MX2007015943A

MX2007015943A - Curacion de heridas.

Info

Publication number: MX2007015943A
Application number: MX2007015943A
Authority: MX
Inventors: Timothy J Breen; Stuart Bunting; Charles P Semba
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-03-07
Also published as: NO20080333L; CA2612233A1; RU2008101791A; EP1904094A2; WO2006138468A2; AU2006259408A1; IL187753A0; BRPI0613284A2; JP2008546707A; US20060287234A1; WO2006138468A3; KR20080017362A; US20070021342A1

Abstract

Se proporcionan metodos para acelerar y/o mejorar la curacion de heridas en un sujeto al administrar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Description

CURACIÓN DE HERIDAS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad y el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. de Serie 60/691,909, presentada el 17 de Junio de 2005, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos No. de Serie 60/794,008, presentada el 21 de Abril de 2006, las especificaciones de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos para acelerar o mejorar la curación de heridas al administrar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . ANTECEDENTES La curación de heridas es un proceso complejo, que incluye una fase de inflamación, una fase de formación de tejido de granulación, y una fase de remodelación de tejido. Singer and Clark, Cutaneous Wound Healing, N. Engl . J. Med. 341:738-46 (1999) . Estos eventos se accionan por citocinas y factores de crecimiento que se liberan en el sitio de la lesión. Muchos factores pueden complicarse o interferir con la curación de heridas normal, adecuada. Por ejemplo, tales factores incluyen edad, infección, nutrición deficiente, inmunosupresión, medicaciones, radiación, diabetes, enfermedad vascular periférica, enfermedad sistémica, fumar, tensión, etc. Para pacientes con diabetes, que es una enfermedad debilitante, crónica que afectará aproximadamente a 20 millones de personas en los Estados Unidos en 2005, el desarrollo de una úlcera del pie diabético (también referida como una herida) es una complicación común. Una úlcera crónica se define como una herida que no procede a través de un proceso de reparación ordenadamente y en tiempo para producir integridad anatómica y funcional (ver, e . g. , Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of ounds and evaluation of healing, Arch . Derma tol . 130:489-93 (1994)). Por su naturaleza, la úlcera del pie diabético es una herida crónica (American Diabetes Association, Consensus development conference on diabetic foot wound care, Diabetes Care, 22 (8) : 1354-60 (1999)). Debido a que la piel sirve como la barrera primaria contra el ambiente, una herida refractaria abierta puede ser catastrófica; puede dar como resultado una incapacidad principal (incluyendo pérdida del miembro) e incluso la muerte. La ulceración del pie es la precursora de aproximadamente el 85% de las amputaciones de la extremidad inferior en personas con diabetes. Ver, e . g. , Apelqvist, et al., What is the most effective way to reduce incidence of amputation in the diabetic foot? Diabetes Metab Res . Rev. , 16(1 Suppl.): S75-S83 (2000). Se ha reportado que existen más de treinta y cinco millones de heridas cutáneas que requieren intervención anualmente en los E.U. Ver, e . g. , Tonnesen et al., Angiogenesis in Wound Healing JID Symposium Proceedings 5(l):40-46 (2000). Las terapias actuales de cuidado de heridas no han sido muy exitosas debido a su eficacia frustrada y a su costo. De esta manera, existe una necesidad de mejorar y optimizar las terapias de curación de heridas para sujetos. La presente invención trata estas y otras necesidades, como será aparente en la revisión de la siguiente descripción. SUMARIO Se proporcionan métodos para acelerar la curación de heridas, e.g., agudas (e.g., quemadura, herida quirúrgica, etc.) o crónicas (e.g., úlcera diabética, úlcera por presión, una úlcera de decúbito, una úlcera venosa, etc.), o normales. También se proporcionan métodos para mejorar la curación de heridas a lo largo y reducir la cantidad de recurrencias de úlceras con la administración del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los métodos incluyen, e.g., un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto, en donde un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de heridas más del 50%, o igual a o más del 60%, igual a o más del 70%, igual a o más del 74%, igual a o más del 75%, igual a o más del 80%, igual a o más del 85%, igual a o más del 90%, igual a o más del 95%, igual a o más del 100%, igual a o más del 110% o más, cuando se compara con un control. Un control incluye, pero no se limita a, e.g., un sujeto a quien no se administra tratamiento, o un sujeto a quien se administra una cantidad sub-terapéutica de VEGF, o un sujeto a quien se administra otro tratamiento de herida, o un sujeto a quien se administra un placebo, ya sea con o sin Buen Cuidado de la herida (GWC) , o un sujeto a quien se administra GWC solo. GWC puede incluir, pero no se limita a, e.g., desbridamiento, limpieza/vendajes, alivio de presión, control de infección, y/o combinaciones de los mismos. En una modalidad, un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto humano incluye administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de heridas más del 60% cuando se compara a un control y en donde la herida está presente en el sujeto por aproximadamente 4 semanas o más antes de administrar la cantidad efectiva de VEGF. En una modalidad, un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto humano incluye administrar una cantidad efectiva de rhVEGF165 a una herida diabética, en donde la administración de la cantidad efectiva de rhVEGF165 acelera la curación de heridas en más del 60% cuando se compara con un control. En ciertas modalidades, un agonista de VEGFR puede utilizarse en lugar de o con VEGF en los métodos. La valoración de la curación de heridas puede determinarse, e.g., por el % de reducción en el área de la herida, o cierre completo de la herida. El área de la herida puede determinarse por análisis cuantitativo, e.g., mediciones de área de la herida, trazos planimétricos de la herida, etc. El cierre completo de la herida puede determinarse mediante, e.g., cierre de la piel sin requerimientos de vendaje o drenaje. Las fotografías de la herida, exámenes físicos de la herida, etc. también pueden utilizarse para valorar la curación de la herida. La aceleración de la curación de heridas puede expresarse en términos de % de aceleración o expresarse en términos del índice de riesgo como un tiempo para curación (e.g., VEGF contra un control, e.g., un placebo), etc. En ciertas modalidades de la invención, el índice de riesgo (HR) es mayor o igual a 1.75, o mayor o igual a 1.8, o mayor o igual a 1.85, o mayor o igual a 1.87, o mayor o igual a 1.9, o mayor o igual a 1.95, o mayor o igual a 1.98, o mayor o igual a 2.0, o mayor o igual a 2.1 o más. En una modalidad, la herida comprende además una infección. En otra modalidad, la herida es una herida isquémica. En una modalidad, el área de la herida antes del tratamiento es de aproximadamente 0.4 cm2 o más, o aproximadamente 1.0 cm2 o más, o entre aproximadamente 1.0 cm2 y aproximadamente 10.0 cm2, o entre aproximadamente 1.0 cm2 y aproximadamente 6.5 cm2, o entre aproximadamente 1.0 cm2 y aproximadamente 5.0 cm2. En una modalidad adicional, el área de la herida se determina antes del tratamiento con VEGF pero después del desbridamiento. En una modalidad, la herida está presente en el sujeto por aproximadamente 4 semanas o más, o aproximadamente 6 semanas o más, antes de administrar el VEGF. En ciertos aspectos de la invención, el sujeto está en o ha experimentado un tratamiento, en donde el tratamiento retrasa o proporciona curación ineficaz de la herida. En otra modalidad, el sujeto tiene una condición secundaria, en donde la condición secundaria retrasa o proporciona curación ineficaz de la herida. En una modalidad adicional, la condición secundaria es diabetes. En una modalidad, el VEGF administrado es VEGF?65 (e.g., VEGF humano recombinante (e.g., VEGF?65 humano)). En una modalidad, el VEGF se administra tópicamente. En ciertas modalidades, el VEGF se administra en combinación con otros factores que aceleran la curación de heridas (e.g., factor o agente de angiogénesis, agente o procedimiento de curación de heridas, factor de crecimiento, etc.). El VEGF puede formularse en, e.g., una formulación de liberación lenta, una formulación de gel, un vendaje o compresa, etc. En ciertas modalidades, el sujeto es un humano. En una modalidad, la cantidad efectiva de VEGF administrada es de aproximadamente µg/cm2 a aproximadamente 250 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2, o 24 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 72 µg/cm2, o 72 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 216 µg/cm2, o 216 µg/cm2. En una modalidad, la cantidad efectiva de VEGF administrada es 20 µg/cm2 a 250 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2 a aproximadamente 216 µg/cm2, o 24 µg/cm2 a 216 µg/cm2" En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2 a aproximadamente 72 µg/cm2, o 24 µg/cm2 s 72 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 72 µg/cm2 a aproximadamente 216 µg/cm2, o 72 µg/cm2 a 216 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 216 µg/cm2 a aproximadamente 250 µg/cm2, o 216 µg/cm2 a 250 µg/cm2. La administración de la cantidad efectiva de VEGF puede ser diariamente u opcionalmente algunas veces a la semana, e.g., al menos dos veces a la semana, o al menos tres veces a la semana, o al menos cuatro veces a la semana, o al menos cinco veces a la semana, o al menos seis veces a la semana. En una modalidad, VEGF se administra por al menos seis semanas, o más de seis semanas, o al menos aproximadamente doce semanas, o hasta el cierre completo de la herida (e.g., que puede determinarse por el cierre de la piel sin requerimientos de vendajes o drenaje). En una modalidad, VEGF se administra por menos de 20 semanas para un curso de tratamiento. Los métodos de la invención también incluyen un método para mejorar la curación de heridas en una población de sujetos. Por ejemplo, un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida de un sujeto de la población, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF resulta en más del 10% (o más del 12%, o 14%, o 15%, o 17%, o 20%, o 25%, o 30%, o 33%, o 35%, o 40%, o 45%, o 50% o más) de mejora en curación de heridas en la población en comparación con una población de control. Por ejemplo, una población de control incluye, pero no se limita a, e.g., sujetos a quienes no se administra tratamiento, o sujetos a quienes se administra una cantidad sub-terapéutica de VEGF, o sujetos a quienes se administra otro tratamiento de herida, o sujetos a quienes se administra un placebo, ya sea con o sin Buen Cuidado de heridas (GWC) , o sujetos a quienes se administra GWC solo. En una modalidad, la curación de heridas mejorada se valora por la curación de heridas completa. En ciertas modalidades de la invención, la población incluye sujetos con curación de heridas deteriorada. En una modalidad, la población es pacientes diabéticos con heridas crónicas, e.g., por aproximadamente 4 semanas o más antes del tratamiento. Se proporcionan también por la invención métodos para reducir la recurrencia de úlceras. Por ejemplo, un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una úlcera, en donde la incidencia de formación de úlcera se reduce con administración de VEGF en comparación con un control. Por ejemplo, un control incluye, pero no se limita a, e.g., un sujeto a quien no se administra tratamiento, o un sujeto a quien se administra cantidad sub-terapéutica de VEGF, o un sujeto a quien se administra otro tratamiento de herida, o un sujeto a quien se administra un placebo, ya sea con o sin Buen Cuidado de heridas (GWC) , o un sujeto a quien se administra GWC solo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS [0001] Fig. 1 ilustra un diseño de estudio, e.g., VGF 2763g, para administrar rhVEGF para el tratamiento de heridas diabéticas . [0002] Fig. 2 ilustra curva de respuesta a dosis de la adición de rhVEGF en un modelo de herida de oreja isquémica de conejo el día 14. [0003] Fig. 3 ilustra una curva de respuesta a dosis de la adición de rhVEGF en un modelo de ratón diabético el DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones Antes de describir la invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por su puesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se propone ser limitante. Como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el (la)" incluyen referencias plurales al menos que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, referencia a "una molécula" opcionalmente incluye una combinación de dos o más de tales moléculas, y lo similar. El término "VEGF" (también referido como VEGF-A) como se utiliza en la presente se refiere a proteína del factor de crecimiento celular endotelial vascular. El término "VEGF de humano" (también referido como VEGF-A de humano) como se utiliza en la presente se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular de humano de 165 aminoácidos, y factores de crecimiento celular endotelial vascular relacionados de 121, 145, 183 189, y 206, (y otras isoformas) aminoácidos, como se describe por Leung et al . , Science 246:1306 (1989), y Houck et al . , Mol . Endocrin . :1806 (1991) junto con las formas que ocurren naturalmente alélicas y procesadas de aquellos factores de crecimiento. Un polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de polipéptido que ocurre de manera natural de cualquier mamífero. Tal polipéptido de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia nativa" comprende específicamente ' formas secretadas o truncadas que ocurren naturalmente del polipéptido (e.g., una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que ocurren naturalmente (e.g., formas alternativamente empalmadas) y variantes alélicas que ocurren naturalmente del polipéptido. Una "variante" de polipéptido significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa correspondiente, o fragmento del mismo. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde uno o más residuos de aminoácido se agregan, o eliminan, en el término N y/o C del polipéptido. De manera ordinaria, una variante tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos aproximadamente 95% O más de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa, o fragmento del mismo. Los análogos o variantes se definen como moléculas en las cuales la secuencia de aminoácidos, glicosilación, u otra característica de VEGF nativo se ha modificado covalente o no covalentemente . El término "variante de VEGF " como se utiliza en la presente se refiere a una variante como se describe arriba y/o un VEGF que incluye una o más mutaciones de aminoácido en la secuencia de VEGF nativa. Opcionalmente, la una o más mutaciones de aminoácido incluyen substitución (es) de aminoácido. VEGF y variantes del mismo para utilizarse en la invención pueden prepararse por una variedad de métodos bien conocidos en la materia. Las variantes de secuencia de aminoácidos de VEGF pueden prepararse por mutaciones en el ADN de VEGF. Tales variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, inserciones en o substituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de VEGF, e.g., una secuencia de aminoácidos de humano codificada por el ácido nucleico mostrado en 5,332,671; 5,194,596; o 5,240,848. Cualquier combinación de eliminación, inserción, y substitución puede hacerse para llegar a la construcción final que tiene la actividad deseada, e.g., actividad de VEGF, e.g., acelerando la curación de herida. Las mutaciones que se harán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de mARN secundaria. EP 75,444A. Las variantes de VEGF pueden valorarse para actividad de VEGF, e.g., por un ensayo de proliferación celular. Por ejemplo, un ensayo de proliferación celular incluye incrementar el grado de crecimiento y/o reproducción de la célula relativo a una célula no tratada o una célula tratada reducida ya sea ín vi tro o in vivo . Un incremento en la proliferación celular en cultivo celular puede detectarse al contar el número de células antes y después de la exposición a una molécula de interés. El grado de proliferación puede cuantificarse a través de examinación microscópica del grado de confluencia. La proliferación celular también puede cuantificarse utilizando el ensayo de incorporación de timidina. Las variantes de VEGF opcionalmente se preparan por mutagénesis sitio-dirigida de nucleótidos en el ADN que codifica el VEGF nativo o técnicas de despliegue de fago, produciendo así el ADN que codifica la variante, y después expresando el ADN en cultivo celular recombinante. Aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos se predetermina, la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para optimizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria puede conducirse en la región o codón objetivo y las variantes de VEGF expresadas seleccionadas para la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de substitución en sitios predeterminados en ADN teniendo una secuencia conocida se conocen bien, tal como, por ejemplo, mutagénesis específica de sitio. La preparación de las variantes de VEGF descritas en la presente pueden lograrse por técnicas de despliegue de fago, tales como aquellas descritas en la publicación de PCT WO 00/63380. Después de que tal clon se selecciona, la región de proteína mutada puede removerse y colocarse en un vector apropiado para producción de proteína, generalmente un vector de expresión del tipo que puede emplearse para transformación de un huésped apropiado. Las eliminaciones de la secuencia de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 30 residuos, opcionalmente 1 a 10 residuos, opcionalmente 1 a 5 o menos, y típicamente son contiguos. Las inserciones de la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminal carboxilo y/o amino de desde un residuo a polipéptidos de longitud esencialmente no restringida así como también inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácido múltiples o único. Las inserciones de intrasecuencia (i.e., inserciones dentro de la secuencia de VEGF nativo) pueden variar generalmente de aproximadamente 1 a 10 residuos, opcionalmente 1 a 5, u opcionalmente 1 a 3. Un ejemplo de una inserción terminal incluye una fusión de una secuencia de señal, ya sea heteróloga u homologa a la célula huésped, al término N para facilitar la secreción de huéspedes recombinantes. Las variantes de VEGF adicionales son aquellas en las cuales al menos un residuo de aminoácido en el VEGF nativo se ha removido y un residuo diferente se ha insertado en su lugar. Tales substituciones pueden hacerse de acuerdo con aquellas mostradas en la Tabla 1. Las variantes de VEGF pueden también comprender aminoácidos no naturales como se describen en la presente. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo a similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemis try, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares sin cargar: Gly (G) , Ser (S), Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) acidas: Asp (D), Glu (E) (4) básicas: Lys (K) , Arg (R) , His(H) Alternativamente, los residuos que ocurren naturalmente pueden dividirse en grupos en base a las propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Tabla 1 "Residuos de aminoácido que ocurren naturalmente" (i.e. residuos de aminoácido codificados por el código genético) pueden seleccionarse del grupo que consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (He): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofan (Trp); tirosina (Tyr); y valina (Val). Un "residuo de aminoácido que no ocurre naturalmente" se refiere a un residuo, diferente a aquellos residuos de aminoácido que ocurren naturalmente listados arriba, que es capaz de unir covalentemente residuo (s) de aminoácido adyacente (s) en una cadena de polipéptido. Los ejemplos de residuos de aminoácido que no ocurren naturalmente incluyen, e.g., norleucina, onitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuo de aminoácido tales como aquellos descritos en Ellman et al. Meth . Enzym . 202:301-336 (1991) & publicaciones de solicitud de Patente de E.U. 20030108885 y 20030082575.

Brevemente, estos procedimientos incluyen activar un tARN supresor con un residuo de aminoácido que no ocurre naturalmente seguido por transcripción y traducción ín vi tro o in vivo del ARN. Ver, e . g publicaciones de solicitud de patente de E.U. 20030108885 y 20030082575; Noren et al. Science 244:182 (1989); y, Ellman et al., supra . "Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna substitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en varias maneras que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando el software de computadora públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para propósitos en la presente, sin embargo, el % de valores de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen como se describe abajo al utilizar el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 fue obra de Genentech, Inc. ha sido presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de E.U., Washington D.C., 20559, en donde se registra bajo el No. de Registro de Derechos de Autor de E.U. TXU510087, y está públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debe compilares para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. Para propósitos en la presente, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que puede enunciarse alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue: 100 por la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, and en donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. El término "receptor de VEGF" o "VEGFR" como se utiliza en la presente se refiere a un receptor celular para VEGF, ordinariamente un receptor de superficie celular encontrado en células endoteliales vasculares, así como también variantes del mismo que retienen la capacidad de unir VEGF. El término "agonista de VEGFR" se refiere a una molécula que puede activar un receptor de VEGF o incrementar su expresión. Los agonistas de VEGFR incluyen, pero no se limitan a, e.g., agonistas de ligando de un VEGFR, variantes de VEGF, anticuerpos y fragmentos activos. VEGF es un agonista de VEGFR, pero en la presente se enlista y refiere por separado. El término "anticuerpo anti-VEGFR" es un anticuerpo que se une a VEGFR con especificidad y afinidad suficiente. En una modalidad, el anticuerpo anti-agonista de VEGFR de la invención puede utilizarse como un agente terapéutico para tratar heridas. En otra modalidad, una variante de VEGF puede utilizarse como un agente terapéutico para tratar heridas. El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (e.g., anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad biológica deseada. Al menos que se indique de otra manera, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza para denotar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente se forma típicamente para tener los tres o más sitios de unión a antígeno y generalmente no es un anticuerpo de IgA o IgM de secuencia nativa . "Fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y reteniendo de esta manera la capacidad de unir el antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo comprendidos por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el término C del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el término C del dominio CH1; (v) el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Na ture 341, 544-546 (1989)) que consiste de un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente incluyendo dos fragmentos Fab' enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (ix) moléculas de anticuerpo de cadena única (e.g Fv de cadena única; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); y Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (ver, e.g., EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Na tl . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fd aleatorios (VH-CH1-VH-CH1 ) los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057 1062 (1995); and US Patent No. 5,641,870). El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un antígeno único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal" no debe construirse como requiriendo la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Na ture 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, e.g., Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Na ture 352:624-628 (1991) o Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Na tl . Acad. Sci . USA 81:6851-6855 (1984) ) . Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o substancialmente todos los ciclos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Na ture 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992) . Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha hecho utilizando cualquiera de las técnicas para hacer los anticuerpos humanos como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la materia. En una modalidad, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fago, en donde esa biblioteca de fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Na ture Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol . , 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Bíol . , 222:581 (1991)).

Los anticuerpos humanos también pueden hacerse al introducir locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, e.g., ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. En un desafío, la producción de anticuerpo humano se observa, que se parece cercanamente a aquella observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo reinstalación de gen, ensamble, y repertorio de anticuerpo. Este planteamiento se describe, por ejemplo, en Patentes de E.U. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Na ture 368: 856-859 (1994); Morrison, Na ture 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Na ture Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Na ture Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern . Rev. Immunol . 13:65-93 (1995).

Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse a través de inmortalización de linfocitos B de humano que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haberse inmunizado in vi tro) . Ver, e . g. , Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol . , 147 (l):8ß-95 (1991); y Pat. de E.U. No. 5,750,373. La diabetes es un trastorno crónico que afecta el metabolismo de proteína, grasa y carbohidrato en animales. La diabetes es la causa principal de la ceguera, falla renal, y amputaciones de miembro inferior en adultos y es un factor de riesgo principal para apoplejía y enfermedad cardiovascular. Diabetes mellitus tipo I (o diabetes mellitus dependiente de insulina ("IDDM") o diabetes de inicio juvenil) comprende aproximadamente 10% de todos los casos de diabetes. La enfermedad se caracteriza por una pérdida progresiva de función secretora de insulina por células beta del páncreas. Esta característica también se comparte por diabetes no idiopáticas, o "secundaria" que tiene sus orígenes en enfermedad pancreática. Diabetes mellitus tipo I se asocia con los siguientes síntomas o señales clínicas, e.g., hiperglicemia o concentración de glucosa de plasma persistentemente elevada; poliuria; polidipsia y/o hiperfagia; complicaciones microvasculares crónicas tales como retinopatía, nefropatía y neuropatía; y complicaciones macrovasculares tales como hiperlipidemia e hipertensión que pueden conducir a ceguera, enfermedad renal en etapa final, amputación de extremidad e infarto al miocardio. Diabetes mellitus tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina o NIDDM) es un trastorno metabólico que incluye la desregulación de metabolismo de glucosa y sensibilidad de insulina deteriorada. Diabetes mellitus tipo II usualmente se desarrolla en la edad adulta y se asocia con la incapacidad del cuerpo para utilizar o hacer suficiente insulina. Además de la resistencia a insulina observada en los tejidos objetivo, los pacientes que sufren de diabetes mellitus tipo II tienen una deficiencia a insulina relativa, es decir, los pacientes tienen niveles de insulina inferiores a los predichos para una concentración de glucosa en plasma dada. Diabetes mellitus tipo II se caracteriza por los siguientes síntomas o señales clínicas, e.g., hiperglicemia o concentración de glucosa en plasma persistentemente elevada; poliuria; polidipsia y/o hiperfagia; complicaciones microvasculares crónicas tales como retinopatía, nefropatía y neuropatía; y complicaciones macrovasculares tales como hiperlipidemia e hipertensión que pueden conducir a ceguera, enfermedad renal en etapa final, amputación de extremidad e infarto al miocardio. "Sujeto" para propósitos de la invención se refiere a cualquier animal. Generalmente, el animal es un mamífero. "Mamífero" para propósitos de la invención se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, oveja, puercos, etc. Típicamente, el mamífero es un humano. El término "acelerar la curación de herida" o "aceleración de la curación de herida" se refiere al incremento en la velocidad de curación, e.g., una reducción en tiempo hasta que ocurre el cierre completo de la herida o una reducción en tiempo hasta que ocurre un % de reducción en el área de la herida. El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectiva para acelerar o mejorar la curación de heridas en un sujeto o prevenir la recurrencia de una úlcera en un sujeto. Una dosis terapéutica es una dosis que muestra un efecto terapéutico en el sujeto y una dosis sub-terapéutica es una dosis que no muestra un efecto terapéutico en el sujeto tratado. La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y/o consecutiva en cualquier orden. "Tratamiento" se refiere a tanto tratamiento terapéutico como mediciones preventivas o profilácticas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno así como también aquellos en los cuales el trastorno está por prevenirse. "Curación de herida" se refiere a una condición que se beneficiaría de tratamiento con una molécula de la invención . Una "herida crónica" se refiere a una herida que no se cura. Ver, e . g. , Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch . Derma tol . 130:489-93 (1994). Las heridas crónicas incluyen, pero no se limitan a, e.g., úlceras arteriales, úlceras diabéticas, úlceras por presión, úlceras venosas, etc. Una herida aguda puede desarrollarse en una herida crónica. Las heridas agudas incluyen, pero no se limitan a, heridas causadas por, e.g., lesión térmica, trauma, cirugía, escisión de cáncer de piel extensiva, infecciones bacterianas y fúngicas profundas, vasculitis, escleroderma, pénfigos, necrolisis epidérmica tóxica, etc. Ver, e . g. , Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell . com, publicada el 24 de Octubre de 2001. Una "herida normal" se refiere a una herida que experimenta reparación de herida de curación normal. "Buen Cuidado de heridas (GWC)" se refiere a las etapas de cuidar de una herida. Por ejemplo, las prácticas de buen cuidado de heridas incluyen, pero no se limitan a, una o más de los siguientes, desbridamiento (e.g., quirúrgica/aguda, mecánica, autolítica o química/enzimática) , limpieza (e.g., limpieza de herida de rutina con, e.g., salina), vendajes, alivio de presión (e.g., presión de descarga al piel), mantenimiento de ambiente húmedo de herida, y/o control de infección (e.g., pomada o pildoras). Otras etapas opcionalmente incluyen ajustar al sujeto calzado amortiguado, cómodo, soporte nutricional, manteniendo el control de glucosa de sangre, administración de otros factores de riesgo (e.g., peso, el fumar), etc. GWC puede incluir una o más de las prácticas. La expresión "trauma que afecta el endotelio vascular" se refiere a trauma, tales como lesiones, a los vasos sanguíneos o corazón, incluyendo la red vascular de órganos, a los cuales un animal o humano, preferentemente un mamífero y más preferentemente un humano, se somete. Ejemplos de tal trauma incluyen heridas, incisiones, y úlceras, o laceraciones de los vasos sanguíneos o corazón. El trauma incluye condiciones causadas por eventos internos así como también aquellas que se imponen por un agente extrínseco que pueden mejorarse por promoción de crecimiento celular endotelial vascular. Un "agente o factor angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, e.g., promueve angiogénesis, crecimiento celular endotelial, estabilidad de vasos sanguíneos, y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos, incluyen, pero no se limitan a, e.g., VEGF y miembros de la familia de VEGF, P1GF, familia de PDGF, familia del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFs), ligandos TIE (Angiopoyetinas) , efrinas, ANGPTL3, ANGPTL4, etc. También incluye factores, tales como hormona de crecimiento, factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-I), VIGF, factor epidérmico de crecimiento (EGF) , CTGF y miembros de su familia, y TGF-a y TGF-ß. Ver , e . g. , Klagsbrun and D'Amore, Annu . Rev. Physiol . , 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Na ture Medicine 5 (12 ): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (e.g., Tabla 1 listado de factores angiogénicos); y, Sato Int . J. Clin . Oncol . , 8:200-206 (2003) . Curación de herida La curación de una herida es un proceso complejo que incluye tres fases principales: inflamación, tejido de granulación, y remodelación de tejido. En el sitio de la herida existen muchos procesos que ocurren, e.g., migración/concentración, metaloproteasas de matriz (MMP) producción, proliferación, y angiogénesis. Existe contracción (reducción en tamaño de la herida), epitelialización (creación de nuevas células epiteliales) y deposición de tejido conectivo para curar la herida. Ver Singer & Clark, Cutaneous Wound Healing N. Engl . J. Med. , 341:738-46 (1999). Uno de los objetivos de terapia de herida es promover la matriz de granulación, en donde un suministro de sangre adecuado es necesario. Sin embargo, factores de riesgo, con frecuencia asociados con estados de enfermedad, (e.g., incluyen, pero no se limitan a, edad, infección, nutrición deficiente, inmunosupresión, medicaciones, radiación, diabetes, enfermedad vascular periférica, enfermedad sistémica, el fumar, tensión, etc.) crean desafíos para la curación de herida. Ejemplos de algunos de los factores de riesgo para úlceras del pie diabético incluyen neuropatía periférica, que afecta tanto las funciones motrices y sensoriales del pie, movilidad de articulación limitada, deformidades del pie, distribución anormal de presión del pie, trauma menor repetitivo, y agudeza visual deteriorada. Ver, e . g. , Boyko et al., A prospective study of risk factors for diabetic foot ulcer, The Seattle Diabetic Foot Study, Diabetes Care, 22:1036-42 (1999); y Apelqvist et al., International consensus and practical guidelines on the management and the prevention of the diabetic foot, International Working Group on the Diabetic Foot., Diabetes Metab Res . Rev 16(1 Suppl): S84-S92 (2000) . Neuropatía sensorial periférica es un factor primario. Aproximadamente 45%-60% de todas las úlceras diabéticas son neuropáticas, mientras hasta 45% tienen tanto componentes isquémicos como neuropáticos. Con un alimento insensato, el paciente es incapaz de percibir lesión repetitiva al pie causada por, e.g., calzado de ajuste deficiente durante la caminata y actividades de la vida diaria. Neuropatía, combinada con biomecánicos alterados de caminar, conduce a trauma abrupto repetitivo y distribución de cargas de de tensión anormalmente altas a porciones vulnerables del pie, resultando en formación de callo y erosión cutánea. Una vez que se forma una úlcera, que con frecuencia se cura de manera lenta, puede continuar agrandándose, lo que proporciona una oportunidad para infección sistémica o local, y requiere cuidado quirúrgico y médico para promover la curación. Existen también desafíos para crear terapias de proteína para acelerar la curación de herida, e.g., acelerar la curación de heridas crónicas, e.g., úlceras del pie diabético. El área de la herida es un ambiente hostil (enzimas proteolíticas, inhibidores naturalmente producidos de actividad de proteína junto con infección superimpuesta) , en donde con frecuencia en estados de enfermedad (e.g., en diabetes) los factores huésped se alteran (e.g., en diabetes existe expresión de VEGF suprimida, respuesta deteriorada de VEGF a hipoxida, metabolismo celular alterado, respuesta inmune/inflamatoria suprimida, etc.). Por ejemplo, en base a los estudios in vi tro, los keratinocitos y fibroblastos de ratones diabéticos (db/db) muestran deterioro selectivo de procesos celulares esenciales para reparación de tejido normal, y fibroblastos db/db muestran alteraciones del factor de crecimiento y migración celular significativamente disminuida. Ver, e . g. , Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing, J. Biol . Chem . , 270:12607-13 (1995); y, Lerman et al, Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia, Am . J. Pa thol . , 162:303-12 (2003) . Se proporcionan en la presente métodos para acelerar y/o mejorar la curación de heridas, al administrar cantidad efectiva de VEGF o un agonista de VEGF. Por ejemplo, un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida de un sujeto, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de herida. Los métodos también incluyen un método para mejorar la curación de heridas en una población de sujetos. Por ejemplo, un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida de un sujeto de la población, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF resulta en más del 10% (o más del 12%, o 14%, o 15%, o 17%, o 20%, o 25%, o 30%, o 33%, o 35%, o 40%, o 45%, o 50% o más) mejora en la curación de heridas en la población comparada con un control. También se proporcionan métodos para reducir la recurrencia de úlceras. Por ejemplo, un método comprende administrar una cantidad efectiva de VEGF a una úlcera, en donde la incidencia de recurrencia de úlcera se reduce con administración de VEGF comparada con un control .

Los métodos también son aplicables a sujetos quienes experimentan o han experimentado un tratamiento, en donde el tratamiento retrasa o proporciona la curación ineficaz de la herida. Los tratamientos pueden incluir, pero no se limitan a, medicaciones, radiación, tratamientos que resulta en sistemas inmunes suprimidos, etc. opcionalmente, un sujeto de la invención tiene una condición secundaria, en donde las condiciones secundarias retrasan o proporcionan la curación ineficaz de la herida. Las condiciones secundarias, incluyen, pero no se limitan a, e.g., diabetes, enfermedad vascular periférica, infección, trastornos vasculares de colágeno o autoinmunes, estados de enfermedad que resultan en sistemas inmunes suprimidos, etc. La aceleración de la curación de heridas puede describirse por % de aceleración de la curación de heridas y/o índice de riesgo. En ciertas modalidades, la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de heridas más del 50%, o igual a o más del 60%, igual a o más del 70%, igual a o más del 74%, igual a o más del 75%, igual a o más del 80%, igual a o más del 85%, igual a o más del 90%, igual a o más del 95%, igual a o más del 100%, igual a o más del 110% o más, cuando se compara con un control. En ciertas modalidades, la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de heridas entre más del 60% y 110%, cuando se compara con un control.

En ciertas modalidades, la aceleración de la curación de heridas se describe por el índice de riesgo, que es igual a o más del 1.75, o es igual a o más del 1.80, o es igual a o más del 1.85, o es igual a o más del 1.95, o es igual a o más del 2.0, o es igual a o más del 2.1, o es igual a o más del 2.2, o es igual a o más del 2.3 o más. En ciertas modalidades, la aceleración de la curación de heridas se describe por el índice de riesgo, que está entre 1.75 y 2.3. Los sujetos de la invención tienen al menos una herida. La herida puede ser una herida crónica, aguda o normal. En una modalidad, la herida que se trata es una herida en etapa ÍA. Ver Etapas de Heridas en la Tabla 2. Una herida de la invención puede incluir opcionalmente una infección o isquemia, o incluir tanto una infección como isquemia. En una modalidad, la herida es una úlcera del pie diabético. En una modalidad, la herida está presente en el sujeto por aproximadamente 4 semanas o más, o aproximadamente 6 semanas o más antes de administrar el VEGF.

Tabla 2 El análisis cuantitativo puede utilizarse para valorar la curación de herida, e.g., determinar el % de reducción en el área de la herida, o cierre completo de la herida (e.g., medido por el cierre de la piel sin requerimientos de vendaje o drenaje) . El área de la herida se valora antes, durante y después del tratamiento por métodos conocidos por aquellos en la materia. Por ejemplo, la valoración puede determinarse por, e.g., planimetría cuantitativa (ver, e.g., Robson et al., Arch. Surg 135:773-77 (2000)), fotografías, examinaciones físicas, etc. El área de la herida puede determinarse antes, durante y después del tratamiento. En una modalidad, el área de la herida puede estimarse al medir la longitud, L, de la herida, la longitud más larga de borde a borde en, e.g., cm, y el ancho, W, el ancho más largo de borde a borde con perpendicular a L en, e.g., cm, y multiplicando LxW para obtener el área de superficie estimada (cm2) . El tamaño de la herida para tratamiento puede variar. En una modalidad de la invención, el área de la herida antes del tratamiento es de aproximadamente 0.4 cm2 o más, o aproximadamente 1.0 cm2 o más, o entre aproximadamente 0.4 cm2 y aproximadamente 10 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 10 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 6.5 cm2, o entre aproximadamente 1 cm2 y aproximadamente 5 cm2, o más de 4.0 cm2. El área puede medirse antes o después del desbridamiento. VEGF Una cantidad efectiva de VEGF se administra en los métodos proporcionados en la presente para promover la aceleración o mejora de la curación de herida. La familia de gen VEGF, para la cual VEGF es un miembro, es uno de los reguladores clave del desarrollo del sistema vascular. La familia de gen de VEGF incluye VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E y factor de crecimiento placental (P1GF) . Ver , e . g. , Ferrara, Role of Vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Sem Oncol . , 29 (suppl 16): 10-14 (2002); y, Veikkola and Alitalo, VEGFs receptors and angiogenesis Se in Cáncer Biol . 9:211-220 (1999). VEGF-A, también conocido como VEGF, es un regulador principal de angiogénesis normal incluyendo la curación normal de herida y curación de hueso y angiogénesis anormal, tal como proliferación vascular en tumores y trastornos oftalmológicos (e.g., degeneración relacionada con la edad, retinopatía diabética). Ver, e . g. , Ferrara, Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress, Endocrine Reviews 25(4): 581-611 (2004); Ferrara and Henzel, Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells, Biochem, Biophys Res Comm 161:851-58 (1989); and Leung et al., Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen, Science 246:1306-9 (1989). Está dentro del alcance de la invención utilizar también variantes de VEGF que tienen actividad de VEGF y agonista de los receptores de VEGF, e.g., agonistas de VEGFR1 y/o VEGFR2, en lugar de o en adición a VEGF. VEGF de humano existe como al menos seis isoformas (VEGF121, VEGF?45, VEGF?65, VEGF183, VEGF?89, y VEGF206) que se origina del empalme alternativo de mARN de un gen único organizado en 8 exones ubicados en el cromosoma 6 ( ver, e . g. , Ferrara N, Davis Smyth T. Endocr Rev 18:1-22 (1997); and, Henry and Abraham, Review of Preclinical and Clinical Results with Vascular Endothelial Growth Factors for Therapeutic Angiogenesis, Curren t In terventional Cardiology Reports, 2:228-241 (2000)). Ver also, Pat. de E.U. No. 5,332,671 y 6,899,882. En una modalidad, VEGF?6s se administra en los métodos de la invención. Típicamente, VEGF165 de humano se utiliza (e.g., VEGF165 de humano recombinante). VEGF165, la isoforma más abundante, es una glicoproteína covalente dimérica, de unión a heparina, básica con una masa molecular de ~45,000 daltones ( Id) . El homodímero de VEGF?6s consiste de dos cadenas de 165 aminoácidos. La proteína tiene dos dominios distintos: un dominio de unión a receptor (residuos 1-110) y un dominio de unión a heparina (residuos 110-165) . Los dominios se estabilizan por siete enlaces de disulfuro intramoleculares, y los monómeros se enlazan por dos enlaces de disulfuro de intercadena para formar el homodímero nativo. VEGF?2? carece del dominio de unión a heparina ( ver, e . g. , Pat. de E.U. No. 5,194,596), mientras que VEGF?8g ( ver, e . g. , Pats. de E.U. Nos. 5,008,196; 5,036,003; y, 5,240,848) y VEGF2o6 se secuestran en la matriz extracelular. Ver, e.g., Ferrara VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors, Na ture Rev. Cáncer 2:795-803 (2002). Los efectos biológicos de VEGF se median a través de receptores de quinasa de tirosina de alta afinidad. Los agonistas de los receptores de VEGF también pueden utilizarse en los métodos de la invención. Dos quinasas de tirosina de receptor de VEGF, VEGFR1 y VEGFR2, se han identificado (Shibuya et al. Oncogene 5:519-24 (1990); Matthews et al., Proc Na tl Acad Sci U S A 88:9026-30 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677-83 (1991); Terman et al. Biochem Biophys Res Commun 187:1579-86 (1992); de Vries et al., Science 255:989-91 (1992); Millauer et al. Cell 72:835-46 (1993); y, Quinn et al. Proc Na tl Acad Sci USA 90:7533-7 (1993)). VEGFR1 tiene la afinidad más alta para VEGF, con Kd de -10-20 pM (de Vries et al., Science 255:989-91 (1992)), y VEGFR2 tiene una afinidad de alguna manera inferior para VEGF, con Kd de ~75-125 pM (Terman et al., Oncogene 6:1677-83 (1991); Millauer et al. Cell 72:835-46 (1993); y, Quinn et al. Proc Na tl Acad Sci USA 90:7533-7 (1993)). Un tercer receptor de quinasa de tirosina, VEGFR3 se ha identificado, que se incluye en la regulación de angiogénesis linfática. VEGFR3 es un receptor para VEGF-C y VEGF-D, quet también puede unir el VEGFR2.

Estos receptores consisten de un dominio extracelular (incluyendo siete regiones similares a inmunoglobülina, una región de transmembrana) y un dominio intracßlular que contiene elementos relacionados con las trayectorias de quinasa de tirosina VEGF-B y P1GF se unen a VEGFR1 pero no VEGFR2. VEGF165 también se une neuropilin-1 , un receptor que regula la guía celular neuronal. Cuando se co-expresa con VEGFR2, neuropilin-1 mejora la unión de VEGF?65 a VEGFR2 y quimotaxis mediada por VEGF. Otros estudios tienen neuropilin 2 (NP2) enlazada a desarrollo de linfático. Ver, e . g. , Ferrara, Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress, Endocrine Reviews, 254(4): 581-611. Después de unir a VEGF-A, VEGFR2 experimenta autofosforilación de tirosina que conduce a angiogénesis subsiguiente, permeabilidad vascular incrementada, mutogénesis, y quimiotaxis. VEGF tiene varias funciones biológicas, incluyendo la regulación de expresión de gen de VEGF bajo condiciones hipóxicas (Ferrara N, Davis Smyth T. Endocr Rev 18:1-22 (1997)), actividad mitogénica para células endoteliales micro y macrovasculares (Ferrara N, Henzel WJ. Biochem Biophys Res Commun 161:851-8 (1989); Leung et al., Science 246:1306-9 (1989); Connolly et al. J Clin Inves t 84:1470-8 (1989a); Keck et al. Science 246:1309-12 (1989); Plouet et al., EMBO J 8:3801-6 (1989); Conn et al. Proc Na tl Acad Sci USA 87:2628-32 (1990); y, Pepper et al., Exp Cell Res 210:298-305 (1994)), e inducción de expresión de activadores de plasminógeno y colagenasa (Pepper et al., Biochem Biophys Res Commun 181:902-6 (1991)). Durante hipoxia, el factor 1 que induce hipoxia (HIP-1) se supraregula y se une a la región promotora del gen de VEGF y activa la transcripción (ver, e.g., Wang et al., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular oxygen tensión, PNAS USA 92:5510 (1995)). Otros agonistas que pueden supraregular VEGF incluyen citocinas (IL-ß) y otros factores de crecimiento incluyendo EGF, PDGF, bFGF. VEGF se produce por una amplia variedad de tipos celulares normales (e.g., keratinocitos, plaquetas, macrófagos, fibroblastos, células retínales, células ováricas) por todo el cuerpo además de varios tipos de tumores sólidos. El trabajo hecho sobre los últimos varios años ha establecido un rol clave de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulación de angiogénesis normal y anormal (Ferrara et al . Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). VEGF es un factor de crecimiento necesario para vasculogénesis embriónica normal, desarrollo de miocito cardiaco (ver, e.g., Ferrara et al., Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene, Na ture 380:439-42 (1996)), formación de hueso encondral normal ( ver, e . g. , Gerber et al., VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification, and angiogenesis during enchondral bone formation, Na t . Med, 5:623-28 (1999)), reparación de tejido, y en la fisiología del tracto reproductor femenino, crecimiento folicular y la función endocrina del corpus luteum, son dependientes de la proliferación de nuevas capilares ( ver, e . g. , Phillips et al . , Vascular endothelial growth factor is expressed in rat corpus luteum, Endocrinology, 127:965-67 (1990)). Además, VEGF ha mostrado ser un mediador clave de neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al . ) . El mARN de VEGF se sobreexpresa por la mayoría de tumores humanos examinados (Berkman et al . J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown et al . Human Pa thol . 26:86-91 (1995); Brown et al . Cáncer Res . 53:4727-4735 (1993); Mattern et al . Bri t . J. Cáncer. 73:931-934 (1996); y Dvorak et al . Am J. Pa thol . 146:1029-1039 (1995)). VEGF también se conoce como factor de permeabilidad vascular, en base a su capacidad para inducir el derrame vascular en modelos animales. Ver, e . g. , Senger et al., Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid, Science 219: 983-89 (1983) . Senger y colegas proponen que un incremento en la permeabilidad vascular a proteínas es una etapa crucial en angiogénesis. Por ejemplo, el derrame inducido de proteínas de plasma y formación de gel de fibrina extracelular puede ser matriz suficiente para crecimiento celular endotelial; el rol de los factores de crecimiento mitogénicos puede ser reforzar este proceso. La angiogénesis también se requiere para permitir la migración de leucocitos, factores de crecimiento, y oxígeno durante formación de tejido de granulación durante la curación de herida. En la curación de herida, VEGF juega un rol pivotal en la inducción de angiogénesis durante la curación de heridas cutánea. Es un mitógeno potent para células endoteliales microvasculares dérmicas y se expresa por keratinocitos de heridas de curación ( Ver, e . g. , Nissen et al . , Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activity during the proliferative phase of wound healing, Am .

J. Pa thol . , 152:1445-52 (1998); Corral et al-, Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblast growth factor during ischemic wound healing, Arch Surg. , 134:200-5 (1999); Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impalred wound healing. J. Biol . Chem . , 270:12607-13 (1995); Ballaun et al., Human keratinocytes express the three major splice forms of vascular endothelial growth factor, J. Invest Derma tol . , 104:7-10 (1995). También actúa en una manera paracrina en microvasos dérmicos, conduciendo a vascularidad de piel incrementada y formación de matriz de granulación. Ver, e . g. , Corral et al., supra ; and, Romano de Peppe, et al., Adenovirus-mediated VEGF165 gene transfer enhances wound healing by promoting angiogenesis in CDl diabetic mice, Gen Ther. , 9:1271-7 (2002). Las deficiencias en la reparación de tejido, e.g., curación de herida, etc., se observan cuando los niveles de VEGF y otros factores angiogénicos se alteran. Ver, e . g. , Howdieshell, et al., Antibody neutralization of vascular endothelial growth factor inhibits wound granulation tissue formation, J. Surg. Res .96:173-82 (2001); Street et al . , Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover, PNAS USA, 99:9656-61 (2002); Tsou et al., Retroviral delivery of dominant-negative vascular endothelial growth factor receptor type 3 to murine wounds inhibits wound angiogenesis, Wound Repair Regen . , 10:222-9 (2002); Frank et al., Regulation of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes, Implications for normal and impaired wound healing. J. Biol . Chem . , 270:12607-13 (1995); y, Lerman et al . , Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast: impairment in migration, vascular endothelial growth factor production, and response to hypoxia, Am . J. Pa thol . , 162:303-12 (2003) . En algunos modelos animales, VEGF exógeno promovió la curación de herida. Ver, e.g., Galliano et al., Topical Vascular Endothelial Growth Factor Accelerates Diabetic Wound Healing through increased angiogenesis and by Mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells, American Journal of Pa thology, 164 ( 6) : 1935-1947 (2004); Romano de Peppe S et al., Adenovirus-mediated VEGF165 gene transfer enhances wound healing by promoting angiogenesis in CDl diabetic mice, Gen Ther 9:1271-7 (2002); y, Pat. de E.U. Appl. No. US20030180259. Como se describe arriba, existen desafíos para crear terapias de proteína para acelerar la curación de herida. Describimos en la presente una prueba clínica para tratar úlceras con terapia de proteína recombinante de VEGF que resulta en la curación de heridas acelerada. Ver ejemplo 1, en la presente. Agentes Adicionales Se encuentra dentro del alcance de la presente combinar la terapia de VEGF con uno o más de, e.g., buena terapia de cuidado de heridas (e.g., GWC), otras terapias nuevas o convencionales (e.g., otros números de la familia de VEGF, factores de crecimiento tales como los enlistados en la presente, factor de crecimiento nervioso (NGF) , factores de angiogénesis positivos o agentes o activadores, esteroides anabólicos, reemplazos de tejido bioformados (e.g., Apligraph®, Dermagraft™, etc.), oxígeno hiperbárico, terapia de vacío) para mejorar la actividad de VEGF, en acelerar y/o mejorar la curación de herida. Ver, e.g., Meier and Nanney, Emerging New Drugs for Wound Repair, Expert Opin . Emerging Drugs (2006) 11 (1) :23-37. Seis familias del factor de crecimiento principales (EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF, y VEGF) se asocian con la curación de herida. Ver, e.g., Nagai and Embil, Becaplermin : recombinant platelet derived growth factor, a new treatment for healing diabetic foot ulcers, Exprt Opin Biol . Ther 2:211-18 (2002). Los ejemplos de tales factores de crecimiento incluyen factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, y PDGF-D) , factor I y II de crecimiento similar a insulina (IGF-I y IGF-II), factor de crecimiento de fibroblasto ácido y básico (aFGF y bFGF) , factor de crecimiento de transformación alta y beta (TGF-a y TGF-ß (e.g., TGF-beta 1, TGF beta 2, TGF beta 3)), factor de crecimiento epidérmico (EGF), y otros. Ver Id. Estos factores de crecimiento estimulan la mitosis de una o más de las células incluidas en la curación de heridas y pueden combinarse con VEGF. Otros agentes de angiogénesis positivos que pueden combinarse con VEGF incluyen, pero no se limitan a, e.g., HGF, TNF-a, angiogemna, IL-8, etc. (Folkman et al . J. Biol . Chem . 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al . Annu . Rev. Physiol . 53:217-239 (1991)), activadores de angiogenesis en la Tabla 3, factores de angiogenesis y agentes descritos en la presente, etc. Tabla 3 Ejemplos de Activadores de Angiogénesis Angiogénesis Angiopoyetmas 1 y 2 T?e-2 Alfa-5 mtegrinas Metaloproteinasas de matriz Óxido nítrico (NO) COX-2 TGFbeta y receptores VEGF y receptores Además , los s iguientes agentes también pueden combinarse con tratamientos de curación de heridas de VEGF, e.g., factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) (e.g., Becaplermina (rhPDGF-BB) tal como Regranex ®; Johnson & Johnson (ver, e.g., Patente de E.U. 5,457,093; 5,705,485; y, 5,427,778; Perry, BH et al., A meta-analytic approach to an integrated summary of efficacy: a case study of becamplemin gel., Con t . Clin . Triáis 23:389-408 (2002)), agonistas de receptor de adenosine-A2A (e.g., MRE0094 (King Pharmaceuticals)); factor de crecimiento de keratinocito (KGF-2, repifermina (Human Genome Sciences)); lactoferrina (LF) (Agennix, Inc.,); timosina beta-4 (Tß4 (ReGeneRx Biopharmaceuticals)); péptido de receptor de activación derivado de trombina (TP508; Chrysalin® (Chrysalis Biotechnology, Inc.)); el factor de crecimiento derivado de plaqueta que codifica el vector adenoviral (PDGF-B) (GAM501) (Selective Genetics); las células germinales de médula ósea autólogas (BMSC) ( ver, e . g. , Badiavas & Falanga, Treatment of chronic wounds with bone marrow-derived cells, Arch Derma tol , 139:510-16 (2003); e injertos de tejido vivo formados (e.g., Apligraf, etc.). Los agentes de úlcera antibióticos o antisépticos también pueden combinarse con la administración de VEGF. La administración de VEGF también puede administrarse junto con tratamiento inmunosupresor (e.g., corticoesteroides, terapia de radiación, quimioterapia) o tratamiento de cáncer. No es necesario que tales agentes de cotratamiento o procedimientos se incluyan per se en las composiciones de esta invención, aunque esto será conveniente en donde tales agentes son proteínicos. Tales mezclas se administran de manera adecuada en la misma manera y para los mismos propósitos como el VEGF utilizado solo. La proporción molar útil de VEGF a tales factores terapéuticos secundarios es típicamente 1:0.1-10, con aproximadamente cantidades equimolares en una modalidad de la invención utilizándose. Dosificación y Administración Las dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas de la invención pueden variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosificación apropiada o vía de administración se encuentra dentro de la experiencia de un médico ordinario. Los experimentos animales pueden proporcionar guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia de humano. La escala de las interespecies de dosis efectivas puede realizarse siguiendo los principios expuestos por Mordenti, J. and Chappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics In Toxicokinetics and New Drug Development , Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96. Ejemplos de curva de respuesta a dosis para modelos de herida animal con VEGF administrado pueden observarse en la Fig. 2, que es una curva de respuesta a dosis para VEGF administrado a las heridas de oreja isquémicas de conejo. Fig. 3 es una curva de respuesta a dosis para VEGF administrado a herida de ratón diabético. Para la prevención o tratamiento de enfermedad o tipo de herida, la dosificación apropiada de VEGF dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, como se define arriba, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea el agente se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al agente, y la discreción del médico que atiende. VEGF se formulará y dosificará en una manera consistente con buena práctica médica tomando en cuenta el trastorno específico a tratarse, la condición del paciente individual, el sitio de suministro del VEGF, el método de administración, y otros factores conocidos por el practicante. La dosificación a emplearse es dependiente de los factores descritos en la presente. En ciertas modalidades de la invención, dependiendo del tipo y severidad de la condición del sujeto, aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg (e.g. 0.1-20mg/kg) de VEGF y/o un agente adicional, es una dosificación candidata para administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por aplicación continúa. La guía a dosificaciones particulares y métodos de suministro se proporciona en la literatura. En una modalidad, la cantidad efectiva de VEGF administrada es de aproximadamente 20 µg/cm2 a aproximadamente 250 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2, o 24 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 72 µg/cm2, o 72 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 216 µg/cm2, o 216 µg/cm2. En una modalidad, la cantidad efectiva de VEGF administrada es 20 µg/cm2 a 250 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2 a aproximadamente 216 µg/cm2, o 24 µg/cm2 a 216 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 24 µg/cm2 a aproximadamente 72 µg/cm2, o 24 µg/cm2 a 72 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 72 µg/cm2 a aproximadamente 216 µg/cm2, o 72 µg/cm2 a 216 µg/cm2. En ciertas modalidades, la cantidad efectiva administrada es de aproximadamente 216 µg/cm2 a aproximadamente 250 µg/cm2, o 216 µg/cm2 a 250 µg/cm2. El agente se administra de manera adecuada al sujeto durante una serie de tratamientos o una sola vez. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad e.g., cierre completo de la herida, o reducción en el área de la herida. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Típicamente, el médico administrará una(s) molécula (s) de la invención hasta que una(s) dosificación (es) se alcance (n), lo que proporciona el efecto biológico requerido. La administración de la cantidad efectiva de VEGF puede ser diariamente u opcionalmente algunas veces a la semana, e.g., al menos dos veces a la semana, o al menos tres veces a la semana, o al menos cuatro veces a la semana, o al menos cinco veces a la semana, o al menos seis veces a la semana. En una modalidad, el VEGF se administra al menos por seis semanas, o al menos aproximadamente doce semanas o hasta el cierre completo de la herida (e.g., que puede determinarse por el cierre de la piel sin requerimientos de vendaje o drenaje) . En ciertos aspectos de la invención, el VEGF se administra por menos de 20 semanas. El progreso de la terapia de la invención se monitorea fácilmente por ensayos y técnicas convencionales. La composición terapéutica de la invención se administra típicamente de manera tópica al sujeto. En una modalidad de la invención, el VEGF está en una formulación de un gel tópico, e.g., en un recipiente o jeringa pre-llenada. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional también se administra tópicamente. Otras vías de administración de VEGF y/o agentes terapéuticos adicionales, también pueden utilizarse opcionalmente, e.g., para administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo pero no limitándose a, administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intracerobroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Como se describe en la presente, VEGF puede combinarse con uno o más agentes terapéuticos o procedimientos adicionales. La administración combinada incluye coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden. Uso de múltiples agentes también se incluye en la invención. Por ejemplo, VEGF puede preceder, seguir, alternar con administración del agente terapéutico adicional, o puede darse de manera simultánea con el mismo. En una modalidad, existe un periodo de tiempo mientras ambos agentes activos (o todos) de manera simultánea ejercen sus actividades biológicas. En un régimen de terapia de combinación, las composiciones de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad terapéuticamente sinergística. Como se utiliza en la presente, una cantidad terapéuticamente efectiva es tal que la co-administración de VEGF y uno o más otros agentes terapéuticos, o administración de un procedimiento, resulta en reducción o inhibición de la condición o enfermedad objetivo. Una cantidad terapéuticamente sinergística es esa cantidad de VEGF y uno o más agentes terapéuticos, e.g., descritos en la presente, necesarios para acelerar y/o mejorar sinergística o significativamente la curación de herida. Composiciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de moléculas de la invención, e.g., VEGF o agentes terapéuticos adicionales combinados con VEGF, utilizados de acuerdo con la invención se preparan para almacenamiento al mezclar una molécula, e.g., un polipéptido, que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores ( Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos a receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butilo o alcohol bencílico; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol, resorcinol, ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contrapones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal, complejos de Zn-proteína) ; y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o glicol de polietilenp (PEG). En ciertas modalidades, las formulaciones a utilizarse para administración in vivo son estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. El VEGF puede almacenarse en forma liofilizada o como una solución acuosa o forma de gel. El pH de las preparaciones de VEGF puede ser de aproximadamente de 5 a 9, aunque los valores de pH más altos o inferiores pueden también ser apropiados en ciertos casos. Se entenderá que el uso de ciertos de los excipientes, vehículos, o estabilizadores pueden resultar en la formación de sales del VEGF. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli- (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Ver also Johnson et al., Nat . Med. , 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther . , 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in Vaccine Design : The Subuni t and Adj uvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y Pat. de E.U. No. 5,654,010. Típicamente para la curación de herida, VEGF se formula para suministro específico en sitio. Cuando se aplica de manera tópica, el VEGF se combina de manera adecuada con otros ingredientes, tales como vehículos y/o adyuvantes. No existen limitaciones en la naturaleza de tales otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables y eficaces para su administración propuesta, y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen pomadas, cremas, geles, sprays, o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Las composiciones también pueden impregnarse en vendajes estériles, parches transdérmicos, plastificadotes, y vendajes, opcionalmente en forma líquida o semi-líquida . También pueden utilizarse matrices de celulosa/colágeno regeneradas oxidadas, e.g., Vendaje de Herida de Matriz Promogran™ o Promogran Prisma Matrix™. Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen un polipéptido de la invención, tales matrices están en la forma de artículos formados, e.g. películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Pat. de E.U. No. 3,773,919), 'copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de vinilo-etileno no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables, tal como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) , polímero de poli-ácido láctico-Coglicólico (PLGA), y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas para periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de exposición a humedad a 37EC, resultando en una pérdida de actividad biológica y cambios posibles en inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden contemplarse para la estabilización dependiendo del mecanismo incluido. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre para ser formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse al modificar residuos de sulfhidrilo, liofilizar de soluciones acidas, controlar el contenido de humedad, utilizar los aditivos apropiados, y desarrollar las composiciones de matriz de polímero específicas. Para obtener una formulación de gel, el VEGF formulado en una composición líquida puede mezclarse con una cantidad efectiva de un polisacárido soluble en agua o polímero sintético tal como glicol de polietileno para formar un gel de la viscosidad apropiada a aplicarse tópicamente. El polisacárido que puede utilizarse incluye, por ejemplo, derivados de celulosa tales como derivados de celulosa eterificados, que incluyen celulosas de alquilo, celulosas de hidroxialquilo, y celulosas de alquilhidroxialquilo, por ejemplo, metilcelulosa, celulosa de hidroxietilo, celulosa de carboximetilo, metilcelulosa de hidroxipropilo, y celulosa de hidroxipropilo; almidón y almidón fraccionado; ágar; ácido algínico y alginatos; goma arábiga; pululan; agarosa; carraghenan; dextranos; dextrinas; fructanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanos; glicógenos; glucanos; y bipolímeros sintéticos; así como también gomas tales como goma xantano; goma guar; goma de semilla de locust; goma arábiga; goma tragacanto; y goma karaya; y los derivados y mezclas de los mismos. En una modalidad de la invención, el agente cuajador en la presente es uno que es, e.g., inerte a sistemas biológicos, no tóxico, simple de preparar, y/o no muy derretida o viscosa, y no desestabilizará el VEGF dentro de él. En ciertas modalidades de la invención, el polisacárido es un derivado de celulosa eterificado, en otra modalidad uno que se define bien, purifica, y enlista en USP, e.g., derivados de celulosa de metilcelulosa e hidroxialquilo, tales como celulosa de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo, y metilcelulosa de hidroxipropilo. En una modalidad, metilcelulosa es el polisacárido. El glicol de polietileno útil para cuajar es típicamente una mezcla de glicoles de polietileno de alto y bajo peso molecular para obtener la viscosidad apropiada. Por ejemplo, una mezcla de un glicol de polietileno de peso molecular 400-600 con uno de peso molecular 1500 sería efectiva para este propósito cuando se mezcla en la proporción apropiada para obtener una pasta. El término "soluble en agua" como se aplica a los polisacáridos y glicoles de polietileno significa incluir dispersiones y soluciones coloidales. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por el grado de substitución de grupos éter, y los derivados de estabilización útiles en la presente deberían tener una cantidad suficiente de tales grupos éster por unidad de anhidroglicosa en la cadena de celulosa para volver a los derivados solubles en agua. Un grado de substitución de éter de al menos 0.35 grupos éter por unidad anhidroglucosa es generalmente suficiente. Adicionalmente, los derivados de celulosa pueden estar en la forma de sales de metal álcali, por ejemplo, las sales de Li, Na, K, o Cs. Si se emplea metilcelulosa en el gel, e.g., comprende aproximadamente 2-5%, o aproximadamente 3%, o aproximadamente 4% o aproximadamente 5%, del gel y el VEGF está presente en una cantidad de aproximadamente 100-2000 µg per ml de gel. VEGF y/o un agente adicional también puede administrarse a la herida por terapia de gen. La terapia de gen se refiere a terapia realizada por la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En aplicaciones de terapia de gen, los genes se introducen en las células para lograr síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, para reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia de gen" incluye tanto terapia de gen convencional en donde un efecto duradero se logra por un tratamiento único, como la administración de agentes terapéuticos genéticos, que incluye la administración de una sola vez o repetida de un mARN o ADN terapéuticamente efectivo. Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su toma, e.g. al substituir sus grupos de fosfodiéster negativamente cargados por grupos no cargados. Para revisiones generales de los métodos de terapia genética, ver, por ejemplo, Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann . Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan and Anderson Ann . Rev. Biochem . 62:191-217 (1993); y May TIBTECH 11:155-215 (1993). Los métodos comúnmente conocidos en la material de tecnología de ADN recombinante que pueden utilizarse se describen en Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression , A Labora tory Manual , Stockton Press, NY. Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia células cultivadas in vi tro, o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células mamíferas in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de gen in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por proteína-liposoma de revestimiento viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Por ejemplo, las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I, lentivirus, retrovirus, o virus adeno-asociado) y sistemas en base a lípido (lípidos útiles para transferencia mediada por lípido del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). Los ejemplos de utilizar vectores virales en terapia de gen pueden encontrarse en Clowes et al. J. Clin . Invest . 93:644-651 (1994); Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman and Wilson Curr. Opin . in Genetics and Devel . 3:110-114 (1993); Bout et al. Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994); Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al. J. Clin . Invest . 91:225-234 (1993); and Walsh et al. Proc .

Soc . Exp . Biol . Med. 204:289-300 (1993). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que tiene como objetivo las células de una herida, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. En donde las liposomas se emplean, proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden utilizarse para tener como objetivo y/o para facilitar la toma, e.g. proteínas de cápsido o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclado, proteínas que tienen como objetivo localización intracelular y mejorar la vida media intracelular. Se describe la técnica de endocitosis mediada por receptor, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol . Chem . 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990). Para una revisión de protocolos de terapia de gen y marcado de gen ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992). Modificaciones Covalentes a Polipéptidos de la Invención Las modificaciones covalentes de un polipéptido de la invención, e.g., VEGF u otros agentes de polipéptido terapéutico adicionales combinados con VEGF, se incluyen dentro del alcance de esta invención. Pueden hacerse por síntesis química o por desdoblamiento químico o enzimático del polipéptido, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido se introducen en la molécula al reaccionar los residuos de aminoácido objetivo del polipéptido con un agente de derivado orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de terminal N o C, o al incorporar un aminoácido modificado o aminoácido no natural en la cadena de polipéptido en desarrollo, e.g., Ellman et al. Meth . Enzym . 202:301-336 (1991); Noren et al. Science 244:182 (1989); y, Solicitudes de Patente de E.U. 20030108885 y 20030082575. Los residuos de cisteinilo más comúnmente se reaccionan con a-haloacetatos (y aminas correspondientes) , tal como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboxiamidometilo o carboximetilo. Residuos de cisteinilo también se derivan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-ß- (5-imidozoil ) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-clóromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol . Residuos de histidilo se derivan por reacción con dietil-piro-carbonato a pH 5.5-7.0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. Bromuro de para-bromofenacilo también es útil, la reacción se realiza típicamente en 0.1 M cacodilato de sodio a pH 6.0. Los residuos de terminal amino y lisinilo se reaccionan con anhídridos succínicos u otros de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar los residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanediona, y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2, 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de residuos de arginina requiere que la reacción a realizarse en condiciones alcalinas debido a pKa alta del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como también el grupo amino-epsilón de arginina. La modificación específica de residuos de tirosilo puede hacerse, con interés particular en introducir etiquetas espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se utilizan para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodinan utilizando 125I o 131I para preparar proteínas etiquetadas para utilizarse en radioinmunoensayos. Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , en donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia- , 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se deamidan frecuentemente a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Estos residuos se deamidan bajo condiciones básicas o neutrales. La forma deamidada de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención . Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, mutilación de la los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp . 79-86 (1983)), acetilación de la amina N terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal. Otro tipo de modificación covalente incluye glicósidos acoplados química o enzimáticamente ' a un polipéptido de la invención. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para glicosilación N- u O-enlazada. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el (los) azúcar (es) puede (n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptofan, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Cri t . Rev. Biochem . , pp. 259-306 (1981). El retiro de cualquier residuo de carbohidrato presente en un polipéptido de la invención puede realizarse química o enzimáticamente. La deglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al ácido trifluorometanosulfónico del compuesto, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en el desdoblamiento de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina) , mientras se deja el polipéptido intacto. La deglicosilación química se describe por Hakimuddin, et al . Arch . Biochem . Biophys . 259:52 (1987) y por Edge et al . Anal . Biochem . , 118:131 (1981). El desdoblamiento enzimático de residuos de carbohidrato, e.g., en anticuerpos, puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al . Meth . Enzymol . 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de la invención comprende enlace del polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, e.g., glicol de polietileno, glicol de polipropileno, o polioxialquilenos, en una manera establecida en las Patentes de E.U. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4, 179,337. Vectores , Células Huésped y Métodos Recombinantes Los polipéptidos de la invención pueden producirse recombinantemente, utilizando técnicas y materiales fácilmente obtenibles. Para producción recombinante de un polipéptido de la invención, e.g., VEGF o agentes de polipéptido terapéuticos adicionales combinados con VEGF, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. Muchos vectores están disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, una o más de las siguientes secuencias de control, una secuencia de señal, un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La expresión de "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operativamente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión de ribosima. Las células eucarióticas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación y mejoradores . El ácido nucleico se "enlaza operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o guía secretora se enlaza operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosima se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se coloca para facilitar la traducción. Generalmente, "operativamente enlazadas" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas, y, en el caso de una guía secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se realiza por ligación a sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótido sintéticos o enlazadores se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. ADN codificando el polipéptido de la invención se aisla fácilmente y/o secuencia utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, un ADN que codifica VEGF se aisla y secuencia, e.g., al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente al gen que codifica VEGF. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separada de la menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico de polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o establecimiento en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico y existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que expresan de manera ordinaria el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las células naturales.

Componente de Secuencia de Señal Los polipéptidos de la invención pueden producirse de manera recombinante no solamente de manera directa, sino que también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es típicamente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de desdoblamiento específico en el término N del polipéptido o proteína madura. La secuencia de señal heteróloga seleccionada típicamente es una que se reconoce y procesa (i.e., desdoblada por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de polipéptido nativa, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o guías de enterotoxina II estables en calor. Para secreción de levadura la secuencia de señal nativa puede substituirse por, e.g., el guía de invertasa de levadura, guía de factor a (incluyendo guías de a-factor de Saccharomyces y Kluyveromyces) , o guía de fosfatasa ácido, la guía de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de la célula de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como también guías secretoras virales, por ejemplo, la señal de herpes simple gD, están disponibles. El ADN para tal región precursora se liga en el marco de lectura a ADN que codifica el polipéptido de la invención . Origen de Componen te de Réplica Tanto los vectores de expresión como clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector duplicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector duplicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye los orígenes de réplica o secuencias que se duplican de manera autónoma. Tales secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de réplica del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de la bacteria de gram negativo, el origen de plásmido de 2µ es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de réplica no se necesita para los vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 puede utilizarse típicamente solo debido a que contiene el promotor anterior) . Selección del Componente de Gen Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias autotróficas complemento, o (c) suministro de nutrientes crítico no disponibles de medios complejos, e.g., el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y de esta manera sobreviven el régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico, tal como DHFR, quinasa de timidina, metalotioneina-I y II, típicamente genes de metalotioneina de primate, deaminasa de adenosina, decarboxilasa de ornitina, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando el DHFR tipo silvestre se emplea es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.

Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de la invención, proteína de DHFR tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3' -fosfonotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico e.g., kanamicina, neomicina, o G418. Ver Patente de E.U. No. 4,965,199. Un gen de selección adecuado para utilizarse en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb et al . , Na ture, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de desarrollarse en triptofan, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofan. De manera similar, las cepas de levadura deficientes de ¿eu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. Además, los vectores derivados del plásmido circular 1.6 µm pKDl pueden utilizarse para transformación de levaduras de Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina de becerro recombinante para K. lactis . Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Los vectores de expresión de múltiples copias estables para secreción de albúmina de suero de humano recombinante, maduro por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer et al . , Bio/Technology, 9:968-975 (1991). Componente del Promotor Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Los promotores adecuados para utilizarse con huéspedes procarióticas incluyen el promotor phoA, ß-lactamasa y sistemas promotores de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofan (trp) , y promotores híbridos tal como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente enlazada al ADN que codifica el polipéptido de la invención. Las secuencias promotoras se conocen para eucarióticas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba del sitio en donde la transcripción se inicia. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases aguas arriba desde el inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la parte posterior poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucarióticos. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizarse con huéspedes de levadura incluyen los promotores para quinasa 3-fosfoglicerado u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldihído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, decarboxilasa de piruvato, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, quinasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa, y glucoquinasa . Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para dehidrogenasa de alcohol 2, isocitocromo C, fosfatasa de ácido, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldihído-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables de utilización de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y promotores para utilizarse en expresión de levadura se describen además en EP 73,657. Los mejoradores de levadura también se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. La transcripción de polipéptidos de la invención de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de aves de corral, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y típicamente Virus 40 de Simio (SV40) de promotores de mamífero heterólogos, e.g., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de ataque de calor, estipulando que los promotores son compatibles con los sistemas de célula huésped. Los promotores tempranos y anteriores del virus SV40 se obtienen de manera conveniente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral de SV40 de réplica. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar el ADN en huéspedes de mamífero utilizando el virus de papiloma bovino como un vector se describe en la Patente de E.U. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de E.U. No. 4,601,978. Ver también Reyes et al . , Na ture 297:598-601 (1982) en expresión de cADN de ß-interferón de humano en células de ratón bajo el control de un promotor de quinasa de timidina de virus de herpes simple. Alternativamente, la repetición terminal larga de virus de sarcoma rous puede utilizarse como el promotor. Componente de Elemen to Mej orador La transcripción de un ADN que codifica un polipéptido de esta invención por eucariótas mayores, con frecuencia se incrementa al insertar una secuencia mejoradora en el vector. Muchas secuencias mejoradoras se conocen ahora de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina). Típicamente, uno utilizará un mejorador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el último lado del origen de réplica (bp 100-270) , el mejorador de promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el último lado del origen de réplica, y mejoradores de adenovirus. Ver también Yaniv, Na ture 297:17-18 (1982) en elementos mejoradores para la activación de promotores eucarióticos. El mejorador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el polipéptido, pero se ubica típicamente en un sitio 5' del promotor. Componen te de Terminación de la Transcripción Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (levadura, hongos, insectos, planta, animal, humano, o células nucleadas de los otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducir 5' y, ocasionalmente, 3' , de cADNs o ADNs virales o eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del mARN que codifica el polipéptido de la invención. Una componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. WO94/11026 y el vector de expresión descrito en la presente. Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped adecuadas para clonación y expresión de ADN que codifica los polipéptidos de la invención en los vectores en la presente son las células procariótcas, levadura o eucariótas mayores, descritas arriba. Las procarióticas adecuadas para este propósito incluyen eubacteria, tales como organismos de gram negativo o gram positivo, ejemplo, Enterobacterias tales como Escherichia , e . g. , E. coli, Enterobacter, Erwinia , Klebsiella, Proteus, Salmonella , e . g. , Salmonella typhimurium, Serra tia , e . g. , Serra tia marcescans, y Shigella, así como también Ba cilli tales como B. subtilis y B . licheniformis ( e . g. , B . licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa , y Streptomyces . Típicamente el huésped de clonación de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Además de las procariótas, los microbios eucarióticos tales como levadura y hongo filamentoso son huéspedes de clonación y expresión adecuados para polipéptido de la invención que codifican los vectores. Saccharomyces cerevisiae, o levadura para hornear común, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kluyveromyces tales como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus ; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida ; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa ; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occiden talis; y hongos filamentosos tales como, e.g., huéspedes Neurospora , Penicillium, Tolypocladium, y Aspergill us tales como A . nidulans y A . niger. Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insecto y planta. Numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (caterpilar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de fruta), y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están públicamente disponibles, e.g., la variante L-l de Autographa calif ornica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de acuerdo a la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperda . Los cultivos de célula vegetal de algodón, máiz, papa, semilla de soya, petunia, tomate, y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares de huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al . , J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células de riñon de hámbster bebe (BHK, ATCC CCL 10) ; células ováricas de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); células de Sértoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamífero de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al . , Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos arriba para el polipéptido de la invención, producción y cultivo en medio nutriente convencional modificado como apropiado para inducir promotores, selección de transformadores, o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas. Cul tivo de Células Huésped Las células huésped utilizadas para producir polipéptidos de la invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham' s FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Medio de Tagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma), medio de crecimiento normal para hepatocitos (Cambrex) , medio de crecimiento para preadipocitos (Cambrex) , etc. son adecuados para el cultivo de las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al . , Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al . , Anal . Biochem .102:255 (1980), Pats. de E.U. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U. Re. 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), reguladores (tal como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco GENTAMYCIN™) , elementos indicadores (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolecuar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de los otros complementos necesarios también puede incluirse en concentraciones apropiadas que se conocerían por aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y lo similar, se utilizan previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y será aparente para el experto ordinario en la materia) .

Purificación del Polipéptido Cuando se utilizan técnicas recombinantes, un polipéptido de la invención, e.g., VEGF o agente de polipéptido terapéutico adicional que se combina con VEGF, puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente secretarse en el medio. Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y/o aislarse del medio de cultivo o de lisatos de célula huésped. Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos próteínicos o no proteínicos. En ciertas modalidades, el polipéptido se purificará (1) a más del 95% en peso de polipéptido como se determina por el método Lowry, o más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal secuencia interna de aminoácidos por el uso de una secuenciador de copa giratorio, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul Coomassie, o cepa plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación . Varios métodos de purificación de proteína pueden emplearse y tales métodos se conocen en la materia y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Métodos in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa(s) de purificación dependerá (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el polipéptido particular de la invención producido. Si se unen a la membrana, los polipéptidos de la invención pueden liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (e.g. Triton-X 100) o por desdoblamiento enzimático. Las células empleadas en expresión de un polipéptido de la invención pueden interrumpirse por varios medios químicos o físicos, tales como ciclo de congelado-descongelado, sonicación, interrupción mecánica, o agentes de lisis celular. Los siguientes procedimientos son ejemplificativos de los procedimientos de purificación adecuados, por fraccionamiento en una columna de intercambio de ion; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice, cromatografía en Heparina, cromatografía SEPHAROSE™ en una resina de intercambio de catión o anión (tal como una columna de ácido poliaspártico) , DEAE, etc.); cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para remover los contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metal para unir las formas marcadas con epítope de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, una composición de VEGF preparada de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de heparina, electroforesis de gel, y diálisis. Otras técnicas para purificación de proteína también están disponibles. Articulos de Manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para los métodos y tratamiento de heridas descritos arriba. El artículo de manufactura comprende un recipiente, una etiqueta y una inserción de paquete. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, vendajes, compresas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio, plástico, nylón, algodón, poliéster, etc. El recipiente mantiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril o puede ser un tubo con múltiples dosificaciones o puede ser una jeringa con indicaciones de cantidades medidas de agente activo. Al menos un agente activo en la composición se incluye en el recipiente. La etiqueta en, o asociada con, el recipiente indica que la composición se utiliza para acelerar o mejorar la curación de herida. El artículo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como salina normal, salina regulada por fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa, o solución de gel. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, vendajes, compresas, aplicadores, gasas, barreras, barreras semi-permeables, depresores de lengua, agujas y jeringas. Opcionalmente, un conjunto de instrucciones, generalmente instrucciones escritas, se incluye, que se refiere al uso y dosificación de VEGF para administrar a la herida descrita en la presente. Las instrucciones incluidas con el kit generalmente incluyen la información en cuanto a dosificación, programa de dosificación, y vía de administración para el tratamiento del trastorno. Los recipientes de VEGF pueden ser dosis unitarias, paquetes voluminososo (e.g., paquetes de múltiples dosis) o dosis de subunidad. La especificación se considera que es suficiente para permitir que un experto en la material practique la invención. Sin embargo, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí serán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la siguiente descripción y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. EJEMPLOS Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos se sugerirán para personas expertas en la materia y se incluyen dentro del espíritu y prevista de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1: VEGF tópico en prueba clinica de VGF27S3g en curación de herida Una prueba clínica doble ciega (e.g., farmacéutico no cegado, cegado por MD o paciente cegado) se realiza para determinar si la aplicación de VEGF tópico promovería la curación de herida en sujetos humanos con ulceraciones diabéticas. Ver Tabla 4 para un diagrama de las características de la enfermedad base de los pacientes en el estudio para administrar rhVEGF (como se refiere en la presente como "Telbermina") para el tratamiento de heridas diabéticas. El diseño del estudio se indica en la Fig. 1.

Tabla 4 Características de la Enfermedad Base Placebo (N=26) Telbermina (N"29) Edad promedio, y (rango) 59.3 (38-81) 59.5 (42-74) Glucose promedio, mg/dL (rango) 225.8 (77-465) 179.1 (29-593) HbAlC promedio, % (rango) 1.4 (5.5-13.6) .3 (5.6-13.6) Úlcera extirpada en selección, N (%) Si 21 (80.8) No 5 (19.2) 27 (93.1) 2 (6.9) Área de úlcera promedio, cm' (rango) Longitud x ancho en selección 1.85 (1.08-2.90) 1.92 (0.96-4.08) Planimetría en selección J 1.14 (0.50-2.24) 1.35 (0.59-3.51) Planimetría en día 1 1.05 (0.62-2.34) 1.15 (0.44-2.97) * Un sujeto tratado con placebo se excluye del sumario debido a un valor de glucosa faltante. f Un sujeto tratado con talbermina se excluye del sumario debido a un valor HbAl faltante |Dos sujetos tratados con placebo no tienen las valoraciones de planimetría base. 24 de los pacientes tratados con placebo completaron la fase de tratamiento y 22 completaron la fase de observación. 27 de los pacientes tratados con telbermina (VEGF recombinante tópico) completaron la fase de tratamiento y 22 completaron la fase de observación. Los pacientes con diabetes mellitus I o II (hemoglobina glicosilada, controlada Ale (HbAlc) < 12%) con un área de úlcera extirpada de >0.4 cm2 y < 4.0 cm2 el día 1 que fueron heridas superficies (e.g., a etapa UT la (sin hueso, músculo, tendón), ver Table 2) se tratan con ya sea VEGF o un placebo 3 veces a la semana por 6 semanas (total de 18 dosis) . El tratamiento fue cada 48 horas ( +/- 24 horas) pero no más de 3 dosis por semana. La cantidad de VEGF por tratamiento fue 72 µg/cm2. El VEGF se prepara en el sitio. 0.22 ml de VEGF (5mg/ml) o el Placebo (vehículo regulador) se remueve del frasco y se agrega a aproximadamente un 5% de metilcelulosa (e.g., 4.7%) (e.g., metilcelulosa premium Methocel A4M (The Dow Chemical Company; Midland, MI) formulación en 5mM regulador de succinato, pH 5.0. El VEGF o Placebo y el gel se mezclan por 2 horas, lo que incrementa la viscosidad y reduce la pérdida de material de dosificación cuando se aplica. Un gel VEGF final al 0.06% (gel final al 3% metilcelulosa) en 5 mM, regulador de succionato pH 5.0 (con, e.g., en VEGF 1.8 mg/ml, 0.0036% polisorbato 20 y 100 mM dehidrato de trehalosa) fue el material de dosificación final. El material de dosificación final se aplica con una jeringa de tuberculina de 1.0 ml, e.g., llenada con 0.6 mL de material de dosificación final. Típicamente, la úlcera fue una úlcera crónica. La duración de la úlcera fue mayor a o igual a 4 semanas o menos de 6 meses antes del tratamiento. No hubo infección activa y el sujeto tuvo un miembro modificado; índice de tobillo- braquial (ABl) > 0.6 y menos de o igual a 1.2 en el pie de estudio. Durante el tratamiento los dos grupos VEGF o placebo tuvieron práctica del buen cuidado de herida y valoraciones semanales, e.g., examinaciones físucas, indicadores planimétricos y/o fotografías de 35 mm (e.g., Food and Drug Administración (FDA) Guidance for Industry 2000, Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds-Developing Products for Treatment, Junio 2000) . Los puntos finales a dirigirse fueron incidencia de cierre completo de la herida, que incluyeron el cierre de la piel sin requerimientos de vendaje o drenaje, (e.g., valorados, e.g., 3 meses después del cierre) y aceleración de la curación de herida, donde la velocidad refleja una disminución clínicamente significativa del tiempo hasta que, e.g., ocurre el cierre completo, y un tiempo ara análisis eventual (e.g., tiempo para cierre completo). El punto final de eficacia primaria fue por ciento de reducción en área de superficie de úlcera total el día 43 (hasta el día 49) de labase se determina por análisis cuantitativo de indicadores planimétricos de la úlcera. Los puntos finales de eficacia secundarios incluyeron: por ciendo de reducción en área de superficie de úlcera total el Día 29 y Día 84 en comparación con la base (e.g., valor de Día 1), incidencia de curaciones completas de la úlcera en los Días 29, 43, y 84, tiempo (e.g., días) para la curación completa de la úlcera, tiempo (e.g., días) para recurrencia de la formación de úlcera para el sujeto con curación completa de la úlcera antes del final del tratamiento, incidencia de área de superficie de úlcera total incrementada (> 15%) en comparación con base, incidencia de etapa avanzada de úlcera (e.g., > UT la), y modificación microcirculatoria del lecho de úlcera en los Días 1, 8, 22, y 43. Los asuntos de seguridad que se monitorean incluyeron hipotensión clínicamente significativa (e.g., definida como una caída de > 35 mmHg en presión sanguínea sistolítica relativa a la predosis en 60 minutos después de la aplicación de cada dosis del fármaco de estudio durante la primer semana de tratamiento (días 1, 3 y 5), la infección de la úlcera clínicamente significativa (e.g., definida por la descarga incrementada y exudatos de mal olor de la úlcera, fiebre (temperatura de > 38.6°C), y un conteo de glóbulos blancos de > 10, OOOµL) , producción de anticuerpos anti-VEGF. La presión sanguínea se mide antes de cada dosis y 60 minutos después de cada dosis durante la primer semana. El volumen total del gel aplicado para cada tratamiento es 0.12-0.48 mL (72 µg-288 µg VEGF). La cantidad de gel aplicada se basa en las mediciones de la herida ( (LxW) , donde L es la longitud de borde a borde más larga en cm y W es el ancho de borde a borde más largo perpendicular a L en cm (LxW=área de superficie estimada (cm2)). Por ejemplo, el gel se aplica al utilizar un depressor de lengua estéril, donde la cantidad total de gel aplicada sobre la superficie completa de la úlcera fue en un espesor de 1/16' ' . La herida se cubre con barrera semipermeable, estéril (e.g., vendaje de película adaptec) y se envuelve con envoltura de gasa de algodón (e.g., Kerlix) . En el siguiente tratamiento, el vendaje se remueve y la úlcera se irriga gentilamente con salina normal estéril. La superficie de úlcera se mide de nuevo, la dosis apropiada de gel se aplica y la úlcera se vuelve a vendar. Resultados: VEGF tópico parece ser seguro y bien tolerado. La incidencia de los eventos adversos fue comparable entre grupos de tratamiento (grupos telbermina y placebo) . Ninguno de los eventos adversos o eventos adversos serios observados se atribuyen al fármaco de estudio. Dos pacientes no continúa el estudio debido a serios eventos adversoso (1 en el grupo telbermina - úlcera de piel infectada; 1 en el grupo placebo - infección localizada) . Hubo un paciente en el grupo telbermina que murió a los 4 días después del último tratamiento, pero la muerte no se atribuye al fármaco de estudio. Ninguno de los casos de hipotensión clínicamente significativa se observan en ningún grupo de tratamiento. Los datos sugieren evidencia de la actividad biológica. Ninguna señal de seguridad se observa en una prueba que tuvo tama {os de úlceras pequeñas que estuvieron en etapa la UT. Ver la Tabla 5 para un sumario de los resultados para % de reducción mediana en área de la herida, % de sujetos con curación completa y tiempo de curación. En sujetos diabéticos tratados con VEGF por 6 semanas a 3 veces por semana, la población de sujetos mostró un 14-25% de mejora en la curación de herida completa después de 6 semanas con VEGF en comparación con placebo. La prueba mostró que VEGF tuvo una aceleración de la curación de -75-100% más rápida que placebo. Ver Table 6, que ilustra el tiempo para completer primero la curación de la herida en pacientes tratados con Telbermina (rhVEGF) o placebo. El tiempo para completar la curación de la úlcera se acelera en los pacientes tratados con VEGF, e.g., tiempo para completar la curación (25 pocentual) fue 32.5 días contra 43.0 días.

Tabla 5 % de Reducción % Sujetos Tiempo de Mediana en Área de curación curación (VEGF la herida completa (VEGF vs . Placebo)4* (superficie de vs . Placebo) 3* úlcera total) (VEGF vs . Placebo) 2* Día 43 Seguridad 95% vs . 85% 41% vs 27% HR 1.75 (p=0.18) (semana 6) Evaluable (p=0.67) (p=0.39) Eficacia1 100% vs. 88% 52% vs 27% HR 1.98 (p=0.12) Evaluable (p=0.17) (p=0.13) Dia 84 (SM Seguridad 100% vs. 92% 52% vs 35% HR 1.87 (p=0.13) 12) Evaluable (p=0.49) (p=0.28) Eficacia1 100% vs . 93% 71% vs 38% HR 2.10 (p-0.08) Evaluable (p=0.05) (p=0.06) 1 sujetos evaluables por eficacia (especificada antes del no cegado) Sujetos a quienes les faltan 3 dosis consecutivas en censo al menos dosificación disponible 2 valor p prueba de suma de rango Wilcoxon 3 valor p prueba exacta de Fisher. valor p prueba de Log-rango 'análisis planimétrico cuantitativo del método de valoración Tabla 6 ND = No detectable * Estimado utilizando el método Kapanl Meier. Para los sujetos quienes lograron la curación completa de la herida, la recurrencia de la formación de úlcera se valora entre el tiempo de primer curación completa de la úlcera y el tiempo de terminación del estudio o discontinuación. De los sujetos evaluables para seguridad quienes lograron la curación completa de la úlcera, 26.7% de los sujetos tratados con terlbermina (4 de 15) y 33.3% de los sujetos tratados con placebo (3 de 9) tuvieron una recurrencia de formación de úlcera (valor p de log-rango = 0.57). El índice de riesgo para la recurrencia de formación de úlcera para sujetos tratados con telbermina en comparación con sujetos tratados con placebo fue 0.63 (95% Cl : 0.13, 3.15) . Ejemplo 2 : VEGF tópico en curación de heridas Los sujetos, e.g., pacientes con diabetes mellitus tupo I o II, con un área de úlcera estimada después del desbridamiento aguda de, e.g., >1.0 cm2 y < 6.5 cm2 al inicio de tratamiento, se tratan con VEGF recombinante tópico (e.g., formulación de gel) diariamente por 12 semanas (por un total de hasta 84 dosis) en total o hasta el cierre completo de la herida (e.g., cierre de la piel sin requerimientos de vendaje o drenaje), lo que suceda primero. Los sujetos pueden observarse por 12 semanas o más después de la fase de tratamiento. Los sujetos recibieron ya sea 24 µg/cm2, 72 µg/cm2, o 216 µg/cm2 VEGF en cada tratamiento diario. El área de superficie de úlcera (cm2) se estima, e.g., por la longitud de (L(cm)) que es la medición de borde a borde más larga de la úlcera y el ancho (W(cm)) se toma de un eje perpendicular a la longitud en la medición de borde a borde más largo. El área de superficie estimada es entonces LxW. El tratamiento puede valorarse por medición del perímetro del área de úlcera a través de indicadores, indicadores de análisis planimétricos del margen de úlcera, fotografías, examinaciones físicas, etc. El VEGF aplicado era de 1.8, 0.6 y 0.2 mg/ml de VEGF, 3% metilcelulosa (e.g., meitulcelulosa Premium Methocel A4M (The Dow Chemical Company; Midland, MI), en 5 mM, regulador de succinato pH 5.0 (with, e.g., a VEGF 1.8 mg/ml, 0.0036% polisorbato 20 y 100 mM de dehidrato de trehalosa) . La especificación se considera suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente. En realidad, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

[0004] The specification is considered to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. It is understood that the ejemplos and embodiments described en la presente are for illustrative purposes only. Indeed, various modifications de la invención in addition to those shown and described en la presente will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and fall within the scope of the appended claims.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto, comprendiendo el método: administrar una cantidad efectiva de VEGF a una herida, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de heridas en más del 60% en comparación a un control .
2. El método de la reivindicación 1, en donde la aceleración de la curación de heridas es igual o mayor al 74% en comparación al control.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la aceleración de la curación de heridas se valora por el % de reducción en el área de la herida.
4. El método de la reivindicación 3, en donde el área de la herida es de aproximadamente 0.4 cm2 o más antes del tratamiento.
5. El método de la reivindicación 3, en donde el área de la herida es de aproximadamente 1.0 cm2 o más antes del tratamiento.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la aceleración de la curación de heridas se valora por la tasa de curación completa de la herida.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la herida es una úlcera de pie diabético.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva de VEGF se administra al menos tres veces por semana.
9. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva de VEGF se administra al menos durante seis semanas.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva de VEGF se administra hasta que se completa el cierre de la herida.
11. El método de la reivindicación 1, en donde el VEGF es VEGF?65.
12. El método de la reivindicación 1 u 11, en donde el VEGF es un VEGF humano recombinante.
13. El método de la reivindicación 1, en donde la administración es tópica.
14. El método de la reivindicación 1, en donde el VEGF es una formulación para administración tópica.
15. El método de la reivindicación 1, en donde la herida es una herida crónica.
16. El método de la reivindicación 1, en donde la herida es una úlcera por presión, úlcera por decúbito, una úlcera venosa, una quemadura, una herida quirúrgica o una herida normal.
17. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto sufre o ha sufrido un tratamiento en donde el tratamiento retarda o proporciona la curación ineficaz de la herida.
18. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene una condición secundaria, en donde las condiciones secundarias retardan o proporcionan la curación ineficaz de la herida.
19. El método de la reivindicación 18, en donde la condición secundaria es diabetes.
20. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva de VEGF es de aproximadamente 20 µg/cm2 hasta aproximadamente 250 µg/cm2.
21. El método de la reivindicación 20, en donde la cantidad efectiva de VEGF es de aproximadamente 24 µg/cm2.
22. El método de la reivindicación 20, en donde la cantidad efectiva de VEGF es de aproximadamente 72 µg/cm2.
23. El método de la reivindicación 20, en donde la cantidad efectiva de VEGF es de aproximadamente 216 µg/cm2.
24. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto es un humano.
25. Un método para acelerar la curación de heridas en un sujeto . humano, comprendiendo el método la administración de una cantidad efectiva de VEGF a una herida, en donde la administración de la cantidad efectiva de VEGF acelera la curación de la herida en más del 60% en comparación al control y en donde la herida se encuentra presente en e sujeto durante aproximadamente 4 semanas o más antes de la administración de la cantidad efectiva de VEGF.