ES2932861T3 - Composiciones de IL-22 Fc y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a composiciones (p. ej., composiciones farmacéuticas) que incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión IL-22 Fc, métodos para prepararlas y métodos para usarlas, p. ej., para el tratamiento de enfermedades (p. ej., EII). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de IL-22 Fc y procedimientos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, comprendiendo la proteína de fusión IL-22 Fc un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector, y procedimientos de preparación, purificación y uso de la misma.

Antecedentes de la invención

La interleucina (IL)-22 es un miembro de la familia de citocinas IL-10 que se produce, por ejemplo, por células Th22, linfocitos NK, células inductoras de tejido linfático (LTi), células dendríticas y células Th17. IL-22 se une al complejo receptor IL-22R1/IL-10R2, que se expresa en células innatas (por ejemplo, células epiteliales, hepatocitos y queratinocitos) y en tejidos epiteliales de barrera de varios órganos (por ejemplo, dermis, páncreas, intestino, y el sistema respiratorio).

IL-22 desempeña un papel importante en la inmunidad de las mucosas, mediando en la defensa temprana del huésped contra la adhesión y el borrado de patógenos bacterianos. IL-22 promueve la producción de péptidos antimicrobianos y citocinas proinflamatorias a partir de células epiteliales y estimula la proliferación y migración de células epiteliales colónicas en el intestino. Tras la infección bacteriana, los ratones con IL-22 inactivada mostraron regeneración epitelial intestinal deteriorada, carga bacteriana alta y mortalidad incrementada. De forma similar, la infección de ratones con IL-22 inactivada con el virus de la gripe dio como resultado una pérdida de peso grave y una regeneración deteriorada de células epiteliales traqueales y bronquiales. Por tanto, IL-22 desempeña un papel proinflamatorio en suprimir la infección microbiana, así como un papel protector antiinflamatorio en la regeneración epitelial en respuestas inflamatorias.

Sigue existiendo la necesidad de obtener composiciones y procedimientos mejorados para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluyendo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, así como otros trastornos asociados con IL-22, incluyendo infección microbiana, lesión renal aguda, pancreatitis aguda, heridas, afecciones cardiovasculares, síndrome metabólico, endotoxemia aguda, enfermedad injerto contra huésped (EICH) y sepsis.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, comprendiendo la proteína de fusión IL-22 Fc un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector, y procedimientos de preparación y uso de la misma.

La invención presenta una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, comprendiendo la proteína de fusión IL-22 Fc un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector, en la que la composición farmacéutica comprende una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc, metionina aproximadamente 5 mM y polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1. La composición farmacéutica comprende además fosfato de sodio aproximadamente 10 mM y sacarosa aproximadamente 240 mM. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato de sodio es una mezcla de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica unitaria.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el vehículo es agua.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica es estable a través de uno o más ciclos de congelación-descongelación.

En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es estable a través de tres ciclos de congelacióndescongelación.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 2 semanas o más a aproximadamente 25 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 4 semanas o más a aproximadamente 25 °C.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 48 meses o más a -20 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 60 meses o más a -20 °C.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC). En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 90 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 36 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 42 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPL^c durante aproximadamente 42 meses a aproximadamente 5 °C.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 75 % o mayor como se evalúa por electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio sin tamizado de gel (CE-SDS-NGS) (por ejemplo, CE-SDS-NGS no reducida (NR)). En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 80 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS n R) durante aproximadamente 36 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR) durante aproximadamente 42 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS durante aproximadamente 42 meses a aproximadamente 5 °C. En cualquiera de los modos de realización precedentes, el CE-SDS-NGS puede ser CE-SDS-NGS NR.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o tópica. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para administración subcutánea.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica no contiene ningún conservante. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio y/o un diluyente. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con un diluyente. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio y un diluyente. En algunos modos de realización, la solución isotónica de cloruro de sodio comprende NaCl de aproximadamente al 0,1 % a aproximadamente al 2 %. En algunos modos de realización, la solución isotónica de cloruro de sodio comprende NaCl de aproximadamente al 0,5 % a aproximadamente al 1,5 %. En algunos modos de realización, la solución isotónica de cloruro de sodio comprende NaCl aproximadamente al 0,9 % (p/v). En algunos modos de realización, el diluyente comprende un agente tamponador, un agente de tonicidad y un tensioactivo. En algunos modos de realización, el diluyente comprende una concentración final de fosfato de sodio aproximadamente 10 mM, sacarosa aproximadamente 240 mM, polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, el polipéptido IL-22 está glucosilado. En algunos modos de realización, el polipéptido IL-22 está N-glucosilado. En algunos modos de realización, la región Fc no está glucosilada. En algunos modos de realización, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es glicina (Gly). En algunos modos de realización, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es alanina (Ala). En algunos modos de realización, el residuo aminoacídico en la posición 299 como en el índice EU de la región Fc es Ala, Gly o valina (Val).

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4. En algunos modos de realización, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG4.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:16. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos modos de realización, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos modos de realización, la región Fc no está N-glucosilada.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica comprende además un agente gelificante. En algunos modos de realización, el agente gelificante es un polisacárido. En algunos modos de realización, el agente gelificante es un agente celulósico. En algunos modos de realización, el agente gelificante es metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polímeros de bloque POE-POP, alginato, ácido hialurónico, poli(ácido acrílico), hidroxietilmetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. En algunos modos de realización, el agente gelificante es hidroxipropilmetilcelulosa. En algunos modos de realización, la formulación farmacéutica es para administración tópica.

En algunos modos de realización de cualquiera de los aspectos precedentes, la composición farmacéutica es para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención presenta la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En algunos modos de realización, la EII es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En algunos modos de realización, la EII es colitis ulcerosa. En algunos modos de realización, la colitis ulcerosa es colitis ulcerosa de moderada a grave. En algunos modos de realización, la EII es enfermedad de Crohn.

En otro aspecto, la invención presenta la composición farmacéutica para su uso en la inhibición de infección microbiana en el intestino, conservación de células caliciformes en el intestino durante una infección microbiana, potenciación de la integridad de células epiteliales, proliferación de células epiteliales, diferenciación de células epiteliales, migración de células epiteliales o cicatrización de heridas epiteliales en el intestino. En algunos modos de realización, la célula epitelial es una célula epitelial intestinal.

En otro aspecto, la invención presenta la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de lesión renal aguda o pancreatitis aguda.

En otro aspecto, la invención presenta la composición farmacéutica para su uso en la aceleración o mejora de la cicatrización de heridas en un sujeto que lo necesita. En algunos modos de realización, la herida es una herida crónica o una herida infectada. En algunos modos de realización, el sujeto es diabético. En algunos modos de realización, el sujeto diabético tiene diabetes de tipo II. En algunos modos de realización, la herida es una úlcera de pie diabético. En algunos modos de realización, la composición farmacéutica se administra hasta el cierre completo de la herida.

En otro aspecto, la invención presenta la composición farmacéutica para su uso en la prevención o tratamiento de una afección cardiovascular en un sujeto que lo necesita, afección que incluye una patología de formación de placas ateroescleróticas. En algunos modos de realización, la cardiovasculopatía es arteriopatía coronaria, microangiopatía coronaria, apoplejía, arteriopatía carotídea, arteriopatía periférica o nefropatía crónica. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además ralentizar la progresión de la formación de placas ateroescleróticas o evitar indicios de ateroesclerosis. En algunos modos de realización, los indicios de ateroesclerosis incluyen acumulación de placas o inflamación vascular.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un cromatograma que muestra una superposición de cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC) de una composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc que incluye 10 mg/ml en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 (PS20) al 0,02 % (p/v) a pH 5,5 después de 4 semanas a 40 °C y 5 °C.

La FIG. 2A es un gráfico que muestra la estabilidad térmica de una composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc por calorimetría diferencial de barrido (DSC) a 10 mg/ml en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 0,02 % (p/v) a pH 5,5.

La FIG. 2B es un gráfico que muestra la estabilidad térmica de una composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc por DSC a 10 mg/ml en PBS a pH 7,4. La temperatura de fusión inicial (Tf) para IgG4 es de aproximadamente 34 °C en comparación con PBS, pH 7,4 con una Tf de aproximadamente 45 °C.

La FIG. 3A es un gráfico que compara los perfiles de DSC de la proteína de fusión IL-22 Fc en acetato de histidina 10 mM a pH 5,5, 6,0, 6,5 y 7,0.

La FIG. 3B es un gráfico que muestra los perfiles de fluorescencia de DSC y de triptófano (Trp) intrínseca de la proteína de fusión IL-22 Fc en acetato de histidina 10 mM a pH 6,0.

La FIG. 3C es un gráfico que muestra los perfiles de fluorescencia de DSC y Trp de la proteína de fusión IL-22 Fc en acetato de histidina 10 mM a pH 6,5.

La FIG. 3D es un gráfico que muestra los perfiles de fluorescencia de DSC y Trp de la proteína de fusión IL-22 Fc en acetato de histidina 10 mM a pH 7,0.

La FIG. 3E es una serie de gráficos que muestran los análisis SE-HPLC, representados como porcentaje de alto peso molecular (% HMW) frente al tiempo (panel izquierdo), % de pico principal frente al tiempo (panel central) y % de dímero frente al tiempo (panel derecho), de proteína de fusión IL-22 Fc en condiciones térmicamente extremas en acetato de histidina 10 mM a pH 5,5, 6,0, 6,5 y 7,0 después de 4 semanas a 30 °C.

La FIG. 4 es un gráfico que muestra el perfil DSC de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc a pH 6,5, 7,0, 7,3 y 7,6 en fosfato de sodio 10 mM y pH 7,3 en tris 20 mM.

Las FIGS. 5A-5B son una serie de gráficos que muestran la tasa de degradación del pico principal (5A) y el porcentaje de agregación en el tiempo (5B) de la proteína de fusión IL-22 Fc por SE-HPLC en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1 después de T=0 y 6 semanas de almacenamiento a 30 °C.

Las FIGS. 5C-5D son una serie de gráficos que muestran la tasa de degradación del pico principal (5C) y el porcentaje de agregación en el tiempo (5D) de la proteína de fusión IL-22 Fc por SE-HPLC en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1 después de T=0 y 6 semanas de almacenamiento a 40 °C.

La FIG. 6 es un gráfico que muestra la tasa de formación de picos ácidos por isoelectroenfoque capilar por imagen (ICIEF) de la proteína de fusión IL-22 Fc en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1 después de T=0 y 4 semanas de almacenamiento a 30 °C.

La FIG. 7 es una superposición de cromatogramas que muestran los perfiles de SE-HPLC de la proteína de fusión IL-22 Fc después de un estudio de agitación.

La FIG. 8 es un gráfico que muestra la oxidación de metionina de ocho péptidos trípticos que contienen metionina de la proteína de fusión IL-22 Fc después del tratamiento con diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metil-propanimidamida (AAPH) y cartografía de péptidos trípticos por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas en tándem (CL-EM-EM). Se informa de la oxidación de metionina para cada péptido tríptico como un porcentaje de la proporción de péptido tríptico oxidado con respecto a la del péptido tríptico total (natural oxidado).

La FIG. 9 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de IL-22 madura de diferentes especies de mamíferos: ser humano (n.° de acceso GenBank Q9GZX6, SEQ ID NO: 4), chimpancé (n.° de acceso GenBank XP_003313906, SEQ ID NO: 48), orangután (n.° de acceso GenBank XP_002823544, SEQ ID NO: 49), ratón (n.° de acceso GenBank Q9JJY9, s Eq ID NO: 50) y perro (n.° de acceso GenBank XP_538274, SEQ ID NO: 51). Descripción detallada

I. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente entendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en el presente documento no se debe interpretar necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que en general se entiende en la técnica.

El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento se refiere al intervalo de error normal para el valor respectivo fácilmente conocido para el experto en la técnica en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se refieren a ese valor o parámetro per se.

Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por ejemplo, la referencia a "un péptido aislado" quiere decir uno o más péptidos aislados.

En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, el término "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de enteros.

El término "proteína de fusión IL-22 Fc" o "proteína de fusión de IL-22" o "proteína de fusión IL-22 Ig" como se usa en el presente documento se refiere a una proteína de fusión en la que la proteína o polipéptido IL-22 está unido, directa o indirectamente, a una región IgG Fc. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína o polipéptido IL-22 está glucosilado. En determinados aspectos preferentes de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una proteína o polipéptido IL-22 humana unida a una región Fc de IgG humana. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína IL-22 humana comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. Sin embargo, se entiende que las variaciones de secuencia pequeñas tales como inserciones, deleciones, sustituciones, especialmente sustituciones aminoacídicas conservadoras de IL-22 o Fc que no afectan a la función y/o actividad de la proteína de fusión IL-22 Fc o IL-22 también se contemplan en el presente documento. La proteína de fusión IL-22 Fc divulgada en el presente documento se puede unir al receptor de IL-22, lo que puede dar lugar a la señalización hacia 3' del receptor de IL-22. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc se puede unir al receptor de IL-22 y/o puede dar lugar a la señalización hacia 3' del receptor de IL-22. Las funciones y/o actividades de la proteína de fusión IL-22 Fc se pueden someter a ensayo por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación ELISA, ensayo de unión ligando-receptor y ensayo de luciferasa Stat3. En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona una proteína de fusión IL-22 Fc que se une al receptor de IL-22, en la que la unión puede dar lugar a la señalización hacia 3' del receptor de IL-22, comprendiendo la proteína de fusión IL-22 Fc una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, y en la que la región Fc no está glucosilada. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la región Fc de la proteína de fusión de IL-22 no posee actividades efectoras (por ejemplo, no se une a FcyIIIR) o presenta actividad efectora sustancialmente menor que un anticuerpo IgG completo (por ejemplo, natural). En determinados otros aspectos de la divulgación, la región Fc de la proteína de fusión IL-22 Fc no desencadena citotoxicidad tal como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). A menos que se especifique de otro modo, "proteína de fusión de IL-22", "fusión IL-22 Fc", "proteína de fusión IL-22 Ig", "proteína de fusión IL-22 Fc" o "IL-22 Fc" se usan de manera intercambiable en toda la presente solicitud.

El término "IL-22" o "polipéptido IL-22" o "proteína IL-22" como se usa en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier IL-22 natural de cualquier fuente de mamífero, incluyendo primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba IL-22 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de IL-22 que resulta del procesamiento en la célula. Por ejemplo, se engloban tanto IL-22 de longitud completa que contiene la secuencia líder N terminal como la forma madura de IL-22. La secuencia líder (o péptido señal) puede ser la secuencia líder de IL-22 endógena o una secuencia líder exógena de otra proteína secretora de mamífero. En determinados aspectos de la divulgación, la secuencia líder puede ser de una proteína secretora eucariota o procariota. El término también engloba variantes naturales de IL-22, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-22 humana ejemplar se muestra en SEQ ID NO:4 (forma madura, sin un péptido señal). En determinados aspectos de la divulgación, la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-22 de longitud completa con la secuencia líder endógena se proporciona en SEQ ID NO:71; mientras que en otros aspectos de la divulgación, la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-22 madura con una secuencia líder exógena se proporciona en SEQ ID NO:2. También se contemplan variaciones de secuencia pequeñas, especialmente sustituciones aminoacídicas conservadoras de IL-22 que no afectan a la función y/o actividad de IL-22 (por ejemplo, unión al receptor de IL-22). La figura 9 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de IL-22 madura de varias especies de mamíferos ejemplares. Los asteriscos indican residuos aminoacídicos altamente conservados entre especies que probablemente son importantes para las funciones y/o actividades de IL-22. En consecuencia, en determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende un polipéptido IL-22 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:4. En determinados otros modos de realización, la proteína IL-22 tiene un 95 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:71, un 96 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:71, un 97 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:71; un 98 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:71; o un 99 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO:71. Los polipéptidos IL-22 descritos en el presente documento se pueden aislar de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparar por procedimientos recombinantes o sintéticos.

El término "receptor de IL-22" o "IL-22R" se refiere a un heterodímero que consiste en IL-22R1 e IL-10R2 o variantes alélicas naturales de los mismos. Véase, por ejemplo, Ouyang et al., 2011, Annu. Rev. Immunol. 29:159-63. IL-10R2 se expresa de forma ubicua por muchos tipos de células, y IL-22R1 se expresa solo en células innatas tales como células epiteliales, hepatocitos y queratinocitos. IL-22R1 también es conocido como IL-22Ra1 o IL-22Ra1. IL-22R1 se puede emparejar con otros polipéptidos para formar receptores heterodiméricos para otros miembros de la familia IL-10, por ejemplo, IL-20 o IL-24. Véase, por ejemplo, Ouyang et al., 2011, supra. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de un polipéptido IL-22R1 ejemplar se muestra en SEQ ID NO:81. Esta secuencia de longitud completa de IL-22R1 incluye una secuencia señal N terminal (aminoácidos 1-15) que se escinde en la molécula funcional final (de la que una secuencia de aminoácidos ejemplar se muestra en ^s E^q ID NO:82). La secuencia de aminoácidos de longitud completa de un polipéptido IL10R2 ejemplar se muestra en SEQ ID NO:83. Esta secuencia de longitud completa de IL10R2 incluye una secuencia señal N terminal (aminoácidos 1-19) que se escinde en la molécula funcional final (de la que una secuencia de aminoácidos ejemplar se muestra en Se Q ID NO:84).

Un "polipéptido IL-22 de secuencia natural" o un "polipéptido IL-22R de secuencia natural" se refiere a un polipéptido que comprende la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido IL-22 o IL-22R correspondiente derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos IL-22 o IL-22R de secuencia natural se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos. Los términos engloban específicamente formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido IL-22 o IL-22R específico (por ejemplo, una IL-22 que carece de su péptido señal asociado), formas variantes naturales (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En diversos aspectos de la divulgación, los polipéptidos IL-22 o IL-22R de secuencia natural divulgados en el presente documento son polipéptidos de secuencia natural de longitud completa o maduros. Una IL-22 humana natural de longitud completa ejemplar se muestra en SEQ ID NO:70 (ADN) y SEQ ID NO:71 (proteína). Aunque se muestra que las secuencias polipeptídicas de IL-22 e IL-22R comienzan con los residuos de metionina designados en el presente documento como posición aminoacídica 1, es concebible y posible que se puedan emplear otros residuos de metionina localizados hacia 5' o bien hacia 3' de la posición aminoacídica 1 como el residuo aminoacídico inicial para los polipéptidos IL-22 o IL-22R.

Una "variante de IL-22", una "variante de IL-22R", un "polipéptido variante de IL-22" o un "polipéptido de variante de IL-22R" quiere decir un polipéptido IL-22 o IL-22R activo como se define anteriormente que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia polipeptídica de IL-22 o IL-22R de secuencia natural de longitud completa. Normalmente, una variante de polipéptido ⁱL-22 o IL-22R tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 84 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 88 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 89 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 90 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 91 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 92 % % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y de forma alternativa al menos aproximadamente un 99 % % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia polipeptídica de IL-22 o IL-22R de secuencia natural madura o de longitud completa.

El término "región Fc", "dominio Fc" o "Fc" se refiere a una región sin unión a antígeno C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc naturales y regiones Fc variantes. En determinados aspectos de la divulgación, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226 al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no, sin afectar la estructura o estabilidad de la región Fc. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región IgG o Fc es de acuerdo con el sistema de numeración EU para anticuerpos, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

En determinados aspectos de la divulgación, la región Fc se refiere a una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG que comprende una región bisagra (que comienza en Cys226), un dominio CH2 de IgG y un dominio CH3. El término "región bisagra" o "secuencia bisagra", como se usa en el presente documento, se refiere a la secuencia de aminoácidos localizada entre el conector y el dominio CH2. En determinados aspectos de la divulgación, la región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos CPPCP (SEQ ID NO:31). En determinados modos de realización, la región bisagra para la proteína de fusión IL-22 IgG4 Fc comprende la secuencia CPPCP (SEQ ID NO:31), una secuencia hallada en la región bisagra IgG1 natural, para facilitar la dimerización. En determinados otros aspectos de la divulgación, la región Fc comienza en la región bisagra y se extiende al extremo C de la cadena pesada de IgG. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la región Fc comprende la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG4. En determinados otros aspectos particulares de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG1.

En determinados aspectos de la divulgación, el dominio CH2 de IgG comienza en Ala 231. En determinados otros aspectos de la divulgación, el dominio CH3 comienza en Gly 341. Se entiende que el residuo Lys del extremo C de IgG humana puede estar opcionalmente ausente. También se entiende que las sustituciones aminoacídicas conservadoras de la región Fc sin afectar a la estructura y/o estabilidad deseada de Fc se contemplan dentro del alcance de la divulgación.

En determinados aspectos de la divulgación, la IL-22 se une a la región Fc por medio de un conector. En determinados aspectos particulares de la divulgación, el conector es un péptido que conecta el extremo C de IL-22 con la región Fc como se describe en el presente documento. En determinados modos de realización, las secuencias de IgG naturales están presentes en el conector y/o región bisagra para minimizar y/o evitar el riesgo de inmunogenicidad. En otros aspectos de la divulgación, se pueden introducir variaciones de secuencias pequeñas en las secuencias naturales para facilitar la fabricación. Las construcciones de fusión IL-22 Fc que comprenden un conector exógeno o secuencias bisagra que presentan alta actividad (medida, por ejemplo, por un ensayo de luciferasa) también están dentro del alcance de la divulgación. En determinados aspectos de la divulgación, el conector comprende una secuencia de aminoácidos que es de 8-20 aminoácidos, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 11-16, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 aminoácidos de largo. En determinados otros aspectos de la divulgación, el conector comprende la secuencia de aminoácidos DKTHT (SEQ ID NO:32). En determinados aspectos particulares de la divulgación, el conector no comprende la secuencia Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:45), Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:46), o Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:47).

En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector. El término "unido a" o "fusionado a" se refiere a un enlace covalente, por ejemplo, un enlace peptídico, formado entre dos restos.

Los términos "glucosilación" y "glucosilado", como se usan en el presente documento, se refieren a la presencia de un carbohidrato (por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido, también denominado "glucano") fijado a una molécula biológica (por ejemplo, una proteína o un lípido). En aspectos particulares de la divulgación, la glucosilación se refiere a la presencia de un glucano (por ejemplo, un N-glucano) unido a una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) o una porción de una proteína de interés (por ejemplo, un resto polipeptídico de IL-22 de una proteína de fusión IL-22 Fc). Glucosilación unida a N se refiere a la fijación del resto glucídico a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto glucídico a la cadena lateral de asparagina. La glucosilación unida a O se refiere a la fijación de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina también pueden estar implicadas en la glucosilación unida a O. Para una revisión de la glucosilación, véase, por ejemplo, Varki et al., Essentials of Glycobiology, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017.

Los términos "aglucosilado" y "no glucosilado", como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una proteína o una porción de una proteína de interés (por ejemplo, la región Fc de una proteína de fusión IL-22 Fc) que no está glucosilada (por ejemplo, no N-glucosilada). Se debe entender que en algunos aspectos de la divulgación, una porción de una proteína de interés (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) está glucosilada (por ejemplo, la porción de polipéptido IL-22 de una proteína de fusión IL-22 Fc), mientras que otra porción de la proteína de interés no está glucosilada (por ejemplo, la región Fc de la proteína de fusión IL-22 Fc).

En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan en el presente documento proteínas de fusión IL-22 Fc en las que la región Fc o dominio CH2 no están glucosilados. En determinados aspectos de la divulgación, el sitio de N-glucosilación en el dominio CH2 está mutado para evitar la glucosilación. Por ejemplo, se puede preparar una proteína de fusión IL-22 Fc con una región Fc aglucosilada mutagenizando el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU en el dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, N297). En determinados aspectos de la divulgación, la glucosilación en el dominio CH2 de la región Fc se puede eliminar alterando el sitio de consenso de glucosilación, es decir, Asn en la posición 297 seguido de cualquier residuo aminoacídico (en el caso de IgG humana, Ser) y Thr. El sitio de glucosilación se puede alterar por inserciones, deleciones y/o sustituciones aminoacídicas. Por ejemplo, se pueden insertar uno o más residuos aminoacídicos entre Asn y Ser o entre Ser y Thr para alterar el sitio de glucosilación original, en el que las inserciones no regeneran un sitio de N-glucosilación. En determinados aspectos particulares de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU (por ejemplo, el sitio N-glucosilado en Fc) dentro del dominio CH2 de IgG Fc humana se muta para anular el sitio de glucosilación. En determinados aspectos particulares de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU (por ejemplo, N297) se cambia a Gly, Ala, Gln, Asp o Glu. En algunos aspectos particulares de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU (por ejemplo, N297) se cambia a Gly o Ala. En otros aspectos particulares de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU (por ejemplo, N297) se cambia a Gly. En determinados otros aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 299 como en el índice EU se puede sustituir con otro aminoácido, por ejemplo, Ala, Val o Gly. En determinados aspectos particulares de la divulgación, las mutaciones que dan como resultado un Fc aglucosilado no afectan la estructura y/o estabilidad de la proteína de fusión IL-22 Fc.

En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una región Fc en la que se muta el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU en el dominio CH2. En determinados aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU se cambia a Gly o Ala, preferentemente a Gly. En determinados otros aspectos de la divulgación, se elimina el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc que comprende un Fc que tiene una sustitución aminoacídica en el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU está aglucosilada o no glucosilada.

En otros aspectos de la divulgación, el N-glucano fijado al residuo aminoacídico natural en la posición 297 como en el índice EU (por ejemplo, N297) se puede retirar enzimáticamente, por ejemplo, por desglucosilación. Las enzimas glucolíticas adecuadas incluyen, sin limitación, péptido-N-glucosidasa (PNGasa).

El término "afucosilación", "afucosilado", "desfucosilación" o "desfucosilado" se refiere a la ausencia o retirada de fucosa central de un N-glucano, por ejemplo, un N-glucano unido a una proteína o una porción de una proteína. (por ejemplo, el dominio CH2 de Fc).

El término "proteína de fusión IL-22 Fc dimérica" se refiere a un dímero en el que cada monómero comprende una proteína de fusión IL-22 Fc. El término "proteína de fusión IL-22 Fc monomérica" se refiere a un dímero en el que un monómero comprende una proteína de fusión IL-22 Fc (el brazo IL-22 Fc), mientras que el otro monómero comprende una región Fc sin el polipéptido IL-22 (el brazo Fc). En consecuencia, la proteína de fusión IL-22 Fc dimérica es bivalente con respecto a la unión a IL-22R, mientras que la proteína de fusión IL-22 Fc monomérica es monovalente con respecto a la unión a IL-22R. La heterodimerización de la proteína de fusión IL-22 Fc monomérica se puede facilitar por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo sin limitación, heterodimerización por la tecnología de botón en ojal. La estructura y el procedimiento de ensamblaje de la tecnología de botón en ojal se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos US5.821.333, US7.642.228, US 2011/0287009 y PCT/US2012/059810. Esta tecnología se desarrolló introduciendo un "botón" (o una protuberancia) reemplazando un pequeño residuo aminoacídico con uno grande en el dominio CH3 de un Fc, e introduciendo un "ojal" (o una cavidad) en el dominio CH3 del otro Fc reemplazando uno o más residuos aminoacídicos grandes por otros más pequeños. En determinados aspectos de la divulgación, el brazo de fusión IL-22 Fc comprende un botón, y el brazo de solo Fc comprende un ojal.

Los residuos preferentes para la formación de un botón son en general residuos aminoacídicos naturales y se seleccionan preferentemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferentes son triptófano y tirosina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original para la formación del botón tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares en el dominio CH3 para formar el botón incluyen sin limitación la sustitución T366W, T366Y o F405W.

Los residuos preferentes para la formación de un ojal son normalmente residuos aminoacídicos naturales y se seleccionan preferentemente de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). En un aspecto de la divulgación, el residuo original para la formación del ojal tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares en el dominio CH3 para generar el ojal incluyen sin limitación las sustituciones T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T e Y407V. En determinados aspectos de la divulgación, el botón comprende la sustitución T366W y el ojal comprende las sustituciones T366S/L368A/Y407V. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la región Fc de la proteína de fusión IL-22 Fc monomérica comprende una región Fc de IgG1. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la fusión IL-22 Fc IgG1 monomérica comprende un brazo de botón de IL-22 Fc y un brazo de ojal de Fc. En determinados modos de realización, el brazo de botón de IL-22 Fc comprende una sustitución T366W (SEQ ID NO:61), y el brazo de ojal de Fc comprende T366S, L368A e Y407V (Se Q ID NO:62). En determinados otros aspectos de la divulgación, la región Fc de ambos brazos comprende además una mutación N297G o N297A. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc monomérica se expresa en células de E. coli. Se entiende que otras modificaciones de la región Fc conocidas en la técnica que facilitan la heterodimerización también se contemplan y se engloban por la presente solicitud.

El término "herida" se refiere a una lesión, especialmente una en la que la piel u otra superficie externa se desgarra, perfora, corta o rompe de otro modo.

El término "úlcera" es un sitio de daño en la piel o membrana mucosa que a menudo se caracteriza por la formación de pus, muerte de tejido y con frecuencia se acompaña por una reacción inflamatoria.

El término "intestino" como se usa de manera intercambiable en el presente documento engloba ampliamente el intestino delgado y el intestino grueso.

El término "aceleración de la cicatrización de heridas" se refiere al incremento en la tasa de cicatrización, por ejemplo, una reducción en el tiempo hasta que se produce el cierre completo de la herida o una reducción en el tiempo hasta que se produce un porcentaje (%) de reducción en el área de la herida.

Una "herida diabética" es una herida que está asociada con diabetes.

Una "úlcera diabética" es una úlcera que está asociada con diabetes.

Una "herida crónica" se refiere a una herida que no cicatriza. Véase, por ejemplo, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Las heridas crónicas incluyen, por ejemplo, úlceras arteriales, úlceras diabéticas, úlceras o escaras de decúbito, úlceras venosas y similares. Una herida aguda puede convertirse en una herida crónica. Las heridas agudas incluyen heridas provocadas por, por ejemplo, lesión térmica (por ejemplo, quemadura), traumatismo, cirugía, escisión de cáncer de piel extenso, infecciones fúngicas y bacterianas profundas, vasculitis, esclerodermia, pénfigo, necrólisis epidérmica tóxica y similares. Véase, por ejemplo, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, publicado: 24 de octubre de 2001. Por tanto, en determinados aspectos de la divulgación, una herida crónica es una herida infectada. Una "herida normal" se refiere a una herida experimenta una reparación de cicatrización de heridas normal.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un ligando o un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un receptor o un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, proteína de fusión IL-22 Fc y receptor de IL-22). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')², diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹ e IgA². Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, ^y y M, respectivamente.

Las "funciones efectoras" o "actividades efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc no presenta ninguna función efectora o ninguna función efectora detectable. En determinados otros aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc presenta una función efectora sustancialmente reducida, por ejemplo, aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de función efectora reducida.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Por ejemplo, en el caso de una enfermedad o afección cardiovascular, la cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión IL-22 Fc puede reducir el grado de formación de placas ateroescleróticas; reducir el tamaño de la(s) placa(s) ateroesclerótica(s); inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la placa ateroesclerótica; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la trombosis o ruptura de una placa ateroesclerótica; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o afección.

Por "reducir o inhibir" se quiere decir la capacidad para provocar una disminución global preferentemente de un 20 % o mayor, más preferentemente de un 50 % o mayor, y lo más preferentemente de un 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas del trastorno que se está tratando, la presencia o el tamaño de las placas ateroescleróticas o el número de placas ateroescleróticas.

Una "cantidad subóptima" se refiere a la cantidad menor que la cantidad óptima de un agente terapéutico usado típicamente para un determinado tratamiento. Cuando se dan dos agentes terapéuticos a un sujeto, de forma simultánea o bien secuencial, cada agente terapéutico se puede dar en una cantidad subóptima en comparación con el tratamiento cuando cada agente terapéutico se administra solo. Por ejemplo, en determinados aspectos de la divulgación, al sujeto que necesita tratamiento para EII se le administra la composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión IL-22 Fc y una dexametasona en una cantidad subóptima.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La célula transformada incluye célula transformada de forma transitoria o estable. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. En determinados modos de realización, la célula huésped se transfecta de forma transitoria con el ácido nucleico exógeno. En determinados otros modos de realización, la célula huésped se transfecta de forma estable con el ácido nucleico exógeno.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo, sujeto o paciente es un ser humano.

Una proteína de fusión IL-22 Fc "aislada" es una que se ha separado del entorno de una célula huésped que produce de forma recombinante la proteína de fusión. En algunos aspectos de la divulgación, una proteína de fusión IL-22 Fc se purifica a más de un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de pureza como se determina por, por ejemplo, enfoques electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

El término "ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión IL-22 Fc" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión IL-22 Fc, incluyendo dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un solo vector o vectores separados, dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico transfectada(s) de forma transitoria o estable en una célula huésped, y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico se "une de forma funcional" cuando se coloca en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora se une de forma funcional al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se une de forma funcional a una secuencia codificante si se sitúa para facilitar la traducción. En general, "unido de forma funcional" quiere decir que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra por fijación en sitios de restricción accesibles. Si dichos sitios no existen, se usan los conectores o adaptadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades pequeñas. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar en el presente documento se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Los "anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6,a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se une. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se unen de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Una "región Fc de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia natural incluyen, sin limitación, una región Fc de IgG1 humana de secuencia natural (alotipos A y distinto a A); región Fc de IgG2 humana de secuencia natural; región Fc de IgG3 humana de secuencia natural; y región Fc de IgG4 humana de secuencia natural, así como variantes naturales de las mismas.

Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica, preferentemente una o más sustituciones aminoacídicas. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución aminoacídica en comparación con una región Fc de secuencia natural o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones aminoacídicas y, preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones aminoacídicas en una región Fc de secuencia natural o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un polipéptido original y, lo más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de homología con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de homología con la misma. En determinados aspectos de la divulgación, la región Fc variante no está glucosilada.

Un "trastorno", una "enfermedad" o una "afección", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) descrita en el presente documento, por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye una proteína de fusión iL-22 Fc. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. En algunos aspectos de la divulgación, el trastorno es un trastorno asociado con IL-22. Los trastornos ejemplares incluyen EII (por ejemplo, CU o enfermedad de Crohn), infección microbiana, lesión renal aguda, pancreatitis aguda, heridas, afecciones cardiovasculares, síndrome metabólico, endotoxemia aguda y sepsis.

Los términos "trastorno inflamatorio intestinal", "enfermedad inflamatoria intestinal" o "EII", como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se usan en el presente documento en el sentido más amplio e incluyen todas las enfermedades y afecciones patológicas con una patogenia que implica inflamación recurrente en el intestino, incluyendo intestino delgado y colon. EII incluye, por ejemplo, colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn. EII no se limita a CU y EC. Las manifestaciones de la enfermedad incluyen inflamación y disminución de la integridad epitelial en el intestino.

Los términos "cardiovasculopatía" o "trastorno cardiovascular" se usan en el presente documento en el sentido más amplio e incluyen todas las enfermedades y afecciones patológicas con una patogenia que implica anomalías de los vasos sanguíneos, tales como, por ejemplo, formación de placas ateroescleróticas (incluyendo placas estables o inestables/vulnerables), ateroesclerosis, arteriesclerosis, arterioloesclerosis y exposición elevada a lipopolisacáridos (LPS) sistémicos. El término incluye adicionalmente enfermedades y afecciones patológicas que se benefician de la inhibición de la formación de placas ateroescleróticas. Las cardiovasculopatías incluyen, sin limitación, ateroesclerosis coronaria, microangiopatía coronaria, apoplejía, arteriopatía carotídea, arteriopatía periférica, isquemia, arteriopatía coronaria (CAD), síndrome coronario agudo (ACS), cardiopatía coronaria (CHD), afecciones asociadas con CAD y CHD, enfermedad cerebrovascular, vasculopatía periférica, aneurisma, vasculitis, flebotrombosis, diabetes mellitus, síndrome metabólico insuficiencia renal crónica, lesión tisular remota después de isquemia y reperfusión, y circulación extracorporal. Se incluyen específicamente dentro de este grupo todas las cardiovasculopatías asociadas con una aparición, desarrollo o progresión que se puede controlar por la inhibición de la formación de placas ateroescleróticas.

El término "afección cardiovascular" se usa en el presente documento en el sentido más amplio e incluye todas las enfermedades y afecciones cardiovasculares con una patología que implica la formación de placas ateroescleróticas (incluyendo placas estables o inestables/vulnerables), ateroesclerosis, arterioesclerosis, arterioloesclerosis y exposición elevada a lipopolisacáridos (LPS) sistémicos. Se incluyen específicamente dentro de este grupo todas las enfermedades y afecciones cardiovasculares asociadas con la formación de placas ateroescleróticas, con una aparición, desarrollo o progresión que se puede controlar por la inhibición de la formación de placas ateroescleróticas. El término incluye específicamente enfermedades y afecciones patológicas que se benefician de la inhibición de la formación de placas ateroescleróticas. Las afecciones cardiovasculares incluyen, sin limitación, ateroesclerosis coronaria, microangiopatía coronaria, apoplejía, arteriopatía carotídea, arteriopatía periférica, isquemia, arteriopatía coronaria (CAD), cardiopatía coronaria (CHD), afecciones asociadas con CAD y CHD, enfermedad cerebrovascular y afecciones asociadas con enfermedad cerebrovascular, vasculopatía periférica y afecciones asociadas con vasculopatía periférica, aneurisma, vasculitis, flebotrombosis, diabetes mellitus, síndrome metabólico, insuficiencia renal crónica, lesión tisular remota después de isquemia y reperfusión y circulación extracorporal. Las "afecciones asociadas con enfermedad cerebrovascular" como se usa en el presente documento incluyen, por ejemplo, accidente isquémico transitorio (AIT) y apoplejía. Las "afecciones asociadas con vasculopatía periférica" como se usa en el presente documento incluyen, por ejemplo, claudicación. Se incluyen específicamente dentro de este grupo todas las enfermedades y afecciones cardiovasculares asociadas con una aparición, desarrollo o progresión que se puede controlar por la inhibición de la formación de placas ateroescleróticas.

La formación de placas ateroescleróticas se puede producir como resultado de una respuesta inmunitaria innata a la endotoxemia metabólica, que se caracteriza por niveles elevados de lipopolisacáridos (LPS) sistémicos que se originan en la microbiota intestinal y una pérdida de integridad funcional en la barrera de la mucosa intestinal. La respuesta inmunitaria innata a endotoxemia da como resultado la inflamación crónica de bajo grado que es responsable de la formación de placas.

El término "síndrome metabólico" se usa en el presente documento en el sentido más amplio. El síndrome metabólico incluye la coaparición en un sujeto adulto de varios factores de riesgo metabólicos, incluyendo al menos tres de los siguientes cinco rasgos: obesidad abdominal, que puede ser, por ejemplo, una circunferencia de cintura en hombres mayor que o igual a 90 cm y en mujeres mayor que o igual a 80 cm; triglicéridos séricos elevados, que pueden ser, por ejemplo, mayores que o iguales a 150 mg/dl, o tratamiento farmacológico para triglicéridos elevados; nivel de colesterol HDL sérico reducido, que puede ser, por ejemplo, inferior a 40 mg/dl en hombres e inferior a 50 mg/dl en mujeres, o tratamiento farmacológico para colesterol HDL bajo; hipertensión, que puede ser, por ejemplo, tensión arterial sistólica mayor que 130 mmHg y tensión arterial diastólica mayor que 85 mmHg, o tratamiento farmacológico para hipertensión; y glucosa plasmática en ayunas elevada, que puede ser, por ejemplo, mayor que o igual a 100 mg/dl, tratamiento farmacológico para glucosa elevada o diabetes de tipo 2 previamente diagnosticada.

Para niños de más de 16 años, se pueden usar los criterios anteriores para adultos. Para niños entre 10-16 años, el síndrome metabólico incluye la coaparición en un sujeto de varios factores de riesgo metabólicos, incluyendo al menos tres de los siguientes cinco rasgos: obesidad abdominal, que puede ser, por ejemplo, una circunferencia de cintura mayor que un percentil 90; triglicéridos séricos elevados, que pueden ser, por ejemplo, mayores que o iguales a 110 mg/dl, mayores que un percentil 95 o tratamiento farmacológico para triglicéridos elevados; nivel de colesterol HDL sérico reducido, que puede ser, por ejemplo, inferior a 40 mg/dl, menor que un percentil 5 o tratamiento farmacológico para colesterol HDL bajo; hipertensión, que puede ser, por ejemplo, tensión arterial sistólica mayor que 130 mmHg y tensión arterial diastólica mayor que 85 mmHg, mayor que un percentil 90, o tratamiento farmacológico para hipertensión; y glucosa plasmática en ayunas elevada, que puede ser, por ejemplo, mayor que o igual a 100 mg/dl, intolerancia a la glucosa, tratamiento farmacológico para glucosa elevada o diabetes de tipo 2 previamente diagnosticada.

En términos generales, los factores de riesgo que se producen conjuntamente en el síndrome metabólico incluyen obesidad (tal como obesidad abdominal), hiperglucemia, dislipidemia, resistencia a la insulina y/o hipertensión. Todos estos factores de riesgo promueven el desarrollo de cardiovasculopatía ateroesclerótica, diabetes o ambas. El síndrome metabólico también puede presentar inflamación crónica del tejido adiposo.

El síndrome metabólico se puede reconocer como un estado proinflamatorio, protrombótico y puede estar asociado con niveles elevados de una o más proteínas C reactivas, IL-6, LPS e inhibidor del activador del plasminógeno 1; dichos marcadores pueden estar asociados con un riesgo incrementado de desarrollo posterior de cardiovasculopatía ateroesclerótica, diabetes o ambas.

El síndrome metabólico puede estar asociado con varios trastornos relacionados con la obesidad, incluyendo uno o más de esteatosis hepática con esteatosis, fibrosis y cirrosis, colangiocarcinoma hepatocelular e intrahepático, insuficiencia renal crónica, síndrome del ovario poliquístico, trastornos respiratorios del sueño, incluyendo apnea obstructiva del sueño, e hiperuricemia y gota.

El término "trastorno relacionado con la insulina" engloba enfermedades o afecciones caracterizadas por intolerancia a la glucosa. En un modo de realización, el trastorno relacionado con la insulina es diabetes mellitus incluyendo, sin limitación, diabetes de tipo I (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), tipo II (diabetes mellitus no insulinodependiente o NIDDM), diabetes gestacional y cualquier otro trastorno que se beneficiaría de agentes que estimulan la secreción de insulina. En otro modo de realización, el trastorno relacionado con la insulina se caracteriza por resistencia a la insulina.

El término "sepsis" se usa en su sentido más amplio y puede englobar un estado inflamatorio sistémico provocado por una infección grave. La sepsis puede estar provocada por la respuesta del sistema inmunitario a una infección grave, más comúnmente bacterias, pero también hongos, virus y parásitos en la sangre, vías urinarias, pulmones, la piel u otros tejidos.

El término "endotoxemia aguda" se usa en su sentido más amplio y puede englobar la afección de lipopolisacáridos (LPS) bacterianos en plasma incrementados. La endotoxemia aguda a su vez podría dar como resultado sepsis. LPS incrementados en circulación sistémica inducirán una inflamación crónica de bajo grado, activando la respuesta protectora endógena del huésped para elevar los lípidos plasmáticos que, en la afección crónica, contribuye a obesidad inducida por dieta, resistencia a la insulina y ateroesclerosis, y acontecimientos de CVD definitivos.

El término "enfermedad de injerto contra huésped (EICH)" se refiere a una complicación del alotrasplante de células madre. En la EICH, las células madre hematopoyéticas del donante reconocen al receptor del trasplante como extraño y atacan los tejidos y órganos del paciente, lo que puede afectar a la función del tejido u órgano o provocar que fallen. Como se usa en el presente documento, EICH incluye, por ejemplo, EICH aguda o EICH crónica. Además, los ejemplos no limitantes incluyen EICH intestinal.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado.

Por ejemplo, con respecto a EII, "tratamiento" se puede referir a una disminución en la probabilidad de desarrollo de EII, una disminución en la tasa de desarrollo de EII y una disminución en la gravedad de la enfermedad. Como otro ejemplo, con respecto a la formación de placas ateroescleróticas, "tratamiento" se puede referir a una disminución en la probabilidad de desarrollar depósitos de placas ateroescleróticas, una disminución en la tasa de desarrollo de depósitos, una disminución en el número o tamaño de depósitos existentes, o estabilidad de placa mejorada. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno, así como en los que se va a evitar el trastorno. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, evitar la aparición o recidiva de la enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la enfermedad, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, mejorar o atenuar la enfermedad, y provocar remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, las proteínas de fusión IL-22 Fc divulgadas en el presente documento se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

En determinados modos de realización, un "sujeto que lo necesita" en el contexto de evitar o tratar una afección cardiovascular se refiere a un sujeto diagnosticado con una cardiovasculopatía o afección cardiovascular (CVD) o síndrome metabólico o que presenta una o más afecciones asociadas con CVD o síndrome metabólico, un sujeto al que se le ha diagnosticado o que presentó una o más afecciones asociadas con CVD o síndrome metabólico en el pasado, o un sujeto que se ha considerado en riesgo de desarrollar CVD o síndrome metabólico o una o más afecciones asociadas con CVD o síndrome metabólico en el futuro debido a factores hereditarios o ambientales. Por lo tanto, en determinados modos de realización, un sujeto que lo necesita puede ser un sujeto que presenta una CVD o síndrome metabólico o una afección asociada con una CVD o síndrome metabólico o un sujeto que ha presentado una CVD o síndrome metabólico o una afección asociada con una CVD o síndrome metabólico en el pasado o se ha considerado en riesgo de desarrollar una CVD o síndrome metabólico o una afección asociada con una CVD o síndrome metabólico en el futuro.

En el tratamiento de una enfermedad o afección cardiovascular, un agente terapéutico puede alterar directamente la magnitud de la respuesta de un componente de la respuesta inmunitaria o hacer que la enfermedad sea más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterápicos, etc. En el tratamiento de una enfermedad arterial, el tratamiento, por ejemplo, podría evitar o ralentizar la progresión de una enfermedad. Por tanto, el tratamiento de una arteriopatía incluye específicamente la prevención, inhibición o ralentización del desarrollo de la afección, o de la progresión de una fase de la afección a otra fase más avanzada, o a una afección relacionada más grave.

La "patología" de una enfermedad o afección incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del sujeto. En el caso de una enfermedad o afección cardiovascular, esto incluye, sin limitación, formación de placas ateroescleróticas (incluyendo placas estables o inestables/vulnerables), ateroesclerosis, arteriesclerosis, arterioloesclerosis y exposición elevada a lipopolisacáridos (LPS) sistémicos.

"Alivio", "aliviar" o equivalentes de los mismos, se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en los que el objetivo es mejorar, evitar, ralentizar (reducir), disminuir o inhibir una enfermedad o afección, por ejemplo, la formación de placas ateroescleróticas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen la enfermedad o afección, así como los propensos a tener la enfermedad o afección o en los que se va a evitar la enfermedad o afección.

La administración "crónica" se refiere a la administración de un agente(s) en un modo continuo a diferencia del modo agudo, para mantener el efecto terapéutico inicial durante un período de tiempo prolongado.

La administración "intermitente" es un tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, b La s T-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

A continuación se muestran ejemplos de cómo calcular el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "proteína de comparación" o "proteína de referencia" con la secuencia de aminoácidos denominada "IL-22", en los que "IL-22" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-22 de interés, "proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el que se compara el polipéptido "IL-22" de interés, y "X", "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos aminoacídicos.

^IL-22 X X X X X X X X X X X X X X X ^{(longitud = 15 aminoácidos)}

^{Proteína de referencia} X X X X X Y Y Y Y Y Y Y ^{(longitud = 12 aminoácidos)}

% de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos aminoacídicos idénticamente emparejados entre las dos secuencias polipeptídicas) dividido entre (el número total de residuos aminoacídicos del polipéptido IL-22) = 5 dividido entre 15 = 33,3 %

_IL-22 xxxxxxxxxx _{(longitud = 10 aminoácidos)}

Proteína de referencia

(longitud = 15 aminoácidos)

% de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos aminoacídicos idénticamente emparejados entre las dos secuencias polipeptídicas) dividido entre (el número total de residuos aminoacídicos del polipéptido IL-22) = 5 dividido entre 10 = 50 %

El término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido IL-22. También se engloban por "agonista" las moléculas que estimulan la transcripción o traducción del ARNm que codifica el polipéptido.

Las moléculas agonistas adecuadas incluyen, por ejemplo, anticuerpos agonistas o fragmentos de anticuerpo; un polipéptido natural; fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido natural; péptidos; oligonucleótidos antisentido; pequeñas moléculas orgánicas; y ácidos nucleicos que codifican agonistas de polipéptidos o anticuerpos. La referencia a "un" agonista engloba un solo agonista o una combinación de dos o más diferentes agonistas.

El término "agonista de IL-22" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica cualitativa (como se define anteriormente en el presente documento) de un polipéptido IL-22 de secuencia natural. Los agonistas de IL-22 incluyen específicamente polipéptidos IL-22-Fc o IL-22 Ig (inmunoadhesinas), pero también moléculas pequeñas que imitan al menos una actividad biológica de IL-22. Preferentemente, la actividad biológica es la unión del receptor de IL-22, interactuando con IL-22BP, facilitando una vía de respuesta inmunitaria innata, o en el caso de una enfermedad o afección cardiovascular, para afectar a la formación de placas ateroescleróticas, en particular para inhibir la formación de formación de placas ateroescleróticas. La inhibición de la formación de placas se puede evaluar por cualquier procedimiento de formación de imágenes adecuado conocido por los expertos en la técnica.

IL-22R1 se empareja con otras proteínas para formar heterodímeros como receptores para determinados miembros de la familia IL-10. Véase Ouyang et al., 2011, supra. Por tanto, en determinados aspectos de la divulgación, los agonistas de IL-22 pueden incluir un agonista del receptor de IL-22, que incluye una citocina (o una proteína de fusión o agonista de la misma) que se une a y desencadena la señalización hacia 3' del IL-22R1. En determinados aspectos de la divulgación, los agonistas de IL-22 incluyen un agonista de IL-22R1, incluyendo sin limitación un anticuerpo agonista anti-IL-22R1; un agonista de IL-20, incluyendo sin limitación polipéptido IL-20 o proteína de fusión IL-20 Fc; y un agonista de IL-24, incluyendo sin limitación polipéptido IL-24 o proteína de fusión de IL-24. En determinados otros aspectos de la divulgación, los agonistas de IL-22R1 incluyen un agonista de IL-19 incluyendo sin limitación polipéptido IL-19 o proteína de fusión IL-19 Fc; y un agonista de IL-26, incluyendo sin limitación polipéptido IL-26 o proteína de fusión IL-26 Fc. Las secuencias ejemplares para IL-19 (n.° de acceso GenBank AAG16755.1, SEQ ID NO:77), IL-20 (n.° de acceso GenBank AAH69311.1, SEQ ID NO:78), IL-24 (n.° de acceso GenBank AAH09681.1, SEQ ID NO:79) e IL-26 (n.° de acceso GenBank NP_060872.1, SEQ ID NO:80) se proporcionan en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, un polipéptido IL-19 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:77 o la proteína madura sin el péptido señal. En determinados otros aspectos de la divulgación, un polipéptido IL-20 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:78 o la proteína madura sin el péptido señal. Aún en otros aspectos de la divulgación, un polipéptido IL-24 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:79 o la proteína madura sin el péptido señal. En determinados otros aspectos de la divulgación, un polipéptido IL-26 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:80 o la proteína madura sin el péptido señal.

Una "molécula pequeña" se define en el presente documento por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 600, preferentemente por debajo de aproximadamente 1000 daltons.

Un "anticuerpo agonista", como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido IL-22.

Los términos "formulación farmacéutica" o "composición farmacéutica" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, diluyente, estabilizante o conservante.

El término "tiempo de vida útil" se refiere al período de tiempo que un producto (por ejemplo, una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc)) se puede almacenar sin volverse inadecuado para su uso (por ejemplo, administración a un sujeto) o venta. En algunos modos de realización, el tiempo de vida útil es el período de tiempo en el que una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) es estable. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, una composición en el presente documento tiene un tiempo de vida útil de al menos 36 meses cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz. En algunos aspectos de la divulgación, una composición en el presente documento tiene un tiempo de vida útil de al menos 48 meses cuando se almacena a -20 °C. En algunos aspectos de la divulgación, una composición en el presente documento tiene un tiempo de vida útil de al menos 60 meses cuando se almacena a -20 °C.

Una formulación farmacéutica "estable" es una en la que la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras el almacenamiento. Preferentemente, la formulación conserva esencialmente su estabilidad física y química, así como su actividad biológica tras el almacenamiento. El período de almacenamiento se selecciona en general en base al tiempo de vida útil previsto de la formulación. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas están disponibles en la técnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una cantidad seleccionada de exposición a la luz y/o temperatura durante un período de tiempo seleccionado. La estabilidad se puede evaluar cualitativa y/o cuantitativamente en una variedad de formas diferentes, incluyendo evaluación de la formación de agregados (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo la turbidez y/o por inspección visual); evaluación de la formación de ROS (por ejemplo, usando un ensayo de condiciones extremas ligero o un ensayo de condiciones extremas con diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-amidinopropano)(AAPH)); oxidación de residuos aminoacídicos específicos de la proteína (por ejemplo, un residuo Met de una proteína de fusión IL-22 Fc); evaluar la heterogeneidad de carga por cromatografía de intercambio catiónico, isoelectroenfoque capilar por imagen (iCIEF) o electroforesis de zona capilar; análisis de secuencia aminoterminal o carboxiterminal; análisis espectrométrico de masas; análisis SDS-PAGE para comparar polipéptidos reducidos e intactos (por ejemplo, proteínas de fusión IL-22 Fc); análisis de mapa peptídico (por ejemplo, tríptico o LYS-C); evaluar la actividad biológica o función de unión a diana de la proteína (por ejemplo, unión de una proteína de fusión IL-22 Fc a un receptor de IL-22); y similares. La inestabilidad puede implicar uno o más de: agregación, desamidación (por ejemplo, desamidación de Asn), oxidación (por ejemplo, oxidación de Met y/u oxidación de T rp), isomerización (por ejemplo, isomerización de Asp), recorte/hidrólisis/fragmentación (por ejemplo, fragmentación de región bisagra), formación de succinimida, cisteína(s) desapareada(s), extensión N terminal, procesamiento C terminal, diferencias de glucosilación y similares.

Una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si muestra muy pocos o ningún signo de agregación, precipitación, fragmentación y/o desnaturalización tras examen visual del color y/o claridad, o como se mide por dispersión de luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño.

Una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) todavía conserva su actividad biológica como se define a continuación. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando formas químicamente alteradas de la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc). La alteración química puede implicar la oxidación de proteínas que se puede evaluar usando cartografía de péptidos trípticos, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLc ) de fase inversa y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL/E^m ), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de carga de la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) que se puede evaluar por cromatografía de intercambio iónico o icI^e F, por ejemplo.

Una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) "mantiene su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica de la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) en un momento dado está dentro de aproximadamente un 20 % (tal como dentro de aproximadamente un 10 %) de la actividad biológica presentada en el momento en que se preparó la formulación farmacéutica (dentro de los errores del ensayo), como se determina, por ejemplo, en un ensayo de unión a receptor.

Como se usa en el presente documento, "actividad biológica" de la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) se refiere a la capacidad de la proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) para unirse a su diana, por ejemplo, la capacidad de una proteína de fusión IL-22 Fc para unirse a un receptor de IL-22. Puede incluir además una respuesta biológica que se puede medir in vitro o in vivo. Dicha actividad puede ser antagonista o agonista. En modos de realización particulares, la actividad es agonística (por ejemplo, activación del receptor).

Una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) que es "susceptible a la oxidación" es una que comprende uno o más residuos que se ha descubierto que son propensos a la oxidación tales como, pero sin limitarse a, metionina (Met), cisteína (Cys), histidina (His), triptófano (Trp) y tirosina (Tyr). Por ejemplo, uno o más residuos de metionina en un polipéptido IL-22 pueden ser susceptibles de oxidación.

El término "porcentaje de oxidación" se refiere al porcentaje de proteínas (por ejemplo, proteínas de fusión IL-22 Fc) en una formulación (por ejemplo, una composición farmacéutica) que se oxidan en un residuo aminoacídico particular, por ejemplo, un residuo Met. El porcentaje de oxidación se puede determinar, por ejemplo, por análisis de espectrometría de masas (EM) de uno o más péptidos trípticos, en los que residen uno o más residuos aminoacídicos propensos a la oxidación particulares. El porcentaje de oxidación se puede determinar, por ejemplo, después de una prueba de condiciones extremas con ^a A ^p H, dentro de 9 meses, 12 meses, 18 meses o dos años desde la producción inicial de una proteína (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) o composición farmacéutica de la misma.

El término "como se evalúa por una prueba de condiciones extremas con AAPH", como se usa en el presente documento, quiere decir que el porcentaje de oxidación en un residuo aminoacídico particular (por ejemplo, un residuo Met) se determina por análisis de espectrometría de masas de péptidos trípticos después de formular la proteína (por ejemplo, la proteína de fusión IL-22 Fc) con AAPH (por ejemplo, AAPH aproximadamente 0 mM, AAPH aproximadamente 1 mM, AAPH aproximadamente 3 mM, AAPH aproximadamente 3,5 mM o AAPH aproximadamente 5 mM), por ejemplo, en una formulación de aproximadamente 10 mg/ml de proteína de fusión ⁱL-22 Fc, fosfato de sodio aproximadamente 10 mM, sacarosa aproximadamente 240 mM, polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH aproximadamente 7,1 durante aproximadamente 24 horas a aproximadamente 40 °C. La proteína en condiciones extremas (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) se digiere con tripsina y los péptidos digeridos se someten a CL-EM-EM para determinar el porcentaje de oxidación.

Como se usa en el presente documento, "tampón" se refiere a una solución tamponada que resiste los cambios de pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base (también denominados en el presente documento "agentes tamponadores"). En algunos aspectos de la divulgación, el tampón tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En algunos aspectos de la divulgación, el tampón tiene un pH que es sustancialmente neutro. El tampón tiene preferentemente un pH en el intervalo de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4 (por ejemplo, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3 o aproximadamente 7,4), por ejemplo, aproximadamente pH 7,1. Los agentes tamponadores ejemplares para su uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, un fosfato, un succinato, un acetato, histidina o una combinación de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio tribásico, fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio tribásico o una mezcla de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio monobásico. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio dibásico. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es una mezcla de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico.

El término "sustancialmente neutral", como se usa en el presente documento, se refiere a un intervalo de pH de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7, aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9 o aproximadamente 8,0), como se mide a una temperatura de desde aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C (por ejemplo, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 21 °C, aproximadamente 22 °C, aproximadamente 23 °C, aproximadamente 24 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 26 °C, aproximadamente 27 °C, aproximadamente 28 °C, aproximadamente 29 °C, aproximadamente 30 °C).

Como se usa en el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente activo en superficie, preferentemente un tensioactivo no iónico. Los ejemplos de tensioactivos en el presente documento incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188); TRITON®; octilglucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearilsulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearilsarcosina; linoleil-, miristil- o cetilbetaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropilbetaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropildimetilamina; metilcocoiltaurato de sodio o metiloleiltaurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ); polietilenglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen- y propilenglicol (por ejemplo, copolímeros de bloque tipo PLURONIC®, por ejemplo, PLURONIC® F-68); y similares. En un aspecto de la divulgación, el tensioactivo en el presente documento es polisorbato 20.

Un "conservante" es un compuesto que se puede incluir opcionalmente en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en la misma, facilitando por tanto la producción de una formulación de múltiples usos, por ejemplo. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. En un aspecto de la divulgación, el conservante en el presente documento es alcohol bencílico. En algunos aspectos de la divulgación, la formulación no incluye un conservante.

Dentro de esta solicitud, a menos que se establezca de otro modo, las técnicas utilizadas se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias bien conocidas, tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), y Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente en general se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique de otro modo.

II. Composiciones y procedimientos

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen proteínas de fusión IL-22 Fc y usos de las mismas, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades asociadas a IL-22 tales como EII (por ejemplo, colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn), afecciones cardiovasculares, síndrome metabólico, EIC^h , y para acelerar la cicatrización de heridas (por ejemplo, cicatrización de heridas diabéticas). También se proporcionan en el presente documento procedimientos de preparación de las composiciones.

La invención se basa, al menos en parte, en el presente descubrimiento de que las formulaciones particulares de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento proporcionan propiedades ventajosas, por ejemplo, como se describe en los presentes ejemplos. En determinados aspectos, dichas propiedades ventajosas incluyen una estabilidad incrementada y/o un tiempo de vida útil incrementado de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas actualmente y composiciones que comprenden las proteínas de fusión IL-22 Fc. Además, actualmente se descubre que las proteínas IL-22 Fc descritas en el presente documento tienen inesperadamente una estabilidad térmica mayor a valores de pH mayores, como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 1. Estas y otras propiedades ventajosas de las composiciones actualmente descubiertas se describen con más detalle a continuación.

A. Composiciones farmacéuticas

En el presente documento se proporcionan composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que incluyen proteínas de fusión IL-22 Fc con tiempo de vida útil y estabilidad mejorados. Cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento se puede usar en las composiciones, pero se debe entender que también se pueden usar otras proteínas de fusión Fc (por ejemplo, proteínas de fusión Fc que incluyen otras interleucinas).

Por ejemplo, en un aspecto, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, en la que la composición tiene un tiempo de vida útil de al menos aproximadamente 12 meses (por ejemplo, al menos aproximadamente 12 meses, aproximadamente 18 meses, aproximadamente 24 meses, aproximadamente 30 meses, aproximadamente 36 meses, aproximadamente 42 meses, aproximadamente 48 meses, aproximadamente 54 meses, aproximadamente 60 meses, aproximadamente 66 meses o aproximadamente 72 meses) cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz, y en la que la proteína de fusión IL-22 Fc incluye un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene un tiempo de vida útil de al menos 36 meses cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene un tiempo de vida útil de al menos 42 meses cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene un tiempo de vida útil de al menos 48 meses cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz.

Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el tiempo de vida útil cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz está entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 72 meses (por ejemplo, aproximadamente 1 mes, aproximadamente 5 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 15 meses, aproximadamente 20 meses, aproximadamente 24 meses, aproximadamente 25 meses, aproximadamente 30 meses, aproximadamente 35 meses, aproximadamente 40 meses, aproximadamente 45 meses, aproximadamente 48 meses, aproximadamente 50 meses, aproximadamente 55 meses, aproximadamente 60 meses, aproximadamente 65 meses, aproximadamente 70 meses, o aproximadamente 72 meses). En algunos aspectos de la divulgación, el tiempo de vida útil cuando se almacena a 5 °C ± 3 °C y se protege de la luz está entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 24 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 20 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 18 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 15 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 12 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 9 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 6 meses, aproximadamente 1 mes y aproximadamente 3 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 24 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 20 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 18 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 15 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 12 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 9 meses, aproximadamente 5 meses y aproximadamente 6 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 24 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 20 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 18 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 15 meses, aproximadamente 10 meses y aproximadamente 12 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 24 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 20 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 18 meses, aproximadamente 12 meses y aproximadamente 15 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 24 meses, aproximadamente 18 meses y aproximadamente 20 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 30 meses, aproximadamente 24 meses y aproximadamente 25 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 35 meses, aproximadamente 30 meses y aproximadamente 36 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 36 meses y aproximadamente 40 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 40 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 42 meses y aproximadamente 45 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 46 meses y aproximadamente 48 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 48 meses y aproximadamente 50 meses, aproximadamente 50 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 50 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 50 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 50 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 50 meses y aproximadamente 55 meses, aproximadamente 55 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 55 meses y aproximadamente 70 meses, aproximadamente 55 meses y aproximadamente 65 meses, aproximadamente 55 meses y aproximadamente 60 meses, aproximadamente 60 meses y aproximadamente 72 meses, aproximadamente 60 meses y aproximadamente 70 meses, o aproximadamente 60 meses y aproximadamente 65 meses.

Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) pueden tener cualquier concentración adecuada de la proteína de fusión IL-22 Fc. Por ejemplo, en cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc puede ser de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/ml, aproximadamente 0,05 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, o aproximadamente 30 mg/ml.

Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la concentración de la fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 6 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 7 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 9 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 11 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 12 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 13 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 14 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 25 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 6 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 7 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 9 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 11 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 12 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 13 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 14 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 6 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 7 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 9 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 11 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 12 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 13 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 14 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 9 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml.

En algunos aspectos de la divulgación, la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml. En algunos aspectos, la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 1 mg/ml. En otros aspectos de la divulgación, la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 8 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml. En algunos aspectos, la concentración de la proteína de fusión IL-22 Fc es de aproximadamente 10 mg/ml.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede incluir un estabilizante. Se puede usar cualquier estabilizante adecuado. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el estabilizante es un aminoácido, tiosorbitol, ácido ascórbico, monotioglicerol, una ciclodextrina, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), piridoxina, manitol, un quelante de metales o una combinación de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el estabilizante es un aminoácido. En algunos aspectos de la divulgación, el aminoácido es metionina, cisteína, triptófano o una combinación de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el aminoácido es metionina.

Se puede usar cualquier concentración adecuada del estabilizante. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la concentración del estabilizante (por ejemplo, metionina) es de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 30 mM, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,3 mM, aproximadamente 0,4 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,7 mM, aproximadamente 0,8 mM, aproximadamente 0,9 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, o aproximadamente 30 mM. En algunos aspectos de la divulgación la concentración del estabilizante (por ejemplo, metionina) es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 30 mM de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 30 mM de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 9 mM a aproximadamente 30 mM de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 11 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 12 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 13 mM a aproximadamente

30 mM, de aproximadamente 14 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 30 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 3 mM

aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 5 mM

aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 9 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 11 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 12 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 13 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 14 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 15 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente t 2 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 9 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 11 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 12 mM a aproximadamente

15 mM, de aproximadamente 13 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 14 mM a aproximadamente 15 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 7 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 9 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 5 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del estabilizante (por ejemplo, metionina) es de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 8 mM. En aspectos particulares de la divulgación, la concentración del estabilizante (por ejemplo, metionina) es de aproximadamente 5 mM.

En cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la oxidación de la metionina en la posición M25 o M139 (por ejemplo, en relación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

4) es menor de aproximadamente un 10 % como se evalúa por una prueba de condiciones extremas con AAPH, por ejemplo, menor de aproximadamente un 10 %, aproximadamente un 9 %, aproximadamente un 8 %, aproximadamente un 7 %, aproximadamente un 6 %, aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 1 % o menor. En algunos aspectos de la divulgación, la oxidación de metionina en la posición M25 de SEQ ID NO:4 es menor de un 5 %, menor de un 3 % o menor de un 2 %. En algunos aspectos de la divulgación, la oxidación de metionina en la posición M139 de SEQ ID NO:4 es menor de un 7 %, menor de un 6 % o menor de un 5 %.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede incluir además un tensioactivo. Se puede usar cualquier tensioactivo adecuado. En algunos aspectos de la divulgación, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico (por ejemplo, un polisorbato, un poloxámero, un éter polioxietilenalquílico, un éter polioxietilenfenilalquílico o una combinación de los mismos). En algunos aspectos de la divulgación, el tensioactivo no iónico es un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80). En aspectos particulares, el polisorbato es el polisorbato 20. En otros aspectos de la divulgación, el tensioactivo no iónico es un poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188).

Se puede usar cualquier concentración adecuada del tensioactivo. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la concentración del tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o poloxámero 188) es de aproximadamente un 0,001 % (p/v) a aproximadamente 2 % (p/v), por ejemplo, aproximadamente un 0,001 %, aproximadamente un 0,01 %, aproximadamente un 0,1 %, aproximadamente un 0,2 %, aproximadamente un 0,3 %, aproximadamente un 0,4 %, aproximadamente un 0,5 %, aproximadamente un 0,6 %, aproximadamente un 0,7 %, aproximadamente un 0,8 %, aproximadamente un 0,9 %, aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 1,1 %, aproximadamente un 1,2 %, aproximadamente un 1,3 %, aproximadamente un 1,4 %, aproximadamente un 1,5 %, aproximadamente un 1,6 %, aproximadamente un 1,7 %, aproximadamente un 1,8 %, aproximadamente un 1,9 % o aproximadamente un 2 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o poloxámero 188) es de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a aproximadamente un 0,05 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o poloxámero 188) es de aproximadamente un 0,01 % (p/v) a aproximadamente un 0,07 % (p/v). En aspectos particulares de la divulgación, la concentración del tensioactivo (por ejemplo, polisorbato 20 o poloxámero 188) es de aproximadamente un 0,02 % (p/v).

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede incluir además un agente tamponador. Se puede usar cualquier agente tamponador adecuado. En algunos aspectos de la divulgación, el agente tamponador es un fosfato, un succinato, un acetato, histidina o una combinación de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio tribásico, fosfato de potasio monobásico, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio tribásico o una mezcla de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio monobásico. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es fosfato de sodio dibásico. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato es una mezcla de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico.

Se puede usar cualquier concentración adecuada del agente tamponador. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la concentración del agente amortiguador (por ejemplo, fosfato de sodio) es de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 50 mM, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,3 mM, aproximadamente 0,4 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 0,6 mM, aproximadamente 0,7 mM, aproximadamente 0,8 mM, aproximadamente 0,9 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 mM, aproximadamente 32 mM, aproximadamente 33 mM, aproximadamente 34 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 37 mM, aproximadamente 38 mM, aproximadamente 39 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 41 mM, aproximadamente 42 mM, aproximadamente 43 mM, aproximadamente 44 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 46 mM, aproximadamente 47 mM, aproximadamente 48 mM, aproximadamente 49 mM, o aproximadamente 50 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del agente tamponador (por ejemplo, fosfato de sodio) es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del agente tamponador (por ejemplo, fosfato de sodio) es de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 12 mM. En aspectos particulares de la divulgación, la concentración del agente tamponador (por ejemplo, fosfato de sodio) es de aproximadamente 10 mM.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede incluir además un agente de tonicidad. Se puede usar cualquier agente de tonicidad adecuado. En algunos aspectos de la divulgación, el agente de tonicidad es un glúcido (por ejemplo, sacarosa, glucosa, glicerol o trehalosa), un aminoácido o una sal (por ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio). En aspectos particulares de la divulgación, el agente de tonicidad es sacarosa.

Se puede usar cualquier concentración adecuada del agente de tonicidad. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la concentración del agente de tonicidad (por ejemplo, sacarosa) es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1 M, por ejemplo, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 mM, aproximadamente 32 mM, aproximadamente 33 mM, aproximadamente 34 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 37 mM, aproximadamente 38 mM, aproximadamente 39 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 41 mM, aproximadamente 42 mM, aproximadamente 43 mM, aproximadamente 44 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 46 mM, aproximadamente 47 mM, aproximadamente 48 mM, aproximadamente 49 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM, aproximadamente 110 mM, aproximadamente 120 mM, aproximadamente 130 mM, aproximadamente 140 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 160 mM, aproximadamente t 170 mM, aproximadamente 180 mM, aproximadamente 190 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 210 mM, aproximadamente 220 mM, aproximadamente 230 mM, aproximadamente 240 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 260 mM, aproximadamente 270 mM, aproximadamente 280 mM, aproximadamente 290 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 310 mM, aproximadamente 320 mM, aproximadamente 330 mM, aproximadamente 340 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 360 mM, aproximadamente 370 mM, aproximadamente 380 mM, aproximadamente 390 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 410 mM, aproximadamente 420 mM, aproximadamente 430 mM, aproximadamente 440 mM, aproximadamente 450 mM, aproximadamente 460 mM, aproximadamente 470 mM, aproximadamente 480 mM, aproximadamente 490 mM, aproximadamente 500 mM, aproximadamente 510 mM, aproximadamente 520 mM, aproximadamente 530 mM, aproximadamente 540 mM, aproximadamente 550 mM, aproximadamente 560 mM, aproximadamente 570 mM, aproximadamente 580 mM, aproximadamente 590 mM, aproximadamente 600 mM, aproximadamente 700 mM, aproximadamente 800 mM, aproximadamente 900 mM o aproximadamente 1 M. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del agente de tonicidad es de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del agente de tonicidad es de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 300 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración del agente de tonicidad es de aproximadamente 240 mM.

Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en el presente documento pueden tener cualquier pH adecuado. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el pH de la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, por ejemplo, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,15, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5 o aproximadamente 9. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el pH es de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,6, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,5, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,4, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,3, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,2, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,1, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 6,6, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 6,7, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 6,8, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 6,9, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 6,9 a aproximadamente 7,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,9, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,7, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,6, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,1, de aproximadamente 7,01 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,02 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,03 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,04 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,05 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,06 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,07 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,08 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,09 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,2, de aproximadamente 7,01 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,02 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,03 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,04 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,05 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,06 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,07 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,08 a aproximadamente 7,15, de aproximadamente 7,09 a aproximadamente 7,15, o de aproximadamente 7,1 a aproximadamente 7,15.

Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el pH es sustancialmente neutro. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el pH es de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 8 (por ejemplo, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,15, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0). En algunos aspectos de la divulgación, el pH es de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4 (por ejemplo, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,85, aproximadamente 6,9, aproximadamente 6,95, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,05, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,15, aproximadamente 7,2, aproximadamente 7,25, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,35 o aproximadamente 7,4). En aspectos particulares de la divulgación, el pH es de aproximadamente 7,1.

Por ejemplo, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, incluyendo la proteína de fusión IL-22 Fc un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector, en la que la composición farmacéutica incluye una concentración final de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc (por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/ml, aproximadamente 0,05 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 2 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 7 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, aproximadamente 9 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 11 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 13 mg/ml, aproximadamente 14 mg/ml, aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, aproximadamente 17 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 19 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 22 mg/ml, aproximadamente 23 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 26 mg/ml, aproximadamente 27 mg/ml, aproximadamente 28 mg/ml, aproximadamente 29 mg/ml, o aproximadamente 30 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc), aproximadamente metionina 5 mM y polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1. En algunos aspectos de la divulgación, la composición (por ejemplo, la composición farmacéutica) incluye fosfato de sodio aproximadamente 10 mM y sacarosa aproximadamente 240 mM. En algunos aspectos de la divulgación, la composición (por ejemplo, la composición farmacéutica) incluye aproximadamente 1 mg/ml de la proteína de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, la composición (por ejemplo, la composición farmacéutica) incluye aproximadamente 10 mg/ml de la proteína de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, el fosfato de sodio es una mezcla de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico.

Cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento puede estar en una forma de dosificación unitaria. En algunos aspectos de la divulgación, la forma de dosificación unitaria es una formulación líquida para infusión. En algunos aspectos de la divulgación, la forma de dosificación unitaria es una formulación líquida para inyección. En algunos aspectos de la divulgación, la formulación líquida (por ejemplo, para infusión o inyección) se suministra en un recipiente con un volumen nominal de menos de aproximadamente 100 ml, por ejemplo, menos de aproximadamente 100 ml, menos de aproximadamente 90 ml, menos de aproximadamente 80 ml, menos de aproximadamente 70 ml, menos de aproximadamente 60 ml, menos de aproximadamente 50 ml, menos de aproximadamente 40 ml, menos de aproximadamente 30 ml, menos de aproximadamente 20 ml, menos de aproximadamente 10 ml o menos de aproximadamente 5 ml. En algunos aspectos de la divulgación, el volumen de la formulación líquida (por ejemplo, para infusión o inyección) está entre de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 2 ml, por ejemplo, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 1,1 ml, aproximadamente 1,2 ml, aproximadamente 1,3 ml, aproximadamente 1,4 ml, aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 1,6 ml, aproximadamente 1,7 ml, aproximadamente 1,8 ml, aproximadamente 1,9 ml o aproximadamente 2 ml. En algunos aspectos de la divulgación, el volumen de la formulación líquida (por ejemplo, para infusión o inyección) es de aproximadamente 1 ml.

En aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento, el número de partículas > 10 |jm presentes en el recipiente no excede de aproximadamente 10.000 partículas. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el número de partículas > 10 jm presentes en el recipiente no excede de aproximadamente 10.000 partículas, aproximadamente 9.000 partículas, aproximadamente 7.000 partículas, aproximadamente 6.000 partículas, aproximadamente 5.000 partículas, aproximadamente 4.000 partículas, aproximadamente 3.000 aproximadamente 2000 partículas, aproximadamente 1000 partículas, aproximadamente 900 partículas, aproximadamente 800 partículas, aproximadamente 700 partículas, aproximadamente 600 partículas, aproximadamente 500 partículas, aproximadamente 400 partículas, aproximadamente 300 partículas, aproximadamente 200 partículas o aproximadamente 100 partículas. En algunos aspectos de la divulgación, el número de partículas > 10 jm presentes en el recipiente no excede de 6000 partículas.

En aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento, el número de partículas > 25 jm presentes en el recipiente no excede de aproximadamente 2000 partículas, por ejemplo, aproximadamente 2000 partículas, aproximadamente 1500 partículas, aproximadamente 1200 partículas, aproximadamente 1.000 partículas, aproximadamente 900 partículas, aproximadamente 800 partículas, aproximadamente 700 partículas, aproximadamente 600 partículas, aproximadamente 500 partículas, aproximadamente 400 partículas, aproximadamente 300 partículas, aproximadamente 200 partículas o aproximadamente 100 partículas. En algunos aspectos de la divulgación, el número de partículas > 25 jm presentes en el recipiente no excede de 600 partículas.

Se puede usar cualquier vehículo adecuado en cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, el vehículo es agua.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede ser estable a través de uno o más ciclos de congelación-descongelación, por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más ciclos de congelacióndescongelación. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante tres ciclos de congelación-descongelación.

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) es estable durante de aproximadamente 1 mes o más a aproximadamente 5 °C, por ejemplo, aproximadamente 1 mes o más, aproximadamente 2 meses o más, aproximadamente 3 meses o más, aproximadamente 4 meses o más, aproximadamente 5 meses o más, aproximadamente 6 meses o más, aproximadamente 7 meses o más, aproximadamente 8 meses o más, aproximadamente 9 meses o más, aproximadamente 10 meses o más, aproximadamente 11 meses o más, aproximadamente 12 meses o más, aproximadamente 14 meses o más, aproximadamente 16 meses o más, aproximadamente 18 meses o más, aproximadamente 20 meses o más, aproximadamente 22 meses o más, aproximadamente 24 meses o más, aproximadamente 26 meses o más, aproximadamente 28 meses o más, aproximadamente 30 meses o más, aproximadamente 32 meses o más, aproximadamente 34 meses o más, aproximadamente 36 meses o más, aproximadamente 38 meses o más, aproximadamente 40 meses o más, aproximadamente 42 meses o más, aproximadamente 44 meses o más más, aproximadamente 46 meses o más, aproximadamente 48 meses o más, aproximadamente 50 meses o más, aproximadamente 52 meses s o más, aproximadamente 54 meses o más, aproximadamente 56 meses o más, aproximadamente 58 meses o más, aproximadamente 60 meses o más, aproximadamente 62 meses o más, aproximadamente 64 meses o más, aproximadamente 66 meses o más, aproximadamente 68 meses o más más, aproximadamente 70 meses o más, aproximadamente 72 meses o más, aproximadamente 74 meses o más, aproximadamente 76 meses o más, aproximadamente 78 meses o más, aproximadamente 80 meses o más, aproximadamente 82 meses o más, aproximadamente 84 meses o más, aproximadamente 86 meses o más, aproximadamente 88 meses o más, aproximadamente 90 meses o más, aproximadamente 92 meses o más, aproximadamente 94 meses o más, aproximadamente 96 meses o más, aproximadamente 98 meses o más, o aproximadamente 100 meses o más. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 24 meses o más a 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 36 meses o más a 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 42 meses o más a 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 48 meses o más a 5 °C.

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) es estable durante aproximadamente 1 semana o más a aproximadamente 25 °C, por ejemplo, aproximadamente 1 semana o más, aproximadamente 2 semanas o más, aproximadamente 3 semanas o más, aproximadamente 4 semanas o más, aproximadamente 5 semanas o más, aproximadamente 6 semanas o más, aproximadamente 7 semanas o más, aproximadamente 8 semanas o más, aproximadamente 9 semanas o más, aproximadamente 10 semanas o más, aproximadamente 12 semanas o más, aproximadamente 14 semanas o más, aproximadamente 16 semanas o más, aproximadamente 18 semanas o más, aproximadamente 20 semanas o más, aproximadamente 22 semanas o más, aproximadamente 24 semanas o más, aproximadamente 26 semanas o más, aproximadamente 28 semanas o más, aproximadamente 30 semanas o más, aproximadamente 32 semanas o más, aproximadamente 34 semanas o más, aproximadamente 36 semanas o más, aproximadamente 38 semanas o más, aproximadamente 40 semanas o más, aproximadamente 42 semanas o más, aproximadamente 44 semanas o más, aproximadamente 46 semanas o más más, aproximadamente 48 semanas o más, aproximadamente 50 semanas o más, o aproximadamente 52 semanas o más. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 2 semanas o más a aproximadamente 25 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 4 semanas o más a aproximadamente 25 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 8 semanas o más a aproximadamente 25 °C.

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) es estable durante aproximadamente 12 meses o más a aproximadamente -20 °C, por ejemplo, aproximadamente 12 meses o más, aproximadamente 14 meses o más, aproximadamente 16 meses o más aproximadamente 18 meses o más, aproximadamente 20 meses o más, aproximadamente 22 meses o más aproximadamente 24 meses o más, aproximadamente 26 meses o más, aproximadamente 28 meses o más aproximadamente 30 meses o más, aproximadamente 32 meses o más, aproximadamente 34 meses o más aproximadamente 36 meses o más, aproximadamente 38 meses o más, aproximadamente 40 meses o más aproximadamente 42 meses o más, aproximadamente 44 meses o más, aproximadamente 46 meses o más aproximadamente 48 meses o más, aproximadamente 50 meses o más, aproximadamente 52 meses o más aproximadamente 54 meses o más, aproximadamente 56 meses o más, aproximadamente 58 meses o más aproximadamente 60 meses o más, aproximadamente 62 meses o más, aproximadamente 64 meses o más aproximadamente 66 meses o más, aproximadamente 68 meses o más, aproximadamente 70 meses o más aproximadamente 72 meses o más, aproximadamente 74 meses o más, aproximadamente 76 meses o más aproximadamente 78 meses o más, aproximadamente 80 meses o más, aproximadamente 82 meses o más aproximadamente 84 meses o más, aproximadamente 86 meses o más, aproximadamente 88 meses o más aproximadamente 90 meses o más, aproximadamente 92 meses o más, aproximadamente 94 meses o más aproximadamente 96 meses o más, aproximadamente 98 meses o más, o aproximadamente 100 meses o más En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 48 meses o más a -20 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 60 meses o más a -20 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 72 meses o más a -20 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 84 meses o más a -20 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 96 meses o más a -20 °C.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede tener una pureza de aproximadamente un 70 % o mayor, por ejemplo, como se evalúa por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC). Por ejemplo, la composición (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede tener una pureza de aproximadamente un 70 % o mayor, aproximadamente un 72 % o mayor, aproximadamente un 74 % o mayor, aproximadamente un 76 % o mayor, aproximadamente un 78 % o mayor, aproximadamente un 80 % o mayor, aproximadamente un 82 % o mayor, aproximadamente un 84 % o mayor, aproximadamente un 86 % o mayor, aproximadamente un 88 % o mayor, aproximadamente un 90 % o mayor, aproximadamente un 91 % o mayor, aproximadamente un 92 % o mayor, aproximadamente un 94 % o mayor, aproximadamente un 95 % o mayor, aproximadamente un 96 % o mayor, aproximadamente un 97 % o mayor, aproximadamente un 98 % o mayor, aproximadamente un 99 % o mayor, o aproximadamente un 100 %, como se evalúa por SE-HPLC. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 90 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede tener una pureza de aproximadamente un 70 % o mayor (por ejemplo, aproximadamente un 70 % o mayor, aproximadamente un 72 % o mayor, aproximadamente un 74 % o mayor, aproximadamente un 76 % o mayor, aproximadamente un 78 % o mayor, aproximadamente un 80 % o mayor, aproximadamente un 82 % o mayor, aproximadamente un 84 % o mayor, aproximadamente un 86 % o mayor, aproximadamente un 88 % o mayor, aproximadamente un 90 % o mayor, aproximadamente un 91 % o mayor, aproximadamente un 92 % o mayor, aproximadamente un 94 % o mayor, aproximadamente un 95 % o mayor, aproximadamente un 96 % o mayor, aproximadamente un 97 % o mayor, aproximadamente un 98 % o mayor, aproximadamente un 99 % o mayor, o aproximadamente un 100 %) como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 6 meses o más a aproximadamente 5 °C, por ejemplo, aproximadamente 6 meses o más, aproximadamente 7 meses o más, aproximadamente 8 meses o más, aproximadamente 9 meses o más, aproximadamente 10 meses o más, aproximadamente 11 meses o más, aproximadamente 12 meses o más, aproximadamente 14 meses o más, aproximadamente 16 meses o más, aproximadamente 18 meses o más, aproximadamente 20 meses o más, aproximadamente 22 meses o más, aproximadamente 24 meses o más, aproximadamente 26 meses o más, aproximadamente 28 meses o más, un aproximadamente 30 meses o más, aproximadamente 32 meses o más, aproximadamente 34 meses o más, aproximadamente 36 meses o más, aproximadamente 38 meses o más, aproximadamente 40 meses o más, aproximadamente 42 meses o más, aproximadamente 44 meses o más, aproximadamente 46 aproximadamente 48 meses o más, aproximadamente 50 meses o más, aproximadamente 52 meses o más, aproximadamente 54 meses o más, aproximadamente 56 meses o más, aproximadamente 58 meses o más, aproximadamente 60 meses o más, aproximadamente 62 meses o más más, aproximadamente 64 meses o más, aproximadamente 66 meses o más, aproximadamente 68 meses o más, aproximadamente 70 meses o más, aproximadamente 72 meses o más, aproximadamente 74 meses o más, aproximadamente 76 meses o más, aproximadamente 78 meses o más, aproximadamente 80 meses o más, aproximadamente 82 meses o más, aproximadamente 84 meses o más, aproximadamente 86 meses o más, aproximadamente 88 meses o más, aproximadamente 90 meses o más, aproximadamente 92 meses o más, aproximadamente 94 meses o más, aproximadamente 96 meses o más, aproximadamente 98 meses o más, o aproximadamente 100 meses o más. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 36 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 42 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 95 % o mayor como se evalúa por SE-HPLC durante aproximadamente 48 meses o más a aproximadamente 5 °C.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede tener una pureza de aproximadamente un 65 % o mayor, por ejemplo, como se evalúa por electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio sin tamizado de gel (CE-SDS-NGS), por ejemplo, CE-SDS-NGS NR. Por ejemplo, la composición (por ejemplo, la composición farmacéutica) puede tener una pureza de aproximadamente un 65 % o mayor, aproximadamente un 66 % o mayor, aproximadamente un 67 % o mayor, aproximadamente un 68 % o mayor, aproximadamente un 69 % o mayor, aproximadamente un 70 % o mayor, aproximadamente un 72 % o mayor, aproximadamente un 74 % o mayor, aproximadamente un 76 % o mayor, aproximadamente un 78 % o mayor, aproximadamente un 80 % o mayor, aproximadamente un 82 % o mayor, aproximadamente un 84 % o mayor, aproximadamente un 86 % o mayor, aproximadamente un 88 % o mayor, aproximadamente un 90 % o mayor, aproximadamente un 91 % o mayor, aproximadamente un 92 % o mayor, aproximadamente un 94 % o mayor, aproximadamente un 95 % o mayor, aproximadamente un 96 % o mayor, aproximadamente un 97 % o mayor, aproximadamente un 98 % o mayor, aproximadamente 99 % o mayor, o aproximadamente 100 %, como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 75 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS N^r ). En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 80 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 90 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR). En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 55 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR).

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede tener una pureza de aproximadamente un 65 % o mayor (por ejemplo, aproximadamente un 65 % o mayor, aproximadamente un 66 % o mayor, aproximadamente un 67 % o mayor, aproximadamente un 68 % o mayor, aproximadamente un 69 % o mayor, aproximadamente un 70 % o mayor, aproximadamente un 72 % o mayor, aproximadamente un 74 % o mayor, aproximadamente un 76 % o mayor, aproximadamente un 78 % o mayor, aproximadamente un 80 % o mayor, aproximadamente un 82 % o mayor, aproximadamente un 84 % o mayor, aproximadamente un 86 % o mayor, aproximadamente un 88 % o mayor, aproximadamente un 90 % o mayor, aproximadamente un 91 % o mayor, aproximadamente un 92 % o mayor, aproximadamente un 94 % o mayor, aproximadamente un 95 % o mayor, aproximadamente un 96 % o mayor, aproximadamente un 97 % o mayor, aproximadamente un 98 % o mayor, aproximadamente un 99 % o mayor, o aproximadamente un 100 %) como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR) durante aproximadamente 6 meses o más a aproximadamente 5 °C, por ejemplo, aproximadamente 6 meses o más, aproximadamente 7 meses o más, aproximadamente 8 meses o más, aproximadamente 9 meses o más, aproximadamente 10 meses o más, aproximadamente 11 meses o más, aproximadamente 12 meses o más, aproximadamente 14 meses o más, aproximadamente 16 meses o más, aproximadamente 18 meses o más, aproximadamente 20 meses o más, aproximadamente 22 meses o más, aproximadamente 24 meses o más, aproximadamente 26 meses o más, aproximadamente 28 meses o más, aproximadamente 30 meses o más, aproximadamente 32 meses o más, aproximadamente 34 meses o más, aproximadamente 36 meses o más más, aproximadamente 38 meses o más, aproximadamente 40 meses o más, aproximadamente 42 meses o más, aproximadamente 44 meses o más, aproximadamente 46 meses o más, aproximadamente 48 meses o más, aproximadamente 50 meses o más, aproximadamente 52 meses o más, aproximadamente 54 meses o más, aproximadamente 56 meses o más, aproximadamente 58 meses o más, aproximadamente 60 meses o más, aproximadamente 62 meses o más, aproximadamente 64 meses o más, aproximadamente 66 meses o más, aproximadamente 68 meses o más, aproximadamente 70 aproximadamente 72 meses o más, aproximadamente 74 meses o más, aproximadamente 76 meses o más, aproximadamente 78 meses o más, aproximadamente 80 meses o más, aproximadamente 82 meses o más, aproximadamente 84 meses o más, aproximadamente 86 meses o más más, aproximadamente 88 meses o más, aproximadamente 90 meses o más, aproximadamente 92 meses o más, aproximadamente 94 meses o más, aproximadamente 96 meses o más, aproximadamente 98 meses o más, o aproximadamente 100 meses o más. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR) durante aproximadamente 36 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR) durante aproximadamente 42 meses o más a aproximadamente 5 °C. En algunos aspectos de la divulgación, la composición tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por CE-SDS-NGS (por ejemplo, CE-SDS-NGS NR) durante aproximadamente 48 meses o más a aproximadamente 5 °C.

Cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) se puede formular para su administración por cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o tópica. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para administración subcutánea.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) puede incluir un conservante. En otros aspectos de la divulgación, ninguna de las composiciones precedentes no contiene ningún conservante.

Cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) se puede formular para su administración (por ejemplo, por infusión o inyección) después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio y/o un diluyente. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con un diluyente. En algunos aspectos de la divulgación, la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio y un diluyente. Por ejemplo, en algunos aspectos de la divulgación, una proteína de fusión IL-22 Fc se administra a un sujeto infundiendo una proteína de fusión IL-22 Fc que se diluye solo con diluyente (por ejemplo, en una bomba de jeringa). En otros aspectos de la divulgación, una proteína de fusión IL-22 Fc se administra a un sujeto por infusión de proteína de fusión IL-22 Fc que se diluye con diluyente y solución salina (por ejemplo, en una bolsa i.v.). En algunos aspectos de la divulgación, se administra una proteína de fusión IL-22 Fc a un sujeto infundiendo una proteína de fusión IL-22 Fc que se diluye directamente en solución salina (por ejemplo, solución salina isotónica). En algunos aspectos de la divulgación, la solución isotónica de cloruro de sodio incluye NaCl de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 5 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, la solución isotónica de cloruro de sodio incluye NaCl de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, la solución isotónica de cloruro de sodio incluye NaCl de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,5 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, la solución isotónica de cloruro de sodio incluye NaCl de aproximadamente un 0,9 % (p/v). En algunos aspectos de la divulgación, el diluyente incluye un agente tamponador, un agente de tonicidad y/o un tensioactivo. Cualquiera de los agentes tamponadores, agentes de tonicidad y/o tensioactivos descritos en el presente documento, y en cualquier concentración descrita en el presente documento, se puede usar en el diluyente. En algunos aspectos de la divulgación, el diluyente incluye una concentración final de fosfato de sodio aproximadamente 10 mM, sacarosa aproximadamente 240 mM, polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

En algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la región Fc de la proteína de fusión IL-22 Fc no está glucosilada. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es Gly. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es Ala. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 299 como en el índice EU de la región Fc es Ala, Gly o Val. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG4.

En algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la proteína de fusión ⁱL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, y SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ⁱD NO:8, SEQ ID NQ:10 o SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:10. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc no está N-glucosilada.

En cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la proteína de fusión IL-22 Fc puede ser una proteína de fusión IL-22 Fc dimérica. En otros aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc puede ser una proteína de fusión IL-22 Fc monomérica.

En cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la proteína de fusión IL-22 Fc puede incluir un polipéptido IL-22 humano. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

Se puede usar cualquier conector adecuado en las proteínas de fusión IL-22 Fc contenidas en las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en el presente documento. En algunos aspectos de la divulgación, el conector comprende la secuencia de aminoácidos RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44). En algunos aspectos de la divulgación, el conector consiste en la secuencia de aminoácidos RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44).

En cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), la proteína de fusión IL-22 Fc se puede unir al receptor de IL-22. En algunos aspectos de la divulgación, el receptor de IL-22 es un receptor de IL-22 humano. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc se une a IL-22R1 y/o IL-10R2. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc se une a IL-22R1. En algunos aspectos de la divulgación, el receptor de IL-22 humano comprende un heterodímero que consta de un polipéptido IL-22R1 y un polipéptido IL-10R2. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido IL-22R1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:82 y el polipéptido IL-10R2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:84.

Como ejemplo, se proporciona una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo (por ejemplo, agua), incluyendo la proteína de fusión IL-22 Fc la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:16, en la que la composición farmacéutica incluye una concentración final de metionina aproximadamente 5 mM, fosfato de sodio aproximadamente 10 mM, sacarosa aproximadamente 240 mM y polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

En algunos aspectos de la divulgación, las proteínas de fusión IL-22 Fc contenidas en cualquiera de las composiciones precedentes (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) se producen por el procedimiento que comprende el paso de cultivar una célula huésped que puede expresar la proteína de fusión IL-22 Fc en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, el procedimiento comprende además la etapa de obtener la proteína de fusión IL-22 Fc del cultivo celular o medio de cultivo. En algunos aspectos de la divulgación, la célula huésped es una célula CHO.

Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión IL-22 Fc) en el presente documento se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. En un aspecto de la divulgación, la composición se puede usar para incrementar la duración de la supervivencia de un sujeto humano susceptible o diagnosticado con la enfermedad o afección. El periodo de supervivencia se define como el tiempo desde la primera administración del fármaco hasta la muerte. En un aspecto de la divulgación, la composición se puede usar para reducir uno o más síntomas de un sujeto humano susceptible de o diagnosticado con la enfermedad o afección, por ejemplo, cualquier trastorno descrito en el presente documento (por ejemplo, EII, por ejemplo, CU o enfermedad de Crohn).

Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar usando procedimientos estándar conocidos en la técnica mezclando el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos opcionales farmacéuticamente aceptables (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980) y Remington's Pharmaceutical Sciences 20.a edición, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones de patente de e E. UU. n.os 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Opcionalmente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferentemente cloruro de sodio, y preferentemente en concentraciones aproximadamente fisiológicas.

Opcionalmente, las formulaciones como se divulga en el presente documento pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos de la divulgación, la concentración de conservante varía de un 0,1 a un 2,0 %, típicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en las técnicas farmacéuticas. Alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparabeno, cloruro de benzalconio y propilparabeno son conservantes preferentes. Opcionalmente, las formulaciones como se divulga en el presente documento pueden incluir un tensioactivo farmacéuticamente aceptable en una concentración de un 0,005 a un 0,02 %.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

Se describen formulaciones liofilizadas ejemplares en la patente de EE. UU. n.° 6.267.958. Las formulaciones acuosas incluyen las descritas en la patente de EE. UU. n.° 6.171.586 y documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón acetato-histidina.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un esteroide, antagonista de TNF u otros agentes terapéuticos antiinflamatorios. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

Una composición farmacéutica para administración tópica se puede formular, por ejemplo, en forma de gel tópico. Véanse, por ejemplo, los documentos US 4.717.717; US 5.130.298; US 5.427.778; US 5.457.093; US 5.705.485; US 6.331.309; y WO 2006/138.468. En determinados aspectos de la divulgación, la composición se puede formular en presencia de derivados de celulosa. En determinados otros aspectos de la divulgación, la formulación tópica se puede reconstituir a partir de la formulación liofilizada con suficiente tampón o diluyente antes de la administración. En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido IL-22 o la proteína de fusión IL-22 Fc se formulan para administración tópica a un sujeto que tiene un defecto en la cicatrización de heridas epiteliales. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la cicatrización de heridas epiteliales se produce en la piel. En determinados otros aspectos particulares de la divulgación, el sujeto es un ser humano que tiene un defecto en la cicatrización de heridas. En determinados otros aspectos de la divulgación, la formulación tópica que comprende una proteína de fusión IL-22 Fc de la invención se puede usar para mejorar la cicatrización de heridas después de incisiones quirúrgicas internas o externas.

En un aspecto de la divulgación, un polipéptido IL-22 o una proteína de fusión IL-22 Fc para su uso en la aceleración, promoción o mejora de la cicatrización de heridas está en una formulación de un gel tópico, por ejemplo, en una jeringa o recipiente precargado, o de forma alternativa, el compuesto de la invención se puede mezclar con una matriz de gel justo antes de la administración tópica a un paciente. En determinados aspectos de la divulgación, también se administra por vía tópica un agente terapéutico adicional, de forma simultánea o bien secuencial. También se pueden usar opcionalmente otras vías de administración, por ejemplo, administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo pero sin limitarse a, administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea.

Típicamente, para la cicatrización de heridas, se formula una proteína de fusión IL-22 Fc para suministro en sitio específico. Cuando se aplica por vía tópica, la proteína de fusión IL-22 Fc se combina adecuadamente con otros ingredientes, tales como vehículos y/o adyuvantes. No existen limitaciones sobre la naturaleza de dichos otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables y eficaces para su administración prevista, y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen pomadas, cremas, geles, aerosoles o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Las composiciones también se pueden impregnar en apósitos estériles, parches transdérmicos, emplastos y vendajes, opcionalmente en forma líquida o semilíquida. También se pueden usar matrices de colágeno/celulosa regenerada oxidada, por ejemplo, PROMOGRAN Matrix Wound Dressing o PROMOGRAN PRISMA MATRIX.

Para obtener una formulación en gel, el polipéptido IL-22 o proteína de fusión IL-22 Fc formulada en una composición líquida se puede mezclar con una cantidad eficaz de un polisacárido o polímero sintético soluble en agua para formar un gel (por ejemplo, un agente gelificante) tal como polietilenglicol para formar una formulación de la viscosidad apropiada para aplicarse por vía tópica. El polisacárido o agente gelificante que se puede usar incluye, por ejemplo, derivados de celulosa tales como derivados de celulosa eterificada, incluyendo alquilcelulosas, hidroxialquilcelulosas y alquilhidroxialquilcelulosas, por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa e hidroxipropilcelulosa; carboximetilcelulosa de sodio; polímeros de bloque POE-POP: poloxámero USP en diversos grados; ácido hialurónico; poli(ácido acrílico) tal como carbopol 940; almidón y almidón fraccionado; agar; ácido algínico y alginatos; goma arábiga; pululano; agarosa; carragenina; dextranos; dextrina; fructanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanos; glucógenos; glucanos; y biopolímeros sintéticos; así como gomas tales como goma xantana; goma de guar; goma de algarrobo; goma arábiga; goma de tragacanto; y goma karaya; y derivados, combinaciones y mezclas de los mismos. En un aspecto de la divulgación, el agente gelificante en el presente documento es, por ejemplo, inerte para sistemas biológicos, no tóxico, fácil de preparar y/o no demasiado líquido o viscoso, y no desestabilizará el polipéptido IL-22 o la fusión IL-22 Fc contenida en su interior.

En determinados aspectos de la divulgación, el polisacárido es un derivado de celulosa eterificado, en otro modo de realización uno que está bien definido, purificado y enumerado en la USP, por ejemplo, metilcelulosa y los derivados de hidroxialquilcelulosa, tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa (todos denominados agentes celulósicos). En algunos aspectos de la divulgación, el polisacárido es hidroxietilmetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa.

El polietilenglicol útil para la gelificación es típicamente una mezcla de polietilenglicoles de bajo y alto peso molecular para obtener la viscosidad apropiada. Por ejemplo, una mezcla de polietilenglicol de peso molecular 400­ 600 con uno de peso molecular 1500 sería eficaz para este propósito cuando se mezclan en la proporción apropiada para obtener una pasta.

El término "soluble en agua" como se aplica a los polisacáridos y polietilenglicoles pretende incluir soluciones y dispersiones coloidales. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por el grado de sustitución de los grupos éter, y los derivados estabilizantes útiles en el presente documento deben tener una cantidad suficiente de dichos grupos éter por unidad de anhidroglucosa en la cadena de celulosa para hacer que los derivados sean solubles en agua. Un grado de sustitución de éter de al menos 0,35 grupos éter por unidad de anhidroglucosa en general es suficiente. Adicionalmente, los derivados de celulosa pueden estar en forma de sales de metales alcalinos, por ejemplo, las sales de Li, Na, K o Cs.

En determinados aspectos de la divulgación, se emplea metilcelulosa en el gel, por ejemplo, comprende aproximadamente un 1-5 %, o aproximadamente un 1 %, aproximadamente un 2 %, aproximadamente un 3 %, aproximadamente un 4 % o aproximadamente un 5 %, del gel y la proteína de fusión IL-22 Fc está presente en una cantidad de aproximadamente 50-2000 |jg, 100-2000 |jg o 100-1000 |jg por ml de gel. En determinados aspectos de la divulgación, la cantidad eficaz de proteína de fusión IL-22 Fc para cicatrización de heridas por administración tópica puede ser de aproximadamente 25 jig a aproximadamente 500 jig, de aproximadamente 50 jig a aproximadamente 300 jig, de aproximadamente 100 jig a aproximadamente 250 jig, de aproximadamente 50 jig a aproximadamente 250 jig, de aproximadamente 50 jig a aproximadamente 150 jig, aproximadamente 75 jig, aproximadamente 100 jig, aproximadamente 125 jig, aproximadamente 150 jig, aproximadamente 175 jig, aproximadamente 200 jig, aproximadamente 225 jig, aproximadamente 250 jig, aproximadamente 300 jig, o aproximadamente 350 jig, por cm2 de área de herida.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

La presente divulgación proporciona dosificaciones para los agentes terapéuticos basados en la proteína de fusión IL-22 Fc. Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de polipéptido es una dosificación candidata inicial para su administración al sujeto, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, se mantiene el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de fusión IL-22 Fc) (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de polipéptido, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el polipéptido se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, la anamnesis del sujeto y respuesta al polipéptido, y el criterio del médico especialista. El polipéptido se administra de forma adecuada al sujeto de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 jg/kg a 20 mg/kg (por ejemplo, 0,1mg/kg-15 mg/kg) del polipéptido puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al sujeto, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del polipéptido estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al sujeto una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg o 20 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). En determinados aspectos de la divulgación, aproximadamente 0,5 mg/kg, 1,0 mg.kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 7,0 mg/kg, 8,0 mg/kg, 9,0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg o 20 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al sujeto. Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el sujeto recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del polipéptido). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Una pauta posológica ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Los compuestos divulgados en el presente documento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o afección cardiovascular, síndrome metabólico, endotoxemia aguda o sepsis, EICH o diabetes se administran típicamente por inyección intravenosa.

También se pueden usar otros procedimientos de administración, que incluye pero no se limita a, administración tópica, parenteral, como intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, ocular, intraocular, intravítrea, intralesional, intracerobroespinal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral o por inhalación. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, los compuestos descritos en el presente documento se administran a un sujeto humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo.

1. Proteínas de fusión IL-22 Fc ejemplares para su uso en las composiciones

En general, las proteínas de fusión IL-22 Fc incluyen un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector. Cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en la patente de EE. UU. n.° 9.815.880 se puede usar en las composiciones descritas en el presente documento. En algunos aspectos de cualquiera de las proteínas de fusión ⁱL-22 Fc precedentes, la región Fc no está glucosilada. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es Gly. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es Ala. En algunos aspectos de la divulgación, el residuo aminoacídico en la posición 299 como en el índice EU de la región Fc es Ala, Gly o Val. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG4.

En algunos aspectos de la divulgación de cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc precedentes, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, y SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NQ:10 o SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ:10. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16. En algunos aspectos de la divulgación, la región Fc no está N-glucosilada.

Cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc precedentes puede ser una proteína de fusión IL-22 Fc dimérica. En otros aspectos de la divulgación, cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc precedentes puede ser una proteína de fusión IL-22 Fc monomérica.

Cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc precedentes puede incluir un polipéptido IL-22 humano. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.

Se puede usar cualquier conector adecuado en las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento. En algunos aspectos de la divulgación, el conector comprende la secuencia de aminoácidos RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44). En algunos aspectos de la divulgación, el conector consiste en la secuencia de aminoácidos RVESKYGPP (SEQ ID NO: 44).

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento se une al receptor de IL-22. En algunos aspectos de la divulgación, el receptor de IL-22 es un receptor de IL-22 humano. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc se une a IL-22RA1 y/o IL-10R2. En algunos aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc se une a IL-22RA1.

En algunos aspectos de la divulgación, cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc precedentes se produce por el procedimiento que comprende la etapa de cultivar una célula huésped que puede expresar la proteína de fusión IL-22 Fc en condiciones adecuadas para la expresión de las proteínas de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, el procedimiento comprende además la etapa de obtener la proteína de fusión IL-22 Fc del cultivo celular o medio de cultivo. En algunos aspectos de la divulgación, la célula huésped es una célula CHO.

En determinados aspectos de la divulgación, cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento se une a e induce la actividad o señalización del receptor de IL-22 y/o es un agonista de la actividad del receptor de IL-22.

En otro aspecto, una proteína de fusión IL-22 Fc proporcionada en el presente documento comprende un polipéptido que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4. En otros aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc comprende un polipéptido que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones relativas a la secuencia de referencia, pero una proteína de fusión IL-22 Fc que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse al receptor de IL-22. En determinados aspectos de la divulgación, se han sustituido, insertado y/o eliminado un total de 1 a 10 aminoácidos en SEQ ID NO:8, 10, 12, 14, 16, 24 o 26. En determinados aspectos de la divulgación, se producen sustituciones, inserciones o deleciones en regiones fuera de la IL-22 (es decir, en el Fc). En algunos aspectos de la divulgación, las sustituciones, inserciones o deleciones pueden estar en el conector, la bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3 de la proteína de fusión IL-22 Fc. En determinados aspectos particulares de la divulgación, se elimina el residuo Lys C terminal de Fc. En determinados otros aspectos de la divulgación, se eliminan ambos residuos Gly y Lys C terminales de Fc.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan variantes de proteínas de fusión IL-22 Fc que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla A bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla A bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales aminoacídicas. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en la proteína de fusión IL-22 Fc y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión al receptor de IL-22 conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida o señalización del receptor de IL-22 mejorada.

Tabla A

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile:

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de una proteína que se pueden seleccionar para mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este procedimiento, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se identifican y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción de la proteína con su compañero de unión se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, se puede usar una estructura cristalina de un complejo de proteína (por ejemplo, un complejo citocina-receptor) para identificar puntos de contacto entre una proteína y su compañero de unión. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples.

En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, el ácido nucleico codifica la proteína de fusión IL-22 Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26, preferentemente SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:16, más preferentemente SEQ ID NO:8. En determinados otros aspectos de la divulgación, el ácido nucleico comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:25. En determinados aspectos particulares de la divulgación, el ácido nucleico comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:7 o SEQ I^d NO:11, preferentemente SEQ ID NO:7. En determinados aspectos de la divulgación, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:25. En determinados aspectos de la divulgación, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, en el que el ácido nucleico aislado puede codificar una proteína de fusión IL-22 Fc que se puede unir a IL-22R y/o desencadenar actividad IL-22R y en el que la región Fc de la proteína de fusión IL-22 Fc no está glucosilada. En determinados aspectos de la divulgación, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13; SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, en el que el ácido nucleico aislado puede codificar una proteína de fusión IL-22 Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 10, 12 o 14. En aspectos relacionados, se proporcionan vectores que comprenden el ácido nucleico descrito anteriormente y una célula huésped que comprende el vector. En determinados aspectos de la divulgación, la célula huésped es una célula procariota o célula eucariota. En determinados aspectos particulares de la divulgación, la célula huésped es una célula procariota, incluyendo sin limitación, una célula de E. coli. En determinados otros aspectos de la divulgación, la célula huésped es una célula eucariota, incluyendo sin limitación, una célula CHO. En determinados aspectos de la divulgación, la célula huésped comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión IL-22 Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

a) Variantes de glucosilación

En determinados aspectos de la divulgación, una proteína de fusión IL-22 Fc proporcionada en el presente documento se altera para incrementar o disminuir el grado en que la proteína de fusión o una porción de la misma (por ejemplo, la porción Fc de la proteína de fusión) está glucosilada. La adición o deleción de sitios de glucosilación en una proteína se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.

Cuando la proteína de fusión comprende una región Fc, el carbohidrato fijado a la misma se puede alterar. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos aspectos de la divulgación, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo o la región Fc de un anticuerpo para crear variantes de Fc con determinadas propiedades mejoradas.

La cantidad de fucosa fijada al dominio CH2 de la región Fc se puede determinar calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn 297 o N297 (por ejemplo, complejo, híbrido y alto estructuras de manosa) medida por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos hacia 5' o hacia 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia pequeñas en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108; US 2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Led13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1; y documento WO2004/056312 A1, especialmente el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como células CHO con el gen FUT8, de la alfa-1,6-fucosiltransferasa, inactivado (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y documento WO 2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o una función ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; patente de EE. UU. n.° 6.602.684; y US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

b) Variantes de la región Fc

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de una proteína de fusión de Fc proporcionada en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas. Por ejemplo, la bisagra puede incluir una sustitución de Ser a Pro, por ejemplo, como se muestra en el residuo Pro en negrita y subrayado en la secuencia de aminoácidos de CPPCP (SEQ ID NO:31). Dicha sustitución de Ser a Pro puede incrementar la estabilidad de la molécula.

En determinados aspectos de la divulgación, se contempla una variante de Fc que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la hace una candidata deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo o una proteína de fusión que comprende una región Fc in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo o Fc carece de unión a F^cyR (por tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); pat. de EE. UU. n.° 5.821.337; y Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CYTOTOX 96® (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo o Fc no se puede unir a C1q y por tanto carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo o de Fc con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; documento WO 2004/056312; y Shields et al. J. Biol. Chem. ⁹ (² ): 6591-6604 (2001).)

En determinados aspectos de la divulgación, una proteína de fusión IL-22 Fc comprende una variante de Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la ADCC, por ejemplo, sustitución en la posición 297 de la región Fc para retirar el sitio de N-glucosilación y conservar aún la actividad de unión a FcRn (numeración EU de residuos).

En algunos aspectos de la divulgación, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión de C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) disminuidas, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, documento WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Los anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).

Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente de EE. UU. n.° 5.648.260; patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y documento WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

c) Variantes genomanipuladas con cisteína

En determinados aspectos de la divulgación, puede ser deseable crear una proteína de fusión Fc genomanipulada con cisteína, en la que uno o más residuos de la región Fc de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En aspectos particulares de la divulgación, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del Fc. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan de este modo en sitios accesibles del Fc y se pueden usar para conjugar el Fc a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. Por ejemplo, S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada se puede sustituir con Cys. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.521.541.

2. Polipéptidos IL-22 ejemplares

Por ejemplo, en cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento, el polipéptido IL-22 puede incluir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:71 (IL-22 humana con la secuencia líder de IL-22 endógena), o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia) con SEQ ID NO:71. En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido IL-22 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:4 (IL-22 humana sin una secuencia líder) o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia) con SEQ ID NO:4. En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido IL-22 comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO:4.

La preparación de moléculas de IL-22 natural, junto con sus secuencias de ácido nucleico y polipeptídicas, se puede lograr a través de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos IL-22 se pueden producir cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de IL-22. Por supuesto, se contempla que se pueden emplear procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar IL-22. Por ejemplo, la secuencia de IL-22, o porciones de la misma, se puede producir por síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (véanse, por ejemplo, Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149-2154). La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, California) usando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones de IL-22 se pueden sintetizar químicamente por separado y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir la IL-22 de longitud completa.

Las variantes de IL-22 se pueden preparar introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en el ADN que codifica un polipéptido IL-22 de secuencia natural, o por síntesis del polipéptido IL-22 deseado. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de IL-22, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a membrana.

Se pueden realizar variaciones en los polipéptidos IL-22 de secuencia natural descritos en el presente documento, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras expuestas, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican una IL-22 variante o de secuencia natural que da como resultado un cambio en su secuencia de aminoácidos en comparación con una correspondiente IL-22 variante o de secuencia natural. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de un polipéptido IL-22 de secuencia natural. Se pueden encontrar directrices para determinar qué residuo aminoacídico se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar negativamente a la actividad deseada comparando la secuencia de la IL-22 con la de moléculas de proteína conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de homología alta. Las sustituciones aminoacídicas pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos aminoacídicos conservadores. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y sometiendo a prueba las variantes resultantes para determinar su actividad, por ejemplo, en el ensayo in vitro descrito en los ejemplos a continuación.

En aspectos particulares de la divulgación, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la tabla A bajo el título de sustituciones preferentes. Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, a continuación se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la tabla A, o como se describe además a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos IL-22 comprende alterar el patrón de glucosilación natural de los polipéptidos. "Alterar el patrón de glucosilación natural" pretende querer decir para los propósitos en el presente documento eliminar uno o más restos de carbohidrato hallados en IL-22 de secuencia natural y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en IL-22 de secuencia natural, y/o la alteración de la proporción y/o composición de los residuos glucídicos fijados al/a los sitio(s) de glucosilación.

La glucosilación de polipéptidos es típicamente unida a N o bien unida a O. La adición de sitios de glucosilación al polipéptido IL-22 se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por ejemplo, por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia natural de IL-22 (para sitios de glucosilación unidos a N), o la adición de una secuencia de reconocimiento para glucosilación unida a O. La secuencia de aminoácidos de IL-22 se puede alterar opcionalmente a través de cambios a nivel de ADN, en particular mutando el ADN que codifica el polipéptido IL-22 en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de incrementar el número de restos de carbohidrato en el polipéptido IL-22 es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dichos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 y en Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Se puede lograr la retirada de restos glucídicos presentes en un polipéptido IL-22 química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican residuos aminoacídicos que sirven como dianas para la glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981). La escisión enzimática de restos de carbohidrato en polipéptidos se puede lograr por el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

Las variaciones se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. 10:6487), mutagénesis en casete (Wells et al., 1985, Gene 34:315), mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London A 317:415), u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir ADN de variante de IL-22.

También se divulgan en el presente documento fragmentos de un polipéptido IL-22. Dichos fragmentos se pueden truncar en el extremo N o extremo C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína natural de longitud completa. Determinados fragmentos carecen de residuos aminoacídicos que no son esenciales para una actividad biológica deseada de un polipéptido IL-22 de la presente invención. En consecuencia, en determinados aspectos de la divulgación, un fragmento de un polipéptido IL-22 es biológicamente activo. En determinados aspectos de la divulgación, un fragmento de IL-22 de longitud completa carece de la secuencia del péptido señal N terminal.

Las modificaciones covalentes de polipéptidos IL-22 variantes y de secuencia natural se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoacídicos seleccionados como diana de IL-22 con un agente de derivación orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C terminales del polipéptido IL-22. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular IL-22 con una superficie o matriz de soporte insoluble en agua, por ejemplo, para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-IL-22. Los agentes de reticulación usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato de metilo.

Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86i), acetilación de la amina N terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal.

Otro tipo de modificación covalente de IL-22 comprende unir el polipéptido IL-22 a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, por ejemplo, de la manera expuesta en la pat. de EE. UU. n.os 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; o 4.179.337. La IL-22 variante y de secuencia natural también se puede modificar de manera que forme una molécula quimérica que comprende ⁱL-22 incluyendo fragmentos de IL-22, fusionados a otra secuencia de aminoácidos o polipéptido heterólogo.

En un aspecto de la divulgación, dicha molécula quimérica comprende una fusión de IL-22 con un polipéptido de marca que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca de epítopo se dispone en general en el extremo amínico o carboxílico del polipéptido IL-22. La presencia de dichas formas marcadas con epítopo del polipéptido IL-22 se puede detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. Además, la provisión de la marca de epítopo permite que el polipéptido IL-22 se purifique fácilmente por purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca de epítopo. Diversos polipéptidos de marca y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen marcas de polihistidina (poli-his) o polihistidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido marca flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165); la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 y 9E10 para la misma (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616); y la marca de glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al., 1990, Protein Engineering 3(6):547-553). Otros polipéptidos de marca incluyen el péptido Flag (Hopp et al., 1988, Bio Technology 6:1204-1210); el péptido del epítopo KT3 (Martin et al., 1992, Science 255:192-194); un péptido del epítopo de tubulina (Skinner et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15163-15166); y la marca peptídica de la proteína 10 del gen de T7 (Lutz-Freyermuth et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397).

En otro aspecto de la divulgación, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido IL-22 o un fragmento del mismo con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, dicha fusión puede ser con la región Fc de una molécula de IgG. Estos polipéptidos de fusión son moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina y a menudo se denominan inmunoadhesinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos de IL-22, o una variante de la misma, y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgE, IgD o IgM. En determinados aspectos de la divulgación, la proteína de fusión IL-22 Fc presenta actividades efectoras modificadas.

El polipéptido IL-22, o un fragmento del mismo, se puede fusionar, por ejemplo, a una secuencia de región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina para producir una proteína de fusión IL-22-Ig (por ejemplo, proteína de fusión IL-22 Fc). El polipéptido IL-22 puede ser IL-22 humana o murina. La secuencia de región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina puede ser una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana o murina.

B. Procedimientos de preparación de proteínas de fusión IL-22 Fc para su uso en las composiciones

Las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento se pueden preparar por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión IL-22 Fc, un fragmento o una variante de la misma. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera de dichos vectores. Se puede usar cualquier célula huésped adecuada, por ejemplo, células de mamífero (por ejemplo, células CHO), E. coli o levadura. Los procedimientos para producir cualquiera de las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento se divulgan además y, en general, implican cultivar células huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión IL-22 Fc deseada y recuperar, y opcionalmente purificar, la proteína de fusión IL-22 Fc deseada del cultivo celular. Por ejemplo, se puede usar cualquiera de los procedimientos descritos en la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/622.762.

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción del polipéptido IL-22 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, se pueden seleccionar por el experto en la técnica sin experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.

Los procedimientos de transfección son conocidos para el experto en la técnica, por ejemplo, por CaPO4 y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación se usa en general para procariotas u otras células que contienen barreras de paredes celulares sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de determinadas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, se puede emplear el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) . Se han descrito aspectos generales de transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero en la pat. de EE. UU. n.° 4.399.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact, 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979) . Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo polibreno o poliornitina. Para diversas técnicas para transformar células de mamífero, véanse Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Los polipéptidos expresados de forma recombinante se pueden recuperar del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopo de un polipéptido. Se pueden emplear diversos procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n), por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción usado y del polipéptido particular producido.

Se pueden emplear procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar un polipéptido. Por ejemplo, una secuencia que codifica un polipéptido o una porción del mismo se puede producir por síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (véanse, por ejemplo, Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Ca ; Merrifield, J. 1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones de un polipéptido o porción del mismo se pueden sintetizar químicamente por separado y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido de longitud completa o porción del mismo.

En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento fusionados a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Los ejemplos de dichas moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento fusionados a una secuencia de marca de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, enterobacterias, tales como E. coli. Diversas cepas de E. co liestán disponibles públicamente, tales como E. coli K12, cepa MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli, cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635).

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican IL-22. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior usado comúnmente.

Las células huésped adecuadas para la expresión de IL-22 glucosilada se derivan de organismos pluricelulares. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Los ejemplos más específicos incluyen células CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); células de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51). Se considera que la selección de la célula huésped apropiada está dentro de los conocimientos de la técnica.

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica IL-22 se puede insertar en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia finalizadora de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de fijación estándar que son conocidas para el experto en la técnica.

Los polipéptidos IL-22 se pueden producir de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o polipéptido maduro, así como una proteína de fusión IL-22 Fc. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN de IL-22 que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp o enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes del factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.010.182) o líder de fosfatasa ácida, líder de glucoamilasa de C. albicans (documento Ep 362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, se pueden usar secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o especies relacionadas, así como líderes secretores víricos.

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Dichas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, el origen del plásmido 2|j es adecuado para la levadura, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias autotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilos.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero es uno que permite la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico de IL-22, tales como DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la línea celular CHO carente de actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (véanse, por ejemplo, Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, n.° ATCC 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).

Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor unido de forma funcional a la secuencia de ácido nucleico de IL-22 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de cuadratura-lactamasa y lactosa (véase, por ejemplo, Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (véanse, por ejemplo, Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento Ep 36.776), y promotores híbridos tales como el promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma funcional al ADN que codifica IL-22.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato cinasa (véase, por ejemplo, Hitzeman et al., J. Biol. Chem, 255:2073 (1980)) u otras enzimas glucolíticas (véase, por ejemplo, Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968), Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras se describen además en el documento EP 73.657.

La transcripción de IL-22 a partir de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos IL-22 por eucariotas superiores se puede incrementar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras son conocidas ahora a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el promotor/potenciador temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante de IL-22, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, vegetal, animal, humana o nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están comúnmente disponibles de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica IL-22.

Todavía otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de IL-22 en cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979); documento EP 117.060; y documento EP 117.058.

La amplificación y/o expresión génica se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (véase, por ejemplo, Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), inmunotransferencia por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, en base a las secuencias proporcionadas en el presente documento. De forma alternativa, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARn o dúplex de ADN-proteína. A su vez, se pueden marcar los anticuerpos y se puede llevar a cabo el ensayo donde el dúplex se une a una superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la superficie, se pueda detectar la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

De forma alternativa, se puede medir la expresión génica por procedimientos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o cortes histológicos y ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de líquidos de muestra pueden ser monoclonales o bien policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido IL-22 de secuencia natural o contra un péptido sintético en base a las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento o contra una secuencia exógena fusionada a ADN de IL-22 y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

Las proteínas de fusión IL-22 Fc se pueden recuperar del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si está unida a membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución de detergente adecuada (por ejemplo, TRITON® X-100) o por escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de IL-22 se pueden romper por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular.

Se puede desear purificar proteínas de fusión IL-22 Fc a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopo del polipéptido IL-22. Se pueden emplear diversos procedimientos de purificación de proteínas y dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, ¹⁸² (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n), por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción usado y de la IL-22 particular producida. Los procedimientos generales descritos anteriormente también se pueden aplicar a la preparación de la proteína de fusión IL-2 Fc.

De forma similar, las proteínas de fusión IL-22 Fc se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, como se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al.

1990. Academic Press, San Diego, CA). En un aspecto de la divulgación, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica las proteínas de fusión IL-22 Fc descritas en el presente documento. En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En otro aspecto de la divulgación, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En uno de dicho aspecto de la divulgación, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la proteína de fusión IL-22 Fc. En determinado aspecto de la divulgación, el vector es un vector de expresión. En un aspecto de la divulgación, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula linfocítica (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). En un aspecto de la divulgación, se proporciona un procedimiento de preparación de una proteína de fusión IL-22 Fc, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión IL-22 Fc, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión Fc y, opcionalmente, recuperar la proteína de fusión Fc de la célula huésped (o del medio de cultivo de célula huésped).

Para la producción recombinante de una proteína de fusión IL-22 Fc, el ácido nucleico que codifica una proteína de fusión Fc, por ejemplo, como se describe en el presente documento, se aísla y se inserta en uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se pueden unir específicamente a genes que codifican la proteína de fusión). En determinados aspectos de la divulgación, cuando se preparan las proteínas de fusión iL-22 Fc, el ácido nucleico que codifica el polipéptido IL^{- 22} o un fragmento del mismo se puede fijar al ácido nucleico que codifica una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en una localización específica en el dominio constante para dar como resultado una fusión Fc en el extremo C de IL-22; sin embargo, también son posibles fusiones N terminales.

Como ejemplo de construcción de una proteína de fusión IL-22 Fc, el ADN que codifica IL-22 se escinde por una enzima de restricción en o próximo al extremo 3' del ADN que codifica IL-22 y en un punto en o cerca del ADN que codifica el extremo N terminal del polipéptido maduro (donde se contempla el uso de un líder diferente) o en o próximo a la región codificante N terminal para la proteína de longitud completa de IL-22 (donde se emplea una señal natural). A continuación, este fragmento de ADN se inserta fácilmente en el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina y, si es necesario, se adapta por mutagénesis por deleción. Preferentemente, esta es una inmunoglobulina humana cuando la proteína de fusión se destina a tratamiento in vivo para seres humanos.

En algunos aspectos de la divulgación, las quimeras de IL-22-inmunoglobulina se ensamblan como monómeros, hetero u homomultímeros, o como dímeros o tetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas como se representa por los siguientes diagramas. Una unidad estructural de cuatro cadenas básica es la forma en que existen IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de mayor peso molecular; IgM en general existe como un pentámero de unidades de cuatro cadenas básicas unidas por enlaces disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden existir en una forma multimérica en suero. En el caso de multímeros, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o diferente. Véase también Capon et al. patente de EE. UU. n.° 5.116.964.

El ADN que codifica regiones constantes de la cadena ligera o pesada de inmunoglobulina es conocido o está fácilmente disponible a partir de colecciones de ADNc o se sintetiza. Véanse, por ejemplo, Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710 (1980); Dolby et al; P.N.A.S. USA, 77:6027-6031 (1980); Rice et al P.N.A.S USA 79:7862-7865 (1982); Falkner et al; Nature 298:286-288 (1982); y Morrison et al; Ann. Rev. Immunol. 2:239-256 (1984). La secuencia de ADN que codifica IL-22 humana con la secuencia líder endógena se proporciona en el presente documento (SEQ ID NO:70). Las secuencias de ADN que codifican otros compañeros de unión deseados que son conocidas o están fácilmente disponibles a partir de colecciones de ADNc son adecuadas en la práctica.

El ADN que codifica una proteína de fusión IL-22 Fc se transfecta en una célula huésped para su expresión. Si se desean multímeros, a continuación la célula huésped se transforma con ADN que codifica cada cadena que formará el multímero, estando seleccionada de manera óptima la célula huésped para que pueda ensamblar las cadenas de los multímeros de la forma deseada. Si la célula huésped está produciendo una inmunoglobulina antes de la transfección, a continuación solo se necesita transfectar con el compañero de unión fusionado a la cadena ligera o pesada para producir un heteroanticuerpo. Las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente que tienen uno o más brazos que llevan el dominio del compañero de unión y uno o más brazos que llevan regiones variables acompañantes dan como resultado una doble especificidad para el ligando de compañero de unión y para un antígeno o resto terapéutico. Las células cotransformadas de forma múltiple se usan con los procedimientos recombinantes descritos anteriormente para producir polipéptidos que tienen múltiples especificidades tales como las inmunoglobulinas heterotetraméricas analizadas anteriormente.

Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina, una cadena ligera de inmunoglobulina podría estar presente asociada covalentemente a un polipéptido de fusión IL-22-cadena pesada de inmunoglobulina. En este caso, el ADN que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina típicamente se coexpresa con el ADN que codifica la proteína de fusión IL-22-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares de la cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidos por disulfuro. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras se divulgan, por ejemplo, en la patente de Ee . UU. n.° 4.816.567 expedida el 28 de marzo de 1989. Las células huésped adecuadas para clonación o expresión de vectores que codifican proteínas diana incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, la proteína de fusión IL-22 Fc se puede producir en bacterias, en particular cuando la glucosilación y la función efectora de Fc no son necesarias o son perjudiciales. Para la expresión de polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.648.237, 5.789.199 y 5.840.523. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Después de la expresión, la proteína de fusión de Fc se puede aislar de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar además. Otros procedimientos de purificación incluyen, sin limitación, la purificación usando una columna de proteína A.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o totalmente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas glucosiladas también derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.959.177; 6.040.498; 6.420.548; 7.125.978; y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293, como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A): células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TR1, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas de células de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.

255-268 (2003).

C. Ensayos

Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento, o sus constituyentes, se pueden identificar, cribar o caracterizar por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

1. Ensayos de unión y otros ensayos

En un aspecto, se somete a prueba una proteína de fusión IL-22 Fc para determinar su actividad de unión al receptor, por ejemplo, por procedimientos conocidos tales como ELISA, análisis de inmunoelectrotransferencia, unión a superficie celular por Scatchard, resonancia de plasmón superficial. En otro aspecto, se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con la proteína de fusión IL-22 Fc por la unión al receptor de IL-22. En otro aspecto, se puede usar una proteína de fusión IL-22 Fc para detectar la presencia o cantidad de receptor de IL-22 o proteína de unión a IL22 (receptor soluble) presente en una muestra biológica. En otro aspecto, se puede usar una proteína de fusión IL-22 Fc para detectar la presencia o cantidad de receptor de IL-22 presente en una muestra biológica. En determinados aspectos de la divulgación, la muestra biológica se bloquea en primer lugar con un anticuerpo de control de isotipo inespecífico para saturar cualquier receptor de Fc en la muestra.

2. Ensayos de actividad

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan ensayos para identificar la actividad biológica de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc). La actividad biológica de un polipéptido IL-22 o proteína de fusión IL-22 Fc en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede incluir, por ejemplo, unirse al receptor de IL-22, estimular la señalización de IL-22 e inducir la expresión de STAT3, Reglll y/o PancrePAP. Además, en el caso de una enfermedad o afección cardiovascular, la actividad biológica puede incluir afectar a la formación de placas ateroescleróticas, en particular para inhibir la formación de formación de placas ateroescleróticas. La inhibición de la formación de placas se puede evaluar por cualquier procedimiento de formación de imágenes adecuado conocido por los expertos en la técnica.

3. Ensayos de estabilidad

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan ensayos para determinar la estabilidad de una composición. Por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) se puede evaluar cualitativa y/o cuantitativamente en una variedad de formas diferentes, incluyendo evaluación de la formación de agregados (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño, midiendo la turbidez y/o por inspección visual); evaluación de la formación de ROS (por ejemplo, usando un ensayo de condiciones extremas ligero o un ensayo de condiciones extremas con diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-amidinopropano)(AAPH)); oxidación de residuos aminoacídicos específicos de la proteína (por ejemplo, un residuo Met de una proteína de fusión IL-22 Fc); evaluar la heterogeneidad de carga por cromatografía de intercambio catiónico, isoelectroenfoque capilar por imagen (iCIEF) o electroforesis de zona capilar; análisis de secuencia aminoterminal o carboxiterminal; análisis espectrométrico de masas; análisis SDS-PAGE para comparar polipéptidos reducidos e intactos (por ejemplo, proteínas de fusión IL-22 Fc); análisis de mapa peptídico (por ejemplo, tríptico o LYS-C); evaluar la actividad biológica o función de unión a diana de la proteína (por ejemplo, unión de una proteína de fusión IL-22 Fc a un receptor de IL-22); y similares. La inestabilidad puede implicar uno o más de: agregación, desamidación (por ejemplo, desamidación de Asn), oxidación (por ejemplo, oxidación de Met y/u oxidación de T rp), isomerización (por ejemplo, isomerización de Asp), recorte/hidrólisis/fragmentación (por ejemplo, fragmentación de región bisagra), formación de succinimida, cisteína(s) desapareada(s), extensión N terminal, procesamiento C terminal, diferencias de glucosilación y similares. Los ensayos ejemplares se describen a continuación en los ejemplos.

D. Conjugados para su uso en las composiciones

También se divulgan composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que incluyen conjugados que comprenden una proteína de fusión IL-22 Fc descrita en el presente documento conjugada a uno o más agentes para detección, formulación, prolongación de la semivida, atenuación de la inmunogenicidad o penetración tisular. La conjugación ejemplar incluye sin limitación PEGilación y fijación a isótopos radioactivos.

En otro aspecto de la divulgación, un conjugado comprende una proteína de fusión IL-22 Fc como se describe en el presente documento conjugada a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para tomografía por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

E. Procedimientos terapéuticos y usos de las composiciones

Cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) proporcionadas en el presente documento se puede usar en procedimientos y usos terapéuticos, por ejemplo, cualquiera de los procedimientos y usos terapéuticos descritos a continuación.

a) Enfermedad inflamatoria intestinal

En un aspecto, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión lL-22 Fc) para su uso como medicamento. En otros aspectos, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en el tratamiento de EII, incluyendo CU y EC. En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en un procedimiento de tratamiento. En determinados aspectos, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en un procedimiento para tratar a un individuo que tiene CU o EC que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de proteína de fusión IL-22 Fc. En un aspecto de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otros aspectos de la divulgación, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en la potenciación de la proliferación, diferenciación y/o migración epitelial. En determinados aspectos particulares, el tejido epitelial es tejido epitelial intestinal. En determinados aspectos, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en un procedimiento de potenciación de la proliferación, diferenciación y/o migración epitelial en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición para potenciar la proliferación, diferenciación y/o migración epitelial. Aún en otros aspectos de la divulgación, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en el tratamiento de diabetes, especialmente diabetes de tipo II, cicatrización de heridas diabéticas, síndromes metabólicos y ateroesclerosis. En determinados aspectos de la divulgación, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) para su uso en un procedimiento para tratar diabetes, especialmente diabetes de tipo II, cicatrización de heridas diabéticas, síndromes metabólicos y ateroesclerosis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición. Véase la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2014/145016. Un "individuo" o "sujeto" o "paciente" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores es preferentemente un ser humano.

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona el uso de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) en la fabricación o preparación de un medicamento. En un aspecto, el medicamento es para el tratamiento de EII y cicatrización de heridas. En otro aspecto, el medicamento es para su uso en un procedimiento para tratar EII y cicatrización de heridas que comprende administrar a un individuo que tiene EII una cantidad eficaz del medicamento. En un aspecto de este tipo, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. En otro aspecto, el medicamento es para suprimir la respuesta inflamatoria en las células epiteliales del intestino. En otro aspecto, el medicamento es para su uso en un procedimiento de potenciación de la proliferación, diferenciación y/o migración epitelial en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para potenciar la proliferación, diferenciación y/o migración epitelial. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede ser un ser humano.

b) Otras indicaciones terapéuticas

La presente divulgación proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) para enfermedades y afecciones cardiovasculares, síndrome metabólico, endotoxemia aguda y sepsis, enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y diabetes. Para la prevención, tratamiento o reducción de la gravedad de una enfermedad o afección dada, la dosificación adecuada de una composición descrita en el presente documento dependerá del tipo de enfermedad o afección que se va a tratar, como se define anteriormente, la gravedad y evolución de la enfermedad o afección, si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, la anamnesis y la respuesta del sujeto al compuesto, y el criterio del médico especialista. El compuesto se administra adecuadamente al sujeto de una vez o durante una serie de tratamientos. Preferentemente, es deseable determinar la curva de respuesta a la dosis y la composición farmacéutica en primer lugar in vitro y a continuación en modelos animales útiles antes de someterla a prueba en seres humanos.

Enfermedades y afecciones cardiovasculares

En un aspecto de la divulgación, las proteínas de fusión IL-22 Fc proporcionan un efecto terapéutico, preventivo o profiláctico contra el desarrollo de, o la progresión de, indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de enfermedades o afecciones cardiovasculares en un sujeto. En un aspecto de la divulgación, la enfermedad o afección es ateroesclerosis. En un aspecto, los indicios incluyen formación de placas ateroescleróticas y/o inflamación vascular. En otro aspecto, el sujeto tiene riesgo de cardiovasculopatía. En general, un sujeto en riesgo habrá tenido previamente una enfermedad o afección cardiovascular como se describe en el presente documento, o tendrá una predisposición genética para una enfermedad o afección cardiovascular.

La eficacia del tratamiento de las enfermedades y afecciones cardiovasculares se puede medir por diversas evaluaciones usadas comúnmente para evaluar cardiovasculopatías. Por ejemplo, se puede evaluar la salud cardiovascular. La salud cardiovascular se puede evaluar por, pero sin limitarse a, análisis de sangre (por ejemplo, colesterol total, LDL-C, HDL-C, triglicéridos, proteína C reactiva, fibrinógeno, homocisteína, insulina en ayunas, ferritina, lipoproteína y LPS), tensión arterial, auscultación, electrocardiograma, prueba de esfuerzo cardíaco, imágenes cardíacas (por ejemplo, cateterismo coronario, ecocardiograma, ecografía intravascular, tomografía por emisión positrónica, angiografía por tomografía computarizada y resonancia magnética nuclear).

Síndrome metabólico

En un aspecto, las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) proporcionan un efecto terapéutico, preventivo o profiláctico contra el desarrollo de, o la progresión de, indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos. y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de síndrome metabólico (o trastorno o enfermedad metabólica) en un sujeto. En uno o más modos de realización, el sujeto tiene riesgo de síndrome metabólico.

La eficacia del tratamiento del síndrome metabólico se puede medir por diversas evaluaciones usadas comúnmente para evaluar el síndrome metabólico. Por ejemplo, se puede medir la obesidad. Como otro ejemplo, se puede medir la hiperglucemia, dislipidemia, resistencia a la insulina, inflamación crónica del tejido adiposo y/o hipertensión. Se puede medir la reducción en los niveles de uno o más de proteína C reactiva, IL-6, LPS e inhibidor del activador del plasminógeno 1. Estas mediciones se pueden realizar por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica.

Trastornos relacionados con la insulina

Para los trastornos relacionados con la insulina, el término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas para el trastorno, en el que el objetivo es evitar o ralentizar (reducir) la afección o el trastorno patológico seleccionado. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen un trastorno relacionado con la insulina, así como los propensos a tener dicho trastorno o en los que se va a evitar el trastorno.

En un aspecto, las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) proporcionan un efecto preventivo o profiláctico contra el desarrollo de, o la progresión de, indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de un trastorno relacionado con la insulina en un sujeto. En un aspecto de la divulgación, el trastorno es diabetes de tipo I, diabetes de tipo II o diabetes gestacional. En un modo de realización, la patología o indicios patológicos incluyen uno o más de: poca o ninguna producción de insulina por el páncreas (por ejemplo, células de los islotes), resistencia a la insulina e hiperglucemia. En otro aspecto, el sujeto tiene riesgo de un trastorno relacionado con la insulina. En general, un sujeto en riesgo tiene una predisposición genética a un trastorno relacionado con la insulina, se ha expuesto a un virus que desencadena la destrucción autoinmunitaria de las células de los islotes (por ejemplo, el virus de Epstein-Barr, el virus de Coxsackie, virus de las paperas o el citomegalovirus), es obeso, es prediabético (glucemia mayor de lo normal) o tiene diabetes gestacional.

La eficacia del tratamiento de un trastorno relacionado con la insulina se puede medir por diversas evaluaciones usadas comúnmente para evaluar dichos trastornos. Por ejemplo, la diabetes tanto de tipo I como de tipo II se puede evaluar con uno o más de los siguientes: una prueba de glucohemoglobina (A1C), una prueba de glucemia corriente y una prueba de glucemia en ayunas. El tipo I también se puede evaluar sometiendo a prueba para determinar autoanticuerpos en la sangre y/o cetonas en la orina. El tipo II también se puede evaluar sometiendo a prueba para determinar tolerancia oral a la glucosa.

Endotoxemia aguda y sepsis

En un aspecto, las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) proporcionan un efecto terapéutico, preventivo o profiláctico contra el desarrollo de, o la progresión de, indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de endotoxemia aguda, sepsis, o ambas, en un sujeto. En uno o más aspectos de la divulgación, el sujeto tiene riesgo de endotoxemia aguda, sepsis o ambas.

La eficacia del tratamiento de endotoxemia aguda, sepsis o ambas se puede medir por diversas evaluaciones usadas comúnmente para evaluar la endotoxemia aguda, sepsis o ambas. Por ejemplo, se puede medir la reducción en los niveles de LPS o marcadores inflamatorios. Estas mediciones se pueden realizar por cualquier procedimiento bien conocido en la técnica.

Cicatrización de heridas

Existe variedad de formas para medir la cicatrización de heridas. A menudo se toman imágenes para calcular dimensiones lineales, perímetro y área. El NIH tiene un programa gratuito, Image J, que permite la medición de áreas de herida a partir de una imagen. El pronóstico de cicatrización final se puede extrapolar a partir de las tasas de cicatrización iniciales basadas en la migración de la periferia hacia el centro. Esto se realiza usando una serie de ecuaciones matemáticas, de las que la más común es la ecuación de Gilman modificada. Además de la inspección visual, la medición de la cicatrización de heridas también puede estar asistida por procedimientos espectroscópicos o RM. Véase, por ejemplo, Dargaville et al., Biosensors Bioelectronics, 2013, 41:30-42, Tan et al., 2007, British J. Radiol. 80:939-48. Si la cicatrización es lenta o inadecuada, se pueden tomar biopsias de los bordes de la herida para descartar o determinar la infección y neoplasia maligna. En determinados aspectos, la aceleración o mejora de la cicatrización de heridas se puede evaluar comparando el cierre de heridas en heridas tratadas con IL-22 y de control. En determinados aspectos de la divulgación, la aceleración o mejora de la cicatrización de heridas es al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % más rápida o mejor que la de control.

En determinados aspectos, se proporcionan procedimientos para promover/acelerar/mejorar la cicatrización de una herida con o sin infección activa, contaminación microbiana o colonización en la herida. Las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) se pueden usar para tratar heridas infectadas o promover/acelerar/mejorar la cicatrización de heridas infectadas. En determinados aspectos, las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) se pueden usar para tratar heridas o promover/acelerar/mejorar la cicatrización de heridas, en presencia de infección. En algunos aspectos, las composiciones (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) se pueden usar para tratar heridas o promover/acelerar/mejorar la cicatrización de heridas en presencia de contaminación microbiana o colonización con riesgo de infección. En otros aspectos, el paciente que necesita un tratamiento de cicatrización de heridas puede ser un paciente diabético. En consecuencia, en algunos aspectos, la herida es una herida diabética, por ejemplo, una úlcera de pie diabético. En algunos otros aspectos, la herida es una herida diabética infectada, por ejemplo, una úlcera de pie diabético infectada.

EICH

En un aspecto, las proteínas de fusión IL-22 Fc pueden proporcionar un efecto profiláctico contra el desarrollo de, o un efecto terapéutico contra la progresión de, indicios clínicos y/o histológicos y/o bioquímicos y/o patológicos (incluyendo tanto síntomas como signos) de EICH. La administración de una proteína de fusión IL-22 Fc o una composición de la misma como se describe en el presente documento puede reducir uno o más síntomas de EICH, incluyendo dolor, erupciones cutáneas, engrosamiento de la piel, piel u ojos amarillos, sequedad o úlceras en la boca, alteraciones del gusto, xeroftalmia, infecciones, o pérdida de peso. Las proteínas de fusión IL-22 Fc o composiciones de las mismas se pueden administrar en combinación con tratamiento adicional para EICH, incluyendo, por ejemplo, agentes inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, micofenolato de mofetilo (MMF) o tacrólimus), inhibidores de mTOR (por ejemplo, sirólimus o everólimus)), agentes de quimioterapia (por ejemplo, imatinib, pentostatina, metotrexato o talidomida), antagonistas del TNF (por ejemplo, etanercept), esteroides (por ejemplo, prednisolona, metilprednisolona, esteroides tópicos o colirios con esteroides), tratamiento con luz (por ejemplo, fotoféresis extracorpórea), hidroxicloroquina, agentes antifibróticos (por ejemplo, halofuginona), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, alemtuzumab, infliximab o rituximab) o combinaciones de los mismos.

Una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede usar sola o en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) como se divulga en el presente documento se puede coadministrar con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados aspectos, un agente terapéutico adicional es un inmunosupresor que reduce la respuesta inflamatoria, incluyendo, sin limitación, metotrexato, un inhibidor de TNF, un antagonista de TNF, mesalazina, esteroide, dexametasona, azatioprina y una combinación de los mismos. Los agentes terapéuticos adicionales adecuados que reducen una respuesta inflamatoria incluyen, sin limitación, ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), mercaptopurina (también llamada 6-mercaptopurina o 6-MP), o una combinación de los mismos. En determinados aspectos, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede coadministrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales que reducen una respuesta inflamatoria (por ejemplo, 5-ASA, 6-MP, 0 un antagonista de TNF) para el tratamiento de EII. En determinados otros aspectos, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede coadministrar con un antagonista de integrina tal como etrolizumab para el tratamiento de EII. En un aspecto, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se usa en combinación con un agonista de IL-22.

Para acelerar la cicatrización de heridas crónicas, tal como para el tratamiento de úlcera del pie diabético, la administración de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede combinar con uno o más agentes de cicatrización de heridas adicionales. Los agentes de cicatrización de heridas adicionales adecuados incluyen, sin limitación, factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF y VEGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factores de angiogénesis (por ejemplo, HGF, TNF-a, angiogenina, IL-8, angiopoyetinas 1 y 2, Tie-2, integrina a5, metaloproteinasas de matriz, óxido nítrico y COX-2), miembros de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (por ejemplo, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D), miembros de la familia del factor de crecimiento insulínico (IGF) (por ejemplo, IGF-1 e IGF-II), miembros de la familia del factor de crecimiento transformante (TGF) (por ejemplo, TGF-a y TGF-p) y oxígeno anabólico (tratamiento de vacío). En determinados aspectos de la divulgación, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede coadministrar con uno o más agentes de cicatrización de heridas descritos en el presente documento y/o uno o más agentes antibacterianos o antibióticos adecuados para su uso en administración tópica. Véase, por ejemplo, el documento WO 2006/138468. En dichos aspectos, el antibiótico puede ser un antibiótico de azufre, incluyendo, sin limitación, sulfadiacina de plata, es decir, silvadeen. El uno o más agentes adicionales coadministrados se pueden administrar de forma simultánea, alternativa o secuencial con la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc).

En otros aspectos ejemplares de la divulgación, si el objetivo es la prevención o tratamiento de enfermedades o afecciones cardiovasculares o síndrome metabólico, la administración de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede combinar con o complementar la administración de los hipocolesterolemiantes tales como estatinas (por ejemplo, lovastatina, rosuvastatina, fluvastatina, atorvastatina, pravastatina y simvastatina), resinas fijadoras de ácidos biliares (colestipol, colestiramina sacarosa y colesevelam), ezetimiba o una combinación ezetimiba-simvastatina; agentes antiplaquetarios tales como inhibidores de la ciclooxigenasa (por ejemplo, aspirina), inhibidores del receptor de difosfato de adenosina (ADP) (por ejemplo, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor y ticlopidina), inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, cilostazol), inhibidores de la glucoproteína IIB/IIIA (por ejemplo, abciximab, eptifibatida y tirofibán), inhibidores de la recaptación de adenosina (por ejemplo, dipiridamol), inhibidores de tromboxano (por ejemplo, inhibidores de la tromboxano sintasa, antagonistas del receptor de tromboxano y terutrobán); betabloqueantes como alprenolol, bucindolol, carteolol, carvedilol, labetalol, nadolol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol, eucommia bark, acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, celiprolol, esmolol, metoprolol, nebivolol, butaxamina, ICI-118.551 y SR59230A; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) tales como captopril, zofenopril, agentes que contienen dicarboxilato (por ejemplo, enalapril, ramipril, quinapril, perindopril, lisinopril, benazepril, imidapril y zofenopril), agentes que contienen fosfonato (por ejemplo, fosinopril), casoquininas, lactoquininas, lactotripéptidos (por ejemplo, Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro producidos por el probiótico Lactobacillus helveticus o derivados de la caseína); bloqueantes de los canales de calcio tales como dihidropiridinas (por ejemplo, amlodipina, aranidipina, azelnidipina, barnidipina, benidipina, cilnidipina, clevidipina, isradipina, efonidipina, felodipina, lacidipina, lercanidipina, manidipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina, nimodipina, nisoldipina, nitrendipina y pranidipina), fenilalquilamina (por ejemplo, verapamilo), benzotiazepinas (por ejemplo, diltiazem), mibefradil, bepridil, fluspirileno y fendilino; diuréticos como diuréticos de máxima eficacia (por ejemplo, furosemida, ácido etacrínico, torsemida y bumetanida), tiazidas (por ejemplo, ácido hidroclorotiazida), inhibidores de la anhidrasa carbónica (por ejemplo, acetazolamida y metazolamida), diuréticos ahorradores de potasio (por ejemplo, antagonistas de la aldosterona: espironolactona, y bloqueantes de los canales de sodio epiteliales: amilorida y triamtereno), y diuréticos ahorradores de calcio, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Para trastornos relacionados con la insulina o síndrome metabólico, la administración de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede combinar con o complementar la administración de diversos agentes terapéuticos. En el caso de diabetes de tipo I (diabetes mellitus insulinodependiente o IDDM), la proteína de fusión IL-22 Fc descrita en el presente documento se puede combinar con uno o más tratamientos de reemplazo de insulina corrientes (incluyendo insulina de acción rápida y de acción prolongada), tratamiento inmunosupresor, trasplante de islotes y tratamiento con células madre. En un aspecto, el tratamiento de reemplazo de insulina corriente incluye, sin limitación, insulina corriente (por ejemplo, HUMULIN R®, NOVOLIN R®), insulina isófana (por ejemplo, HUMULIN N®, NOVOLIN N®), insulina lispro (por ejemplo, HUMALOG®), insulina aspart (por ejemplo, NOVOLOG®), insulina glargina (por ejemplo, LANTUS®) e insulina detemir (por ejemplo, LEVEMIR®). En otros aspectos de la divulgación, el tratamiento de reemplazo de insulina incluye además pramlintida (SYMLIN®).

En el caso de diabetes de tipo II (diabetes mellitus no insulinodependiente o NIDDM) o síndrome metabólico, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) descrita en el presente documento se puede combinar con uno o más tratamientos de reemplazo de insulina (como se analiza anteriormente), un agente para reducir la producción de glucosa por el hígado, un agente para estimular la producción y liberación pancreática de insulina, un agente que bloquea la descomposición enzimática de carbohidratos o un agente que incrementa la sensibilidad a la insulina. En un aspecto de la divulgación, el agente para reducir la producción de glucosa es metformina (por ejemplo, GLUCOPHAGE® y GLUMETZA®). En otro aspecto, el agente para estimular la producción y liberación pancreática de insulina es glipizida (por ejemplo, GLUCOTROL® y GLUCOTROL XL®), gliburida (por ejemplo, DIABETA® y GLYNASE®) o glimepirida (por ejemplo, AMARYL®). En otro aspecto, el agente que bloquea la descomposición enzimática de carbohidratos o incrementa la sensibilidad a la insulina es pioglitazona (por ejemplo, Actos). En otro aspecto, la proteína de fusión IL-22 Fc se puede combinar con uno de los siguientes reemplazos para metformina: sitagliptina (por ejemplo, JANUVIA®), saxagliptina (por ejemplo, ONGLYZA®), repaglinida (por ejemplo, PRANDIN®) y nateglinida (por ejemplo, STARLIX®), exenatida (por ejemplo, BYETTA®) y liraglutida (por ejemplo, VICTOZA®). En otro aspecto, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede combinar con un agente hipoglucemiante oral, por ejemplo, sulfonilureas.

En el caso de diabetes gestacional o síndrome metabólico, la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) descrita en el presente documento se puede combinar con un medicamento de control glucémico oral. En un aspecto de la divulgación, el medicamento es gliburida.

La politerapia puede proporcionar "sinergia" y demostrar ser "sinérgica", es decir, el efecto logrado cuando los ingredientes activos usados conjuntamente es mayor que la suma de los efectos que resultan de usar los compuestos por separado. Se puede obtener un efecto sinérgico cuando los ingredientes activos: (1) se coformulan y administran o suministran simultáneamente en una formulación de dosificación unitaria combinada; (2) se suministran por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por alguna otra pauta. Cuando se suministra tratamiento de alternancia, se puede conseguir un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o suministran de forma secuencial, por ejemplo, por diferentes inyecciones en jeringuillas separadas. En general, durante el tratamiento alternante, se administra secuencialmente una dosificación eficaz de cada ingrediente activo, es decir, en serie, mientras que, en la politerapia, las dosificaciones eficaces de dos o más ingredientes activos se administran conjuntamente.

Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración de la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En un aspecto de la divulgación, la administración de la composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) y la administración de un agente terapéutico adicional se producen dentro de aproximadamente un mes, o dentro de aproximadamente una, dos o tres semanas, o dentro de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, uno del otro.

Una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) de la divulgación (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar, tópica e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

Una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) de la divulgación se formularía, dosificaría y administraría de una forma consecuente con la buena práctica médica. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) (cuando se usa sola o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de región Fc, la gravedad y evolución de la enfermedad, si la proteína de fusión se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis y respuesta del paciente a la proteína de fusión IL-22 Fc, y el criterio del médico especialista. La composición (por ejemplo, una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión IL-22 Fc) se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg -10 mg/kg) o de aproximadamente 0,1 jg/kg a 1,5 mg/kg (por ejemplo, 0,01 mg/kg -1 mg/kg) de la proteína de fusión IL-22 Fc puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar de la proteína de fusión iL-22 Fc estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Determinadas otras dosis incluyen el intervalo de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,02 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, y de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se puede administrar al paciente. Para la cicatrización de heridas tópica, una o más dosis de aproximadamente 0,001 mg/cm2 a aproximadamente 10 mg/cm2 de área de herida, de aproximadamente 0,05 mg/cm2 a aproximadamente 5 mg/cm2 de área de herida, de aproximadamente 0,01 mg/cm2 a aproximadamente 1 mg/cm2 de área de herida, de aproximadamente 0,05 mg/cm2 a aproximadamente 0,5 mg/cm2 de área de herida, de aproximadamente 0,01 mg/cm2 a aproximadamente 0,5 mg/cm2 de área de herida, de aproximadamente 0,05 mg/cm2 a aproximadamente 0,2 mg/cm2 de área de herida, o de aproximadamente 0,1 mg/cm2 a aproximadamente 0,5 mg/cm2 de área de herida (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al paciente. En determinados aspectos de la divulgación, una o más dosis de aproximadamente 0,01 mg/cm2, 0,02 mg/cm2, 0,03 mg/cm2, 0,04 mg/cm2, 0,05 mg/cm2, 0,06 mg/cm2, 0,07 mg/cm2, 0,08 mg/cm2, 0,09 mg/cm2, 0,1 mg/cm2, 0,15 mg/cm2, 0,2 mg/cm2, 0,25 mg/cm2, 0,3 mg/cm2, 0,4 mg/cm2, o 0,5 mg/cm2 de área de herida se pueden administrar al paciente. Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión IL-22 Fc). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

F. Artículos de fabricación

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación puede incluir cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que incluyen una proteína de fusión IL-22 Fc) proporcionadas en el presente documento. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, evitar y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). En algunos aspectos de la divulgación, al menos un agente activo en la composición es una proteína de fusión IL-22 Fc. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. En algunos aspectos de la divulgación, el artículo de fabricación o los recipientes están protegidos de la luz. Los artículos de fabricación pueden incluir cualquiera de las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en el presente documento.

En algunos aspectos de la divulgación, el artículo de fabricación incluye un vial que tiene un volumen de aproximadamente 1 ml o más, por ejemplo, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 2 ml, aproximadamente 3 ml, aproximadamente 4 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 6 ml, aproximadamente 7 ml, aproximadamente 8 ml, aproximadamente 9 ml, aproximadamente 10 ml o más. En algunos aspectos de la divulgación, el recipiente es un vial que tiene un volumen de aproximadamente 2 ml. En algunos aspectos de la divulgación, el vial es para un solo uso. En algunos aspectos de la divulgación, el vial contiene aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 11 mg, aproximadamente 12 mg, aproximadamente 13 mg, aproximadamente 14 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 16 mg, aproximadamente 17 mg, aproximadamente 18 mg, aproximadamente 19 mg, aproximadamente 20 mg o más de proteína de fusión IL-22 Fc. En algunos aspectos de la divulgación, el vial incluye aproximadamente 10 mg de proteína de fusión IL-22 Fc. En algunos modos de realización, el vial incluye proteína de fusión IL-22 Fc formulada en fosfato de sodio 10 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 % (p/v), pH 7,1. En algunos aspectos de la divulgación, el sistema de cierre del recipiente comprende uno o más, o todos, de un vial de vidrio, un tapón y una tapa.

Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende una proteína de fusión IL-22 Fc; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este aspecto de la divulgación puede comprender además un prospecto del envase indicando que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular (por ejemplo, EII, por ejemplo, CU o enfermedad de Crohn) o cualquier otro trastorno descrito en el presente documento. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFi), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Ejemplos

Ejemplo 1: estudios de estabilidad de la proteína de fusión IL-22 Fc

El propósito de estos estudios fue investigar la estabilidad de la proteína de fusión IL-22 Fc y la capacidad de fabricación de una formulación líquida de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, metionina 5 mM, polisorbato 20 (PS20) al 0,02 % (p/v), pH 7,1. Se realizó un cribado de pH completo a temperaturas de almacenamiento previstas de -70, -20 y 5 °C, y a temperaturas de condiciones extremas de 25, 30 y 40 °C, para 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc a pH 5,5-7,6. Los resultados demostraron que la formulación a pH 7,1 era adecuada por color, apariencia y claridad (CAC), concentración, pH, cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC), DSC, isoelectroenfoque capilar por imagen (ICIEF) y potencia.

Se completó un estudio de agitación para 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc con polisorbato 20 al 0,0 %, 0,01 %, 0,02 % y 0,04 % (p/v) para determinar las especificaciones de concentración de polisorbato 20 apropiadas para proteger la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc de condiciones extremas de agitación. Aunque se determinó que el polisorbato 20 al 0,01 % era adecuado para la proteína de fusión IL-22 Fc, la recomendación objetivo fue del 0,02 % para tener en cuenta el intervalo de especificación. Además del cribado de formulación para la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml, se completó un estudio de estabilidad de congelación-descongelación para la proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml en la misma formulación mencionada anteriormente. No hubo cambios significativos para la proteína de fusión IL-22 Fc almacenada a -20 °C y 5 °C durante 1 semana y tres ciclos de congelación-descongelación por SE-HPLC. Se realizaron estudios de estabilidad en condiciones extremas con AAPH en ausencia de metionina o en presencia de metionina (3, 3,5 y 5 mM) para evaluar el potencial de oxidación de metioninas de unión al receptor claves y el valor protector de metionina añadida. Estos estudios demuestran que la estabilidad física y química de la proteína de fusión IL-22 Fc formulada a 10 mg/ml para una composición farmacéutica que contiene fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, metionina 5 mM, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1 es aceptable para su uso como composición farmacéutica, y que la fabricación de la proteína de fusión IL-22 Fc es soportable en esta formulación.

Materiales y procedimientos

Materiales

El material de partida de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM y pH 5,5 se almacenó a 5 °C antes del inicio del estudio. Este material se usó para los cribados de formulación 1-3, así como para los estudios de agitación y congelación/descongelación. Se realizaron estudios preliminares de AAPH con el estándar analítico (sin metionina) y se realizaron estudios posteriores con la proteína de fusión IL-22 Fc formulada con metionina 0, 3, 3,5 y 5 mM.

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 1

Se evaluó la estabilidad de la proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de la composición farmacéutica inicial a 10 mg/ml en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5, polisorbato 20 (PS20) al 0,02 % (p/v) para el cribado de formulación preliminar. El material se filtró de forma estéril y se rellenó asépticamente 1,0 ml en viales Forma Vitrum de 2 cm3 esterilizados en autoclave en una campana de flujo laminar. Los viales se taparon con tapones Daikyo de 13 mm de diámetro, se sellaron con sellos de tapa abatible de aluminio y se almacenaron en vertical a -20 °C, 5 °C, 25 °C y 40 °C. Las muestras se analizaron por SE-HPLC y DSC.

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 2

El material de partida a 10 mg/ml se dializó frente a acetato de histidina 10 mM y sacarosa 240 mM, pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5 y pH 7,0, respectivamente, con un casete de diálisis Thermo Scientific. Después de la diálisis, se añadió PS20 a una concentración final de 0,02 % (p/v). La concentración de proteína después de la etapa de diálisis y dilución se determinó volumétricamente. Para establecer el cribado de formulación, el material a pH 5,5, 6,0, pH 6,5 y pH 7,0 se filtró de forma estéril, y se rellenó asépticamente 1,0 ml en viales Forma Vitrum de 2 cm3 esterilizados en autoclave en una campana de flujo laminar. Los viales se taparon con tapones Daikyo de 13 mm de diámetro, se sellaron con sellos de tapa abatible de aluminio y se almacenaron en vertical a -20 °C, 5 °C, 25 °C y 30 °C. Una visión general de este cribado se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 3

El material de partida a 10 mg/ml se dializó frente a fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 0,02 % (p/v), pH 6,5, pH 7,0, pH 7,3, 7,6 y Tris 20 mM pH 7,3, respectivamente, con un casete de diálisis Thermo Scientific. La concentración de proteína después de la etapa de diálisis y dilución se determinó volumétricamente. Para establecer el cribado de formulación, el material a pH 6,5, pH 7,0, pH 7,3, pH 7,6 y tris pH 7,3 se filtró de forma estéril y se rellenó asépticamente 1,0 ml en viales Forma Vitrum de 2 cm3 esterilizados en autoclave en una campana de flujo laminar. Los viales se taparon con tapones Daikyo de 13 mm de diámetro, se sellaron con sellos de tapa abatible de aluminio y se almacenaron en vertical a -20 °C, 5 °C, 25 °C y 30 °C. Una visión general de este cribado se muestra en la tabla 2.

Tabla 2

Estudios de agitación de proteína de fusión IL-22 Fc

El estudio de agitación se realizó a temperatura ambiente con niveles variables de PS20. El material de partida a 10 mg/ml se formuló en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, pH 7,1 que contenía PS20 al 0,0 %, 0,01 %, 0,02 % y 0,04 % (p/v). Las formulaciones de proteína se filtraron de forma estéril y se rellenaron en viales de 2 cm3 con 1,0 ml como se describe anteriormente. Los viales se colocaron en orientación horizontal y se sometieron a agitación continua usando un agitador de sobremesa a una velocidad de 50 ciclos por minuto (velocidad del motor de 70) a temperatura ambiente durante 24 horas. Las muestras de control (PS20 al 0,0 %) se colocaron junto a las muestras agitadas a temperatura ambiente sin agitación.

Estudios de estabilidad de congelación-descongelación de proteína de fusión IL-22 Fc

La estabilidad de composiciones farmacéuticas de proteína de fusión IL-22 Fc congeladas-descongeladas en viales se evaluó en formulaciones que contenían fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 0,02 % (p/v) a pH 6,5, 7,0, 7,3 y 7,6, como así como una formulación que contenía los mismos excipientes, excepto con un tampón de Tris 20 mM a pH 7,3. Las formulaciones de proteína se filtraron de forma estéril y se rellenaron en viales de 2 cm3 con 1,0 ml como se describe anteriormente. Los viales se colocaron a -20 °C durante T=0 y 1 semana. Los viales se congelaron y descongelaron un total de tres veces a temperatura ambiente. Solo se analizaron los ciclos T=0 y tercero de congelación-descongelación.

Estudios de estabilidad en condiciones extremas con AAPH para determinar el nivel de metionina en la formulación

El propósito de este estudio fue generar muestras degradadas usando diclorhidrato de 2,2'-azobis-2-metilpropanimidamida (AAPH) para respaldar el desarrollo del ensayo y explorar la oxidación de la proteína de fusión IL-22 Fc. Las formulaciones de composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 0,02 % (p/v), pH 7,1 con metionina 0, 3 y 3,5 mM se sometieron a condiciones extremas con AAPH. Las muestras se incubaron con AAPH 1 mM durante 24 horas a 40 °C. Tras la finalización de las condiciones extremas con AAPH, se intercambió el tampón de las muestras por tampón de formulación, se alicuotaron y se congelaron a -70 °C para el análisis posterior. Las muestras anteriores se compararon con la proteína de fusión IL-22 Fc, fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 0,02 %, pH 7,1, metionina 5 mM, previamente en condiciones extremas de forma idéntica.

Ensayos

Color, apariencia y claridad

El color, la apariencia y la claridad de las muestras se evaluaron visualmente bajo luz fluorescente blanca usando una estación de inspección de luz con un fondo blanco y negro.

pH

El pH de la solución se midió usando un medidor de pH SevenMulti Mettler Toledo con un microelectrodo Beckman Coulter. Antes de la prueba, se realizó la estandarización del medidor de pH. Para la calibración se usaron soluciones estándar de pH 7,0 y pH 4,0.

Concentración de proteína volumétrica (Dosis)

Se usó un Agilent 8453 para medir la concentración de proteína o la dosis por absorción. Antes de la medición, las muestras se diluyeron volumétricamente a ~0,5 mg/ml con los respectivos tampones de formulación. La absorción se midió en una cubeta de cuarzo con una longitud de paso de 1,0 cm. El instrumento realizó los blancos con los respectivos tampones de formulación. La concentración de proteína se calculó usando absorbancias a 280 nm (Amáx) y 320 nm (A³²⁰) y un coeficiente de extinción (£) de 0,98 (mg/ml)'1 cm1.

(Amáx - A3

Concentración (mg/ml) = ^2o) x factor de dilución (ml/ml)

£ x longitud de paso celular (cm)

Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC)

La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó con un HPLC Agilent 1100. La separación se realizó en una columna de 30 cm TOSOH Bioscience TSKgel G3000SWXL a temperatura ambiente. La fase móvil se mantuvo a un caudal de 0,5 ml/min. Las muestras se inyectaron sin diluir para el cribado de formulación 1, pero se diluyeron hasta 2 mg/ml en fase móvil de fosfato de potasio 0,20 M, cloruro de potasio 0,25 M, pH 6,2 ± 0,1 antes de la inyección para cribados posteriores. Se detectó una inyección de 50 |jg de proteína por muestra a 280 nm. El tiempo de desarrollo de cada muestra fue de 30 minutos. Se realizaron blancos de reactivo con los respectivos tampones de formulación. Las áreas de pico se integraron con respecto al valor de referencia.

Isoelectroenfoque capilar por imagen (iCIEF)

Se evaluó la distribución de variantes de carga por un analizador ÍCE280 (ProteinSimple) con microinyector PrinCE y un cartucho capilar recubierto de fluorocarbono de 100 pm x 5 cm (ProteinSimple). Para retirar el residuo de lisina C terminal de la cadena pesada, se añadió carboxipeptidasa B (CpB) a cada muestra después de la etapa de dilución en una proporción de enzima con respecto a sustrato de 1:1000 (p/p). Además, se añadió sialidasa A para retirar el ácido siálico. Después de la adición de CpB y sialidasa A, las muestras se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Las muestras incubadas se mezclaron con la solución de anfolito que consistía en una mezcla de 700 |jl de metilcelulosa al 1 %, 1218 j l de agua purificada, 8 j l de Pharmalyte 8-10,5, 55 j l de Pharmalyte 5-8, 15 j l de marcador p 5,12, 4 j l de marcador pl 7,05. Las muestras se enfocaron introduciendo un potencial de 1500 V durante 1 minuto, seguido de un potencial de 3000 V durante 5 minutos con el anolito de ácido fosfórico 80 mM, y el catolito de hidróxido de sodio 100 mM, ambos en metilcelulosa al 0,1 %. Se obtuvo una imagen de las variantes de carga enfocadas pasando luz ultravioleta (UV) de 280 nm a través del capilar y dentro de la lente de una cámara digital con dispositivo de carga acoplado.

Estabilidad térmica por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y fluorescencia de triptófano intrínseca

DSC es una técnica termoanalítica en la que la diferencia en la cantidad de calor requerida para incrementar la temperatura de una muestra se mide como una función de la temperatura linealmente. Los puntos de fusión Tf y la temperatura de inicio de la fusión pueden determinar la sensibilidad de la proteína al desplegado térmico. La molécula de fusión se funde a temperatura mucho menor que los anticuerpos monoclonales de longitud completa. Por lo tanto, se empleó DSC para evaluar rápidamente el efecto del pH sobre la estabilidad térmica para guiar además el desarrollo de la formulación. La proteína de fusión IL-22 Fc se diluyó hasta 1 mg/ml en tampones con formulaciones de pH diferentes (pH 5,5-7,6). Las muestras se cargaron en una placa de 96 pocillos, alternando con pocillos que contenían 500 j l de tampones de formulación del correspondiente pH. El instrumento barrió cada par muestras-tampón en el intervalo de temperatura de 15-95 °C a una tasa de 1 °C/min. El análisis de datos se realizó usando el programa informático Origin (Originlab, Northampton, MA).

Los estudios de desnaturalización térmica usando espectros de emisión de fluorescencia de triptófano intrínseca se llevaron a cabo usando un espectrómetro Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4 con un baño de agua circulante Thermo Scientific NESLAB RTE 7. Se obtuvo un espectro de emisión de triptófano de 300 a 450 nm tras excitación a 295 nm. La medición se repitió a intervalos de 2 °C de aproximadamente 5 a 65 °C. Se siguió la intensidad de fluorescencia a 350 nm (Ámáx) para evaluar el cambio en el pico de fluorescencia a lo largo de la rampa térmica. Las curvas de desplegado se generaron usando el análisis de componentes principales de todos los espectros obtenidos y la Tinicio se definió como el primer cambio en la pendiente en la curva de desplegado.

Cartografía de péptidos trípticos (oxidación de metionina)

Se usó el análisis cartográfico de péptidos por cromatografía de líquidos de alta resolución y espectrometría de masas en tándem (CL-EM-EM) para evaluar la oxidación de metionina. Las muestras de péptido de fusión IL-22 Fc se sometieron a condiciones desnaturalizantes con clorhidrato de guanidinio, seguido de reducción con ditiotreitol (DTT) y carboximetilación de cisteínas con ácido yodoacético (IAA). Las muestras reducidas y carboximetiladas se digirieron a continuación con enzima tripsina durante 4 horas a 37 °C para generar péptidos trípticos. Los péptidos trípticos resultantes se separaron por un RP-HPLC Agilent 1200 acoplado a un espectrómetro de masas con capacidad EM-EM Thermo OrbiTrap Elite III. El análisis de datos de la mezcla de péptidos trípticos separados se realizó usando el programa informático Thermo Xcalibur. Existen ocho péptidos trípticos que contienen metionina en la proteína de fusión IL-22 Fc. Los cromatogramas de iones extraídos (EIC) para las masas de los péptidos trípticos que contienen metionina natural se compararon con los EIC de las masas de péptidos que contenían metionina oxidada (si se observa). Se informa de la oxidación de metionina para cada péptido tríptico como un porcentaje de la proporción de péptido tríptico oxidado con respecto a la del péptido tríptico total (natural oxidado).

Ensayo de potencia

El ensayo de potencia de la proteína de fusión IL-22 Fc mide la capacidad de la proteína de fusión IL-22 Fc para unirse al dominio extracelular (ECD) de IL22-R1a. En el ensayo, se añadieron concentraciones variables de muestras, control y estándar de referencia de proteína de fusión IL-22 Fc a una placa de 96 pocillos recubierta con ECD IL22-R1a. La proteína de fusión IL-22 Fc unida se detectó con anticuerpo caprino anti-IgG humana-HRP y una solución de sustrato de tetrametilbencidina. Los resultados, expresados en unidades de densidad óptica (DO), se representaron frente a concentraciones de proteína de fusión IL-22 Fc y se usó un programa de curvas paralelas para calcular la potencia medida de la(s) muestra(s) de proteína de fusión IL-22 Fc en relación con el estándar de referencia.

Para determinar el valor de potencia relativa corregido: en primer lugar, se determinó la potencia relativa prevista (y) para una muestra introduciendo el valor SA (x) para una muestra y resolviendo la ecuación de la línea de correlación (y = 178,25 - 10,604x). A continuación, se restó de 100 el valor de potencia relativa prevista (y). A continuación, este valor se añadió a la potencia relativa medida para obtener el valor de potencia relativa corregido para la muestra: Potencia relativa corregida = potencia relativa medida (100 - y).

Se siguió el nivel de SA en la(s) muestra(s) y se controló usando un procedimiento analítico específico para SA en el sistema de control. El criterio de aceptación en el sistema de control para el contenido de SA es 8 - 12 mol/mol. El estándar de referencia tiene un contenido de SA de 8 mol/mol, que está en el extremo inferior de los criterios de aceptación para SA. Por lo tanto, debido solo a la correlación negativa entre SA y potencia, las muestras con un contenido de SA mayor de 8 mol/mol podrían parecer artificialmente que son subpotentes. El uso de la línea de correlación para generar valores de potencia relativa corregidos proporciona una corrección que es específica para el contenido de SA de cada muestra. La especificidad de la corrección para cada muestra mantiene la capacidad del ensayo de potencia para detectar cambios moleculares que podrían quedar oscurecidos por un valor de corrección fijo que puede compensar en exceso el impacto de SA en la potencia.

Resultados

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 1

Se usó como prueba inicial una composición farmacéutica que tenía proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5, PS20 al 0,02 % (p/v). Después de una semana a 40 °C, los resultados por análisis SE-HPLC demostraron incrementos en especies de muy alto peso molecular (vHMWS), indicativo de desnaturalización térmica (tabla 3 y fig. 1). Esto se confirmó por medición de DSC de la temperatura de fusión inicial (Tf) de la proteína de fusión IL-22 Fc, que fue de aproximadamente 34 °C (fig. 2A). Esto dio lugar a una preocupación por la estabilidad física de la proteína de fusión IL-22 Fc después de la administración. Por lo tanto, se midió la Tf para la proteína de fusión IL-22 Fc en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 para imitar las condiciones fisiológicas (fig. 2B).

Tabla 3: SE-HPLC de proteína de fusión IL-22 Fc a 10 mg/ml en acetato de histidina 20 mM, sacarosa 240 mM, PS20 al 002 % /v a H 55 cribado 1

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 2

El resultado de DSC con PBS a pH 7,4 sugirió inesperadamente que la proteína de fusión IL-22 Fc podría tener mejor estabilidad térmica a pH mayor. Esto dio lugar a una segunda ronda de DSC con material formulado en acetato de histidina 10 mM a pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5 y pH 7,0. Los resultados de DSC, así como los estudios de desnaturalización térmica que utilizan seguimiento de fluorescencia (fluorescencia de Trp) demostraron que a medida que se incrementa el pH de la formulación, la Tf también se incrementa hasta ~12 °C a pH 7,0 (tabla 4 y figs. 3A-3D). El análisis de la proteína de fusión IL-22 Fc en condiciones térmicamente extremas en estas formulaciones por SE-HPLC demostró que la proteína de fusión IL-22 Fc logra la estabilidad física en torno a pH 6,5 y 7,0, mientras que se observaron incrementos en HMWS a pH 5,5 y 6,0 (fig. 3E). Por tanto, se inició un cribado final con un objetivo de pH 7,0 en tampones de pKa más apropiado para establecer el intervalo de pH aceptable para la proteína de fusión IL-22 Fc.

Tabla 4: T ^f medida por DSC y fluorescencia de Trp de la proteína de fusión IL-22 Fc en acetato de histidina 10 mM a pH 5,5, 6,0, 6,5 y 7,0 (cribado 2)

Cribado de formulación de proteína de fusión IL-22 Fc 3

El cribado de formulación final se estableció a pH 6,5, 7,0, 7,3 y 7,6 en fosfato de sodio 10 mM y a pH 7,3 en Tris 20 mM. Estas formulaciones se evaluaron en primer lugar por DSC para determinar la Tf de inicio (fig. 4). Por DSC, parecía haber ganancias más pequeñas en la estabilidad térmica más allá de pH 7,3. A la temperatura de almacenamiento recomendada de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc a 5 °C, no se observaron cambios para todas las formulaciones a pH 6,5, 7,0, 7,3 y 7,6 después de 6 semanas de almacenamiento por SE-HPLC e ICIEF (tablas 5-9). No hubo cambios en la apariencia visual, pH y dosis para todas las formulaciones a -70 °C, -20 °C, 5 °C, 25 °C, 30 °C y 40 °C para todos los puntos temporales. Después de 6 semanas a 30 °C (figs. 5A-5B) y 2 semanas a 40 °C (figs. 5C-5D), las tasas de degradación por SE-HPLC para las formulaciones a pH 7,0, 7,3 y 7,6 fueron comparables. A partir de los datos a 30 °C, la tasa de degradación fue mayor a pH 6,5 y consecuente con los resultados de DSC. La pérdida del pico principal se debió predominantemente a un incremento de HMWF (forma de alto peso molecular) con un incremento más pequeño observado en LMWF (forma de bajo peso molecular). A 30 °C después de 4 semanas (fig. 6) hubo una clara tendencia de ICIEF hacia una degradación más rápida y una tasa más rápida de formación de picos ácidos a medida que el pH se incrementaba de 7,0 a 7,3 a 7,6. Hubo poca diferencia entre pH 6,5 y 7,0 en las tasas de degradación. No se observó pérdida en el ensayo de potencia después del almacenamiento durante 4 semanas a 30 °C y 1 semana a 40 °C, pH 7,0 (tabla 10). Este cribado de formulación sugirió que una composición farmacéutica que contiene 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc en fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 %, a pH 7,1 proporcionaría un equilibrio para mantener la estabilidad tanto física como química. Por lo tanto, se seleccionó un pH de 7,1 para la formulación farmacéutica.

Tabla 5: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,5 almacenada a -70, 20, 5, 25, 30 y 40 °C durante hasta 6 semanas (cribado 3)

Tabla 6: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,0 almacenada a -70, 20, 5, 25, 30 y 40 °C durante hasta 6 semanas (cribado 3)

Tabla 7: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,3 almacenada a -70, 20, 5, 25, 30 y 40 °C durante hasta 6 semanas (cribado 3)

Tabla 8: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,6 almacenada a -70, -20, 5, 25, 30 y 40 °C durante hasta 6 semanas (cribado 3)

Tabla 9: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de Tris 20 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,3 almacenada a -70, -20, 5, 25 y 30 °C durante hasta 6 semanas (cribado 3)

Tabla 10: estabilidad de la potencia de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,0 almacenado a 30 °C hasta 4 semanas y a 40 °C durante hasta 1 semana (cribado 3)

Estudios de agitación de proteína de fusión IL-22 Fc

Para determinar el efecto de PS20 sobre la estabilidad de proteína, se realizó un estudio de agitación de proteína con la proteína de fusión IL-22 Fc. Los resultados de los estudios de agitación no demostraron diferencias entre las muestras con PS20 al 0,01 %, 0,02 % y 0,04 % después de 24 horas de agitación en comparación con los controles sin agitación por CAC, SE-HPLC, ICIEF y turbidez (tabla 11 y fig. 7). Se observó un pequeño incremento en los agregados en la muestra agitada que no contenía tensioactivo, con un pequeño incremento en la turbidez y no se observaron partículas visibles. El estudio sugiere que un 0,01 % de PS20 es suficiente para proteger la proteína de fusión IL-22 Fc durante la agitación. Se seleccionó PS20 al 0,02 % (p/v) en la formulación final para garantizar la capacidad de fabricación en el intervalo de especificación de PS20 al 0,01 % - 0,03 % (p/v).

Tabla 11: estabilidad de agitación de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, metionina 5 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1

Congelación-descongelación de proteína de fusión IL-22 Fc

Después de tres ciclos de congelación a -20 °C y descongelación a temperatura ambiente, no hubo cambios por CAC, pH, dosis y SE-HPLC (tabla 12). Por tanto, la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc es suficientemente tolerante a ciclos repetidos de congelación-descongelación durante el procedimiento de fabricación.

Tabla 12: estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en la formulación de fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, metionina 5 mM, pH 7,0 después de tres ciclos de congelación/descongelación (F/T)

Estudios de condiciones extremas con AAPH

Los estudios iniciales con tratamiento con AAPH del estándar analítico de proteína de fusión IL-22 Fc mostraron susceptibilidad de metioninas clave (M25 y M139) a la oxidación (fig. 8). Por lo tanto, se añadió metionina 5 mM a la formulación para proteger estos residuos de metionina. Adicionalmente, las muestras que contenían metionina 3,5 mM y 3 mM se sometieron a condiciones extremas con AAPH y se analizaron para determinar si los niveles menores que el nivel objetivo de metionina 5 mM proporcionarían protección contra la oxidación de metionina. Se usó el análisis cartográfico de péptidos trípticos por cromatografía de líquidos de alta resolución y espectrometría de masas en tándem (CL-EM-EM) para evaluar la oxidación de metionina. Los datos de cartografía de péptidos trípticos del lote de referencia formulado con muestras tratadas con AAPH 3,5 mM y 3 mM se compararon con el lote de referencia formulado con metionina 5 mM y tratado o bien no tratado con ^a A ^p H. Los datos indican que la oxidación de metionina no incrementa significativamente en las muestras de metionina 3 mM o 3,5 mM en comparación con el material formulado con metionina 5 mM (tabla 13). Por tanto, se fijó metionina 3 mM como el extremo menor de la concentración aceptable con el propósito de establecer los criterios de aceptación.

Tabla 13: resultados de CL-EM-EM para cartografía de péptidos trípticos de estudios de condiciones extremas con AAPH

Conclusiones

Este estudio muestra que la proteína de fusión IL-22 Fc es adecuada para su uso cuando se formula a 10 mg/ml para una composición farmacéutica que contiene fosfato de sodio 10 mM, sacarosa 240 mM, metionina 5 mM y polisorbato 20 al 0,02 %, pH 7,1. Para proteger la proteína de fusión IL-22 Fc de condiciones extremas de agitación, son adecuadas concentraciones de polisorbato de entre un 0,01 y un 0,04 %. 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc en esta formulación fue estable a -20 °C y 5 °C durante 6 semanas y después de 3 ciclos de congelación a -20 °C y descongelación a temperatura ambiente.

Ejemplo 2: desarrollo de la composición farmacéutica de la invención

Descripción y composición de la composición farmacéutica de la invención (proteína de fusión IL-22 Fc, líquido estéril, 10 mg/ml)

La proteína de fusión IL-22 Fc se proporciona como una solución estéril de color amarillo ligeramente pardusco para infusión intravenosa y no contiene conservantes. Cada vial de 2 ml de un solo uso contiene 10 mg (nominales) de proteína de fusión IL-22 Fc a un pH objetivo de 7,1. La composición farmacéutica de la invención se formula como 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc con la composición dada en la tabla 14.

Tabla 14: composición de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc

Composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc

La proteína de fusión IL-22 Fc es el único ingrediente activo en la composición farmacéutica. No existe incompatibilidad entre los excipientes en la formulación y el fármaco activo, como se demuestra por los datos de estabilidad de la composición farmacéutica y la proteína de fusión IL-22 Fc.

Excipientes

La tabla 15 contiene una lista de los excipientes usados en la composición farmacéutica de la invención con sus correspondientes funciones y concentraciones.

Tabla 15: excipientes

Desarrollo de la formulación farmacéutica

Se desarrolló una formulación farmacéutica de un solo uso diseñada como una solución para infusión intravenosa (i.v.) de la proteína de fusión IL-22 Fc. La composición farmacéutica de la invención está compuesta por 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc en fosfato de sodio 10 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

Para seleccionar la formulación farmacéutica para la proteína de fusión IL-22 Fc, se realizaron estudios de formulación que demostraron que la proteína de fusión IL-22 Fc tiene una estabilidad aceptable en una solución que contiene fosfato de sodio, metionina, sacarosa y polisorbato 20 a pH 7,1. En base a los resultados de este estudio, la formulación de la composición farmacéutica se definió como 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc en fosfato de sodio 10 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

Excedentes

La formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc no contiene ningún excedente.

Propiedades fisicoquímicas y biológicas

Todas las pruebas de caracterización se realizaron en la proteína de fusión IL-22 Fc. La composición permanece estable en las condiciones de almacenamiento recomendadas de 2 °C-8 °C cuando se protege de la luz. Como medida de precaución, se usa un filtro en línea (0,2 |jm) para administración i.v. del material clínico.

El seguimiento de partículas subvisibles de > 2 jm y > 5 jm de tamaño se llevará a cabo como caracterización prolongada (además de > 10 jm y > 25 jm , que son parte de la estrategia de control) usando el procedimiento de oscurecimiento de la luz durante el desarrollo. Estas evaluaciones se llevarán a cabo como parte de la caracterización prolongada realizada con la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc en el momento de la liberación y en la estabilidad.

Resultados del estudio de estabilidad de congelación/descongelación

Se siguió la estabilidad de congelación/descongelación para el lote estándar de referencia de proteína de fusión IL-22 Fc después de tres ciclos de congelación a - 20 °C y descongelación a temperatura ambiente. No se observaron cambios en la calidad del producto después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Atributos microbiológicos

La formulación líquida de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc no contiene conservantes.

Compatibilidad

Infusión intravenosa

Para la administración i.v., la formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc (10 mg/ml) se administrará por infusión después de dilución con solución isotónica de cloruro de sodio (NaCl al 0,9 %) y diluyente, que es el tampón de formulación sin metionina (fosfato de sodio 10 mM), sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 % [p/v], pH 7,1). La compatibilidad y estabilidad del ingrediente activo se sometió a prueba en las siguientes condiciones de preparación/administración simuladas.

a) Dilución de la formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc Lote clínico 1 con diluyente y diluida en bolsas de solución salina en el intervalo de 0,025-0,5 mg/ml para cubrir el intervalo de dosis para la administración i.v. en el estudio clínico.

b) Exposición a corto plazo a bolsas de infusión que contienen solución isotónica de cloruro de sodio (material de superficie de contacto del producto de bolsa que consiste en poli(cloruro de vinilo) [PVC] y poliolefina [PO]) para compatibilidad i.v.).

c) Uso de líneas de infusión i.v. y dispositivos de infusión con superficies de contacto del producto de poli(cloruro de vinilo) (PVC), polietileno (PE), policarbonato (PC) y poliéteruretano (PEU).

d) Uso de filtros en línea de 0,2 |jm para compatibilidad i.v. (filtro de membrana de polietersulfona [PES]. Para administración i.v., se sometieron a prueba muestras de bolsas de solución salina después de 24 horas de almacenamiento a 2 °C-8 °C y 24 horas a 30 °C con exposición a luz difusa seguida de paso a través de la línea de infusión y el filtro en línea. A la concentración más baja en la bolsa de solución salina, fue necesario prediluir la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc con diluyente antes de añadirla a la bolsa de solución salina para garantizar un pH adecuado para mantener la estabilidad del producto.

Las muestras se sometieron a prueba usando procedimientos apropiados para evaluar la calidad del producto como sigue: pureza por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y electroforesis-isoelectroenfoque capilar por imagen (clEF) (para muestras > 1 mg/ml), concentración de proteína (por ultravioleta), partículas subvisibles por oscurecimiento de luz, color, claridad/opalescencia y pH. Se estableció una muestra a 2 mg/ml en las bolsas de solución salina y se sometió a ensayo por cIEF por imagen para demostrar que la solución salina no tuvo un impacto negativo en la estabilidad química del producto.

Fórmula de lote (proteína de fusión IL-22 Fc, líquido estéril, 10 mg/ml)

La solución de composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc formulada permanece sin cambios con respecto a la concentración y composición en comparación con la solución de proteína de fusión IL-22 Fc, es decir, no se realiza ninguna mezcla ni dilución adicional durante el procedimiento de fabricación de la composición farmacéutica. El tamaño de la composición farmacéutica a granel es de cinco (5) litros. El tamaño de lote real está sujeto a cambios. La tabla 16 contiene información de formulación de lote para la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc.

Tabla 16: fórmula de lote para la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc

Ejemplo 3: prueba de estabilidad prolongada de la proteína de fusión IL-22 Fc

Prueba de estabilidad prolongada del lote clínico 2 y el lote estándar de referencia de la proteína de fusión IL-22 Fc

Procedimientos y criterios de aceptación

Todas las muestras se analizaron usando los procedimientos de prueba enumerados en la tabla 17. La estabilidad representativa se evalúa a intervalos de tiempo específicos usando el protocolo proporcionado en la tabla 18.

Tabla 17: procedimientos de prueba para evaluar la estabilidad de la proteína de fusión IL-22 Fc

 Resultados

Los resultados de la prueba de estabilidad prolongada de la proteína de fusión IL-22 Fc del lote clínico 2 y 5 el lote estándar de referencia, llevados a cabo a -20 °C y 5 °C como se describe anteriormente, se presentan en la tabla 19 y la tabla 20.

Tiempo de vida útil y almacenamiento recomendado

La condición de almacenamiento recomendada para la proteína de fusión IL-22 Fc es < -20 °C. Con almacenamiento a -20 °C durante hasta 48 meses y a 5 °C durante hasta 6 meses, no se observaron cambios significativos en la concentración de proteína, pH, color, claridad, potencia, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), isoelectroenfoque capilar por imagen (icIEF) y electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio (CE-SDS) no reducida (NR) (tabla 20). Los resultados de las pruebas de estabilidad presentados aquí demuestran que la proteína de fusión IL-22 Fc es estable durante 48 meses a -20 °C. Estos datos respaldan un tiempo de vida útil de 60 meses o más a -20 °C. Adicionalmente, la proteína de fusión IL-22 Fc se puede almacenar hasta un mes a 5 °C. La proteína de fusión IL-22 Fc se almacenó en una bolsa de bioproceso de 50 cm3 y se siguió la estabilidad de congelación-descongelación después de tres ciclos de congelación a -20 °C y descongelación a temperatura ambiente. La bolsa de bioproceso se descongeló en los puntos temporales de 1, 2 y 3 meses, de modo que los datos a los 3 meses representan tres ciclos de congelación/descongelación. No se observaron cambios significativos en la concentración de proteína, pH, color, claridad, potencia, SEC, icIEF y CE-SDS después de 3 ciclos de congelación a -20 °C y descongelación a temperatura ambiente. Por lo tanto, la proteína de fusión IL-22 Fc se puede congelar a -20 °C y descongelarse durante al menos tres ciclos.

Prueba de estabilidad prolongada del lote clínico 1 y el lote estándar de referencia de la proteína de fusión IL-22 Fc

La composición farmacéutica de la proteína de fusión IL-22 Fc es una formulación líquida suministrada en viales de 2 ml de un solo uso de USP/Ph. Eur. Glass de tipo I que contienen 10 mg (nominales) de proteína de fusión IL-22 Fc. La formulación farmacéutica de la invención se formula como 10 mg de proteína de fusión IL-22 Fc en fosfato de sodio 10 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, polisorbato 20 al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

Se inició un estudio de estabilidad de la composición farmacéutica con el lote clínico 1 de proteína de fusión IL-22 Fc. Adicionalmente, se iniciaron estudios representativos de estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc con el lote estándar de referencia (tabla 21). La estabilidad se siguió a temperaturas de 5 °C y 25 °C para ambos lotes.

Se somete a prueba el almacenamiento prolongado a 5 °C ± 3 °C y se realizaron estudios de estabilidad acelerada a 25 °C ± 2 °C (60 % de humedad relativa [HR] ± 5 % de HR). A continuación, las temperaturas se indican como 5 °C y 25 °C, respectivamente.

Procedimientos y criterios de aceptación

Todas las muestras se analizaron usando los procedimientos de prueba enumerados en la tabla 21. La estabilidad representativa se evaluó a intervalos de tiempo específicos utilizando el protocolo proporcionado en la tabla 22 y tabla 23.

Tabla 21: procedimientos de prueba para evaluar la estabilidad de la formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc

Tabla 22: protocolo de estabilidad para estudios de estabilidad de formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc-Condición del estudio: 5 °C

Tabla 23: protocolo de estabilidad para estudios de estabilidad de formulación farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc-Condición del estudio: 25 °C

Resultados

Los resultados de la prueba de estabilidad prolongada de la proteína de fusión IL-22 Fc del lote clínico 1 y el lote estándar de referencia, llevados a cabo a -20 °C y 5 °C como se describe anteriormente, se presentan en la tabla 24 y la tabla 25.

Los datos de estabilidad de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc principal mostraron tendencias similares a las observadas en el estudio de estabilidad de apoyo. Los datos de estabilidad respaldan una fecha de caducidad de 42 meses (36 meses de datos en tiempo real más 6 meses de fecha provisional) a 5 °C para la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc.

Los resultados de los estudios de estabilidad de apoyo demostraron una disminución de 0,7 en porcentaje del pico principal por SE-HPLC observada a los 36 meses principalmente con un incremento en la concentración de dímero. Se observó una disminución de 5 en porcentaje de pico principal por iCIEF principalmente con un incremento en picos ácidos. No se observó ningún cambio en la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc durante un máximo de 36 meses de almacenamiento a 5 °C por los otros procedimientos. No se observó ningún cambio en la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc hasta un mes de almacenamiento a 25 °C. Se observaron cambios en la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc después del almacenamiento a 25 °C durante seis meses. El cIEF por imagen demostró una disminución del 17,6 en porcentaje de pico principal principalmente con un incremento de 18,3 en porcentaje de picos ácidos. Se observó una disminución de 1,3 en porcentaje de pico principal por SE-HPLC, principalmente con un incremento de 1,2 en porcentaje de especies de mayor peso molecular (HMWS). Se observó una disminución de 2,7 en porcentaje del pico principal por CE-SDS no reducida, principalmente con un incremento de 2,1 en porcentaje de área del pico corregida (%CPA) en la suma de picos previos. Se observó una pérdida de un 29 % de potencia relativa después del almacenamiento a 25 °C durante 6 meses, mientras que no se observó ningún cambio en la potencia después del almacenamiento a 25 °C durante tres meses. No se observaron cambios en los ensayos restantes a 25 °C durante seis meses.

Prueba comparativa de estabilidad en condiciones extremas del lote clínico 3 y lote estándar de referencia de proteína de fusión IL-22 Fc

La comparabilidad entre la composición farmacéutica del lote estándar de referencia de proteína de fusión IL-22 Fc y la composición farmacéutica clínica se estableció usando el lote estándar de referencia y el lote clínico 3 de proteína de fusión IL-22 Fc (tabla 26). El material de ambos lotes se rellenó manualmente en viales de vidrio de 2 ml hasta un volumen de relleno de 1 ml. Estos materiales se evaluaron a continuación en condiciones extremas de 40 °C.

Tabla 26: datos comparativos de estabilidad en condiciones extremas para el lote estándar de referencia y lote clínico 3 de composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc (cont.)

Abreviaturas: CE-SDS-NGS = electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio sin

tamizado de gel; cIEF = isoelectroenfoque capilar; CL = transparente; CPA = área

de pico corregida; HMW = alto peso molecular; LIQ = líquido; LMW = bajo peso

molecular; NR = no requerido; PFFP = prácticamente sin partículas; SE-HPLC =

cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño.

Resultados

Los resultados de este estudio demuestran que las tasas de degradación de los dos materiales son comparables en base a una disminución de 2 - 4 en porcentaje de pico principal por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC), una disminución de 15 - 16 en porcentaje de pico principal por isoelectroenfoque capilar por imagen (cIEF) una disminución de 2 en porcentaje de pico principal por electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio sin tamizado de gel (CE-SDS-NGS) y una disminución de 28 - 33 en % de potencia relativa después del almacenamiento a 40 °C durante dos semanas. Además, los perfiles cromatográficos son comparables y no se observaron nuevos picos en el lote clínico en comparación con el lote de desarrollo después del almacenamiento a 40 °C durante dos semanas. Los lotes de composición farmacéutica clínica y estándar de referencia de proteína de fusión IL-22 Fc tienen una estabilidad comparable en base a los datos presentados. Por lo tanto, los datos de estabilidad del lote estándar de referencia se usaron para asignar el tiempo de vida útil para la composición farmacéutica clínica.

Tiempo de vida útil y almacenamiento recomendado

La condición de almacenamiento recomendada para la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc es de 5 °C ± 3 °C, protegida de la luz. El tiempo de vida útil se prolongará en base a los datos de estabilidad disponibles. La composición farmacéutica de proteína de fusión iL-22 Fc es estable durante 36 meses a 5 °C ± 3 °C. En base a los datos disponibles, el tiempo de vida útil inicial de la composición farmacéutica de proteína de fusión IL-22 Fc se establece actualmente en 42 meses si se almacena a 5 °C ± 3 °C, protegida de la luz.

Resultados de validación de los procedimientos analíticos

La tabla 27 muestra los resultados de validación de los procedimientos analíticos.

Tabla 27: validación de los procedimientos analíticos

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión IL-22 Fc y un vehículo, comprendiendo la proteína de fusión IL-22 Fc un polipéptido IL-22 unido a una región Fc por un conector, en la que la composición farmacéutica comprende una concentración final

de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc,

metionina aproximadamente 5 mM,

fosfato de sodio aproximadamente 10 mM y sacarosa aproximadamente 240 mM,

y polisorbato 20 aproximadamente al 0,02 % (p/v), pH 7,1.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el fosfato de sodio es una mezcla de fosfato de sodio monobásico y fosfato de sodio dibásico.

3. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la composición farmacéutica comprende aproximadamente 10 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc.

4. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 mg/ml de proteína de fusión IL-22 Fc.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que:

(i) la composición farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria;

(ii) el vehículo es agua;

(iii) la composición farmacéutica es estable a través de uno o más ciclos de congelación-descongelación; (iv) la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 2 semanas o más a aproximadamente 25 °C;

(v) la composición farmacéutica es estable durante aproximadamente 48 meses o más a -20 °C;

(vi) la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 85 % o mayor como se evalúa por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC);

(vii) la composición farmacéutica tiene una pureza de aproximadamente un 75 % o mayor como se evalúa por electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio sin tamizado de gel (CE-SDS-NGS) no reducida (NR);

(viii) la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o tópica; (ix) la composición farmacéutica no contiene ningún conservante; y/o

(x) la composición farmacéutica se formula para su administración por infusión después de dilución con una solución isotónica de cloruro de sodio y/o un diluyente.

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que:

(i) el polipéptido IL-22 está glucosilado;

(ii) la región Fc no está glucosilada;

(iii) el residuo aminoacídico en la posición 297 como en el índice EU de la región Fc es Gly o Ala y/o el residuo aminoacídico en la posición 299 como en el índice EU de la región Fc es Ala, Gly o Val;

(iv) la región Fc comprende el dominio CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4; y/o

(v) la proteína de fusión IL-22 Fc comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína de fusión IL-22 Fc comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:16.

8. La composición de composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína de fusión IL-22 Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8.

9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un agente terapéutico adicional y/o un agente gelificante.

10. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o tópica.

11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como medicamento.

12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en

(i) tratamiento de enfermedad inflamatoria intestinal (EII),

(ii) inhibición de infección microbiana en el intestino, conservación de células caliciformes en el intestino durante una infección microbiana, potenciación de la integridad de células epiteliales, proliferación de células epiteliales, diferenciación de células epiteliales, migración de células epiteliales o cicatrización de heridas epiteliales en el intestino,

(iii) tratamiento de lesión renal aguda o pancreatitis aguda,

(iv) aceleración o mejora de la cicatrización de heridas, o

(v) prevención o tratamiento de una afección cardiovascular.

13. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 12, en la que la EII es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.

14. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 13, en la que la colitis ulcerosa es una colitis ulcerosa de moderada a grave.