여, 하층액(pellet)만 Tris-extender에 재현탁하여 200 Х 106 sperm cells/mL 농도가 되도록 하였다.
다양한 농도의 CM(0 %, 5 %, 10 % 및 15 %)와 동결버퍼를 혼합하였다 - 동결버퍼의 조성: 54% (v/v) Tris-extender, 40% (v/v) egg yolk 및 6% (v/v) glycerol -.
이후, 샘플을 4℃에서 4~6시간 동안 차갑게 했다.
샘플을 0.5 μL 스트로(straws)(Minitube, Tiefenbach, Germany)에 넣고, 4℃에서 1시간 동안 보관하여 평형화(equilibration)하였다. 그런 다음 액체질소 (LN2) 5cm 지점에서 15분 동안 동결시킨 후 LN2 탱크로 옮겼다.
정액 해동(Semen Thawing)
액체질소에서 스트로를 꺼냈다. 가능한 빠르게 37℃ 항온수조에 30초간 넣었다. 스트로의 끝부분을 잘라 튜브에 내용물을 넣었다. 2.5 ml 버퍼 1을 조금씩 넣고 30초간 흔들어 주었다. 2.5 ml 버퍼 1을 모두 넣으면 정자의 분석을 실시하였다.
CM 조성의 단백질체 분석(Proteomic Analysis of CM Composition)
cAMSC-CM의 단백질 조성을 확인하고 정량화하기 위해, 1 차원 전기 영동-액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석기(1-DE-LC-MS / MS) 시스템)가 결합된 Q Exactive Plus 질량 분석기(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다.
간단히 설명하자면, cAMSC-CM을 수득하고 80 %로 포화된 ammonium sulfate (AS)을 사용하여 단백질 정제를 하였다. CM은 침전을 위해, 원심분리(18,000rpm / 1시간)하고, 20mM tris-HCl pH 8.0을 사용하여 용해시켜 Viva spin (50kD)을 사용하여 AS를 제거 하였다. 단백질 용해물은 트립신으로 in-gel 분해 후, 12 % sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel 전기영동 (12 % SDS-PAGE)을 사용하여 분리하였다.
MASCOT 소프트웨어(Matrix Science Inc., MA, Boston, USA)를 사용하여 단백질을 식별하고 지수적으로 변형된 단백질을 생성하였다. abundance index (emPAI), emPAI 값에 따라 mole %를 계산하였다.
수득한 데이터는 UniProtKB (UniProt Knowledgebase) 데이터베이스 (Canis_lupus)를 사용하여 분석하였다. 확인된 단백질은 기능에 따라 그룹별로 분류되었으며, cAMSC-CM에 존재하는 각 단백질 그룹에 대한 백분율을 계산했습니다.
정자 운동 매개변수 분석(Sperm Kinetic Parameters Analysis)
정자 분석 영상 시스템 (FSA2011 premium edition version 2011; Medical Supply, Gangwon, Korea)을 사용하여 정자 운동성(sperm motility), 곡선 속도 (curvilinear velocity, VCL), 직선 속도(straight-line velocity, VSL), 평균 경로 속도(average path velocity, VAP), 선형성(linearity, LIN), 직진도 (straightness, 또는 VSL/VAP) (STR), 측면 머리의 진폭 (amplitude of lateral head, ALH) 및 생존성 매개 변수를 평가했다.
정자 운동 매개변수는 컴퓨터-보조 정자 분석기(CASA; Sperm Class Analyzer® System 버전 6.4.0.93, Microptic, Barcelona, Spain)를 사용하여 분석하였다. 이 시스템에는 10배 위상차 대물 렌즈와 37℃의 가열 스테이지가 있는 Nikon Eclipse ci-L 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)이 포함되어 있다.
분석시, Leja 20μm 챔버 슬라이드(Leja, Gynotec Malden, Nieuw Vennep, 네덜란드)를 사용하였고, 프레임 속도는 25 frames/s로 설정하였다. 정자 운동성, 진행성 운동성, VCL, VSL, VAP, LIN, STR, ALH와 같은 다양한 매개 변수와 신속하고 움직이지 않는 정자의 비율을 분석하였다.
에오신-니그로신 염색(Eosin-Nigrosin Staining)
에오신-니그로신 염색은 각 그룹에서 살아있는 정자 세포의 비율과 꼬리 형태 결함을 검출하는 데 사용하였다.
간단히 설명하면, 냉동-해동된 샘플을 세척하고 정자 펠렛(pellet) 10 μL에 동일한 양의 에오신과 니그로신을 혼합하여 따뜻한 유리 슬라이드 위에 도말(smear) 하였다. 그런 다음 슬라이드를 공기 건조하여 정자를 분석하였다.
각 염색된 도말에 대해, 오일 침지 대물 렌즈 (1000 배율)를 사용하여 광학 현미경 (Eclipse Ts 2, Nikon, Tokyo, Japan)으로 200 개의 정자를 검사했다. 염색되지 않은 정자는 살아있는 것으로 계산하고, 염색된 정자는 죽은 세포로 계산하였다. 결과는 살아있는 정자 세포의 백분율로 표시하였다. 중간 부분이 꼬인 정자는 꼬리가 꼬인 세포로 카운트하고, 중간 부분 또는 꼬리 전체가 구부러진 정자는 구부러진 꼬리를 가진 세포로 카운트하였다.
아닐린 블루 염색(Aniline Blue Staining)
냉동-해동된 샘플을 세척하고, 20μL의 정자 펠렛(pellet)을 유리 슬라이드에 도말 후, 공기 건조하고, 0.2M 인산염(phosphate) 버퍼(pH 7.2)에 3 % 글루타르 알데히드(glutaraldehyde)가 포함된 용액으로 30분 동안 고정하였다.
그런 다음 슬라이드를 4% 아세트산(pH 3.5)과 5% 아닐린 블루 수용액이 혼합된 용액으로 5분 동안 염색하였다.
각 그룹에서 200개의 정자 세포를 광학 현미경(Eclipse Ts 2, Nikon, Tokyo, Japan)의 오일 침지 대물 렌즈 (1000 배율)로 평가하였다.
염색되지 않은 핵을 가진 세포는 정상(mature chromatin)으로 간주하였고, 청색으로 염색된 핵을 가진 세포는 비정상(immature chromatin)으로 간주하였다.
그 결과는 아닐린 블루 양성 정자(abnormal)의 백분율로 표시하였다.
저삼투압 팽창 테스트(Hypo-Osmotic Swelling Test)
정자 세포의 온전한 원형질막을 가진 비율을 평가하기 위해 저삼투 팽창 검사(e hypo-osmotic swelling test, HOST)를 수행하였다.
간략히 설명하면, 100μL의 정자를 900μL의 저삼투압 용액(150-155mOsm)에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다.
그런 다음 정자가 있는 HOST 용액 한 방울을 따뜻한 슬라이드에 놓고 커버를 덮고, 위상차 현미경(Eclipse Ts 2, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 최소 100개의 정자를 카운트하였다. 꼬리가 꼬인 세포는 HOST 양성 정자로 계산하였다.
첨체 평가 테스트(Acrosome Assessment Test)
정자 첨체막(sperm acrosome membrane)은 FITC-PNA(fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut)를 사용하여 분석하였다.
간단히 설명하면, 정액을 유리 슬라이드에 묻히고, 공기 건조하고, 메탄올로 고정하고, 염색하여 anti-fade mounting medium (VECTASHIELD®, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)으로 마운팅하였다.
정자 첨체 막의 온전성(integrity)은 epifluorescence phase-contrast 현미경(Eclipse Ts 2, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였고, 온전한 첨체(strong green fluorescence) 또는 온전하지 않은 첨체(partial or no fluorescence)로 분류하였다.
미토콘트리아 활성 평가(Mitochondria Activity Assessment)
기능성 미토콘드리아가 있는 살아있는 정자 세포의 비율은 형광 염색 로다 민 R123(Rhodamine 123)(Molecular Probes, OR, Eugene, USA) 및 PI(propidium iodide)를 사용하여 평가하였다.
간략히 설명하자면, 200개의 정자를 R123(blue excitation)을 위한 490/515nm의 excitation/barrier 필터, PI(green excitation)를 위한 545/590 nm의 excitation/barrier 필터가 장착된 epifluorescence phase-contrast 현미경(Eclipse Ts 2, Nikon, Tokyo, Japan) 600x 배율로 평가했다.
중간 부분 영역에서 녹색 형광을 나타내고 머리에 적색 형광이 없는 정자 세포는 기능성 미토콘드리아에서 생존 가능한 것으로 간주한 반면, 머리에서 적색 형광을 나타내는 세포는 죽은 것으로 간주하였다.
통계 분석(Statistical Analysis)
분석에 앞서 D'Agostino 및 Pearson 옴니버스 테스트(Pearson omnibus test)를 수행했습니다. 최적 농도 데이터는 Tukey 다중비교 테스트(Tukey's multiple)에 따른 일원 분산 분석(one-way analysis of variance)으로 분석하였다.
각 실험에 대해 4번 반복 수행하였고, GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, CA, San Diego, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 값은 평균± 표준편차(SEM)로 표시하였고, p <0.05 미만의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: cAMSC 및 cAMSC-CM 특성(cAMSC and cAMSC-CM Characterization)
실시예 1-1: 표면 마커의 확인(Confirmation of the Surface Markers)
cAMSC의 유세포 분석은 CD29, CD44 및 CD90 마커의 발현이 높았고(각각 93.73%, 94.28% 및 90.10%), CD34 및 CD45 마커의 발현이 낮았다(각각 0.39% 및 0.35%)(도 4).
따라서 이러한 표면 마커의 발현을 기반으로 cAMSC 세포가 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)임을 알 수 있다.
실시예 1-2: 다능성 유전자 발현의 확인(Confirmation of Pluripotency Genes Expression)
cAMSC의 다능성 유전자의 발현을 분석하기 위해 qPCR 분석을 수행하였다.
qPCR 결과, cAMSC에서 다능성 유전자 Oct3/4, Sox2 및 Nanog의 발현을 확인하였고(도 5), 이는 cAMSC가 다능성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 1-3: cAMSC-CM 프로테옴(cAMSC-CM Proteome)
프로테오믹 분석(proteomic analysis)은 86개의 단백질의 존재 및 발현량을 보여주며(표 2), 이를 카테고리/기능으로 분류하여 표 3에 몰 백분율로 표시하였다.
특히, 19개의 단백질 - Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin, type II cytoskeletal 1, Vimentin, Collagen type III alpha 1 chain, Thioredoxin, Malate dehydrogenase, Triosephosphate isomerase, YWHAZ, LOC477072, Purine nucleoside phosphorylase, Collagen alpha-1(I) chain, Proteasome subunit beta, Keratin 78, LOC475521, Keratin 72, L-lactate dehydrogenase, Annexin A2, Dihydropyrimidinase like 3, Collagen type V alpha 1 chain - 은 난관세포 조정배지 엑소좀 뿐만 아니라, 양막유래 줄기세포에서도 발현하는 단백질임이 확인되었다(표 3)
cAMSC-CM에 중간 필라멘트(Intermediate filaments)가 26%, 세포 대사(Cell metabolism)에 관여하는 다른 유형의 단백질이 21%, 성장 인자(Growth factors)가 18 %, 세포 외 기질 성분(Extra-cellular matrix components)이 15%, 항산화제(Anti-oxidants)가 13% 및 효소(Enzymes)가 7% 있음을 알 수 있다(표 4)
Protein name Gene 발현량 Category / Function
Secreted protein acidic and cysteine rich/Osteonectin SPARC 6.696 Extracellular matrix component, growth factor, anti-apoptosis
●세포 외 기질 (ECM)의 주요 비 구조 단백질 중 하나.
●칼슘과 결합함.
Serum albumin ALB 5.292 ●혈장의 주요 단백질
●물, Ca2 +, Na +, K +, 지방산, 호르몬, 빌리루빈 및 약물에 대한 결합력이 좋음.
●소 혈청 알부민 (BSA)은 일반적으로 정자에 사용되어 운동성 매개 변수 및 항산화 활성을 향상시킴.
Keratin, type I cytoskeletal 10 KRT10 4.536 Intermediate filament
●중간 필라멘트 (IF) 단백질의 수퍼 패밀리에 속하는 I 형 (산성) 사이토 케라틴 패밀리의 구성원
Lumican LUM 4.212 Extra-cellular matrix component, cell proliferation
●몸 전체의 대부분의 중간엽 조직에 분포함.
●콜라겐 원섬유 조직, 각막 투명성, 상피세포 및 조직복구에 관여.
Keratin, type II cytoskeletal 1 KRT1 3.996 Intermediate filament
●세포 내 세포 골격의 중간 필라멘트 (IF)
●인테그린 베타-1 (ITB1) 및 활성화된 단백질 키나제 C 수용체(RACK1 / GNB2L1)에 결합하여 PKC 및 SRC와 같은 키나제의 활성을 조절.
Metalloproteinase inhibitor 1 TIMP1 3.834 Growth factor, glycoprotein, steroidogenesis stimulation, - May have an anti-apoptotic function.
●다양한 세포 유형에서 세포 증식 촉진 가능
●세포 사멸 방지 기능
Insulin like growth factor binding protein 7 IGFBP7 3.780 Growth factor
●조직에서 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)의 가용성을 조절하고 수용체에 대한 IGF 결합을 조절
Apolipoprotein E APOE 3.618 Apolipoprotein, cholesterol metabolism, anti-oxidant
●지질 입자와 결합하는 단백질
●주로 혈장을 통한 장기 간 지질 단백질 매개 지질 전달 기능
Keratin 14 KRT14 3.402 Intermediate filament
●중간 필라멘트 단백질의 유형 I 케라틴 계열에 속함
Actin, cytoplasmic 1 ACTB 3.078 Cell metabolism
●중합하여 세포의 세포질에서 가교 네트워크를 형성하는 필라멘트 생성
●세포 운동성 및 수축에 주요 기능.
●유전자 전사 및 운동성 조절 및 손상된 DNA 복구
Vimentin VIM 2.808 Intermediate filament
●다양한 비상피 세포, 특히 중간엽 세포에서 발견됨.
●핵, 소포체 및 미토콘드리아에 측면 또는 말단에 부착됨.
Keratin 75 KRT75 2.484 Intermediate filament
●상피 세포의 세포질에 중간 크기의 필라멘트 형성
Follistatin like 1 FSTL1 2.268 Extra-cellular matrix component
●세포 증식 및 분화에 대한 일부 성장 인자의 작용을 조절할 수 있음
●헤파린과 결합함
Uncharacterized protein KRT5 Intermediate filament
Collagen type III alpha 1 chain COL3A1 2.214 Extra-cellular matrix component
●피질 발달 조절에 관여
●발달하는 뇌에서 ADGRG1의 주요 리간드 및 ADGRG1에 결합
●ADGRG1을 GNA13 및 가능하면 GNA12에 결합하여 뉴런 이동을 억제하고 RhoA 경로를 활성화함.
Uncharacterized protein KRT6A 1.998 Intermediate filament
●상처 치유에 관여하는 표피 특정 유형 I 각질
●상처 후 난포 각질 세포 활성화에 관여
Thioredoxin TXN 1.620 Anti-oxidant
●활성 중심 디티올을 이황화로 가역적으로 산화시켜 다양한 산화 환원 반응에 참여하고 디티 올-이황화 교환 반응을 촉매
●표적 단백질에서 시스테인 잔기의 가역적 인 S- 니트로 실화 역할
●세포 내 산화 질소 반응에 기여
●산화 질소 (NO)에 반응하여 CASP3의 활성 부위 Cys를 니트로 실화
●카스파 아제 -3 활성 억제
●산화/환원 상태를 통해 전리 방사선 (IR) 세포에서 FOS/JUN AP-1 DNA 결합 활성을 유도하고 AP-1 전사 활성을 자극함.
Uncharacterized protein KRT42 1.566 Intermediate filament
●중간 필라멘트 계열에 속함.
Malate dehydrogenase MDH1 1.512 Enzyme
●크렙스 사이클(Krebs cycle)에 참여
●malate의 oxaloacetate 로의 가역적 변형을 촉매합니다.
Alpha 2-HS glycoprotein AHSG 1.458 Growth factor
●세포 내 이입 촉진
●옵소닉 속성(opsonic properties) 보유
●칼슘 및 바륨 이온에 대한 친화력 있음
GC, vitamin D binding protein GC 1.404 Cell metabolism
●비타민 D 수송 및 저장에 관여
●세포 외 G- 액틴 소거
●염증 및 대 식세포 활성화에서 호중구에 대한 C5 알파의 화학 주성 활성 향상.
Plasminogen activator, urokinase receptor PLAUR 1.404 Cell metabolism
●유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체
Alpha-fetoprotein AFP 1.404 Cell metabolism
●구리, 니켈 및 지방산, 빌리루빈, 혈청 알부민과 결합함
Uncharacterized protein YWHAZ 1.350 Cell metabolism
●일반 및 특수 신호 경로의 넓은 스펙트럼 조절과 관련된 어댑터 단백질
●일반적으로 포스포세린 또는 포스포트레오닌 모티프를 인식하여 다수의 파트너와 결합
●결합은 일반적으로 결합 파트너의 활동을 조절함.
●RAC1에 대한 ARHGEF7 활성, 라멜리포디아 및 막 주름 형성을 유도함.
Apolipoprotein A-I APOA1 1.242 Apolipoprotein, sperm motility, cholesterol metabolism
●조직에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼 라제 (LCAT)의 보조인 자로 작용하여 배설을 위해 조직에서 간으로의 콜레스테롤 역 전달에 참여
●SPAP 복합체의 일부로 정자 운동성을 활성화함.
Uncharacterized protein KRT4 Intermediate filament
Keratin, type I cytoskeletal 9 KRT9 Intermediate filament
Uncharacterized protein LOC477072 1.188 Cell metabolism
●트랜스페린 패밀리에 속함
Triosephosphate isomerase TPI1 1.188 Enzyme
●매우 효율적인 대사 효소
●해당 과정(glycolysis)과 포도당 생성에서 dihydroxyacetone phosphate (DHAP)와 D-glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) 간의 상호 전환을 촉매함.
●단백질, DNA 및 지질을 변형하고 변경할 수 있는 반응성 세포 독성 부산물인 메틸글리 옥살의 생산을 담당.
Purine nucleoside phosphorylase PNP 1.134 Enzyme
●베타-(데옥시) 리보 뉴클레오시드 분자에서 N-글리코시드 결합의 인산화 분해를 촉매
Hemoglobin subunit beta HBB 1.134 Cell metabolism
●폐에서 다양한 말초 조직으로의 산소 수송에 관여
Fibronectin FN1 1.134 Growth factor
●콜라겐, 피브린, 헤파린, DNA, 액틴을 포함한 다양한 화합물과 세포 표면 결합
●세포 부착, 세포 운동성, 옵소닌 화, 상처 치유 및 세포 모양 유지에 관여
Collagen alpha-1(I) chain COL1A1 0.972 Extra-cellular matrix component
●섬유소와 다른 세포 외 기질 분자 사이의 교차 다리 역할을 함
Keratin 24 KRT24 0.972 Intermediate filament
●각질 세포, 태반, 결장 및 비장에서 많이 발현
●흉선과 고환의 낮은 수준에서 발현
ATP synthase subunit d, mitochondrial ATP5PD 0.972 Enzyme
●호흡 사슬의 전자 수송 복합체에 의해 생성되는 막을 가로 지르는 양성자 구배의 존재하에 ADP로부터 ATP를 생성함
Ferritin LOC102154317 0.918 Anti-oxidant
●철분을 가용성, 무독성, 쉽게 구할 수 있는 형태로 저장.
Decorin DCN 0.918 Anti-oxidant
●원 섬유 형성 속도에 영향을 미칠 수 있음.
Uncharacterized protein LGALS3BP 0.864 Extra-cellular matrix component
●인테그린 매개 세포 접착 촉진
●바이러스 및 종양 세포에 대한 숙주 방어를 자극할 수 있음.
Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal KRT2 0.864 Intermediate filament
●발바닥 피부에 표피 장벽을 형성하는 역할을 함.
SAP domain containing ribonucleoprotein SARNP 0.756 Cell metabolism
●단일 가닥 형태에 대해 더 높은 친화 도로 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA를 결합함.
●scaffold/matrix 부착 부위 DNA에 특이 적으로 결합
●단일 가닥 RNA 결합
●DDX39A의 RNA 풀림 활성 향상
●세포 성장, 대사 및 발암의 중요한 전사 또는 번역 제어에 참여함.
Dermatopontin DPT 0.756 Extra-cellular matrix component
●세포 표면 인테그린 결합에 의해 접착을 매개.
●진피 섬유 아세포 세포 표면과 세포 외 기질 환경 사이의 통신 링크 역할을 하고, TGFB1 활동 향상
●세포 증식 억제
●콜라겐 원 섬유 형성을 가속화하고 저온 해리에 대해 콜라겐 원 섬유를 안화 시킴.
Proteasome subunit beta PSMB6 0.702 Cell metabolism
●대부분의 세포 내 단백질의 단백질 분해에 관여하는 20S core proteasome complex의 성분
●다양한 규제 입자와 결합하여 세포 내에서 필수적인 역할
●2 개의 19S 조절 입자와 결합하여 26S 프로 테아좀을 형성하여 유비퀴틴화된 단백질의 ATP 의존적 분해에 참여
Keratin 78 KRT78 0.648 Intermediate filament
●두 가지 유형의 세포 골격 및 미세 섬유 케라틴, I (산성) 및 II (중성에서 염기성).
Uncharacterized protein LOC475521 0.648 Cell metabolism
●Peptidase S1 도메인 함유 단백질로 명명
Keratin 72 KRT72 0.648 Intermediate filament
●중간 필라멘트 계열에 속함.
Nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase [carboxylating] QPRT 0.594 Enzyme
●퀴놀린산(QA)의 이화 작용에 관여
Growth arrest specific 2 GAS2 0.486 Cell metabolism
●카스파아제의 세포사 기질 역할을하여 세포 자멸사에 역할을 할 수 있음
●아폽토시스 동안 절단되고 절단된 형태는 액틴 세포 골격의 극적인 재배열과 영향을 받은 세포의 모양에 강력한 변화를 유도함.
●멤브레인 러플링 공정에 관여.
Olfactory receptor OR6K6 0.486 Cell metabolism
●후각 수용체임.
Olfactory receptor LOC100687010 0.486 Cell metabolism
Lysosomal protein transmembrane 4 beta LAPTM4B 0.486 Cell metabolism
●최적의 리소좀 기능을 위해 필요함. EGF 자극 EGFR 관내 분류 및 분해 차단함.
●반대로 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate와 결합하여 PIP5K1C 상호 작용을 조절하고 HGS 유비퀴틴화를 억제하며 EGFR 분해의 LAPTM4B 억제를 완화함.
●세포 사멸 경로를 제어하기 위해 세라마이드를 결합하고 후기 엔도솜에서 빠져나가는 것을 촉진함.
Fetuin B FETUB 0.486 Growth factor
●난자 수정에 필요한 프로테아제 억제제
●ZP2의 절단을 매개하고 zona pellucida 경화를 유발하는 프로테아제 인 ASTL의 프로테아제 활성을 억제하여 수정 전 조나 펠루시다 경화(zona pellucida hardening)를 방지하는 데 필요함.
L-lactate dehydrogenase LDHA 0.432 Enzyme
●피루베이트에서 (S)-락테이트를 합성하는 하위 경로의 1 단계에 관여함.
L-lactate dehydrogenase LDHB Enzyme
Tropomyosin 1 TPM1 0.486 Cell metabolism
Annexin A2 ANXA2 0.432 Cell metabolism
●음이온 성 인지질에 의해 칼슘에 대한 친 화성이 크게 강화된 칼슘 조절 막 결합 단백질
●높은 친화력으로 두 개의 칼슘 이온을 결합
●열 스트레스 대응에 관여할 수 있음.
●PCSK9 강화 LDLR 분해를 억제하고 번역 메커니즘을 통해 PCSK9 단백질 수준을 감소시킬 수 있지만 PCSK9와의 결합을 위해 LDLR과 경쟁함.
Collagen alpha-2(I) chain COL1A2 0.432 Extra-cellular matrix component
●그룹 I 콜라겐 (원 섬유 형성 콜라겐)의 구성원.
Cellular communication network factor 2 CCN2 0.432 Growth factor
●혈관 내피 세포에서 분비되는 주요 결합 조직 미토 유인제
●섬유아세포 성장 인자 유도 DNA 합성을 강화함.
Thrombospondin 1 THBS1 0.432 Extra-cellular matrix component
●세포간 및 세포간 상호 작용을 매개하는 접착 성 당 단백질
●헤파린과 결합
●적응형 ER 스트레스 반응 인자를 생성하는 활성화 전사 인자 6 알파 (ATF6)와의 상호 작용을 통해 ER 스트레스 반응에서 역할을 함
Biglycan BGN 0.432 Extra-cellular matrix component
●콜라겐 섬유 조립에 관여함.
Serpin family A member 7 SERPINA7 Cell metabolism
Serpin family F member 1 SERPINF1 0.378 Cell metabolism
●serpin 패밀리에 속함
Nerve growth factor receptor NGFR 0.378 Cell metabolism
●신경 세포의 세포 생존 및 세포 사멸을 중재.
●RHOA 비활성화 역할
●인슐린에 대한 반응으로 지방 세포와 골격근 세포에서 GLUT4의 세포 표면으로의 전좌를 조절하는 역할을 함.
Mitogen-activated protein kinase associated protein 1 MAPKAP1 0.342 Cell metabolism
●호르몬 신호에 반응하여 세포 성장과 생존을 조절하는 mTORC2의 서브유닛
●MAPKAP1은 이량체화 및 자가 인산화를 방지하여 MAP3K2를 억제함.
●HRAS 및 KRAS 신호 억제
●ATF2 및 ATF2 매개 전사의 삼투성 스트레스 유발 인산화 향상
●섬모 형성에 관여하며, mTORC2 복합체와 독립적으로 CCDC28B와의 상호 작용을 통해 섬모 길이를 조절함.
Serpin family C member 1 SERPINC1 0.324 Cell metabolism
Uncharacterized protein ZNF385C 0.324 Cell metabolism
Collagen type V alpha 2 chain COL5A2 0.270 Extra-cellular matrix component
●대부분 유비쿼터스 분포의 작은 결합 조직의 구성 요소
●DNA, 헤파란 설페이트, 트롬보스폰딘, 헤파린 및 인슐린에 결합
●조직 특이적 매트릭스 조립의 주요 결정 요인.
Dihydropyrimidinase like 3 DPYSL3 0.270 Enzyme
●클래스 3 세마포린에 의한 신호 전달 및 후속 세포 골격 리모델링에 필요
Fragile X mental retardation 1 FMR1 0.270 Cell metabolism
●히스톤 H2AFX/H2A.x 및 BRCA1 인산화와 같은 ATR 의존적 신호 전달 경로의 조절을 통해 DNA 손상 반응 (DDR) 메커니즘의 제어에 관여.
TBK1 binding protein 1 TBKBP1 0.270 Enzyme
●항 바이러스성 선천면역에 역할을 하는 TBK1과 IKBKE를 구성적으로 결합하는 어댑터 단백질.
Protein phosphatase 1 regulatory subunit PPP1R12C 0.216 Enzyme
●myosin phosphatase 활동을 조절함.
Uncharacterized protein A2M 0.216 Anti-oxidant
Potassium calcium-activated channel subfamily N member 2 KCNN2 0.162 Cell metabolism
●세포 내 칼슘에 의해 활성화되는 전압 독립적 인 칼륨 채널을 형성함. 막 과분극에 따른 활성화.
●과분극 후 시냅스의 느린 성분에 기여하여 신경 흥분성을 조절하는 것으로 생각됨. 채널은 apamin에 의해 차단됨.
Otoancorin OTOA 0.162 Cell metabolism
●접착 분자(adhesion molecule)로 작용함.
KIAA0319 KIAA0319L 0.162 Cell metabolism
●RTN4R과의 상호 작용을 통한 축삭 유도에서 가능한 역할.
Latent transforming growth factor beta binding protein1 LTBP1 0.108 Other, binding protein
●세포 외 공간 저장시 TGF- 베타를 잠복 상태로 유지하여 TGF- 베타 활성화를 조절하는 형질 전환 성장 인자 베타 (TGFB1, TGFB2, TGFB3)의 핵심 조절제
●특히 이황화 결합을 통해 TGF- 베타의 조절 사슬 인 지연 관련 펩티드 (LAP)와 결합하고 TGF- 베타의 인테그린 의존적 활성화를 조절함.
Rho guanine nucleotide exchange factor 40 ARHGEF40 0.108 ell metabolism
●구아닌 뉴클레오타이드 교환인자 (GEF)로 작용함.
Adenylate cyclase 10 ADCY10 0.108 Enzyme, energy metabolism
●신호 분자 cAMP의 형성을 촉매
●세포 중탄산염 및 CO2 수치 변화에 대한 반응을 매개하는 센서 역할을 할 수 있음.
●부고환의 정자 성숙에 필수적인 cAMP 반응 핵 인자를 조절하는 cAMP를 생산하여 포유류 정자 형성에 중요한 역할을 함
●수정 전에 정자가 겪는 성숙 과정인 수용력 유도
●섬모 박동 조절에 관여함.
Collagen type V alpha 1 chain COL5A1 0.108 Extra-cellular matrix component
●그룹 I 콜라겐(원섬유 형성 콜라겐)의 구성원.
Fibronectin type III domain containing 3B FNDC3B 0.108 Cell metabolism
●지방 생성의 양성 조절자(positive regulator)
Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats UACA 0.108 Cell metabolism
●APAF1 발현 조절
●스트레스 유발 세포 사멸 조절에 중요한 역할
●세 가지 경로, apoptosome up-regulation, LGALS3 / galectin-3 down-regulation 및 NF-kappa-B 비활성화를 조절하여 apoptosis를 촉진함.
●proapoptotic stress 후 APAF1의 핵으로의 재분배 조절
●NFKB1을 억제하여 LGALS3의 발현을 하향 조절
●이소 액틴 역학을 조절하여 세포 성장 및 운동성에 필요한 형태학적 변화를 조절함.
●ARF6와의 상호 작용은 손상 후 세포 모양과 운동성을 조절할 수 있음.
Fms related tyrosine kinase 1 FLT1 0.108 Growth factor
●VEGFA, VEGFB 및 PGF에 대한 세포 표면 수용체 역할을 하는 티로신 단백질 키나아제
●배아 혈관계의 발달, 혈관 신생 조절, 세포 생존, 세포 이동, 대 식세포 기능, 화학 주성 및 암세포 침윤에 필수적인 역할을 함.
Zinc finger protein 142 ZNF142 0.108 Cell metabolism
●전사 조절에 관여
Ryanodine receptor 1 RYR1 0.054 Cell metabolism
●sarcoplasmic reticulum에서 세포질로 Ca2 +의 방출을 매개하는 칼슘 채널
●T-tubules 탈분극에 따른 근육 수축 유발에 중요한 역할
●매우 높은 수준의 운동을 반복하면 채널의 개방 가능성이 증가하고 Ca2 +가 세포질로 누출됨.
Citron rho-interacting serine/threonine kinase CIT 0.054 Enzyme
●세포질 분열에 역할
●중앙 스핀들 및 미드 바디에 KIF14 국산화에 필요
●GTP 결합 형태의 RHO 및 RAC에 결합하는 추정 RHO/RAC 이펙터
●세린/트레오닌 단백질 키나아제 활성 표시
●사이 토키네 시스 조절 및 중추 신경계 발달에 중요한 역할
●MYL9/MLC2를 인산화함.
Laminin subunit alpha 3 LAMA3 0.054 Extra-cellular matrix component
●고친화성 수용체를 통해 세포에 결합하는 라미닌은 다른 세포 외 기질 성분과 상호 작용하여 배아 발달 과정에서 세포의 조직으로의 부착, 이동 및 조직을 매개하는 것으로 생각됨.
DNA-dependent protein kinase catalytic subunit PRKDC 0.054 Enzyme
●DNA 손상에 대한 분자 센서 역할을 하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제.
Protein OC-exo
(n=3)		 AmSC-CM
(n=1)		 GN
Keratin, type I cytoskeletal 10 0.041 ± 0.019 4.536 KRT10
Keratin, type II cytoskeletal 1 0.083 ± 0.022 3.996 KRT1
Vimentin 13.929 ± 1.073 2.808 VIM
Collagen type III alpha 1 chain 0.088 ± 0.005 2.214 COL3A1
Thioredoxin 0.086 ± 0.022 1.620 -
Malate dehydrogenase 0.055 ± 0.007 1.512 MDH1
Uncharacterized protein 0.492 ± 0.038 1.350 YWHAZ
Uncharacterized protein 0.006 ± 0.002 1.188 LOC477072
Triosephosphate isomerase 0.530 ± 0.082 1.188 TPI1
Purine nucleoside phosphorylase 0.053 ± 0.012 1.134 PNP
Collagen alpha-1(I) chain 0.255 ± 0.017 0.972 COL1A1
Proteasome subunit beta 0.043 ± 0.001 0.702 PSMB6
Keratin 78 0.047 ± 0.005 0.648 KRT78
Uncharacterized protein 0.033 ± 0.007 0.648 LOC475521
Keratin 72 0.009 ± 0.000 0.648 KRT72
L-lactate dehydrogenase 0.434 ± 0.080 0.432 LDHA
Annexin A2 3.579 ± 0.372 0.432 ANXA2
Dihydropyrimidinase like 3 0.179 ± 0.005 0.270 DPYSL3
Collagen type V alpha 1 chain 0.015 ± 0.005 0.108 COL5A1
Type of Proteins Total Mole Percentage by Type of Proteins (%)
Intermediate filaments 26
Cell metabolism 21
Growth factors 18
Extra-cellular matrix components 15
Anti-oxidants 13
Enzymes 7
실시예 2: cAMSC-CM 최적 농도 결정(Determination of cAMSC-CM Optimal Concentration)
정자의 운동성 및 활력 분석시, cAMSC-CM가 미치는 효과를 알아보기 위하여 양막줄기세포-조정배지를 고농도, 저농도로 나누어 실험하였다.
고농도의 cAMSC-CM는 동결버퍼에 각각 0%(control), 25%, 50%, 75%, 100%로 첨가하여 사용하였다.
저농도의 cAMSC-CM는 동결버퍼에 각각 0%(control), 5%, 10%, 15%로 첨가하여 사용하였다.
실시예 2-1: cAMSC-CM 고농도 그룹
동결버퍼에 cAMSC-CM을 25%, 50% 처리했을 때 동결-융해 정자의 운동성이 대조군과 다르지 않았으나, 보다 높은 농도를 사용한 경우 대조군보다 운동성이 감소한 것을 알 수 있다(표 5).
Group Motility(%) Linearity(%) Vitality (%) ALH(μm) Straightness(%)
Control 21.9 ± 3.2a 17.3 ± 2.2 42.7 ± 5.3 1.2 ± 0.2ab 50.2 ± 1.0
25% 20.2 ± 2.3a 19.2 ± 2.9 47.8 ± 6.5 1.1 ± 0.1a 53.8 ± 3.2
50% 18.9 ± 4.7ab 19.4 ± 4.7 43.2 ± 8.6 1.0 ± 0.3a 54.2 ± 2.9
75% 6.9 ± 2.8bc 9.6 ± 1.2 22.3 ± 2.2 0.4 ± 0.1ab 57.5 ± 2.5
100% 5.6 ± 0.6c 27.2 ± 10.7 50.7 ± 18.8 0.6 ± 0.1a 66.1 ± 8.1
a-c 열(column) 내 유의적으로 다름을 의미 (p ＜ 0.05, 3회 반복); ALH: lateral head displacement.
실시예 2-2: cAMSC-CM 고농도 그룹에서 정자의 세포막 온전성 분석 및 생존성 분석
정자의 세포막 온전성 분석은 Hypo-osmotic swelling test 방법으로 수행하였다.
정액 100 ㎕를 1 ml의 hypo-osmotic swelling 용액(150 mOsmol/kg)과 혼합하였다. 혼합물을 37℃에서 30분간 넣었다. 따뜻하게 데워진 슬라이드 글라스 위에서 정액 10㎕를 올리고 유리덮개로 덮었다. 현미경 하에서 100개의 정자를 세어 정자의 꼬리 모양을 분석하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, Hypo-osmotic swelling test 시험 결과 정자의 꼬리가 말려 있으면 정상, 곧게 뻗어 있으면 손상된 세포막을 가지고 있는 것으로 평가하였다.
정자의 생존석 분석은 eosin-nigrosin 염색을 실시하여 정자 머리 부분의 염색성을 평가하여 분석하였다.
정자의 세포막 온전성 분석시, 고농도의 양막줄기세포-조정배지가 미치는 효과를 알아보기 위하여 동결 버퍼에 양막줄기세포-조정배지를 각각 0%, 25%, 50%, 75%, 100%로 첨가하여 사용하였고, 이의 실험결과는 [표 6]에 도시하였다.
Group no. sperms counted Intact membrane (%) Abnormal membrane (%)
Control 110.0 ± 9.5 43.6 ± 7.0a 56.4 ± 7.0a
25% 117.0 ± 12.3 40.3 ± 6.4ab 59.7 ± 6.4ab
50% 101.3 ± 1.3 39.6 ± 5.4ab 60.4 ± 5.4ab
75% 104.7 ± 4.2 17.6 ± 3.2bc 82.4 ± 3.2bc
100% 97.7 ± 2.3 7.1 ± 2.6c 91.9 ± 1.7c
a-c 열(column) 내 유의적으로 다름을 의미 (p ＜ 0.05, 3회 반복)
표 6의 결과를 통해, 동결보호제에 양막줄기세포-조정배지를 25%, 50% 처리했을 때 세포막의 온전성이 대조군과 다르지 않았으나, 보다 높은 농도를 사용한 경우 대조군보다 세포막 온전성이 감소하였다.
실시예 2-3: cAMSC-CM 저농도 그룹
정자 생존율과 VCL은 5%, 10% 및 15% cAMSC-CM이 처리된 그룹(5% CM, 83.9±2.8% 및 75.4±6.7%;, 10% CM, 90.1±2.8% 및 87.2±8.1%; 15% CM, 86.8±3.5% 및 75.4± 6.7%)에서 더 높았다. 특히, 10% CM이 처리된 그룹은 대조군(각각 80.8±2.0% 및 74.2±4.4%)과 비교하였을 때, 유의하게 더 높았다.
10% CM이 처리된 그룹은 다른 그룹(대조군, 67.3±2.5% 및 4.1±0.1μm;, 5% CM, 72.4±2.5 % 및 4.2±0.3μm)에 비해 운동성(motility)과 ALH이 유의하게 높았다(각각 79.2± 2.6 % 및 4.8±0.3μm)(표 7 및 8).
따라서, cAMSC-CM의 최적 농도를 10%로 선택하였고, 이후 실험도 최적 농도인 10% cAMSC-CM로 수행하였다.
Concentration of CM(%) Motility(%) Viability(%) VCL(μm/s) VSL(μm/s)
0 67.3±2.5 80.8±2.0 74.2±4.4 21.4±1.3
5 72.4±2.5 83.9±2.8 75.4±6.7 20.4±1.0
10 79.2±2.6 90.1±2.8 87.2±8.1 23.8±1.8
15 72.1±3.9 86.8±3.5 75.4±6.7 24.6±3.7
VCL: average curvilinear velocity;, VSL: straight-line velocity
Concentration of CM(%) VAP(μm/s) LIN(%) STR(%) ALH(μm)
0 45.8±2.0 29.0±1.3 47.4±1.7 4.1±0.1
5 46.8±3.1 29.0±1.5 44.1±1.4 4.2±0.3
10 54.0±4.0 31.2±1.6 44.5±1.2 4.8±0.3
15 46.7±4.0 31.6±2.1 46.4±2.3 4.1±0.3
VAP: average path velocity;, LIN: linearity (average ratio of VSL/VCL);
STR: straightness(average value of the ratio VSL/VAP); ALH: amplitude of lateral head
실시예 2-4: cAMSC-CM 저농도 그룹에서 정자의 세포막 온전성 분석 및 생존성 분석
정자의 세포막 온전성 분석시, 최적농도의 양막줄기세포-조정배지가 미치는 효과를 알아보기 위하여 동결버퍼에 양막줄기세포-조정배지를 각각 0%, 10%로 첨가하여 사용하였고, 이의 실험결과는 [표 9]에 도시하였다.
Group Intact membrane (%) Live sperm (%)
Control 48.5 ± 5.3 49.5 ± 3.7a
10% 60.0 ± 9.1 52.1 ± 3.4b
a,b 열(column) 내 유의적으로 다름을 의미 (p ＜ 0.05, 4회 반복)
[표 9]의 결과를 통해, 최적농도 10%의 양막줄기세포-조정배지를 첨가하여 동결-융해 시 세포막 온정성에서는 대조군과 차이가 없었으나, 생존성이 향상되었음을 확인할 수 있었다.
cAMSC-CM를 15%보다 높은 농도로 사용시, 정자의 항상성에 영향을 미쳐 삼투압 환경을 변화시켜 부정적인 영향을 미친 것으로 생각한다.
따라서, 고농도 및 저농도의 cAMSC-CM를 동결버퍼에 처리한 동결보호제에 의한 정자의 운동성 및 생존성 분석결과를 통해, 최적농도는 10%라고 판단하였다.
실시예 3: cAMSC-CM이 정자 냉동 보존에 미치는 영향(cAMSC-CM Effects on Sperm Cryopreservation)
실시예 2에서 고농도 및 저농도의 cAMSC-CM를 동결버퍼에 처리한 동결보호제에 의한 정자의 운동성 및 생존성 분석결과를 통해, 최적농도는 10% 라고 판단하였다.
그래서, 최적농도 10%의 cAMSC-CM를 처리한 실험군에서 동결-해동 시킨 정자의 운동성, 활력, VSL, ALH 등을 확인한 결과는 다음과 같았다.
실시예 3-1: 운동성 및 속도 매개 변수(Motility and Velocity Parameters)
CASA 시스템 결과 운동성과 LIN이 대조군(42.1±2.1% 및47.0±3.4%)에 비해, 10% cAMSC-CM 처리군(54.3±1.9% 및 50.3±3.1%)에서 유의하게 향상되었다(표 10 및 11).
비 이동성 정자(immotile spermatozoa)의 비율은 대조군(57.9±2.1%)과 비교하였을 때, 10% cAMSC-CM 처리군(45.7 ± 1.9 %)에서 유의하게 감소하는 것을 알 수 있다(도 6).
나머지 매개변수는 그룹간에 유의한 차이를 보이지 않았다.
Concentration of CM(%) Motility(%) Progressive
Motility (%) 		VCL(μm/s) VSL(μm/s)
0 42.1±2.1 22.8±3.4 81.5±6.4 49.4±5.6
10 54.3±1.9 26.2±4.2 74.5±7.8 46.3±7.1
VCL: average curvilinear velocity;, VSL: straight-line velocity
Concentration of CM(%) VAP(μm/s) LIN(%) STR(%) ALH(μm)
0 57.2±5.6 47.0±3.4 68.1±2.4 3.1±0.3
10 53.3±7.2 50.3±3.1 70.0±2.2 2.8±0.2
VAP: average path velocity;, LIN: linearity (average ratio of VSL/VCL);
STR: straightness(average value of the ratio VSL/VAP); ALH: amplitude of lateral head
실시예 3-2: Live/Dead 카운트 및 형태학적 평가(Live/Dead Count and Morphology Assessment)
살아있는 정자 세포의 비율은 10% CM 처리군 (55.2±3.0%)이 대조군 (43.9±4.3%)보다 높았다. 그리고, 꼬리가 구부러진 정자(Bent Tail)의 비율은 대조군(3.1±0.7%)보다 10% CM 처리군(1.8±0.6%)에서 더 낮았다. 그러나, 꼬리가 꼬인 세포(Coiled Tail)의 비율은 대조군과 10% CM 처리군 간에 유의한 차이가 없었다(각각, 3.0±1.2% 및 3.0±1.8%) (표 12).
이러한 결과는 cAMSC-CM이 정자 동결보존 동안 항-아폽토시스(anti-apoptotic) 효과가 있을 가능성이 있음을 시사한다.
Concentration of CM(%) Live Sperm Cells(%) Coiled Tail(%) Bent Tail(%)
0 43.9±4.3 3.0±1.2 3.1±0.7
10 55.2±3.0 3.0±1.8 1.8±0.6
실시예 3-3: 염색질 온전성(Chromatin Integrity)
비정상적인 염색질 축합이 염색된 핵을 가진 정자의 비율은 두 그룹간에서 유의한 차이가 없었다(대조군, 34.0±2.9%, 10% CM, 31.0±3.1%) (표 13). 이러한 결과는 cAMSC-CM이 DNA 온전성(DNA integrity)에 대한 보호 효과가 없음을 시사한다.
Concentration of CM(%) Aniline Blue Positive Spermatozoa (%)
0 34.0±2.9
10 31.0±3.1
실시예 3-4: 첨체와 막 온전성 평가(Acrosome and Membrane Integrity Assessment)
온전한 원형질막(intact plasma membrane)을 가지는 정자세포의 비율은 대조군(54.5±2.9%)보다 10% CM처리군(66.5±2.3%)에서 유의하게 높았다(표 14).
FITC-PNA 테스트는 온전한 첨체(Intact Acrosome)를 가진 정자 비율이 두 그룹 간에 유의한 차이가 없었다(대조군, 74.0±4.3%; 10% CM, 76.6±4.0%)(표 14).
Concentration of CM(%) Intact Acrosome (%) Intact Membrane (%)
0 74.0±4.3 54.5±2.9
10 76.6±4.0 66.5±2.3
실시예 3-5: 미토콘드리아 활성 평가(Mitochondria Activity Assessment)
R123 염료는 미토콘드리아 활성을 평가하는 데 사용하였고, PI는 죽은 정자 세포를 염색하는 데 사용하였다. 두 데이터 모두 각 그룹에서 활성 미토콘드리아가 있는 살아있는 정자의 비율을 계산하는데 사용하였다.
미토콘드리아 활성이 대조군(36.4±2.5%)에 비해 10% CM 처리 그룹(49.6±0.7%)에서 크게 향상되었다(도 7).
실시예 결론
본 출원의 상기 실시예들을 통해,
본 출원의 cAMSC-CM은 성장 인자, 항산화제, 효소, 세포 외 기질 성분, 중간 필라멘트 등을 포함한 단백질을 함유하고 있음을 알 수 있다.
이로 인해, 정자의 동결 보존시, 동결 배지에 cAMSC-CM을 최적함량으로 추가하면 운동성과 생존력, 막 온전성 및 미토콘드리아 활동이 향상함을 알 수 있다.
<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION SEOUL NATIONAL UNIVERSITY <120> A Composition for semen cryoprotectant of animal including amniotic membrane derived stem cell-conditioned media and method of making thereof <130> CP20-249 <150> KR 10-2019-0152119 <151> 2019-11-25 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-ACT_F <400> 1 gctacgtcgc cctggacttc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-ACT_R <400> 2 gcccgtcggg tagttcgtag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct3-4_F <400> 3 cgagtgagag gcaacctgga ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct3-4_R <400> 4 ccacactcgg accacatcct tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_F <400> 5 cagacctaca tgaacggctc gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_R <400> 6 cctggagtgg gaggaggagg ta 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F <400> 7 gaataacccg aattggagca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_R <400> 8 agttgtggag cggattgttc 20

Claims (23)

  1. 정액 동결용 조성물로서,
    상기 조성물은,
    적어도 하나 이상의 동결보호제; 및
    아포지단백(Apolipoprotein), 피브로넥틴(fibronectin), 티오레독신(thioredoxin), 알부민(albumin)을 포함하는 양막유래 줄기세포-조정배지(ASC-CM, amniotic membrane derived Stem Cell-conditioned media);
    를 포함하고,
    상기 ASC-CM는 양막유래 줄기세포를 배양한 배양액이고,
    이 때, 상기 ASC-CM은 양막유래 줄기세포를 포함하고 있지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 Apolipoprotein은 아포 E 지단백(Apolipoprotein E), 아포지단백A1(Apolipoprotein A-I)중 선택된 어느 하나 이상일 수 있고,
    상기 알부민(albumin)은 혈청 알부민(serum albumin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 ASC-CM은 금속단백질분해효소 억제제 1(Metalloproteinase inhibitor 1, TIMP1), 액틴(Actin, cytoplasmic 1, ACTB), 코일드 코일 도메인과 안키린 반복을 갖는 포도막 자가 항원(Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats, UACA)중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 ASC-CM은 케라틴 10(Keratin, type I cytoskeletal 10, Keratin10) 케라틴 1(Keratin, type II cytoskeletal 1, Keratin 1), 비멘틴(Vimentin), 콜라겐 타입 3 알파 1 체인(Collagen type III alpha 1 chain, COL3A1), 티오레독신(Thioredoxin), 말산 탈수소효소(Malate dehydrogenase), 삼탄당인산 이소메라아제(Triosephosphate isomerase, TPI1), 이와츠(YWHAZ), LOC477072, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(Purine nucleoside phosphorylase, PNP), 콜라겐 알파 1 체인(Collagen alpha-1(I) chain, COL1A1), 프로테아좀 서브유닛 베타(Proteasome subunit beta, PSMB6), 케라틴 78(Keratin 78, KRT78), LOC475521, 케라틴 72(Keratin 72, KRT72), L-젖산 탈수소효소(L-lactate dehydrogenase), 아넥신 A2(Annexin A2, ANXA2), 디하이드로피리미디나아제 라이크 3(Dihydropyrimidinase like 3, DPYSL3), 콜라겐 타입 5 알파 1 체인(Collagen type V alpha 1 chain, COL5A1)을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 동결보호제는 난황(egg yolk) 또는 글리세롤(glycerol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 동결보호제는 증류수(distilled water), 트리스(히드록시메틸)아미노메테인(tris (hydroxymethyl) aminomethane), 시트르산(citric acid), 프록토스(fructose), 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물 최종 중량에 대하여 상기 ASC-CM가 5 중량%, 10 중량% 또는 15 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물 최종 중량에 대하여 상기 ASC-CM가 10 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포는 양막유래 중간엽 줄기세포(amniotic membrane derived mesenchymal stem cell, AMSC)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 정액은 개, 말, 소, 토끼, 너구리, 여우, 사슴, 양, 당나귀, 돼지, 침팬지 또는 원숭이의 정액인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포는 개, 말, 소, 토끼, 너구리, 여우, 사슴, 양, 당나귀, 돼지, 침팬지 또는 원숭이의 양막유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 ASC-CM을 포함하지 않는 정액 동결용 조성물과 비교하여, 정액 동결-해동 시, 정자의 운동성, 생존성, 세포막 온전성, 미토콘드리아 활성 중 선택되는 어느 하나 이상이 향상되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물 및 동결 보호용 용기를 포함하는 정액 동결용 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 동결 보호용 용기는 동결 보호용 튜브, 바이알 중 선택되는 어느 하나 이상인 것 특징으로 하는 정액 동결용 키트.
  15. 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;
    상기 배양한 양막유래 줄기세포로의 배양액으로부터 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계; 및
    이 때, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지는 상기 배양액으로부터 양막유래 줄기세포를 제거한 것이고,
    상기 양막유래 줄기세포-조정배지 및 동결보호제를 혼합하는 단계;
    를 포함하고,
    이 때, 상기 양막유래 줄기세포-조정배지가 상기 조성물 최종 중량에 대하여 5 중량% 내지 15 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 조성물 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 양막 유래 줄기세포는 CD29, CD44, 또는 CD90을 발현하고, CD34 또는 CD45를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;는 세포가 증식하여 배양용기 내에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 밀집(컨플루언시, Confluency)이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 단계;는 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계; 및 상기 기본배지에서 배양된 양막유래 줄기세포를 계대배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포를 기본배지에 배양하는 단계;에서 기본배지는 BME(Basal medium Eagle's), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), RPMI(Rosewell Park Menorial Institute), MEM(Minimum essential medium), RCMEP 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포를 배양하는 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 15항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포- 조정배지를 수득하는 단계;를 수행하기 전에, 배양된 양막유래 줄기세포를 영양결핍(starvation)시키는 단계;를 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 영양결핍은 세포배양 용기에서 증식한 양막유래 줄기세포의 배양액을 무혈청 배지(serum free media)로 교체하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 15항에 있어서,
    상기 양막유래 줄기세포- 조정배지의 수득은 양막유래 줄기세포가 배양된 배양액을 원심분리 또는 필터 중 선택되는 어느 하나 이상을 수행하여 양막유래 줄기세포가 제거된 배양액을 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020200159744A 2019-11-25 2020-11-25 양막유래 줄기세포-조정배지를 포함하는 동물의 정액 동결보호용 조성물 및 이의 제조방법 KR102536863B1 (ko)

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KR101121198B1 (ko) * 2009-05-20 2012-03-23 (주)노바셀테크놀로지 태반에서 추출된 펩타이드 혼합물, 그의 제조 방법 및 용도
KR20140137753A (ko) * 2013-05-23 2014-12-03 전북대학교산학협력단 글루코오스를 포함하는 개 정액 동결용 희석액
KR102018609B1 (ko) * 2017-04-26 2019-09-06 이장호 중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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