CN113367123B - 一种细胞冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞冻存方法，属于细胞冷冻技术领域。本发明所述细胞冻存方法包括以下步骤：细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；所述糖类分别包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。本发明所述方法安全、高效，可实现细胞的长期低温高质量保存，且无需使用DMSO、甘油等对细胞有毒性的成分，有利于细胞药物的开发。

Description

一种细胞冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冷冻技术领域，具体涉及一种细胞冻存方法。

背景技术

细胞治疗涉及包括肿瘤在内的多种疾病的干细胞治疗和免疫细胞治疗，近些年细胞治疗更是成为生命科学和医学的前沿探索领域，细胞治疗的创新技术研究和临床研究为细胞治疗产业发展奠定了良好的基础。细胞治疗行业产业链包括细胞存储、细胞医疗技术以及细胞药物开发等；通过一定的方式从脐带、胎盘、骨髓等组织或脐带血、外周血中提取相应的原代干细胞或者免疫前体细胞，这些细胞作为种子细胞需进行存储备用；种子细胞可以通过培养扩增、基因编辑等技术进一步开发成为医疗技术或者细胞新药，无论是种子细胞存储还是细胞治疗医疗技术亦或是细胞新药开发，细胞冷冻保存都是举足轻重的环节，细胞深低温冻存可以极大地延长细胞功能时效，使细胞技术的规模化应用成为可能。

细胞的深低温冻存中，传统方式为收集目标细胞后使用冻存保护剂进行冷冻保存，使用的冷冻保护剂分为渗透型的保护剂和非渗透型的保护剂，渗透型的保护剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇等有机溶剂，非渗透性的保护剂则以大分子物质为主，包括右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、聚蔗糖等，不同细胞保护剂对细胞的保存效果差别很大，需多种保护剂组合使用，制备保护剂工艺繁琐，且传统保护剂存在的最大问题便是DMSO、甘油等物质对细胞和人体产生的毒副作用，以及右旋糖酐、白蛋白等大分子物质潜在的过敏反应等风险，即使辅料级别的DMSO同样具有血管刺激，口腔黏膜刺激等副作用，在同细胞药物共同应用于肿瘤治疗中，患者器官机能受损，DMSO与大分子胞外保护剂会增加患者肝脏、肾脏等器官的代谢负担。

另一方面，使用传统含有DMSO、甘油等高渗透压物质的保护剂，对细胞药物的大规模制备也有较大的限制，细胞无法在高渗透压的环境下存活超过1～2h，即使有存活的细胞，其在活性及功能上也会受到较大的影响，其次，渗透性保护剂DMSO、甘油等温度越高对细胞的毒性便越大，这便使得细胞药物制备环境需严格控制在较低温条件，增加制备工艺难度，这也是目前限制细胞药物工艺开发及应用的关键与亟待解决的技术难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞冻存方法。本发明所述方法安全、高效，可实现细胞的长期低温高质量保存，且无需使用DMSO、甘油等对细胞有毒性的成分，有利于细胞药物的开发。

本发明提供了一种细胞冻存方法，包括以下步骤：

细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；

所述糖类分别包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。

优选的是，细胞收集前，糖类的添加时间为细胞收集前12～36h。

优选的是，细胞收集前，当所述糖类以溶液的形式添加时，溶剂为细胞培养所用的培养基。

优选的是，重悬细胞用的糖溶液的溶剂包括plasma LyteA。

优选的是，所述细胞包括脐带间充质干细胞或CIK细胞。

优选的是，所述冻存包括细胞降温冷冻和细胞长期冻存。

优选的是，所述细胞降温冷冻包括：将细胞在-80℃条件下维持12～16h。

优选的是，所述细胞长期冻存的温度为-80℃～-196℃。

本发明提供了一种细胞冻存方法。本发明所述方法没有使用传统二甲基亚砜、甘油等渗透性保护剂以及白蛋白、右旋糖酐等非渗透性保护剂，避免了渗透性保护剂对细胞和人体产生的毒副作用(二甲基亚砜、甘油等物质具有血管刺激，口腔黏膜刺激等副作用，尤其在细胞治疗中，患者器官机能受损，DMSO与大分子胞外保护剂会增加患者肝脏、肾脏等器官的代谢负担)，以及右旋糖酐、白蛋白等大分子物质潜在的过敏反应等风险。此外，由于传统细胞保护剂细胞毒性以及本身渗透压极高等问题，对于细胞制备条件，尤其是大规模细胞制备条件要求较高，须严格控制细胞制剂制备温度、时间，本发明所述细胞冻存方法可以有效规避以上问题，本申请方法不需使用渗透性保护剂，能够有效规避高渗透压以及细胞毒性作用对细胞制剂制备效率的影响，大大延长细胞制剂生产制备时间，同时传统方法因温度越高对细胞活性的影响越大，需在低温(2～8℃)条件下完成细胞制剂制备，新型细胞冻存方法亦可有效的解决制备温度的限制，使得高效的大规模细胞制剂生产成为可能。试验结果表明，本发明所述方法操作简单，能够解决生产及临床应用中传统方法带来的细胞毒性与人体毒性的关键问题，同时维持细胞高效的保存活率，长期深低温冻存细胞3年，细胞活率大于85％，满足应用的需求。

附图说明

图1为本发明提供的使用本发明细胞保存方法保存脐带间充质干细胞后活性检测图片，其中绿色为活细胞，红色为死细胞；

图2为本发明提供的使用本发明细胞保存方法保存CIK细胞后活性检测图片，其中绿色为活细胞，红色为死细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞冻存方法，包括以下步骤：

细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；

所述糖类分别包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。

本发明在细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，更优选为300～400mM。传统细胞冻存时，通常在收集细胞后再添加冻存保护液进行冻存，收集后的细胞其生理状态发生改变，生物活性降低，对糖类的摄入功能急剧下降，糖类无法有效进入细胞内起到细胞冻存保护的作用，仅能起到部分细胞外膜保护的作用，本发明在生长期的细胞中添加适当浓度的葡萄糖、蔗糖或棉子糖，可以通过主动运输或协助扩散的方式被细胞摄入，使得传统保存方式中难以进入细胞的糖类被充分摄入，摄入的糖类可以有效减少冻存时冰晶生成概率以及改变冰晶生成的形态，起到良好的细胞保护效果。在本发明中，细胞收集前，糖类的添加时间优选为细胞收集前12～36h，更优选为收集前16～30h，最优选为收集前18～24h。在本发明中，所述糖类包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。在本发明中，细胞收集前，当所述糖类以溶液的形式添加时，溶剂为细胞培养所用的培养基，本发明优选使用溶剂将糖类溶解后再添加细胞培养液中，保证溶质充分溶解。以用DMEM/F12培养基培养的脐带间充质干细胞为例，收集前18～24h优选添加以DMEM/F12培养基为溶剂溶解的一定浓度葡萄糖、蔗糖或棉子糖，使细胞培养液中糖类的终浓度为50～400mM。在本发明中，所述细胞优选包括脐带间充质干细胞或CIK细胞。

本发明收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存。本发明优选使用离心的方式收集细胞，离心去除上清液后，得到细胞后，使用糖溶液直接重悬。本发明收集细胞后，冻存前的操作在室温条件下完成，所述室温优选为18～25℃，传统冻存保护方法因为含有二甲基亚砜、甘油等渗透性有机溶剂，具有细胞毒性，且温度越高、制备操作时间越长，细胞毒性越大，因此一般要求2～8℃条件操作，对制备工艺、环境、成本要求高，本发明不含有二甲基亚砜、甘油，无需控制操作温度，常温操作能够有效的解决制备温度的限制，延长制备操作时间，使得高效的大规模细胞制剂生产成为可能。在本发明中，重悬细胞用的糖溶液的溶剂优选包括plasma LyteA。本发明使用plasma LyteA作为溶剂，可以有效保证制备的细胞制剂在临床应用中的安全性。在本发明中，所述冻存优选包括细胞降温冷冻和细胞长期冻存。在本发明中，所述冻存前，优选将重悬细胞分装至冷冻装置中进行细胞降温冷冻。本发明所述冷冻装置优选包括1.8mL冻存管或100mL冻存袋。在本发明中，所述细胞降温冷冻优选包括：将细胞在-80℃条件下维持12～16h，更优选维持16h，具体为将分装后的细胞悬液直接放置于-80℃冰箱中，本发明细胞降温冷冻能够使细胞处于相对稳定的冷冻平衡状态，这之后，再进行细胞长期冻存。在本发明中，所述细胞长期冻存的温度优选为-80℃～-196℃，更优选存储在专用-80℃冰箱或液氮-196℃条件保存。最优选的，本发明所述冻存的整个过程包括：在-80℃进行第一阶段冷冻16h，此阶段的保存可以使细胞处于相对稳定冷冻平衡状态，再在-196℃的条件下进行第二阶段长期冷冻，此温度细胞代谢活动基本停止，细胞功能变化非常缓慢，是细胞长期冷冻保存的温度。采用本发明方法长期冷冻3年后，细胞活力均大于85％，细胞复苏活率高。在本发明中，所述糖类包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖，收集细胞后选取的糖类，与细胞收集前添加的糖类优选相同。当细胞收集前和收集后使用的糖类都为葡萄糖时，收集前葡萄糖添加后的终浓度优选为50mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含50mM的葡萄糖；或者，收集前葡萄糖添加后的终浓度优选为100mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含100mM的葡萄糖；或者，收集前葡萄糖添加后的终浓度优选为200mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含150mM的葡萄糖；或者，收集前葡萄糖添加后的终浓度优选为300mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含200mM的葡萄糖；或者，收集前葡萄糖添加后的终浓度优选为400mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含250mM的葡萄糖。当细胞收集前和收集后使用的糖类都为蔗糖时，收集前蔗糖添加后的终浓度优选为250mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含175mM的蔗糖。当细胞收集前和收集后使用的糖类都为棉子糖时，收集前棉子糖添加后的终浓度优选为200mM，收集细胞后重悬细胞用糖溶液中优选含125mM的棉子糖。

本发明所述方法能够实现细胞安全、高效的冷冻保存。葡萄糖、蔗糖或棉子糖这些糖类物质通过本发明的添加方式可使细胞充分的摄入，减少胞内冰晶形成的概率，解决了传统保护剂仅在收集细胞后添加而导致该类保护剂无法进入细胞起到细胞内保护的作用的问题，以及不得不添加二甲基亚砜、甘油等有毒性渗透性保护剂的问题，同时本发明收集细胞后再次使用糖溶液重悬，起到细胞外保护的作用，保护细胞膜的完整性，本发明整体方法实现细胞内外共同保护的作用，且方法简单，添加物安全，解决细胞制剂工业化制备时间、温度等关键条件的限制，使得细胞制剂规模化制备成为可能。即本发明细胞冷冻方法：组分安全，操作简单，改变了传统的细胞冷冻的方式，使安全性物质能充分进入细胞内，无需使用传统有毒性的二甲基亚砜、甘油等物质，充分保证了临床应用的安全性；保护液合理的渗透压，改变了传统冻存方式高渗透压的状况，解决了细胞制剂规模化制备生产时高渗透压、冻存剂细胞毒性等因素对制备时间、温度等关键条件的限制，有效促进细胞制剂规模化制备生产；无需程序降温，减少昂贵的冷冻设备的费用，降低工业化生产的成本。

本发明所述冷冻保存方法能有效保护不同类型细胞，无论是-80℃低温长期存储还是液氮深低温长期存储，不同存储温度细胞保存效果无明显区别，说明本方法保存的细胞存储温度区间较广，为-80～-196℃，且长期存储36个月后细胞活率仍整体大于85％，维持较高的细胞复苏活率；与传统最经典有效的冻存方法相比，细胞活性的维持效率相当，且本发明方法避免了传统方法中血清带来的外源性物质风险，二甲基亚砜的细胞、人体毒性风险以及二甲基亚砜对细胞制剂规模化生产的限制性问题。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种细胞冻存方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：50mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：50mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例2

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：100mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：100mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例3

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：200mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：150mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例4

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：300mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：200mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例5

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：400mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：250mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例6

细胞收集前14h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：300mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：200mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例7

细胞收集前30h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：300mM葡萄糖(培养基配制)

保存过程：200mM葡萄糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例8

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：250mM蔗糖(培养基配制)

保存过程：175mM蔗糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

实施例9

细胞收集前22h，培养过程中糖添加浓度及细胞收获后保存过程糖类添加浓度为：

培养过程：200mM棉子糖(培养基配制)

保存过程：125mM棉子糖(plasma-A配制)

将细胞悬液转移至冻存管或冻存袋中，再将冻存袋或冻存管直接放置于-80℃冰箱保存，16h后转至-80℃冰箱或液氮罐长期存储。

试验结果：利用AO/PI染色法，对于制备的实施例1～9测定不同时间段的细胞存活率，具体结果见下表：

1、脐带间充质干细胞(MSCs)保存效果

表1脐带间充质干细胞-80℃长期冻存结果

表2脐带间充质干细胞液氮长期冻存结果

2、CIK细胞保存效果

表3 CIK-80℃长期冻存结果

表4 CIK液氮长期冻存结果

3、NK细胞保存效果

表5 NK-80℃长期冻存结果

表6 NK液氮长期冻存结果

4、收集脐带间充干细胞前不同时间添加糖溶液的保存效果

表7脐带间充干细胞收集前不同时间添加糖溶液对冻存效果的影响(液氮)

从表1～表7可以看出，本发明的冷冻保存方法能有效保护间充质干细胞、CIK细胞，无论是-80℃低温长期存储还是液氮深低温长期存储，说明本方法保存的细胞存储温度区间较广可于-80℃～-196℃之间，且长期存储36个月后细胞活率仍整体大于80％，维持相对较高的细胞复苏活率，葡萄糖相较于蔗糖、棉子糖具有更好的细胞保护效果；对照组为正常培养收集并使用90％FBS+10％DMSO冻存液冻存细胞的传统经典方式，与传统经典冻存方法相比，实施例4对于细胞保存的效果最为接近，细胞活性的维持效率相当，说明在本发明中最适工作浓度为培养过程添加300mM葡萄糖，保存过程添加200mM葡萄糖；本发明的冷冻保存方法对于NK细胞的保护效果较差，与经典90％FBS+10％DMSO的冻存方法相比效果存在明显差距，说明本发明的冷冻保存方法对于特定细胞具有保护作用，不具备普适性；本发明最适的糖溶液添加时间为细胞收集前18～24h添加培养，超出本范围的时间段添加糖溶液对脐带间充质干细胞的保护效果有明显下降；

本发明提供的附图中，图1、图2分别为本发明中最优实施例4针对脐带间充质干细胞、CIK细胞液氮保存36个月后的AO/PI检测图，其中红色荧光染色的为死细胞，绿色荧光染色的为活细胞，从图中可以直观的看出无论是脐带间充质干细胞或者是CIK细胞，通过实施例4的保存条件液氮保存细胞36个月后，绿色荧光染色的活细胞依然占大部分(脐带间充质干细胞、CIK细胞的活细胞分别占89.6％和89.4％)，说明大部分细胞依旧维持着活性，证明本发明的可行性。

本发明方法避免了传统方法中血清带来的外源性物质风险，二甲基亚砜的细胞毒性和人体毒性风险，以及二甲基亚砜对细胞制剂规模化生产的限制性问题。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种细胞冻存方法在冷冻保存脐带间充质干细胞或CIK细胞中的应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50~400mM，所述细胞培养液由培养基和糖类组成，所述糖类为葡萄糖或棉子糖；收集细胞后，使用含50~250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；重悬细胞用的糖溶液由plasma Lyte A和糖类组成，所述糖类为葡萄糖或棉子糖；细胞收集前，糖类的添加时间为细胞收集前12~36h。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存方法在冷冻保存脐带间充质干细胞或CIK细胞中的应用，其特征在于，所述冻存包括细胞降温冷冻和细胞长期冻存。

3.根据权利要求2所述的细胞冻存方法在冷冻保存脐带间充质干细胞或CIK细胞中的应用，其特征在于，所述细胞降温冷冻包括：将细胞在-80℃条件下维持12~16h。

4.根据权利要求2所述的细胞冻存方法在冷冻保存脐带间充质干细胞或CIK细胞中的应用，其特征在于，所述细胞长期冻存的温度为-80℃~-196℃。

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