CN101454018A - 用于治疗肾病症的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了治疗受试者中的肾病症的方法，其通过对受试者施用有效量的VEGFR激动剂，例如Flt1激动剂。所述激动剂由在制药学可接受载体中包含用于活化Flt1的VEGFR激动剂，例如VEGF、针对Flt1的抗体、Flt1配体、Flt1小分子活化剂、或Flt1选择剂的组合物构成。

Description

用于治疗肾病症的方法
相关申请
本申请要求2006年3月27日提交的美国临时申请流水号60/786,246的优先权和权益，将其说明书完整收入本文。
发明领域
本发明涉及VEGFR调控剂的治疗用途，包括利用VEGFR激动剂来治疗肾病症的方法。
发明背景
经由两种酪氨酸激酶受体即在内皮细胞上表达的Flt1(VEGFR-1)和Flk1(KDR/VEGFR-2)的活化，血管内皮生长因子(VEGF-A)调节多种血管功能，包括内皮细胞分化和存活(参见例如Ferrara，N.，et al.The biology of VEGF and its receptors.Nat Med 9：669-676(2003))。最近的研究鉴定出多种非内皮细胞上的VEGF受体表达，包括造血干细胞，说明VEGF配体/受体系统有非血管调节功能。参见例如Autiero，M.，et al.Placental growth factor and its receptor，vascular endothelial growth factor receptor-1：novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders.J Thromb Haemost 1：1356-1370(2003)。在肾脏中，VEGF受体主要见于肾小球前、肾小球、肾小球后(参见例如Thomas，S.，et.al.Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease.J Am Soc Nephrol 11：1236-12433(2000))和小管周内皮细胞以及肾小球系膜细胞，但不见于足细胞。参见例如Gruden，G.，et al.，1997.Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells： mechanisms of signal transduction.Proc Natl Acad Sci U S A 94：12112-12116(1997)；Harper，S.J.，et al.Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo.Clin Sci(Lond)101：439-446(2001)；及Takahashi，T.，et al.Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells：Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells.BiochemBiophys Res Commun 209：218-226(4-6)(1995)。在正常成人肾脏中，VEGF-A表达在肾小球足细胞和管内皮细胞中最突出，在肾小球系膜中较低，但在内皮细胞中检测不到。参见例如Noguchi，K.，et al.Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis.J Am Soc Nephrol 9：1815-1825(1998)；及Simon，M.，et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney.Am-J-Physiol 268：F240-250 issn：0002-9513(1995)。根据表达的定位，认为VEGF-A主要经由靶向肾小球和小管周内皮细胞的旁分泌或近分泌(juxtacrine)效应器功能在肾稳态和肾小球滤过中发挥调节作用。多项研究评估了VEGF-A在肾发育过程中及在肾损伤模型中的作用。参见例如deVriese，A.S.et al.Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes.J Am SocNephrol 12：993-1000(2001)；Eremina，V.et al.Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.JClin Invest 111：707-16(2003)；Kang，D.H.，et al.Impaired angiogenesis in the remnant kidney model：II.Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function.J Am Soc Nephrol 12：1448-57(2001)；Masuda，Y.et al.Vascular endothelial growth factor enhances glomerular capillary repair and accelerates resolution of experimentally induced glomerulonephritis.Am J Pathol 159，599-608(2001)；及Ostendorf，T.et al.VEGF(165)mediates glomerular endothelial repair.J Clin Invest 104：913-23(1999)。
VEGF-A的失调是肾疾病(包括肿瘤、糖尿病和肾小球肾炎)实验模型中的共同特征(参见例如Khamaisi，M.，et al.The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease.Nephrol Dial Transplant 18：1427-1430(2003)；及Schrijvers，B.F.，et al..The role of vascular endothelial growth factor(VEGF)in renal pathophysiology.Kidney Int 65：2003-2017(2004))。VEGF-A及其受体在患有1型和2型糖尿病至少某段时期的实验动物或人中上调，而VEGF-A水平降低与多种进行性肾疾病中剩余肾中的肾小球硬化症和小管间质性纤维化的发生有关。参见例如Honkanen，E.，et al.Decreased expression of vascular endothelial growth factor in idiopathic membranous glomerulonephritis： relationships to clinical course.Am J Kidney Dis 42：1139-1148(2003)；Korbet，S.M.，et al.The racial prevalence of glomerular lesions in nephrotic adults.Am JKidney Dis 27：647-51(1996)；Sivridis，E.，et al.Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and angiogenic factor expression in idiopathic membranous nephropathy.Am J Kidney Dis 41：360-365(2003)；及Srivastava，T.，et al.High incidence of focal segmental glomerulosclerosis in nephrotic syndrome of childhood.Pediatr Nephrol 13：13-8(1999)。FSGS的主要组织病理学特征之一是胞外基质(ECM)沉积物的积累或肾小球硬化症。肾小球硬化症的发病机理未知，而且肾小球内存在的三种细胞类型(足细胞、内皮或肾小球系膜细胞)中哪一种参与纤维化过程未知。
肾小球系膜细胞随胞外基质(ECM)生成增加而复制，作为对肾损伤的肾小球应答的一部分，不管损伤的类型，例如在肾小球肾炎或糖尿病性肾病中。此过程损伤肾小球滤过，导致肾小球硬化和末期肾衰竭。参见例如Buschhausen，L.，et al.Kidney fibrosis impairs glomerular ultrafiltration and results in glomerular sclerosis and end-stage renal failure.Regulation of mesangial cell function by vasodilatory signaling molecules.Cardiovasc Res51：463-469(2001)。在肾小球硬化症转基因模型中(参见例如Shih，N.Y.，et al.Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein Science286：312-315(1999))或在患者中(参见例如Srivastava，T.，et al.Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood.Kidney Int 59：118-125(2001))鉴定到的足细胞异常说明这些细胞可能在肾小球疤形成的启动中发挥作用。其它模型暗示内皮或肾小球系膜细胞牵涉硬化过程(参见例如Schnaper，H.W.，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am J Physiol Renal Physiol 284：F243-252(2003))。在肾小球硬化症的许多模型中(以及在FSGS临床中)，ECM积累常常表现出在肾小球系膜中开始。肾小球中的所有三种细胞类型都与疾病进展有关，而且可能以某种方式有助于疾病进展。
根据显示原代人肾小球系膜细胞应答VEGF刺激而增殖增加(Onozaki，A.，et al..Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF：inhibitory effects of thiazolidinedione.Biochem BiophysRes Commun 317：24-29(2004))、诱导胶原合成(Amemiya，T.，et al.Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells.Kidney Int 56：2055-2063(1999))和一氧化氮生成增加(Trachtman，H.，et al.Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun245：443-446(1998))的研究，认为VEGF-A对肾小球系膜细胞具有功能性作用。还可参见例如Thomas，S.，et al.Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol11：1236-1243(2000)。然而，不管在体外肾小球系膜细胞对VEGF-A刺激的应答性，肾发育过程中肾小球系膜细胞中VEGF-A生成改变的效果和所牵涉的VEGF受体的本质仍然未知。
需要探索和理解VEGF和VEGF受体在肾中和在肾的各细胞类型中的生物学功能。理解这些分子的生物学功能可以通向肾疾病的治疗。本发明解决这些和其它需要，正如阅读以下公开内容后将会显而易见的。
发明概述
本发明提供了用于治疗受试者中的肾疾病的方法。例如，本发明的方法包括对患有肾疾病的受试者施用有效量的VEGFR调控剂。可用于本发明的VEGFR调控剂包括但不限于例如对至少一种或多种VEGF受体特异性的激动剂，诸如VEGF、VEGFR-1(Flt-1)激动剂、能选择性结合Flt-1的Flt-1选择性VEGF变体(Flt-sel)、能结合和活化Flt-1的生长因子诸如PIGF或VEGF-B、抗VEGFR-1激动性抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、小分子Flt1激动剂等。在本发明的一个实施方案中，所述VEGFR调控剂是Flt1激动剂。在一个实施方案中，所述VEGFR-1激动剂与血管发生剂(例如VEGF)、别的VEGFR1配体或激动剂、VEGFR2配体、VEGFR-2(KDR)选择性变体、抗VEGFR-2激动性抗体、VEGF-C、VEGF-D、能结合和活化VEGFR1和/或VEGFR2的生长因子等联合施用。可以通过本发明治疗的肾疾病包括但不限于炎性肾疾病(例如特征为炎性细胞改变、免疫复合物沉积(例如IgM沉积)、补体激活(例如C1q、C3和C4的激活)或其组合)、肾炎、肾小球硬化症、肾小球肾炎(肾衰竭)(例如可以通过蛋白尿、肾小球硬化、高血压、肾肾小球系膜细胞的存活时间缩短(decreased survival)、ECM合成的基因表达升高、基质降解降低和/或这些因素的组合确定的)、病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)等。在本发明的某些实施方案中，所述受试者患有导致肾疾病的感染。
在某些实施方案中，所述肾疾病的特征为VEGF水平降低。在本发明的某些实施方案中，所述疾病包含肾的各细胞类型(例如肾小球系膜细胞、足细胞、和/或内皮细胞)的改变。
在本发明的某些实施方案中，投递给受试者的本发明药剂是蛋白质或多肽。在本发明的某些实施方案中，本发明的药剂可以通过系统性(全身性)投递系统施用给受试者。所述系统性投递系统可以包括缓释制备物，其包含药剂(例如纯化的药剂)和聚合物基质。在一个实施方案中，施用细胞制备物，其包含表达重组形式药剂的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。或者，本发明的主题药剂可以经由肾靶向基因投递载体来施用，所述肾靶向基因投递载体包含编码所述药剂的核酸。可以使用已经为了基因疗法完善建立的病毒或非病毒载体，例如肾靶向基因投递载体。
还提供了包含VEGFR调控剂的制品和试剂盒，以及诊断试剂盒和方法。
附图简述
图1，小图a-h，图示了Flt1-Cre转基因小鼠使用ROSA26 LacZ报道株系的表征和Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠的生成。(a)Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)和Flt1-Cre-；VEGF(loxP/loxP)小鼠杂交产生的子代的基因型频率。所有所得基因型的小鼠以预期孟德尔比例出生。(b)Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的存活曲线。降低的存活在出生后4周明显可见，而且>95％的这些小鼠到12周龄时死亡。(c)7.5周龄Flt1-Cre-与Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠相比肾重对体重比率百分比。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾重量显著小于对照的。Flt1-Cre-，n＝25；Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝10；*p<0.0001。(d)(右)切除自4周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的肾的典型外观，与(左)WT和表型正常的肾相比。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾频繁囊肿且外观苍白。(e)(顶)用以检测4-5周龄Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠尿液中存在的蛋白质的银染。自3只小鼠(代表小图顶图所示每种基因型)取1μL尿液进行SDS-PAGE和银染。在Flt1-Cre+，VEGF(loxP/loxP)小鼠的尿液中检测到丰富的蛋白质，但是Flt1-Cre+，VEGF(loxP/+)或Flt1-Cre-小鼠没有，指示条件性VEGF敲除中的严重蛋白尿。(底)来自Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠的尿液使用针对清蛋白制备的抗体的Western印迹分析。(f)7.5周龄Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠中的血液尿素氮(B.U.N.)水平。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝9；Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)，n＝8；Flt1-Cre-，n＝16；**p值<0.0001。(g)7.5周龄Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠中的血清肌酸酐水平。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝9；Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)，n＝8；Flt1-Cre-，n＝16；*p值<0.05。(h)MAP测量过程中的均值动脉血压(MAP)和均值心率。(左轴和柱)MAP+/-标准偏差描绘为黑色柱。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)中的MAP与Flt1-Cre-小鼠相比显著升高。(右轴和正方形)在MAP测量过程中记录每只小鼠的心率，均值测量结果显示为黑色正方形+/-标准偏差。条件性VEGF敲除中的均值心率与对照相比没有显著不同。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝5；Flt1-Cre-，n＝10；**p值<0.005。
图2，小图a-c，图示了Flt1-Cre转基因和VEGF-A在肾小球的肾小球系膜细胞中共表达：(a)(左)来自7.5周龄小鼠肾的切片使用VEGF-A反义探针进行原位杂交的H&E染色的亮视野图像。(右)左小图所示图像的暗视野照片。VEGF-A表达在年龄匹配的Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的肾小球内显著降低。(b)18.5天龄胚胎Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)小鼠肾切片使用亲和纯化的、针对Cre重组酶制备的抗血清的免疫组织化学染色。(顶)由Flt1基因启动子驱动的Cre重组酶表达(褐色)在肾小球内的内皮细胞和肾小球系膜细胞(me)中都检测到。(底)Flt-Cre表达显示于内皮细胞(en)中，遍及小管-间质/髓质隔室，作为对照。(c)分离自7周龄Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠的总肾RNA的实时RT-PCR分析。Cre重组酶、Flt1、Flk1、和VEGF-A的相对RNA单位(RRU)相对于GAPDH水平标准化，且由标准曲线计算(Gerber et al.，2000)。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝6；Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)，n＝6；Flt1-Cre-，n＝6；*p值<0.05。
图3，小图a-m，示意性图示了2-7周龄Flt1-Cre；VEGF-LoxP小鼠肾的组织学分析及分离自5周龄Flt1-Cre；VEGF-LoxP小鼠的肾的透射电子显微照片：(a)2周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的肾皮质用H&E染色并以低放大倍数照相。标示了皮质囊肿的边界(点线)，而且由外周细胞组成且明显缺乏肾小球毛细胞环的肾小球明显可见。(b)H&E染色的2周龄WT肾小球切片。(c)H&E染色的2周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾小球切片。在(b)中其WT同窝幼仔中观察到的紧密毛细管环表现为缺失。(d)H&E染色的2周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾小球切片，其肾小球毛细管扩大，并被丰富的ECM沉积所遮掩。(e)来自7周龄Flt1-Cre-小鼠的肾小球用H&E染色的典型外观。(f)H&E染色的7周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾小球切片。在此阶段，条件性VEGF敲除的肾小球显著扩大，而且丰富的ECM沉积侵害肾小球毛细管和尿液空间(urinaryspace)。(g和h)Flt1-Cre-(g)和Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)(h)7周龄肾中内皮细胞使用α-CD31的免疫组织化学染色。在突变肾中检测到较少的CD31阳性内皮细胞。(i和j)Flt1-Cre-(i)和Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)(j)7周龄肾中通过原位杂交检测到的TGF-β表达。在条件性VEGF-A敲除肾中检测到TGF-β的显著上调。(k和1)用以检测Flt1-Cre-(k)和Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)(1)7周龄小鼠肾中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫组织化学染色。遍及条件性VEGF敲除的肾小球可检测到增加的α-SMA染色，反映了剩余肾小球系膜细胞的活化。(m)(顶)透射电子显微照片证明了Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾与(底)Flt1-Cre-肾的众多缺陷。(左)在患病肾中有足细胞足突(fp)融合(箭头)的区域，而在对照中有清楚的足突。(中)在肾小球系膜(me)中，在与免疫介导的肾小球肾炎一致的内皮下位置可以看到众多电子致密沉积物(de)，其在Flt-Cre-肾中不存在。(右)在具有晚期损伤的肾小球中，在Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾中看到显著增厚的和起皱的肾小球基底膜。在对照中看到开窗的内皮细胞(fenestrated endothelial cell)(en)，但是在条件性VEGF敲除中缺失。
图4，小图a-b，示意性图示了Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中肾衰竭的进展与IgM沉积和补体激活有关：(a)Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)与Flt1-Cre-相比(黑条)及Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)与Flt1-Cre-匹配器官相比(灰条)肾、肺、和心组织中单核细胞/巨噬细胞(MAC-1，F4/80)、B细胞(CD45R)和T细胞(Thy-1)谱系的细胞上表达的基因的RNA水平的倍数变化。表达水平已经相对于鼠GAPDH特异性的探针/引物集标准化。表达的统计学显著倍数变化以星号标注，p值<0.005。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)，n＝6；Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)，n＝6；Flt1-Cre-，n＝6。(b)5周龄Flt1-Cre-和Flt1-Cre+，VEGF(loxP/loxP)小鼠肾中(左)单核细胞/巨噬细胞和(右)T细胞谱系的细胞的免疫组织化学/荧光染色，分别使用α-F4/80抗体和α-CD4抗体。单核细胞/巨噬细胞和T细胞子集被募集入条件性VEGF-A敲除(小鼠)的肾组织。
图5，小图a-f，图示了VEGF-A和Flt1缺陷肾小球系膜细胞的体外分析：(a)用以创建Flt1-loxP小鼠的基因寻靶策略。寻靶载体设计成在包含Flt1基因的翻译起始密码子(ATG)的第一外显子的上游导入侧翼为两个loxP位点(LoxP1和LoxP2)的PGK-Neo盒，及在第一外显子的3’导入第三loxP位点(LoxP3)。Cre重组酶表达后，选择已经在LoxP1和LoxP2之间经历重组的胚胎干(ES)细胞克隆并用以生成Flt1-loxP小鼠。显示了用于通过Southern印迹筛选寻靶事件和重组的PCR扩增的基因组DNA探针(5’Pr，3’Pr)的位置。指出了用于此筛选的限制酶位点的位置和寻靶载体的区域的长度(以千碱基为计)。E：EcoRI；H：HindIII；K：KpnI；kb：千碱基。(b)提取自WT和被靶向的(Targ.)ES细胞克隆及提取自感染了编码LacZ(LZ)或Cre重组酶(Cre)基因的腺病毒的Flt1(loxP/loxP)肾小球系膜细胞(Mes.)的基因组DNA的Southern印迹分析。将来自各细胞的基因组DNA或者用EcoRI或者用HindIII和KpnI二者消化以分析分别在Flt1基因被靶向的区域5’端或3’端的寻靶事件和loxP重组。每个小图的左边和右边分别指出了每条泳道中检测到的预期片段的长度(以千碱基计)。(c)感染了腺病毒的肾小球系膜细胞中的VEGF-A表达。自WT和VEGF(loxP/loxP)小鼠分离肾小球系膜细胞，并感染编码LacZ(Ad-LacZ)或Cre重组酶(Ad-Cre)的腺病毒。分离总RNA，并进行定量实时PCR以分析VEGF-A表达。相对于GAPDH标准化后，结果表述成相对RNA单位(RRU)，并且使用来自WT小鼠的总肾RNA生成每种引物/探针集的标准曲线。(d)感染了腺病毒的肾小球系膜细胞中的Flt1表达。自WT和Flt1(loxP/loxP)小鼠分离肾小球系膜细胞，并感染Ad-LacZ和Ad-Cre。分离RNA，并通过定量RT-PCR分析Flt1表达。结果如(c)中所述表述。(e)VEGF-A和Flt1缺陷肾小球系膜细胞的体外存活。计算Ad-LacZ和Ad-Cre处理之间的细胞计数比率，并标准化为对WT细胞获得的数值的百分比。VEGF-A和Flt1缺陷肾小球系膜细胞都展现与WT肾小球系膜细胞相比显著降低的体外存活。与WT细胞相比的存活的统计学显著差异以星号标注：*p值<0.05；**p值<0.01。Flt1缺陷的和VEGF缺陷的肾小球系膜细胞还展现显著不同的体外存活，p<0.05。(f)在存在中和性VEGF抗体(α-VEGF)或对照抗体(对照IgG)时培养的感染了Ad-LacZ的肾小球系膜细胞的存活。在VEGF-A或Flt1在遗传上消除时明显可见的降低的肾小球系膜细胞存活不能通过在存在α-VEGF时培养肾小球系膜细胞来重演。
图6，小图a-d，图示了分离自7周龄Flt1-Cre；VEGF-loxP小鼠的总肾RNA的实时RT-PCR分析，用以检测不同形式胶原的表达。胶原α1型I(a)、胶原α2型II(b)、胶原α2型IV(c)和胶原α1型XVIII(d)的相对RNA单位(RRU)相对于甘油醛-3-脱氢酶(GAPDH)水平标准化，且由标准曲线计算。
发明详述
定义
在详细描述本发明之前，应当了解本发明不限于特定的组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还应了解本文所用术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意图对其进行限制。在用于本说明书和所附权利要求时，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数的对象，除非另有明确说明。因此，例如，提及“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合，诸如此类。
肾炎即肾脏的炎症。肾炎的迹象(例如尿液中的血液和/或蛋白质及受损的肾功能等)取决于免疫应答的类型、位置和强度，影响肾小管、肾小管、肾小管周围组织、或血管的炎症。“肾炎相关疾病”包括但不限于例如原发性肾小球病(急性弥漫性增生性肾小球肾炎、链球菌后肾小球病、非链球菌后肾小球病、新月体肾小球肾炎、模型肾小球病、类脂性肾病(lipoidnephrosis)、病灶性节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulonephritis)、模型增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis)、IgA肾病、病灶性增生性肾小球肾炎(focal proliferative glomerulonephritis)、和慢性肾小球肾炎)、系统性疾病(系统性红斑狼疮、糖尿病、淀粉样变(amyloidosis)、古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征、节结性多动脉炎、韦格纳氏(Welgener)肉芽肿病、亨诺-许兰(Henoch-Schonlein)紫癜、和细菌性心内膜炎)、和遗传性病症(阿尔波特氏(Alport)综合征、薄膜疾病(thin membrane disease)、和法布里氏(Fabry)病)。
“肾病综合征”是由影响肾脏的许多疾病所致症状的集合，导致严重的、长时间的蛋白质从尿液中丢失、血液蛋白质(尤其是清蛋白)水平降低、过量的盐和水滞留在体内、和血液脂肪(脂质)水平升高。肾病综合征可以是由任何肾小球病或多种疾病引起的。典型的是，该综合征在3或4个月内进展成完全肾衰竭。
“急性肾病综合征”或“急性肾小球肾炎”指常常导致尿液中突然出现血、尿液中有血细胞团块(管型(cast))和不同量的蛋白质的肾小球炎症。急性肾病综合征可以在链球菌感染后发生，诸如咽喉链球菌感染(strep throat)。因为与中和链球菌的抗体一起结成团块的来自死亡链球菌的抗原的积累，肾小球遭到损伤。这些团块(免疫复合物)覆盖肾小球的膜并干扰它们的滤过功能。急性肾病综合征也可以是由对其它感染的反应引起的，诸如人造身体部分(假体)的感染、细菌性心内膜炎、肺炎、腹腔脏器脓肿、禽痘、传染性肝炎、梅毒、和疟疾。最后三种感染可以引起肾病综合征，而非急性肾病综合征。“慢性肾病综合征”或“慢性肾小球肾炎”指在数种疾病中发生的病症，在所述疾病中在数年时段里肾小球遭到损伤且肾功能退化。
肾小球病即肾小球的疾病，其是毛细管丛的疾病。在肾小球疾病中，它是每个肾小管起点处毛细管环形成的丛的疾病。肾小球病的类型包括但不限于例如：(1)急性肾病综合征；(2)快速进展的肾病综合征；(3)肾病综合征；和(4)慢性肾病综合征。因为肾小球遭到损伤，正常情况下不从血流中滤出的物质(诸如蛋白质、血、白细胞、和碎片)可穿过肾小球并进入尿液。微小的血块(微血栓)可以在供应肾小球的毛细管中形成。
肾小球硬化症是一种退行性肾疾病，其导致常常与肾动脉硬化或糖尿病有关的肾小球中玻璃状沉积物(hyaline deposit)或结疤。典型的是，有循环中炎性细胞的滤过、间质纤维化和管萎缩。由数种因素引起的肾小球损伤致使蛋白尿，其中蛋白质结合可溶性免疫球蛋白A(sIgA)、sIgG和sIgM，在基底膜上形成免疫复合物。这些免疫复合物发挥炎性淋巴细胞的趋化因子的功能，其在患病区域中引起过度的免疫应答(Bohle A et al.，Kidney Int 67(Suppl.)：186S-188S(1998))。在管受到炎性细胞损伤时，与肾小球相连接的血管也受到损伤并堵塞。结果是，肾小球受到不利影响并变质。这些肾小球变化伴随有组织纤维化并进展成最终的肾衰竭(参见例如Ratscchek M et al.，Clin Nephrol 25：221-226(1986)；Bohle A et al，Clin Nephrol 29：28-34(1998)；Bohle A et al.，Kidney Blood Press Res 19：191-195(1996))。
一种类型是病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，其是具有增厚基底膜和增多肾小球系膜基质的肾小球毛细管的节段性塌陷(segmental collapse)，其常常导致蛋白尿和肾机能不全。参见例如Kamanna et al.，Histol.Histopathol.13：169-179(1998)；Wehrmann et al.，Clin.Nephrol.33：115-122(1990)；Mackensen-Haen，et al.，Clin.Nephrol.37：70-77(1992)。它可以引起永久的肾衰竭。
术语“肾小球系膜”(mesangium)指支持肾的肾小球中毛细管环的组织，由肾小球系膜细胞和肾小球系膜基质构成。已知肾小球系膜细胞维持肾小球的环结构，以及具有吞噬功能或调节肾小球血流的能力。肾小球系膜细胞具有血管紧张素II受体，并生成血小板激活因子、前列腺素、IV型胶原、纤连蛋白等。肾小球系膜基质是围绕肾小球系膜细胞的胞外基质成分。
术语“VEGF受体”或“VEGFR”在用于本文时指VEGF的细胞受体，通常是在血管内皮细胞上找到的细胞表面受体，及其保留与VEGF结合能力的片段和变体(诸如胞外结构域的片段或截短形式)。VEGFR的一些例子包括文献中称为Flt-1(在本文中也可与“VEGFR-1”互换使用)和KDR/Flk-1(在本文中也可与“VEGFR-2”互换使用)的蛋白激酶受体。参见例如DeVries et al.Science，255：989(1992)；Shibuya et al.Oncogene，5：519(1990)；Matthews et al.Proc.Nat.Acad.Sci.，88：9026(1991)；Terman et al.Oncogene，6：1677(1991)；及Terman et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，187：1579(1992)。Flt-1(fms样酪氨酸激酶)和KDR(激酶结构域区)受体以高亲和力结合VEGF。Flk-1(胎肝激酶-1)，KDR的鼠同系物，与人KDR共享85％的序列同一性。FerraraKidney Intl.56：794-814(1999)。Flt-1和KDR/Flk-1二者都具有胞外结构域(ECD)中的七个免疫球蛋白(Ig)样结构域、单个跨膜区和共有的酪氨酸激酶(TK)序列，其被激酶插入结构域中断。Flt-1具有对rhVEGF165的最高亲和力，Kd为大约10-20pM。KDR具有对VEGF的较低亲和力，Kd为大约75-125pM。VEGFR的核酸序列和氨基酸序列易于由本领域技术人员获取和得到。
其它VEGF受体包括那些可以用VEGF交联标记的，或可以用KDR或Flt-1免疫共沉淀的。已经鉴定了能结合VEGF165但不能结合VEGF121的一种别的VEGF受体，其是神经纤毛蛋白(neuropilin)1。Soker et al.Cell 92：735-45(1998)。同工型(isoform)特异性VEGF结合受体也是介导神经元细胞导向的脑衰蛋白(collapsing)/信号素(semaphoring)家族的受体。
Flt-1和KDR受体主要作为血管内皮细胞表面上的结合受体存在，尽管它们也可以存在于非内皮细胞中。还已经找到了一些可溶形式的VEGFR。例如，已经在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中鉴定了编码可变剪接的可溶形式的Flt-1(sFlt-1)的cDNA，其缺少第七个Ig样结构域、跨膜序列、和胞质结构域。Kendall et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.226：324-328(1996)。
术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.，Science 246：1306(1989)；Houck et al.，Mol.Endocrin.5：1806(1991)；及Robinson & Stringer，Journal of Cell Science，144(5)：853-865(2001)所述，及其天然存在等位形式和加工形式。术语“VEGF”还用于指例如包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位、保留生物学活性的多肽片段。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来提及任何此类形式的VEGF。天然VEGF“片段”的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，天然VEGF片段中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。天然VEGF片段可以具有与天然VEGF相当的对KDR和/或Flt-1受体的结合亲和力。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员(A、B、C、D和E)、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素(angiopoietin))、ANGPTL3、ANGPTL4、ephrin等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53：217-39；Streitand Detmar(2003)Oncogene 22：3172-3179；Ferrara & Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12)：1359-1364；Tonini等(2003)Oncogene 22：6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8：200-206。
“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)和天然存在的等位变体。
“分离的”多肽指已经鉴定且与由其天然环境的成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95％或重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
多肽“变体”意指与相应的天然序列多肽或其片段具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如在多肽的N-末端和/或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，变体与天然序列多肽或其片段将具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约90％的氨基酸序列同一性，或者至少约95％或更多的氨基酸序列同一性。
术语“变体”在用于本文时指本文所述蛋白质变体和/或在天然蛋白质序列中包含一处或多处氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。用于本发明的其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。在本发明的某些实施方案中，本发明方法中所采用的VEGF包含重组VEGF165。氨基酸序列变体可通过例如VEGF DNA或VEGFR DNA中的突变来制备。此类变体包括例如VEGF或VEGFR氨基酸序列内的残基删除、插入或替代。可以进行删除、插入和替代的任何组合以获得具有期望活性的最终构建物。将在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。EP75,444A。
变体的制备任选通过编码天然蛋白质的DNA中的核苷酸定点诱变或噬菌体展示技术，由此产生编码所述变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。
尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身不必预先决定。例如，为了优化指定位点处突变的后果，可以在目标密码子或区域进行随机诱变，并对所表达的变体筛选期望活性的最佳组合。用于在具有已知序列的DNA中预先决定的位点进行替代突变的技术是众所周知的，诸如例如位点特异诱变。本文所述变体的制备可通过噬菌体展示技术来实现，诸如那些PCT出版物WO 00/63380中所记载的。
在选出这样的一个克隆后，可以取出突变后的蛋白质区并置入适用于蛋白质生产的载体，一般是可用于转化适宜宿主的那种类型的表达载体。
氨基酸序列删除的范围一般是约1-30个残基，任选1-10个残基，任选1-5个残基或更少，而且通常是连续的。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，从一个残基至长度本质上不受限制的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即天然蛋白质序列内的插入)的范围一般可以是约1-10个残基，任选1-5个，或任选1-3个。末端插入的例子包括在N-末端融合信号序列(无论对宿主细胞是异源的或同源的)以便于由重组宿主分泌。
别的变体有那些其中天然蛋白质的至少一个氨基酸残基已经消除并在它的位置插入了不同残基的变体。此类替代可依照表1所示进行。变体还可包含本文所述的非天然氨基酸。
氨基酸可以根据其侧链特性的相似性如下分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New York，(1975))：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，天然存在残基可以基于共同的侧链特性如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
表1
 
原始残基 例示替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码的氨基酸残基)可以选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。“非天然存在的氨基酸残基”指上文所列天然存在氨基酸残基以外的，能够在多肽链中与邻近氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如那些Ellman et al.，Meth.Enzym.202：301-336(1991)及美国专利申请出版物20030108885和20030082575中所记载的。简而言之，这些规程牵涉用非天然存在氨基酸残基活化阻抑型tRNA，接着体外或体内转录并翻译RNA。参见例如美国专利申请出版物20030108885和20030082575；Noren et al.，Science 244：182(1989)；及Ellman et al.，supra。
本领域技术人员使用常规筛选测定法可以容易地评估替代、删除或插入的效果。例如，通过噬菌体展示选出的VEGF变体可以在重组细胞培养物中表达，并任选从该细胞培养物中纯化。然后可以对VEGF变体评估KDR或Flt-1受体结合亲和力和其它生物学活性，诸如本领域已知的或本申请中公开的生物活性。细胞溶胞物或纯化的VEGF变体的结合特性或活性可以在针对期望特征的合适筛选测定法中筛选。例如，可能希望VEGF变体与天然VEGF相比免疫学特征的变化，诸如对给定抗体的亲和力。此类变化可以通过竞争性免疫测定法来测量，该测定法可以依照本领域已知技术来进行。VEGF变体的各受体结合亲和力可以通过本领域已知的和下文实施例中进一步描述的ELISA、RIA、和/或BLAcore测定法来测定。在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF变体还在反映诱导KDR受体磷酸化能力的KIRA测定法中展现出活性。在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF变体诱导内皮细胞增殖，或者，额外还诱导内皮细胞增殖(其可以通过本领域已知方法来测定，诸如HUVEC增殖测定法)。本发明涵盖在本文中公开的特定VEGF变体，除此之外，还涵盖用于本发明的Keyt et al.J.Biol.Chem.271：5638-5646(1996)中披露的VEGF变体。
“百分比(％)氨基酸序列同一性”在本文中定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为本发明目的％氨基酸序列同一性值是如下所述使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US CopyrightOffice，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册，公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)获得。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，例如数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
为本发明目的，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
术语“调控”在用于本文时指降低、抑制、减少、改善、升高、增加或增强VEGFR基因功能、表达、活性或与VEGFR基因有关的表型。
术语“VEGFR调控物”或“VEGFR调控剂”或“VEGFR调控化合物”指能活化(例如激动剂)其表达或能抑制(例如拮抗剂或抑制剂)VEGFR的活性或其表达的分子。术语“激动剂”用于指有能力经由天然VEGFR受体发信号的药剂。术语“激动剂”在VEGFR受体生物学作用的语境中定义。在本发明的某些实施方案中，VEGFR调控物包括但不限于VEGFR激动剂(例如Flt1激动剂)、能结合VEGFR受体的配体(例如VEGF、VEGF选择性变体、PlGF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)。本发明别的激动剂包括但不限于例如具有激动剂活性的VEGFR变体、VEGFR激动性抗体等。
VEGFR拮抗剂指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGFR活性(例如细胞增殖或生长、迁移、粘附或代谢，包括其与配体(例如VEGF、VEGF选择性变体、PlGF和VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)结合)的分子。VEGFR拮抗剂包括例如抗VEGFR抗体及其抗原结合片段、能特异性结合VEGFR由此使其隔绝与一种或多种配体结合的受体分子及衍生物、抗VEGFR抗体和VEGFR拮抗剂诸如受体的小分子抑制剂。其它VEGFR拮抗剂还包括VEGFR的拮抗性变体、反义分子(例如VEGFR-siRNA)、RNA适体、和针对VEGFR或其受体的核酶。在某些实施方案中，拮抗性VEGFR抗体是能通过结合VEGFR的特定亚序列或区域而抑制或降低VEGFR活性的抗体。
术语“抗VEGFR抗体”指能以足够亲和力和特异性结合VEGFR的抗体。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗VEGFR抗体可以在靶向和干扰其中牵涉VEGFR活性的疾病或疾患时用作治疗剂。一般而言，抗VEGFR抗体通常不会结合其它VEGFR同系物。
术语“抗体”以最广义使用，包括单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。
除非另有说明，贯穿本说明书，表述“多价抗体”用于指包含三个或更多个抗原结合位点的抗体。多价抗体通常改造成具有三个或更多个抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区的二硫键相连的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Birdet al.，Science 242：423-426(1988)和Huston et al.，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)和美国专利5,641,870)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)或Marks et al.，J.Mol.Bio l.222：581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)；Sheets et al.，PNAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom andWinter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物例如小鼠来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)；美国专利No.5,750,373。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异显著且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中相对保守得多部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，完整抗体可归入不同的“类”。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1(包括非A和A同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，其可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体而产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Fc区的大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结构域和CH3结构域，而且任选包含CH4结构域。“Fc区链”在本文中指Fc区的两条多肽链之一。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自大约第231位氨基酸延伸至大约第340位氨基酸。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测该碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C-端的一段残基(即自IgG的大约第341位氨基酸残基至大约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域；参见美国专利No.5,821,333，明确收入本文作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成如本文所述的多特异性(例如双特异性)抗体。
“铰链区”通常定义为自人IgG1的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的多种测定法来评估。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体可以具有改变的Fc区，导致改变的效应器功能，例如增强的功能或减弱的功能。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将典型地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区拥有例如至少约80％的序列同一性，或至少约90％的序列同一性，或至少约95％的序列同一性。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。典型的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如如本文所述从血液或PBMC分离。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述参见Daёron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel etal.，Immunomethods4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))和调节免疫球蛋白的动态平衡。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward，Immunol Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetieet al.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem279(8)：6213-6216(2004)；and WO2004/92219(Hinton et al.))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2000/42072记载了对FcR的结合得到改良或消除的抗体变体。还可参见例如Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指在存在补体时靶物的溶解。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoroet al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必在量上相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。
具有规定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该规定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选能结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlowand David Lane(1988)中所记载的。
“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其它结构域相连的多肽。
“柔性接头”在本文中指包含两个或更多通过肽键相连的氨基酸残基且为由其连接的两段多肽(诸如两个Fd区)提供更多旋转自由的肽。所述旋转自由容许由柔性接头连接的两个或更多抗原结合位点各自更高效的接近靶抗原。合适的柔性接头肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。
“二聚化结构域”是由至少两个氨基酸残基(一般是半胱氨酸残基)或者至少两个肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)结合形成的。所述肽或多肽可以经由共价和/或非共价结合而彼此相互作用。本文中的二聚化结构域的例子包括Fc区；铰链区；CH3结构域；CH4结构域；CH1-CL对；具有改造的“结节”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”，如美国专利No.5,821,333所述，明确收入本文作为参考；亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，参见Kostelney et al.，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉链)；异亮氨酸拉链；受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R)；和整联蛋白异二聚体，诸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区；二聚配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员、和脑衍生神经营养性因子(BDNF)；参见Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)：27833-27839(1994)及Radziejewski et al.Biochem.32(48)：1350(1993))或其二聚化区；一对能够形成二硫键的半胱氨酸残基；一对肽或多肽，各自包含至少一个半胱氨酸残基(例如约1个、2个或3个到约10个半胱氨酸残基)使得可以在所述肽或多肽之间形成二硫键(下文的“合成铰链”)；及抗体可变域。本文中最优选的二聚化结构域是Fc区或铰链区。
短语“刺激细胞增殖”涵盖在体外或在体内提高细胞相对于未处理细胞或减轻处理细胞(reduced treated cell)的生长和/或繁殖程度的步骤。细胞培养中细胞增殖的升高可通过在暴露于目的分子之前和之后对细胞计数来检测。增殖程度可通过显微镜检验汇合程度来定量。细胞增殖还可使用本领域已知的测定法(例如胸苷掺入测定法)和商品化测定法来定量。短语“抑制细胞增殖”涵盖在体外或在体内降低细胞相对于未处理细胞或减轻处理细胞(reduced treated cell)的生长和/或繁殖程度的步骤。它可以如上所述来定量。
为了治疗的目的，“受试者”指任何动物。一般而言，动物指哺乳动物。为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、绵羊、猪等。典型的是，哺乳动物指人。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括同时(共同)施用和/或任何次序的序贯施用。
术语“有效量”或“治疗有效量”指药物有效治疗受试者中的疾病或病症的量。在肾疾病的情况中，药物的有效量可以减轻/减少症状或者减轻或消除疾病。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处置和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有病症的以及那些要预防病症的受试者。
“病症”指任何会受益于本发明的分子的治疗的疾患，例如参见本文损伤肾病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使受试者倾向于所讨论病症的病理状况。
“转染”指宿主细胞对表达载体的摄取，无论任何编码序列事实上是否表达。普通技术人员知道许多转染方法，例如CaPO4和电穿孔。当宿主细胞内出现此载体运转的任何迹象时，通常承认转染是成功的。
“转化”指将DNA导入生物体，使得该DNA可复制，或是作为染色体外元件或是作为染色体整合成分(integrant)复制。根据所用宿主细胞，使用适于此类细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理，如Cohen，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，69：2110(1972)及Mandel et al.J.Mol.Biol.，53：154(1970)所述，通常用于具有坚固细胞壁屏障的原核生物或其它细胞。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，常常采用Graham and van der Eb，Virology，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般情况描述于1983年8月16日公告的Axel的美国专利No.4,399,216。对酵母的转化通常依照VanSolingen et al.J.Bact.，130：946(1977)及Hsiao et al.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)的方法进行。然而，还可使用将DNA导入细胞的其它方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。
肾疾病
肾小球基质积累的一项关键决定因素是ECM合成与溶解之间的平衡(参见例如Schnaper，H.W.(1995).Balance between matrix synthesis and degradation：a determinant of glomerulosclerosis.Pediatr Nephrol 9，104-111)。当该平衡遭到破坏时，肾病症就发生了。例如，肾小球硬化症就是正常的、功能性的肾小球组织被胞外基质(ECM)的积累沉积物置换的过程。长期暴露于对肾小球硬化症的当前治疗(例如类固醇、环孢菌素等)常常诱发对数种器官的副作用。另外，所述的当前治疗未必能中断或逆转疾病的进展，因而仍然需要进一步的治疗，诸如肾透析或肾移植。
具有VEGF下调的肾疾病通常与肾小球硬化症和自身免疫性沉积物有关。参见例如Shulman，K.，et al.Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF)is altered in many glomerular diseases.J Am Soc Nephrol7：661-666(1996a)；Noguchi，K.，et al.Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis.J Am Soc Nephrol 9：1815-1825(1998)；Shulman，K.，et al.Expression of vascular permeability factor(VPF/VEGF)is altered in many glomerular diseases.J-Am-Soc-Nephrol 7：661-666 issn：1046-6673(1996b)；Wada，Y.，et al.(2002).Impairment of vascular regeneration precedes progressive glomerulosclerosis in anti-Thy 1 glomerulonephritis.Kidney Int61：432-443)；及Yuan，H.T.，et al.(2002).Angiopoietin correlates with glomerular capillary loss in anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.Kidney Int 61：2078-2089。
本申请描述了VEGF-A和VEGFR在肾细胞中在肾发育过程中的功能。对此类功能的干扰在小鼠中诱发肾小球硬化症。本发明提供了使用VEGFR调控物治疗受试者中的病理性肾疾患的方法。短语“病理性肾疾患”可以与“肾病症”或“肾疾病”或“肾疾病”互换使用，指任何结构性和/或功能性的肾异常。VEGFR的调控物包括但不限于VEGFR配体(例如VEGF(A、B、C、D和/或E))、Flt-1激动剂(例如Flt选择性VEGF变体、VEGF-B、PlGF)、VEGFR激动性抗体、VEGFR激动性小分子等，其可以是治疗肾疾病(例如炎性肾疾病、肾小球硬化症等)的治疗剂。在某些实施方案中，所述肾疾病是由感染引起的。在某些实施方案中，所述受试者正在用其它药剂治疗肾疾病，例如类固醇、环孢菌素等。在本发明的某些实施方案中，对受试者施用有效量的Flt1激动剂以治疗病理性肾疾患。在本发明的一个实施方案中，KDR激动剂或其它血管发生因子可以与Flt1激动剂联合施用，例如以低于Flt1可以通过提供血管发生刺激导致最大治疗好处的比率。在本发明的某些实施方案中，KDR激动剂或其它血管发生因子可以与Flt1激动剂联合施用，例如以高于Flt1的比率或等比率。在另一个实施方案中，可以使用优先活化Flt-1而非KDR的VEGF变体以组合安全性和疗效的最佳特征。在某些实施方案中，VEGF是与Flt1激动剂联合施用的。
病理性肾疾患的治疗可以由本领域技术人员来评估，例如通过组织学分析和免疫细胞化学，通过尿液分析，例如血液尿素氮(B.U.N)、血清肌酸酐等，通过测量平均动脉血压等。在本发明的某些实施方案中，所述炎性肾疾病的特征为以下各项，而且治疗通过以下各项来评估：炎性细胞的改变、免疫复合物沉积(例如IgM沉积)、或患病肾小球中的补体激活(例如C1q、C3和C4的激活)。在本发明的某些实施方案中，所述肾疾病包含肾小球系膜细胞的改变，例如VEGF水平的降低，而治疗将会具有相反效果。在本发明的某些实施方案中，肾小球肾炎是由以下各项确定的，而且治疗通过测量以下各项来评估：蛋白尿、肾小球硬化、高血压、或其组合。还可通过测定以下各项来评估：肾细胞(例如肾小球系膜细胞)的存活、ECM合成的基因表达或基质降解。在此类情况中，所述肾小球肾炎可以通过以下各项来确定：肾小球系膜细胞存活时间缩短(decreased survival of kidney mesangial cells)、ECM合成的基因合成升高、基质降解的降低、或其组合，而治疗将会具有相反效果。
本发明的组合物及其生产
本发明涉及能够调控肾中的VEGFR(例如VEGFR-1和VEGFR-2)活性的各种药剂的用途。术语“药剂”或“化合物”在用于本文时广泛地指具有可鉴定的分子结构和物理化学特性的任何物质。能够调控VEGFR活性的药剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物(peptidomimetic)、制药学药剂(pharmacologicalagent)及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。
本发明所涵盖的VEGFR调控剂可以是VEGFR的激动剂。例如，VEGFR激动剂可以是生长因子配体(例如VEGF、VEGF B、VEGF C、VEGF D、VEGF E、PlGF等，典型地是VEGF、VEGF B和/或PlGF)或能结合VEGFR胞外结构域并触发其信号转导活性的抗体。或者，VEGFR激动剂可以是能结合VEGFR胞质结构域并介导其酪氨酸磷酸化的小分子化合物。
在一个实施方案中，本发明的激动剂是对Flt-1“选择性的”或“特异性的”，即它排他性地或优选地调控Flt-1而非其它受体酪氨酸激酶诸如KDR。在另一个实施方案中，本发明的激动剂是对KDR“选择性的”或“特异性的”，即它排他性地或优选地调控KDR而非其它受体酪氨酸激酶诸如Flt-1。在一个方面，本发明的VEGFR激动剂包含能够选择性结合Flt-1的VEGF变体多肽(下文称为“Flt-1选择性VEGF变体”或“Flt1-sel”或“Flt1sel”)。在一个方面，所述VEGFR激动剂是VEGF-B或PlGF，其能选择性结合Flt1。
Flt-sel及其制备方法是已知的，描述于下文实施例。涉及Flt-sel的别的公开内容可以参见例如PCT公开号WO 00/63380及Li et al.J.Biol.Chem.275：29823-29828(2000)。在本发明的某些实施方案中，Flt-sel变体包含一处或多处氨基酸突变，并展现出对Flt-1受体的结合亲和力等于或大于(≥)天然VEGF对Flt-1受体的结合亲和力，甚至更优选的是，此类VEGF变体展现出对KDR受体的结合亲和力小于(<)天然VEGF所展现的对KDR的结合亲和力。当此类VEGF变体对Flt-1受体的结合亲和力大致等于(未变化)或大于(升高了)天然VEGF而且该VEGF变体对KDR受体的结合亲和力小于天然VEGF或几乎消除时，为本文目的，该VEGF变体的结合亲和力视为对Flt-1受体是“选择性的”。在本发明的一个实施方案中，本发明的Flt-1选择性VEGF变体具有小至少10倍的对KDR受体的结合亲和力(与天然VEGF相比)，甚至更优选具有小至少100倍的对KDR受体的结合亲和力(与天然VEGF相比)。VEGF变体的各自结合亲和力可以通过ELISA、RIA、和/或BIAcore测定法来测定，它们是本领域已知的且记载于PCT公开号WO 00/63380中。
在本发明的有些方面，肾治疗的各种方法进一步包括使用能够调控KDR活性的药剂。例如，KDR激动剂可以与Flt-1激动剂联合施用以治疗肾疾病。KDR已经鉴定为在内皮细胞增殖中介导VEGF活性的主要受体酪氨酸激酶。
在一个方面，所述KDR激动剂包括VEGF(以及VEGF-C或VEGF-D)或能够选择性结合KDR的VEGF变体多肽(下文称为“KDR选择性VEGF变体”或“KDR-sel”或“KDRsel”)。KDR-sel VEGF变体及其制备方法详细记载于例如PCT公开号WO 00/63380及Li et al.J.Biol.Chem.275：29823-29828(2000)。在一个实施方案中，所述KDR-sel包含一处或多处氨基酸突变，并展现出对KDR受体的结合亲和力等于或大于(≥)天然VEGF对KDR受体的结合亲和力，甚至更优选的是，此类VEGF变体展现出对Flt-1受体的结合亲和力小于(<)天然VEGF所展现的对Flt-1的结合亲和力。当此类VEGF变体对KDR受体的结合亲和力大致等于(未变化)或大于(升高了)天然VEGF而且该VEGF变体对Flt-1受体的结合亲和力小于天然VEGF或几乎消除时，为本文目的，该VEGF变体的结合亲和力视为对KDR受体是“选择性的”。在本发明的一个实施方案中，本发明的KDR-sel具有小至少10倍的对Flt-1受体的结合亲和力(与天然VEGF相比)，甚至更优选具有小至少100倍的对Flt-1受体的结合亲和力(与天然VEGF相比)。VEGF变体的各自结合亲和力可以通过ELISA、RIA、和/或BIAcore测定法来测定，它们是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，本发明的KDR-sel还在反映诱导KDR受体磷酸化能力的KIRA测定法中展现出活性。在本发明的一个实施方案中，本发明的KDR选择性VEGF变体另外/或者诱导内皮细胞增殖(其可以通过已知方法来测定，诸如HUVEC增殖测定法)。
在一个方面，本发明的VEGFR调控剂是通过重组方法生产的。这些方法中所使用的分离的DNA在本文中理解为指化学合成的DNA、cDNA、染色体或染色体外DNA，有或无3′和/或5′侧翼区。在本发明的某些实施方案中，VEGFR调控剂是通过重组细胞培养物中的合成制备的。
关于此类合成，需要编码VEGF或VEGFR或其变体的核酸。编码VEGF分子的DNA可以从垂体滤泡细胞获得，例如牛垂体滤泡细胞，其通过(a)从这些细胞制备cDNA文库，(b)用编码VEGF或其片段(长度可达或超过100个碱基对)的经标记DNA实施杂交分析以检测文库中包含同源序列的克隆，并(c)通过限制酶分析和核酸测序分析所述克隆以鉴定全长克隆。如果cDNA文库中不存在全长克隆，那么可以使用本文中首次公开的核酸序列信息从各克隆回收适宜片段，并在各克隆共同的限制性位点处连接以装配编码VEGF的全长克隆。或者，基因组文库可提供期望的DNA。一旦此DNA自文库得到鉴定和分离，将它连接入可复制载体供进一步克隆或表达。
在重组表达系统的一个例子中，编码本发明多肽(例如VEGF)的基因等通过用包含编码例如VEGF的DNA的表达载体转化而在细胞系统中表达。在本发明的某些实施方案中，优选转化能够实现这样的加工的宿主细胞，即在培养物培养液或宿主细胞的周质中获得多肽，即获得分泌的分子。
在本发明的一些方面，所述Flt-1激动剂包括能选择性结合并活化Flt-1的生长因子。已经鉴定了能特异性结合Flt-1但非KDR的数种天然存在VEGF同源物，包括但不限于胎盘生长因子(PIGF)和VEGF-B。PIGF具有与VEGF的血小板衍生生长因子样结构域共享53％同一性的氨基酸序列。Park et al.J.Biol.Chem.269：25646-54(1994)；Maglione et al.Oncogene 8：925-31(1993)。与VEGF一样，不同种类的PIGF源自mRNA的可变剪接，而且蛋白质以多聚体形式存在。参见例如Park et al.，supra。PIGF-1和PIGF-2二者都以高亲和力结合Flt-1，但是都不能与KDR相互作用。参见例如Park et al.，supra。
VEGF-B以两种同工型产生(167个和185个残基)，也表现出特异性结合Flt-1。Pepper et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：11709-11714(1998)。与长型VEGF相似，VEGF-B以膜结合蛋白质形式表达，而且可以在添加肝素后以可溶形式释放。VEGF-B和VEGF在共表达时还能够形成异二聚体。Olofsson etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：2576-2581(1996)。
可用于本发明的化合物包括能在RTK的胞内酪氨酸激酶结构域处发挥其调控功能的有机小分子。在某些优选的实施方案中，采用小分子激动剂来刺激酪氨酸磷酸化，由此激活相应的信号传导途径。
可用于本发明的化合物包括激动性抗体。本发明的抗体典型地是对受体(诸如Flt-1)特异性的。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体包括抗Flt-1抗体。在本发明的一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体能选择性结合Flt-1并调控Flt-1，而不影响KDR功能。在本发明的一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体是激动性抗体(agonist antibody)。
用途
本发明提供了治疗肾疾病的方法，例如通过促进肾小球系膜细胞存活，通过施用有效量的VEGFR激动剂。本发明的存活促进效果可以在体外或在体内评估，使用本领域已知的方法和本文中描述的方法。例如，可以评估胶原合成的诱导(参见例如Amemiya，T.，et al.Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells.Kidney Int 56：2055-2063(1999))和监测一氧化氮生成(参见例如Trachtman，H.，et al.Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun 245：443-446(1998))。在培养过程中使用本领域已知的方法评估细胞增殖，包括但不限于测量DNA合成的速率、锥虫蓝染料排除/血球计计数、或流式细胞术。还可参见例如Onozaki，A.，et al.Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF：inhibitory effects of thiazolidinedione.Biochem Biophys Res Commun 317：24-29(2004)。
在一个方面，本发明提供了使用VEGFR激动剂来上调或下调在调节肾活性中重要的因子(例如表2)的基因表达的方法。用于检测靶细胞/组织中mRNA表达或蛋白质表达水平的方法和技术是本领域技术人员知道的。例如，基因表达水平可以通过已知的核酸杂交测定法来检测，其中在适于杂交及后续检测和测量的条件下使用能够与多核苷酸杂交的探针。可用于检测各种细胞类型中的基因表达的方法包括但不限于Southern杂交(Southern J.Mol.Biol.98：503-517(1975))、Northern杂交(参见例如Freeman et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4094-4098(1983))、限制性内切核酸酶制图(Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)、RNA酶保护测定法(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，New York，1997)、DNA序列分析、和聚合物链式反应扩增(PCR；美国专利No.4,683,202，4,683,195和4,889,818；Gyllenstein et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA 85：7652-7657(1988)；Ochman et al.Genetics 120：621-623(1988)；及Loh et al.Science 243：217-220(1989))接着Southern杂交(其中使用对基因特异的探针)。可以采用本领域普遍知道的其它扩增方法。可以操纵用于Northern或Southern印迹分析的杂交条件的严格性以确保具有与所用特定探针具有期望相关程度的核酸的检测。细胞或组织样品中基因的表达也可以使用原位杂交技术来检测和定量，依照例如CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，1997。
蛋白质水平可以使用对蛋白质特异性的抗体通过免疫测定法来检测。可以使用本领域知道的多种免疫测定法，包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，使用诸如以下技术：放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治/夹心式”免疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(使用胶体金、酶或放射性同位素标记物)、Western印迹分析、沉淀反应、凝集测定法(例如凝胶凝集测定法、hernagglutination测定法)、补体结合测定法(complement fixation assay)、免疫荧光测定法、蛋白A测定法、免疫电泳测定法等。在一个实施方案中，抗体结合是通过检测一抗上的标记物来检测的。在另一个实施方案中，所述一抗是通过检测二抗或试剂对一抗的结合来检测的。在又一个实施方案中，二抗是经标记的。本领域知道许多手段可用于在免疫测定法中检测结合，而且它们在本发明的范围内。
抗体
本发明的抗体包括抗VEGFR抗体或VEGFR的抗原结合片段，或者本文所述其它抗体。例示性的抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、多特异性抗体、异源偶联抗体、多价抗体、效应器功能抗体等。在本发明的某些实施方案中，所述抗体是激动性抗体。
多克隆抗体
本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员知道的。例如，针对VEGFR的多克隆抗体在动物中生成，通过一次或多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烃基)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔
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血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对VEGFR、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。1个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫直到滴度达到平台(plateau)。典型地是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
单克隆抗体
单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或短尾猴(macaque monkey)，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基典型地含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
典型的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对VEGFR的单克隆抗体的生成。可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
此类技术和测定法是本领域知道的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-SepharoseTM、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利No.4,816,567中所记载的。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更详细的描述。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段。Clackson etal.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。
典型地是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
人源化抗体和人抗体
本发明的抗体可以包括人源化抗体和人抗体。人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型地取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种典型的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann etal.，Year in Immuno.7：33(1993)；及Duchosal et al.Nature 355：258(1992)。人抗体还可以衍生自噬菌体展示库(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan et al.NatureBiotech 14：309(1996))。
人抗体还可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种格式进行；综述参见例如Johnson，K S.and Chiswell，D J.，CurOpin in Struct Biol 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。例如，Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。例如通过基本上遵循Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBOJ.12：725-734(1993)所记载的技术，可以自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)及Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991))。还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
抗体片段
抗体片段也包括在本发明内。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimotoet al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，抗体片段可以从上文讨论的噬菌体抗体库中分离。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter etal.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，supra。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
多特异性抗体(例如双特异性的)
本发明的抗体还包括例如多特异性抗体，其具有对至少两种不同抗原的特异性。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的例子包括一个臂针对细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异性结合细胞上的抗原而另一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作溶纤剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于传染病治疗的BsAb，诸如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感病毒、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。在本发明的一个实施方案中，双特异性抗体是抗Flt-1激动剂/抗整联蛋白α-8。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达VEGF受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny etal.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
异源偶联抗体
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体，它们是本发明的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
多价抗体
本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至大约八个但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(和优选的四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
效应器功能工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗疾病中的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利第5,739,277号中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
其它抗体修饰
本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980。
脂质体和纳米颗粒
本发明的多肽可以配制成脂质体。例如，本发明的VEGFR调控物也可以配制成免疫脂质体。含有多肽的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545。循环时间延长的脂质体披露于美国专利5,013,556。一般而言，脂质体的配制和使用是本领域技术人员所知道的。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明的多肽(例如抗体的Fab’片段)经二硫化物交换反应与脂质体偶联。纳米颗粒或纳米胶囊还可以用于诱捕(entrap)本发明的多肽。在一个实施方案中，生物可降解的polyalky-cyanoacrylate纳米颗粒可以与本发明的多肽一起使用。
其它用途
抗VEGFR抗体具有多种功用。例如，抗VEGFR抗体可用于VEGFR或VEGFR片段的诊断测定法，例如用于检测其在特定细胞、组织、或血清中的表达，用于疾病检测(例如本文所述病症)等。在一个实施方案中，VEGFR抗体用于选择用本文提供的方法治疗的患者群。可以使用本领域已知的多种诊断测定技术，诸如竞争性结合测定法、直接或间接三明治测定法和免疫沉淀测定法，以异相或同相(heterogeneous or homogeneous phase)进行(Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)pp.147-158)。诊断测定法中所使用的抗体可以用可检测模块(moiety)标记。可检测模块应当能够直接或间接产生可检测信号。例如，可检测模块可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以采用本领域知道的用于将抗体与可检测模块偶联的任何方法，包括下列文献中所记载的那些方法：Hunter et al.，Nature 144：945(1962)；David et al.，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；Nygren，J.Histochem.And Cytochem.30：407(1982)。
抗VEGFR抗体还可用于从重组细胞培养物或天然来源亲和纯化VEGFR。在该过程中，使用本领域众所周知的方法将针对VEGFR的抗体固定化在合适的支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。接着使固定化抗体接触含有待纯化VEGFR的样品，然后用合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会基本上清除样品中除VEGFR以外的所有物质，而蛋白质结合到固定化抗体上。最后，用另一种合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会从抗体上释放VEGFR。
载体、宿主细胞和重组方法
本发明的多肽可以使用易于获得的技术和材料重组生产。
为了重组生产本发明的多肽，例如多肽VEGFR调控剂，分离编码它的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可以使用常规流程容易地分离编码本发明多肽的DNA并测序。例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针，分离并测序编码多克隆抗体的DNA。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
信号序列构件
本发明的多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽典型地是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列典型地是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码本发明多肽的DNA连接。
复制起点构件
表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。
选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II典型地是灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竞争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码本发明多肽、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺少色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。
此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991)。
启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码本发明多肽的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码本发明多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录本发明多肽受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及从热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes etal.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子元件构件
常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于多肽编码序列的5′或3′位置，但是通常位于启动子的5′位点。
转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码本发明多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的编码本发明多肽的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。典型地是，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码本发明多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(Kthermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化本发明多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产本发明多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)、用于肾细胞的正常生长培养基等适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes etal.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
多肽纯化
在使用重组技术时，本发明的多肽，例如多肽VEGFR调控剂，可以在细胞内、在周质空间中生成，或者直接分泌到培养基中。可以从培养物的培养液或者从宿主细胞溶胞液回收本发明的多肽。如果是膜结合的，那么可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解从膜上释放。本发明多肽的表达中所采用的细胞可通过各种物理或化学手段破碎，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。
可能希望从重组细胞蛋白质或多肽纯化本发明的多肽。以下规程是合适的纯化规程的例子：通过离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的层析，肝素SEPHAROSETM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；用蛋白A Sepharose柱去除杂质诸如IgG；及用金属螯合柱结合表位标记形式的本发明多肽。可以采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，而且记载于例如Deutscher，Methodsin Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles andPractice，Springer-Verlag，New York(1982)。所选纯化步骤取决于例如所用纯化方法的本质和所生成的具体本发明多肽。
例如，可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，典型的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss etal.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如上文所述。还可参见Carter etal.，Bio/Technology 10：163-167(1992)，其记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。
对本发明多肽的共价修饰
本发明多肽，例如多肽VEGFR调控剂等的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适当，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割所述多肽来进行。将多肽的其它类型共价修饰引入分子，其通过将多肽的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应，或者通过将修饰后的氨基酸或非天然的氨基酸掺入正在增长的多肽链，例如Ellman etal.，Meth.Enzym.202：301-336(1991)；Noren et al.，Science 244：182(1989)；及美国专利申请20030108885和20030082575。
半胱氨酰残基最常见的是与α-卤代乙酸(盐/酯)(和相应的胺)反应，诸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(盐/酯)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸(盐/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚、或(4-)氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑反应而衍生化。
组氨酰残基通过与二乙基-焦-碳酸(盐/酯)在pH5.5-7.0反应而衍生化，因为此试剂相对特异于组氨酰侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；此反应通常在pH6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。适于衍生化含α-氨基的残基的其它试剂包括亚氨基酯，诸如皮考啉亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮、和与乙醛酸(glyoxylate)的转氨酶催化反应。
精氨酰残基通过与一种或数种常规试剂反应来修饰，其中有苯甲酰甲醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能基的高pKa所以需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸以及精氨酸ε-氨基反应。
酪氨酰残基可以进行特异性修饰，对在酪氨酰残基中引入光谱标记物特别感兴趣，其通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成邻乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备带标记的蛋白质供放射免疫测定法使用。
羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应而进行选择性修饰，碳二亚胺中的R和R’是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷酰胺酰残基。
谷酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C末端羧基的酰胺化。
另一类型的共价修饰包括向本发明的多肽，例如多肽VEGFR调控剂等化学或酶促偶联糖苷。这些规程的优点在于它们不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生多肽。取决于所使用的偶联模式，可以将糖附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的巯基，(d)游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法可参阅1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.pp.259-306(1981)。
本发明多肽上存在的任何碳水化合物模块的消除可通过化学或酶促方法实现。化学的脱糖基化作用需要使多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(linking sugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化学的脱糖基化作用参阅Hakimuddin et al.，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.118：131(1981)。例如多肽(例如抗体)上的，碳水化合物模块的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，参阅Thotakura et al.，Meth.Enzymol.138：350(1987)。
本发明多肽的另一类型的共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所列方式。
药用配制剂
为了依照本发明方法的体内用途，使用本领域已知的且适于特定用途的方法和技术将本发明的治疗性化合物施用于受试者。在一个优选的实施方案中，所述化合物是在药物学可接受剂量以药用组合物的形式施用的。
一方面，本发明涵盖治疗性蛋白质药剂的蛋白质制备物用于施用治疗性蛋白质药剂(例如重组蛋白质制备物)的用途。一方面，本发明涵盖哺乳动物细胞制备物用于施用治疗性蛋白质药剂(例如多肽VEGFR调控剂等)的用途。本文中所使用的哺乳动物细胞已经用编码所述蛋白质的异源基因转染，如上文详述的。在一个实施方案中，施用所使用的宿主细胞是CHO细胞。
已知本发明使用的感兴趣分子(诸如VEGFR调控剂，例如VEGF、VEGFR变体、VEGF变体(例如Flt-sel或KDR-sel)、VEGFR抗体、VEGFR小分子调控物等)的的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的多肽或小分子与任选的制药学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备，以冻干剂型或水溶液的形式贮存(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第20版，Osol，A.编，2000)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第20版，Osol，A.编，2000。还可参见Johnson et al.，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Horaet al.，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，＂Design and Production ofSingle Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide MicrosphereSystems，＂in Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell andNewman，eds，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；及美国专利No.5,654,010。
在某些实施方案中，用于体内施用的配制剂是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)聚合物、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化多肽在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。还可参见例如美国专利No.6,699,501，其记载了具有聚电解质覆盖物的胶囊。
还涵盖可以通过基因疗法将本发明的治疗性蛋白质药剂(例如VEGFR调控物，例如VEGF、VEGFR变体、VEGF变体(例如Flt1-sel或KDR-sel)、VEGFR抗体等)导入受试者。基因疗法指通过给受试者施用核酸进行的疗法。在基因疗法的应用中，为了实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如为了替换缺陷基因，将基因引入细胞。“基因疗法”包括通过单次处理实现持久效果的传统基因疗法及涉及一次或重复施用治疗上有效的DNA或mRNA的基因治疗剂施用二者。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于阻断某些基因的体内表达。早已显示可以将短反义寡核苷酸输入细胞，在那里它们起抑制剂的作用，尽管由于细胞膜对它们的摄取受限制因而它们的胞内浓度低(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以增强它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。关于基因疗法的方法的全面综述参阅例如Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；及May，TIBTECH 11：155-215(1993)。重组DNA技术领域普遍知道的、可以使用的方法参阅Ausubel等人编(1993)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，NY和Kriegler(1990)Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
有多种技术可用于将核酸引入活细胞。所述技术可根据核酸是在体外转移入培养的细胞还是在体内转移入预期宿主的细胞而变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。例如，体内基因转移技术包括但不限于例如用病毒(典型地是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau et al.，Trends in Biotechnology 11：205-210(1993))。例如，体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂类有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在基因疗法中使用病毒载体的例子可参阅Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，HumanGene Therapy4：129-141(1993)；Grossman and Wilson，Curr.Opin.in Geneticsand Devel.3：110-114(1993)；Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)；Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；及Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)。
在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂一起提供核酸来源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术参阅例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)。关于基因标记和基因疗法方案的综述参阅Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。
例如，用于基因疗法的病毒载体或非病毒载体以及遗传修饰的肾细胞已经用于在肾中投递外来基因。多种载体通过不同路径注射入肾细胞，经由动脉内、输尿管内或薄壁组织/实质内注射(Bosch R J et al.，(1993)Exp Nephrol 1：49-54；及Ye X et al.，(2001)Hum Gene Ther 12：141-148)。薄壁组织/实质内注射的主要限制在于它引起一些肾损伤。在有些情况中，还可以使用将转基因离体投递至肾，之后移植入接受者。
剂量和施用
本发明药用组合物的剂量和期望药物浓度可以随所设想的特定用途而变化。适宜施用剂量或路径的确定完全在普通医师的技术范围内。动物实验为人体治疗的有效剂量的确定提供了可靠指导。可以遵循Mordenti，J.andChappell，W.＂The use of interspecies scaling in toxicokinetics＂In Toxicokineticsand New Drug Development，Yacobi et al.，Eds.，Pergamon Press，New York1989，pp.42-96中所述原理进行有效剂量的物种间定标。
根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGFR调控物是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。在采用体内施用VEGFR调控物时，正常剂量的范围可以是每天约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约1μg/kg/天至10mg/kg/天，取决于施用路径。文献中提供了有关具体剂量和投递方法的指导；参阅例如美国专利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。预期不同配制剂将对不同治疗用化合物和不同病症有效，即例如靶向一种器官或组织的施药可能必须以不同于另一器官或组织的方式投递。对于根据状况，在数天或更长时间内进行重复施用来说，持续进行治疗，直到出现期望的疾病症状被抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型地是，临床医师将会施用本发明的分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易地监测本发明疗法的进展。
本发明的治疗性组合物可以通过任何合适的手段施用，包括但不限于肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、表面、和鼻内施用。肠胃外灌注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下的施用。此外，治疗性组合物适合通过脉冲灌注(pulse infusion)施用，特别是使用剂量逐渐下降的调控物。在某些实施方案中，治疗性组合物通过注射给予，例如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是暂时的或长期的。
多种药剂的使用也包括在本发明内。如本文所述，VEGFR调控物可以与一种或多种治疗剂联合。联合施用包括使用分开的配制剂或单一药用配制剂的共施用，和/或任一次序的序贯施用。例如，VEGFR激动剂可以在别的治疗剂(例如血管发生剂)之前、之后、交替，或者可以同时给予。在一个实施方案中，有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。
为了预防或治疗疾病，VEGFR调控物的合适剂量取决于将要治疗的疾病的类型(如上文所定义的)、疾病的严重性和进程，施用药剂是用于预防目还是治疗目的、先前的治疗、患者临床史和对药剂的应答，以及主治医生的判断力。适合在一次或在一连串治疗中将药剂施用给患者。在联合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的VEGFR调控物及一种或多种其它治疗剂的共施用量或者本发明组合物的施用量。治疗协同量指协同地或显著地减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的VEGFR调控物及一种或多种其它治疗剂(例如本文所述)的量。
制品
在本发明的另一个实施方案中提供了包含可用于上文所述病症治疗和方法的物质的制品。所述制品包括容器、标签和包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述肾疾病的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是VEGFR调控物。容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于治疗肾疾病。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。本发明的制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括别的缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。任选的是，包括与将VEGFR调控物用于本文所述病症的用法和剂量有关的一组指令，一般是书面指令。试剂盒所包含的指令一般包括关于病症治疗的剂量、给药方案、和施用路径的信息。VEGFR调控物的容器可以是单位剂量容器、散装/大量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量容器。
实施例
应当理解，本文所述实施例和实施方案仅用于例示目的，据此本领域技术人员知道各种变更或变化，而且它们在本申请的精神和范围及所述权利要求的范围之内。本文中所引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文作为参考用于所有目的。
实施例1：Flt1/VEGFR-1介导的肾小球系膜细胞中VEGF-A的新自分泌调节环的鉴定
我们生成了转基因小鼠，由此消除了表达VEGF受体-1(Flt-1/VEGFR-1)的细胞中的VEGF基因。我们发现，消除肾小球系膜细胞中的VEGF-A基因在1-3月龄小鼠中导致以蛋白尿、肾小球硬化、高血压和死亡为特征的进行性肾衰竭。患病肾小球展现出足细胞中VEGF-A表达降低及炎性细胞数目增加、免疫复合物沉积和补体激活。干扰肾小球系膜细胞中的自分泌环诱导独特的肾变化，让人联想到与肾VEGF水平降低有关的人肾病理学状况。在体外，VEGF-A-和Flt-1-缺陷的肾小球系膜细胞展现出细胞存活时间缩短(deseasedcell survival)及通向ECM合成和基质降解降低的基因表达转变。这些发现鉴定出足细胞中VEGF-A与VEGFR-1间调节ECM生成和VEGF表达的新自分泌环。在肾细胞(例如肾小球系膜细胞)中刺激VEGFR1可以是治疗与VEGF-A水平降低有关的进行性肾小球硬化症治疗策略。
Flt-1：fms样酪氨酸激酶；GBM：肾小球基底膜；VEGF：血管内皮生长因子；VEGFR：VEGF受体；VEGFR-1：VEGF受体；Flt-1：fms样酪氨酸激酶；VEGFR-2：VEGF受体，KDR(或Flk1)；WT：野生型；WT-1：维尔姆斯氏(Wilm)瘤核蛋白-1(Wilm’s tumor nuclear protein-1)；ECM：胞外基质。
材料和方法
VEGF-loxP和Flt1-Cre小鼠的生成和ROSA26报道株的培养：VEGF-loxP小鼠如先前所述生成(参见例如Gerber，H.P.，et al.VEGF is required forgrowth and survival in neonatal mice.Development 126：1149-1159(1999a))。简言之，在VEGF-loxP小鼠中，VEGF外显子3的侧翼为loxP位点，导致发生loxP重组的细胞中没有VEGF等位基因。将VEGF-loxP小鼠与Flt1-Cre小鼠培育，在后者中Flt1启动子的3.1kb片段(参见例如Gerber，H.P.，et al.Differentialtranscriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptorgenes.Flt-1，but not Flk-1/KDR，is up-regulated by hypoxia.J Biol Chem272：23659-23667(1997))驱动Cre重组酶表达。Flt1-Cre小鼠如下生成，如先前所述将包含驱动Cre表达的Flt1启动子3.1kb片段的构建物显微注射入小鼠卵子前核。参见Hogan，B.，et al.(eds.).Manipulating the mouse embryo，(ColdSpring Harbor Laborator Press，1994)。为了监测Cre重组酶表达，将Flt-CRE+；VEGF-loxP/loxP)或Flt-Cre+小鼠与ROSA26报道株杂交(参见例如Mao，X.，et al.Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNAexcisions in mice.Proc Natl Acad Sci U S A 96，5037-5042(1999))，由此β-半乳糖苷酶的遍在表达受到转录/翻译终止信号的抑制。此“终止物片段”侧翼为loxP位点，发生Cre介导的切除，导致在表达Cre重组酶的细胞中表达β-半乳糖苷酶基因。
Flt1-loxP小鼠的生成：涵盖鼠Flt1基因座外显子1的16kb基因组Flt-1DNA克隆如下分离，即筛选细菌人工染色体文库，其中使用如下引物：切下跨越Flt1翻译起始密码子上游3.0-1.6kb的1.4kb HindIII基因组DNA片段，并平末端克隆入TNLOX1-3寻靶载体的NotI位点。随后，通过平末端连接将2.0kbHindIII/BstXI基因组DNA片段克隆入TNLOX1-3的唯一AscI位点，位于PGK-neoR盒下游和紧挨LoxP3的5’。此2.0kb片段包含如下区域，Flt1基因启动子、转录起始位点和Flt1基因的外显子1。最后，将2.0kb BstXI/BsmI基因组DNA片段补平末端并克隆入PmeI位点，紧挨第三个loxP位点的3’，以生成称为TKNeoFlt1-1的寻靶载体。将TKNeoFlt1-1测序，并进行限制性内切核酸酶消化，以验证loxP位点和基因组DNA插入物的序列和取向。
将寻靶载体通过SalI消化线性化，并取20μg电穿孔入衍生自129Sv株的TCL1和R1ES细胞。将ES细胞和小鼠胚胎成纤维细胞在存在鼠白血病抑制因子(LIF)时维持培养，如先前所述(参见例如Gerber，H.P.，et al.VEGF isrequired for growth and survival in neonatal mice.Development 126：1149-1159(1999a))。将ES细胞在电穿孔后用G418(400μg/ml)进行正选择24小时，并在此选择9天后挑取各个克隆，培养并通过Southern印迹分析筛选阳性重组事件。将来自抗性克隆的基因组DNA用EcoRI(用于分析寻靶事件的5’末端)或者用HindIII和KpnI(用于分析靶物基因组区的3’末端)二者消化。用于筛选靶物区的5’和3’末端的探针使用如下引物对通过PCR生成：5’探针(639nt)：Flt-LOX.1123F(GAT GGC CTT GAG TATATC CTG(SEQ ID NO：1))和Flt-LOX.1762R(CAG CTC TGG ACT CCA GCT TGC(SEQ ID NO：2))；3’探针(834nt)：Flt-LOX.9733F(GGA AAC TAT GTG GCT GAT CTC(SEQ IDNO：3))和Flt-LOX.10567R(GTG AGA GCC AAG ATC GAG GAG(SEQ IDNO：4))。两个独立的ES细胞克隆，称为#15和#F7鉴定为同源重组体且由编码Cre重组酶的表达载体(pMC-Cre)瞬时转染，如先前所述(参见例如Gerber，H.P.，et al.VEGF is required for growth and survival in neonatal mice.Development 126：1149-1159(1999a))。挑取经转染的ES克隆以获得各个克隆，并根据PGK-neoR盒的删除和LoxP1与LoxP2之间的重组通过Southern印迹和PCR进行筛选。在Southern印迹分析以外，所选择的克隆还通过PCR分析，其中使用引物Flt-LOX.236F(TAG ACT CTG CGC GCC ATA ACT(SEQ IDNO：5))和Flt-LOX.2629R(CAC TAA GAA GGC AGA GGC CAA(SEQ IDNO：6))。Flt-LOX.236F与紧挨LoxP3的5’且与LoxP3的头6个核苷酸交叠的DNA退火，与Flt-LOX.2629R(其与同源的3’臂下游的DNA同源)组合使用，只会自包含LoxP3的DNA生成PCR产物。将这些引物用于进一步确认第三loxP位点没有进行重组。
将衍生自#15和#F7且其中PGK-neoR盒被清除的一个ES细胞克隆(分别称为#15.C1.H1和#F7.A.E11)注射入3.5日C57B1/6J胚泡的囊胚腔(参见例如Hogan et al.，et al.(eds.).Manipulating the mouse embryo，(Cold Spring HarborLaborator Press)(1994))。将嵌合雄性小鼠与C57B1/6J雌性小鼠交配，并对子代通过PCR分析检测LoxP1/2和LoxP3来筛选种系传递。用于筛选LoxP1/2存在的PCR引物是Flt-LOX.1335F(CCT GCA TGA TTC CTG ATT GGA(SEQ IDNO：7))和Flt-LOX.3207R(GCC TAA GCT CAC CTG CGG(SEQ ID NO：8))。用于筛选LoxP3存在的PCR引物是Flt-LOX.236F和Flt-LOX.2629R。然后将Flt1-LoxP(+/-)小鼠交配以生成不携带含lox(floxed)的Flt1等位基因的Flt1-LoxP(-/-)、携带单一含lox(floxed)的Flt1等位基因的Flt1-LoxP(+/-)、和两个Flt1等位基因都包含loxP位点的Flt1-LoxP(+/+)小鼠。将Flt1-loxP小鼠典型地通过PCR基因分型，其中使用Flt-LOX.1335F和Flt-LOX.3207R寡核苷酸。
原位杂交：VEGF和TGF-β的原位杂交使用通过PCR扩增生成的反义和有义探针进行，所述PCR扩增中使用对鼠TGF-β(正向：5’-CACCGCGACTCCTGCTGCTTT(SEQIDNO：9)；反向：5’-GGGGGTTCGGGCACTGCTT(SEQ ID NO：10)；探针长度：609nt)和大鼠VEGF(正向：5’-CAACGTCACTATGCAGATCATGCG(SEQ ID NO：11)；反向：5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCA(SEQ ID NO：12)；探针长度：348nt)特异性的引物。自7.5周龄小鼠中切出肾组织，在4％福尔马林中固定，并石蜡包埋。将5μm厚的切片脱石蜡，在4μg/ml蛋白酶K中于37℃除蛋白质30分钟，并进一步加工供原位杂交，如先前所述(参见例如Gerber，H.P，et al.VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling，ossification and angiogenesisduring endochondral bone formation.Nat Med 5：623-628(1999b))。将33P-UTP标记的有义和反义探针与切片于55℃杂交过夜。将未杂交的探针通过在20μg/ml RNA酶A中于37℃温育30分钟除去，接着是高严格性清洗，即于55℃在0.1X标准盐水柠檬酸盐(SSC)中温育2小时，并通过分级乙醇脱水。将载玻片浸入NBT2核踪迹乳剂(nuclear track emulsion，Eastman Kodak)，在装有干燥剂的密封塑料载玻片盒中于4℃曝光4-6周，显影并用苏木精和曙红(H & E)复染。
电子显微镜：将来自4-5周龄VEGF-loxP、Flt1-Cre小鼠的皮层肾组织片在0.1M甲次砷酸盐缓冲液中的2％甲醛、2.5％戊二醛中于4℃固定过夜。清洗后，将样品在水性1％锇中后固定2小时，在水中清洗，通过分级乙醇和环氧丙烷脱水，并在EPONATE 12(Ted Pella，Inc.Redding，Ca)中包埋。在ReichertUltracut UCT切片机上切出超薄切片，用乙酸铀酰(uranyl acetate)和柠檬酸铅复染，并在Philips CM12透射电子显微镜中于80kV检查。用GATANRetractable Multiscan数码相机记录图像。
LacZ染色：为了LacZ染色完整胚胎9.5日龄胚胎或来自1周龄小鼠的组织，将组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中解剖，并用PBS中的4％低聚甲醛(PFA)于4℃固定1小时。三次漂洗缓冲液(PBS中5mM乙二醇-双(氨基乙基醚)-四乙酸(EGTA)，0.01％脱氧胆酸盐，0.02％ NP-40，2mM MgCl2)中30分钟清洗后，将胚胎在染色溶液(漂洗缓冲液，含5mM K3Fe(CN)6，5mM K4Fe(CN)6，1mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal))中于37℃温育过夜。然后将组织在PBS中的4％ PFA中于4℃后固定30分钟，转移入70％乙醇，并用LeicaMZFLIII解剖显微镜、SPOT数码相机和SPOT高级照相软件照相，或者为石蜡包埋和切片加工。
组织学分析和免疫细胞化学：为了组织学分析，将组织在10％中性缓冲的福尔马林中固定12-16小时，转移至70％乙醇，并石蜡包埋。使用切片机(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)切出5μm切片，并用苏木精和曙红(H&E)染色。将石蜡包埋的切片通过免疫组织化学分析，其中使用针对Cre重组酶(EMD Biosciences.Novagen，San Diego，California)、CD31(MEC 13.3，BD Biosciences Pharmingen，San Diego，California)(用于检测所有内皮细胞)、VEGFR-2/Flk-1(MALK-1，Genentech，Inc.South San Francisco，California)(主要标记非动脉血管内皮)、和α平滑肌肌动蛋白(DakoCytomation California，Inc.，Carpinteria，CA)(检测发育中的和活化的肾小球系膜细胞和平滑肌细胞)制备的抗体。为了检测胞外基质成分，使用针对胶原IV(Chemicon Internation，Temecula，California)和层粘连蛋白(Chemicon)制备的抗体。染色基本上如先前所述进行(参见例如Gerber，H.P.，et al.VEGF is required for growth andsurvival in neonatal mice.Development 126：1149-1159(1999a))。
为了免疫荧光研究，将切出的肾纵向解剖，在O.C.T.化合物(Tissue Tek，Sakura Finetek U.S.A.，Inc.，Torrance，CA)中包埋，并以5-10μm切片。为了鉴定表达小鼠VEGF的肾小球细胞类型，将冷冻切片与识别小鼠VEGF(α-VEGF，Genentech Inc.)的人源化单克隆抗体以20μg/ml的浓度一起温育，其中联合整联蛋白α8亲和纯化的家兔抗血清(1/200，用以检测肾小球系膜细胞，UlrichMuller，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA馈赠)、大鼠抗小鼠CD31(BD Pharmingen)(用以检测内皮细胞)或家兔抗小鼠维尔姆斯氏肿瘤核蛋白(WT-1；Santa Cruz Biotechnology Inc.，2μg/ml)(用以检测足细胞)。随后将切片清洗并与AlexaFluor-594偶联的山羊抗人IgG及AlexaFluor-488偶联的山羊抗大鼠或山羊抗家兔IgG二抗以4μg/ml(Invitrogen)温育。为了鉴定表达Flt1-Cre转基因的肾小球细胞类型，将冷冻切片与抗β-半乳糖苷酶(RocklandImmunochemicals Inc.；200μg/ml)温育，接着是AlexaFluor-594偶联的山羊抗家兔IgG。WT-1抗体和抗整联蛋白α8用AlexaFluor-488标记，即依照制造商使用用于家兔IgG(Invitrogen)的Zenon标记技术。然后将CD31抗体或AlexaFluor-488标记的抗WT-1或抗整联蛋白a8应用于经清洗的切片。在此项研究中，抗β-Gal染色反映了发育的任何或所有阶段中的Flt1-Cre转基因表达，因为Cre重组酶介导的切除不可逆地消除在其它情况中普遍表达的ROSA26基因启动子的抑制，所述ROSA26基因启动子在这些小鼠中驱动抗β-Gal表达(Mao et.al.，Improved reporter strain for monitoring Cre recombinase-mediatedDNA excisions in mice.Proc Natl Acad Sci U S A96：5037-42(1999))。
为了检测免疫球蛋白沉积，一系列异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的对小鼠免疫球蛋白(Ig)每一种类和同种型特异性的大鼠单克隆抗体(BD BiosciencesPharmingen，San Jose，CA)以4μg/ml浓度在经封闭的冷冻切片上温育1.5小时。Ig沉积使用亲和纯化的、FITC偶联的针对特定类和同种型小鼠Ig制备的多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)来确认。小鼠补体系统的C1q、C3和C4成分使用大鼠单克隆抗体(HyCult Biotechnology b.v.，Uden，The Netherlands)(以5μg/ml)和AlexaFluor-594偶联的山羊抗大鼠IgG(Invitrogen)(作为第二试剂)来检测。
T细胞和单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞分别使用针对CD4(BDBiosciences，Pharmingen，San Jose，California)和F4/80(Serotec Inc.，Raleigh，NC)制备的抗体和标准染色方案来鉴定。对于所有免疫细胞化学研究，包括阴性对照，即用纯化的Ig(匹配所省略一抗的浓度、物种和同种型)替换一抗。
为了检测小鼠肾中的低氧(hypoxia)，给4周龄Flt1-Cre-和Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠腹膜内注射盐酸哌莫硝唑(pimonidazole hydrochloride，HypoxyprobeTM-1，Chemicon International，Temecula，California，60mg/kg)。注射后1小时，将小鼠通过颈脱位法安乐死，切出肾并在10％福尔马林中固定过夜，然后脱水并在石蜡中包埋。然后将5μm石蜡包埋切片加工并用HypoxyprobeTM-1Mab1染色，如HypoxyprobeTM-1试剂盒制造商(ChemiconInternational)所述，其中排除了链霉亲合素过氧化物酶温育，用链霉亲合素-AlexaFluor594(Invitrogen)替换以容许荧光检测。将浓度与HypoxyprobeTM-Mab1所用浓度匹配的小鼠IgG1用作一抗非特异性染色的同种型对照。作为附加的阴性对照，将分离自未注射HypoxyprobeTM-1的小鼠的肾切片与HypoxyprobeTM-Mab1温育。
实时定量RT-PCR分析：使用STAT60法(TEL-TEST“B”，Friendswood，TX)自5-7.5周龄小鼠的组织分离RNA，并在Rneasy Quick旋转柱(Qiagen，Valencia，CA)上纯化。如先前所述进行实时定量RT-PCR分析(参见例如Gerber，H.P，etal.Complete inhibition of rhabdomyosarcoma xenograft growth andneovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelialgrowth factor.Cancer Res 60：6253-6258(2000))，其中使用100ng总RNA、Applied Biosystems RT-PCR试剂和96孔格式的Model 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)。RT-PCR条件为48℃ 30分钟，95℃ 10分钟，及40个循环的95℃ 30秒和60℃ 90秒。结果使用Sequence Detection Software(AppliedBiosystems)分析，并使用StatView软件(SAS Institute Inc.，Cary，.North Carolina)通过ANOVA进行统计学分析。通过相对于甘油醛-3-脱氢酶(GAPDH)水平的标准化，得到每份样品的相对RNA当量。
血清化学和血液学参数：将7.5周龄小鼠通过CO2吸入安乐死，并通过心脏穿刺收集血液入乙二胺四乙酸(EDTA)包被的管(Microtainer，BectonDickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey)。使用Cell Dyn 3700(Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois)测量血液学细胞计数。通过收集入血清分离管(Microtainer，Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，NewJersey)得到血清，并使用Roche Cobas Integra 400仪器(Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)测量血清参数。
尿液分析：自4-5周龄小鼠被动收集尿液。使用尿检试纸条(Chemstrip 10with SG，Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，Indiana，USA)对来自每种基因型的小鼠的代表性尿液样品测试蛋白质、血液、葡萄糖和酮类的存在。蛋白尿如下进一步验证，加载1ul尿液到4-20％梯度tris/甘氨酸凝胶(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)上并进行SDS-PAGE，接着银染或Western印迹(用于小鼠清蛋白)，其中以200μg/ml使用亲和纯化的山羊抗血清(BethylLaboratories Inc.，Montgomery，TX)。
均值动脉血压的测量：将小鼠麻醉，即吸入异氟烷至发挥效果(Aerrane，Baxter Caribe Inc.)。通过在颈部做出的腹中线切口，将一导管(聚乙烯管，PE-10，Becton-Dickinson)置于右颈总动脉中，并用丝线固定到位。使用AcqKnowledge硬件和软件(Biopac Systems，Inc.，Santa Barbara，CA)数字收集15分钟的血压测量。
统计学分析：除了互补DNA微阵列数据分析(见别的部分)以外的所有统计学分析使用StatView软件(SAS Institute Inc.，U.S.A.)通过方差分析(ANOVA)进行，除非另有说明。
分离肾小球和肾小球系膜细胞培养物：依照文献(Takemoto et al.，A newmethod for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.Am J Pathol161：799-805(2002))中的方法进行小鼠肾小球分离，并置于用肾小球系膜细胞培养基(Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)，20％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)中的20μg/mL纤连蛋白(Sigma Corp，St Louis，Missouri)包被的盘上。将肾小球在5％ CO2、95％空气的加湿气氛中于37℃温育6-7天，期间肾小球贴壁而且汇合细胞单层覆盖盘。使用这种技术，得到能够传代至少5次的肾小球系膜细胞的均质培养物。肾小球系膜细胞形态学表现为与肾小球系膜细胞的已出版的光学显微镜报告一致(Mene et al.，Phospholipids in signal transduction of mesangial cells.AmJ Physiol 256：F375-386(1989))。肾小球系膜细胞对α-波形蛋白(DakoCytomation)和抗肌球蛋白(Zymed Laboratories，Inc，South San Francisco，California)免疫染色阳性，且对CD31(BD Biosciences Pharmingen，San Jose，California)和乙酰基化低密度脂蛋白摄取(Biomedical Technologies，Inc，Stoughton，Massachusetts)阴性。另外，将所有肾小球系膜细胞在D-缬氨酸替换的极限必需培养基(MEM)中培养至少3天，其阻断成纤维细胞的体外生长(Gilbert and Migeon，(1975).D-valine as a selective agent for normal humanand rodent epithelial cells in culture.Cell 5：11-17)。
自VEGF(loxP/loxP)和Flt1(loxP/loxP)小鼠及来自相同克隆但不携带基因组loxP位点的WT小鼠建立肾小球系膜细胞培养物。为了肾小球系膜细胞存活研究，将肾小球系膜细胞以105个细胞/孔的密度铺入6孔盘，并在含20％ FCS的肾小球系膜细胞培养基中温育过夜。然后吸出培养基，并更换为无血清培养基，其含有表达LacZ(Ad-LacZ)(作为对照)或Cre重组酶(Ad-Cre)(诱导loxP位点之间的重组并分别在VEGF(loxP/loxP)和Flt1(loxP/loxP)细胞中导致VEGF或Flt1基因消除(ablation))的腺病毒。腺病毒在存活研究中以感染复数(MOI)1000使用。以10μg/mL向培养基中添加中和性抗小鼠VEGF抗体(α-VEGF，G6-23-IgG)(Genentech，Inc.South San Francisco，California)或对照同种型匹配抗体(Control IgG)，以及MOI为1000的Ad-LacZ。添加腺病毒后4天，将剩余贴壁细胞用PBS清洗，胰蛋白酶处理，并使用Z2 Coulter Particle Count和SizeAnalyzer(Beckman Coulter，Inc.Fullerton，California)计数。自每种基因型(genotype)的小鼠(每种基因型n＝5-7只小鼠)分离肾小球系膜细胞。在每只提供细胞的小鼠中对每种病毒对2-5个平行孔计数。计算Ad-LacZ和Ad-Cre处理间的细胞计数比，并标准化为对照组所得数值的百分比。
互补DNA微阵列：自4只WT小鼠和4只VEGF(loxP/loxP)小鼠制备肾小球系膜细胞。在第2或3代，将肾小球系膜细胞在含Ad-LacZ或Ad-Cre(MOI为100)的无血清培养基中培养5天。使用STAT60方法和Rneasy Quick Spin Column分离RNA，如“实时定量RT-PCR”部分所述。用于制备互补RNA(cRNA)和阵列杂交/扫描的方法是由Affymetrix(Affymetrix，Inc.Santa Clara，California)提供的。使用cDNA合成试剂盒(SuperScript Choice，GIBCO/BRL，Grand Island，New York)和T7-(dT)24寡聚物引物(Biosearch Technologies，Inc，Novato，California，Custom Synthesis)将5μg总RNA转变成双链cDNA。在亲和树脂(Sample Cleanup Module Kit，Affymetrix，Inc.Santa Clara，California)上并通过乙醇沉淀来纯化双链cDNA。第二链合成后，在体外转录反应(Enzo Biochem，Inc.Farmingdale，New York)中使用T7RNA聚合酶和生物素标记的核苷酸自cDNA样品生成带标记物的cRNA。将带标记物的cRNA在亲和树脂(样品清洁模块试剂盒，Affymetrix)上纯化。带标记物的cRNA的量通过测量260nm吸光度并使用260nm的1个OD对应于40μg/ml RNA的换算关系来测定。将20μg cRNA通过在40mM Tris-乙酸(pH8.1)，100mM乙酸钾，和30mM乙酸镁中于94℃温育30分钟而片段化。然后将样品与小鼠基因组4302.0阵列在设定为60rpm的电转烤炉中于45℃杂交19小时。将阵列在Affymetrix Fluidics工作站和扫描仪中清洗，染色，并扫描。数据分析使用Affymetrix GeneChip分析软件进行。基因表达由Affymetrix MAS 5.0信号值概述，其是在对数标度上分析的。对每个探针集应用方差分析，其中考虑病毒效果(virus effect)(Ad-LacZ或Ad-Cre)、基因型效果(genotype effect)(WT或VEGF(loxP/loxP))、和VEGF基因消除效果(effect of VEGF gene ablation)。使用VEGF(loxP/loxP)细胞中从Ad-LacZ至Ad-Cre的基因表达的平均倍数变化较之WT细胞中的相应倍数变化、基因表达差异的证据(来自t检验的p值)的强度和基因表达的最小绝对信号作为标准组合来筛选受到基因消除效果显著影响的探针集。这些标准设定为最小倍数变化为2倍，p值<0.05，且绝对信号>50。比较了WT和VEGF缺陷的肾小球系膜细胞之间基因表达的变化。
为了依照Affymetrix提供的基因本体论分类法(gene ontologyclassification)将显著失调的基因归类，我们获取了2004年8月9日版本的基因本体论(Gene Ontology，GO)分层法(hierarchies)。将NetAffy数据库用于将每种Affymetrix探针集与LocusLink基因鉴定联系起来。自NCBI LocusLink站点下载loc2go文件(可以在因特网上得到，ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/LocusLink/)，其用于将基因和GO概念(concept)联系起来。使用具有GO注解的整个基因集和受到VEGF基因消除(gene ablation)影响的基因集，在GO分层(hierarchy)上计算基因联系的分布。对于每个GO概念，生成2x2列联表(two-by-twocontingency table)，代表GO概念的存在与否对基因消除效果的存在与否。进行联系的卡方分析以确定统计学显著性。计算优势比(odd ratio)，即将GO概念的敲除影响基因的观测数除以预期数。自1000份自举(bootstrap)样品得到优势比的95％置信区间。
微阵列数据还通过使用Ingenuity Pathways Analysis(IPA；IngenuitySystems，www.ingenuity.com)进行分析。将其表达受到显著的差异调节(p值<4e-3)的探针的标识符加载入定位至基因的应用。使用Ingenuity PathwaysKnowledge Base(IPKB)中所包含的信息，将这些探针所定位的基因用于生成分子网络。为了功能分析，使用IPKB将这些相同基因与生物学功能和/或疾病联系起来。使用Fischer精确检验来计算p值，其测定归为该数据集的每种生物学功能和/或疾病仅由于偶然性发生的可能性。
结果
发育过程中的Flt1-Cre转基因表达重演内源Flt1表达
Flt1基因的3.1kb启动子片段先前已鉴定和表征为足以介导暴露于低氧条件的瞬时转染的内皮细胞或Hep3 B细胞中升高的报道基因表达(参见例如Gerber，H.P.，et al.Differential transcriptional regulation of the two vascularendothelial growth factor receptor genes.Flt-1，but not Flk-1/KDR，isup-regulated by hypoxia.J Biol Chem 272：23659-23667(1997))。将由相同3.1kbFlt-1启动子片段组成的构建物插入Cre重组酶基因的上游，用于生成转基因小鼠。选择在成年肾中具有最高LacZ表达的株系用于详细的转基因表达分析。9.5天转基因胚胎的全标本染色揭示了与内源Flt1基因表达一致的血管表达样式。还可参见例如Fong，G.H.，et al.Regulation of flt-1 expression duringmouse embryogenesi ssuggests a role in the establishment of vascularendothelium.Developmental Dynamics 207：1-10(1996)。在新生小鼠中，LacZ阳性细胞存在于多种组织中，包括心、脾、肺、睾丸、和皮肤。与先前描述Flt-1在肾内皮和肾小球系膜细胞中表达的报告一致(参见例如Takahashi，T.，et al.Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerularcells：Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells.Biochem Biophys ResCommun 209：218-226(1995))，LacZ阳性细胞见于小管周内皮细胞和肾小球中央区内细胞，其中内皮和肾小球系膜细胞典型地位于5日龄Flt1-Cre+；ROSA+小鼠。
Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠发生肾小球肾炎并在4-12周龄经历末期肾衰竭
Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠以预期的孟德尔比例出生(图1，小图a)，然而自4周龄起明显可见存活降低，超过95％的Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠到12周时死亡(图1，小图b)。更严格的检验揭示了缺少脾和肾质量的Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠显著减少。见图1，小图c。还有减少的肾血管化和囊肾损伤的出现，指示双侧肾疾病。见图1，小图d。具有LacZ阳性血管结构的其它器官，诸如肺、肝、心、脑和骨骼肌，不展示形态学、重量或血管化的任何显著变化。
尿液分析揭示了4-5周龄Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中超过500mg/dL的蛋白尿。在Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)而非Flt-CRE+；VEGF(loxP/-)或Flt1-Cre-小鼠的尿液中，银染和Western印迹分析揭示了大量的清蛋白，指示缺陷的肾小球滤过屏障功能。见图1，小图e。血液化学分析揭示了Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中与对照小鼠相比血液尿素氮(B.U.N.)和血清肌苷水平的4倍增长(见图1，小图f和g)，而钠、钾、氯化物和钙的血清水平不受影响。与肾衰竭相关病理学一致，Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)转基因小鼠相对于Flt-CRE-对照同窝幼仔血压显著升高。见图1，小图h。联合起来看，这些可以指示Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠逐渐形成与蛋白尿和高血压有关的肾功能障碍，最终达到末期肾衰竭。
肾小球系膜细胞中的Flt1-Cre转基因表达和VEGF-A基因消除
使用免疫组织学方法，我们在4周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的肾小球中共定位了VEGF-A表达和表达α-维尔姆斯氏肿瘤核蛋白的足细胞(参见例如Haas，C.，et al.MHC antigens in interferon gamma(IFN gamma)receptordeficient mice：IFN gamma-dependent up-regulation of MHC class II in renaltubules.Kidney-Int 48：1721-7 issn：0085-2538(1995))，强调了VEGF-A表达主要局限于足细胞。在4周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)；ROSA26+小鼠肾的冷冻切片用抗体染色以检测肾小球系膜细胞(抗整联蛋白α8)、内皮细胞(抗CD31)、和足细胞(抗WT-1)以及用α-VEGF共染色切片以鉴定表达VEGF-A的肾小球细胞类型时，在肾小球足细胞和肾小球系膜细胞中检测到VEGF-A。合并的图像指示VEGF-A表达在WT-1阳性足细胞中可检测到且是显著的，但是在肾小球系膜细胞中可检测到较低的VEGF-A表达。VEGF-A的原位杂交证实了VEGF-A在足细胞中高水平表达，如7周龄小鼠Flt1-Cre-肾小球外周丰富银颗粒所示。见图2，小图a。整联蛋白α8阳性肾小球系膜细胞(参见例如Hartner，A.，et al.，Alpha8 integrin in glomerular mesangial cells and in experimentalglomerulonephritis.Kidney Int 56：1468-80(1999))与VEGF-A的共染色揭示了4周龄小鼠肾小球系膜细胞中较弱但显著的表达。见图2，小图a。然而，我们在所分析的任何肾切片中未能检测到VEGF-A/CD31双重阳性内皮细胞，与先前所述肾小球内皮细胞中缺乏VEGF-A一致。参见例如Simon，M.et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renalontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268：F240-50 issn：0002-9513(1995)；及Noguchi，K.et al.Activated mesangial cells producevascular permeability factor in early-stage mesangial proliferativeglomerulonephritis.J Am Soc Nephrol 9：1815-25(1998)。
为了确定胚胎和出生后发育过程中表达Cre重组酶的肾小球细胞类型，采用了免疫荧光组织化学，其中使用检测β-半乳糖苷酶的抗体(抗β-Gal)。4周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾切片的分析揭示了Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)与Flt1-Cre+；VEGF(loxP/+)同窝幼仔相比β-Gal/整联蛋白α8双重阳性肾小球系膜细胞数目和染色的增加。然而，我们没有检测到对β-Gal和足细胞标志物WT-1或内皮细胞标志物CD31双重阳性的细胞。免疫组织化学揭示了在肾小球系膜细胞而非肾小球内皮细胞中检测到Flt1-Cre转基因，而已知表达Flt-1的管内皮细胞是阳性的。见图2，小图b。基因组PCR揭示了胚胎发育过程中(E17.5和E18.5)的肾中和来自1周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/wt)小鼠肾的肾小球系膜细胞外植体中(在扩增7-10天后)显著水平的VEGF消融。这些发现与先前的报告一致(参见例如Takahashi，T.et al.Protein tyrosine kinases expressed inglomeruli and cultured glomerular cells：Flt-1 and VEGF expression in renalmesangial cells.Biochem Biophys Res Commun 209：218-26(1995))，说明肾小球内的肾小球系膜细胞可表达VEGF-A和Flt1二者，且进一步支持Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾小球中的VEGF基因消除至少在肾小球系膜细胞中发生的观念。VEGF-A基因消除可发生于其它肾小球细胞或肾小球隔室以外的细胞，它们在我们的测定法中没有检测到，它们可间接有助于观察到的肾小球变化。RNA的定量基因表达证实了Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾中的组织损伤和正在进行中的修复过程引起Cre重组酶的显著上调(见图2，小图c)。相伴的，检测到Flk1(VEGFR-2)和VEGF-A的下调(图2，小图c)，与VEGF-A基因消除和肾小球血管分布降低一致(图3，小图g和h)，而Flt-1水平保持不变。Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾的原位杂交实验揭示了到7周龄时所有肾小球细胞类型中显著降低的VEGF-A表达。1周龄肾的VEGF和B-Gal表达的免疫组织化学分析鉴定出3种主要肾小球类别：1)在缺乏β-Gal染色时表达正常水平VEGF的肾小球；2)展示降低的VEGF和点状β-Gal表达的肾小球；及3)在存在β-Gal高染色时检测不到VEGF水平。肾小球系膜细胞中的VEGF基因消除可发生于整个出生后发育过程，而且可以与降低的足细胞VEGF表达和/或足细胞细胞死亡有关。在这些实验中，所述发现鉴定了足细胞的VEGF表达是肾小球系膜细胞中VEGF自分泌调节环的下游靶物。
发现低氧上调VEGF-A和VEGFR-1二者的表达(参见例如Gerber，H.P.，etal.Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growthfactor receptor genes.Flt-1，but not Flk-1/KDR，is up-regulated by hypoxia.JBiol Chem 272：23659-67(1997))，而且增加的肾低氧报告肾小球肾炎。参见例如Nangaku，M.Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney：finalcommon pathways to end-stage renal failure.Intern Med 43：9-17(2004)。在使用HypoxyprobeTM-Mab1对4周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)的肾小球分析低氧区时，与野生型同窝幼仔相比，增加的低氧一致性地见于条件性敲除小鼠，指示低氧可以经上调Flt-CRE而加速VEGF基因消除(gene ablation)。低氧的区域变化联合各个肾小球内疾病进展严重性的变化可以解释Flt1-Cre转基因的频繁性病灶表达和肾小球内皮细胞(其直接接触正常含氧量循环)中转基因表达的缺失。
Flt-CRE+；VEGF-loxP/loxP)转基因小鼠肾小球的病理生理学变化
分析Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中发生的组织病理学变化以了解导致肾衰竭的细胞事件。异常肾小球结构在Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中明显可见，该结果可见于根据光学显微镜检术在第2、3、和7周的检查。在2周龄小鼠中，在整个肾皮质中存在囊肿(cyst)(图3，小图a)，而且可辨认出两种类型的肾小球结构，它们在外观上与其年龄匹配的WT同窝幼仔的肾小球截然不同(图3，小图b)。在2周龄Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中，频繁观察到由非细胞核心(acellular core)周围的足细胞组成的发育不足肾小球(图3，小图a和c)。具有这种外观的肾小球可丧失功能，这是由于缺失毛细管环，而且它们可丧失此阶段后的发育，因为在7周龄小鼠的肾中没有相似结构的证据(图3，小图e和f)。2-3周龄Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾内的许多肾小球显著扩大并在整个肾小球中展示丰富的嗜曙红、蛋白质性质沉积及毛细管环的缺失或现存毛细管环的崩溃(图3，小图d)。这些肾小球具有与7周龄Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠典型肾小球相似的外观，其展示肾小球硬化症、纤维化、和病灶性间质性肾炎(图3，小图f)。在每个肾内，各个肾小球受到不同程度的影响，具有中度至重度的明显变化。另外，观察到衬有移行上皮的大囊肿(图3，小图a)，及充满蛋白质性质物质的扩张的皮质小管的离散组(比较图3，小图e和f)。与WT肾中的观察结果相比，降低的细胞性(cellularity)在Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的整个肾小球中明显可见，其可部分归于内皮细胞数目减少(比较图3，小图g和h)。在许多硬化的肾小球中，Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾中降低的CD31染色伴有广泛的层粘连蛋白和病灶性胶原IV沉积，这是根据RT-PCR(图6，a-d)和免疫组织化学染色的测定的。例如，在7周龄小鼠的肾切片中，层粘连蛋白沉积在小管中检测到且遍及患病肾的肾小球，而且与野生型同窝幼仔相比，在患病组织中检测到增加的胶原IV染色。另外，在肾疾病中频繁上调的转化生长因子-β(tgf-β)(图3，小图i和j)，即肾小球纤维化和组织损伤的介导物，(综述见Schnaper，H.W.，et al.TGF-beta signaltransduction and mesangial cell fibrogenesis.Am J Physiol Renal Physiol284：F243-52(2003))，以及α-平滑肌肌动蛋白(图3，小图k和1)，即激活的肾小球系膜细胞的标志物，在受损的肾中都显著升高。
透射电子显微镜检术对肾切片的超微结构分析鉴定出肾小球系膜的缺陷和其它与病灶性肾小球硬化症一致的特征，包括Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)肾中足细胞足突融合和肾小球系膜基质的扩增(图3，小图m)。尽管内皮在有些肾小球中表现为健康的，但是在具有更多严重损伤的肾小球中观察到开孔(fenestration)的丧失和肾小球基底膜的大量扩增。另外，在发育不足的肾小球中存在肾小球系膜细胞的丧失和电子致密沉积物(图3，小图m)。
肾小球系膜细胞中的VEGF基因消除与免疫球蛋白M(IgM)沉积物和补体激活有关
循环中的淋巴细胞升高表明了Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾中升高的免疫应答的证据。肾RNA关于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和T细胞谱系标志物(分别为CD11b、F4/80、CD45R和Thy-1)的实时定量RT-PCR分析检测到Flt-CRE+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾中的免疫渗入物，对照同窝幼仔中没有(图4，小图a)。免疫组织化学分析揭示了Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠肾中表达F4/80和CD4(T细胞子集的标志物)的细胞数目增加。见图4，小图b。免疫细胞渗入表现为对肾组织特异性的，因为这些细胞谱系标志物在Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)转基因小鼠的肺或心中没有升高。
在所分析抗体的Ig亚类中，发现IgM在患病肾小球中沉积，但IgG、IgA、IgD或IgE不然，例如通过来自5周龄Flt1-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠的肾皮质组织的免疫荧光染色，其中使用对IgM特异性的单克隆抗体和对IgG的每种小鼠同种型特异性的单克隆抗体。另外，检测到补体途径C1q、C3、和C4蛋白质的显著增加(例如通过采用对该途径的C1q、C3和C4成分特异性的单克隆抗体的免疫荧光)，特别是在Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)肾的肾小球中，与WT肾相比。在1周龄小鼠中检测到增加的C1q、C3和C4，表明补体介导的细胞溶胞可以显著促成Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠中的肾损伤。没有检测到具有单倍体不足足细胞选择性VEGF删除的小鼠肾中补体介导的损伤的证据。
VEGF基因消除在体外不利地影响肾小球系膜细胞存活：VEGF在肾小球系膜细胞中经内部自分泌环起作用的证据
为了调查VEGF-A和Flt1基因消除对体外培养的肾小球系膜细胞的影响，我们生成了对于Flt1等位基因具有条件性等位基因(conditional allele)的小鼠(Flt1-lox/loxP)。见图5，小图a。生成了其中小鼠Flt1基因的外显子1侧翼为loxP位点的寻靶载体，并用于小鼠胚胎干细胞中的同源重组。Flt1(loxP/loxP)小鼠以预期的孟德尔频率出生，表明两个loxP位点的存在不干扰小鼠发育。自肾小球分离物得到来自WT VEGF(loxP/loxP)和Flt1(loxP/loxP)小鼠的肾小球系膜细胞的均质制备物，并感染表达LacZ的对照腺病毒(Ad-LacZ)或表达Cre重组酶的腺病毒(Ad-Cre)。Flt1和VEGF-A基因体外消融频率通过Southern印迹分析(图5，小图b)和实时RT-PCR(图5，小图c和d)来监测，发现为>95％。Flt-1或VEGF-A基因在肾小球系膜细胞中的消融引起细胞存活的显著降低(图5，小图e)，表明VEGF以由Flt1介导的细胞自主方式调节肾小球系膜细胞存活。添加中和性VEGF抗体(α-VEGF，G6-23)对肾小球系膜细胞存活没有影响(图5，小图f)。因为G6-23自胞内隔室排出，所以重演在VEGF-A-或Flt1-缺陷肾小球系膜细胞中观察到的肾小球系膜细胞存活降低的失败指示VEGF-A可能经内部自分泌环起作用。Flt1缺陷肾小球系膜细胞存活的降低大于由VEGF-A缺陷单独引起的，说明Flt1的其它配体，诸如PlGF或VEGF-B，可能也有帮助。
肾小球系膜细胞中的VEGF基因消除诱导与ECM生成增加一致的基因表达变化
我们对在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中差异表达的基因进行了基因本体论(GO)分析。在选择大于2倍(绝对值)的变化和<0.05的p值(Student’st检验)时，我们发现了11810种所分析的基因中有480种在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中与WT肾小球系膜细胞相比显著上调。各类上调基因与所有基因对照集之间GO注解的比较揭示了涉及调节趋化性、结构完整性或ECM生成、细胞迁移和体液防御机制方面的基因的显著差异是显著过度呈现的(over-represented)(表2)。我们对在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中下调的基因进行了相同的分析，鉴定出显著过度呈现的六类。这六类中三类属于蛋白水解基因超类(super-class)，一类包括涉及细胞通讯的基因(表2)。使用Ingenuity Pathways系统进行的信号途径分析进一步揭示了属于定义为细胞生长和增殖、细胞装配、组织(organization)和调和(compromise)途径亚类的基因的表达在VEGF缺陷肾小球系膜细胞中显著改变(表2)。我们还鉴定出属于涉及蛋白质合成、细胞死亡、细胞-细胞信号传导和免疫应答的分子网络的类的46％-57％的基因的表达受到VEGF缺陷的显著影响(表2)。与肾小球系膜基质积累或肾小球疾病有关的候选基因在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中也显著失调。其中，tgf-β1(参见例如Schnaper，H.W.，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am J Physiol Renal Physiol284：F243-252(2003))、血管生成素-1(angiopoietin-1)(参见例如Satchell，S.C.，and Mathieson，P.W.Angiopoietins：microvascular modulators with potential roles in glomerular pathophysiology.J Nephrol 16：168-178(2003))、和COX-2(综述见Nasrallah，R.& Hebert，R.L.Prostacyclin signalingin the kidney： implications for health and disease.Am J Physiol Renal Physiol 289：F235-46(2005))上调，而血小板衍生生长因子受体-β(Pdgfr-β)和Pdgf-c(综述见Betsholtz，C.et al.Role of platelet-derived growth factor in mesangium development and vasculopathies：lessons from platelet-derived growth factor and platelet-derived growth factor receptor mutations in mice.Curr Opin NephrolHypertens 13：45-52(2004))下调。体外VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中基因表达变化突显了通向ECM肾小球系膜成分积累的转变，并鉴定出VEGF-A以细胞自主方式调节这些过程。
表2：肾小球系膜细胞中与VEGF缺陷有关的基因表达变化
在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中或是上调或是下调的那些基因中的显著过度呈现的基因本体论类别(gene ontology class)
在VEGF-缺陷肾小球系膜细胞中上调的基因本体论家族
Figure A200780019536D00751
在VEGF缺陷肾小球系膜细胞中下调的基因本体论家族(gene ontology family)
Figure A200780019536D00761
Ingenuity Pathways Analysis鉴定出其表达在VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞中显著差异调节的基因所表现的功能途径
根据Functional Pathways归为在VEGF缺陷肾小球系膜细胞中的表达显 著改变的基因
Figure A200780019536D00762
Figure A200780019536D00771
与肾发育过程中降低的VEGF表达有关的肾病理学
鉴定出肾小球系膜细胞中由Flt-1介导的VEGF-A的细胞自主功能，而且描述了此调节机制在肾发育过程中的作用。提供了对此调节机制的干扰可引起一些与肾小球硬化症有关的病理生理学特征的证据。此模型中的进行性肾衰竭代表了发育损伤模型，而非肾小球肾炎的成年发作模型。此模型中的肾病理学和与肾中较低VEGF水平有关的人肾疾病之间有一些相似性(参见例如Schrijvers，B.F.，et al.，The role of vascular endothelial growth factor(VEGF) in renal pathophysiology.Kidney Int 65：2003-17(2004))，例如在肾小球损伤、硬化、和炎性沉积物和补体激活中。参见例如Isselbacher，K.J.et al.Harrison′s Princip les of Internal Medicine，(1994)(McGraw-Hill Inc.，New York)。Flt-Cre+；VEGF(loxP/loxP)小鼠是展示患病肾中IgM沉积物积累及C1q、C3和C4激活的遗传模型。我们的发现不同于先前在具有足细胞特异性VEGF-A单倍体缺陷的9-12周龄小鼠中的观察结果，后者在缺乏免疫复合物形成时发生末期肾衰竭。参见例如Eremina，V.et al.Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.J Clin Invest111：707-16(2003)。
大多数调查原代细胞分离物中及健康的和患病的肾中VEGFR1和/或VEGF-A表达的报告鉴定出肾小球系膜细胞最有可能共表达这两种基因(参见例如Thomas，S.et al.Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease.J Am Soc Nephrol 11：1236-43(2000)；Gruden，G.et al.Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells：mechanisms of signal transduction.Proc Natl Acad SciUSA 94：12112-6(1997)；Harper，S.J.et al.Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo.Clin Sci(Lond)101：439-46(2001)；Takahashi，T.et al.Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells：Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun 209：218-26(1995)；Simon，M.et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney.Am-J-Physiol 268(1995)；及Noguchi，K.et al.Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis.J Am Soc Nephrol 9：1815-25(1998))，而非足细胞(已知其表达最高水平的VEGF-A)(参见例如Berse，B.，et al.Vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor)gene is expressed differentially in normal tissues，macrophages，and tumors.Molecular Biology ofthe Cell 3：211-20(1992)；及Brown，L.F.et al.Expression of vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor)by epidermal keratinocytes during wound healing.Journal of Experimental Medicine176：1375-9(1992))或内皮细胞(其表达VEGFR-1)(参见例如Thomas，S.et al.Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease.J Am Soc Nephrol 11：1236-43(2000))。在Flt1-Cre+，VEGF(LoxP/loxP)，ROSA26化合物转基因小鼠中在发育过程中的各个阶段没有检测到Cre阳性足细胞。非转化足细胞中VEGFR-1/2表达的缺失与先前的报告(参见例如Gruden，G.et al.Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells：mechanisms of signal transduction.Proc NatlAcad Sci U S A 94：12112-6(1997)；Harper，S.J.et al.Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo.Clin Sci(Lond)101：439-46(2001)；及Takahashi，T.et al.Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells：Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells.Biochem Biophys Res Commun 209：218-26(1995))和我们自己的观察结果一致。然而，SV40大T抗原转化原代小鼠足细胞导致VEGFR-1和VEGF-A在一些转化的足细胞细胞系中的表达。参见例如Chen，S.et al.Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV)collagen production by transforming growth factor-betal in mouse podocytes.Diabetes 53：2939-49(2004)。
提供了肾小球发育中受VEGF控制的两种调节机制存在的证据：1)足细胞和肾小球毛细管内皮细胞之间的旁分泌机制，有人提出其涉及开孔和/或肾小球滤过率的诱导和维持(综述见Schrijvers，B.F.，et al.The role of vascular endothelial growth factor(VEGF)in renal pathophysiology.Kidney Int65：2003-17(2004))；和2)肾小球系膜细胞中调节ECM生成和足细胞功能的自分泌环，包括VEGF表达。其中足细胞中的VEGF生成是肾小球系膜细胞中VEGF自分泌作用的下游功能的模型可以说明这两种细胞类型之任一中具有VEGF缺陷的小鼠中表型的交叠。肾小球系膜VEGF-A缺陷还导致在足细胞特异性、VEGF单倍体不足小鼠中没有发现的一组别的肾变化，包括渗入性炎性细胞的存在(图4a-b)和肾小球基底膜的扩增(expansion)(图3m)。这些发现说明在VEGF-A表达的整体降低以外，受影响的细胞类型可代表肾病理学的关键决定因素。施用刺激VEGF信号传导的化合物，特别是VEGFR-1，对于与肾小球硬化有关的肾疾病子集的治疗可以是有益的。
遗传和生化灭活VEGF之间对肾小球系膜细胞的差异效果：内部自分泌VEGF-A效应器功能作为调节机制的进一步证据
检测肾小球系膜细胞中VEGF的细胞自主功能的前提条件是足细胞衍生的VEGF-A经旁分泌或近分泌信号传导挽救VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞的明显失败。不限于单一模型，足细胞VEGF表达作为肾小球系膜细胞中VEGF自分泌环的下游功能的鉴定为足细胞不能挽救VEGF-A缺陷肾小球系膜细胞提供了合理性解释。VEGF-A在调节造血干细胞(HSC)存活中的细胞自主功能先前有报告。参见例如Gerber，H.P.et al.VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism.Nature 417，954-8(2002)。类似的，对在培养物中培养的肾小球系膜细胞施用中和VEGF-A的抗体(G6-23)对肾小球系膜细胞数目没有影响，这与VEGF-A或Flt1缺陷的细胞相反。不限于一种理论，这些发现说明自分泌信号传导可以代表更一般性的调节机制，将多种细胞类型中VEGF控制血管形成的旁分泌功能与非血管发生效应器功能分开(综述见Gerber，H.P.& Ferrara，N.The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis.J Mol Med 81：20-31(2003))。
实施例2：VEGF的VEGFR选择性变体
选择性结合和活化特定VEGF受体(诸如KDR或Flt-1)的VEGF变体的生成和表征是本领域已知的，记载于例如Li et al.J.Biol.Chem.275：29823(2000)；Gille et al.J.Biol.Chem.276：3222-3230(2001)；PCT公开号WO00/63380和97/08313；及美国专利No.6,057,428，将其公开内容明确收入本文作为参考。
具体而言，具有对Flt-1受体的高选择性的VEGF变体通过组合大大影响KDR结合但不影响Flt-1结合的四处突变而生成。Ile 43、Ile 46、Gln 79和/或Ile83的突变显示了这些残基的侧链对于紧密结合KDR是至关重要的，但是对Flt-1结合是不重要的。Li et al.(2000)supra。Flt-sel变体通过位置Ile 43、Ile46、Gln 79和Ile 83处的丙氨酸替代而构建，其中使用Kunkel et al.MethodsEnzymol.204：125-139(1991)记载的定点诱变法。此特定Flt-sel变体也可以用标识I43A/I46A/Q79A/I83A来表示。位置43、46、79和83的这四处丙氨酸替代的相应密码子分别是GCC/GCC/GCG/GCC。
实施了多种测定法来检验I43A/I46A/Q79A/I83A Flt-sel变体的特性和生物学活性。Li et al.(2000)supra。例如，使用可溶性放射免疫受体结合测定法(RIA)实施了定量结合测量。在该测定法中，天然VEGF(8-109)对KDR和Flt-1的亲和力分别为0.5nM和0.4nM。发现Flt1-sel在此测定法中具有降低至少470倍的KDR结合亲和力。在ELISA中对各个点突变体观察到Flt-1结合略有降低，Flt-sel变体对Flt-1的亲和力与天然蛋白质基本上相同。
认为本说明书足以使本领域技术人员能实施本发明。应当理解，本文所述实施例和实施方案仅用于例示目的。事实上，除了本文所显示和记载的那些内容之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言根据前文描述将是显而易见的且落入所附权利要求的范围。本文中所引用的所有出版物、专利、和专利申请完整收入本文作为参考用于所有目的。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTEcH，INc.)
<120>用于治疗肾病症的方法
<130>P2346R1
<141>2007-03-26
<150>US60/786,246
<151>2006-03-27
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Claims (20)

1.一种治疗肾病症的方法，该方法包括：对患有肾疾病的受试者施用有效量的VEGFR调控剂，其中所述VEGFR调控剂包括Flt1激动剂。
2.权利要求1的方法，其中所述Flt1激动剂是Flt1激动性抗体。
3.权利要求1的方法，其中所述Flt1激动剂是VEGF A Flt1选择剂。
4.权利要求1的方法，其中所述Flt1激动剂是VEGF A、PlGF或VEGFB。
5.权利要求1的方法，其中所述Flt1激动剂是Flt1的小分子激动剂。
6.权利要求1的方法，其中所述肾疾病的特征为VEGF水平降低。
7.权利要求1的方法，其中所述肾疾病是炎性肾疾病。
8.权利要求7的方法，其中所述炎性肾疾病的特征为患病肾小球中的炎性细胞改变、免疫复合物沉积或补体激活。
9.权利要求8的方法，其中所述免疫复合物沉积是IgM沉积。
10.权利要求8的方法，其中所述补体激活包括C1q、C3和C4的激活。
11.权利要求1的方法，其中所述肾疾病包括肾小球肾炎(肾衰竭)。
12.权利要求11的方法，其中所述肾小球肾炎是通过蛋白尿、肾小球硬化或高血压确定的。
13.权利要求12的方法，其中所述肾小球肾炎是通过肾肾小球系膜细胞的存活时间缩短、ECM合成的基因表达升高、或基质降解降低确定的。
14.权利要求11的方法，其中所述肾小球肾炎是病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)。
15.权利要求1的方法，进一步包括施用有效量的第二药剂，其中所述第二药剂是血管发生剂。
16.权利要求1的方法，进一步包括施用有效量的第二药剂，其中所述第二药剂是第二Flt1激动剂。
17.权利要求15的方法，其中所述血管发生剂是VEGF。
18.权利要求2的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
19.权利要求2的方法，其中所述抗体是嵌合的、人源化的或人的抗体。
20.权利要求1的方法，其中所述受试者患有引起肾疾病的感染。
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