KR20080108570A - 신장 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

신장 질환을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

유효량의 VEGFR 효능제, 예를 들어, Flt1 효능제를 대상에게 투여함으로써, 대상에서 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 효능제는 Flt1을 활성화하는데 유용한 VEGFR 효능제, 예를 들어, Flt1, Flt1 리간드, Flt1 소분자 활성인자, 또는 Flt1 선택제에 대해 작용하는 VEGF 항체를 제약상 허용되는 담체 내에 포함하는 조성물로 이루어진다.
신장 질환, VEGFR 효능제, Flt1, Flt1 리간드, Flt1 소분자 활성인자, Flt1 선택제, VEGF 항체

Description

신장 질환을 치료하는 방법 {METHODS FOR TREATING KIDNEY DISORDERS}
관련 출원
본원은 그 명세서의 전문을 본원에 참고로 포함시킨, 2006년 3월 17일 출원된 미국 특허 가출원 60/786,246을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 신장 (신) 질환을 치료하기 위해 VEGFR 효능제 (agonist)를 사용하는 방법을 포함하는, VEGFR 조정제의 치료 용도에 관한 것이다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF-A)는 내피세포 상에 발현된 2개의 티로신 키나제 수용체, Flt1 (VEGFR-1) 및 Flk1 (KDR/VEGFR-2)의 활성화를 통해 내피세포 분화와 생존을 포함한 다양한 혈관 기능을 조절한다 (예를 들어, 문헌 [Ferrara, N., et al., The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9:669-676 (2003)] 참조). 최근 연구에서는 조혈 줄기 세포를 포함한 다양한 비-내피세포 상의 VEGF 수용체 발현을 확인하였고, 이는 VEGF 리간드/수용체 시스템에 대한 비-혈관 조절 기능을 제안한다 (예를 들어, 문헌 [Autiero, M., et al. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders. J Thromb Haemost 1: 1356-1370 (2003)] 참조). 신장 내에서, VEGF 수용체는 사구체전, 사구체, 사구체후 (예를 들어, 문헌 [Thomas, S., et. al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-12433 (2000)] 참조) 및 요세관주위 내피세포뿐만 아니라 사구체 혈관사이 세포 상에서 주로 발견되지만, 족세포 (podocyte) 상에서는 발견되지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Gruden, G., et al., 1997. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA 94: 12112-12116 (1997)]; [Harper, S.J., et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-446 (2001)]; 및 [Takahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226 (4-6) (1995)] 참조). 정상 성인 신장에서, VEGF-A 발현은 사구체 족세포와 요세관 상피 세포에서 가장 현저하고, 혈관사이 세포에서 보다 낮지만, 내피세포에서는 검출가능하지 않다 (예를 들어, 문헌 [Noguchi, K., et al., Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998)]; 및 [Simon, M., et al., Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268:F240-250 issn: 0002-9513 (1995)] 참조). 발현 위치에 기초하여, VEGF-A는 대부분 사구체 및 요세관주위 내피세포를 표적으로 하는 측분비 (paracrine) 또는 근접분비 (juxtacrine) 효과기 기능을 통해 신장 항상성 및 사구체 여과에서 조절 역할을 하는 것으로 생각되었다. 다양한 연구에서 신장 발달 동안 및 신 손상 모델에서 VEGF-A의 역할을 평가하였다 (예를 들어, 문헌 [de Vriese, A.S. et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol 12: 993-1000 (2001)]; [Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003)]; [Kang, D.H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J Am Soc Nephrol 12:1448-57 (2001)]; [Masuda, Y. et al. Vascular endothelial growth factor enhances glomerular capillary repair and accelerates resolution of experimentally induced glomerulonephritis. Am J Pathol 159, 599-608 (2001)]; 및 [Ostendorf, T. et al. VEGFH(165) mediates glomerular endothelial repair. J Clin Invest 104:913-23 (1999)] 참조).
VEGF-A의 조절 곤란은 종양, 당뇨, 및 사구체신염을 포함한 신장병의 실험 모델에서 공통적인 특징이다 (예를 들어, 문헌 [Khamaisi, M., et al. The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 18: 1427-1430 (2003)]; 및 [Schrijvers, B.F., et al., The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-2017 (2004)] 참조). VEGF-A 및 그의 수용체는 적어도 특정 기간 동안 1형 및 2형 당뇨가 있는 실험 동물 또는 인간에서 상향조절된 반면, 감소된 VEGF-A 수준은 다양한 진행성 신장 질병에서 잔여 신장에서 사구체경화증 및 세뇨관간질 섬유증의 발생과 연관되었다 (예를 들어, 문헌 [Honkanen, E., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor in idiopathic membranous glomerulonephritis: relationships to clinical course. Am J Kidney Dis 42: 1139-1148 (2003)]; [Korbet, S.M., et al. The racial prevalence of glomerular lesions in nephrotic adults. Am J Kidney Dis 27:647-51 (1996)]; [Sivridis, E., et al. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and angiogenic factor expression in idiopathic membranous nephropathy. Am J Kidney Dis 41:360-365 (2003)]; 및 [Srivastava, T., et al. High incidence of focal segmental glomerulosclerosis in nephrotic syndrome of childhood. Pediatr Nephrol 13: 13-8 (1999)] 참조). FSGS의 주요 조직병리학적 특징 중 하나는 세포외 매트릭스 (ECM) 또는 사구체경화증의 침착물의 축적이다. 사구체경화증의 발병기전을 알려져 있지 않고, 사구체 내에 존재하는 3가지 세포 종류 (족세포, 내피, 또는 혈관사이 세포) 중 어떤 것이 섬유화 과정에 참여하는지 알려져 있지 않다.
혈관사이 세포는 손상의 종류에 무관하게, 예를 들어 사구체신염 또는 당뇨병 신장병증에서 신 손상에 대한 사구체 반응의 일부로서 세포외 매트릭스 (ECM)의 증가된 생산과 함께 복제한다. 상기 과정은 사구체 한외여과를 손상시켜, 사구체 경화증 및 말기 신부전을 일으킨다 (예를 들어, 문헌 [Buschhausen, L., et al. Kidney fibrosis impairs glomerular ultrafiltration and results in glomerular sclerosis and end-stage renal failure. Regulation of mesangial cell function by vasodilatory signaling molecules. Cardiovasc Res 51:463-469 (2001)] 참조). 족세포 이상은 사구체경화증의 트랜스제닉 모델 (예를 들어, 문헌 [Shih, N. Y., et al. Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein Science 286:312-315 (1999)] 참조)에서 또는 환자 (예를 들어, 문헌 [Srivastava, T., et al. Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood. Kidney Int 59: 118-125 (2001)] 참조)에서 확인되었고, 이는 이들 세포가 사구체 흉터형성의 개시에서 역할을 할 수 있음을 제안한다. 다른 모델은 내피 또는 혈관사이 세포를 경화 과정에 연관시켰다 (예를 들어, 문헌 [Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252 (2003)] 참조). 사구체경화증의 많은 모델에서 (또한 임상적으로 FSGS에서), ECM 축적은 종종 혈관사이막에서 시작하는 것으로 보인다. 신장 사구체 내의 3개 모두의 세포 종류가 연관되고, 몇몇 방식으로 질병 진행에 기여할 수 있다.
VEGF-A는 VEGF 자극에 반응하여 일차 인간 혈관사이 세포의 증가된 증식 (Onozaki, A., et al., Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione. Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004)), 콜라겐 합성 의 유도 (Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)) 및 증가된 산화질소 생산 (Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998))을 보여준 연구에 기초하여 혈관사이 세포에서 기능적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Thomas, S., et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11: 1236-1243 (2000)]을 참조한다. 그러나, 시험관 내에서 VEGF-A 자극에 대한 혈관사이 세포의 반응성에도 불구하고, 관여된 VEGF 수용체(들)의 성질 및 신장 발달 동안 혈관사이 세포에서 VEGF-A 생산 변경의 효과는 알려지지 않고 있다.
신장 및 신장의 세포 종류에서 VEGF 및 VEGF 수용체의 생물학적 기능을 밝히고 이해하는 것이 필요하다. 상기 분자들의 생물학적 기능을 이해하면 신장 질병을 치료할 수 있다. 본 발명은 다음 명세서를 살펴보면 명백해지는 바와 같이 상기 필요성 및 다른 필요성을 해결한다.
<발명의 개요>
본 발명은 대상에서 신장병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 신장병이 있는 대상에게 유효량의 VEGFR 조정제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에서 유용한 VEGFR 조정제는 예를 들어 적어도 하나 이상의 VEGF 수용체에 특이적인 효능제, 예를 들어 VEGF, VEGFR-1 (Flt-1) 효능제, Flt-1에 선택적으로 결합하는 Flt-1 선택적 VEGF 변이체 (Flt-sel), Flt-1에 결합하고 활성화시키는 성장 인자, 예를 들어 PlGF 또는 VEGF-B, 항-VEGFR-1 효능제 항체 (예를 들어, 모노클로날, 폴리클로날, 항체 단편, 인간, 인간화 또는 키메라 (chimera) 항체), 소분자 Flt1 효능제 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 한 실시태양에서, VEGFR 조정인자는 Flt1 효능제이다. 한 실시태양에서, VEGFR-1 효능제는 혈관신생제, 예를 들어, VEGF, 추가의 VEGFR1 리간드 또는 효능제, VEGFR2 리간드, 그의 VEGFR-2 (KDR) 선택적 변이체, 항-VEGFR-2 효능제 항체, VEGF-C, VEGF-D, 및 VEGFR1 및/또는 VEGFR2에 결합하여 활성화시키는 성장 인자 등과 조합하여 투여된다. 본 발명에 의해 치료할 수 있는 신장 질병은 염증성 신장 질병 (예를 들어, 염증성 세포의 변경, 면역 복합체 침착 (예를 들어, IgM 침착), 보체 활성화 (예를 들어, C1q, C3 및 C4의 활성화) 또는 그의 조합을 특징으로 함), 신장염, 사구체경화증, 사구체신염 (신부전) (예를 들어, 단백뇨, 사구체 경화증, 고혈압, 신장 혈관사이 세포의 감소된 생존율, ECM 합성의 유전자 발현의 증가, 매트릭스 분해의 감소 및/또는 상기 인자의 조합에 의해 결정할 수 있음), 국소 분절 사구체경화증 (FSGS) 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 대상은 신장병을 일으키는 감염에 걸려있다.
특정 실시태양에서, 신장병은 VEGF 수준의 감소를 특징으로 한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 질병은 신장의 세포 종류 (예를 들어, 혈관사이 세포, 족세포 및/또는 내피세포)의 변경을 포함한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 대상에게 전달되는 본 발명의 물질은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 물질은 전신 전달 시스템을 통해 대상에게 투여될 수 있다. 전신 전달 시스템은 물질, 예를 들어, 정제된 물질, 및 중합체 매트릭스를 포함하는 서방 제제를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 재조합 형태의 물질을 발현하는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)를 포함하는 세포 제제가 투여된다. 별법으로, 본 발명의 물질은 물질을 코딩하는 핵산을 포함하는 신장-표적화 유전자 전달 벡터를 통해 투여될 수 있다. 유전자 요법을 위한 잘 확립된 바이러스 또는 비바이러스 벡터, 예를 들어, 신장-표적화 유전자 전달 벡터가 사용될 수 있다.
VEGFR 조정제를 포함하는 제품 및 키트를 또한 제공하고, 진단 키트 및 방법도 제공한다.
도 1, 패널 a-h는 ROSA26 LacZ 리포터 균주를 사용하는 Flt1-Cre 트랜스제닉 마우스의 특성화 및 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스의 생성을 설명한다. (a) Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+) 및 Flt1-Cre-;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 교배로부터 발생하는 자손의 유전자형 빈도. 생성되는 모든 유전자형의 마우스는 예상 멘델 (Mendelian) 빈도로 출생한다. (b) Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에 대한 생존율 곡선. 생존율 감소는 출생 4주 후 명백하고, 상기 마우스의 >95%이 12주령에 사망하였다. (c) 7.5주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에 비교한 Flt1-Cre-에서 신장 질량 대 체질량 비 (%). Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장 중량은 대조군에 비해 유의하게 작다. Flt1-Cre-, n = 25; Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 10; *p < 0.0001. (d) (좌측) WT 및 표현형상 정상인 신장에 비해 (우측) 4주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스로부터 절제된 신장의 전형적인 외형. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장은 외형이 종종 낭성이고 창백하다. (e) (상부) 4-5주령의 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스의 소변 내에 존재하는 단백질을 검출하기 위한 은 염색. 패널의 상부에 나타낸 각각의 유전자형에 대표적인 3마리의 마우스로부터의 1 ㎕의 소변을 SDS-PAGE 및 은 염색하였다. Flt1-Cre+,VEGF(loxP/loxP) 마우스의 소변에서는 풍부한 단백질이 검출되지만, Flt1-Cre+,VEGF(loxP/+) 또는 Flt1-Cre- 마우스에서는 검출되지 않고, 이는 조건화된 VEGF 낙아웃 (knockout)에서 중증 단백뇨를 나타낸다. (하부) 알부민에 대해 생성된 항체를 사용하여 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스로부터의 소변의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석. (f) 7.5주령의 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스에서 혈액 요소 질소 (B.U.N.)의 수준. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 9; Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+), n = 8; Flt1-Cre-, n = 16; **p 값 < 0.0001. (g) 7.5주령 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스에서 혈청 크레아티닌 수준. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 9. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+), n = 8; Flt1-Cre-, n = 16; *p 값 < 0.05. (h) MAP 측정 동안 평균 동맥 혈압 (MAP) 및 평균 심박수. (좌측 축 및 칼럼) MAP +/- 표준 편차를 흑색 칼럼으로서 나타낸다. MAP는 Flt1-Cre- 마우스에 비해 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP)에서 유의하게 상승한다. (우측 축 및 사각형) MAP 측정 과정 동안 각각의 마우스의 심박수를 기록하였고, 평균 측정치를 흑색 사각형 +/- 표준 편차로서 나타낸다. 평균 심박수는 대조군에 비해 조건화된 VEGF 낙아웃에서 유의하게 상이하지 않았다. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 5; Flt1-Cre-, n = 10; **p 값 < 0.005.
도 2, 패널 a-c는 Flt1-Cre 트랜스젠 (transgene) 및 VEGF-A가 신장 사구체의 혈관사이 세포에서 동시-발현되는 것을 도시한 것이다: (a) (좌측) VEGF-A 안티센스 프로브를 사용하여 계내 (in situ) 혼성화시킨 7.5주령의 마우스의 신장으로부터의 절편의 H&E 염색된 명시야 영상. (우측) 좌측 패널에 도시된 영상의 암시야 사진. VEGF-A 발현은 연령-매칭된 (matched) Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장 사구체 내에서 현저하게 감소된다. (b) Cre-재조합효소 (recombinase)에 대해 생성된 친화도-정제된 항혈청을 사용하는 18.5일령의 배아 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+) 마우스의 신장 절편에 대한 면역조직화학 염색. (상부) Flt1 유전자 프로모터에 의해 구동된 Cre-재조합효소 발현 (갈색)은 사구체 내에서 내피 및 혈관사이 세포 (me) 모두에서 검출된다. (하부) Flt-Cre 발현은 대조군으로서 세뇨관-간질/수질 컴파트먼트 전체에서 내피세포 (en)에서 나타난다. (c) 7주령의 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스로부터 단리된 총 신장 RNA의 실시간 RT-PCR 분석. Cre 재조합효소, Flt1, Flk1, 및 VEGF-A에 대한 상대 RNA 단위 (RRU)를 GAPDH 수준에 대해 표준화하고, 표준 곡선으로부터 계산하였다 (Gerber et al., 2000). Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 6; Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+), n = 6; Flt1-Cre-, n = 6; *p 값 < 0.05.
도 3, 패널 a-m은 2 내지 7주령의 Flt1-Cre;VEGF-LoxP 마우스 신장의 조직학적 분석 및 5주령 Flt1-Cre;VEGF-LoxP 마우스로부터 단리된 신장의 투과 전자 현미경 사진을 개략적으로 도시한 것이다: (a) H&E로 염색하고 낮은 배율에서 촬영한 2주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장 피질. 피질 낭 (cyst)의 경계는 현저하고 (점선), 말초 세포로 이루어지고 겉보기에 사구체 모세혈관 루프가 결핍되는 사구체가 명백하다.
(b) 2주령의 WT 신장 사구체의 H&E 염색된 절편. (c) 2주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 신장 사구체의 H&E 염색된 절편. (b)에서 그의 WT 동배새끼에서 관찰된 단단한 모세혈관 루프가 없는 것으로 보인다. (d) 풍부한 ECM 침착에 의해 가려진 사구체 모세혈관을 갖고 확대된 2주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 신장 사구체의 H&E 염색된 절편. (e) H&E로 염색한 7주령의 Flt1-Cre- 마우스로부터의 사구체의 전형적인 외형. (f) 7주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 사구체의 H&E 염색된 절편. 상기 주령에서, 조건화된 VEGF 낙아웃의 사구체는 현저하 게 확대되고, 풍부한 ECM 침착은 사구체 모세혈관 및 비뇨기 공간에 영향을 미친다. (g 및 h) α-CD31을 사용하는 7주령의 Flt1-Cre- (g) 및 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (h) 신장에서 내피세포의 면역조직화학 염색. 돌연변이체 신장에서 보다 적은 CD31-양성 내피세포가 검출된다. (i 및 j) 계내 혼성화에 의해 검출된 7주령의 Flt1-Cre- (i) 및 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (j) 신장에서 TGF-β 발현. 조건화 VEGF-A 낙아웃 신장에서 TGF-β의 현저한 상향조절이 검출된다. (k 및 l) 7주령의 Flt1-Cre- (k) 및 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (l) 마우스의 신장에서 알파 평활근 액틴 (α-SMA)을 검출하기 위한 면역조직화학 염색. 조건화 VEGF 낙아웃의 사구체 전체에서 증가된 α-SMA 염색이 검출가능하고, 이는 나머지 혈관사이 세포의 활성화를 반영한다. (m) (하부) Flt1-Cre- 신장에 비해 (상부) 투과 전자 현미경은 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장에서 많은 결함을 입증한다. (좌측) 질병에 걸린 신장에 족세포 족돌기 (fp) 융합 (화살표)의 영역이 존재하는 반면, 대조군에서 뚜렷한 족돌기가 존재한다. (중간) 혈관사이막 (me)에서, Flt-Cre- 신장에는 존재하지 않는 수많은 전자 치밀 침착 (de)을 면역-매개 사구체신염과 일치하는 내피하 위치에서 볼 수 있다. (우측) 진행된 병변을 갖는 사구체에서, 현저하게 비후되고 주름진 사구체 기저막이 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장에서 보인다. 창문구멍이 있는 내피세포 (en)가 대조군에서 보이지만, 조건화 VEGF 낙아웃에는 없다.
도 4, 패널 a-b는 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 신장 부전의 진행이 IgM 침착 및 보체 활성화와 연관되는 것을 개략적으로 도시한 것이다: (a) Flt1-Cre- 신장, 폐, 및 심장 조직에 비해 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (흑색 막대)에서, 및 Flt1-Cre- 매칭된 장기에 비해 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+) (회색 막대)에서 단핵구/대식세포 (MAC-1, F4/80), B-세포 (CD45R) 및 T-세포 (Thy-1) 계통의 세포 상에서 발현된 유전자의 RNA 수준의 배수 변화. 발현 수준을 뮤린 GAPDH에 특이적인 프로브/프라이머 세트에 대해 표준화한다. 발현에서 통계상 유의한 배수 변화를 별표로 표시한다, p 값 < 0.005. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP), n = 6; Flt1-Cre+VEGF(loxP/+), n = 6; Flt1-Cre-, n = 6. (b) 각각 α-F4/80 및 α-CD4 항체를 사용하는 5주령의 Flt1-Cre- 및 Flt1-Cre+,VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장에서 (좌측) 단핵구/대식세포 및 (우측) T-세포 계통의 세포에 대한 면역조직화학/형광 염색. 단핵구/대식세포 및 T-세포의 하위세트는 조건화 VEGF-A 낙아웃의 신장 조직 내로 동원된다.
도 5, 패널 a-f는 VEGF-A 및 Flt1-결핍 혈관사이 세포의 시험관내 분석을 도시한 것이다: (a) Flt1-loxP 마우스를 생성하기 위한 유전자-표적화 전략. 표적화 벡터는 2개의 loxP 부위 (LoxP1 및 LoxP2)가 인접하는 PGK-Neo 카세트를 Flt1 유전자의 번역 개시 코돈 (ATG)을 포함하는 제1 엑손의 상류에 도입하고, 제3 loxP 부위 (LoxP3)를 제1 엑손의 3'에 도입하기 위해 설계하였다. Cre-재조합효소 발현 후, LoxP1과 LoxP2 사이에 재조합을 거친 배아 줄기 (ES) 세포 클론을 선택하고, Flt1-loxP 마우스를 생성하기 위해 사용하였다. 서던 (Southern) 블로팅에 의해 표적화 사건 및 재조합에 대해 스크리닝하기 위해 사용되는 PCR-증폭된 게놈 DNA 프로브 (5' Pr, 3' Pr)의 위치를 나타낸다. 상기 스크리닝에 사용된 제한 효소 부위의 위치 및 표적화 벡터의 구역들의 크기 (킬로염기)는 표시된 바와 같다. E: EcoRI; H: HindIII; K: KpnI; kb: 킬로염기. (b) WT 및 표적화된 (Targ.) ES 세포 클론으로부터, 및 LacZ (LZ) 또는 Cre-재조합효소 (Cre) 유전자를 코딩하는 아데노바이러스로 감염된 Flt1(loxP/loxP) 혈관사이 세포 (Mes.)로부터 추출된 게놈 DNA의 서던 블롯 분석. 각각의 세포로부터의 게놈 DNA를 각각 Flt1 유전자의 표적화된 구역의 5' 단부 또는 3' 단부에서 표적화 사건 및 loxP 재조합에 대해 분석하기 위해 EcoRI 또는 HindIII과 KpnI로 소화시켰다. 각각의 레인에서 검출된 예상된 단편의 크기를 각각의 패널의 좌측 및 우측에 각각 표시한다 (킬로염기). (c) 아데노바이러스로 감염된 혈관사이 세포에서 VEGF-A 발현. 혈관사이 세포를 WT 및 VEGF(loxP/loxP) 마우스로부터 단리하고, LacZ (Ad-LacZ) 또는 Cre-재조합효소 (Ad-Cre)를 코딩하는 아데노바이러스로 감염시켰다. 총 RNA를 단리하고, VEGF-A 발현의 분석을 위해 정량적 실시간 PCR로 처리하였다. 결과를 GAPDH에 대한 표준화 후 상대 RNA 단위 (RRU)로서 표현하고, WT 마우스로부터의 총 신장 RNA를 사용하여 각각의 프라이머/프로브 세트에 대한 표준 곡선을 생성하였다. (d) 아데노바이러스로 감염된 혈관사이 세포에서 Flt1 발현. WT 및 Flt1(loxP/loxP) 마우스로부터 혈관사이 세포를 단리하고, Ad-LacZ 및 Ad-Cre로 감염시켰다. RNA를 단리하고, 정량적 RT-PCR에 의해 Flt1 발현에 대해 분석하였다. 결과를 (c)에 기재된 바와 같이 표현한다. (e) 시험관 내에서 VEGF-A 및 Flt1-결핍 혈관사이 세포의 생존율. Ad-LacZ와 Ad-Cre 처리 사이의 세포 계수비를 계산하고, WT 세포에 대해 얻은 값의 백분율로서 표준화하였다. VEGF-A 및 Flt1-결핍 혈관사이 세포는 모두 WT 혈관사이 세포에 비해 시험관 내에서 유의하게 감소된 생존율을 보였다. WT 세포에 비해 생존율의 통계상 유의한 차이는 별표로 나타낸다: *p 값 < 0.05; **p 값 < 0.01. Flt1-결핍 및 VEGF-결핍 혈관사이 세포는 또한 시험관 내에서 유의하게 상이한 생존율을 보인다, p < 0.05. (f) 중화 VEGF 항체 (α-VEGF) 또는 대조 항체 (대조 IgG)의 존재 하에 배양된 Ad-LacZ 감염된 혈관사이 세포의 생존율. VEGF-A 또는 Flt1이 유전학적으로 제거될 때 명백한 혈관사이 세포 생존의 감소는 혈관사이 세포를 α-VEGF의 존재 하에 배양함으로써 반복되지 않았다.
도 6, 패널 a-d는 상이한 형태의 콜라겐의 발현을 검출하기 위해 7주령 Flt1-Cre;VEGF-loxP 마우스로부터 단리된 총 신장 RNA의 실시간 RT-PCR 분석을 도시한 것이다. 콜라겐 α1 타입 I (a), 콜라겐 α2 타입 II (b), 콜라겐 α2 타입 IV (c) 및 콜라겐 α1 타입 XVIII (d)에 대한 상대 RNA 단위 (RRU)를 글리세르알데히드-3-데히드로게나제 (GAPDH) 수준에 대해 표준화하고, 표준 곡선으로부터 계산하였다.
정의
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 물론 상이할 수 있는 특정 조성물 또는 생물학 시스템으로 한정되지 않아야 함을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서 본 발명을 제한하고자 의도하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서와 첨부하는 청구의 범위에서 사용될 때, 단수 형태 (하나 ("a", "an") 및 "그" ("the"))는 분명하게 다른 의미를 나타내지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "분자"라는 언급은 임의로 2개 이상의 상기 분자의 조합 등을 포함한다.
신장염은 신장의 염증이다. 신장염의 증거, 예를 들어, 소변 내의 혈액 및/또는 단백질 및 손상된 신장 기능 등은 사구체, 요세관, 요세관 둘레의 조직, 또는 혈관을 침범하는 면역 반응, 염증의 종류, 위치 및 강도에 따른다. "신장염-관련 질병"은 예를 들어 원발 사구체병증 (급성 미만성 증식 사구체신염, 연쇄상구균후 사구체병증, 비-연쇄상구균후 사구체병증, 초승달 (crescentic) 사구체신염, 막성 사구체병증, 리포이드 (lipoid) 신증, 국소 분절 사구체경화증, 막증식 사구체신염, IgA 신장병증, 초점 증식 사구체신염 및 만성 사구체신염), 전신 질병 (전신 홍반 루프스, 당뇨병, 아밀로이드증, 굿파스쳐 (Goodpasture) 증후군, 결절 다발동맥염, 베게너 (Wegener) 육아종증, 헤노흐-쇤라인 (Henoch-Schonlein) 자반증, 및 세균성 심내막염), 및 유전 질환 (알포트 (Alport) 증후군, 얇은 막 (thin membrane) 질병, 및 패브리 (Fabry) 질병)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"신 증후군"은 단백질의 소변 내로의 심각한 장기적인 배출, 단백질 (특히 알부민)의 감소된 혈액 수준, 체내에 과도한 염 및 물의 저류, 및 혈액 내에 증가된 수준의 지방 (지질)을 일으키는 신장을 침범하는 많은 질병에 의해 유발된 증상의 집합이다. 신 증후군은 임의의 사구체병증 또는 광범한 질병에 의해 유발될 수 있다. 일반적으로, 신 증후군은 3 또는 4 개월 내에 완전 신장 부전으로 진행한다.
"급성 신염 증후군" 또는 "급성 사구체신염"은 종종 소변 내에 적혈구 (원추체 (cast))의 응괴 및 가변량의 단백질을 갖는, 소변 내에 갑작스러운 혈액 출현을 일으키는 사구체의 염증을 나타낸다. 급성 신염 증후군은 연쇄상구균 감염, 예를 들어 패혈성 인두염 (strep throat) 후에 일어날 수 있다. 사구체는 그를 중화시키는 항체와 함께 응괴된 사멸 연쇄구균으로부터의 항원의 축적에 의해 손상된다. 상기 응괴 (면역 복합체)는 사구체의 막을 코팅하고, 그들의 여과 기능을 저해한다. 급성 신염 증후군은 또한 다른 감염, 예를 들어 인공 신체 부품 (보철물)의 감염, 세균성 심내막염, 폐렴, 복부 장기의 농양, 수두, 감염성 간염, 매독, 및 말라리아에 대한 반응에 의해 유발될 수 있다. 마지막 3가지 감염은 급성 신염 증후군보다는 신 증후군을 일으킬 수 있다. "만성 신염 증후군" 또는 "만성 사구체신염"은 사구체가 손상되고 신장 기능이 수년에 걸쳐 퇴행하는 중증 질병에서 일어나는 질환을 나타낸다.
사구체병증은 모세혈관 얼기 (plexus)의 질병인 사구체 질병이다. 신장 사구체 질병에서, 사구체병증은 각각의 신장 요세관의 출발점에서 모세혈관 루프로 형성된 다발의 질병이다. 사구체병증의 종류는 예를 들어, (1) 급성 신염 증후군; (2) 신속 진행성 신염 증후군; (3) 신 증후군; 및 (4) 만성 신염 증후군을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 사구체가 손상되기 때문에, 정상적으로는 혈류로부터 여과되지 않는 물질, 예를 들어 단백질, 혈액, 백혈구 및 파쇄물이 사구체를 통해 통과하여 소변에 유입될 수 있다. 미세한 혈전 (미세혈전)이 사구체를 부양하는 모세혈관 내에 형성할 수 있다.
사구체경화증은 신 사구체 내에서 종종 신성 동맥경화증 또는 당뇨와 연관되는 히알린 침착 또는 흉터형성을 일으키는 퇴행성 신장 질병이다. 일반적으로, 순환 염증성 세포의 침윤, 간질의 섬유증 및 요세관 위축이 존재한다. 몇몇 인자에 의해 유발된 사구체 손상은 단백뇨를 일으키고, 여기서 단백질은 가용형 면역글로불린 A (sIgA), sIgG 및 sIgM과 결합하여 기저막 상에 면역 복합체를 형성한다. 상기 면역 복합체는 염증성 림프구에 대한 화학주성 인자로서 기능하고, 이는 침범된 영역에서 과도한 면역 반응을 일으킨다 (Bohle A et al., Kidney Int 67 (Suppl.):186S-188S(1998)). 요세관이 염증성 세포에 의해 손상될 때, 사구체와 연결된 혈관이 또한 손상되어 폐쇄된다. 그 결과, 사구체는 불리하게 영향을 받아 악화된다. 상기 사구체 변화에는 조직 섬유증이 동반하고, 궁극적인 신부전으로 진행한다 (예를 들어, 문헌 [Ratscchek M et al., Clin Nephrol 25: 221-226 (1986)]; [Bohle A et al., Clin Nephrol 29: 28-34 (1998)]; [Bohle A et al., Kidney Blood Press Res 19:191-195 (1996)] 참조).
하나의 종류는 비후된 기저막 및 증가된 혈관사이 매트릭스를 갖는 사구체 모세혈관의 분절 붕괴 (collapse)가 존재하는 국소 분절 사구체경화증 (FSGS)이고, 이는 종종 단백뇨 및 신부전을 일으킨다 (예를 들어, 문헌 [Kamanna et al., Histol. Histopathol. 13: 169-179(1998)]; [Wehrmann et al., Clin. Nephrol. 33:115-122 (1990)]; [Mackensen-Haen, et al., Clin. Nephrol. 37:70-77 (1992)] 참조). 이는 영구적인 신장 부전을 일으킬 수 있다.
용어 "혈관사이막"은 신장의 사구체에서 모세혈관 루프를 부양하는 조직을 나타내고, 혈관사이 세포와 혈관사이 매트릭스로 이루어진다. 혈관사이 세포는 사구체의 루프 구조를 유지할 뿐만 아니라, 식세포 기능 또는 사구체 혈류를 조절하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 혈관사이 세포는 안지오텐신 II 수용체를 갖고, 혈소판-활성화 인자, 프로스타글란딘, 타입 IV 콜라겐, 피브로넥틴 등을 생산한다. 혈관사이 매트릭스는 혈관사이 세포를 둘러싸는 세포외 매트릭스 성분이다.
본원에서 사용될 때 용어 "VEGF 수용체" 또는 "VEGFR"은 혈관 내피세포 상에서 발견되는 VEGF에 대한 세포성 수용체, 보통 세포-표면 수용체와, VEGF에 결합하는 능력을 보유하는 그의 단편 및 변이체 (예를 들어, 세포외 도메인의 단편 또는 말단절단된 (truncated) 형태)를 나타낸다. VEGFR의 일부 예는 문헌에서 Flt-1 (또한 본원에서 상호 교환가능하게 "VEGFR-1"로 사용됨) 및 KDR/Flk-1 (또한 본원에서 상호 교환가능하게 "VEGFR-2"로 사용됨)으로 나타내는 단백질 키나제 수용체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [DeVries et al. Science, 255:989 (1992)]; [Shibuya et al. Oncogene, 5:519 (1990)]; [Matthews et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 88:9026 (1991)]; [Terman et al. Oncogene, 6:1677 (1991)]; 및 [Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992)] 참조). Flt-1 (fms-유사-티로신 키나제) 및 KDR (키나제 도메인 구역) 수용체는 VEGF에 높은 친화도로 결합한다. KDR의 뮤린 상동체인 Flk-1 (태아 간 키나제-1)은 인간 KDR과 85% 서열 동일성을 공유한다 (Ferrara Kidney Intl. 56:794-814 (1999)). Flt-1 및 KDR/Flk-1은 둘 모두 세포외 도메인 (ECD) 내에 7개의 면역글로불린 (Ig)-유사 도메인, 단일 막횡단 구역 및 컨센서스 티로신 키나제 (TK) 서열을 갖고, 이는 키나제-삽입 도메인에 의해 개재된다. Flt-1은 약 10 내지 20 pM의 Kd를 갖는 rhVEGF165에 대해 최고 친화도를 갖는다. KDR은 약 75 내지 125 pM의 Kd를 갖는 VEGF에 대해 보다 낮은 친화도를 갖는다. VEGFR의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 당업자가 쉽게 입수가능하다.
다른 VEGF 수용체는 VEGF로 가교결합 표지될 수 있는 것, 또는 KDR 또는 Flt-1로 동시-면역침전될 수 있는 것을 포함한다. VEGF165에 결합하지만 VEGF121에 결합하지 않은 추가의 VEGF 수용체가 확인되었고, 이는 뉴로필린 1이다 (Soker et al Cell 92:735-45 (1998)). 이소형-특이적 VEGF 결합 수용체는 또한 뉴런 세포 유도를 매개하는 콜랩신/세마포린 패밀리에 대한 수용체이다.
Flt-1 및 KDR 수용체는 주로 혈관 내피세포의 표면 상에 결합된 수용체로서 존재하지만, 또한 비-내피세포에 존재할 수 있다. 일부 가용형의 VEGFR이 또한 발견되었다. 예를 들어, 7번째 Ig-유사 도메인, 막횡단 서열, 및 세포질 도메인이 결핍되는 선택적으로 스플라이싱된 가용형의 Flt-1 (sFlt-1)을 코딩하는 cDNA가 인간 배꼽 정맥 내피세포 (HUVEC)에서 확인되었다 (Kendall et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 226:324-328 (1996)).
용어 "VEGF" 및 "VEGF-A"는 천연 발생 대립유전자 및 그의 프로세싱된 형태와 함께 문헌 ([Leung et al. Science, 246: 1306 (1989)], 및 [Houck et al. Mol. Endocrin. 5: 1806 (1991)])에 기재된 바와 같은 165-아미노산 인간 혈관 내피세포 성장 인자 및 관련 121-, 145-, 183-, 189-, 및 206-아미노산 혈관 내피세포 성장 인자를 나타내기 위해 상호 교환가능하게 사용된다. 용어 "VEGF"는 또한 예를 들어 생물학적 활성을 보유하는, 165-아미노산 인간 혈관 내피세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리클로날 항체의 단편을 의미하기 위해 사용된다. 상기 임의의 형태의 VEGF에 대한 언급은 본원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"에 의해 확인할 수 있다. "단편" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 나타낸 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 단편 천연 VEGF의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 천연 VEGF의 위치 17 (메티오닌)이다. 단편 천연 VEGF는 천연 VEGF에 필적할만한, KDR 및/또는 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
"혈관신생 인자 또는 혈관신생제"는 혈관의 발생을 자극하는 성장 인자, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 혈관형성 등을 촉진시키는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자는 VEGF 및 VEGF 패밀리의 멤버 (A, B, C, D, 및 E), PlGF, PDGF 패밀리, 섬유모세포 성장 인자 패밀리 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴), ANGPTL3, ANGPTL4, 에프린 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 혈관신생 인자는 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 패밀리의 멤버, 및 TGF-α 및 TGF-β 등의 상처 치유를 촉진시키는 인자도 포함한다 (예를 들어, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)], [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)], [Ferrara ＆ Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999)], [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)] (예를 들어, 공지의 혈관신생 인자를 나열한 표 1) 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)])을 참조한다).
"천연 서열" 폴리펩티드는 자연에서 유도되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 천연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드는 구체적으로 천연 발생 말단절단된 또는 분비된 형태의 폴리펩티드 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 천연 발생 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태) 및 천연 발생 대립유전자 변이체를 포함한다.
"단리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 폴리펩티드의 95 중량% 초과, 또는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
폴리펩티드 "변이체"는 대응하는 천연 서열 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 상기 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에서 부가되거나 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드 또는 그의 단편과 적어도 약 80%의 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
본원엔서 사용되는 용어 "변이체"는 본원에서 설명되고/되거나 천연 단백질 서열에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질 변이체를 의미한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환(들)을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 그의 변이체는 당업계에 잘 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 VEGF는 재조합 VEGF165를 포함한다. 아미노산 서열 변이체는 예를 들어 VEGF DNA 또는 VEGFR DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 상기 변이체는 예를 들어 VEGF 또는 VEGFR의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 상기 잔기 내로의 삽입 또는 상기 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합을 통해 목적하는 활성을 갖는 최종 구성체를 제조할 수 있다. 변이체를 코딩하는 DNA에 유도되는 돌연변이는 서열을 해독 프레임 (reading frame)으로부터 벗어나도록 배치하지 않아야 하고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성시킬 수 있는 상보성 구역을 생성시키지 않을 것이다 (EP 75,444A).
변이체는 임의로 천연 단백질을 코딩하는 DNA 내의 뉴클레오티드의 부위 지정 돌연변이 유발, 또는 파지 디스플레이 기술에 의해 변이체를 코딩하는 DNA를 생산한 후, 재조합 세포 배양액에서 DNA를 발현시켜 제조한다.
아미노산 서열 변이를 도입하는 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체는 미리 결정될 필요는 없다. 예를 들어, 지정 부위에서 돌연변이의 수행능을 최적화하기 위해서 무작위 돌연변이 유발은 표적 코돈 또는 구역에서 수행되고, 발현된 변이체는 목적하는 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝될 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 소정의 위치에서의 치환 돌연변이를 형성하는 기술은 잘 공지되어 있고, 그 예는 부위-특이적 돌연변이 유발이다. 본원에 설명된 변이체의 제조는 파지 디스플레이 기술에 의해, 예를 들어, PCT 공개 WO 00/63380에 기재되어 있는 것에 의해 달성될 수 있다.
상기 클론을 선택한 후, 돌연변이된 단백질 구역을 제거하여 단백질 생산에 적절한 벡터, 일반적으로는 적절한 숙주의 형질전환에 이용될 수 있는 유형의 발현 벡터에 위치시킬 수 있다.
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1개 내지 30개의 잔기, 임의로 1개 내지 10개의 잔기, 임의로 1개 내지 5개 이하의 범위이고, 전형적으로 인접하여 위치한다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 내지 본질적으로 제한되지 않는 길이의 폴리펩티드의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합 및 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 서열 내 삽입 (즉, 천연 단백질 서열 내 삽입)은 일반적으로 약 1개 내지 10개의 잔기, 임의로 1개 내지의 5개, 또는 임의로 1개 내지 3개의 범위일 수 있다. 말단 삽입의 예는 숙주 세포에 이종성이거나 상동성인 신호 서열을 N-말단에 융합시켜 재조합 숙주로부터의 분비를 용이하게 하는 것 등이 있다.
추가의 변이체는 천연 단백질 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 대신에 상이한 잔기가 삽입된 것이다. 이러한 치환은 하기 표 1에 나타낸 바에 따라 이루어질 수 있다. 변이체는 또한 본원에 기재한 바와 같은 비천연 아미노산을 포함할 수도 있다.
아미노산은 그들의 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류될 수 있다 (A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비대전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
별법으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본래 서열 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
"천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산 잔기)는 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. "비-천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬에서 인접 아미노산 잔기(들)과 공유 결합할 수 있는, 상기 나열된 천연 발생 아미노산 잔기 이외의 다른 잔기를 의미한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예는 예를 들어 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]와 미국 특허 출원 공개 20030108885 및 20030082575에 기재된 바와 같은 다른 아미노산 잔기 유사체를 포함한다. 간단히 설명하면, 상기 과정은 비-천연 발생 아미노산 잔기를 사용한 서프레서 tRNA의 활성화, 이어서 RNA의 시험관 내 또는 생체 내 전사 및 번역을 수반한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 20030108885 및 20030082575; 문헌 [Noren et al. Science 244:182 (1989)]; 및 [Ellman et al., 상기 문헌] 참조).
치환, 결실, 또는 삽입의 효과는 통상적인 스크리닝 분석을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이-선택된 VEGF 변이체는 재조합 세포 배양액에서 발현될 수 있고, 임의로 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다. 이어서, VEGF 변이체는 KDR 또는 Flt-1 수용체 결합 친화도 및 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 바와 같은 다른 생물학적 활성에 대해 평가될 수 있다. 세포 용해물 또는 정제된 VEGF 변이체의 결합 특성 또는 활성은 바람직한 특성에 대한 적합한 스크리닝 분석으로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 천연 VEGF에 비교할 때 VEGF 변이체의 면역학적 특성, 예를 들어 제시된 항체에 대한 친화도의 변화가 바람직할 수 있다. 상기 변화는 경쟁형 면역분석으로 측정할 수 있고, 이것은 당업계에 공지된 기술에 따라 수행할 수 있다. VEGF 변이체의 각각의 수용체 결합 친화도는 당업계에 공지되고 아래 실시예에서 추가로 설명되는 ELISA, RIA, 및/또는 BLAcore 분석에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 VEGF 변이체는 또한 KIRA 분석에서 활성을 보일 것이고, 이것은 KDR 수용체의 인산화를 유도하는 능력을 반영한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 VEGF 변이체는 추가로 또는 별법으로 내피세포 증식을 유도할 것이다 (이것은 HUVEC 증식 분석과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정할 수 있다). 본원에 개시된 특이적인 VEGF 변이체 이외에, 문헌 [Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:5638-5646 (1996)]에 기재되어 있는 VEGF 변이체도 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다.
본원에서 "아미노산 서열 동일성 비율 (%)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 아래에서 설명되는 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 얻는다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.) 소유로서, 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록되었고, 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 예를 들어 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
본원의 목적을 위해, 제시된 아미노산 서열 A의 제시된 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 동일성 % (별법으로, 제시된 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 포함하는 제시된 아미노산 서열 A로 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다.
100 x (X/Y)
상기 식에서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 것으로 평가된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않을 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "조정하는" 또는 "조정"은 VEGFR 유전자 기능, 발현, 활성, 또는 별법으로 VEGFR 유전자와 연관된 표현형의 감소, 억제, 저하, 개선, 증가 또는 향상을 의미한다.
용어 "VEGFR 조정인자" 또는 "VEGFR 조정제" 또는 "VEGFR 조정 화합물"은 그의 발현을 활성화시킬 수 있는 분자, 예를 들어, 효능제, 또는 VEGFR의 활성 또는 그의 발현을 억제할 수 있는 분자, 예를 들어, 길항제 (또는 억제제)를 의미한다. 용어 "효능제"는 천연 VEGFR 수용체를 통해 신호를 전달하는 능력을 갖는 물질을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "효능제"는 VEGFR 수용체의 생물학적 역할이라는 측면에서 규정된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, VEGFR 조정인자는 VEGFR 효능제, 예를 들어, Flt1 효능제, VEGFR 수용체에 결합하는 리간드, 예를 들어, VEGF, VEGF 선택적 변이체, PlGF, VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 추가의 효능제는 예를 들어 효능제 활성을 갖는 VEGFR 변이체, VEGFR 효능제 항체 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
VEGFR 길항제는 VEGFR 활성, 예를 들어, 세포 증식 또는 성장, 이동, 부착 또는 대사, 예를 들어 리간드, 예를 들어, VEGF, VEGF 선택적 변이체, PlGF 및 VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D에 대한 그의 결합을 중화, 차단, 억제, 제거, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 의미한다. VEGFR 길항제는 예를 들어 VEGFR에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 리간드, 항-VEGFR 항체 및 VEGFR 길항제, 예를 들어 수용체의 소분자 억제제에 대한 그의 결합을 차단하는 수용체 분자 및 유도체, 항-VEGFR 항체 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 다른 VEGFR 길항제는 또한 VEGFR의 길항제 변이체, 안티센스 분자 (예를 들어, VEGFR-SiRNA), RNA 앱타머, 및 VEGFR 또는 그의 수용체에 대한 리보자임을 포함한다. 특정 실시태양에서, 길항제 VEGFR 항체는 VEGFR의 특이적인 서열 또는 구역에 결합함으로써 VEGFR의 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다.
용어 "항-VEGFR 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 VEGFR에 결합하는 항체이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항-VEGFR 항체는 VEGFR 활성이 관련되는 질병 또는 병태를 표적으로 하여 이를 처치할 때 치료제로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 항-VEGFR 항체는 대체로 다른 VEGFR 상동체에는 결합하지 않을 것이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체 (전장 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체의 단편 (하기 참조)을 포함한다.
달리 나타내지 않으면, 표현 "다가 항체"는 본 명세서 전반에 걸쳐서 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내기 위해 사용된다. 다가 항체는 전형적으로 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 공학적으로 처리되고, 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
"항체 단편"은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하여 항원에 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 본 발명의 정의에 포함되는 항체 단편의 예는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편; (ii) CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인 및 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편; (v) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vii) 단리된 CDR 구역; (viii) 힌지 구역에서 디술피드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ix) 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, 단일쇄 Fv; scFv) ([Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]; 및 [Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)]); (x) 동일한 폴리펩티드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)를 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 "디아바디 (diabody)" (예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); (xi) 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 구역의 쌍을 형성하는 일렬 (tandem) Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 "선형 항체" ([Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057 1062 (1995)]; 및 미국 특허 5,641,870)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원에 대해 작용하며, 특이성이 높다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 변경 표현 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용할 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,816,567 참조). 또한, "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 ([Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 또는 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)])에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 및 그의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 구역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 구역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 구역 (FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 보다 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 구역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)])을 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 본원에 개시되는 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 ([Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)], [Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)], [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)], [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 로커스를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 도입하여 만들어질 수도 있다. 시험 접종시에는 인간 항체 생성이 관찰되며, 이것은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리 등을 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 문헌 ([Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)])에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대하여 작용하는 항체를 생성하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다 (상기 B 림프구는 개체로부터 회수될 수도 있고, 또는 시험관 내에서 면역화된 것일 수도 있음) (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991)]); 및 미국 특허 제5,750,373호 참조).
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 내의 서열에서 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 존재하는 초가변 구역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 구역에 의해 연결되는, 주로 베타-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 구역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 구역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.
용어 "초가변 구역"은 본원에서 사용될 때 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 구역은 일반적으로 "상보성 결정 구역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크 구역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정된 초가변 구역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체는 상이한 "클래스"로 분류될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1 (비-A 및 A 동종이인자형 포함), IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.
임의의 척추동물종으로부터의 항체의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 명백하게 구분되는 종류 중 하나에 분류될 수 있다.
용어 "Fc 구역"은 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 형성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 구역을 정의하기 위하여 사용된다. Fc 구역은 천연 서열 Fc 구역 또는 변이체 Fc 구역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 구역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 구역은 일반적으로 대략 위치 Cys226, 또는 위치 Pro230의 아미노산 잔기로부터 Fc 구역의 카르복실-말단으로 확장되도록 규정된다. 면역글로불린의 Fc 구역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. "Fc 구역 사슬"은 Fc 구역의 2개의 폴리펩티드 사슬 중의 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 구역의 "CH2 도메인" ("Cg2" 도메인으로도 언급됨)은 일반적으로 대략 위치 231번의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 340번의 아미노산 잔기로 확장된다. CH2 도메인은 또다른 도메인과는 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 특유한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 탄수화물이 도메인-도메인 페어링에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있다고 추정되었다 [Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)]. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 구역에서 CH2 도메인으로의 잔기 C-말단의 확장부 (즉, IgG의 대략 위치 341번의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 447번의 아미노산 잔기로의 확장)를 포함한다. 본원에서 CH3 구역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인일 수 있다 (예를 들어, 그의 하나의 사슬에 도입된 "돌출부 (protuberance)"를 포함하고 그의 다른 사슬에 상응하는 도입된 "캐비티 (cavity)"를 포함하는 CH3 도메인; 본원에서 참고로 포함된 미국 특허 5,821,333 참조). 상기 변이체 CH3 도메인을 사용하여 본원에 기술되어 있는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조할 수 있다.
"힌지 구역"은 일반적으로 인간 IgG1의 대략 Glu216, 또는 대략 Cys226으로부터 대략 Pro230으로 확장된 것으로서 규정된다 [Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)]. 다른 IgG 이소형의 힌지 구역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치시켜 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다. 본원에서 힌지 구역은 천연 서열 힌지 구역 또는 변이체 힌지 구역일 수 있다. 변이체 힌지 구역의 2개의 폴리펩티드 사슬은 일반적으로 폴리펩티드 사슬당 적어도 하나의 시스테인 잔기를 보유하고, 이로써, 변이체 힌지 구역의 2개의 폴리펩티드 사슬은 2개의 사슬 사이에 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 본원에서 바람직한 힌지 구역은 천연 서열 인간 힌지 구역, 예를 들어, 천연 서열 인간 IgG1 힌지 구역이다.
"기능적 Fc 구역"은 천연 서열 Fc 구역의 적어도 하나의 "효과기 기능"을 갖는다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 일반적으로 Fc 구역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 필요로하고 상기 항체 효과기 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 분석법을 사용하여 평가할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 변경된 효과기 기능, 예를 들어, 기능의 향상 또는 기능의 감소를 야기하는 변경된 Fc 구역을 가질 수 있다.
"천연 서열 Fc 구역"은 자연에서 발견되는 Fc 구역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
"변이체 Fc 구역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 구역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 구역은 천연 서열 Fc 구역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역과 비교시에, 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 구역에서 또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 구역은 전형적으로 예를 들어 천연 서열 Fc 구역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 구역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 90%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적인 세포독성의 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 후, 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 일반적으로, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 일반적으로 바람직하다. 효과기 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 혈액 또는 PBMC으로부터 단리할 수 있다.
"Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 구역에 결합하는 수용체를 설명한다. 한 실시태양에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시태양에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 선택적 스플라이싱된 형태를 포함)를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]에서 검토됨). FcR은 예를 들어 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에서 검토된 바 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성 조절에 작용하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)]; [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)]; [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; 및 WO 2004/92219 (Hinton 등) 참조).
생체내 인간 FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 구역을 갖는 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석될 수 있다. WO2000/42072에는 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다 (또한, 예를 들어, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)] 참조).
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적의 용해를 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 (cognate) 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조된다. 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에서는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌 ([Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)])에 기재되어 있다.
항체의 "기능적 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합할 수 있는 것이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 항원 결합 부위가 유래되는 모 항체만큼 강할 필요는 없지만, 항원에 결합하는 능력은 항원에 대한 항체의 결합을 평가하기 위해 공지되어 있는 다양한 방법 중 어느 하나를 사용하여 측정될 수 있어야 한다. 또한, 본원에서 각각의 다가 항체의 항원 결합 부위의 항원 결합 친화도는 정량적으로 동일할 필요는 없다. 본원에서 다량체 항체의 경우, 기능적 항원 결합 부위의 수는 초원심분리 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 이 분석 방법에 따르면, 표적 항원 대 다량체 항체의 상이한 비를 조합하고 복합체의 평균 분자량은 상이한 수의 기능적 결합 부위를 가정하면서 산출한다. 상기 이론치를 수득한 실제 실험치와 비교하여 기능적 결합 부위의 수를 평가한다.
지정된 항체의 "생물학적 특징"을 갖는 항체는 동일한 항원과 결합하는 다른 항체와 구별되는 상기 항체의 생물학적 특징들 중 하나 이상을 갖는 것이다. 목적하는 항체가 결합하는 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위하여, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기술된 것과 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다.
"폴리펩티드 사슬"은 각각의 그의 도메인이 비-공유 상호작용 또는 디술피드 결합과 대조적으로, 펩티드 결합(들)에 의해 다른 도메인(들)에 연결된 폴리펩티드이다.
본원에서 "가요성 링커"는 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 의미하고, 그에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 (예를 들어, 2개의 Fd 구역)에 보다 큰 회전 자유도를 제공한다. 상기의 회전 자유도는 가요성 링커에 의해 연결된 2개 이상의 항원 결합 부위가 각각 보다 더 효율적으로 표적 항원(들)에 접근할 수 있도록 한다. 적절한 가요성 링커 펩티드 서열의 예는 gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser, 및 gly-gly-gly-ser를 포함한다.
"이량체화 도메인"은 적어도 2개의 아미노산 잔기 (일반적으로 시스테인 잔기) 또는 적어도 2개의 펩티드 또는 폴리펩티드 (동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다)의 회합에 의해 형성된다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 공유 및/또는 비공유 회합(들)을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 본원에서 이량체화 도메인의 예는 Fc 구역; 힌지 구역; CH3 도메인; CH4 도메인; CH1-CL 쌍; 명백하게 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,821,333에 기재되어 있는 바와 같이 공학적으로 처리된 "마디 (knob)" 및/또는 "돌출부 (protruberance)"를 포함하는 "계면"; 류신 지퍼 (예를 들어, jun/fos 류신 지퍼, (문헌 [Kostelney et al., J. Immunol, 148: 1547-1553 (1992)] 참조); 또는 효모 GCN4 류신 지퍼); 이소류신 지퍼; 수용체 이량체 쌍 (예를 들어, 인터루킨-8 수용체 (IL-8R); 및 인테그린 이종이량체 (heterodimer), 예를 들어, LFA-1 및 GPⅢb/Ⅲa), 또는 그의 이량체화 구역(들); 이량체 리간드 폴리펩티드 (예를 들어, 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF-C, VEGF-D, PDGF 멤버, 및 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF); (문헌 [Arakawa et al. J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)] 및 [Radziejewski et al. Biochem. 32(48): 1350 (1993)] 참조), 또는 그의 이량체화 구역(들); 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기쌍; 펩티드 또는 폴리펩티드 사이에 디술피드 결합(들)이 형성될 수 있도록 각각 적어도 하나의 시스테인 잔기 (예를 들어, 약 1, 2 또는 3개 내지 약 10개의 시스테인 잔기)를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 쌍 (이하, "합성 힌지"); 및 항체 가변 도메인을 포함한다. 본원에서 가장 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 구역 또는 힌지 구역이다.
구문 "세포의 증식을 자극하는"은 비처리 세포 또는 시험관 내에서 생체 내에서 감소된 수준으로 처리된 세포에 비해 세포의 성장 및/또는 재생의 정도를 증가시키는 단계를 포함한다. 세포 배양에서 세포 증식의 증가는 목적하는 분자에 노출시키기 전과 후에 세포의 수를 계수함으로써 검출할 수 있다. 증식 정도는 융합 (confluence) 정도를 현미경으로 조사하여 정량화할 수 있다. 세포 증식은 또한 당업계에 공지된 분석, 예를 들어 티미딘 혼입 분석, 및 상업적으로 입수가능한 분석을 사용하여 정량화할 수 있다. 구문 "세포의 증식을 억제하는"은 비처리 세포 또는 시험관 내에서 생체 내에서 감소된 수준으로 처리된 세포에 비해 세포의 성장 및/또는 재생의 정도를 감소시키는 단계를 포함한다. 이것은 상기 설명한 바와 같이 정량화할 수 있다.
치료를 목적으로 하는 "대상"은 임의의 동물을 의미한다. 일반적으로, 동물은 포유동물이다. 치료를 목적으로 하는 "포유동물"은 포유동물로서 분류되는 임의의 동물, 예를 들어 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 나타낸다. 일반적으로, 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 추가의 치료제와 "조합한" 투여는 동시 (병행) 및/또는 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대상에서 질병 또는 질환의 치료에 효과적인 약물의 양을 의미한다. 신장 질병의 경우에, 약물의 유효량은 질병의 증상을 감소시키거나 또는 질병을 완화 또는 제거할 수 있다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 억제 조치 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 것은 이미 질환에 걸린 것뿐만 아니라, 질환이 예방되어야 하는 것을 포함한다.
"질환"은 본 발명의 분자를 사용한 치료로부터 이익을 얻는 임의의 병태이다. 예를 들어, 본원에 기재된 신장 질환을 참조한다. 이것은 포유동물이 문제되는 질환에 걸리기 쉽게 하는 병적 상태를 포함하는 만성 및 급성 질병 또는 질환을 포함한다.
"형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는지의 여부와 무관하게 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 흡수를 의미한다. 많은 형질감염 방법, 예를 들어 CaPO4 및 전기천공이 당업자에게 알려져 있다. 성공적인 형질감염은 일반적으로 상기 벡터가 작동함을 나타내는 임의의 표시가 숙주 세포 내에서 발생할 때 알 수 있다.
"형질전환"은 DNA가 염색체 외부의 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA가 유기체 내로 도입됨을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 문헌 ([Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972)]; 및 [Mandel et al. J. Mol. Biol, 53: 154 (1970)])에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 일반적으로 실질적인 세포벽 장벽을 포함하는 원핵세포 또는 다른 세포에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법이 종종 사용된다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 1983년 8월 16일 등록된 미국 특허 4,399,216 (Axel)에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 ([Van Solingen et al. J. Bact., 130: 946 (1977)] 및 [Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)])의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 핵 주사 또는 원형질체 (protoplast) 융합과 같이 DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법을 사용할 수도 있다.
신장 질병
사구체 매트릭스 축적의 중요한 결정자는 ECM 합성과 분해 사이의 균형이다 (예를 들어, 문헌 [Schnaper, H. W. (1995). Balance between matrix synthesis and degradation: a determinant of glomerulosclerosis. Pediatr Nephrol 9, 104-111] 참조). 상기 균형이 파괴되면, 신장 질환이 발생한다. 예를 들어, 사구체경화증은 정상적인 기능적 사구체 조직이 세포외 매트릭스 (ECM)의 축적된 침착에 의해 교체되는 과정이다. 사구체경화증에 대한 현재의 치료제 (예를 들어, 스테로이드, 시클로스포린 등)에 장기간 노출되면 종종 몇몇 장기에 부작용이 유발된다. 또한, 현재의 치료는 반드시 질병의 진행을 중지시키거나 역전시키지 않아서, 여전히 신장 투석 또는 신장 이식과 같은 추가의 치료를 필요로 한다.
VEGF의 하향조절을 갖는 신장병은 종종 사구체경화증 및 자가-면역 침착과 상관된다 (예를 들어, 문헌 [Shulman, K., et al. Expression of vascular permeability factor(VPF/VEGF) is altered in many glomerular diseases. J Am Soc Nephrol 7:661-666 (1996a)]; [Noguchi, K., et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998)]; [Shulman, K., et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) is altered in many glomerular diseases. J-Am-Soc-Nephrol 7:661-666 issn: 1046-6673 (1996b)]; [Wada, Y., et al. (2002). Impairment of vascular regeneration precedes progressive glomerulosclerosis in anti-Thy 1 glomerulonephritis. Kidney Int 61:432-443)]; 및 [Yuan, H. T., et al. (2002). Angiopoietin correlates with glomerular capillary loss in anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. Kidney Int 61:2078-2089]) 참조).
본원은 신장 발달 동안 신장 세포에서 VEGF-A 및 VEGFR의 기능을 설명한다. 상기 기능을 간섭하면 마우스에서 사구체경화증을 유발한다. 본 발명은 VEGFR의 조정인자를 사용하여 대상에서 신장 병태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 어구 "신장 병태"는 임의의 구조적 및/또는 기능적 신장 이상을 나타내도록 "신장 질환" 또는 "신장 질병" 또는 "신장병"과 상호 교환가능하게 사용된다. VEGFR의 조정인자는 VEGFR 리간드, 예를 들어, VEGF (A, B, C, D 및/또는 E), Flt-1 효능제 (예를 들어, Flt-선택적 VEGF 변이체, VEGF-B, PlGF), VEGFR 효능제 항체, VEGFR 효능제 소분자 등 (이는 신장 질병, 예를 들어, 염증성 신장 질병, 사구체경화증 등을 치료하기 위한 치료제일 수 있음)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 신장 질병은 감염에 의해 유발된다. 특정 실시태양에서, 대상은 신장 질병에 대해 다른 물질, 예를 들어, 스테로이드, 시클로스포린 등을 사용하여 치료받고 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 유효량의 Flt1 효능제가 대상에게 신장 병태를 치료하기 위해 투여된다. 본 발명의 한 실시태양에서, KDR 효능제 또는 다른 혈관신생 인자가 Flt1 효능제와 조합으로, 예를 들어 Flt1보다 더 적은 비율로 투여될 수 있고, 이는 혈관신생의 자극을 제공함으로써 최대 치료 이익을 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, KDR 효능제 또는 다른 혈관신생 인자는 Flt1 효능제와 조합으로, 예를 들어 Flt1보다 높은 비율로 또는 동일 비율로 투여될 수 있다. 다른 실시태양에서, KDR에 대해 Flt-1을 우세하게 활성화시키는 VEGF 변이체가 안전성 및 효능의 최적 특징을 조합하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, VEGF는 Flt1 효능제와 조합으로 투여된다.
신장 병태의 치료는 당업자가 예를 들어 조직학적 분석 및 면역세포화학에 의해, 소변 분석, 예를 들어, 혈액 요소 질소 (B.U.N), 혈청 크레아틴 등에 의해, 평균 동맥 혈압의 측정 등에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 염증성 신장 질병은 염증성 세포의 변경, 면역 복합체 침착, 예를 들어, IgM 침착, 또는 질병에 걸린 사구체에서 보체 활성화, 예를 들어, C1q, C3 및 C4의 활성화를 특징으로 하고, 그에 의해 치료를 평가한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 신장병은 신장 혈관사이 세포의 변경, 예를 들어, VEGF 수준의 감소를 포함하는 한편, 치료는 반대 효과를 가질 것이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 사구체신염은 단백뇨, 사구체 경화증, 고혈압, 또는 그의 조합을 측정함으로써 결정되고, 그에 의해 치료가 평가된다. 이는 또한 신장 세포, 예를 들어, 신장 혈관사이 세포의 생존율, ECM 합성의 유전자 발현 또는 매트릭스 분해를 결정함으로써 평가할 수 있다. 상기한 경우에, 사구체신염은 신장 혈관사이 세포의 감소된 생존율, ECM 합성의 유전자 발현의 증가, 매트릭스 분해의 감소 또는 그의 조합에 의해 결정될 수 있는 한편, 치료는 반대 효과를 가질 것이다.
본 발명의 조성물 및 그의 생산
본 발명은 신장에서 VEGFR, 예를 들어, VEGFR-1 및 VEGFR-2 활성을 조정할 수 있는 다양한 물질의 용도에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "물질" 또는, 별법으로, "화합물"은 확인가능한 분자 구조 및 물리화학적 특성을 갖는 임의의 물질을 나타낸다. VEGFR 활성을 조정할 수 있는 물질의 비제한적인 예는 항체, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 다당류, 올리고당, 핵산, 생물유기 분자, 펩티드 모방체 (peptidomimetic), 약물학적 물질 및 그들의 대사체, 전사 및 번역 제어 서열 등을 포함한다.
본 발명에 포함되는 VEGFR 조정제는 VEGFR의 효능제일 수 있다. 예를 들어, VEGFR 효능제는 성장 인자 리간드 (예를 들어, VEGF, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF E, PlGF 등 (일반적으로, VEGF, VEGF B 및/또는 PlGF)) 또는 VEGFR의 세포외 도메인에 결합하여 그의 신호 전달 활성을 촉발하는 항체일 수 있다. 별법으로, VEGFR 효능제는 VEGFR의 세포질 도메인에 결합하여 그의 티로신 인산화를 매개하는 소분자 화합물일 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 효능제는 Flt-1에 "선택적" 또는 "특이적"이다. 즉, 이 효능제는 배타적으로 또는 바람직하게는 다른 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 KDR보다 Flt-1을 조정한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 효능제는 KDR에 "선택적" 또는 "특이적"이다. 즉, 이 효능제는 배타적으로 또는 바람직하게는 다른 수용체 티로신 키나제, 예를 들어 Flt-1보다 KDR을 조정한다. 한 측면에서, 본 발명의 VEGFR 효능제는 선택적으로 Flt-1에 결합할 수 있는 VEGF 변이체 폴리펩티드 (이하 "Flt-1 선택적 VEGF 변이체", 또는 "Flt1-sel", 또는 "Flt1sel")를 포함한다. 한 측면에서, VEGFR 효능제는 선택적으로 Flt1에 결합하는 VEGF-B 또는 PlGF이다.
Flt-sel 및 그의 제조 방법은 공지되어 있고, 하기 실시예에서 설명된다. Flt-sel에 대한 추가의 개시 내용은 예를 들어 PCT 공개 WO 00/63380 및 문헌 [Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823-29828 (2000)]에서 볼 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, Flt-sel 변이체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 천연 VEGF의 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도와 동등하거나 이보다 더 큰 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 보이고, 훨씬 더 바람직하게는, 상기 VEGF 변이체는 천연 VEGF가 KDR에 대해 보이는 결합 친화도보다 더 작은, KDR 수용체에 대한 결합 친화도를 보인다. 상기 VEGF 변이체의 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도는 천연 VEGF에 비해 거의 동일하거나 (불변) 또는 더 크고 (증가), VEGF 변이체의 KDR 수용체에 대한 결합 친화도가 천연 VEGF에 비해 더 작거나 거의 제거될 경우, VEGF 변이체의 결합 친화도는 본원의 목적을 위해 Flt-1 수용체에 대해 "선택적인" 것으로 간주된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 Flt-1 선택적 VEGF 변이체는 KDR 수용체에 대해 적어도 10배 더 작은 결합 친화도를 가질 것이고 (천연 VEGF에 비해), 훨씬 더 바람직하게는 KDR 수용체에 대해 적어도 100배 더 작은 결합 친화도를 가질 것이다 (천연 VEGF에 비해). VEGF 변이체의 각각의 결합 친화도는 당업계에 공지되고 PCT 공개 WO 00/63380에 설명된 ELISA, RIA, 및/또는 BIAcore 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 신장 치료를 위한 다양한 방법은 KDR 활성을 조정할 수 있는 물질의 투여를 추가로 포함한다. 예를 들어, KDR 효능제는 신장 질병을 치료하기 위해 Flt-1 효능제와 조합하여 투여될 수 있다. KDR은 내피세포 증식에서 VEGF의 활성을 매개하는 주요 수용체 티로신 키나제로서 확인되었다.
한 측면에서, KDR 효능제는 VEGF (및 VEGF-C 또는 VEGF-D) 또는 선택적으로 KDR에 결합할 수 있는 VEGF 변이체 폴리펩티드 (이후 "KDR 선택적 VEGF 변이체", 또는 "KDR-sel", 또는 "KDRsel"로 언급됨)를 포함한다. KDR-sel VEGF 변이체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 PCT 공개 WO 00/63380 및 문헌 [Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823-29828 (2000)]에 상세히 설명되어 있다. 한 실시태양에서, KDR-sel은 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 천연 VEGF의 KDR 수용체에 대한 결합 친화도와 동등하거나 이보다 더 큰 KDR 수용체에 대한 결합 친화도를 보이고, 훨씬 더 바람직하게는, 상기 VEGF 변이체는 천연 VEGF가 flt-1에 대해 보이는 결합 친화도보다 더 작은, flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 보인다. 상기 VEGF 변이체의 KDR 수용체에 대한 결합 친화도는 천연 VEGF에 비해 거의 동일하거나 (불변) 또는 더 크고 (증가), VEGF 변이체의 flt-1 수용체에 대한 결합 친화도가 천연 VEGF에 비해 더 작거나 거의 제거될 경우, VEGF 변이체의 결합 친화도는 본원의 목적을 위해 KDR 수용체에 대해 "선택적인" 것으로 간주된다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 KDR-sel은 Flt-1 수용체에 대해 적어도 10배 더 작은 결합 친화도를 가질 것이고 (천연 VEGF에 비해), 훨씬 더 바람직하게는 Flt-1 수용체에 대해 적어도 100배 더 작은 결합 친화도를 가질 것이다 (천연 VEGF에 비해). VEGF 변이체의 각각의 결합 친화도는 당업계에 공지된 ELISA, RIA, 및/또는 BIAcore 분석에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 KDR-sel은 또한 KDR 수용체의 인산화를 유도하는 능력을 반영하는 KIRA 분석에서 활성을 보일 것이다. 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명의 KDR 선택적 VEGF 변이체는 추가로 또는 별법으로 내피세포 증식 (HUVEC 증식 분석과 같은 공지의 방법에 의해 결정될 수 있음)을 유도할 것이다.
한 측면에서, 본 발명의 VEGFR 조정제는 재조합 방법에 의해 생산된다. 상기 방법에 사용되는 단리된 DNA는 3'- 및/또는 5'-인접 구역이 존재하거나 존재하지 않는 화학적으로 합성된 DNA, cDNA, 염색체, 또는 염색체 외부 DNA를 의미하는 것으로 본원에서 이해된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, VEGFR 조정제는 재조합 세포 배양액에서 합성에 의해 제조된다.
상기 합성을 위해, VEGF 또는 VEGFR 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산이 필요하다. VEGF 분자를 코딩하는 DNA는 (a) 뇌하수체 난포 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, (b) 라이브러리에서 상동성 서열을 포함하는 클론을 검출하기 위해서 VEGF 또는 그의 단편 (100개의 염기쌍 이하 또는 초과의 길이)을 코딩하는 표지된 DNA를 사용하여 혼성화 분석을 수행하고, (c) 전장 클론을 확인하기 위해 제한 효소 분석 및 핵산의 서열결정에 의해 클론을 분석함으로써 뇌하수체 난포 세포, 예를 들어 소 뇌하수체 난포 세포로부터 얻을 수 있다. 전장 클론이 cDNA 라이브러리에 존재하지 않으면, 본원에서 처음으로 개시되는 핵산 서열 정보를 사용하여 적절한 단편을 다양한 클론으로부터 회수하고 클론에 공통적인 제한 부위에서 라이게이션시켜 VEGF를 코딩하는 전장 클론을 조립할 수 있다. 별법으로, 게놈 라이브러리가 요구되는 DNA를 제공할 것이다. 이 DNA가 일단 확인되고 라이브러리로부터 단리된 후에, 추가의 클로닝 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내에 라이게이션된다.
재조합 발현 시스템의 한 예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, VEGF-코딩 유전자 등은 예를 들어 VEGF를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 사용한 형질전환에 의해 세포 시스템에서 발현된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 배양 배지 또는 숙주 세포의 원형질막 공간에서 폴리펩티드를 얻기 위해, 즉 분비된 분자를 얻기 위해 상기 프로세싱을 달성할 수 있는 숙주 세포를 형질전환시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 실시태양에서, Flt-1 효능제는 Flt-1에 선택적으로 결합하여 활성화시키는 성장 인자를 포함한다. 태반 성장 인자 (PlGF) 및 VEGF-B를 포함하고 이로 제한되지 않는, Flt-1에는 특이적으로 결합하지만 KDR에는 결합하지 않는 몇몇 천연 발생 VEGF 상동체가 확인되었다. PlGF는 VEGF의 혈소판-유래 성장 인자-유사 도메인과 53%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다 ([Park et al. J. Biol. Chem. 269:25646-54 (1994)]; [Maglione et al. Oncogene 8:925-31 (1993)]). VEGF와 마찬가지로, 상이한 종의 PlGF가 mRNA의 선택적인 스플라이싱으로부터 발생하고, 단백질은 이량체 형태로 존재한다 (예를 들어, [Park et al., 상기 문헌] 참조). PlGF-1 및 PlGF-2는 모두 Flt-1에 높은 친화도로 결합하지만, KDR과 상호작용할 수 없다 (예를 들어, [Park et al., 상기 문헌] 참조).
VEGF-B는 Flt-1에 특이적으로 결합하는 것으로 보이는 두개의 이소형 (167개 및 185개의 잔기)으로서 생산된다 (Pepper et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11709-11714 (1998)). VEGF의 긴 형태에 유사하게, VEGF-B는 헤파린 첨가 후에 가용성 형태로 방출될 수 있는 막 결합 단백질로서 발현된다. VEGF-B 및 VEGF는 또한 동시에 발현될 때 이종이량체를 형성할 수도 있다 (Olofsson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2576-2581 (1996)).
본 발명에 유용한 화합물은 RTK의 세포내 티로신 키나제 도메인에서 그들의 조정 기능을 나타내는 작은 유기 분자를 포함한다. 특정 바람직한 실시태양에서, 소분자 효능제는 티로신 인산화를 자극하여 상응하는 신호전달 경로를 활성화시키기 위해 사용된다.
본 발명에서 유용한 화합물은 효능제 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 일반적으로 수용체 (예를 들어 Flt-1)에 대해 특이적이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 항-Flt-1 항체를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 항-Flt-1 항체는 KDR 기능에 영향을 주지 않으면서 Flt-1에 선택적으로 결합하여 이를 조정한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 항-Flt-1 항체는 효능제 항체이다.
용도
본 발명은 예를 들어 유효량의 VEGFR 효능제를 투여하여 혈관사이 세포 생존율을 증가시킴으로써 신장 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 생존율 증가 효과는 당업계에 공지되고 본원에 설명되는 방법을 사용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 합성의 유도를 평가할 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)] 참조), 산화질소 생산을 모니터링할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998)] 참조). 세포 증식은 DNA 합성 속도 측정, 트리판 블루 염료 배제/혈구계 계수, 또는 유동 세포 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양 동안 평가한다 (또한, 예를 들어, 문헌 [Onozaki, A., et al. Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione. Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004)] 참조).
한 측면에서, 본 발명은 신장 활성 조절에 중요한 인자의 유전자 발현을 상향조절하거나 하향조절하기 위해 VEGFR 효능제를 사용하는 방법을 제공한다 (예를 들어, 표 2). 표적 세포/조직에서 mRNA 발현 또는 단백질 발현의 수준을 검출하기 위한 방법 및 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 유전자 발현 수준은 혼성화 및 후속 검출 및 측정에 적합한 조건 하에 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 프로브를 사용한 공지의 핵산 혼성화 분석에 의해 검출될 수 있다. 유전자 발현 검출에 유용한 방법은 다양한 세포 종류에서의 서던 혼성화 (Southern J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)), 노던 (northern) 혼성화 (예를 들어, 문헌 [Freeman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4094-4098 (1983)] 참조), 제한 엔도뉴클레아제 매핑 (mapping) (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), RNase 보호 분석 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1997), DNA 서열 분석, 및 폴리머라제 연쇄 반응 증폭 (PCR; 미국 특허 4,683,202, 4,683, 195, 및 4,889,818; [Gyllenstein et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA 85:7652-7657 (1988)]; [Ochman et al. Genetics 120:621-623 (1988)]; 및 [Loh et al. Science 243:217-220 (1989)]) 후에 유전자에 특이적인 프로브를 사용한 서던 혼성화를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 당업계에 일반적으로 공지된 다른 증폭 방법이 사용될 수 있다. 노던 또는 서던 블롯 분석에 대한 혼성화 조건의 엄격도는 사용되는 특이적 프로브에 대해 요구되는 관련도로 핵산을 검출할 수 있도록 조정될 수 있다. 또한, 세포 또는 조직 샘플에서의 유전자 발현은 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1997]에 따른 계내 혼성화 기술을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있다.
단백질 수준은 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 면역분석에 의해 검출될 수 있다. 방사성 면역분석, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사 측정 분석, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 계내 면역분석 (콜로이드성 금, 효소 또는 방사성 동위원소 표지), 웨스턴 블롯 분석, 침전 반응, 응집 분석 (예를 들어, 겔 응집 분석, 적혈구 응집 분석), 보체 고정 분석, 면역형광 분석, 단백질 A 분석, 면역 전기영동 분석 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 면역분석을 사용할 수 있다. 한 실시태양에서, 항체 결합은 1차 항체에 대한 표지를 검출함으로써 검출된다. 다른 실시태양에서, 1차 항체는 1차 항체에 대한 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 실시태양에서, 2차 항체가 표지된다. 면역분석에서 결합을 검출하기 위한 많은 수단이 당업계에 공지되어 있고, 이것은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
항체
본 발명의 항체는 항-VEGFR 항체 또는 VEGFR의 항원 결합 단편, 또는 본원에 기재된 다른 항체를 포함한다. 예시적인 항체는 예를 들어 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 단편, 다중특이적, 이종컨쥬게이팅된 (heteroconjugated), 다가, 효과기 기능 항체 등을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 항체는 효능제 항체이다.
폴리클로날 항체
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, VEGFR에 대한 폴리클로날 항체는 관련 항원 및 어쥬번트 (adjuvant)의 1회 또는 다수회의 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성시킬 수 있다. 2관능성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 면역화되는 종에 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다.
동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 컨쥬게이트 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 (Freund) 완전 어쥬번트와 합한 후 용액을 다중 부위에 피내 주사함으로써 VEGFR, 면역원성 컨쥬게이트, 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후에, 동물은 프로인트 완전 어쥬번트 중의 펩티드 또는 컨쥬게이트를 처음 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 부스터된다. 7일 내지 14일 후에, 동물에서 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스터한다. 전형적으로, 동물은 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 컨쥬게이팅된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 부스터된다. 컨쥬게이트는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양으로 제조될 수도 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 응집제, 예를 들어 명반을 적절하게 사용한다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이는 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 설명한 바와 같이 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
이와 같이 제조한 하이브리도마 세포는 전형적으로 융합되지 않은 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모골수종 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
전형적인 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 이 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 메릴랜드주 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection))에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는 예를 들어 VEGFR에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소 결합 면역 측정법 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해, 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 항체의 재조합 생산은 아래에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
다른 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)]에서는 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 단리를 설명하고 있다. 후속 문헌은 사슬 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 제조를 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 설명하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 실행가능한 대안이다.
또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (미국 특허 4,816,567; [Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인을 대체하거나, 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대체하여 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
인간화 항체 및 인간 항체
본 발명의 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 일반적으로 "도입 (import)" 가변 도메인으로부터 취한 "도입" 잔기로서 종종 언급된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 및 공동연구자의 방법 ([Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])을 따라 수행할 수 있다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체 (미국 특허 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
인간화 항체 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "최적 맞춤 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열은 공지의 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류와 가장 근접한 인간 서열은 이어서 인간화 항체의 인간 프레임워크 구역 (FR)으로서 허용된다 ([Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래한 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immnol, 151:2623 (1993)]).
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 전형적인 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 줄 때 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관련된다.
별법으로, 내인성 면역글로불린이 생성되지 않는 상태에서 면역화시에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험접종시에 인간 항체의 생성을 유발할 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al. Nature 355:258 (1992)])를 참조한다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다 (문헌 ([Hoogenboom et al., J. Mol.. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol.. Biol., 222:581-597 (1991)]; [Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)] 참조).
또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)])를 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 또한 항체의 기능성 특성에 기초한 선택을 통해 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 예를 들어 문헌 [Johnson, K S. and Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993)]에서 검토된 바와 같은 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다. 코울 (Cole) 등 및 뵈르너 (Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]). 인간 항체는 또한 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해서도 생성될 수 있다 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조).
항체 단편
또한, 항체 단편도 본 발명에 포함된다. 항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 직접 재조합 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의한 바와 같은 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시태양에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 5,571,894; 및 미국 특허 5,587,458을 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 구역이 결여된 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 단편이고, 따라서 생체내 사용 동안 비특이적 결합의 감소에 적합하다. SFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에 효과기 단백질의 융합체를 생성시키도록 제조될 수 있다 (문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조). 또한, 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적)
또한, 본 발명의 항체는 예를 들어 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적 항체를 포함한다. 상기 분자는 일반적으로 단지 2개의 항원에 결합하는 반면 (즉, 이중 특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예를 들어, 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우, 상기 표현에 포함된다. BsAb의 예는 종양 세포 항원에 대해 작용하는 하나의 아암과 세포독성 유발 분자에 대해 작용하는 다른 아암을 갖는 것, 예를 들어, 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185HER2/FcγRⅢ (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD3/항-p185HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장 세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-폴레이트 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-판(pan) 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3; 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 아암과 독소에 결합하는 하나의 아암을 갖는 BsAb, 예를 들어, 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 사슬, 항-인터페론-α (IFN-α)/항-하이브리도마 개별특이형, 항-CEA/항-빈카 알칼로이드; 효소에 의해 활성화되는 전구약물을 전환시키는 BsAb, 예를 들어, 항-CD30/항-알칼린 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물의 미토마이신 알콜로의 전환을 촉매함); 섬유소 용해 물질로서 사용될 수 있는 BsAb, 예를 들어, 항-섬유소/항-조직 플라스미노겐 활성제 (tPA), 항-섬유소/항-유로키나제형 플라스미노겐 활성제 (uPA); 면역 복합체를 세포 표면 수용체에 표적화시키기 위한 BsAb, 예를 들어, 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRⅡ 또는 FcγRⅢ); 감염 질환 치료에 사용하기 위한 BsAb, 예를 들어, 항-CD3/항-단순 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV; 시험관 내 또는 생체 내에서 종양 검출을 위한 BsAb, 예를 들어, 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185HER2/항-합텐; 백신 어쥬번트로서 BsAb; 및 진단 도구로서의 BsAb, 예를 들어, 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-β-갈락토시다제를 포함한다. 삼중특이적 항체의 예는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37을 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 항-Flt1 효능제/항-인테그린 α-8이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 그 중 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합체는 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2, 및 CH3 구역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 구역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특별히 유의한 영향을 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입할 수 있다.
상기 방법의 한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
W096/27011에 기재된 다른 방법에 따라, 한쌍의 항체 분자들 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 공학적으로 처리될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예, 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "캐비티"가 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체 (homodimer)에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술도 문헌에서 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에서는 무손상 항체가 단백질 분해 방식으로 절단되어 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술하고 있다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지하기 위해 디티올 착화제인 아비소산나트륨의 존재 하에 환원된다. 이어서 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로 환원시켜 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로서 사용될 수 있다.
최근의 진보는 이중특이적 항체를 형성하도록 화학적으로 커플링될 수 있는, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에서는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었고, 이중특이적 항체를 형성하도록 시험관 내에서 유도 화학 커플링 반응에 적용되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 VEGF 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
이중특이적 항체 단편을 재조합 세포 배양액으로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 설명되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드가 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 구역에서 환원되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 본 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 강제로 페어링되고, 이에 의해 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용한 이중특이적 항체 단편의 다른 제조 전략도 보고된 바 있다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)] 참조).
3가 이상의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)).
이종컨쥬게이트 항체
이중특이적 항체는 본 발명의 항체인 가교결합된 또는 "이종컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종컨쥬게이트에서 한 항체는 아비딘에, 다른 항체는 비오틴에 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 대해 표적화시키고 (미국 특허 4,676,980), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
다가 항체
본 발명의 항체는 다가 항체를 포함한다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빠르게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 (예를 들어 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스가 아닌)일 수 있고, 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 구역 또는 힌지 구역을 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 구역 및 Fc 구역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 구역의 하나의 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 구역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 구역 사슬을 포함할 수 있다. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는 예를 들어 약 2 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
효과기 기능의 공학 처리
예를 들어, 항체의 질병 치료 효능을 향상시키기 위해 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)이 Fc 구역 내에 도입되어, 상기 영역 내에서의 사슬내 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력을 보일 수 있다 (문헌 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]) 참조. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 구역의 에피토프를 나타낸다.
다른 항체 변형
항체의 다른 변형도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
리포좀 및 나노입자
본 발명의 폴리펩티드는 리포좀으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 VEGFR 조정인자는 면역리포좀으로서 제제화될 수도 있다. 폴리펩티드를 함유하는 리포좀은 문헌 ([Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)]; 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545)에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다. 일반적으로, 리포좀의 제제화 및 용도는 당업자에게 공지되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하기 위해 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 폴리펩티드는 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀 (예를 들어, 항체의 Fab' 단편)에 컨쥬게이트될 수 있다. 또한, 나노입자 또는 나노캡슐이 본 발명의 폴리펩티드를 봉입하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다.
다른 용도
항-VEGFR 항체는 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항-VEGFR 항체는 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 그의 발현을 검출하기 위한 VEGFR 또는 VEGFR의 단편의 진단 분석에, 예를 들어 본원에서 설명되는 질환의 질병 검출을 위한 목적 등에 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, VEGFR 항체는 본원에서 제시된 방법을 사용하여 치료하기 위한 환자 집단을 선택하기 위해 사용된다. 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술, 예를 들어 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 불균질 또는 균질상에서 수행되는 면역침전 분석을 사용할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. 진단 분석에서 사용되는 항체는 검출가능한 모이어티 (moiety)로 표지될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 생산할 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린 또는 효소, 예를 들어 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 문헌 ([Hunter et al., Nature. 144:945 (1962)]; [David et al., Biochemistry. 13:1014-1021 (1974)]; [Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219-230 (1981)]; 및 [Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)])에 설명된 방법을 포함하여 항체를 검출가능한 모이어티에 컨쥬게이팅시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-VEGFR 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 VEGFR의 친화도 정제에 유용하다. 상기 방법에서, VEGFR에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 지지체, 예를 들어 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정된다. 이어서, 고정된 항체는 정제될 VEGFR을 함유하는 샘플과 접촉한 후, 지지체를 적합한 용매로 세척하고, 이에 의해, 고정된 항체에 결합된 VEGFR을 제외하고 샘플 내의 실질적으로 모든 물질이 제거될 것이다. 마지막으로, 지지체는 항체로부터 VEGFR을 방출시키는 다른 적합한 용매로 세척한다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 폴리펩티드는 용이하게 수득할 수 있는 물질 및 기술을 사용하여 재조합 방식으로 생산할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 VEGFR 조정제의 재조합 생산을 위해 그를 코딩하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입시킨다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 통상의 방법을 사용하여 용이하게 단리하고 서열화한다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 단리하고, 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 서열을 결정한다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
신호 서열 성분
본 발명의 폴리펩티드는 직접적으로 재조합 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 전형적으로 신호 서열인 이종 폴리펩티드 또는 성숙 단백질 또는 폴리클로날 항체의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 생산될 수 있다. 전형적으로 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨)되는 것이다. 천연 폴리펩티드 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼킨 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 내열성 장독소 Ⅱ 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열로 대체된다. 효모에서의 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기술된 신호로 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
상기 전구체 구역에 대한 DNA는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 해독 프레임으로 라이게이션된다.
복제 기점 성분
발현 및 클로닝 벡터 둘 모두는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터를 복제시킬 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 숙주 염색체 DNA와 상관없이 벡터를 복제시킬 수 있는 것이고, 복제 기점 또는 자동 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).
선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택법에서 생존할 수 있다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 일반적으로 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
별법으로, 본 발명의 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병소의 존재는 트립토판 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1에서 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]에 보고되었다. 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).
프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 포함할 것이다.
프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵세포 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 구역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 구역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터 본 발명의 폴리펩티드의 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 일반적으로는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
인핸서 요소 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 일반적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 폴리펩티드 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 일반적으로 프로모터로부터 5'의 부위에 위치한다.
전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 구역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 구역이다. W094/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터 내의 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵, 효모 또는 고등한 진핵 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵세포는 원시세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 일반적으로, 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 비, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
원핵세포 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 본 발명의 폴리펩티드 코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 제빵용 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔하게 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스, 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
본 발명의 글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 감자의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.
그러나, 척추동물 숙주 세포가 가장 널리 사용되고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드 생산을 위해 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양된다.
숙주 세포의 배양
본 발명의 폴리펩티드 생산에 사용되는 숙주세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 (Dulbecco) 개질 이글 (Eagle) 배지 (DMEM, 시그마), 신장 세포의 정상 성장 배지 등이 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985)에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물도 당업자에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 자명할 것이다.
폴리펩티드 정제
재조합 기술을 사용할 때, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 VEGFR 조정제는 세포 내에서, 원형질막 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합된 경우에는, 폴리펩티드는 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소에 의한 절단으로 막으로부터 방출될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 사이클, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포용해제에 의해 파괴될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 과정의 예이다: 이온-교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 헤파린 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼, DEAE 등) 상의 SEPHAROSE™ 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용한 겔 여과; 오염물, 예를 들어 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-태깅된 (tagged) 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 단백질의 다양한 정제 방법을 사용할 수 있고, 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 ([Deutscher, Methods in Enzvmology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)])에 설명되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어 사용된 생산 방법의 특성 및 생산되는 본 발명의 특정 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다.
예를 들어, 세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 대표적인 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종류 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al. J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al. EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 공극 제어 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker, 미국 뉴저지주 필립스버그))가 정제에 유용하다. 상기한 바와 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다. 이. 콜라이의 원형질막 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 방법을 설명하고 있는 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]를 참조한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 공유 변형
본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 VEGFR 조정제 등의 공유 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 변형은 폴리펩티드의 화학적 합성 또는 적용가능한 경우에 폴리펩티드의 효소에 의한 또는 화학적 절단에 의해 수행될 수 있다. 폴리펩티드의 다른 종류의 공유 변형은 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기와, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나 또는 변형 아미노산 또는 비천연 아미노산을 연장되는 폴리펩티드 사슬 내에 포함시킴으로써 분자 내에 도입된다 (예를 들어, 문헌 [Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]; [Noren et al. Science 244: 182 (1989)]; 및 미국 특허 출원 공개 20030108885 및 20030082575 참조).
시스테이닐 잔기를 가장 통상적으로는 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응시켜 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디술피드, 메틸 2-피리딜 디술피드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도된다.
히스티딜 잔기는, 히스티딜 측쇄에 비교적 특이적이기 때문에 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카르보네이트와 반응시킴으로써 유도체화된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드도 유용하고, 반응은 일반적으로 pH 6.0의 0.1M 나트륨 카코딜레이트에서 수행된다.
라이시닐 및 아미노-말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응된다. 이들 물질을 사용하는 유도체화는 라이시닐 잔기의 하전을 역전시키는 효과를 갖는다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스테르, 예를 들어 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로히드라이드, 트리니트로벤젠술폰산, O-메틸이소우레아, 2,4-펜탄디온, 및 글리옥실레이트를 사용하는 트랜스아미나제-촉매화 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇몇의 통상적인 시약, 예를 들어 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-시클로헥산디온, 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 높은 pKa의 구아니딘 관능기 때문에 알칼리 조건에서 수행될 것을 요구한다. 더욱이, 이들 시약은 라이신의 기뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형은 특히 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼 표지를 티로실 잔기 내로 도입함으로써 이루어질 수 있다. 가장 통상적으로, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 형성하기 위해 사용된다. 티로실 잔기를 125I 또는 131I로 요오드화하여 방사성 면역 분석에 사용되는 표지된 단백질을 생산한다.
카르복실 측쇄기 (아스파르틸 또는 글루타밀)는 카르보디이미드 (R-N=C=N-R') (여기서, R 및 R'는 상이한 알킬기임), 예컨대 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 이들 잔기는 중성 또는 염기성 조건 하에 탈아미드화된다. 탈아미드화된 형태의 상기 잔기는 본 발명의 범위에 포함된다.
다른 변형에는 프롤린 및 라이신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화가 포함된다.
또다른 종류의 공유 변형은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리펩티드 VEGFR 조정제 등에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 이들 과정은 이들이 N- 또는 O-연결 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생산을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 유리 술프히드릴기, 예컨대 시스테인의 유리 술프히드릴기, (d) 유리 히드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 요구한다. 이 처리는 연결 당 (N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 제외한 대부분의 당 또는 모든 당을 절단하지만, 폴리펩티드는 손상시키지 않는다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 ([Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987)] 및 [Edge et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981)])에 기재되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 상의 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 공유 변형의 또다른 형태는 폴리펩티드를 미국 특허 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 임의의 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다.
제약 조성물
본 발명의 방법에 따른 생체내 사용을 위해, 본 발명의 치료 화합물은 당업계에 공지되고 특정 용도에 적합한 방법 및 기술을 사용하여 대상에게 투여된다. 바람직한 실시태양에서, 화합물은 제약 조성물 형태로 제약상 허용되는 투여량으로 투여된다.
한 측면에서, 본 발명은 치료 단백질 물질의 투여를 위한 치료 단백질 물질의 단백질 제제 (예를 들어, 재조합 단백질 제제)의 용도를 고려한다. 한 측면에서, 본 발명은 치료 단백질 물질 (예를 들어, 폴리펩티드 VEGFR 조정제 등)의 투여를 위한 포유동물 세포 제제의 용도를 고려한다. 본원에서 사용되는 포유동물 세포는 상기 상세하게 설명한 바와 같이 단백질을 코딩하는 이종 유전자로 형질감염되었다. 한 실시태양에서, 투여를 위해 사용되는 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명에 따라 사용되는 본 발명의 분자 (예를 들어 VEGFR 조정제, 예를 들어, VEGF, VEGFR 변이체, VEGF 변이체 (예를 들어, Flt1-sel 또는 KDR-sel), VEGFR 항체, VEGFR 소분자 조정인자 등)의 치료 제제는 요구되는 정도의 순도를 갖는 분자, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 소분자를 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 20th edition, Osol, A. Ed. (2000))와 혼합함으로써 보관을 위해 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 투여 대상에게 비독성이고, 버퍼, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 20th edition, Osol, A. Ed. (2000)]에 개시되어 있다. 또한, 문헌 ([ Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990)]; [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462]); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 및 미국 특허 5,654,010을 참조한다.
특정 실시태양에서, 생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구), 폴리-락트산-co-글리콜산 (PLGA) 중합체 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 폴리펩티드가 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 상실 및 가능하게는 면역원성의 변경을 야기할 수 있다. 관련되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 습기 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성할 수 있다. 또한, 예를 들어 고분자 전해질 (polyelectrolyte) 피복이 존재하는 캡슐을 설명하고 있는 미국 특허 6,699,501을 참고한다.
추가로, 본 발명의 치료 단백질 물질 (예를 들어, VEGFR 조정인자, 예를 들어, VEGF, VEGFR 변이체, VEGF 변이체 (예를 들어, Flt1-sel 또는 KDR-sel), VEGFR 항체 등)을 유전자 요법에 의해 대상에게 도입할 수 있는 것도 고려된다. 유전자 요법은 핵산을 대상에게 투여함으로써 수행되는 요법을 의미한다. 유전자 요법 적용시에, 유전자는 치료상 효과적인 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 예를 들어, 결함 유전자의 대체를 위해 세포 내로 도입된다. "유전자 요법"은 지속 효과가 단일 요법에 의해 달성되는 통상적인 유전자 요법, 및 치료상 효과적인 DNA 또는 mRNA의 1회 투여 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA를 생체 내에서 특정 유전자의 발현을 차단하는 치료제로서 사용할 수 있다. 단쇄 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포막에 의한 흡수가 제한되기 때문에 그의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고 단쇄 안티센스 올리고뉴클레오티드가 억제제로서 작용하는 세포 내로 도입될 수 있다는 것은 이미 밝혀져 있다 [Zamecnik et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]. 올리고뉴클레오티드는 그 흡수를 향상시키기 위해서, 예를 들어 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전된 기로 치환함으로써 변형될 수 있다. 유전자 요법의 방법에 대한 일반적인 개관을 위해서는, 예를 들어 문헌 ([Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)]; [Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan Science 260:926-932 (1993)]; [Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; 및 [May TIBTECH 11:155-215 (1993)])을 참조한다. 재조합 DNA 기술 분야에서 보편적으로 공지되어 있는 사용할 수 있는 방법은 문헌 ([Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]; 및 [Kriegler (1990) Gene Transfer and Expresstion, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기재되어 있다.
핵산을 생육성 세포 내로 도입하기 위해 다양한 기술이 이용가능하다. 핵산을 시험관 내에서 배양된 세포로 전달하는지, 생체 내에서 의도하는 숙주 세포로 전달되는지에 따라 기술이 달라진다. 시험관 내에서 핵산을 포유동물 세포 내로 전달하기에 적절한 기술은 리포좀, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등의 사용을 포함한다. 예를 들어, 생체내 유전자 전달 기술은 바이러스 (전형적으로, 레트로바이러스) 벡터를 사용하는 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개 형질감염을 포함하고, 이로 제한되지 않는다 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)]. 예를 들어, 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스)를 사용하는 형질감염 및 지질-기반 시스템 (예를 들어, 유전자의 지질-매개 전달을 위해 유용한 지질은 DOTMA, DOPE 및 DC-Choi임)을 포함한다. 유전자 요법에서 바이러스 벡터를 사용하는 예는 문헌 ([Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)]; [Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994)]; [Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)]; [Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)]; [Bout et al. Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]; [Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991)]; [Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992)]; [Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)]; 및 [Walsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)])에서 찾을 수 있다.
몇몇 상황에서, 표적 세포를 표적화하는 물질, 예를 들어, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀을 사용하는 경우, 세포내 이입 (endocytosis)과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 예를 들어 특정 세포 종류에 대하여 작용하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적화하고/하거나 그의 흡수를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내 이입 기술은 예를 들어 문헌 ([Wu et al., J. Biol. Chein. 262, 4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)])에 기술되어 있다. 유전자 마킹 (marking) 및 유전자 요법 프로토콜의 개관을 위해 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]를 참조한다.
예를 들어, 유전자 요법을 위한 바이러스 또는 비바이러스 벡터 및 유전자 변형된 신 세포가 신장에서 외래 유전자의 전달을 위해 사용되었다. 다양한 벡터가 상이한 경로를 통해, 동맥내, 요관내 또는 실질내 (intraparenchymal) 주사를 통해 신 세포 내에 주사되었다 ([Bosch R J et al., (1993) Exp Nephrol 1: 49-54]; 및 [Ye X et al., (2001) Hum Gene Ther 12: 141-148]). 실질내 주사의 주요 제한 요인은 일부 신 손상을 유발한다는 것이었다. 또한, 이식 전에 생체 외에서 신장으로 트랜스젠의 전달이 일부 환자에서 사용될 수 있다.
투여량 및 투여
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 치료를 위한 유효 용량의 결정에 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효 용량의 종간 크기 조정 (scaling)은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 규정된 원리에 따라 수행할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 분리 투여, 또는 연속 주입 여부와는 상관없이, 질병 종류 및 심도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1-20 mg/kg)의 VEGFR 조정인자가 환자에게 투여하기 위한 초기의 후보 투여량이다. VEGFR 조정인자의 생체내 투여가 사용될 때, 정상적인 투여량은 투여 경로에 따라 약 10 ng/kg (포유동물 체중) 내지 100 mg/kg/일 또는 또는 이보다 큰 범위, 바람직하게는 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일일 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제시되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212 참조). 예를 들어, 한 장기 또는 조직을 표적으로 하는 투여는 다른 장기 또는 조직과 상이한 방식으로 전달할 것을 필요로 할 수 있기 때문에, 상이한 제제가 상이한 치료 화합물 및 상이한 질환에 대해 효과적일 것으로 예상된다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라 치료는 질병 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있다. 일반적으로, 임상의는 요구되는 생물학적 효과를 제공하는 투여량(들)에 도달할 때까지 본 발명의 분자(들)를 투여할 것이다. 본 발명의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 치료 조성물은 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 경막내, 구강, 국소 및 비내 투여를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 치료 조성물은 특히 조정인자의 감소하는 투여량을 사용하는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 특정 실시태양에서, 치료 조성물은 주사, 예를 들어, 부분적으로는 투여가 단기간에 이루어지는지 또는 장기간에 걸쳐 이루어지는지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
다수의 물질을 사용하는 것도 본 발명에 포함된다. 본원에서 설명되는 바와 같이, VEGFR 조정인자는 하나 이상의 치료제와 조합될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 동시 투여, 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다. 예를 들어, VEGFR 효능제는 추가의 치료제 (예를 들어, 혈관신생제)의 투여 전에, 또는 투여 후에 투여되거나 또는 추가의 치료제와 교대로 투여될 수 있거나, 또는 추가의 치료제와 동시에 투여될 수 있다. 한 실시태양에서, 두개의 (또는 모든) 활성제가 생물학적 활성을 동시에 보이는 시기가 존재한다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, VEGFR 조정인자의 적절한 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질병의 종류, 질병의 심도 및 경과, 물질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 사전 요법, 환자의 임상 병력 및 물질에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 물질은 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 조합 치료 요법에서, 본 발명의 조성물은 치료 유효량 또는 치료상 상승량으로 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 치료 유효량은 VEGFR 조정인자 및 하나 이상의 다른 치료제의 동시 투여 또는 본 발명의 조성물의 투여가 표적 질병 또는 병태를 감소시키거나 억제할 수 있도록 하는 양이다. 치료상 상승량은 특정 질병과 관련된 병태 또는 증상을 상승적으로 또는 현저히 감소시키거나 제거하기 위해 필요한, 예를 들어 본원에 기재된 VEGFR 조정인자 및 하나 이상의 다른 치료제의 양이다.
제품
본 발명의 다른 실시태양에서, 상기한 방법 및 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 신장 질병의 치료에 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 주입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 (bag), 또는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개 (stopper)를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 VEGFR 조정인자이다. 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 조성물이 신장 병태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 또한, 제품은 제약상 허용되는 버퍼, 예를 들어 포스페이트 완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 본원에서 설명된 질환에 대한 VEGFR 조정인자의 용도 및 투여량에 관한 설명서 세트, 일반적으로 사용 설명서가 포함된다. 키트와 함께 포함된 설명서는 일반적으로 치료를 위한 투여량, 투여 계획 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. VEGFR 조정인자의 용기는 단위 용량, 대량 (bulk) 패키지 (예를 들어, 다용량 패키지), 또는 단위 미만 (sub-unit) 용량일 수 있다.
본원에 기재된 실시예 및 실시태양은 단지 예시를 위한 것이고, 그의 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고 본원의 취지와 범위 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적으로 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1: Flt1/VEGFR-1에 의해 매개되는, 신장 혈관사이 세포에서 VEGF-A에 의한 신규한 자가분비 조절 루프의 확인
본 발명자들은 VEGF 수용체-1을 발현하는 세포에서 VEGF 유전자가 제거된 트랜스제닉 마우스를 생성하였다 (Flt1/VEGFR-1). 신장 혈관사이 세포에서 VEGF-A 유전자 제거는 1-3월령의 마우스에서 단백뇨, 사구체 경화증, 고혈압 및 사망을 특징으로 하는 진행성 신부전을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 질병에 걸린 사구체는 족세포에서 감소된 VEGF-A 발현, 및 증가된 수의 염증성 세포, 면역 복합체 조성물 및 보체 활성화를 나타냈다. 혈관사이 세포에서 자가분비 루프를 저해하면 감소된 신장 VEGF 수준과 연관된 인간 신장 병리학의 하위세트를 암시하는 뚜렷한 신 변화를 유도한다. 시험관 내에서 VEGF-A- 및 Flt-1-결핍 혈관사이 세포는 감소된 세포 생존율 및 유전자 발현에서 ECM 합성을 향한 이동 및 감소된 매트릭스 분해를 나타냈다. 상기 발견은 족세포에서 ECM 생산 및 VEGF 발현을 조절하는, VEGF-A와 VEGFR-1 사이에서 신규한 자가분비 신호전달 루프를 확인한 것이다. 신장 세포, 예를 들어, 혈관사이 세포에서 VEGFR1의 자극은 감소된 VEGF-A 수준과 연관된 진행성 사구체경화증의 치료를 위한 치료 전략일 수 있다.
Flt-1: fms-유사 티로신 키나제; GBM: 사구체 기저막; VEGF: 혈관 내피 성장 인자; VEGFR: VEGF 수용체; VEGFR-1: VEGF 수용체; Flt-1: fms-유사 티로신 키나제; VEGFR-2: VEGF 수용체, KDR (또는 Flk1); WT: 야생형; WT-1: 윌름 (Wilm) 종양 핵 단백질-1; ECM: 세포외 매트릭스.
물질 및 방법
VEGF-loxP 및 Flt1-Cre 마우스의 생성 및 ROSA26 리포터 균주로의 사육: VEGF-loxP 마우스를 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)] 참조). 간단히 설명하면, VEGF-loxP 마우스에서 VEGF의 엑손 3은 loxP 부위들과 인접하여, loxP 재조합을 겪는 세포에서 무반응 (null) VEGF 대립유전자를 생성한다. VEGF-loxP 마우스를 Flt1-Cre 마우스와 교배시켰고, 여기서 Flt1 프로모터의 3.1 kb 단편 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor gene. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667 (1997)] 참조)이 Cre-재조합효소의 발현을 구동한다. Flt1-Cre 마우스는 이전에 설명된 바와 같이 (Hogan, B., et al. (eds.) 참조), Cre-재조합효소의 발현을 구동하는 Flt1 프로모터의 3.1 kb 단편을 함유하는 구성체를 마우스 난자 전핵 내로 미세주입함으로써 생성하였다.
마우스 배아 조작 (Cold Spring Harbor Laborator Press, 1994). Cre-재조합효소의 발현을 모니터링하기 위해, Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 또는 Flt-Cre+ 마우스를 ROSA26 리포터 균주 (예를 들어, 문헌 [Mao, X., et al. Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci USA 96, 5037-5042 (1999)] 참조)에 교배시켜, β-갈락토시다제의 편재 발현을 전사/번역 종결 신호에 의해 억제한다. 상기 '스토퍼-단편'은 loxP 부위와 인접하고, Cre-매개된 절개를 겪어 Cre-재조합효소를 발현하는 세포에서 β-갈락토시다제 유전자의 발현을 일으킨다.
Flt1-loxP 마우스의 생성: 다음 프라이머를 사용하는 세균 인공 염색체 라이브러리의 스크리닝 후 뮤린 Flt1 유전자 로커스의 엑손 1을 포함하는 16-kb 게놈 Flt-1 DNA 클론을 단리하였다: Flt1 번역 개시 코돈의 상류 3.0 내지 1.6 kb에 걸치는 1.4 kb HindIII 게놈 DNA 단편을 절제하고, TNLOX1-3 표적화 벡터의 NotI 부위 내로 둔단 (blunt-end) 클로닝하였다. 이어서, 2.0 kb HindIII/BstXI 게놈 DNA 단편을 둔단 연결에 의해 TNLOX1-3의 독특한 AscI 부위 내로, PGK-neoR 카세트의 하류 및 LoxP3의 바로 5'에 클로닝하였다. 상기 2.0 kb 단편은 Flt1 유전자 프로모터, 전사 개시 부위 및 Flt1 유전자의 엑손 1의 구역을 포함하였다. 마지막으로, 2.0 kb BstXI/BsmI 게놈 DNA 단편을 제3 loxP 부위의 바로 3'의 PmeI 부위 내로 둔단 클로닝하여, TKNeoFlt1-1로 표시한 표적화 벡터를 생성하였다. TKNeoFlt1-1을 loxP 부위 및 게놈 DNA 삽입체의 순서 및 배향을 입증하기 위해 서열결정하고, 제한 엔도뉴클레아제로 소화하였다.
표적화 벡터를 SalI 소화에 의해 선형화시키고, 129Sv 균주로부터 유래하는 TCL1 및 R1 ES 세포 내로 20 ㎍ 전기천공하였다. ES 세포 및 마우스 배아 섬유모 세포를 이전에 설명된 바와 같이 뮤린 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재 하에 배양액 내에 유지하였다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126: 1149-1159 (1999a)]). ES 세포를 전기천공 24시간 후 G418 (400 ㎍/ml)을 사용하여 양성 선택하고, 상기 선택의 9일 후에, 개별 콜로니를 집어 성장시키고 서던 블롯 분석에 의해 양성 재조합 사건에 대해 스크리닝하였다. 내성 클론으로부터의 게놈 DNA를 EcoRI (표적화 대상의 5' 단부의 분석을 위해) 또는 HindIII와 KpnI (표적화된 게놈 구역의 3' 단부의 분석을 위해)로 소화시켰다. 표적화된 구역의 5' 및 3' 단부를 스크리닝하기 위해 사용되는 프로브는 다음 프라이머쌍을 사용하는 PCR에 의해 생성하였다: 5' 프로브 (639 nt): Flt-LOX.1123F (GAT GGC CTT GAG TAT ATC CTG (서열 1)) 및 Flt-LOX.1762R (CAG CTC TGG ACT CCA GCT TGC (서열 2)); 3' 프로브 (834 nt): Flt-LOX.9733F (GGA AAC TAT GTG GCT GAT CTC (서열 3)) 및 Flt-LOX.10567R (GTG AGA GCC AAG ATC GAG GAG (서열 4)). 2개의 독립적인 ES 세포 클론 (#15 및 #F7로 지정함)을 상동성 재조합체로서 확인하고, 이전에 설명된 바와 같이 Cre-재조합효소를 코딩하는 발현 벡터 (pMC-Cre)로 일시 형질감염시켰다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)] 참조). 형질감염된 ES 클론을 집어 개별 콜로니를 얻고, PGK-neoR 카세트의 결실 및 LoxP1과 LoxP2 사이의 재조합에 대해 서던 블롯 및 PCR에 의해 스크리닝하였다. 서던 블롯 분석에 추가로, 선택된 콜로 니를 또한 프라이머 Flt-LOX.236F (TAG ACT CTG CGC GCC ATA ACT (서열 5)) 및 Flt-LOX.2629R (CAC TAA GAA GGC AGA GGC CAA (서열 6))을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. DNA에 바로 5'에서 어닐링하고, LoxP3의 처음 6개의 뉴클레오티드와 겹치고, Flt-LOX.2629R (상동체의 3' 아암의 하류의 DNA에 상동성임)과 조합으로 사용되는 Flt-LOX.236F는 단지 LoxP3을 함유하는 DNA로부터 PCR 산물을 생성할 것이다. 상기 프라이머는 제3 loxP 부위가 재조합을 겪지 않음을 추가로 확인하기 위해 사용되었다.
#15 및 #F7로부터 유래하는 하나의 ES 세포 클론 (여기서 PGK-neoR 카세트가 제거된다 (각각 #15.C1.H1 및 #F7.A.E11로 표시함))을 3.5일 C57B1/6J 포배의 포배강 내로 주사하였다 (예를 들어, 문헌 [Hogan et al., et al. (eds.). Manipulating the mouse embryo (Cold Spring Harbor Laborator Press) (1994)] 참조). 키메라 수컷을 C57B1/6J 암컷 마우스와 교배하고, 자손을 LoxP1/2 및 LoxP3을 검출하기 위해 PCR 분석에 의해 생식세포 전달에 대해 스크리닝하였다. LoxP1/2의 존재에 대해 스크리닝하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 Flt-LOX.1335F (CCT GCA TGA TTC CTG ATT GGA (서열 7)) 및 Flt-LOX.3207R (GCC TAA GCT CAC CTG CGG (서열 8))이었다. LoxP3의 존재에 대해 스크리닝하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 Flt-LOX.236F 및 Flt-LOX.2629R이었다. 이어서, Flt1-LoxP(+/-) 마우스를 교배시켜 플록싱된 (floxed) Flt1 대립유전자를 갖지 않는 Flt1-LoxP(-/-), 플록싱된 단일 Flt1 대립유전자를 갖는 Flt1-LoxP(+/-), 및 Flt1의 두 대립유전자가 모두 loxP 부위를 함유하는 Flt1-LoxP(+/+) 마우스를 생성하였다. Flt1-loxP 마우스는 대개 Flt-LOX.1335F 및 Flt-LOX.3207R 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 유전자형결정하였다.
계내 혼성화: VEGF 및 TGF-β에 대한 계내 혼성화를 뮤린 TGF-β (전방향: 5'-CACCGCGACTCCTGCTGCTTT (서열 9); 역방향: 5'-GGGGGTTCGGGCACTGCTT (서열 10); 프로브 크기: 609 nt)와 래트 VEGF (전방향: 5'-CAACGTCACTATGCAGATCATGCG (서열 11); 역방향: 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCA (서열 12); 프로브 크기: 348 nt)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 생성된 안티센스 및 센스 프로브를 사용하여 수행하였다. 신장 조직을 7.5주령의 마우스로부터 절제하여, 4% 포르말린 내에 고정시키고 파라핀-매몰시켰다. 5 ㎛ 두께 절편을 파라핀 제거하고, 4 ㎍/ml의 프로테이나제 K 내에서 30분 동안 37℃에서 탈단백화하고, 이전에 설명된 바와 같이 계내 혼성화를 위해 추가로 처리하였다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5:623-628 (1999b)] 참조). 33P-UTP 표지된 센스 및 안티센스 프로브를 55℃에서 밤새 절편에 혼성화시켰다. 혼성화되지 않은 프로브는 20 ㎍/ml RNase A 내에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 55℃에서 0.1X 표준 염수 시트레이트 (SSC) 내에서 2시간 동안 고엄격도 세척하고 등급 (graded) 에탄올을 통해 탈수시킴으로써 제거하였다. 슬라이드를 NBT2 핵 트랙 에멀젼 (이스트만 코닥 (Eastman Kodak))에 담그고, 4-6주 동 안 4℃에서 건조제를 함유하는 밀봉 플라스틱 슬라이드 박스 내에서 노출시키고, 현상하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 대조염색하였다.
전자 현미경: 4 내지 5주령의 VEGF-loxP,Flt1-Cre 마우스로부터의 피질 신장 조직 조각을 4℃에서 0.1M 카코딜레이트 버퍼 내의 2% 포름알데히드, 2.5% 글루타르알데히드 내에서 고정시켰다. 세척한 후, 샘플을 수성 1% 오스뮴 내에서 2시간 동안 후고정시키고, 물에 세척하고, 등급 에탄올 및 프로필렌 옥시드를 통해 탈수시키고, EPONATE 12 (테드 펠라, 인크. (Ted Pella, Inc. 미국 캘리포니아주 레딩))에 매몰시켰다. 초박 절편을 Reichert Ultracut UCT 마이크로톰 (microtome)으로 절단하고, 우라닐 아세테이트 및 시트르산납으로 대조염색하고, Philips CM 12 투과 전자 현미경으로 80 kV에서 검사하였다. GATAN Retractable Multiscan 디지탈 카메라를 사용하여 영상을 촬영하였다.
LacZ 염색; 전체 배아 9.5일 배아 또는 1주령 마우스로부터의 조직을 LacZ 염색하기 위해, 조직을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내에서 박리하고, PBS 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 1시간 동안 4℃에서 고정시켰다. 세정 버퍼 (PBS 중 5 mM 에틸렌 글리콜-비스(아미노에틸에테르)-테트라아세트산 (EGTA), 0.01% 데옥시콜레이트, 0.02% NP-40, 2 mM MgCl2) 내에서 3회 30분 세척 후, 배아를 37℃에서 염색 용액 (5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 1 mg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드 (X-gal)를 함유하는 세정 버퍼) 내에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 조직을 PBS 중 4% PFA 내에서 30분 동안 4℃에서 후고정시키고, 70% 에탄올에 옮기고, Leica MZFLIII 박리 현미경, SPOT 디지탈 카메라 및 SPOT Advanced 사진 소프트웨어를 사용하여 촬영하거나, 파라핀 매몰 및 절단을 위해 처리하였다.
조직학적 분석 및 면역세포화학: 조직학적 분석을 위해, 조직을 10% 중성 완충 포르말린 내에서 12 내지 16시간 동안 고정시키고, 70% 에탄올에 옮기고, 파라핀 매몰시켰다. 5 ㎛ 절편을 마이크로톰 (레이카 마이크로시스템즈 (Leica Microsystems, 독일 베츨라))을 사용하여 절단하고, 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 파라핀 매몰된 절편은 Cre-재조합효소 (이엠디 바이오사이언시즈.노바겐 (EMD Biosciences.Novagen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)), 모든 내피세포를 검출하는 CD31 (MEC 13.3, 비디 바이오사이언시즈 파밍엔 (BD Biosciences Pharmingen, 미국 캘리포니아주 샌디에고)), 주로 비-동맥 혈관 내피를 표지하는 VEGFR-2/Flk-1 (MALK-I, 제넨테크, 인크.), 및 발생하고 활성화된 혈관사이 세포와 평활근 세포를 검출하는 알파 평활근 액틴 (다코사이토메이션 캘리포니아 인크. (DakoCytomation California, Inc., 미국 캘리포니아주 카르핀테리아))에 대해 생성된 항체를 사용하여 면역조직화학에 의해 분석하였다. 세포외 매트릭스 성분을 검출하기 위해, 콜라겐 IV (케미콘 인터내셔날 (Chemicon International, 미국 캘리포니아주 테메쿨라)) 및 라미닌 (케미콘)에 대해 생성된 항체를 사용하였다. 염색은 본질적으로 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H.P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)] 참조).
면역형광 연구를 위해, 절제된 신장을 세로로 박리하고, O.C.T. 화합물 (Tissue Tek, 사쿠라 파인테크 유.에스.에이. 인크. (Sakura Finetek U.S.A., Inc., 미국 캘리포니아주 토랜스))에 매몰시키고, 5 내지 10 ㎛로 절단하였다. 마우스 VEGF를 발현하는 사구체 세포 종류를 확인하기 위해, 동결된 절편을 20 ㎍/ml의 농도에서 마우스 VEGF (α-VEGF, 제넨테크, 인크.)를 인식하는 인간화 모노클로날 항체와 함께, 인테그린 α8 친화도-정제된 토끼 항혈청 (혈관사이 세포를 검출하기 위해 1/200으로, 울리히 뮐러 (Ulrich Muller, 더 스크립스 리서치 인스티튜트 (The Scripps Research Institute, 미국 캘리포니아주 라 졸라))의 기증물), 래트 α-마우스 CD31 (비디 파밍엔) (내피세포를 검출하기 위해) 또는 토끼 α-마우스 윌름 종양 핵 단백질 (WT-1; 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인크. (Santa Cruz Biotechnology Inc.), 2 ㎍/ml) (족세포를 검출하기 위해)과 조합하여 인큐베이팅하였다. 후속적으로 절편을 세척하고, AlexaFluor-594 컨쥬게이팅된 염소 항-인간 IgG 및 AlexaFluor-488 컨쥬게이팅된 염소 항-토끼 또는 염소 항-토끼 IgG 2차 항체와 함께 4 ㎍/ml에서 인큐베이팅하였다 (인비트로겐 (Invitrogen)). Flt1-Cre 트랜스젠을 발현하는 사구체 세포 종류를 확인하기 위해, 동결된 절편을 항-베타-갈락토시다제 (록랜드 이뮤노케미칼스 인크. (Rockland Immunochemicals Inc.); 200 ㎍/ml)에 이어 AlexaFluor-594 컨쥬게이팅된 염소 항-토끼 IgG와 함께 인큐베이팅하였다. WT-1 항체 및 항-인테그린 α8을 제조자의 지시에 따라 토끼 IgG에 대한 Zenon 표지 기술을 이용하여 AlexaFluor-488로 표지하였다 (인비트로겐). 이어서, CD31 항체, 또는 AlexaFluor-488-표지된 α-WT-1 또는 항-인테그린 a8을 세척된 절편에 적용하였다. 상기 연구에서, Cre-재조합효소 매개된 절제는 상기 마 우스에서 항-베타-Gal 발현을 구동하는 달리 편재 발현된 ROSA26 유전자 프로모터의 발현을 비가역적으로 제거하므로, 항-베타-Gal 염색은 임의의 또는 모든 발달 단계 동안 Flt1-Cre 트랜스젠 발현을 반영한다 (Mao et.al., Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci USA 96:5037-42 (1999)).
면역글로불린 침착을 검출하기 위해, 마우스 면역글로불린 (Ig)의 각각의 클래스 및 이소형에 특이적인 일련의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-컨쥬게이팅된 래트 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시즈 파밍엔)를 차단된 동결된 절편 상에서 1.5시간 동안 4 ㎍/ml의 농도에서 인큐베이팅하였다. Ig 침착은 특정한 클래스 및 이소형의 마우스 Ig에 대해 생성된 친화도 정제된 FITC-컨쥬게이팅된 폴리클로날 항체 (서던 바이오테크놀로지 어소시에이트 (Southern Biotechnology Associates, 미국 알라바마주 버밍햄))를 사용하여 확인하였다. 마우스 보체 시스템의 C1q, C3 및 C4 성분은 5 ㎍/ml의 래트 모노클로날 항체 (하이컬트 바이오테크놀로지 비.브이. (HyCult Biotechnology b.v., 네덜란드 우덴)) 및 2차 시약으로서 AlexaFluor-594-컨쥬게이팅된 염소 항-래트-IgG (인비트로겐)를 사용하여 검출하였다.
T-세포 및 단핵구-대식세포 계통의 세포는 각각 CD4 (비디 바이오사이언시즈 파밍엔)와 F4/80 (세로텍 인크. (Serotec Inc., 미국 노쓰캐롤리나주 라레이))에 대해 생성된 항체 및 표준 염색 프로토콜을 사용하여 확인하였다. 모든 면역세포화학 연구를 위해, 1차 항체를 삭제된 1차 항체의 농도, 종 및 이소형에 매칭된 정 제된 Ig로 치환함으로써 음성 대조군이 포함되었다.
마우스 신장에서 저산소증을 검출하기 위해, 4주령 Flt1-Cre- 및 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에게 피모니다졸 염산염 (Hypoxyprobe™-1, 케미콘 인터내셔날, 60 mg/kg)을 복강내 주사하였다. 주사 1시간 후, 마우스를 경추 탈구로 안락사시키고, 신장을 절개하고, 밤새 10% 포르말린 내에서 고정시킨 후, 탈수시키고 파라핀에 매몰시켰다. 이어서, 5 ㎛ 파라핀 매몰된 절편을 처리하고, 형광 검출을 허용하기 위해 스트렙타비딘-AlexaFluor594 (인비트로겐)으로 치환시킨 스트렙타비딘 페록시다제 인큐베이션을 제외하고는 Hypoxyprobe™-1 키트 제조사 (케미콘 인터내셔날)에서 설명한 바와 같이 Hypoxyprobe™-1Mab1로 염색하였다. Hypoxyprobe™-Mab1에 대해 사용된 농도에서 매칭된 마우스 IgG1을 1차 항체의 비-특이적 염색을 위한 이소형 대조군으로서 사용하였다. 추가의 음성 대조군으로서, Hypoxyprobe™-1을 주사하지 않은 마우스로부터 단리된 신장 절편을 Hypoxyprobe™-Mab1과 함께 인큐베이팅하였다.
실시간 정량적 RT-PCR 분석; RNA를 STAT 60 방법 (TEL-TEST "B", 미국 텍사스주 프린즈우드)을 사용하여 5 내지 7.5주령 마우스의 조직으로부터 단리하고, Rneasy Quick 스핀 칼럼 (퀴아겐 (Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아)) 상에서정제하였다. 실시간 정량적 RT-PCR 분석은 100 ng의 총 RNA, Applied Biosystems RT-PCR 시약 및 96-웰 포맷의 Model 7700 서열 검출기 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))을 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. Complete inhibition of rhabdomyosarcoma xenograft growth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial growth factor. Cancer Res 60:6253-6258 (2000)] 참조). RT-PCR 조건은 48℃에서 30분, 95℃에서 10분, 및 95℃에서 30s 및 60℃에서 90s의 40 사이클이었다. 결과는 서열 검출 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 분석하고, ANOVA에 의한 통계학적 분은 StatView 소프트웨어 (에스에이에스 인스티튜트 인크. (SAS Institute Inc., 미국 노쓰캐롤리나주 캐리))를 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 상대적 RNA 당량은 글리세르알데히드-3-데히드로게나제 (GAPDH) 수준에 표준화함으로써 얻었다.
혈청 화학 및 혈액학 파라미터: 7.5주령 마우스를 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 혈액을 심장 천공에 의해 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)-코팅된 튜브 (Microtainer, 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 (Becton Dickinson and Company, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)) 내로 수집하였다. 혈액학 세포 계수는 Cell Dyn 3700 (애보트 래보래토리스 (Abbott Laboratories, 미국 일리노이주 애보트 파크))을 사용하여 측정하였다. 혈청은 혈청-분리기 튜브 (Microtainer, 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니) 내로 수집하여 얻고, 혈청 파라미터는 Roche Cobas Integra 400 장치 (로슈 다이어그노스틱스 (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 측정하였다.
소변 분석: 소변을 4 내지 5주령의 마우스로부터 수동적으로 수집하였다. 각각의 유전자형의 마우스로부터 대표적인 소변 샘플을 소변 시험 스트립 (SG를 갖 는 Chemstrip 10, 로슈 다이어그노스틱스 코퍼레이션)을 사용하여 단백질, 혈액, 포도당 및 케톤의 존재에 대해 시험하였다. 단백뇨는 1 ㎕의 소변을 4-20% 구배 tris/글리신 겔 (인비트로겐 코퍼레이션) 상에 로딩하고 SDS-PAGE한 후, 200 ㎍/ml에서 친화도-정제된 염소 항-혈청 (베틸 래보래토리스 인크. (Bethyl Laboratories Inc., 미국 텍사스주 몽고메리))을 사용하여 마우스 알부민에 대해 은 염색 또는 웨스턴 블롯팅함으로써 추가로 확인하였다.
평균 동맥 혈압의 측정: 마우스를 이소플루란 흡입 (Aerrane, 박스터 카리브 인크. (Baxter Caribe Inc.))으로 마취하였다. 목에 시술한 배쪽 정중 절개를 통해, 카테터 (폴리에틸렌 튜브, PE-10, 벡톤-디킨슨)를 우측 온목동맥 내에 넣고, 은 봉합사로 제자리에 고정시켰다. 혈압 측정치는 AcqKnowledge 하드웨어 및 소프트웨어 (바이오팩 시스템즈, 인크. (Biopac Systems, Inc., 미국 캘리포니아주 산타바바라))를 사용하여 15분 동안 디지탈 방식으로 수집하였다.
통계학적 분석: 상보성 DNA 마이크로어레이 데이타 (별개의 섹션 참조)의 분석을 제외한 모든 통계학적 분석은 달리 진술하지 않으면 StatView 소프트웨어 (에스에이에스 인스티튜트 인크.)를 이용하여 분산 분석 (ANOVA)에 의해 수행하였다.
사구체의 단리 및 혈관사이 세포 배양: 마우스 사구체를 문헌 [Takemoto et al., A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. Am J Pathol 161:799-805 (2002)]의 방법에 따라 단리하고, 혈관사이 세포 배지 (둘베코 개질 이글 배지 (DMEM), 20% 태아 송아지 혈청 (FCS), 2 mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신) 내에서 20 ㎍/mL 피브로넥틴 (시그마 코퍼레 이션 (Sigma Corp, 미국 미주리주 세인트루이스))으로 코팅된 디쉬 상에 플레이팅하였다. 사구체를 5% CO2, 95% 공기의 가습 대기 중에서 37℃에서 6-7일 동안 인큐베이팅하고, 이 동안 사구체는 플레이트에 유착되고, 융합성 단층의 세포가 디쉬를 덮었다. 상기 기술을 이용하여, 적어도 5회 계대배양될 수 있는 사구체 혈관사이 세포의 균질 배양액을 얻었다. 사구체 혈관사이 세포 형태학은 광 현미경을 사용한 혈관사이 세포의 공개된 보고와 일치하는 것으로 나타났다 (Mene et al., Phospholipids in signal transduction of mesangial cells. Am J Physiol 256:F375-386(1989)). 사구체 혈관사이 세포는 α-비멘틴 (다코사이토메이션) 및 항-미오신 (자이메드 래보래토리스, 인크. (Zymed Laboratories, Inc, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코))에 대해 양성으로 면역염색되고, CD31 (비디 바이오사이언시즈 파밍엔) 및 아세틸화 저밀도 지단백질 섭취 (바이오메디칼 테크놀로지스, 인크. (Biomedical Technologies, Inc, 미국 매사추세츠주 스터프턴))에 대해 음성이었다. 또한, 모든 혈관사이 세포를 시험관 내에서 섬유모세포의 성장을 차단시키는 적어도 3일 동안 D-발린 치환된 최소 필수 배지 (MEM) 내에서 배양하였다 (Gilbert and Migeon, (1975). D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell 5:11-17).
사구체 혈관사이 세포 배양액을 VEGF(loxP/loxP) 및 Flt1(loxP/loxP) 마우스 및 게놈 loxP 부위를 갖지 않는 동일한 콜로니로부터의 WT 마우스로부터 확립하였다. 혈관사이 세포 생존율 연구를 위해, 혈관사이 세포를 6-웰 디쉬에 105 세포/웰 의 밀도로 플레이팅하고, 20% FCS를 함유하는 혈관사이 세포 배지 내에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 배지를 흡인하고, 대조군으로서 LacZ (Ad-LacZ), 또는 Cre-재조합효소 (Ad-Cre)를 발현하는 아데노바이러스를 함유하는 무혈청 배지로 교체하였고, 이는 loxP 부위들 사이에 재조합을 유도하고 각각 VEGF(loxP/loxP) 및 Flt1(loxP/loxP) 세포에서 VEGF 또는 Flt1 유전자 제거를 일으킨다. 아데노바이러스는 생존율 연구에서 1000의 감염 다중도 (MOI)에서 사용하였다. 중화 항-뮤린 VEGF 항체 (α-VEGF, G6-23-IgG) (제넨테크, 인크.) 또는 대조군 이소형 매칭된 항체 (대조 IgG)를 10 ㎍/mL로 1000의 MOI의 Ad-LacZ와 함께 배지에 첨가하였다. 아데노바이러스의 첨가 4일 후, 남아있는 유착 세포를 PBS로 세척하고, 트립신처리하고, Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer (벡크만 콜터, 인크. (Beckman Coulter, Inc. 미국 캘리포니아주 풀러톤))를 사용하여 계수하였다. 혈관사이 세포를 각각의 유전자형의 마우스 (n=5-7 마우스/유전자형)로부터 단리하였다. 2 내지 5개의 중복 웰을 세포가 유래되는 각각의 마우스에서 각각의 바이러스에 대해 계수하였다. Ad-LacZ와 Ad-Cre 처리 사이의 세포 계수비를 계산하고, 대조군에 대한 값의 백분율로서 표준화하였다.
상보성 DNA 마이크로어레이: 혈관사이 세포를 4 WT 및 4 VEGF(loxP/loxP) 마우스로부터 제조하였다. 2 또는 3회의 계대배양시에, 혈관사이 세포를 100의 MOI에서 Ad-LacZ 또는 Ad-Cre를 함유하는 무혈청 배지 내에서 5일 동안 배양하였다. RNA를 '실시간 정량적 RT-PCR' 섹션에 설명한 바와 같이 STAT60 방법 및 Rneasy Quick 스핀 컬럼을 사용하여 단리하였다. 상보성 RNA (cRNA)의 제조 및 어레이의 혼성화/스캐닝을 위한 방법은 Affymetrix (아피메트릭스, 인크. (Affymetrix, Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라))에서 제공된다. 5 ㎍의 총 RNA를 cDNA 합성 키트 (Superscript Choice, 깁코/비알엘 (GIBCO/BRL, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)) 및 T7-(dT)24 올리고머 프라이머 (바이오서치 테크놀로지스, 인크. (Biosearch Technologies, Inc, 미국 캘리포니아주 노바토), Custom Synthesis)를 사용하여 이중가닥 cDNA로 전환하였다. 이중가닥 cDNA를 친화도 수지 (Sample Cleanup Module Kit, 아피메트릭스, 인크.) 상에서 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 제2 가닥 합성 후, cDNA 샘플로부터 T7 RNA 폴리머라제 및 비오틴-표지된 뉴클레오티드를 사용하여 시험관내 전사 반응 (엔조 비오켐, 인크. (Enzo Biochem, Inc., 미국 뉴욕주 파밍데일))으로 표지된 cRNA를 생성하였다. 표지된 cRNA를 친화도 수지 (Sample Cleanup Module Kit, 아피메트릭스) 상에서 정제하였다. 표지된 cRNA의 양은 260 nm에서 흡광도를 측정하고 260 nm에서 1 OD가 40 ㎍/ml의 RNA에 상응한다는 개념을 이용하여 결정하였다. 20 ㎍의 cRNA를 94℃에서 30분 동안 40 mM Tris-아세테이트 (pH 8.1), 100 mM 아세트산칼륨 및 30 mM 아세트산마그네슘 중에서 인큐베이팅하여 단편화하였다. 이어서, 샘플을 60 rpm에 설정한 회전식 오븐 내에서 45℃에서 19시간 동안 Mouse Genome 430 2.0 어레이에 혼성화하였다. 어레이를 세척하고, 염색하고, Affymetrix Fluidics 스테이션 및 스캐너에서 스캐닝하였다. 데이타 분석은 Affymetrix GeneChip 분석 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 유전자 발현을 로그 눈금에서 분석하는 Affymetrix MAS 5.0 신호 값에 의해 요약하였 다. 분산 분석은 바이러스 효과 (Ad-LacZ 또는 Ad-Cre), 유전자형 효과 (WT 또는 VEGF(loxP/loxP)), 및 각각의 프로브 세트에 대해 VEGF 유전자 제거의 효과를 고려하여 적용된다. VEGF(loxP/loxP) 세포에서 Ad-LacZ로부터 Ad-Cre로 유전자 발현에서 평균 배수 변화 대 WT 세포에서 상응하는 배수 변화, 유전자 발현 차이에 대한 증거의 강도 (t-테스트로부터 p 값) 및 유전자 발현의 최소 절대 신호를 유전자 제거 효과에 의해 유의하게 영향을 받은 프로브 세트를 스크리닝하기 위해 기준의 조합으로서 사용하였다. 상기 기준들을 2배의 최소 배수 변화, p 값 < 0.05, 및 절대 신호 >50로 설정하였다. WT와 VEGF-결핍 혈관사이 세포 사이의 유전자 발현의 차이를 비교하였다.
아피메트릭스에서 제공된 유전자 실체 분류에 따라 유의하게 조절이 어려운 유전자를 분류하기 위해, Gene Ontology (GO) 체계의 2004년 8월 9일 버전을 얻었다. 각각의 Affymetrix 프로브 세트를 LocusLink 유전자 확인과 연합시키기 위해 NetAffy 데이타베이스를 사용하였다. loc2go 파일을 NCBI LocusLink 웹사이트 (인터넷 상에서 ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/LocusLink/에서 이용가능함)로부터 다운로딩하고, 이를 유전자 및 GO 개념을 연합시키기 위해 사용하였다. 유전자 연합의 분포는 GO 주석 (annotation)을 갖는 유전자의 전체 세트, 및 VEGF 유전자 제거에 의해 영향을 받은 유전자의 세트를 사용함으로써 GO 체계 상에서 산출하였다. 각각의 GO 개념에 대해, GO 개념의 존재 또는 부재 대 유전자 제거 효과의 존재 또는 부재를 나타내는 2-대-2 분할 (contingency) 표를 생성하였다. 통계학적 유의성을 결정하기 위해 연합의 카이-제곱 (chi-square) 분석을 수행하였다. GO 개념 에 대해 낙아웃-영향을 받은 유전자의 관찰된 수를 예상 수로 나누어 승산비 (odds ratio)를 산출하였다. 승산비에 대한 95% 신뢰 간격을 1000 붓스트랩 (bootstrap) 샘플로부터 얻었다.
마이크로어레이 데이타를 Ingenuity Pathways Analysis (IPA; Ingenuity(등록상표) Systems, www.ingenuity.com)를 사용하여 또한 분석하였다. 그의 발현이 유의하게 차별적으로 조절되는 (p-값 < 4e-3) 프로브에 대한 식별기호를 이들이 유전자에 매핑되는 용도에 로딩하였다. 상기 프로브가 매핑되는 유전자를 사용하여, Ingenuity Pathways Knowledge Base (IPKB)에 포함된 정보를 이용하여 분자 네트워크를 생성하였다. 기능적 분석을 위해, 상기 동일한 유전자를 IPKB를 사용하여 생물학적 기능 및/또는 질병과 연관지었다. 그 데이타 세트에 배정된 각각의 생물학적 기능 및/또는 질병이 단지 우연에 기인한 것이라는 확률을 결정하는 p-값을 계산하기 위해 피셔 (Fischer) 정확도 시험을 사용하였다.
결과
발달 동안 Flt1-Cre 트랜스젠 발현은 내인성 Flt1 발현을 반복한다
Flt1 유전자의 3.1 kb 프로모터 단편이 이전에 확인되었고, 저산소 조건에 노출된 일시 형질감염된 내피세포 또는 Hep3 B 세포에서 증가된 리포터 유전자 발현을 매개하기에 충분한 것으로 특성화되었다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H. P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667 (1997)] 참조). 동일한 3.1 kb Flt-1 프로모터 단편으로 이루어지는 구성체를 Cre-재조합효소 유전자의 상류에 삽입하여, 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해 사용하였다. 성인 신장에서 최고 LacZ 발현을 갖는 균주를 상세한 트랜스젠 발현 분석을 위해 선택하였다. 제9.5일에 트랜스제닉 배아의 전조직 염색으로 내인성 Flt1 유전자 발현과 일치하는 혈관 발현 패턴을 밝혔다 (또한, 예를 들어 문헌 [Fong, G.H., et al. Regulation of flt-1 expression during mouse embryo genesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium. Developmental Dynamics 207:1-10 (1996)] 참조). 신생 마우스에서, LacZ 양성 세포는 심장, 비장, 폐, 고환 및 피부를 포함한 다양한 조직 내에 존재하였다. 신장 내피 및 혈관사이 세포에서 Flt-1 발현을 설명하는 이전의 보고서 (예를 들어, 문헌 [Takahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226 (1995)] 참조)와 일치하게, LacZ 양성 세포는 요세관주위 내피세포 및 신장 사구체의 중심 구역 내의 세포에서 발견되었고, 여기서 내피 및 혈관사이 세포는 대개 5일령의 Flt1-Cre+;ROSA+ 마우스 내에 위치한다.
Flt-CRE + ;VEGF (loxP/loxP) 마우스는 사구체신염이 발병하고, 4-12주령에 말기 신부전으로 죽는다.
Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스는 예상 멘델비로 출생하지만 (도 1, 패널 a), 감소된 생존율이 4주령부터 명백하고, 95% 초과의 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스가 12주에 죽었다 (도 1, 패널 b). 보다 정밀한 조사에 따르면, Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스는 비장이 결핍되었고, 신장 질량이 유의하게 감소되었음이 밝혀졌다 (도 1, 패널 c 참조). 감소된 신장 혈관형성 및 낭성 신장 병변의 외형이 또한 존재하였고, 이는 양측성 신장 질병의 표시이다 (도 1, 패널 d 참조). LacZ 양성 혈관계를 갖는 다른 장기, 예를 들어 폐, 간, 심장, 뇌 및 골격근은 형태학, 중량 또는 혈관형성에서 임의의 유의한 변화를 나타내지 않았다.
소변 분석에 의해 4 내지 5주령의 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 500 mg/dL을 초과하는 단백뇨가 밝혀졌다. 은 염색 및 웨스턴 블롯팅 분석으로 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 소변에서 결함성 사구체 여과 장벽 기능의 표시인 대량의 알부민이 밝혀졌지만, Flt-CRE+;VEGF(loxP/-) 또는 Flt1-Cre-마우스에서는 아니었다 (도 1, 패널 e 참조). 혈액 화학 분석으로 대조 마우스에 비해 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 혈액 요소 질소 (B.U.N.) 및 혈청 크레아티닌의 수준의 4배 증가가 밝혀졌지만 (도 1, 패널 f 및 g 참조), 나트륨, 칼륨, 클로라이드 및 칼슘의 혈청 수준은 영향을 받지 않았다. 신부전과 연관된 병리학과 일치하게, Flt-CRE- 대조 동배새끼에 비해 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 트랜스제닉 마우스에서 혈압이 유의하게 상승하였다 (도 1, 패널 h 참조). 함께 살펴보면, 이들은 Flt- CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스가 점진적으로 단백뇨 및 고혈압과 연관된 신장 기능장애가 발병하여 말기 신부전에 이르는 것을 알 수 있다.
신장 혈관사이 세포에서 Flt1-Cre 트랜스젠 발현 및 VEGF-A 유전자 제거
면역조직학적 방안을 사용하여, 본 발명자들은 4주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 사구체에서 VEGF-A 발현 및 α-윌름 종양 핵 단백질을 발현하는 족세포를 동시-배치하여 (예를 들어, 문헌 [Haas, C, et al. MHC antigens in interferon gamma (IFN gamma) receptor deficient mouse: IFN gamma-dependent up-regulation of MHC class II in renal tubules. Kidney-Int 48: 1721-7 issn: 0085-2538 (1995)] 참조), 대부분의 VEGF-A 발현은 족세포에 한정됨을 강조하였다. 4주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP);ROSA26+ 마우스의 신장의 동결된 절편을 VEGF-A를 발현하는 사구체 세포 종류를 확인하기 위해 α-VEGF로 절편을 동시-염색하면서 혈관사이 세포 (항-인테그린 α8), 내피세포 (항-CD31) 및 족세포 (항-WT-1)를 검출하기 위해 항체로 염색할 때, VEGF-A는 사구체 족세포 및 혈관사이 세포에서 검출되었다. 융합된 영상은 VEGF-A 발현이 WT-1-양성 족세포에서 검출가능하고 유의하지만, 사구체 혈관사이 세포에서는 보다 낮은 VEGF-A 발현이 검출가능함을 나타냈다. VEGF-A의 계내 혼성화는 7주령 마우스의 Flt1-Cre- 사구체의 주변에서 풍부한 은 과립에 의해 나타나는 바와 같이 족세포에서 높은 수준의 VEGF-A 발현을 확인하였다 (도 2, 패널 a 참조). VEGF-A와 함께 인테그린 α8 양성 혈관사이 세포의 동시-염색 (예를 들어, 문헌 [Hartner, A., et al., Alpha8 integrin in glomerular mesangial cells and in experimental glomerulonephritis. Kidney Int 56:1468-80 (1999)] 참조)으로 4주령 마우스에서 혈관사이 세포에서 보다 약하지만 유의한 발현이 밝혀졌다 (도 2, 패널 a 참조). 그러나, 분석된 임의의 신장 절편에서 VEGF-A/CD31 이중 양성 내피세포를 검출할 수 없었고, 이는 이전에 설명된 바와 같이 사구체 내피세포 내의 VEGF-A의 부재와 일치한다 (예를 들어, 문헌 ([Simon, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Phvsiol 268:F240-50 issn: 0002-9513(1995)]; 및 [Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-25 (1998)] 참조).
배아 및 생후 발육 동안 Cre-재조합효소를 발현하는 사구체 세포-종류를 결정하기 위해, β-갈락토시다제를 검출하는 항체 (항-베타-Gal)를 사용하여 면역형광 조직화학을 이용하였다. 4주령 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장 졀편의 분석으로 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+) 동배새끼에 비해 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP)에서 β-Gal/인테그린 α8 이중-양성 혈관사이 세포의 증가된 수 및 염색이 밝혀졌다. 그러나, β-Gal 및 족세포 마커 WT-1 또는 내피세포 마커 CD31에 대해 이중 양성인 세포를 검출하지 못하였다. 면역조직화학으로 Flt1-Cre 트랜스젠이 혈관사이 세포에서 검출되지만 사구체 내피세포에서 검출되지 않은 반면, Flt-1을 발현하는 것으로 공지된 요세관 내피세포가 양성이었음이 밝혀졌다 (도 2, 패널 b 참조). 게놈 PCR로 배아 발생 동안 신장에서 (E17.5 및 E18.5), 및 7 내지 10일 동안 팽창시킨 후 1주령 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/wt) 마우스의 신장으로부터 혈관사이 세포 체외이식편에서 유의한 수준의 VEGF 제거가 밝혀졌다. 상기 발견은 이전의 기록과 일치하고 (예를 들어, 문헌 [Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)] 참조), 이는 신장 사구체 내의 혈관사이 세포가 VEGF-A 및 Flt1을 모두 발현할 수 있음을 제안하고, Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 사구체에서 VEGF-유전자 제거가 적어도 혈관사이 세포에서 일어난다는 것을 추가로 지지한다. VEGF-A 유전자 제거는 다른 사구체 세포 또는 사구체 컴파트먼트 외부의 세포에서 일어날 수 있고 (본 발명자들의 분석에서 검출되지 않음), 관찰된 사구체 변화에 간접적으로 기여할 수 있다. RNA의 정량적 유전자-발현 분석으로 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장에서 조직 손상 및 진행하는 수복 과정이 Cre-재조합효소의 현저한 상향조절을 일으킴을 확인하였다 (도 2, 패널 c 참조). 동시에, Flk1 (VEGFR-2) 및 VEGF-A의 하향 조절이 검출되었고 (도 2, 패널 c), 이는 VEGF-A 유전자 제거 및 사구체 혈관분포의 감소와 일치한 한편 (도 3, 패널 g 및 h), Flt-1 수준은 변화되지 않고 남는다. Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장을 사용하는 계내 혼성화 실험으로 7주령에 모든 사구체 세포 종류에서 현저하게 감소된 VEGF-A 발현이 밝혀졌다. VEGF 및 B-Gal 발현에 대한 1주령 신장의 면역조직화학 분석으로 3개의 주요 사구체 클래스를 확인하였다: 1) β-Gal 염색의 부재 시에 정상 수준의 VEGF 를 발현하는 사구체. 2) 감소된 VEGF 및 점상 (punctate) β-Gal 발현을 보이는 사구체, 및 3) 높은 β-Gal 염색의 존재 하에 검출가능하지 않은 VEGF 수준. 신장 혈관사이 세포에서 VEGF 유전자 제거는 생후 발육 전체 동안 일어날 수 있고, 감소된 족세포 VEGF 발현 및/또는 족세포 세포 사멸과 연관될 수 있다. 상기 실험에서의 발견은 신장 혈관사이 세포에서 VEGF에 의한 자가분비 조절 루프의 하류 표적으로서 족세포에 의한 VEGF 발현을 확인한다.
저산소증은 VEGF-A 및 VEGFR-1 모두의 발현을 상향조절하는 것으로 밝혀졌고 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H.P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-67 (1997)] 참조), 증가된 신 저산소증은 사구체신염에서 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Nangaku, M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med 43: 9-17 (2004)] 참조). Hypoxyprobe™-Mab1을 사용하여 저산소 구역에 대한 4주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장 사구체를 분석할 때, 증가된 저산소증은 야생형 동배새끼에 비해 조건화 낙아웃 마우스에서 일정하게 발견되었고, 이는 저산소증이 Flt-CRE의 상향조절을 통해 VEGF 유전자 제거를 가속화할 수 있음을 나타낸다. 저산소증에서 구역적 변동을 개별 사구체 내에서 질병 진행의 심도의 변동과 조합하면, Flt1-Cre 트랜스젠의 빈번한 국소 발현 및 사구체 내피세포에서 트랜스젠 발현의 결핍 (이는 정상 산소 순환과 직접 접촉한다)을 설명할 수 있다.
Flt-CRE + ;VEGF (loxP/loxP) 트랜스제닉 마우스의 사구체의 병태생리학적 변화
신장 부전을 일으키는 세포 사건을 이해하기 위해 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 일어나는 조직병리학적 변화를 분석하였다. 제2, 3, 및 7주에 광 현미경으로 검사한 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 이상 사구체 구조가 명백하였다. 2주령의 마우스에서, 낭이 신피질 전체에 존재하였고 (도 3, 패널 a), 그들의 연령-매칭된 WT 동배새끼의 사구체에 대해 외관이 뚜렷한 2개의 종류의 사구체 구조가 구별될 수 있었다 (도 3, 패널 b). 2주령 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서, 무세포성 코어 (core)를 둘러싸는 족세포로 이루어지는 저발달된 사구체가 종종 관찰되었다 (도 3, 패널 a 및 c). 상기 외관을 갖는 사구체는 모세혈관 루프의 부재로 인해 기능을 할 수 없을 수 있고, 7주령의 마우스의 신장에서 유사한 구조의 증거가 없기 때문에 상기 단계를 넘어 발달할 수 없을 수 있다 (도. 3, 패널 e 및 f). 2-3주령 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장 내에서 수많은 사구체가 현저하게 확대되고, 풍부한 호산성, 사구체 전체에 단백질성 침착 및 기존의 모세혈관 루프의 부재 또는 붕괴를 나타냈다 (도 3, 패널 d). 상기 사구체는 사구체경화증, 섬유증, 및 국소 간질 신장염을 나타내는 7주령의 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 전형적인 사구체에 유사한 외관을 갖는다 (도 3, 패널 f). 각각의 신장 내에서, 개별 사구체는 가벼운 내지 심한 변화가 명백하여 상이한 정도로 영향을 받는다. 또한, 이행 상피로 내부가 덮인 큰 낭 (도 3, 패널 a), 및 단백질성 물질로 채워진 확장된 피질 요세관의 산재된 그룹이 관찰되었다 (도 3, 패널 e 및 f를 비교한다). WT 신장에서 관찰된 것에 비해 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 사구체 전체에서 감소된 세포충실성이 명백하였고, 이는 부분적으로 감소된 수의 내피세포에 기인할 수 있다 (도 3, 패널 g 및 h를 비교한다). Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장에서 감소된 CD31 염색에는 RT-PCR (도 6, a-d) 및 면역조직화학 염색에 의해 결정될 때 많은 경화 사구체에서 광범한 라미닌 및 국소 콜라겐 IV 침착이 동반되었다. 예를 들어, 7주령 마우스의 신장 절편에서, 라미닌 침착은 요세관에서 검출되었고, 질병에 걸린 신장의 사구체 전체에 존재하였고, 증가된 콜라겐 IV 염색은 야생형 동배새끼에 비해 질병에 걸린 조직에서 검출되었다. 또한, 형질전환 성장 인자-β (tgf-β, 도 3, 패널 i 및 j) (사구체 섬유증 및 조직 손상의 매개인자)가 신장 질병에서 종종 상향조절되었을 뿐만 아니라 (문헌 [Schnaper, H.W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-52(2003)]에서 재검토됨), 알파 평활근 액틴 (도 3, 패널 k 및 1) (활성화된 혈관사이 세포에 대한 마커)는 손상을 입은 신장에서 모두 현저하게 상승되었다.
투과 전자 현미경검사에 의한 신장 절편의 초미세구조 분석으로 혈관사이막에서 결함 및 Flt-CRE<+>;VEGF(loxP/loxP) 신장에서 족세포 족돌기 융합 및 혈관사이 매트릭스의 팽창을 포함한 국소 사구체경화증과 일치하는 다른 특징을 확인하였다 (도 3, 패널 m). 내피는 일부 사구체에서 건강한 것으로 나타났지만, 유창 (fenestration)의 손실 및 사구체 기저막의 대량 팽창이 보다 진행된 병변이 있는 사구체에서 관찰되었다. 또한, 혈관사이 세포의 손실 및 전자 치밀 침착이 저발달된 사구체에 존재하였다 (도 3, 패널 m).
사구체 혈관사이 세포에서 VEGF 유전자 제거는 면역글로불린 M (IgM) 침착 및 보체 활성화와 연관된다.
Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장에서 강화된 면역 반응의 증거가 순환 림프구의 상승에 의해 제안되었다. 단핵구/대식세포, B-세포 및 T-세포 계통의 마커 (각각 CD11b, F4/80, CD45R 및 Thy-1)에 대한 신장 RNA의 실시간 정량적 RT-PCR 분석으로 Flt-CRE+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장에서 면역 침윤을 검출하였지만, 대조 동배새끼에서는 검출되지 않았다 (도 4, 패널 a). 면역조직화학 분석으로 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스의 신장에서 F4/80 및 CD4 (T-세포의 서브세트의 마커)를 발현하는 세포의 수의 증가가 밝혀졌다 (도 4, 패널 b 참조). 상기 세포 계통 마커는 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 트랜스제닉 마우스의 폐 또는 심장에서 상승되지 않았으므로, 면역 세포 침윤은 신장 조직에 특이적인 것으로 나타났다.
분석된 항체의 Ig 서브클래스 중에, 예를 들어, IgM 및 IgG의 각각의 뮤린 이소형에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 5주령의 Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스로부터의 신장 피질 조직의 면역형광 염색에 의해 IgM은 질병에 걸린 사구체에서 침착된 것으로 밝혀졌지만, IgG, IgA, IgD, 또는 IgE는 그렇지 않았다. 추가로, 특히 WT 신장에 비해 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 신장의 사구체에서 보체 경로의 C1q, C3, 및 C4 단백질의 현저한 증가가 검출되었다 (예를 들어, 경로의 C1q, C3 및 C4 성분에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 면역형광에 의해). 증가된 C1q, C3, 및 C4가 1주령의 마우스에서 검출되었고, 이는 보체-매개 세포 용해가 Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스에서 신장 손상에 유의하게 기여할 수 있음을 제안한다. VEGF의 하플로 (haplo)-불충분 족세포-선택적 결실을 갖는 마우스의 신장에서 보체-매개 손상의 증거는 검출되지 않았다.
시험관 내에서 VEGF 유전자 제거는 혈관사이 세포 생존율에 불리한 영향을 미친다: VEGF가 혈관사이 세포에서 내부 자가분비 루프를 통해 작용한다는 증거.
시험관 내에서 성장된 혈관사이 세포에 대한 VEGF-A 및 Flt1 유전자 제거의 효과를 조사하기 위해, Flt1 대립유전자에 대해 조건화 대립유전자를 갖는 마우스를 생성하였다 (Flt1-lox/loxP) (도 5, 패널 a 참조). 마우스 Flt1 유전자의 엑손 1이 loxP 부위와 인접하는 표적화 벡터를 생성하고, 마우스 배아 줄기 세포에서 상동성 재조합을 위해 사용하였다. Flt1(loxP/loxP) 마우스는 예상 멘델 빈도로 출생하였고, 이는 2개의 loxP 부위의 존재가 마우스 발달을 저해하지 않았음을 나타낸다. 사구체 단리물로부터 WT VEGF(loxP/loxP) 및 Flt1(loxP/loxP) 마우스로부터의 혈관사이 세포의 균질 제제를 얻고, LacZ를 발현하는 대조 아데노바이러스 (Ad-LacZ) 또는 Cre-재조합효소를 발현하는 아데노바이러스 (Ad-Cre)로 감염시켰다. 시험관 내에서 Flt1 및 VEGF-A 유전자 제거 빈도를 서던 블롯 분석 (도 5, 패널 b)과 실시간 RT-PCR (도 5, 패널 c 및 d)에 의해 모니터링하였고, >95%인 것으로 밝혀졌다. 혈관사이 세포에서 Flt-1 또는 VEGF-A 유전자 제거는 세포 생존율의 유의한 감소를 일으켰고 (도 5, 패널 e), 이는 VEGF가 혈관사이 세포 생존율을 Flt1에 의해 매개되는 세포 자율 방식으로 조절하는 것을 나타낸다. 중화 VEGF 항체 (α-VEGF, G6-23)의 첨가는 혈관사이 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다 (도 5, 패널 f). G6-23은 세포내 컴파트먼트로부터 제외되므로, VEGF-A- 또는 Flt1-결핍 혈관사이 세포에서 관찰된 혈관사이 세포 생존의 감소를 반복하지 못하는 것은 VEGF-A가 내부 자가분비 루프를 통해 작용할 수 있음을 나타낸다. Flt1-결핍 혈관사이 세포의 생존율의 감소는 VEGF-A 결핍 단독에 의해 유발되는 것보다 더 크고, 이는 Flt1에 대한 다른 리간드, 예를 들어 PlGF 또는 VEGF-B가 또한 기여할 수 있음을 제안한다.
혈관사이 세포에서 VEGF 유전자 제거는 증가된 ECM 생산과 일치하는 유전자 발현의 변화를 유도한다.
VEGF-A-결핍 혈관사이 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자의 유전자 실체 (GO) 분석을 수행하였다. 2배보다 더 큰 변화 (절대값) 및 p-값 < 0.05 (스튜던츠 (Students) t-테스트)에 대해 선택될 때, WT 혈관사이 세포에 비교할 때 VEGF-A-결핍 혈관사이 세포에서 유의하게 상향조절된 것으로 분석된 11810개의 유전자 중 480개를 발견하였다. 상향조절된 유전자의 클래스 및 모든 유전자의 대조 세트 사이의 GO 주석의 비교를 통해 화학주성, 구조적 완전성 또는 ECM 생산, 세포 이동 및 체액성 방어 메카니즘을 조절하는데 관여하는 유전자에서의 유의한 차이가 유의하게 과다-제시됨이 밝혀졌다 (표 2). VEGF-A 결핍 혈관사이 세포에서 하향조절된 유전자에 대해 동일한 분석을 수행하였고, 유의하게 과다 제시된 6개의 카테고리를 확인하였다. 6개 카테고리 중 3개 카테고리는 단백분해 유전자의 수퍼-클래스에 속하였고, 하나는 세포 소통 (communication)에 관여하는 유전자를 포함하였다 (표 2). Ingenuity Pathways 시스템을 사용하여 수행된 신호 경로 분석으로 세포 성장 및 증식, 세포 조립, 조직화 및 절충 (compromise) 경로로서 규정된 서브클래스에 속하는 유전자의 발현이 VEGF-결핍 혈관사이 세포에서 유의하게 변경되었음이 추가로 밝혀졌다 (표 2). 본 발명자들은 또한 단백질 합성, 세포 사멸, 세포-세포 신호전달 및 면역 반응에 관여하는 분자 네트워크의 카테고리에 속하는 유전자의 46% 내지 57%의 발현이 VEGF 결핍에 의해 유의하게 영향을 받았음을 확인하였다 (표 2). 혈관사이 매트릭스 축적 또는 사구체 질병과 연관된 후보 유전자도 또한 VEGF-A-결핍 혈관사이 세포에서 유의하게 조절되지 않았다. 이들 중에서, tgf-β1 (예를 들어, 문헌 [Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252 (2003)] 참조), 안지오포이에틴-1 (예를 들어, 문헌 [Satchell, S. C, and Mathieson, P. W. Angiopoietins: microvascular modulators with potential roles in glomerular pathophysiology. J Nephrol 16:168-178 (2003)] 참조), 및 COX-2 (문헌 [Nasrallah, R. & Hebert, R.L. Prostacyclin signaling in the kidney: implications for health and disease. Am J Physiol Renal Physiol 289:F235-46 (2005)]에서 재검토됨)는 상향조절된 반면, 혈소판-유래 성장 인자 수용체-β (Pdgfr-β) 및 Pdgf-c (문헌 [Betsholtz, C. et al. Role of platelet-derived growth factor in mesangium development and vasculopathies: lessons from platelet-derived growth factor and platelet-derived growth factor receptor mutations in mice. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:45-52 (2004)]에서 재검토됨)는 하향조절되었다. 시험관 내에서 VEGF-A-결핍 혈관사이 세포에서 유전자 발현의 변화는 ECM 혈관사이막 성분의 축적을 향한 이동을 강조하고, VEGF-A가 상기 과정을 세포 자율 방식으로 조절하는 것을 확인하였다.
Figure 112008073906940-PCT00001
Ingenuity Pathways 분석으로 그의 발현이 VEGF-A 결핍 혈관사이 세포에서 유의하게 차별적으로 조절된 유전자에 의해 나타나는 기능적 경로를 확인하였다.
Figure 112008073906940-PCT00002
신장 발달 동안 감소된 VEGF 발현과 연관된 신 병리학
Flt-1에 의해 매개되는, 신장 혈관사이 세포에서 VEGF-A의 세포 자율 기능이 확인되고, 신장 발달 동안 상기 조절 메카니즘의 역할이 설명된다. 상기 조절 메카니즘을 간섭하면 사구체경화증과 연관된 일부 병태생리학적 특징을 유발할 수 있다는 증거가 제공된다. 상기 모델에서 진행성 신부전은 사구체신염의 성인 발병 모델보다는 발달 손상 모델을 나타낸다. 상기 모델에서 신장 병리학 및 신장에서 보다 낮은 VEGF 수준과 연관된 인간 신장 질병 (예를 들어, 문헌 [Schrijvers, B.F., et al., The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-17 (2004)] 참조), 예를 들어, 사구체 손상, 경화증, 및 염증성 침착 및 보체 활성화에서 일부 유사성이 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Isselbacher, K.J. et al. Harrison's Princip les of Internal Medicine. (1994) (McGraw-Hill Inc., New York)] 참조). Flt-Cre+;VEGF(loxP/loxP) 마우스는 질병에 걸린 신장에서 IgM 침착의 축적 및 C1q, C3, 및 C4의 활성화를 나타내는 유전자 모델이다. 본 발명의 발견은 면역 복합체 형성의 부재 하에 말기 신부전이 발병한 족세포-특이적 VEGF-A 하플로-결핍을 갖는 9-12주령의 마우스에서 이전의 관찰과 상이하다 (예를 들어, 문헌 [Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003)] 참조).
일차 세포 단리물에서 및 건강한 신장 및 질병에 걸린 신장에서 VEGFR1 및/또는 VEGF-A 발현을 조사하는 대부분의 보고서는 최고 수준의 VEGF-A를 발현하는 것으로 공지된 족세포 (예를 들어, 문헌 [Berse, B., et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors. Molecular Biology of the Cell 3:211-20 (1992)]; 및 [Brown, L.F. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocvtes during wound healing. Journal of Experimental Medicine 176: 1375-9 (1992)] 참조), 또는 VEGFR-1을 발현하는 내피세포 (예를 들어, 문헌 [Thomas, S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11: 1236-43 (2000)] 참조)보다는, 혈관사이 세포를 아마도 두 유전자를 모두 동시발현하는 것으로서 확인하였다 (예를 들어, 문헌 [Thomas, S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. JAm Soc Nephrol 11: 1236-43 (2000)]; [Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA 94:12112-6 (1997)]; [Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001)]; [Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)]; [Simon, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268 (1995)]; 및 [Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9: 1815-25 (1998)] 참조). Cre-양성 족세포는 Flt1-Cre+,VEGF(LoxP/LoxP),ROSA26 화합 트랜스제닉 마우스에서 발달 동안의 다양한 단계에서 검출되었다. 비-형질전환된 족세포에서 VEGFR-1/2 발현의 부재는 이전의 보고 (예를 들어, 문헌 [Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA 94:12112-6 (1997)]; [Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001)]; 및 [Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)] 참조) 및 본 발명자들의 관찰과 일치한다. 그러나, 일차 뮤린 족세포를 SV40 큰 T-항원으로 형질전환시키면 일부 형질전환된 족세포 세포주에서 VEGFR-1 및 VEGF-A 발현을 일으켰다 (예를 들어, 문헌 [Chen, S. et al. Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV) collagen production by transforming growth factor-betal in mouse podocytes. Diabetes 53:2939-49 (2004)] 참조).
VEGF에 의해 제어되는 신장 사구체의 발달에서 2개의 조절 메카니즘이 존재한다는 증거가 제공된다: 1) 창 및/또는 사구체 여과율의 유도 및 유지에 관여될 수 있는 것으로 제안된 족세포와 사구체 모세혈관 내피세포 사이의 측분비 메카니즘 (문헌 [Schrijvers, B. F., et al. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-17 (2004)]에서 재검토됨); 및 2) ECM 생산 및 VEGF 발현을 포함하는 족세포 기능을 조절하는 혈관사이 세포에서 자가분비 루프. 족세포에서 VEGF 생산이 혈관사이 세포에서 VEGF의 자가분비 역할의 하류 기능인 모델은 두 세포-종류에서 VEGF-결핍을 갖는 마우스에서 표현형의 겹침의 원인이 될 수 있다. 혈관사이 VEGF-A 결핍은 또한 침윤 염증성 세포의 존재 (도 4 a-b) 및 사구체 기저막의 팽창 (도 3m)을 포함한, 족세포-특이적인 VEGF-하플로-불충분 마우스에서 발견되지 않는 추가의 세트의 신 변화를 일으킨다. 상기 발견은 VEGF-A 발현의 총 감소에 추가로 영향을 받은 세포 종류가 신장 병리학에 주요 결정인자를 나타낼 수 있음을 제안한다. VEGF 신호전달을 자극하는 화합물, 특히 VEGFR-1의 투여는 사구체 경화증과 연관된 서브세트 신장 질병의 치료에 유익할 수 있다.
혈관사이 세포에 대한 VEGF의 유전적 및 생화학적 불활성화 사이의 차별적인 효과: 조절 메카니즘으로서 내부, 자가분비 VEGF-A 효과기 기능에 대한 추가의 증거
혈관사이 세포에서 VEGF의 세포 자율 기능의 검출을 위한 필요조건은 족세포-유래 VEGF-A가 측분비 또는 근접분비 신호전달을 통해 VEGF-A-결핍 혈관사이 세포를 명백하게 구조하지 못하는 것이었다. 단일 모델에 제한되지 않으면서, 혈관사이 세포에서 VEGF의 자가분비 루프의 하류 기능인 족세포 VEGF 발현의 확인은 족세포가 VEGF-A 결핍 혈관사이 세포를 구조하지 못하는 근본적인 이유를 제공한다. 조혈 줄기 세포 생존 (HSC)의 조절에서 VEGF-A에 대한 세포 자율 기능은 이전에 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H.P. et al. VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature 417, 954-8 (2002)] 참조). 유사하게, 배양액 중에서 성장시킨 혈관사이 세포에 VEGF-A를 중화하는 항체 (G6-23)를 투여하면 VEGF-A 또는 Flt1에 대해 결핍인 세포와 반대로 혈관사이 세포 수에 영향을 미치지 않았다. 한 이론에 제한되지 않으면서, 상기 발견은 자가분비 신호전달이 다중 세포 종류에서 비-혈관신생 효과기 기능으로부터 혈관 형성을 제어하는 VEGF의 측분비 기능을 분리하기 위해 보다 일반적인 조절 메카니즘을 나타낼 수 있음을 제안한다 (예를 들어, 문헌 [Gerber, H.P. & Ferrara, N. The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis. J. Mol. Med 81:20-31 (2003)]에서 재검토됨).
실시예 2: VEGF의 VEGFR 선택적 변이체
특이적 VEGF 수용체 (예를 들어 KDR 또는 Flt-1)에 선택적으로 결합하여 활성화시키는 VEGF 변이체의 생성 및 특성화는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 그 개시내용이 본원에 참고로 명백하게 포함되는 문헌 ([Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823 (2000)]; [Grille et al. J. Biol. Chem. 276:3222-3230 (2001)]); PCT 공개 WO 00/63380 및 97/08313; 및 미국 특허 6,057,428에 기재되어 있다.
구체적으로, Flt-1 수용체에 높은 특이성을 갖는 VEGF 변이체는 KDR에는 크게 영향을 미치지만 Flt-1 결합에는 영향을 미치지 않는 4개의 돌연변이를 조합함으로써 생성하였다. Ile 43, Ile 46, Gln 79 및/또는 He 83의 돌연변이는 이들 잔기의 측쇄가 KDR에 대한 단단한 결합을 위해 중요하지만 Flt-1-결합에는 중요하지 않음을 보여주었다 (Li et al. (2000) 상기 문헌). Flt-sel 변이체는 문헌 [Kunkel et al. Methods Enzymol. 204:125-139 (1991)]에 기재된 부위 지정 돌연변이 생성 방법을 이용하여 위치 Ile 43, Ile 46, Gln 79 및 He 83에서 알라닌 치환에 의해 생성시켰다. 상기 특정 Flt-sel 변이체는 또한 식별기호 I43A/I46A/Q79A/I83A로 나타낼 수 있다. 위치 43, 46, 79 및 83에서 상기 4개의 알라닌 치환에 대한 상응하는 코돈은 각각 GCC/GCC/GCG/GCC이다.
I43A/I46A/Q79A/I83A Flt-sel 변이체의 특성 및 생물학적 활성을 검사하기 위해 다양한 분석을 수행하였다 (Li et al. (2000) 상기 문헌). 예를 들어, 가용형 방사선-면역 수용체-결합 분석 (RIA)을 이용하여 정량적 결합 측정을 수행하였다. 상기 분석에서, 천연 VEGF(8-109)는 KDR 및 Flt-1에 대한 친화도가 각각 0.5 nM 및 0.4 nM이었다. Flt1-sel은 상기 분석에서 적어도 470배 감소된 KDR-결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다. Flt-1결합의 작은 감소가 ELISA에서 개별 점 돌연변이체로부터 관찰되었고, Flt-1에 대한 Flt-sel 변이체의 친화도는 천연 단백질과 실질적으로 동일하였다.
본 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하기 위해 충분한 것으로 간주된다. 본원에 기재된 실시예 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것임이 이해된다. 실제로, 본원에 나타내고 설명된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 첨부된 청구의 범위 내에 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적으로 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
<110> GENENTECH, INC. Baldwin, Megan Ferrara, Napoleone Gerber, Hans-Peter <120> Methods for Treating Kidney Disorders <130> P2346R1 <141> 2007-03-26 <150> US 60/786,246 <151> 2006-03-27 <160> 12 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 1 gatggccttg agtatatcct g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 2 cagctctgga ctccagcttg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 3 ggaaactatg tggctgatct c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 4 gtgagagcca agatcgagga g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 tagactctgc gcgccataac t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 6 cactaagaag gcagaggcca a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 7 cctgcatgat tcctgattgg a 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 8 gcctaagctc acctgcgg 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 9 caccgcgact cctgctgctt t 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 10 gggggttcgg gcactgctt 19 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 11 caacgtcact atgcagatca tgcg 24 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 12 tcaccgcctt ggcttgtca 19

Claims (20)

  1. Flt1 효능제를 포함하는 유효량의 VEGFR 조정제를 신장병이 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 신장병을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, Flt1 효능제가 Flt1 효능제 항체인 방법.
  3. 제1항에 있어서, Flt1 효능제가 VEGF A Flt1 선택제인 방법.
  4. 제1항에 있어서, Flt1 효능제가 VEGF A, PlGF 또는 VEGFB인 방법.
  5. 제1항에 있어서, Flt1 효능제가 Flt1의 소분자 효능제인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 신장병이 VEGF 수준의 감소를 특징으로 하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 신장병이 염증성 신장 질병인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 염증성 신장 질병이 이환된 사구체에서 염증성 세포의 변경, 면역 복합체 침착 또는 보체 활성화를 특징으로 하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 면역 복합체 침착이 IgM 침착인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 보체 활성화가 C1q, C3 및 C4의 활성화를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 신장병이 사구체신염 (신부전)을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 사구체신염이 단백뇨, 사구체 경화증, 또는 고혈압에 의해 결정되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 사구체신염이 신장 혈관사이 세포의 생존율 감소, ECM 합성의 유전자 발현의 증가 또는 매트릭스 분해의 감소에 의해 결정되는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 사구체신염이 국소 분절 사구체경화증 (FSGS)인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 혈관신생제인 유효량의 제2 물질을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 제2 Flt1 효능제인 유효량의 제2 물질을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 혈관신생제가 VEGF인 방법.
  18. 제2항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  19. 제2항에 있어서, 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 대상이 신장병을 유발하는 감염에 걸린 것인 방법.
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