KR20080017362A

KR20080017362A - 창상 치유를 위한 ｖｅｇｆ의 용도

Info

Publication number: KR20080017362A
Application number: KR1020077029259A
Authority: KR
Inventors: 티모시 제이. 브린; 스튜어트 번팅; 찰스 피. 셈바
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-02-26
Also published as: WO2006138468A2; US20060287234A1; NO20080333L; AU2006259408A1; RU2008101791A; US20070021342A1; EP1904094A2; MX2007015943A; WO2006138468A3; IL187753A0; CA2612233A1; BRPI0613284A2; JP2008546707A

Abstract

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 투여하여, 대상체에서 창상 치유를 가속화시키고/시키거나 개선시키는 방법이 제공된다.

혈관 내피 성장 인자, 창상 치유, 가속화, 창상 면적, 창상 치유 속도, 당뇨병성 족부 궤양

Description

창상 치유를 위한 ＶＥＧＦ의 용도 {Use of VEGF for Wound Healing}

관련 출원

본 출원은 2005년 6월 17일자로 출원한 미국 가출원 제60/691,909호, 및 2006년 4월 21일자로 출원한 미국 가출원 제60/794,008호를 우선권 주장하고 이들의 이점을 청구하며, 상기 문헌들의 명세서는 본원에 그 전문이 포함된다.

본 발명은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 투여하여 창상 치유를 가속화하거나 개선시키는 방법에 관한 것이다.

창상 치유는 염증기, 육아 조직 형성기 및 조직 리모델링기를 수반하는 복잡한 과정이다 [Singer and Clark, Cutaneous Wound Healing, N. Engl. J. Med. 341:738-46 (1999)]. 이러한 사건들은 상해 부위에서 방출되는 사이토카인 및 성장 인자에 의해 촉발된다. 많은 인자들이 정상적인 적절한 창상 치유를 악화시키거나 방해할 수 있다. 예를 들어, 이러한 인자로는 연령, 감염, 영양 불량, 면역억제, 투약, 방사선조사, 당뇨병, 말초 혈관 질환, 전신 질병, 흡연, 스트레스 등이 있다.

2005년에 미국에서 대략 2천만 명의 사람들이 걸리게 될 만성 허약화 질환인 당뇨병에 걸린 환자의 경우, 당뇨병성 족부 궤양 (또한, 창상이라고 지칭되기도 함)의 발병이 공통적인 합병증이다. 만성 궤양은 순차적이고 시기 적절한 복구 과정을 통해 해부학적이고 기능적인 일체성(integrity)을 생성하여 더이상 진행되지 않는 창상으로 정의된다 (예를 들어 문헌 [Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994)] 참조). 당뇨병성 족부 궤양은 그 성질상 만성 창상이다 [American Diabetes Association, Consensus development conference on diabetic foot wound care, Diabetes Care, 22(8):1354-60 (1999)]. 피부가 환경에 대한 1차 장벽으로 작용하기 때문에, 난치성 개방 창상(open refractory wound)은 치명적일 수 있고, 중대 장애 (사지 손실 포함) 및 심지어는 사망이 초래될 수 있다. 당뇨병에 걸린 사람들에서 하지 절단의 약 85％에서는 족부 궤양형성이 선행된다. 예를 들어 문헌 [Apelqvist, et al., What is the most effective way to reduce incidence of amputation in the diabetic foot? Diabetes Metab Res. Rev., 16(1 Suppl.):S75-S83 (2000)]을 참조한다.

미국에서는 매년 시술이 요구되는 피부 창상이 3천 5백만 건이 넘는다는 보고가 있다. 예를 들어 문헌 [Tonnesen et al., Angiogenesis in Wound Healing JID Symposium Proceedings 5(1):40-46 (2000)]을 참조한다. 현행 창상 관리 요법은 효능이 실망스럽고 비용 문제로 인해 그다지 성공적이지 못하다. 따라서, 대상체를 위한 창상 치유 요법을 증대시키고 최적화할 것이 요구된다. 하기하는 개시내용을 검토할 때 명백해지겠지만, 본 발명은 이러한 요구 및 기타 요구에 관한 것 이다.

요약

예를 들어, 급성 창상 (예를 들어, 화상, 수술 창상 등) 또는 만성 창상 (예를 들어, 당뇨병성 궤양, 압력 궤양, 욕창성 궤양, 정맥 궤양 등) 또는 통상의 창상 등과 같은 창상의 치유를 가속화하는 방법이 제공된다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 투여를 이용하여 창상 치유를 개선시키고 궤양 재발 빈도를 감소시키는 방법도 제공된다. 상기 방법은, 예를 들어 유효량의 VEGF를 창상에 투여하는 것을 포함하며, 유효량의 VEGF 투여가 대조군과 비교시에 창상 치유를 50％ 초과, 또는 60％ 이상, 70％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 100％ 이상, 110％ 이상 또는 더 많이 가속화하는 것인, 대상체에서의 창상 치유 가속화 방법 등을 포함한다. 대조군의 예로는 치료 처방을 받지 않은 대상체, 또는 치료량에 미치지 못하는 양의 VEGF가 투여된 대상체, 또는 또다른 창상 치료 처방을 받은 대상체, 또는 GWC (Good Wound Care)를 병행하거나 병행하지 않은 위약 투여된 대상체, 또는 GWC만이 처방된 대상체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. GWC로는 예를 들어, 창면절제술, 세정/드레싱, 압력 경감, 감염 제어, 및/또는 이들의 조합 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 인간 대상체에서의 창상 치유 가속화 방법은 유효량의 VEGF를 창상에 투여하는 것을 포함하고, 유효량의 VEGF 투여가 대조군과 비교시에 창상 치유를 60％ 초과 가속화하며, 여기서의 상기 창상은 유효량의 VEGF 투여 전 대상체에 약 4주 이상 동안 존재한 것이다. 한 실시양태에서, 인간 대상체에서의 창상 치유 가속화 방법은 유효량의 rhVEGF165를 당뇨병성 창상에 투여하는 것을 포함하고, 유효량의 rhVEGF165 투여가 대조군과 비교시에 창상 치유를 60％ 초과 가속화한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법에서 VEGF 대신 또는 그와 병용하여 VEGFR 아고니스트가 사용될 수 있다.

창상 치유의 평가는 예를 들어 창상 면적에서의 감소율(％) 또는 완벽한 창상 봉합(closure)으로 결정될 수 있다. 창상 면적은 정량적 분석, 예를 들어 창상의 면적 측정, 창상의 면적계측 추적 등으로 결정될 수 있다. 완벽한 창상 봉합은 예를 들어 배액법(drainage) 또는 드레싱이 필요 없는 피부 봉합으로 결정될 수 있다. 창상 사진, 창상의 물리적 시험 등도 창상 치유의 평가에 이용될 수 있다. 창상 치유의 가속화는 가속화율(％) 또는 치유 시간 해저드 비율(Hazard ratio) (예를 들어, VEGF vs. 위약 등의 대조군) 등으로 표현될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 해저드 비율 (HR)은 1.75 이상, 또는 1.8 이상, 또는 1.85 이상, 또는 1.87 이상, 또는 1.9 이상, 또는 1.95 이상, 또는 1.98 이상, 또는 2.0 이상, 또는 2.1 이상이거나, 더 높다.

한 실시양태에서, 창상은 감염을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 창상은 허혈성 창상이다. 한 실시양태에서, 치료 전의 창상 면적은 약 0.4 ㎠ 이상, 또는 약 1.0 ㎠ 이상, 또는 약 1.0 ㎠ 내지 약 10.0 ㎠, 또는 약 1.0 ㎠ 내지 약 6.5 ㎠, 또는 약 1.0 ㎠ 내지 약 5.0 ㎠이다. 추가의 실시양태에서, VEGF를 사용한 치료 전 및 창면절제술 후의 창상 면적이 결정된다. 한 실시양태에서, 창상은 VEGF 투여 전 대상체에 약 4주 이상 동안, 또는 약 6주 이상 동안 존재한다. 본 발명의 특정 측면에서, 상기 대상체는 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 처치를 받고 있거나, 그러한 처치를 받은 적이 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 대상체는 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 2차 상태에 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 2차 상태는 당뇨병이다.

한 실시양태에서, 투여되는 VEGF는 VEGF₁₆₅ (예를 들어, 재조합 인간 VEGF (예를 들어 인간 VEGF₁₆₅))이다. 한 실시양태에서, VEGF는 국소 투여된다. 특정 실시양태에서, VEGF는 창상 치유를 가속화하는 기타 인자 (예를 들어, 혈관형성(angiogenesis) 인자 또는 혈관형성제, 창상 치유제 또는 창상 치유 절차, 성장 인자 등)와 병용 투여된다. VEGF는 예를 들어 서방형 제제, 겔 제제, 붕대 또는 드레싱 등으로 제제화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 인간이다. 한 실시양태에서, 투여 유효량의 VEGF는 약 20 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠ 또는 24 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 72 ㎍/㎠ 또는 72 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 216 ㎍/㎠ 또는 216 ㎍/㎠이다. 한 실시양태에서, 투여 유효량의 VEGF는 20 ㎍/㎠ 내지 250 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠ 내지 약 216 ㎍/㎠, 또는 24 ㎍/㎠ 내지 216 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠ 내지 약 72 ㎍/㎠, 또는 24 ㎍/㎠ 내지 72 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 72 ㎍/㎠ 내지 약 216 ㎍/㎠, 또는 72 ㎍/㎠ 내지 216 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 216 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/ ㎠, 또는 216 ㎍/㎠ 내지 250 ㎍/㎠이다.

유효량의 VEGF 투여는 매일 이루어질 수도 있고, 또는 임의로는 1주 당 수회, 예를 들어 1주 당 2회 이상 또는 1주 당 3회 이상, 또는 1주 당 4회 이상, 또는 1주 당 5회 이상, 또는 1주 당 6회 이상 이루어질 수도 있다. 한 실시양태에서, VEGF는 6주 이상, 또는 6주 초과 또는 약 12주 이상 동안 투여되거나, 또는 완벽한 창상 봉합 (예를 들어, 배액법 또는 드레싱이 필요 없는 피부 봉합으로 결정될 수 있음)시까지 투여된다. 한 실시양태에서, VEGF는 1번의 치료 기간으로 20주 미만 동안 투여된다.

본 발명의 방법은 또한 대상체 집단에서의 창상 치유 개선 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 유효량의 VEGF를 상기 집단 대상체의 창상에 투여하는 것을 포함하며, 유효량의 VEGF 투여는 대조군 집단과 비교시에 상기 집단에서의 창상 치유를 10％ 초과 (또는 12％ 초과, 또는 14％ 초과, 또는 15％ 초과, 또는 17％ 초과, 또는 20％ 초과, 또는 25％ 초과, 또는 30％ 초과, 또는 33％ 초과, 또는 35％ 초과, 또는 40％ 초과, 또는 45％ 초과, 또는 50％ 초과 또는 그 이상)로 개선시킨다. 예를 들어, 대조군 집단의 예로는 치료 처방을 받지 않은 대상체, 또는 치료량에 미치지 못하는 양의 VEGF가 투여된 대상체, 또는 또다른 창상 치료 처방을 받은 대상체, 또는 GWC (Good Wound Care)를 병행하거나 병행하지 않은 위약 투여된 대상체, 또는 GWC만이 처방된 대상체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 창상 치유의 개선은 완벽한 창상 치유로 평가된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 집단은 창상 치유가 손상된 대상체를 포함한다. 한 실시양태 에서, 상기 집단은 치료 전에 예를 들어 약 4주 이상 동안 만성 창상을 갖는 당뇨병 환자이다.

본 발명은 또한 궤양의 재발 감소 방법도 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 유효량의 VEGF를 궤양에 투여하는 것을 포함하고, VEGF 투여시에 궤양 형성의 발생이 대조군에 비해 감소된다. 예를 들어, 대조군의 예로는 치료 처방을 받지 않은 대상체, 또는 치료량에 미치지 못하는 양의 VEGF가 투여된 대상체, 또는 또다른 창상 치료 처방을 받은 대상체, 또는 GWC (Good Wound Care)를 병행하거나 병행하지 않은 위약 투여된 대상체, 또는 GWC만이 처방된 대상체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

도 1은 당뇨병성 창상 치료를 위해 rhVEGF를 투여하기 위한 연구 디자인 (예를 들어 VGF2763g)을 예시한다.

도 2는 토끼 허혈성 귀 창상 모델에서 rhVEGF 첨가 제14일의 투여량-반응 곡선을 예시한다.

도 3은 당뇨병성 마우스 모델에서 rhVEGF 첨가 제8일의 투여량-반응 곡선을 예시한다.

정의

본 발명을 상세하게 기재하기에 앞서, 본 발명이 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되는 것이 아님을 이해해야 하며, 이것들은 물론 다양할 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태를 기술하기 위한 것에 불과한 것이며 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본원 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 분명하게 다른 내용이 기재되지 않는다면 복수형에 대한 언급을 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들어, "분자"라는 지칭은 임의로는 이러한 분자(들) 2개 이상의 조합을 포함하는 식이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF" (또한, VEGF-A라고도 지칭됨)는 혈관 내피 세포 성장 인자 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 VEGF" (또한, 인간 VEGF-A라고도 지칭됨)는 문헌 ([Leung et al., Science 246:1306 (1989)] 및 [Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)])에 기재된 바와 같은 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 145-, 183-, 189- 및 206- (및 기타 이소형) 아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 또한 이들의 천연 대립유전자 및 그의 프로세싱(processing)된 형태를 지칭한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연계로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 천연 폴리펩티드 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연계로부터 단리될 수도 있고, 또는 재조합 수단 또는 합성 수단에 의해 제조될 수도 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 구체적으로 천연 말단절단(truncation) 형태 또는 분비된 형태의 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 형태 (예를 들어, 선택적 스플라이싱(alternative splicing) 형태) 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다.

폴리펩티드 "변이체"는 상응하는 천연 서열 폴리펩티드 또는 그의 단편과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체로는 예를 들어 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 폴리펩티드 등이 있다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드 또는 그의 단편과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 또는 약 95％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 유사체 또는 변이체는 천연 VEGF의 아미노산 서열, 글리코실화 또는 기타 특성이 공유결합 또는 비공유결합에 의해 변형된 분자로 정의된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF 변이체"는 상기한 바와 같은 변이체 및/또는 천연 VEGF 서열 내에 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 VEGF를 지칭한다. 임의로, 1개 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 VEGF 및 그의 변이체는 당업계에 공지된 여러가지 방법으로 제조될 수 있다. VEGF의 아미노산 서열 변이체는 VEGF DNA에서의 돌연변이로 제조될 수 있다. 이러한 변이체로는 예를 들어 VEGF의 아미노산 서열, 예를 들어 제5,332,671호, 제5,194,596호 또는 제5,240,848호에 제시된 핵산에 의해 코딩되는 인간 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 상기 잔기로의 삽입 또는 상기 잔기의 치환 등이 있다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 원하는 활성, 예를 들어 창상 치유를 가속화하는 VEGF 활성 등을 갖는 최종 구축물에서 달성되도록 가해질 수 있다. 상기 변이체를 코딩하는 DNA에서 만들어질 돌연변이는 상기 서열에서 리딩 프레임을 벗어나서는 안되고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 만들지 않는다. 유럽 제75,444A호를 참조한다. VEGF 변이체는 예를 들어 세포 증식 검정 등을 통해 VEGF 활성에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식 검정은 미처치 세포 또는 감소 처치된 세포에 대한 세포의 성장 및/또는 재생 정도를 시험관내 또는 생체내 증가시키는 것을 포함한다. 세포 배양물 중 세포 증식의 증가는 관심 분자로의 노출 전 및 노출 후에 세포의 수를 계수하여 검출될 수 있다. 증식 정도는 전면생장 정도의 현미경 시험으로 정량화될 수 있다. 또한, 세포 증식은 티미딘 혼입 검정으로 정량화될 수도 있다.

VEGF 변이체는 임의로 천연 VEGF를 코딩하는 DNA 뉴클레오티드의 부위-지정 돌연변이유발 또는 파지 디스플레이 기술로 제조되어, 상기 변이체를 코딩하는 DNA를 생성한 후에 재조합 세포 배양물 중 상기 DNA를 발현한다.

아미노산 서열 변이의 도입 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 무작위 돌연변이유발을 수행할 수 있고, 원하는 활성의 최적 조합에 대하여 발현된 VEGF 변이체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 부위-특이적 돌연변이유발 등과 같이, 공지 서열을 갖는 DNA에서 미리 결정된 부위에 치환 돌연변이를 만드는 기술은 공지되어 있다. 본원에 기재한 VEGF 변이체의 제조는 파지 디스플레이 기술, 예컨대 PCT 공개공보 제WO 00/63380호에 기재된 기술로 달성될 수 있다.

이러한 클론을 선별한 후, 돌연변이된 단백질 영역을 제거하여 단백질 생산용으로 적절한 벡터, 일반적으로는 적절한 숙주의 형질전환에 이용될 후 있는 유형의 발현 벡터에 위치시킬 수 있다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1개 내지 30개 잔기, 임의로는 1개 내지 10개 잔기, 임의로는 1개 내지 5개 이하의 범위이고, 전형적으로 인접하여 위치한다.

아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 내지 본질적으로 제한되지 않는 길이의 폴리펩티드의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합 및 또한 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 서열내 삽입 (즉, 천연 VEGF 서열 내 삽입)은 일반적으로 약 1개 내지 10개 잔기, 임의로는 1개 내지 5개, 또는 임의로는 1개 내지 3개 범위일 수 있다. 말단 삽입의 예로는 숙주 세포에 이종이거나 동종인 신호 서열을 N-말단에 융합시켜 재조합 숙주로부터의 분비를 용이하게 하는 것 등이 있다.

추가의 VEGF 변이체는 천연 VEGF 내 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 이러한 치환은 하기 표 1에 나타낸 바에 따라 만들어질 수 있다. VEGF 변이체는 또한 본원에 기재한 바와 같은 비-천연 아미노산을 포함할 수도 있다.

아미노산은 이들의 측쇄 성질에 있어서의 유사성에 따라 군으로 분류될 수 있다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):

(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 비대전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)

별법으로, 천연 잔기는 공통적인 측쇄 성질에 따라 다음과 같은 군으로 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln

(3) 산성: Asp, Glu

(4) 염기성: His, Lys, Arg

(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

"천연 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산 잔기)는 알라닌 (Ala), 알르기닌 (Arg), 아스파라진 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소루이신 (Ile): 루이신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. "비-천연 아미노산 잔기"는 상기한 천연 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭하며, 이것은 폴리펩티드 쇄 내의 인접 아미노산 잔기(들)에 공유 결합될 수 있다. 비-천연 아미노산 잔기의 예로는 노르루이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)] 및 미국 특허 출원 공개 제20030108885호 및 동 제20030082575호에 기재된 것과 같은 기타 아미노산 잔기 유사체 등이 있다. 간략하게 설명하면, 이러한 절차는 저해자 tRNA를 비-천연 아미노산 잔기로 활성화시킨 후에 상기 RNA의 시험관내 또는 생체내 전사 및 번역을 수행하는 것을 포함한다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20030108885호 및 동 제20030082575호, 문헌 [Noren et al. Science 244:182 (1989)] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]을 참조한다.

본원에서, "아미노산 서열 동일성(％)"은 서열을 정렬하고, 필요하다면 최대 서열 동일성(％)을 달성하기 위한 갭(gap)을 도입한 후에 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않으면서, 선택된 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율(％)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈린(Megalign; DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열 전장에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 결정에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적상, 아미노산 서열 동일성(％) 값은 하기하는 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 이용하여 구한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)가 개발하였으며, 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서로 보관되어 있고, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있으며, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 이용할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D 상에서 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

본원에서의 목적상, 주어진 아미노산 서열 A가 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대하여 갖는 아미노산 서열 동일성(％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 달리 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:

X/Y ×100

여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치(match)로 스코어링되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF 수용체" 또는 "VEGFR"은 VEGF에 대한 세포 수용체를 지칭하며, 일반적으로 혈관 내피 세포에서 발견되는 세포-표면 수용체 및 또한 VEGF 결합력을 보유하는 그의 변이체이다.

용어 "VEGFR 아고니스트"는 VEGF 수용체를 활성화시키거나 그의 발현을 증가시킬 수 있는 분자를 지칭한다. VEGFR 아고니스트의 예로는 VEGFR의 리간드 아고니스트, VEGF 변이체, 항체 및 활성 단편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. VEGF는 VEGFR 아고니스트이지만, 본원에서는 별도로 기재하여 언급한다. 용어 "항-VEGFR 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 VEGFR에 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGFR 아고니스트 항체는 창상 치료시의 치료제로 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, VEGF 변이체가 창상 치료시의 치료제로 사용될 수 있다.

본원에서, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (전장 또는 무손상 모노클로날 항체 등), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편까지도 포함한다.

달리 지시하지 않는다면, 표현 "다가 항체"는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내는데 사용된다. 전형적으로, 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작되고, 일반적으로는 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하며, 일반적으로는 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원 결합력을 보유한다. 본 발명에서의 정의에 포함되는 항체 단편의 예로는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편, (ii) Fab 단편에서 CH1 도메인의 C-말단에 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 것인 Fab' 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편, (iv) VH 및 CH1 도메인 및 CH1 도메인 C-말단에 1개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편, (v) 항체의 단일 아암(arm) VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 [Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)], (vii) 단리된 CDR 영역, (viii) 힌지 영역에서 디술피드 연결기에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편, (ix) 단일 쇄 항체 분자 (예를 들어 단일 쇄 Fv, scFv) ([Bird et al., Science 242:423-426 (1988)] 및 [Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)]), (x) 동일 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하며 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디(diabody)" (예를 들어 유럽 제404,097호, 제WO 93/11161호 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조), (xi) 한쌍의 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하며, 이것이 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 것인 "선형 항체" ([Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)] 및 미국 특허 제5,641,870호) 등이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단에 포함된 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서 단일 항원에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 여러가지 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 여러가지 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법을 통한 항체 생성이 요구된다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법으로 제조될 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조될 수도 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 또는 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 상기 쇄(들)의 나머지는 또다른 종에서 유래하거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편까지도 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린(murine)) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가, 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력(capacity)을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등과 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 더 증진되도록 가해질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 보다 상세한 사항을 위해서는, 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 이용하여 만들어진 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서, 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외된다. 인간 항체는 당업계 공지의 각종 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 ([Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)], [Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998))], [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)], [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완벽하게 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 도입하여 만들어질 수도 있다. 시험감염(challenge)시에는 인간 항체 생성이 관찰되며, 이것은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리 등을 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,661,016호 및 하기하는 과학학술 간행물에 기재되어 있다: [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)], [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)], [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)], [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)], [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)], [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대하여 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다 (예를 들어 B 림프구는 개인으로부터 회수될 수도 있고, 또는 시험관내 면역화된 것일 수도 있음). 예를 들어 문헌 [Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)], [Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)] 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조한다.

당뇨병은 동물에서의 탄수화물, 지방 및 단백질 대사에 악영향을 주는 만성 장애이다. 당뇨병은 성인에서의 실명, 신부전증, 및 하지 절단의 1위 원인이고, 심혈관 질환 및 졸중의 주요 위험 인자이다.

제I형 진성 당뇨병 (또는 인슐린-의존성 진성 당뇨병 ("IDDM") 또는 유년 발병형 당뇨병)은 모든 당뇨병 사례의 대략 10％를 차지한다. 상기 질환은 췌장 베타 세포에 의한 인슐린 분비 기능의 점진적 상실을 특징으로 한다. 이러한 특징은 또한 췌장 질환에서 기원하는 비-특발성 또는 "2차" 당뇨병에서도 공통적이다. 제I형 진성 당뇨병은 예를 들어 하기하는 임상적 징후 또는 증상과 관련이 있다: 지속적으로 상승되는 혈장 글루코스 농도 또는 과혈당; 다뇨증; 다음다갈증 및/또는 폭식; 만성 미세혈관 합병증, 예컨대 망막증, 신장병증 및 신경병증; 및 실명, 말기 신질환, 사지 절단 및 심근경색으로 이어질 수 있는 거대혈관 합병증, 예컨대 고지혈증 및 고혈압.

제II형 진성 당뇨병 (비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM)은 글루코스 대사의 조절곤란 및 인슐린 감수성 감퇴를 수반하는 대사 장애이다. 제II형 진성 당뇨병은 일반적으로 성인기에 발병하고, 신체가 충분한 인슐린을 이용하거나 만들 수 없는 것과 관련이 있다. 표적 조직에서 관찰된 인슐린 내성 뿐만이 아니라, 제II형 진성 당뇨병을 앓고 있는 환자에서는 상대적 인슐린 결핍이 있다 - 즉, 환자의 인슐린 수준이, 주어진 혈장 글루코스 농도에서 예측되는 인슐린 수준보다 낮다. 제II형 진성 당뇨병은 예를 들어 하기하는 임상적 징후 또는 증상을 특징으로 한다: 지속적으로 상승되는 혈장 글루코스 농도 또는 과혈당; 다뇨증; 다음다갈증 및/또는 폭식; 만성 미세혈관 합병증, 예컨대 망막증, 신장병증 및 신경병증; 및 실명, 말기 신질환, 사지 절단 및 심근경색으로 이어질 수 있는 거대혈관 합병증, 예컨대 고지혈증 및 고혈압.

본 발명의 목적상, "대상체"는 임의의 동물을 지칭한다. 일반적으로, 동물은 포유동물이다. 본 발명의 목적상, "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 및 동물원 동물, 경주용 동물 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 전형적으로, 포유동물은 인간이다.

용어 "창상 치유를 가속화하는" 또는 "창상 치유의 가속화"는 치유 속도의 증가, 예를 들어 완벽한 창상 봉합이 일어날 때까지의 시간 감소 또는 창상 면적 감소율(％)이 일어날 때까지의 시간 감소를 지칭한다.

용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대상체에서의 창상 치유를 가속화하거나 개선시키는데 유효하거나, 또는 대상체에서의 궤양 재발을 예방하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 치료 용량은 대상체에 치료 효과를 나타내는 용량이고, 치료 투여량 미만은 처치되는 대상체에 치료 효과를 나타내지 않는 용량이다.

1종 이상의 추가의 치료제"와 함께" 투여한다는 것은 동시 (한꺼번에) 및/또는 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.

"치료"는 치유적 처치와 예방적 또는 방지적 조치 둘다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 그 장애에 걸린 대상체들 뿐만이 아니라 그 장애가 예방될 대상체들도 포함된다.

"창상 치유"는 본 발명의 분자를 이용한 처치가 유익한 상태를 지칭한다.

"만성 창상"은 치유되지 않는 창상을 지칭한다. 예를 들어 문헌 [Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994)]을 참조한다. 만성 창상으로는 예를 들어, 동맥성 궤양, 당뇨병성 궤양, 압력 궤양, 정맥 궤양 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 급성 창상은 만성 창상으로 발전할 수 있다. 급성 창상으로는 예를 들어 열 상해, 외상, 수술, 광범위한 피부암의 절제술, 심재성 진균 및 박테리아 감염, 혈관염, 경피증, 천포창, 독성 표피 괴사용해 등에 의해 유발되는 창상 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 문헌 [Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, published on:October 24, 2001]을 참조한다. "통상의 창상"은 정상적인 창상 치유 복구가 일어나는 창상을 지칭한다.

"GWC (Good Wound Care)"는 창상 관리 단계를 지칭한다. 예를 들어, GWC (Good Wound Care) 실행예로는 하기 중 하나 이상 등이 있으나 이에 제한되지 않는다: 창면절제술 (예를 들어, 외과적(surgical/sharp), 기계적, 자가용해성 또는 화학적/효소적), 세정 (예를 들어, 염수 등을 이용한 통상의 창상 세정), 드레싱, 압력 경감 (예를 들어, 족부에 대한 압력 해지), 촉촉한 창상 환경의 유지, 및/또는 감염 제어 (예를 들어, 항생제 연고 또는 환제). 다른 단계는 임의로 대상체에게 안락하고 쿠션감있는 신발류를 착용시키거나, 영양 보충, 혈중 글루코스 제어의 유지, 기타 위험 인자의 관리 (예를 들어, 체중, 흡연) 등을 포함한다. GWC는 상기한 실행예 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

표현 "혈관 내피에 영향을 주는 외상"은 동물 또는 인간, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 장기의 혈관망을 비롯한 혈관 또는 심장에 대한 외상, 예컨대 상해를 지칭한다. 이러한 외상의 예로는 창상, 절개, 및 궤양, 또는 혈관 또는 심장의 열상 등이 있다. 외상은 내부 사건에 의해 야기되는 상태 및 또한 혈관 내피 세포 성장 촉진에 의해 개선될 수 있는 외적 요인에 의한 상태를 포함한다.

"혈관형성 인자 또는 혈관형성제"는 혈관의 발생을 자극하는 성장 인자, 예를 들어 혈관형성, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 맥관형성(vasculogenesis) 등을 촉진시키는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관형성 인자의 예로는 VEGF 및 VEGF 족의 구성원, PlGF, PDGF 족, 섬유아세포 성장 인자 족 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴), 에프린, ANGPTL3, ANGPTL4 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 CTGF 족의 구성원, 및 TGF-α 및 TGF-β 등의 인자도 포함한다. 예를 들어 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)], [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)], [Ferrara ＆ Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)], [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 혈관형성 인자를 나열한 표 1) 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)])을 참조한다.

창상 치유

창상 치유는 염증, 육아 조직 형성 및 조직 리모델링의 3가지 주요 시기를 수반하는 복잡한 과정이다. 창상 부위에서는 예를 들어 이동/수축, 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 생성, 증식, 및 혈관형성 등을 비롯한 많은 과정들이 일어난다. 창상을 치유하기 위한 수축 (창상의 크기 감소), 상피화 (새로운 상피 세포의 생성) 및 결합 조직의 침착이 있다. 문헌 [Singer ＆ Clark, Cutaneous Wound Healing N. Engl. J. Med., 341:738-46 (1999)]을 참조한다. 창상 요법의 목적 중 하나는 육아 매트릭스 형성을 촉진시키는 것이며, 이 때 적절한 혈액 공급이 필요하다. 그러나, 창상 치유는 질환 상태와 흔히 관련이 있는 위험 인자 (예를 들어, 연령, 감염, 영양 불량, 면역억제, 투약, 방사선조사, 당뇨병, 말초 혈관 질환, 전신 질병, 흡연, 스트레스 등이 있으나 이에 제한되지 않음)에 의한 도전을 받게 된다.

당뇨병성 족부 궤양에 대한 몇가지 위험 인자의 예로는 발의 운동 기능과 감각 기관 둘다에 영향을 주는 말초 신경병증, 관절 운동성 제한, 발의 뒤틀림, 발 압력의 비정상적 분포, 반복적인 작은 외상, 및 시력 감퇴 등이 있다. 예를 들어 문헌 [Boyko et al., A prospective study of risk factors for diabetic foot ulcer, The Seattle Diabetic Foot Study, Diabetes Care, 22:1036-42 (1999)] 및 [Apelqvist et al., International consensus and practical guidelines on the management and the prevention of the diabetic foot, International Working Group on the Diabetic Foot., Diabetes Metab Res. Rev 16(1 Suppl):S84-S92 (2000)]을 참조한다. 말초 감각 신경병증이 주요 인자이다. 모든 당뇨병성 궤양형성 중 대략 45％ 내지 60％가 신경병증인 반면, 최대 45％ 이하가 신경병증 요소와 허혈성 요소를 둘다 갖는다. 발이 무감각해진 환자는 예를 들어 보행 및 일상 활동 동안에 잘못 착용한 신발류로 인해 야기되는 반복적인 발 상해를 지각할 수 없다. 신경병증은 보행의 생체역학 변경과 함께 발의 취약 부분에 반복적인 둔상(blunt trauma) 및 비정상적으로 높은 스트레스 부과를 야기하고, 이로 인해 가골(假骨) 형성 및 피부 짓무름이 발생한다. 일단 궤양이 형성되면, 흔히 치유가 더디고, 국소 또는 전신 감염 위험 발생 및 그러한 위험의 증가를 야기할 수 있고, 치유 촉진을 위해 광범위한 의학적 및 외과적 관리가 요구된다.

또한, 창상 치유를 가속화하는 단백질 요법, 예를 들어 만성 (예를 들어 당뇨병성 족부 궤양) 창상의 치유를 가속화하는 단백질 요법을 개발하려는 시도가 있다. 창상 영역은 부적당한 환경 (단백질분해 효소, 감염 심화와 더불어 단백질 활성에 대한 천연 생성 억제제)에 있고, 여기서는 흔히 질환 상태 (예를 들어 당뇨병)에서 숙주 인자가 변경된다 (예를 들어 당뇨병에서는, VEGF 발현 저해, 저산소증에 대한 VEGF 반응 감소, 세포 대사 변경, 면역/염증성 반응의 저해 등). 예를 들어, 시험관내 연구에서, 당뇨병성 (db/db) 마우스의 각질세포 및 섬유아세포는 정상적인 조직 복구에 필수적인 세포 과정의 선택적 장해를 나타냈고, db/db 섬유아세포는 유의하게 감소된 세포 이동 및 성장 인자 변경을 나타냈다. 예를 들어 문헌 ([Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing, J. Biol. Chem., 270:12607-13 (1995)] 및 [Lerman et al, Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast:impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia, Am. J. Pathol., 162:303-12 (2003)])을 참조한다.

본원에서는, 유효량의 VEGF 또는 VEGF 아고니스트를 투여하여 창상 치유를 가속화하고/하거나 개선시키는 방법이 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 유효량의 VEGF를 대상체의 창상에 투여하는 것을 포함하며, 유효량의 VEGF 투여는 창상 치유를 가속화한다. 상기 방법은 또한 대상체 집단에서의 창상 치유 개선 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 유효량의 VEGF를 상기 집단의 대상체의 창상에 투여하는 것을 포함하고, 유효량의 VEGF 투여는 대조군과 비교시에 상기 집단에서의 창상 치유를 10％ 초과 (또는 12％ 초과, 또는 14％ 초과, 또는 15％ 초과, 또는 17％ 초과, 또는 20％ 초과, 또는 25％ 초과, 또는 30％ 초과, 또는 33％ 초과, 또는 35％ 초과, 또는 40％ 초과, 또는 45％ 초과, 또는 50％ 초과 또는 그 이상)로 개선시킨다. 궤양의 재발 감소 방법도 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 유효량의 VEGF를 궤양에 투여하는 것을 포함하고, 이때 궤양 재발의 발생이 대조군과 비교시에 VEGF 투여로 인해 감소된다.

상기 방법은 또한 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 처치를 받고 있거나, 그러한 처치를 받은 적이 있는 대상체에 적용될 수도 있다. 이러한 처치로는 투약, 방사선조사, 면역계 저해를 야기하는 처치 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 임의로는, 본 발명의 대상체는 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 2차 상태에 있다. 2차 상태의 예로는 당뇨병, 말초 혈관 질환, 감염, 자가면역 또는 콜라겐 혈관 장애, 면역계 저해를 야기하는 질환 상태 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

창상 치유의 가속화는 창상 치유의 가속화율(％) 및/또는 해저드 비율로 기재될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유효량의 VEGF 투여는 대조군과 비교시에 창상 치유를 50％ 초과, 또는 60％ 이상, 70％ 이상, 74％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 100％ 이상, 110％ 이상 또는 더 많이 가속화한다. 특정 실시양태에서, 유효량의 VEGF 투여는 대조군과 비교시에 창상 치유를 60％ 내지 110％ 초과 가속화한다. 특정 실시양태에서, 창상 치유의 가속화는 1.75 이상, 또는 1.80 이상, 또는 1.85 이상, 또는 1.95 이상, 또는 2.0 이상, 또는 2.1 이상, 또는 2.2 이상, 또는 2.3 이상이거나, 그보다 더 높은 해저드 비율로 기재된다. 특정 실시양태에서, 창상 치유의 가속화는 1.75 내지 2.3의 해저드 비율로 기재된다.

본 발명의 대상체에는 1개 이상의 창상이 있다. 창상은 만성, 급성 또는 통상의 창상일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료될 창상은 단계 1A 창상이다. 표 2의 창상 단계를 참조한다. 본 발명의 창상은 임의로 감염 또는 허혈, 또는 감염과 허혈을 둘다 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 창상은 당뇨병성 족부 궤양이다. 한 실시양태에서, 상기 창상은 VEGF 투여 전 대상체에 약 4주 이상 동안 또는 약 6주 이상 동안 존재한다.

	창상 등급/심도
단계/ 동반이환	0	1	2	3
A	궤양전 또는 궤양후 병변이 완벽하게 상피화됨	힘줄, 피막, 또는 뼈와 무관한 표층성 궤양	힘줄 또는 피막으로의 궤양 침투	뼈 또는 관절로의 궤양 침투
B	감염 수반	감염 수반	감염 수반	감염 수반
C	허혈 수반	허혈 수반	허혈 수반	허혈 수반
D	감염 및 허혈 수반	감염 및 허혈 수반	감염 및 허혈 수반	감염 및 허혈 수반

창상 치유 평가에 정량적 분석이 이용될 수 있으며, 예를 들어 창상 면적에서의 감소율(％), 또는 완벽한 창상 봉합 (예를 들어, 배액법 또는 드레싱이 필요 없는 피부 봉합으로 결정됨)을 결정한다. 창상 면적은 당업자에게 공지된 방법에 의한 처치 전, 처치 동안 및 처치 후에 평가된다. 예를 들어, 평가는 정량적 면적계측 (예를 들어 문헌 [Robson et al., Arch. Surg 135:773-77 (2000)] 참조), 사진, 물리적 시험 등으로 결정할 수 있다. 창상 면적은 처치 전, 처치 동안 및 처치 후에 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 창상 면적은 창상의 길이 (L), 연부에서 연부까지의 최장 길이 (예를 들어 cm) 및 너비 (W), L에 수직인 연부에서 연부까지의 최장 너비 (예를 들어 cm)를 측정하고, L × W 곱셈을 계산하여 표면적 추정치 (㎠)를 얻어서 추정할 수 있다. 치료될 창상의 크기는 다양할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 치료 전의 창상 면적은 약 0.4 ㎠ 이상, 또는 약 1.0 ㎠ 이상, 또는 약 0.4 ㎠ 내지 약 10 ㎠, 또는 약 1 ㎠ 내지 약 10 ㎠, 또는 약 1 ㎠ 내지 약 6.5 ㎠, 또는 약 1 ㎠ 내지 약 5 ㎠, 또는 4.0 ㎠ 초과이다. 상기 면적은 창면절제술 이전 또는 이후에 측정될 수 있다.

VEGF

본원의 방법에서는 창상 치유의 가속화 촉진 또는 개선을 위해 유효량의 VEGF가 투여된다. VEGF는, 혈관 시스템 발생의 핵심 조절자 중 하나인 VEGF 유전자 족의 구성원이다. VEGF 유전자 족으로는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 및 태반 성장 인자 (PlGF) 등이 있다. 예를 들어 문헌 ([Ferrara, Role of Vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Sem Oncol., 29(suppl 16):10-14 (2002)] 및 [Veikkola and Alitalo, VEGFs receptors and angiogenesis Semin Cancer Biol. 9:211-220 (1999)])을 참조한다. VEGF라고도 공지되어 있는 VEGF-A는 정상적인 혈관형성, 예를 들어 정상적인 창상 치유 및 골 치유 및 비정상적인 혈관형성, 예를 들어 종양 및 안과 장애에서의 혈관 증식 (예를 들어, 노화 관련 퇴행, 당뇨병성 망막증)에 있어서의 주요 조절자이다. 예를 들어 문헌 ([Ferrara, Vascular Endothelial Growth Factor:Basic Science and Clinical Progress, Endocrine Reviews 25(4):581-611 (2004)], [Ferrara and Henzel, Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem, Biophys Res Comm 161:851-58 (1989)] 및 [Leung et al., Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen, Science 246:1306-9 (1989)])을 참조한다. VEGF 활성을 갖는 VEGF 변이체 및 VEGF 수용체의 아고니스트, 예를 들어, VEGFR1 및/또는 VEGFR2 아고니스트를 VEGF 대신 사용하거나 그와 함께 병용하는 것도 본 발명의 범위 내에 속한다.

인간 VEGF는 염색체 6에 위치한 8개 엑손으로 조직화되는 단일 유전자 mRNA의 선택적 스플라이싱으로 인한, 적어도 6종의 이소형 (VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉ 및 VEGF₂₀₆)으로 존재한다 (예를 들어 문헌 [Ferrara N, Davis Smyth T. Endocr Rev 18:1-22 (1997)] 및 [Henry and Abraham, Review of Preclinical and Clinical Results with Vascular Endothelial Growth Factors for Therapeutic Angiogenesis, Current Interventional Cardiology Reports, 2:228-241 (2000)] 참조). 또한, 미국 특허 제5,332,671호 및 동 제6,899,882호를 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 VEGF₁₆₅가 투여된다. 전형적으로는 인간 VEGF₁₆₅가 사용된다 (예를 들어, 재조합 인간 VEGF₁₆₅). 가장 풍부한 이소형인 VEGF₁₆₅는 염기성 헤파린 결합 2량체성 공유 당단백질로서 분자량은 약 45,000 달톤이다 (동일 문헌). VEGF₁₆₅ 동종이량체는 165개 아미노산 쇄 2개로 구성된다. 상기 단백질은 수용체 결합 도메인 (잔기 1 내지 110) 및 헤파린 결합 도메인 (잔기 110 내지 165)의 2개의 독특한 도메인을 갖는다. 상기 도메인들은 7개의 분자내 디술피드 결합에 의해 안정화되고, 단량체는 2개의 쇄간 디술피드 결합으로 연결되어 천연 동종이량체를 형성한다. VEGF₁₂₁에는 헤파린 결합 도메인이 없지만 (예를 들어 미국 특허 제5,194,596호 참조), VEGF₁₈₉ (예를 들어 미국 특허 제5,008,196호, 동 제5,036,003호 및 동 제5,240,848호 참조) 및 VEGF₂₀₆은 세포외 매트릭스에서 격리된다. 예를 들어 문헌 [Ferrara VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors, Nature Rev. Cancer 2:795-803 (2002)]을 참조한다.

VEGF의 생물학적 효과는 고친화도 티로신 키나제 수용체를 통해 매개된다. VEGF 수용체의 아고니스트 역시 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 2종의 VEGF 수용체 티로신 키나제인 VEGFR1 및 VEGFR2가 동정되었다 ([Shibuya et al. Oncogene 5:519-24 (1990)], [Matthews et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:9026-30 (1991)], [Terman et al., Oncogene 6:1677-83 (1991)], [Terman et al. Biochem Biophys Res Commun 187:1579-86 (1992)], [de Vries et al., Science 255:989-91 (1992)], [Millauer et al. Cell 72:835-46 (1993)] 및 [Quinn et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:7533-7 (1993)]). VEGFR1은 VEGF에 가장 높은 친화도를 가지며 Kd가 약 10 내지 20 pM이고 [de Vries et al., Science 255:989-91 (1992)], VEGFR2는 VEGF에 약간 더 낮은 친화도를 가지며 Kd가 약 75 내지 125 pM이다 ([Terman et al., Oncogene 6:1677-83 (1991)], [Millauer et al. Cell 72:835-46 (1993)] 및 [Quinn et al. Proc Natl Acad Sci USA 90:7533-7 (1993)]). 3번째 티로신 키나제 수용체인 VEGFR3이 동정되었고, 이것은 림프 혈관형성의 조절에 관여한다. VEGFR3은, VEGFR2에도 결합할 수 있는 VEGF-C 및 VEGF-D에 대한 수용체이다. 이들 수용체는 세포외 도메인 (7개의 이뮤노글로불린-유사 영역, 막횡단 영역을 포함함) 및 티로신 키나제 경로와 관련이 있는 요소를 함유하는 세포내 도메인으로 구성된다. VEGF-B 및 PlGF는 VEGFR1에는 결합하지만 VEGFR2에는 결합하지 않는다. VEGF₁₆₅는 또한 뉴런 세포 길잡이를 조절하는 수용체인 뉴로필린-1에도 결합한다. 뉴로필린-1은 VEGFR2와 동시발현될 때 VEGFR2에 대한 VEGF₁₆₅의 결합 및 VEGF-매개 화학주성을 증대시킨다. 다른 연구는 뉴로필린 2 (NP2)를 림프관 발생과 연결시켰다. 예를 들어 문헌 [Ferrara, Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress, Endocrine Reviews, 254(4):581-611]을 참조한다. VEGFR2는 VEGF-A에 결합한 후에 티로신 자가인산화가 일어나고, 이로 인해 이후의 혈관형성, 혈관 투과도 증가, 유사분열생식 및 화학주성이 야기된다.

VEGF는 저산소 상태하에 VEGF 유전자 발현의 조절 [Ferrara N, Davis Smyth T. Endocr Rev 18:1-22 (1997)], 미세혈관 및 거대혈관 내피 세포의 유사분열촉진 활성 ([Ferrara N, Henzel WJ. Biochem Biophys Res Commun 161:851-8 (1989)], [Leung et al., Science 246:1306-9 (1989)], [Connolly et al. J Clin Invest 84:1470-8 (1989a)], [Keck et al. Science 246:1309-12 (1989)], [Plouet et al., EMBO J 8:3801-6 (1989)], [Conn et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:2628-32 (1990)] 및 [Pepper et al., Exp Cell Res 210:298-305 (1994)]) 및 플라스미노겐 활성자 및 콜라게나제의 발현 유도 [Pepper et al., Biochem Biophys Res Commun 181:902-6 (1991)] 등을 비롯한 여러가지 생물학적 기능을 갖는다. 저산소증 동안, 저산소증-유도 인자-1 (HIP-1)이 상향-조절되고, VEGF 유전자의 프로모터 영역에 결합하여 전사를 활성화시킨다 (예를 들어, 문헌 [Wang et al., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular oxygen tension, PNAS USA 92:5510 (1995)] 참조). VEGF를 상향-조절할 수 있는 다른 아고니스트로는 사이토카인 (IL-6), 및 EGF, PDGF, bFGF 등을 비롯한 기타 성장 인자 등이 있다.

VEGF는 매우 다양한 정상 세포 유형 (예를 들어, 각질세포, 혈소판, 대식세포, 섬유아세포, 망막 세포, 난소 세포)에 의해 신체 전체 및 또한 각종 유형의 충실성 종양에서 생성된다. 지난 수년간의 연구로, 정상적인 혈관형성 및 비정상적인 혈관형성의 조절에 있어서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 핵심적인 역할이 수립되었다 [Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]. VEGF는 정상적인 배아 맥관형성, 심근세포 발생 (예를 들어, [Ferrara et al., Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene, Nature 380:439-42 (1996)] 참조), 정상적인 연골내 뼈 형성 (예를 들어, [Gerber et al., VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification, and angiogenesis during enchondral bone formation, Nat. Med, 5:623-28 (1999)] 참조), 조직 복구, 및 여성 생식관의 생리 (난포 성장 및 황체의 내분비 기능은 새로운 모세혈관의 증식에 의존적임) (예를 들어, 문헌 [Phillips et al., Vascular endothelial growth factor is expressed in rat corpus luteum, Endocrinology, 127:965-67 (1990)] 참조)에 필요한 성장 인자이다. 추가로, VEGF는 종양 및 안내(眼內) 장애와 관련된 신혈관생성의 핵심적인 매개자인 것으로 밝혀진 바 있다 [Ferrara et al.]. VEGF mRNA는 시험된 대다수의 인간 종양에서 과발현된다 ([Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993)], [Brown et al. Human Pathol., 26:86-91 (1995)], [Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)], [Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)] 및 [Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)]).

VEGF는 또한 동물 모델에서 혈관 누출을 유도하는 능력을 기초로 하여 혈관 투과 인자라고도 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Senger et al., Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid, Science 219:983-89 (1983)]을 참조한다. 센저(Senger) 및 동료들은 단백질에 대한 미세혈관 투과도 증가가 혈관형성에 있어서의 중대 단계라고 제안하였다. 예를 들어, 혈장 단백질의 누출 유도 및 세포외 피브린 겔의 형성은 내피 세포 성장에 충분한 매트릭스일 수 있고, 유사분열촉진 성장 인자의 역할이 이 과정을 증대시킬 수 있다. 혈관형성에는 또한 창상 치유 동안의 육아 조직 형성시에 림프구, 성장 인자, 및 산소의 이동이 허용될 것이 요구된다.

창상 치유시에, VEGF는 피부 창상 치유 동안의 혈관형성 유도에 중추적인 역할을 한다. 이것은 피부 미세혈관 내피 세포를 위한 강력한 유사분열촉진인자이고, 창상 치유 중의 각질세포에서 발현된다 (예를 들어 문헌 ([Nissen et al., Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activity during the proliferative phase of wound healing, Am. J. Pathol., 152:1445-52 (1998)], [Corral et al., Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblast growth factor during ischemic wound healing, Arch Surg., 134:200-5 (1999)], [Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing. J. Biol. Chem., 270:12607-13 (1995)], [Ballaun et al., Human keratinocytes express the three major splice forms of vascular endothelial growth factor, J. Invest Dermatol., 104:7-10 (1995)] 참조). 이것은 또한 측분비(paracrine) 방식으로 피부 미세혈관에 작용하여, 피부 혈관분포 및 육아 매트릭스 형성을 증가시킨다. 예를 들어 문헌 [Corral et al., 상기 문헌] 및 [Romano de Peppe, et al., Adenovirus-mediated VEGF165 gene transfer enhances wound healing by promoting angiogenesis in CD1 diabetic mice, Gen Ther., 9:1271-7 (2002)]을 참조한다. VEGF 수준 및 기타 혈관형성 인자가 변경될 때 조직 복구, 예를 들어 창상 치유 등에서의 결함이 관찰된다. 예를 들어 문헌 ([Howdieshell, et al., Antibody neutralization of vascular endothelial growth factor inhibits wound granulation tissue formation, J. Surg. Res.96:173-82 (2001)], [Street et al., Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover, PNAS USA, 99:9656-61 (2002)], [Tsou et al., Retroviral delivery of dominant-negative vascular endothelial growth factor receptor type 3 to murine wounds inhibits wound angiogenesis, Wound Repair Regen., 10:222-9 (2002)], [Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing. J. Biol. Chem., 270:12607-13 (1995)] 및 [Lerman et al., Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast:impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia, Am. J. Pathol., 162:303-12 (2003)])을 참조한다. 일부 동물 모델에서, 외인성 VEGF는 창상 치유를 촉진시켰다. 예를 들어 문헌 [Galliano et al., Topical Vascular Endothelial Growth Factor Accelerates Diabetic Wound Healing through increased angiogenesis and by Mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells, American Journal of Pathology, 164(6):1935-1947 (2004)], [Romano de Peppe S et al., Adenovirus-배지ted VEGF165 gene transfer enhances wound healing by promoting angiogenesis in CD1 diabetic mice, Gen Ther 9:1271-7 (2002)] 및 미국 특허 출원 제20030180259호를 참조한다.

상기한 바와 같이, 창상 치유를 가속화하는 단백질 요법을 개발하려는 시도가 있다. 본 발명자들은 본원에 VEGF 재조합 단백질 요법으로 창상 치유를 가속화하여 궤양을 치료하는 임상 시험을 기재한다. 본원의 실시예 1을 참조한다.

추가의 작용제

창상 치유를 가속화하고/하거나 개선시키는데 VEGF 요법을 1종 이상의 VEGF 활성 증진 요법, 예를 들어 GWC (Good Wound Care) 요법, 기타 신규하거나 통상적인 요법 (예를 들어, VEGF 족의 다른 구성원, 본원에 기재한 것과 같은 성장 인자, 신경 성장 인자 (NGF), 양성 혈관형성 인자 또는 작용제 또는 활성자, 동화성 스테로이드, 생물조작된 조직 대체법 (예를 들어, 아플리그래프(Apligraph)^®, 더르마그래프트(Dermagraft)^TM 등) 고압 산소, 진공 요법)과 병행하는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어 문헌 [Meier and Nanney, Emerging New Drugs for Wound Repair, Expert Opin. Emerging Drugs (2006) 11(1):23-37]을 참조한다.

6종의 주요 성장 인자 족 (EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF 및 VEGF)이 창상 치유와 관련이 있다. 예를 들어 문헌 [Nagai and Embil, Becaplermin:recombinant platelet derived growth factor, a new treatment for healing diabetic foot ulcers, Exprt Opin Biol. Ther 2:211-18 (2002)]을 참조한다. 이러한 성장 인자의 예로는 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C 및 PDGF-D), 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF 및 bFGF), 알파 및 베타 형질전환 성장 인자 (TGF-α 및 TGF-β (예를 들어, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3)), 표피 성장 인자 (EGF) 등이 있다. 상기 문헌을 참조한다. 이들 성장 인자는 창상 치유에 관여하는 1종 이상의 세포의 체세포분열을 자극하고, VEGF와 병용될 수 있다.

VEGF와 병용될 수 있는 기타 양성 혈관형성제로는 예를 들어 HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8 등 ([Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992)], [Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)]), 표 3의 혈관형성 활성자, 본원에 기재한 혈관형성 인자 및 혈관형성제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

혈관형성 활성자의 예

혈관형성

안지오포이에틴 1 및 2

Tie-2

알파-5 인테그린

매트릭스 메탈로프로테이나제

산화질소 (NO)

COX-2

TGF베타 및 수용체

VEGF 및 수용체

또한, 하기 제제, 예를 들어 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) (예를 들어, 베카플레르민(Becaplermin) (rhPDGF-BB) 예컨대 레그라넥스(Regranex) ®; 존슨 앤 존슨(Johnson ＆ Johnson) (참조, 예를 들어, 미국 특허 제5,457,093호; 동 제5,705,485호; 및 동 제5,427,778호; 문헌 [Perry, BH et al., A meta - analytic approach to an integrated summary of efficacy : a case study of becamplemin gel., Cont. Clin. Trials 23:389-408 (2002))], 아데노신-A2A 수용체 아고니스트 (예를 들어, MRE0094 (킹 파마슈티칼즈(King Pharmaceuticals))); 각질세포 성장 인자 (KGF-2, 레피페르민 (휴먼 게놈 사이언스즈(Human Genome Sciences))); 락토페린 (LF) (아게닉스, 인크.(Agennix, Inc.),); 티모신 베타-4 (Tβ4 (레진릭스 바이오파마슈티칼즈(ReGeneRx Biopharmaceuticals))); 트롬빈-유래 활성화 수용체 펩티드 (TP508; 크리살린(Chrysalin)^® (크리살리스 바이오테크놀로지, 인크.(Chrysalis Biotechnology, Inc.))); 아데노바이러스 벡터 코딩 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF-B) (GAM501) (셀렉티브 제네틱스(Selective Genetics)); 자가유래 골수 줄기 세포 (BMSC) (참조, 예를 들어, 문헌 [Badiavas ＆ Falanga, Treatment of chronic wounds with bone marrow - derived cells, Arch Dermatol, 139:510-16 (2003)]; 및 가공 생 조직 그라프트 (예를 들어, 아플리그라프(Apligraf) 등)는 VEGF 창상 치유 치료와 함께 병용될 수도 있다. 항생제 및 방부 궤양 제제는 VEGF 투여와 병용될 수도 있다. VEGF 투여는 면역억제 치료 (예를 들어, 코르티코스테로이드, 방사선조사 요법, 화학요법) 또는 암 치료와 함께 투여될 수도 있다.

이러한 동시처리 제제 또는 절차 자체가 본 발명의 조성물에 포함될 필요는 없지만, 이러한 제제가 단백질성인 경우에 그것이 통상적일 것이다. 이러한 혼합물은 VEGF가 단독으로 사용되는 것과 같이 동일한 방식으로 동일한 목적을 위해 적합하게 투여된다. VEGF 대 이러한 2차 치료 인자의 유용한 몰비는 전형적으로 1:0.1 내지 10이며, 본 발명의 한 실시양태에서는 대략 등몰의 양을 사용한다.

투여량 및 투여

본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획되는 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 숙련된 의사의 능력 내이다. 동물 실험은 인간 요법에 대한 유효 투여량의 결정을 위한 믿을 만한 지침을 제공할 수 있다. 유효 투여량의 이종간 크기 조절은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 의해 정해진 원칙에 따라 수행할 수 있다. VEGF 투여 동물 창상 모델에 대한 투여량-반응 곡선의 예는 도 2에서 알 수 있으며, 이는 토끼 허혈성 귀 창상에 투여된 VEGF에 대한 투여량 반응 곡선이다. 도 3은 당뇨병성 마우스 창상에 투여된 VEGF에 대한 투여량-반응 곡선이다. 질환 또는 창상 유형의 예방 또는 치료를 위해, VEGF의 적절한 투여량은 상기 정의된 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 제제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 전처리 요법, 환자 임상력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. VEGF는 치료될 특정 장애, 개별 환자의 증상, VEGF 전달 부위, 투여 방법 및 실시자에게 공지된 다른 인자를 고려한 양호한 의학 실무와 일치하는 방식으로 제제화 및 투여될 것이다.

사용될 투여량은 본원에 기재된 인자에 의존적이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 대상체의 증상 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어 0.1 내지 20 mg/kg)의 VEGF 및/또는 추가의 제제는 예를 들어 1회 이상의 별개 투여, 또는 연속 투여에 따라 수행하던지 간에 환자에 대한 투여 후보 투여량이다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제공된다. 한 실시양태에서, 투여되는 유효량의 VEGF는 약 20 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠, 또는 24 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 72 ㎍/㎠, 또는 72 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 216 ㎍/㎠, 또는 216 ㎍/㎠이다. 한 실시양태에서, 투여되는 VEGF의 유효량은 20 ㎍/㎠ 내지 250 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠ 내지 약 216 ㎍/㎠, 또는 24 ㎍/㎠ 내지 216 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 24 ㎍/㎠ 내지 약 72 ㎍/㎠, 또는 24 ㎍/㎠ 내지 72 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 72 ㎍/㎠ 내지 약 216 ㎍/㎠, 또는 72 ㎍/㎠ 내지 216 ㎍/㎠이다. 특정 실시양태에서, 투여 유효량은 약 216 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠, 또는 216 ㎍/㎠ 내지 250 ㎍/㎠이다. 제제는 일련 또는 1회의 처리에 걸쳐 대상체에게 적합하게 투여된다.

수 일 이상에 걸친 반복된 투여의 경우에, 질환 증상의 원하는 저해, 예를 들어 창상의 완벽한 봉합, 또는 창상 면적의 감소가 발생할 때까지 증상에 따라 처리는 지속된다. 그러나, 다른 투여 처방도 유용할 수 있다. 전형적으로, 임상의는 요구되는 생물학적 효과를 제공하는 투여(들)에 도달할 때까지 본 발명의 분자(들)를 투여할 것이다. 유효량의 VEGF 투여는 매일 이루어질 수도 있고, 또는 1주 당 수회, 예를 들어 1주 당 2회 이상 또는 1주 당 3회 이상, 또는 1주 당 4회 이상, 또는 1주 당 5회 이상, 또는 1주 당 6회 이상 이루어질 수도 있다. 한 실시양태에서, VEGF는 6주 이상, 또는 약 12주 이상 동안 투여되거나, 또는 완벽한 창상 봉합 (예를 들어, 배액법 또는 드레싱이 필요 없는 피부봉합으로 결정될 수 있음)시까지 투여된다. 본 발명의 특정 측면에서, VEGF는 20주 미만 동안 투여된다. 본 발명의 요법의 진행은 통상적 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.

본 발명의 치료 조성물은 대상체에 전형적으로 국소 투여된다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF는 국소 겔의 제제, 예를 들어 예비-충전된 주사기 또는 컨테이너 중에 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 또한 국소 투여된다. VEGF 및/또는 추가의 치료제의 다른 투여 경로는 임의로는 사용될 수도 있는데, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 초내, 경구, 및 비내 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다.

본원에 기재된 바와 같이, VEGF는 하나 이상의 추가의 치료제 또는 과정과 병용될 수 있다. 병용된 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동투여 및 양쪽 모든 순서의 연속적인 투여를 포함한다. 다중 제제의 사용도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, VEGF는 추가의 치료제의 투여 전에, 후에, 번갈아 투여될 수 있거나, 또는 그와 함께 동시에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 일정 기간 동안 양쪽 (또는 모든 ) 활성 제제가 동시에 그의 생물학적 활성을 발휘한다. 병용 요법 처방에서, 본 발명의 조성물은 치료 유효량 또는 치료 상조적 양으로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 치료 유효량은 VEGF 및 하나 이상의 다른 치료제의 공동-투여, 또는 투여 절차가 표적 질환 또는 증상을 감소시키거나 또는 억제하도록 하는 것이다. 치료 상조적 양은 창상 치유를 상조적 또는 유의하게 가속화하고/거나 개선시키는데 필요한, 예를 들어 본원에 기재된 VEGF 및 하나 이상의 다른 치료제의 양이다.

제약 조성물

본 발명에 따라 사용되는, 본 발명의 분자, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF와 병용되는 추가의 치료제의 치료 제제는 원하는 순도를 갖는 분자, 예를 들어 폴리펩티드를 동결건조 제제 또는 수성 용액 형태로 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조한다 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌를 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 알르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 생체내 투여용으로 사용될 제제는 멸균된다. 이는 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 용이하게 달성된다. VEGF는 동결건조 형태 또는 수성 용액 또는 겔 형태로 저장될 수 있다. VEGF 제제의 pH는 약 5 내지 9일 수 있지만, 더 높거나 또는 더 낮은 pH 값도 특정 예에서는 적절할 수도 있다. 부형제, 담체, 또는 안정화제의 특정 사용은 VEGF의 염을 형성할 수 있음이 이해될 것이다.

활성 성분은 예를 들어, 액적형성 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 미세에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼으로 제조된 마이크로캡슐 내에 포착될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 [Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990)]; [Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462]; 제WO 97/03692호, 제WO 96/40072호, 제WO 96/07399호; 및 미국 특허 제5,654,010호를 참조한다.

전형적으로 창상 치유의 경우에, VEGF는 부위-특이적 전달을 위해 제제화된다. 국소에 투여되는 경우에, VEGF는 다른 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 적합하게 조합된다. 이들이 제약상 허용되고 그의 의도된 투여에 효과가 있어야 하고 조성물의 활성 성분의 활성을 파괴할 수 없는 것을 제외하고는 이러한 다른 성분의 특성에 대한 제약은 없다. 적합한 비히클의 예에는 정제된 콜라겐과 함께 또는 없이 연고, 크림, 겔, 스프레이 또는 현탁액이 포함된다. 조성물은 멸균 드레싱, 경피 패치, 석고, 및 붕대로 임의로는 액체 또는 반-액체 형태로 함침될 수도 있다. 산화 재생 셀룰로스/콜라겐 매트릭스, 예를 들어 프로모그란(Promogran)^TM 매트릭스 창상 드레싱 또는 프로모그란 프리즈마 매트릭스(Promogran Prisma Matrix)^TM도 사용될 수 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 여기서 매트릭스는 구형 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐이다. 지속-방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능 미세구), 폴리-락트산-코글리콜산 (PLGA) 중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 100일 동안 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 체내에 존재하는 경우에, 이들은 37℃에서 습기에 노출되어 변성 또는 응집된 결과, 생물학적 활성을 감소시키고, 면역원성을 변화시킬 수 있다. 합리적 계획은 관련된 메카니즘에 따라 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통해 분자간 S-S 결합을 형성하는 것으로 발견되는 경우에, 안정화는 술프히드릴 잔기의 개질, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

겔 제제를 수득하기 위해, 액체 조성물에 제제화된 VEGF는 유효량의 수용성 다당류 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 국소적으로 가해지기에 적절한 점도의 겔을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 다당류에는 예를 들어 셀룰로스 유도체, 예컨대 에테르화 셀룰로스 유도체 (알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬히드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 히드록시프로필 셀룰로스 포함); 전분 및 분획 전분; 한천; 알긴산 및 알기네이트; 아라비아 고무; 풀룰란; 아가로스; 카라기닌; 덱스트란; 덱스트린; 프룩탄; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생중합체; 뿐만 아니라 검, 예컨대 크산탄 검; 구아르 검; 로쿠스트 콩 검; 아라비아 고무; 트래거캔스 검; 및 카라야 검; 및 유도체 및 그의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 겔화 제제는 본원에서 예를 들어 생물학적 시스템에 대해 불활성이고/거나, 비독성이고/거나, 제조가 간단하고/거나, 너무 무르거나 또는 점성이지 않고, 겔화 제제 내에 보유한 VEGF를 탈안정화시키지 않는 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 다당류는 에테르화 셀룰로스 유도체이며, 또다른 실시양태에서는 USP에 잘 정의되고, 정제되고, 열거된 것, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 히드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 한 실시양태에서, 메틸셀룰로스는 다당류이다.

겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적합한 점성을 얻기 위해 저분자량 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400 내지 600과 분자량 1500의 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물은 적절한 비율로 혼합되어 패이스트를 얻는 경우에 상기 목적에 유효할 것이다.

다당류 및 폴리에틸렌 글리콜에 사용되는 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산물을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 가용성은 에테르기의 치환 정도에 의해 결정되고, 본원에 유용한 안정화 유도체는 유도체 수용성을 부여하기 위해 셀룰로스 쇄 중에 무수글루코스 단위당 충분한 양의 이러한 에테르기를 가져야 한다. 무수글루코스 단위당 0.35개 이상의 에테르기의 에테르 치환 정도가 일반적으로 충분하다. 추가적으로, 셀룰로스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어, Li, Na, K, 또는 Cs 염의 형태일 수 있다.

메틸셀룰로스가 겔에 사용되는 경우에, 예를 들어 약 2 내지 5％, 또는 약 3％, 또는 약 4％ 또는 약 5％의 겔을 포함하고, VEGF는 겔 1 ml당 약 100 내지 2000 ㎍의 양으로 존재한다.

VEGF 및/또는 추가 제제는 유전자 요법에 의해 창상에 투여될 수도 있다. 유전자 요법은 대상체에 핵산을 투여하여 수행하는 요법을 나타낸다. 유전자 요법 응용에서, 유전자는 예를 들어 결실 유전자의 대체를 위해 치료 유효한 유전자성 생성물의 생체내 합성을 달성하기 위해 세포 내로 도입된다. "유전자 요법"에는 지속하는 효과가 단일 처리 및 치료 유효한 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여에 의해 달성되는 경우 모두의 통상적 유전자 요법이 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 비대전 기에 의한 그의 음성적 하전 포스포디에스테르기를 치환함으로써 개질시켜 그의 흡수를 증대시킬 수 있다. 유전자 요법의 방법에 대한 일반 개관의 대해 예를 들어 문헌 [Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)]; [Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan Science 260:926-932 (1993)]; [Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; 및 [May TIBTECH 11:155-215 (1993)]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 업계에 통상적으로 공지된 방법은 문헌 [Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, NY]; 및 [Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기재되어 있다.

생육가능 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 사용가능한 각종 기술이 있다. 상기 기술은 핵산이 배양된 세포에 시험관내 전달되거나 또는 목적 숙주 세포에 생체내 전달되는지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포에 시험관내 전달하기에 적합한 기술에는 리포솜, 전기천공법, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용이 포함된다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술에는 바이러스 (전형적으로 레트로바이러스) 벡터를 사용하는 형질감염 및 바이러스 코팅 단백질-리포솜 매개 형질감염 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)]이 포함된다. 예를 들어, 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 단순 I 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스)를 사용하는 형질감염 및 지질-기재 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)이 포함된다. 유전자 요법에 바이러스 벡터를 사용하는 예는 문헌 [Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)]; [Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994)]; [Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)]; [Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)]; [Bout et al. Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994)]; [Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991)]; [Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992)]; [Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)]; 및 [Walsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)]에서 알 수 있다.

일부 경우에서, 창상 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포에 대한 수용체에 대한 리간드 등으로 핵산 공급을 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우에, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 예를 들어 특정 세포 유형, 순환에서 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화 표적 및 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 지향인 캡시드 단백질 또는 그의 단편을 표적화 및/또는 그의 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내이입 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 표식 및 유전자 요법 프로토콜의 개관에 대해서는 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]을 참조한다.

본 발명의 폴리펩티드에 대한 공유 변형

본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF와 병용되는 다른 추가의 치료 폴리펩티드 제제의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들은 사용가능한 경우에 폴리펩티드의 화학 합성 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어질 수 있다. 폴리펩티드의 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드의 표적화 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도제와 반응시키거나, 변형된 아미노산 또는 비-천연 아미노산을 성장 폴리펩티드 쇄에 도입함으로써 분자에 도입된다 (예를 들어, 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]; [Noren et al. Science 244:182 (1989)]; 및 미국 특허 출원 제20030108885호 및 동 제20030082575호).

시스테이닐 잔기를 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 거의 통상적으로 반응시켜 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로메르쿠리벤조에이트, 2-클로로메르쿠리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도된다.

히스티딜 잔기는 상기 제제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문에 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카르보네이트와 반응시킴으로써 유도된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드는 또한 유용한데; 반응은 전형적으로 pH 6.0의 0.1 M 소듐 카코딜레이트에서 수행된다.

리시닐 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응된다. 이들 제제를 사용하는 유도는 리시닐 잔기의 하전을 거꾸로하는 효과를 가진다. α-아미노-함유 잔기를 유도하기 위한 다른 적합한 제제에는 이미도에스테르, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트를 사용하는 트랜스아미나제-촉매화 반응이 포함된다.

아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온, 및 닌히드린 중에 하나 또는 몇몇의 통상적 제제와의 반응에 의해 변형된다. 알르기닌 잔기의 유도는 높은 pK_a의 구아니딘 관능기 때문에 알칼리 조건에서 수행될 것을 요구한다. 더욱이, 이들 제제는 라이신의 기 뿐만 아니라 알르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.

티로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼 표지를 티로실 잔기 내로 도입하는 데 특히 흥미로울 수 있다. 가장 통상적으로, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 형성하기 위해 사용된다. 티로실 잔기를 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I로 요오드화하여 방사능면역검정에 사용되는 표지된 단백질을 생산한다.

카르복시 측쇄 기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R') (여기서, R 및 R'은 상이한 알킬기임), 예컨대 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건하에 탈아미드화된다. 탈아미드화된 형태의 이들 잔기는 본 발명의 범위에 속한다.

다른 변형에는 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 알르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복시기의 아미드화가 포함된다.

또다른 유형의 공유 변형은 본 발명의 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 이들 과정은 이들이 N- 또는 O-연결 글리코실화에 대한 글리코실화능을 갖는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생산을 요구하지 않는 것이 이점이다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 알르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복시기, (c) 유리 술프히드릴기, 예컨대 시스테인의 유리 술프히드릴기, (d) 유리 히드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 제WO 87/05330호 (1987년 9월 11일자로 공개됨) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드 상에 존재하는 임의의 탄수화물 잔기의 제거는 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 요구한다. 이 처리는 연결 당 (N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 제외한 대부분 또는 모든 당을 절단하지만, 폴리펩티드는 손상시키지 않는다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)] 및 [Edge et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 예를 들어 항체 상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 공유 변형의 또다른 유형은 폴리펩티드를 각종 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 연결하는 것을 포함한다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명의 폴리펩티드는 용이하게 입수가능한 기술 및 재료로 재조합적으로 생산할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF와 병용되는 추가의 치료 폴리펩티드 제제의 재조합 생산의 경우에, 그를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터 내로 삽입한다. 다수의 벡터가 사용가능하다. 일반적으로 벡터 성분으로는 하기 중 하나 이상 등이 있으나 이에 제한되지 않는다: 조절 서열, 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

표현 "조절 서열"은 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 특정 숙주 유기체에서 발현하기 위해 필요한 DNA 서열을 나타낸다. 원핵생물에 적합한 조절 서열에는 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계 내에 위치하는 경우에 "작동가능하게 연결된다." 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되어 있거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 대해 작동가능하게 연결되어 있거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우에 코딩 서열에 대해 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하여 위치하고, 분비 리더의 경우에 판독 단계에서 인접하여 위치하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한효소절단 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 실무에 따라 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 통상적 과정으로 용이하게 단리되고/거나 서열분석된다. 예를 들어, VEGF 코딩 DNA를 단리하고, 예를 들어 VEGF 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 서열분석하였다. "단리된" 핵산 분자는 폴리펩티드 핵산의 천연 공급원과 보통 관련된 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정하고 분리한 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견된 형태 또는 셋팅 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하기 때문에 핵산 분자로부터 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는 폴리펩티드를 보통 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자가 포함되며, 여기서 예를 들어 핵산 분자는 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있다.

신호 서열 성분

본 발명의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드 (이는 전형적으로 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드임)로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 전형적으로 선별된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 (즉, 신호 팹티다제에 의한 절단) 인식 및 프로세싱되는 것이다. 천연 폴리펩티드 신호 서열을 인식하지 않고 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비의 경우에, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 제WO 90/13646호에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 헤르페스 단순 gD 신호가 사용가능하다.

이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임으로 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 라이게이션된다.

복제 성분의 기점

발현 및 클로닝 벡터 모두는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터를 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 숙주 염색체 DNA에 독립적으로 벡터를 복제시킬 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 각종 박테리아, 효모, 및 바이러스에 잘 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터 클로닝에 유용하다. 일반적으로, 복제 성분의 기점은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있음).

선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선별 유전자 (또한, 선별가능한 마커로도 칭함)를 함유할 수 있다. 전형적 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구 결실을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지에서 사용가능하지 않은 중요한 영양물 (예를 들어, 바실리(Bacilli)의 경우에 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)을 제공하는 단백질을 코딩한다.

선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 저지하는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선별 처리에 생존한다. 이러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.

포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또다른 예는 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 전형적으로 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 수용하는 수용능 세포를 동정할 수 있는 것이다.

예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제트인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유한 배양 배지에 배양함으로써 먼저 동정된다. 적절한 숙주 세포는 야생형 DHFR이 사용되는 경우에 DHFR 활성을 결실한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 본 발명의 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별가능한 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유한 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별제, 예컨대 아미노글리코시드 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유한 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호 참조).

효모에 사용되는 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]. trp1 유전자는 트립토판에서의 성장능이 결실된 효모의 돌연변이체 계통에 대한 선별 마커를 제공한다 (예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1, 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]). 효모 숙주 세포 게놈 중의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 탐지하기에 유효한 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결실 효모 계통 (ATCC 20,622 또는 38,626)은 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산에 대한 발현 시스템은 문헌 [K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]에 보고되었다. 클루이베로마이세스의 산업적 계통에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비에 안정한 다중-카피 발현 벡터도 개시되어 있다 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)].

프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인지되는 프로모터를 함유하고, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주를 사용하기에 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 함유할 것이다.

프로모터 서열은 진핵세포에 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 상류로 대략 25 내지 30개 염기에 위치한 AT-풍부 영역을 가진다. 다수의 유전자의 전사 개시로부터 상류로 70 내지 80개 염기에 알려진 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N이 임의의 뉴클레오티드일 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단은 폴리 A 꼬리를 코딩 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이다. 모든 이들 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.

효모 숙주를 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포플루크토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소메라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소메라제, 포스포글루코스 이소메라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 퇴행성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현의 사용에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 제EP 73,657호에 기재되어 있다. 효모 인핸서는 또한 효모 프로모터로 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터 본 발명의 폴리펩티드의 전사는 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육아종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 전형적으로 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터에 의해 조절되며, 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용가능하다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 복제의 SV40 바이러스 기점을 또한 함유한 SV40 제한효소절단 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한효소절단 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하는 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 헤르페스 단순 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터 조절하에서 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 관해서는 또한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 사용될 수 있다.

인핸서 요소 성분

더 고급의 진핵세포동물에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터내로 삽입하는 것에 의해 증가된다. 다수의 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예에는 복제 기점의 후기 쪽 상의 SV40 인핸서 (bp 100 내지 270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 쪽 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 요소를 증대시키는 것에 관해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 벡터 내로 폴리펩티드-코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에 스플라이싱될 수 있지만, 전형적으로 프로모터로부터의 부위 5'에 위치한다.

전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다중대사 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3'의 비번역 영역으로부터 입수가능하다. 이들 영역은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부위에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 제WO 94/11026호를 참조하고, 발현 벡터는 그 문헌에 개시되어 있다.

숙주 세포의 선별 및 형질전환

본원에서 벡터 중의 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기 기재된 더 고급의 진핵세포동물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜리(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 쉬겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli) 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 제DD 266,710호에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 전형적으로, 이. 콜리 클로닝 숙주가 이. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 계통, 예컨대 이. 콜리 B, 이. 콜리 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한보다는 설명을 위한 것이다.

원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예컨대 선형 진균 또는 효모가 본 발명의 폴리펩티드-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 저급 진핵 숙주 미생물 중에 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 계통, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 숙주 예컨대, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (제EP 402,226호); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (제EP 183,070호); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia) (제EP 244,234호); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 쉬완니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 선형 진균, 예컨대 뉴로스포라, 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니게르(A. niger)가 통상적으로 입수가능하고, 본원에 유용하다.

본 발명의 글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다중대사 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 다수의 베큘로바이러스 계통 및 변이체 및 숙주로부터의 상응하는 증식허용 곤충 숙주 세포, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)가 동정되어 있다. 형질감염에 대한 각종 바이러스 계통, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 계통이 공공연하게 사용되고 있고, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본원에 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양도 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포에 가장 흥미를 가지고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 통상적 과정이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통 (현탁액 배양물에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 카닌 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 주 (Hep G2)가 있다.

숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 개질된 통상적 영양 배지에서 배양한다.

숙주 세포의 배양

본 발명의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 시판 입수가능한 배지, 예컨대 함스(Ham's) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, 시그마), 간세포에 통상적인 성장 배지 (캄브렉스(Cambrex)), 전-지방세포용 성장 배지 (캄브렉스)등이 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호, 동 제4,657,866호, 동 제4,927,762호, 동 제4,560,655호 또는 동 제5,122,469호, 제WO 90/03430호, 제WO 87/00195호 또는 미국 특허 제Re 30,985호에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, GENTAMYCIN™drug), 미량 요소 (최종 농도가 마이크로몰 범위로 보통 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요 보충물도 당업자에게 공지되는 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포로 이전에 사용된 조건이고, 당업자에게 명백할 것이다.

폴리펩티드 정제

재조합 기술을 사용하는 경우에, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF와 병용되는 추가 치료 폴리펩티드 제제는 세포내, 원형질막 주위공간에서 생산되거나, 또는 배지로 직접적으로 분비될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균물로부터 회수 및/또는 단리될 수 있다. "단리된" 폴리펩티드는 동정되어 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 간섭하는 물질이고, 그에는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정되어 폴리펩티드의 95 중량％ 이상 또는 99 중량％ 이상, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 15 잔기 이상의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 얻기에 충분한 정도, 또는 (3) 쿠마시에 블루, 또는 실버 염색을 사용하는 환원 또는 비환원 조건하의 SDS-PAGE에 의해 확인되는 균질성 정도로 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 성분의 폴리펩티드에 대한 천연 환경이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 계내의 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 생산될 것이다.

단백질 정제의 각종 방법이 사용될 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)는 예를 들어 사용되는 생산 과정의 특성 및 생산되는 본 발명의 특정 폴리펩티드에 따라 달라질 것이다. 막-결합인 경우에, 본 발명의 폴리펩티드는 적합한 세제 용액 (예를 들어 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 각종 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용균제에 의해 파쇄될 수 있다. 하기 과정은 적합한 정제 과정의 예이다: 이온-교환 칼럼 상의 분획; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 크로마토그래피 상의 크로마토그래피 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼, DEAE 등); 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 오염물, 예컨대 IgG를 제거하는 단백질 A 세파로스(Sepharose) 칼럼; 및 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-태깅 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼.

예를 들어, 세포로부터 생산한 VEGF 조성물은 예를 들어 헤파린 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 투석으로 정제될 수 있다. 단백질 정제를 위한 다른 기술도 사용될 수 있다.

제조품

본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 방법 및 창상 치료에 유용한 물질을 함유한 제조품을 제공한다. 제조품은 컨테이너, 라벨 및 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 드레싱, 붕대 등을 포함한다. 컨테이너는 각종 물질 예컨대 유리, 플라스틱, 나일론, 면, 폴리에스테르 등으로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 증상을 치료하기에 유용한 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가지거나 또는 다중 투여량을 갖는 튜브이거나 또는 활성 제제의 측정량을 표시하는 주사기일 수 있다. 조성물 중의 하나 이상의 활성 제제는 컨테이너에 포함된다. 컨테이너 상의 또는 그와 관련된 라벨은 조성물이 창상 치유를 가속화 또는 개선시키기 위해 사용됨을 나타낸다. 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 일반 염수, 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액, 또는 겔 용액을 포함하는 제2 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 드레싱, 붕대, 애플러케이터(applicator), 거즈, 장벽, 반-투과성 장벽, 혀누르개, 바늘, 및 주사기를 포함하는, 시판자 및 사용자 관점에 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 임의로는, 본원에 기재되어 있는 창상에 투여하기 위한 VEGF의 사용법 및 투여량과 관련된 지시 세트, 일반적으로 지시서가 포함된다. 키트와 포함된 지시서는 일반적으로 장애 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. VEGF의 컨테이너는 단위 투여, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-투여 패키지), 또는 서브-단위 투여일 수 있다.

본원 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 고려된다. 더욱이, 본원에 나타내고 기재한 것 외에, 본 발명의 각종 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 자명하게 될 것이고, 첨부된 청구의 범위 내에 속한다.

본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 위한 것이고, 그의 견해로 비추어서 각종 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 이는 본원의 취지 및 범위, 및 첨부된 청구의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예 1: 창상 치유 VGF2763g 임상 시험에서의 국소적 VEGF

이중 맹검 (예를 들어, 제약자 비-맹검, MD 맹검 및 환자 맹검) 임상 시험 을, 국소적 VEGF의 투여가 당뇨병성 궤양형성을 갖는 인간 대상체에서 창상 치유을 촉진시킬 수 있는지를 결정하기 위해 수행하였다. 당뇨병성 창상을 치료하기 위해 rhVEGF ("텔베르민(Telbermin)"으로서 본원에 나타냄)를 투여하는 연구에서 환자의 기저수준 질환 특징의 차트에 대해 하기 표 4를 참조한다. 연구 디자인은 도 1에 나타낸다.

기저수준 질환 특징
	위약 (N=26)	텔베르민 (N=29)
평균 연령, y (범위)	59.3 (38-81)	59.5 (42-74)
평균 글루코스, mg/dL (범위)*	225.8 (77-465)	179.1 (29-593)
평균 HbA1C, ％ (범위)†	8.4 (5.5-13.6)	8.3 (5.6-13.6)
스크리닝에서 창상제거한 궤양, N(％) 예 아니요	21 (80.8) 5 (19.2)	27 (93.1) 2 (6.9)
평균 궤양 면적, ㎠ (범위) 스크리닝에서의 길이 x 폭 스크리닝에서의 면적측정 ‡ 제1일에서의 면적측정	1.85 (1.08-2.90) 1.14 (0.50-2.24) 1.05 (0.62-2.34)	1.92 (0.96-4.08) 1.35 (0.59-3.51) 1.15 (0.44-2.97)

* 1명의 위약-처치 대상체는 글루코스 값의 누락으로 인해 요약에서 제외함.

† 1명의 텔베르민-처치 대상체는 HbA1C값 누락으로 인해 요약에서 제외함.

‡ 2명의 위약-처치 대상체는 기저수준 면적계측 평가를 수행하지 않음.

24명의 위약 처치 환자는 처치기를 완료하였고, 22명은 관찰기를 완료하였다. 27명의 텔베르민 (국소적 재조합 VEGF) 처치 환자는 처치기를 완료하고, 22명은 관찰기를 완료하였다. 표층성 창상 (예를 들어, UT 단계 1a에서 (뼈, 근육, 힘줄은 아님), 표 2 참조)인 창상제거 궤양 면적이 제1일 째에 ≥ 0.4 ㎠ 및 ≤ 4.0 ㎠인 제I형 또는 제II형 진성 당뇨병 (조절된 글리코실화 헤모글로빈 Alc (HbA1c) ≤ 12％)을 앓고 있는 환자는 6주 동안 매주 3회의 VEGF 또는 위약 (총 18회 투여)으로 처치하였다. 처치는 매 48시간 (+/- 24시간)마다 1주당 3회 미만의 투여이다. 처치당 VEGF의 양은 72 ㎍/㎠이었다. VEGF는 현장에서 제조하였다. 0.22 ml의 VEGF (5 mg/ml) 또는 위약 (완충제 비히클)을 바이알로부터 들어내고, 5 mM 숙시네이트 완충제 (pH 5.0) 중의 약 5％ 메틸셀룰로스 (예를 들어, 4.7％) (예를 들어, 메토셀(Methocel) A4M 프리미엄 메틸셀룰로스 (미국 미시건주 미들랜드 소재의 더 다우 케미컬 컴퍼니(The Dow Chemical Company)) 제제에 첨가하였다. VEGF 또는 위약 및 겔을 2시간 동안 혼합하여 투여시에 점성을 증가시키고, 투여 물질의 손실을 저하시키다. 5 mM 숙시네이트 완충제 (pH 5.0) 중의 최종 0.06％ VEGF 겔 (최종 겔 3％ 메틸셀룰로스)이 최종 투여 물질이었다 (예를 들어, VEGF 1.8 mg/ml, 0.0036％ 폴리소르베이트 20 및 100 mM 트레할로스 데히드레이트를 가짐). 최종 투여 물질은 예를 들어 0.6 mL의 최종 투여 물질이 충전된 1.0 ml 투베르쿨린 주사기로 투여하였다.

전형적으로, 궤양은 만성 궤양이었다. 치료 전 궤양 기간은 4주 이상 내지 6개월 미만이었다. 활성 감염이 없었고, 대상체의 팔다리에 관류시키고; 발목-위팔 지수(ankle-brachial index; ABI) ≥ 0.6이고 연구 발 상에서는 1.2 이하이었다. 처치 동안 2개 군의 VEGF 또는 위약은 GWC (Good Wound Care) 관리기준을 가지고, 물리적 시험, 면적계측 추적 및/또는 35-mm 사진 (예를 들어, 문헌 [Food and Drug Administration (FDA) Guidance for Industry 2000, Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds-Developing Products for Treatment, June 2000])와 같은 매주 평가를 수행하였다.

어드레싱될 종료시기(endpoint)는 배액법 또는 드레싱이 필요 없는 피부봉합을 포함하고 창상 치유를 가속화하는 완벽한 창상 봉합의 발생시이며 (예를 들어, 봉합후 3개월에 평가함), 여기서 속도는 예를 들어 완벽한 봉합이 이루어질 때까지의 임상적으로 유의한 감소, 및 현상 분석에 대한 시간 (예를 들어, 완벽한 봉합에 대한 시간)을 반영한다. 1차 효능 종료시기는 제43일 (최대 제49일)째에 기저수준으로부터의 총 궤양 표면적의 감소율이며, 이는 궤양의 면적계측 추적의 정량적 분석에 의해 측정된다. 2차 효능 종료시기는 기저수준 (예를 들어, 제1일 값)에 비해 제29일 및 제84일째에서의 총 궤양 표면적의 감소율, 제29일, 제43일 및 제84일에서의 완벽한 궤양 치유의 발생, 궤양의 완벽한 치유를 위한 시간(예를 들어, 수일), 치료의 종료 전에 완벽한 궤양 치유를 갖는 대상체에 대한 궤양 형성의 재발 시간 (예를 들어, 수일), 기저수준에 비해 증가된 총 궤양 표면적 (> 15％)의 발생, 진행되는 궤양 단계의 발생 (예를 들어, 〉 UT 1a), 및 제1일, 제8일, 제22일 및 제43일째의 궤양 층의 미세순환 관류를 포함한다.

모니터링된 안전성 문제는 임상적으로 유의한 저혈압 (예를 들어, 제1 처치 주 (제1일, 제3일 및 제5일) 동안 연구 약물의 각 투여량을 투여한 60분 후에 예비투여에 상대적인 수축 혈압의 ≥ 35 mmHg 하강으로 정의됨), 임상적으로 유의한 궤양 감염 (예를 들어, 궤양으로부터의 증가된 배출 및 악취 삼출물, 열 (온도 ≥ 38.6℃), 및 백혈구 (WBC) 계수 〉 10,000 ㎕로 정의됨), 항-VEGF 항체 등의 생산을 포함한다. 혈압은 제1 주 동안 각 투여 전 및 60분 후에 측정하였다.

각 처치를 위해 사용되는 겔의 총 부피는 0.12 내지 0.48 mL (VEGF 72 ㎍ 내지 288 ㎍)이다. 사용되는 겔의 양은 창상 측정치 (L × W)를 기초로 하며, 여기서 L은 연부에서 연부까지의 최장 길이 (cm)이고, W는 L에 수직인 연부에서 연부까지의 최장 너비 (cm)이다 (L × W = 표면적 추정치 (㎠)). 예를 들어, 겔은 멸균 혀누르개를 사용하여 가하고, 여기서 궤양의 전체 표면에 걸쳐 가해지는 겔의 총량은 두께 1/16''이었다. 창상을 멸균 반투과성 장벽 (예를 들어, 어댑터(adaptec) 필름 드레싱)으로 덮고, 면 거즈 (예를 들어, 케를릭스(Kerlix)) 랩으로 랩핑하였다. 다음 처치에서, 드레싱을 제거하고, 궤양을 멸균 일반 염수로 서서히 세척하였다. 궤양 표면을 다시 측정하고, 적절한 투여량의 겔을 가하고, 궤양을 제거하였다.

결과: 국소적 VEGF는 안전하고 잘 허용되는 것으로 나타난다. 부작용의 발생은 처치 군 (텔베르민 및 위약 군) 간에 유사하다. 연구 약물을 사용한 결과, 부작용 또는 심각한 부작용이 관찰되지 않았다. 2명의 환자는 심각한 부작용 때문에 연구를 중단하였다 (텔베르민 군 → 감염 피부궤양에서 1명; 위약 군 → 국소화 감염에서 1명). 텔베르민 군에서 최종 처치 4일 후에 1명의 환자가 사망하였지만, 사인은 연구 약물이 아니었다. 임상적으로 유의한 저혈압은 양 처치 군에서 관찰되지 않았다.

상기 데이터는 생물학적 활성의 증명을 제시한다. 안전성 신호는 UT 단계 1a인 작은 궤양 크기를 갖는 시험에서 관찰되지 않았다. 창상 면적에서의 정중 감소율(％), 완벽한 치유를 갖는 대상체 (％) 및 치유에 대한 시간의 결과에 대한 요약은 하기 표 5를 참조한다. 6주 동안 주당 3회 VEGF로 치료된 당뇨병성 대상체에서, 대상체 집단은 위약에 비해 VEGF를 사용하는 6주 후에 완벽한 창상 치유를 14 내지 25％ 개선하였음을 나타냈다. 상기 시험은 VEGF가 위약보다 치유를 ~75 내지 100％ 가속화시켰음을 나타냈다. 텔베르민 (rhVEGF) 또는 위약으로 처치한 환자에서의 제1 완벽 궤양 치유에 대한 시간을 나타내는 하기 표 6을 참조한다. 궤양의 완벽한 치유를 위한 시간은 VEGF로 처치한 환자에서 가속화되는데, 예를 들어, 완벽한 치유 (25 백분위수)에 대한 시간은 32.5일 대 43.0일이었다.

		창상 면적 (총 궤양 표면) 에서의 정중 감소율(％) (VEGF 대 위약)^2*	완벽한 치유를 갖는 대상체 (％) (VEGF 대 위약)^3*	치유에 대한 시간 (VEGF 대 위약)^4*
제43일 (제6주)	평가가능 안전성	95％ 대 85％ (p=0.67)	41％ 대 27％ (p=0.39)	HR 1.75 (p=0.18)
제43일 (제6주)	평가가능 효능¹	100％ 대 88％ (p=0.17)	52％ 대 27％ (p=0.13)	HR 1.98 (p=0.12)
제84일 (제12주)	평가가능 안전성	100％ 대 92％ (p=0.49)	52％ 대 35％ (p=0.28)	HR 1.87 (p=0.13)
제84일 (제12주)	평가가능 효능¹	100％ 대 93％ (p=0.05)	71％ 대 38％ (p=0.06)	HR 2.10 (p=0.08)

¹ 효능 평가가능 대상체 (비맹검 전에 특정됨):

주요 프로토콜 위배의 경우는 제거함

대상체는 최종 사용가능 투여에서 3회 연속 투여-검열을 누락함

비 LOCF (누락 데이터는 귀속되지 않음)

² p-값: 윌콕손 랭크-합 시험(Wilcoxon rank-sum test)

³ p-값: 피셔 정확 검정(Fisher's exact test)

⁴ p-값: 로그-랭크 시험(Log-Rank test)

^*평가 방법-정량적 면적계측 분석

완벽한 치유에 대한 시간^*	위약(N=26)	텔베르민 (N=29)
25 백분위수 (일)	43.0	32.5
50 백분위수 (일)	ND	58.0

ND = 검출가능하지 않음

* 카플란 마이어(Kaplan Meier) 방법을 사용하여 추정함.

완벽한 궤양 치유를 달성한 대상체의 경우, 궤양 형성의 재발은 제1 완벽한 궤양 치유의 시간과 연구 완료 또는 중지의 시간 간에 평가하였다. 완벽한 궤양 치유를 달성한 안전성 평가가능 대상체 중에 26.7％의 텔베르민-처치 대상체 (15명 중 4명) 및 33.3％의 위약-처치 대상체 (9명 중 3명)는 궤양 형성이 재발되었다 (로그-랭크 p-값 = 0.57). 위약-처치 대상체에 비해 텔베르민-처치 대상체에 대한 궤양 형성 재발의 해저드 비율은 0.63 (95％ CI: 0.13, 3.15)이었다.

실시예 2: 창상 치유에서의 국소적 VEGF

처치 개시 시에 예를 들어 ≥ 1.0 ㎠ 및 ≥ 6.5 ㎠의 예리한 창면절제술 후에 추정되는 궤양 면적을 갖는 대상체, 예를 들어, 제I형 또는 제II형 진성 당뇨병을 앓는 환자는 총 12주 동안 (총 84회 이하의 투여 동안) 또는 항상 일찍 도래하는 완벽한 창상 봉합 (예를 들어, 배액법 또는 드레싱이 필요 없는 피부봉합)될 때까지 매일 국소적 재조합 VEGF (예를 들어, 겔 제제)로 처치한다. 대상체는 처치기 후에 12주 이상 동안 관찰할 수 있다. 대상체는 각 일일 처치에서 VEGF 24 ㎍/㎠, 72 ㎍/㎠, 또는 216 ㎍/㎠를 수용한다. 궤양 표면적 (㎠)은 예를 들어 궤양의 연부에서 연부까지의 최장 길이를 측정한 길이 (L (cm)) 및 최장 부에서 연부까지의 최장 길이 측정에서 길이에 대한 수직 축으로 부터 얻는 너비 (W (cm))에 의해 추정된다. 따라서, 표면적 추정치는 L × W이다. 치료는 궤양 면적의 주변 대 추적, 궤양 가장자리의 면적계측 분석 추적, 사진, 물리적 시험 등의 측정에 의해 평가될 수 있다. 사용되는 VEGF는 5 mM 숙시네이트 완충제 (pH 5.0) 중의 1.8, 0.6 및 0.2 mg/ml의 VEGF, 3％ 메틸셀룰로스 (예를 들어, 메토셀 A4M 프리머엄 메틸셀룰로스 (미국 미시건주 미들랜드 소재의 더 다우 케미컬 컴퍼니) (예를 들어, VEGF 1.8 mg/ml, 0.0036％ 폴리소르베이트 20 및 100 mM 트레할로스 데히드레이트에서)일 것이다.

본원 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하기에 충분한 것으로 고려된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 설명을 위한 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본원에 나타내고 기재한 것 외에, 본 발명의 각종 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 자명하게 될 것이고, 첨부된 청구의 범위 내에 속한다.

Claims

유효량의 VEGF를 창상에 투여하는 것을 포함하며, 유효량의 VEGF 투여가 대조군과 비교시에 창상 치유를 60％ 초과 가속화하는 것인, 대상체에서의 창상 치유 가속화 방법.
제1항에 있어서, 창상 치유의 가속화가 대조군과 비교시에 74％ 이상인 방법.
제1항에 있어서, 창상 치유의 가속화가 창상 면적에서의 감소율(％)로 평가되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 처치 전의 창상 면적이 약 0.4 ㎠ 이상인 방법.
제3항에 있어서, 처치 전의 창상 면적이 약 1.0 ㎠ 이상인 방법.
제1항에 있어서, 창상 치유의 가속화가 완벽한 창상 치유 속도로 평가되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 창상이 당뇨병성 족부 궤양인 방법.
제1항에 있어서, 유효량의 VEGF가 1주에 3회 이상 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 유효량의 VEGF가 6주 이상 동안 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 유효량의 VEGF가 완벽한 창상 봉합(closure)시까지 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, VEGF가 VEGF₁₆₅인 방법.
제1항 또는 제11항에 있어서, VEGF가 재조합 인간 VEGF인 방법.
제1항에 있어서, 투여가 국소인 방법.
제1항에 있어서, VEGF가 국소 투여용 제제 중에 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 창상이 만성 창상인 방법.
제1항에 있어서, 창상이 압력 궤양, 욕창성 궤양, 정맥 궤양, 화상, 수술 창 상 또는 통상의 창상인 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 처치를 받고 있거나 그러한 처치를 받은 적이 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 창상 치유를 지연시키거나 비효과적인 창상 치유를 제공하는 2차 상태에 있는 것인 방법.
제18항에 있어서, 2차 상태가 당뇨병인 방법.
제1항에 있어서, 유효량의 VEGF가 약 20 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠인 방법.
제20항에 있어서, 유효량의 VEGF가 약 24 ㎍/㎠인 방법.
제20항에 있어서, 유효량의 VEGF가 약 72 ㎍/㎠인 방법.
제20항에 있어서, 유효량의 VEGF가 약 216 ㎍/㎠인 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
유효량의 VEGF를 창상에 투여하는 것을 포함하고, 유효량의 VEGF 투여가 대조군과 비교시에 창상 치유를 60％ 초과 가속화하며, 상기 창상이 유효량의 VEGF 투여 전 대상체에 약 4주 이상 동안 존재한 것인, 인간 대상체에서의 창상 치유 가속화 방법.