BRPI0709411A2 - método para tratamento de uma doença renal - Google Patents

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Abstract

<B>MéTODO PARA TRATAMENTO DE UMA DOENçA RENAL<D> São fornecidos métodos para tratamento de disfunções renais em um sujeito, pela administração de uma quantidade efetiva do agonista do VEGFR, por exemplo, um agonista de Fít1 para um sujeito. Os agonistas são compostos de composições que compreendem agonistas do VEGFR, por exemplo, VEGF, anticorpos dirigidos aos ligantes Fít1, Fít1, Fit1 ativadores demoléculas pequenas, ou agentes seletivos Fít1 em um carreador farmaceuticamente aceitável para uso na ativação de Fit1.

Description

"MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UMA DOENÇA RENAL"
Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório da patente US 60/786.246, depositado em 27 de março de 2006, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência.
Campo Da Invenção
A invenção refere-se aos usos terapêuticos de agentes muduladores do VEGFR, incluindo métodos de utilização dos agonistas do VEGFR para tratar disfunções renais.
Antecedentes Da Invenção
O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF-A) reguladiversas funções vasculares, incluindo diferenciação e sobrevivência de células endoteliais (ver, por exemplo, Ferrara, N., et al The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 9:669-676 (2003)), via ativação de dois receptores tirosina quinase, Fltl (VEGFR-1) e Flkl (KDR/VEGFR-2) expressos nas células endoteliais. Recentes estudos identificaram a expressão do receptor VEGF em várias células não endoteliais, incluindo células-tronco hematopoiéticas, sugerindo funções reguladoras não vasculares para o sistema ligante/receptor do VEGF. Ver também, por exemplo, Autiero, M., et al. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatorv disorders. J Thromb Haemost 1: 1356-1370 (2003). No rim, os receptores do VEGF são encontrados principalmente nas células endoteliais ρré-gIomerulares, glomerulares, pós-glomerulares (ver, por exemplo, Thomas, S., et. al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-12433 (2000)) e peritubulares, bem como nas células glomerulares mesangiais, mas não nos podócitos. Ver, por exemplo, Gruden, G., et al., 1997. Mechanical stretch induces vascular permeabilitv factor in human mesangial cells: mechanisms ofsignal transduction. Proe NatIAcad Sci USA 94:12112-12116 (1997); Harper1 S.J., et al. Expression of neuropilin-1 bv human qlomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-446 (2001); e Takahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in qlomeruli and cultured qlomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesanqial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226 (4-6) (1995). No rim normal adulto, a expressão do VEGF-A é mais proeminente nos podócitos e células epiteliais tubulares, menor nas mesangiais, mas indetectável nas células endoteliais. Ver também, Noguchi, K., et al. Activated mesanqial cells produce vascular permeability factor in early-staqe mesanqial proliferative glomerulonephritis. J Am Soe Nephrol 9:1815-1825 (1998); e Simon, M., et al. Expression of vascular endothelial qrowth factor and its receptors in human renal ontoqenesis and in adult kidnev. Am-J-Physiol 268:F240-250 issn: 0002-9513 (1995). Com base na localização da expressão, acreditou-se que o VEGF-A desempenhasse um papel regulador na homéostase renal e filtração glomerular, principalmente via funções efetoras justacrinas, dirigidas às células endotelias glomerulares e peritubulares. Vários estudos avaliaram o papel do VEGF-A durante o desenvolvimento renal e em modelos de lesão renal. Ver, por exemplo, de Vriese, A.S. et al. Antibodies aqainst vascular endothelial qrowth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soe Nephrol 12: 993-1000 (2001); Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression Iead to distinct conqenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003); Kang, D.H., et al. Impaired anqioqenesis in the remnant kidnev model: II. Vascular endothelial qrowth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J Am Soe Nephrol 12:1448-57qlomerular capillarv repair and accelerates resolution of experimentally induced glomerulonephritis. Am J Pathol 159, 599-608 (2001); e Ostendorf, T. et al.VEGF(165) mediates qlomerular endothelial repair. J Clin Invest 104:913-23 (1999).
A desregulação do VEGF-A é uma característica comum em modelos experimentais de doenças renais, incluindo tumores, diabetes e glomerulonefrite (ver, por exemplo, Khamaisi, M., et al.) The emerqing role of VEGF in diabetic kidnev disease. Nephrol Dial Transplant 18:1427-1430 (2003); e Schrijvers, B. F., et al. The role of vascular endothelial qrowth factor (VEGF) in renal pathophvsioloqy. Kidney Int 65:2003-2017 (2004)). VEGF-A e seus receptores são supra-regulados em animais experimentais ou humanos com diabetes tipo 1 e tipo 2, pelo menos por um certo período de tempo, enquanto níveis reduzidos do VEGF-A foram associados ao desenvolvimento de glomeruloesclerose e fibrose tubulointersticial no restante dos rins em diversas doenças renais progressivas. Ver, por exemplo, Honkanen, E., et al. Decreased expression of vascular endothelial qrowth factor in idiopathic membranous glomerulonephritis: relationships to clinicai course. Am J Kidney Dis 42:1139-1148 (2003); Korbet, S.M., et al. The racial prevalence of qlomerular Iesions in nephrotic adults. Am J Kidney Dis 27:6 47-51 (1996); Sivridis, E., et al. Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 and angioqenic factor expression in idiopathic membranous nephropathv. Am J Kidney Dis 41:360-365 (2003); e Srivastava, T., et al. Hiqh incidence of focai segmentai qlomerulosclerosis in nephrotic svndrome of childhood. Pediatr Nephrol 13:13-8 (1999). Uma das principais características histopatológicas de FSGS é o acúmulo de depósitos da matriz extracelular (ECM) ou glomeruloesclerose. A patogênese da glomeruloesclerose não é conhecida, e não de sabe quais dos três tipos celulares presentes nos glomérulos (podócitos, células endotelias ou mesangiais) participam do processo fibrótico.
As células mesangiais se replicam com aumento de produção da matriz extracelular (ECM) como parate da resposta à lesão renal, sem levar emconsideração o tipo de lesão, por exemplo, em glomerulonefrite ou nefropatia diabética. Este processo prejudica a infiltração glomerular, resultando em esclerose glomerular e em insuficiência renal em estágio terminal. Ver, por exemplo, Buschhausen, L., et al. Kidnev fibrosis impairs glomerular ultrafiltration and results in glomerular sclerosis and end-stage renal failure. Regulation of mesangial cell function by vasodilatorv signaling molecules. Cardiovasc Res 51:463-469 (2001). As anomalias nos podócitos identificadas em modelos transgênicos de glomeruloesclerose (ver, por exemplo, Shih, N. Y., et al. Congenital nephrotic syndrome in mice Iacking CD2-associated protein Science 286:312-315 (1999)) ou em pacientes (ver, por exemplo, Srivastava, T., et al. Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood. Kidney Int 59:118-125 (2001)), sugerem que estas células podem desempenhar um papel na iniciação da cicatrização glomerular. Outros modelos envolveram células endoteliais ou mesangiais no processo esclerótico (ver, por exemplo, Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252 (2003)). Em muitos modelos de glomeruloescerose (bem como clinicamente em FSGS), o acúmulo de ECM freqüentemente parece iniciar no mesângio. Todos os três tipos celulares de glomérulos renais estão associados e podem contribuir de alguma forma para o progresso da doença.
Acredita-se que VEGF-A tenha um papel funcional nas células mesangiais, com base nos estudos que mostraram aumento na proliferação de células mesangiais humanas em resposta ao estímulo do VEGF (Onozaki, A., et al. Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione. Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004)), indução da síntese de colágeno (Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances
collagen svnthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999))e aumento da produção de óxido nítrico (Trachtman, H., etal. Effect of vascular endothelial qrowth factor on nitric oxide production bv cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998)). Ver também, por exemplo, Thomas, S., et ai. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-1243 (2000). No entato, apesar da receptividade das células mesangiais ao estímulo com VEGF-A in vitro, a natureza do(s) receptor(es) do VEGF envolvidos e o efeito das alterações na produção do VEGF-A nas células mesangiais durante o desenvolvimento do rim permancem desconhecidos. Há uma necessidade em se descobrir e entender as funçõesbiológicas do VEGF e receptores do VEGF no rim e nos tipos celulares renais. O entendimento da função biológica destas moléculas pode levar ao tratamento das doenças renais. A invenção se remete a estas e outras necessidades, como será aparente sob revisão das divulgações a seguir.
Descrição Resumida Da Invenção
A invenção fornece métodos para tratamento de doença renal em um sujeito. Por exemplo, um método da invenção compreende administrar ao sujeito com doença renal uma quantidade efetiva de um agente modulador do VEGFR. O agente modulador do VEGFR útil para a invenção inclui, mas não se limita a, por exemplo, um agonista específico para pelo menos um ou mais dos receptores do VEGF como, VEGF, agonista do VEGFR-1 (Flt-1), um Flt-1, variante seletivo do VEGF (Flt-sel) que se liga seletivamente ao Flt-1, um fator de crescimento que se liga e ativa Flt-1 como, PIGF ou VEGF-B, um anticorpo agonístico anti-VEGFR-1 (por exemplo, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, humano ou humanizado), um agonista do Fltl de molécula pequena, etc. Em uma realização da invenção, o modulador do VEGFR é um agonista do Flt1. Em uma realização, o agonista do VEGFR-1 é administrado em combinação comum agente angiogênico, por exemplo, VEGF, um Iigante ou agonista do VEGFR1 adicional, Iigante do VEGFR2, um variante seletivo do VEGFR-2 (KDR), um anticorpo agonista anti-VEGFR-2, VEGF-C, VEGF-D1 um fator de crescimento que inibe e ativa VEGFR1 e/ou VEGFR2, etc. Doenças renais que podem ser tratadas pela invenção incluem, mas não se limitam a doença inflamatória renal (por exemplo, caracterizada por alterações nas células inflamatórias, deposição de complexo imune (por exemplo, deposição de IgM), ativação de complemento (por exemplo, ativação de C1q, C3 e C4) ou uma combinação destes), nefrite, glomeruloesclerose, gIomeruIonefrite (insuficiência renal) (por exemplo, que pode ser determinada por proteinúria, esclerose glomerular, hipertensão, sobrevivência reduzida das células mesangiais renais, um aumento na expressão gênica da síntese de ECM1 uma redução na degradação da matriz e/ou combinação destes fatores), glomeruloesclerose segmentai focai (FSGS), etc. Em certas realizações da invenção, o sujeito tem uma infecção que resulta em doença renal.
Em certas realizações, a doença renal é caracterizada por uma redução nos níveis de VEGF. Em certas realizações da invenção, a doença compreende alterações nos tipos celulares do rim (por exemplo, células mesangiais, podócitos e/ou células endotelais).
Em certas realizações da invenção, o agente da invenção que éfornecido ao sujeito é uma proteína ou polipeptídeo. Em certas realizações da invenção, um agente da invenção pode ser administrado ao sujeito através de um sistema de entrega sistêmico. O sistema de entrega sistêmico pode compreender uma preparação de liberação lenta que compreende um agente, por exemplo, um agente purificado e uma matriz polimérica. Em uma realização, é administrada uma preparação celular que compreende células de mamíferos (por exemplo, células CHO) que expressam uma forma recombinante do agente. Alternativamente, o agente para o sujeito dainvenção pode ser administrado via um vetor de entrega de gene dirigido ao rim que compreende um ácido nucléico que codifica o agente. Vetores virais e não virais bem estabelecidos para terapia gênica podem ser usados, por exemplo, um vetor de entrega de gene dirigido ao rim.
Um artigo de fabricação e um kit que compreende um agente modulador do VEGFR são também fornecidos, bem como kits e métodos para diagnóstico.
Breve Descrição Das Figuras
Fig. 1, Painéis a-h, ilustram a caracterização de camundongos transgênicos Fltl-Cre usando-se a linhagem repórter ROSA26 LacZ e geração de camundongos Flt1-Cre;VEGF-loxP. (a) Freqüência genotípica da prole que surge do cruzamento de camundongos Fltl-Cre+-,VEGFiloxp^ e Fltl-Cre ;VEGF(loxP/loxP). Camundongos de todos os genótipos resultantes nascem na freqüência Mendeliana esperada, (b) Curva de sobrevida para camundongos Fltl-Cre+IVEGFtloxpyioxp*. A redução na sobrevida é evidente 4 semanas após o nascimento e 95% destes camundongos morreram com 12 semanas de idade, (c) Porcentagem do rim em relação ao índice de massa corporal em camundongos Fltl-Cre' comparado com camundongos FH1-Cre+;VEGF^'oxP/'mP) com 7,5 semanas de idade. Os rins de FItI-Cre+IVEGFiloxpnox^ pesaram significativamente menos do que os controles. Fltl-Cre', η = 25; Fltl-Cre+; VEGF(ioxp/ioxP)t n _ 10; *p < 0 0001. (d) (Direita) Aparência típica de um rim retirado de um camundongo FItI-Cre+IVEGFiloxpfloxn com 4 semanas de idade comparado com (esquerda) um WT e rim fenotipicamente normal. Os rins de Fltl-Cre+-,VEGFfloxpfloxn são freqüentemente císticos e de aparência pálida, (e) (Topo) Silver stain para detectar a presença de proteína na urina de camundongos Fltl-Cre1VEGF-IoxP com 4 a 5 semanas de idade. 1 μL da urina de três camundongos representativos para cada genótipo mostrado no topo do painel foi sujeito a SDS-PAGE e silver stain. Proteína abundante é detectadana urina de camundongos Fltl-Cre+^EGFfloxpfloxpj, mas não em camundongos Fltl-Cre+, VEGFfloxp^ ou Fltl-Cre', indicando proteinúria grave nos nocautes VEGF condicionais. (Parte inferior) Análise IVesfem blot da urina de camundongos FltI-CrelVEGF-IoxP usando-se um anticorpo desenvolvido contra albumina. (f) Níveis de nitrogênio da uréia sangüínea (B.U.N.) em camundongos Fltl-Cre;VEGF-IoxP com 7,5 semanas de idade. Fltl-Cre+; VEGFfloxpfloxpi, η = 9; Fltl-Cre+; VEGF<loxP/+), η = 8; Fltl-Cre, η = 16; **valor ρ < 0,0001. (g) Níveis de creatinina no soro em camundongos Fltl-Cre;VEGF-loxP com 7,5 semanas de idade. Fltl-Cre+; VEGFfloxpfloxp\ η = 9; Fltl-Cre+; VEGF<loxP/+), η = 8; Fltl-Cre, η = 16; *valor ρ < 0,05. (h) Média da pressão sangüínea arterial (MAP) e média de batimentos cardíacos durante as medições de MAP. (Eixo e colunas da esquerda) MAP +/- desvio padrão está descrita como colunas pretas. MAP é significativamente elevada em camundongos FItI-Cre+^EGFfloxpfloxpi em comparação a camundongos Fltl-Cre'. (Eixo e quadrados da direita) O batimento cardíaco de cada camundongo foi registrado durante as medições de MAP e a média das medições é mostrada como quadrados pretos +/- desvio padrão. A média de batimentos cardíacos não foi significativamente diferente dos nocautes VEGF condicionais em comparação aos controles. Fltl-Cre+; VEGFfloxpfloxpi, η = 5; Fltl-Cre, η = 10; **valor ρ < 0,005.
Fig. 2, Painéis a-c, ilustram que o transgene Fltl-Cre e VEGF-A são co-expressos em células mesangiais dos glomérulos renais: (a) (Esquerda) Imagens de campo claro dos cortes corados com H&E dos rins de camundongos com 7,5 semanas de idade, sujeitos a hibridização in situ usando-se uma sonda anti-sense VEGF-A. (Direita) Fotografias de campo escuro das imagens mostradas nos painéis da esquerda. A expressão do VEGF-A é reduzida acentuadamente nos glomérulos renais dos camundongos Flt1-Cre+;VEGF<,oxPfloxP) com idades semelhantes. (b) Coloraçãoimunohistoquímica nos cortes do rim de embriões de camundongos Fltl-Cre+,VEGFiloxp^ com 18,5 dias de idade usando-se um anti-soro purificado para aumento de afinidade contra Cre-recombinase. (Topo) A expressão de Cre-recombinase (marrom), dirigida pelo promotor do gene Flt1, é detectada tanto em células endoteliais como mesangiais (me) nos glomérulos. (Parte inferior) A expressão de Flt-Cre é mostrada nas células endoteliais (en) por todo o compartimento túbulo-intersticial/compartimento medular como controle, (c) Análise RT-PCR em tempo real do RNA total de rim isolado de camundongos Fltl-Cre;VEGF-loxP com 7 semanas de idade. Unidades de RNA relativas (RRU) para Cre recombinase, Flt1, Flk1, e VEGF-A foram normalizadas para níveis de GAPDH e calculadas a partir de curvas padrão (Gerber et a/., 2000). Fltl-Cre+; VEGF<loxP/loxP), η = 6; Fltl-Cre+; VEGF(loxP/+), η = 6; Fltl-Cre, η = 6; * valor ρ < 0,05.
Fig. 3, Painéis a-m, ilustra esquematicamente a análise 15 histológica dos rins de camundongos Flt1-Cre;VEGF-LoxP com 2 a 7 semanas de idade e Micrográficos de Transmissão Eletrônica de rins isolados de camundongos Flt1-Cre;VEGF-LoxP com 5 semanas de idade: (a) córtex renal de um camundongo Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP) com 2 semanas de idade, corado com H&E e fotografado com baixa ampliação. As junções de um cisto cortical e 20 glomérulos são marcadas (linhas pontilhadas), consistindo em células periféricas e aparentemente sem alças capilares glomerulares, e são evidentes, (b) Corte corado com H&E de um glomérulo renal WT em camundongo com 2 semanas de idade, (a) corte corado com H&E de gromérulo renal em um camundongo Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) com 2 semanas de idade. Alças capilares compactas como observadas em ninhadas WT (b), parecem estar ausentes, (a) corte corado com H&E de gromérulo renal em um camundongo Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP) com 2 semanas de idade, que é ampliado com capilares glomerulares que são obscurecidos pela deposição abundante da ECM. (e)Aparência típica de um glomérulo de um camundongo Fltl-Cre" com 7 semanas de idade, corado com H&E. (a) corte corado com H&E de gromérulo em um camundongo Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) com 7 semanas de idade. Nesta idade, os glomérulos dos nocautes VEGF condicionais são acentuadamente ampliados e a deposição de ECM invade os capilares glomerulares e espaço urinário. (g e h) Coloração imunohistoquímica de células endoteliais em Fltl-Cre" (g) e Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (h) rins com 7 semanas usando-se a-CD31. Menos células endoteliais CD31-positivas são detectadas nos rins mutantes. (i e j) Expressão de TGF-β em Fltl-Cre (i) e Fltl-Cre+; VEGF(loxP/loxP) (j) rins com 7 semanas detectados por hibridização in situ. Supra-regulação marcada de TGF-β é detectada em rins nocaute VEGF-A. (k e I) Coloração imunohistoquímica para detectar actina alfa de músculo liso (α-SMA) no rins de Fltl-Cre (k) e Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) (I) camundongos com 7 semanas de idade. Aumento de coloração α-SMA é detectável por todo glomérulo do nocaute BEGF condicional, refletindo ativação das células mesangiais remanescentes. (m) (Topo) Micrográficos de transmissão eletr6onica demonstra numerosos defeitos nos rins de Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP) comparados aos rins de (parte inferior) Fltl-Cre". (Esquerda) Existem áreas em processo de fusão de pedicelos (fp) (flechas) nos rins doentes, enquanto que existem processos de pedicelos diferentes nos controles. (Meio) No mesângio (me), numerosos depósitos eletrodensos (de) que não estão presentes no rim Flt-Cre" , podem ser vistos em uma localização subendotelial, consistente com gIomeruIonefrite imunomediada. (Direita) Nos glomérulos com lesões avançadas, uma membrana basal acentuadamente grossa e enrugada é vista nos rins Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP). Células endoteliais fenestradas (en) são vistas nos controles, mas não aparecem nos nocautes VEGF condicionais.
Fig. 4, Painéis a-b, ilustra esquematicamente que a progressão de insuficiência renal em camundongos FItI-Cre+IVEGFfloxpyiox^ está associadacom a deposição de IgM e ativação de complemento: (a) Número de alterações nos níveis de RNA de genes expressos em linhagens celulares de monócitos/macrófagos (MAC-1, F4/80), células B (CD45R) e células T (Thy-1) em Fltl-Cre+; VEGFfloxp^oxp' comparado com rim Fltl-Crel pulmão e tecido cardíaco (barras pretas) e em Fltl-Cre+!VEGFfloxp^ comparado com órgãos compatíveis Fltl-Cre' (barras cinzas). Níveis de expressão foram padronizados para os conjuntos de sondaIprimers específicos para GAPDH murino. Número de alterações estatisticamente significativo na expressão são apontados por asteriscos, valor ρ < 0,005. Fltl-Cre+; VEGFfloxpw, η = 6; Fltl-Cre+; VEGFfloxp^1 η = 6; Fltl-Cre1 η = 6. (b) (Esquerda) Coloração imunohistoquímica/fluorescente para linhagens celulares de monócito/macrófago e (direita) células T nos rins de camundongos Fltl-Cre' e Fltl-Cre+, VEGFfloxp^oxp' com 5 semanas de idade, usando-se anticorpo a-F4/80 e oc-CD4, respectivamente. Monócitos/macrófagos e um subgrupo de células T são recrutados nos tecidos renais dos nocautes VEGF-A condicionais.
Fig. 5, Painéis a- f, ilustram análise in vitro de células mesangiais deficientes em VEGF-A e Flt1: (a) Estratégia de direcionamento do gene para criar camundongos Fltl-loxP. O vetor de direcionamento foi designado para introduzir um cassette PGK-Neo ladeado pelos sítios 2 IoxP (LoxP1 e LoxP2) a montante do primeiro exon contendo o códon de iniciação de tradução (ATG) do gene Flt1, e para introduzir um terceiro sítio IoxP (LoxP3) 3' ao primeiro exon. Seguindo expressão de Cre-recombinase, células-tronco embrionárias (ES) que foram submetidas à recombinação entre LoxPI e LoxP2 foram selecionadas e usadas para gerar camundongos Fltl-loxP. As posições das sondas de DNA genômico amplificado por PCR (5' Pr, 3' Pr) usadas para selecionar eventos de direcionamento e recombinação por Southern blotting são mostradas. A posição dos sítios das enzimas de restrição usados na seleção e o tamanho das regiões do vetor de direcionamento (in kilobases) sãocomo indicado. Ε: EcoRI; Η: Hindlll; Κ: Kpnl; kb: kilobases. (b) Análise Southern blot do DNA genômico extraído de WT e direcionado (Targ.) Clones de células ES e de células mesangiais Flt1{loxP/loxP) (Mes.) infectadas com adenovirus que codificam genes LacZ (LZ) ou Cre-recombinase (Cre). O DNA genômico das respectivas células foi digerido tanto por EcoRI como por Hindlll e Kpnl para analisar os eventos direcionados e recombinação de IoxP tanto na terminação 5' como 3' das regiões alvo do gene Fltl1 respectivamente. O tamanho dos fragmentos esperados detectados em cada uma das fileiras está indicado (em kilobases) da esquerda para direita de cada painel, respectivamente, (c) expressão de VEGF-A nas células mesangiais infectadas com adenovirus. Células mesangiais foram isoladas de camundongos WT e VEGF(,oxP/loxP) e infectadas com adenovirus que codificam genes LacZ (LZ) ou Cre-recombinase (Ad-Cre). O RNA total foi isolado e sujeito a PCR quantitativo em tempo real para análise da expressão de VEGF-A. Os resultados são expressos como unidades relativas de RNA (RRU) seguindo padronização para GAPDH1 e as curvas padrão para cada conjunto de pr/mer/sonda foram geradas usando-se RNA total de rim de camundongos WT. (d) expressão de Fltl nas células mesangiais infectadas com adenovirus. Células mesangiais de camundongos WT e Fltl (|0xp/l0xp) foram isoladas e infectadas com Ad-LacZ e Ad-Cre. O RNA foi isolado e analisado para expressão de Fltl por RT-PCR quantitativo. Os resultados são expressos conforme descrito em C. (e) Sobrevida de células mesangiais deficientes em VEGF-A e Fltl in vitro. A proporção de contagem das células entre os tratamentos Ad-LacZ e Ad-Cre foi calculada e normalizada como porcentagem do valor obtido para as células WT. Tanto as células mesangiais deficientes em VEGF-A como Fltl exibiram sobrevida significativamente reduzida in vitro, em comparação às células mesangiais WT. Diferenças estatisticamente significantes na sobrevida em comparação às células WT são apontadas por asteriscos: *valor ρ < 0,05;**valor ρ < 0,01. Células mesangiais deficientes em Fltl e VEGF também exibem diferença significativa na sobrevida in vitro, ρ < 0,05. (f) Sobrevida de células mesangiais infectadas com Ad-LacZ, cultivadas na presença de um anticorpo VEGF neutralizante (α-VEGF) ou anticorpo controle (IgG controle). A redução evidente na sobrevida de células mesangiais quando VEGF-A ou Fltl são geneticamente removidos não foi repetida pelo cultivo de células mesangiais na presença de a-VEGF.
Fig. 6, Panéis a-d, ilustram análise RT-PCR em tempo real do RNA total de rim isolado de camundongos Flt1-Cre;VEGF-loxPoi com 7 10 semanas de idade para detectar a expressão de formas diferentes de colágeno. Unidades relativas de (RRU) para colágeno α1 tipo I (a), colágeno a2 tipo Il (b), colágeno a2 tipo IV (c) e colágeno α1 tipoXVIII (d) foram normalizados para níveis de gliceraldeídos-3-desidrogenase (GAPDH) e calculados a partir de curvas padrão.
Descrição Detalhada Da Invenção
Definições
Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se entender que esta invenção não está limitada a composições específicas ou a sistemas biológicos, que podem certamente variar. Entende-se também que a terminologia usada no presente pedido é somente para os propósitos das realizações específicas descritas, e não tem a intenção de ser limitante. Como usado nesta especificação e nas especificações anexas, as formas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem os plurais referentes, a menos que o conteúdo claramente dite de outra forma. Dessa forma, por exemplo, a referência a "uma molécula" opcionalmente inclui uma combinação de duas ou mais de tais moléculas e similares.
Nefrite é uma inflamação dos rins. Evidências de nefrite, por exemplo, sangue e/ou proteína na urina e função renal debilitada, etc.,depende do tipo, localização e intensidade da resposta imune, inflamação que afeta o glomérulo, túbulos, tecido ao redor dos túbulos ou vasos sangüíneos. "Doença relacionada à nefrite" inclui, mas não se limita a, por exemplo, glomerulopatias primárias (glomerulonefrite proliferativa difusa aguda, glomerulopatia pós-estreptocóccica, glomerulopatia não pós-estreptocóccica, glomerulonefrite crescente, glomerulopatia membranosa, nefrose lipóide, glomeruloesclerose segmentária focai, glomerulonefrite membranoproliferativa, nefropatia por IgA1 glomerulonefrite proliferativa focai e glomerulonefrite crônica), doenças sistêmicas (lúpus eritematoso sistêmico, diabetes mellitus, amiloidose, síndrome de Goodpasture, poliarterite nodosa, granulomatose de Welgener, púrpura de Henoch-Schonlein e endocardite bacteriana) e disfunções hereditárias (síndrome de Alport, síndrome da membrana fina e doença de Fabry's).
"Síndrome nefrótica" é um grupo de sintomas causados por muitas doenças que afetam os rins, resultando em uma perda grave e prolongada de proteína na urina, redução nos níveis de proteína no sangue (especialmente albumina), retenção de excesso de sal e água no corpo, e aumento nos níveis de gordura (lipídeos) no sangue. Síndrome nefrótica pode ser causada por qualquer uma das glomerulopatias ou um vasto número de doenças. Tipicamente, a síndrome progride para a insufuciência completa em 3 a 4 meses.
"Síndrome nefrítica aguda" ou "glomerulonefrite aguda" refere-se a uma inflamação dos glomérulos, que freqüentemente resulta no aparecimento repentino de sangue na urina, com massa de glóbulos vermelhos (aspecto) e quantidades variáveis de proteína na urina. Síndrome nefrítica aguda pode ser seguida de uma infecção esptreptocócica, como infecção esptreptocócica na garganta. Os glomérulos são danificados pelo acúmulo de antígeno do agrupamento de estreptococos mortos junto com os anticorposque os neutralizam. Estes agrupamentos (complexos imunes) revestem as membranas dos glomérulos e interferem em sua função de filtração. Síndrome nefrítica aguda também pode ser causada por uma reação a outras infecções, como infecção de uma parte artificial do corpo (prótese), endocardite bacteriana, pneumonia, abcesso de órgãos abdominais, catapora, hepatite infecciosa, sífilis e malária. As últimas três infecções podem causar síndrome nefrótica ao invés de síndrome nefrítica aguda. "Síndrome nefrítica crônica" ou "glomerulonefrite crônica" refere-se a uma disfunção que ocorre em diversas doenças em que os glomérulos são danificados e a função renal se degenera ao longo dos anos.
Glomerulopatia é uma doença glomerular, que é uma doença de um plexo de capilares. A doença glomerular renal é uma doença dos tufos formados por alças capilares no início de cada túbulo nefrítico. Tipos de glomerulopatias incluem, mas não se limitam a, por exemplo, (1) síndrome nefrítica guda, (2) síndrome nefrítica rapidamente progressiva, (3) síndrome nefrótica e (4) síndrome nefrítica crônica. Devido à danificação dos glomérulos, substâncias que normalmente são filtradas da corrente sangüínea, como proteínas, sangue, glóbulos brancos e fragmentos, podem passar atavés dos glomérulos e entrar na urina. Pequenos agrupamentos sangüíneos (microcoágulos) podem ser formados nos capilares que suprem os glomérulos.
Glomeruloesclerose é uma doneça renal degenerativa que resulta em depósitos hialinos ou escoriações nos glomérulos renais, freqüentemente associadas com arterioesclerose renal ou diabetes. Tipicamente, há uma infiltração de células circulantes, fibrose do interstício e atrofia tubular. A lesão glomerular causada por diversos fatores ocasiona proteinúria, na qual proteínas se ligam à Imunoglobulina A solúvel (slgA), slgG e slgM, formando complexos imunes na membrana basal. Estes complexos imunes funcionam como um fator quimiotáxico para linfócitos inflamatórios, os quais causam resposta imuneexcessiva em áreas afetadas (Bohle A et al., Kidney Int 67 (Suppl.):186S-188S(1998)). Quando os túbulos estão danificados pelas células inflamatórias, os vasos sangüíneos conectados aos glomérulos também ficam lesados e obstruídos. Como conseqüência, os glomérulos se tornam adversamente afetados e deteriorados. Estas alterações glomerulares são acompanhadas por fibrose do tecido e progresso para eventual insuficiência renal (ver, por exemplo, Ratscchek M et al., Clin Nephrol 25: 221-226 (1986); Bohle A et al, Clin Nephrol 29: 28-34 (1998); Bohle A et al., Kidney Blood Press Res 19:191-195(1996)).
Um tipo é Glomeruloesclerose Segmentai Focai (FSGS) que é umcolapso segmentai dos capilares glomerulares com membranas basais espessas e aumento da matriz mesangial, que freqüentemente resulta em proteinúria e insuficiência renal. Ver, por exemplo, Kamanna et al., Histoi Histopathol. 13: 169-179(1998); Wehrmann et al., Clin. Nephrol. 33:115-122 (1990); Mackensen-Haen, et ai, Clin. Nephrol. 37:70-77 (1992). Pode causar insuficiência renal permanente.
O termo "mesângio" refere-se a um tecido que suporta as alças capilares no glomérulo renal e é composto de células mesangiais e matriz mesangial. Células mesangiais são conhecidas por manter a estrutura de alças dos glomérulos, bem como ter uma função fagocítica ou a capacidade de regular o fluxo sangüíneo glomerular. Células mesangiais têm receptores da angiotensina Il e produzem fatores que ativam plaquetas, prostaglandinas, colágeno tipo IV, fibronectina, etc. A matriz mesangial é um componente da matriz extracelular que envolve as células mesangiais.
O termo "receptor do VEGF" ou "VEGFR", como usado nopresente pedido, refere-se a um receptor celular para VEGF1 comumente um receptor de superfície celular encontrado nas células endoteliais vasculares, como também fragmentos e variantes destes que mantêm a capacidade de seligar ao VEGF (como fragmentos ou formas truncadas do domínio extracelular). Alguns exemplos de VEGFR incluem receptores de proteína quinase, denominados na literatura de Flt-1 (também usado alternadamente no presente pedido como "VEGFR-1") e KDR/Flk-1 (também usado alternadamente no 5 presente pedido como "VEGFR-2"). Ver, por exemplo, DeVries et al. Science 255:9891992 (1992); Shibuya et al. Oncogene, 5:519 (1990); Matthews et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 88:9026 (1991); Terman et al. Oncogene, 6:1677 (1991) e Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992). Os receptores Flt-1 (formas similares à tirocina quinase) e KDR (região de domínio quinase) se ligam ao VEGF com alta afinidade. Flk-1 (kinase-1 de fígado fetal), o homólogo murino de KDR, compartilha 85% de identidade de seqüência com KDR humano. Ferrara Kidney Intl. 56:794-814 (1999). Tanto Flt-1 como KDR/Flk-1 têm sete domínios similares à imunoglobulina (Ig) no domínio extracelular (ECD)1 uma região transmembrana única e uma seqüência de tirosina quinase consenso (TK), que é interrompida por um domínio para inserção de quinase. Flt-1 tem afinidade mais alta para rhVEGFi65, com um Kd de aproximadamente 10 a pM. KDR tem afinidade mais baixa para VEGF, com um Kd de aproximadamente 75 a 125 pM. As seqüências de ácidos nucléicos e seqüências de aminoácidos de um VEGFR estão facilmente acessíveis e podem ser obtidas por um técnico no assunto.
Outros receptores do VEGF incluem aqueles que podem ser reticulados e marcados com VEGF, ou aqueles que podem ser co-imunoprecipitados com KDR ou Flt-1. Um receptor do VEGF adicional que se liga ao VEGF165, mas não ao VEGF121 foi identificado, e é neuropilina 1. Soker 25 et al Cell 92:735-45 (1998). O receptor de ligação ao VEGF com isoforma específica é também um receptor para a família colapsina/semaforina, que media a orientação celular neuronal.
Os receptores Flt-1 e KDR existem principalmente como umreceptor de superfície nas células endotelias vasculares, embora eles possam estar presentes em células não endotelias. Algumas formas solúveis de VEGFR também foram encontradas. Por exemplo, um cDNA que codifica uma forma solúvel alternativamente unida de Flt-1 (sFlt-1), sem o sétimo domínio similar à Ig1 seqüência transmembrana e domínio citoplasmático, foi identificado em células endotelias da veia umbilical humana (HUVECs). Kendall etal. Biochem. Biophys. Res. Comm. 226:324-328 (1996).
Os termos "VEGF" e "VEGF-A" são usados alternadamente para se referir ao fator de crescimento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos e fatores de crescimento celular endoteliais vasculares relacionados, com 121, 189 e 206 aminoácidos, conforme descrito por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), e Houck et ai. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991) e Robinson & Stringer1 Journal of Cell Science, 144(5):853-865 (2001), junto com as forma alélicas que ocorrem naturalmente e formas processadas destes. O termo "VEGF" é também usado para se referir a fragmentos polipetídicos, por exemplo, que compreendem 8 a 109 ou 1 a 109 aminoácidos do fator de crescimento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos, que mantém atividade biológica. Referências para qualquer uma destas formas de VEGF podem ser identificadas no presente pedido, por exemplo, como "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF 165." As posições de aminoácidos para um "fragmento" de VEGF nativo estão numeradas conforme indicado na seqüência do VEGF nativo. Por exemplo, a posição 17 de aminoácido (metionina) no fragmento de VEGF nativo é também a posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O fragmento do VEGF nativo tem afinidade de ligação para os receptores KDR e/ou Flt-1 comparável ao VEGF nativo.
Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento dos vasos sangüíneos, por exemplo, promove a angiogênese, crescimento endotelial, estabilidade dos vasos sangüíneos e/ouvasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos, incluem, mas não se limitam a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF (A, B, C, D e E), família PIGF, família PDGF, família do fator de crescimento de fibroblasto (FGFs), Iigantes TIE (Angiopoietinas)1 ANGPTL3, ANGPTL4, efrinas, etc.
Também inclui fatores que aceleram a cicatrização, como hormônio do crescimento, fator I de crescimento similar à insulina (IGF-I)1 VIGF, fator de crescimento epidermal (EGF), CTGF e membros desta família, TGF-α e TGF-β. Ver, por exemplo, Klagsbrun e D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991); Streit e Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et ai, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por exemplo, Tabela 1 listando fatores angiogênicos conhecidos) e Sato Int J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).
Um polipeptídeo de "seqüência nativa" compreende um polipeptídeo que possui a mesma seqüência de aminoácido que aquela derivada da natureza. Dessa forma, um polipeptídeo de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo de ocorrência natural de qualquer mamífero. Tal polipeptídeo de seqüência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo de seqüência nativa" especificamente abrange formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural do polipeptídeo (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas do polipeptídeo de ocorrência natural.
Um polipeptídeo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em certasrealizações, o polipeptídeo será purificado (1) para mais que 95% por peso de anticorpo, como determinado pelo método Lowry1 ou mais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna, pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução, usando-se Coomassie blue ou silver stain. O polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não esteja presente. Geralmente, no entanto, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Um polipeptídeo "variante" significa um polipeptídeo ativo biologicamente que possui pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido em relação à seqüência do polipeptídeo nativo correspondente ou fragmento deste. Tais variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou deletados no N ou C-terminal do polipeptídeo. Geralmente, um variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácido ou pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoácido, ou pelo menos cerca de 95% ou mais de identidade de seqüência de aminoácido em relação à seqüência do polipeptídeo nativo ou fragmento deste.
O termo "variante", como usado no presente pedido, refere-se a uma proteína variante como descrita no presente pedido e/ou que inclui uma ou mais mutações de aminoácido na seqüência da proteína nativa. Opcionalmente, uma ou mais mutações de aminoácido incluem substituição(ões) de aminoácido(s). Variantes destas para uso na invenção podem ser preparados por uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Em certas realizações da invenção, o VEGF empregado nos métdos da invenção compreende VEGF165 recombinante. Seqüências de aminoácidosvariantes podem ser preparadas por mutações, por exemplo, no DNA do VEGF ou DNA do VEGFR. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácido da proteína. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final tendo a atividade desejada. As mutações que serão feitas no DNA que codifica a variante não devem colocar a seqüência fora do quadro de leitura e, preferencialmente, não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura de mRNA secundária. Patente EP 75.444A.
Variantes, opcionalmente, são preparados por mutagênese denucleotídeos sítio-dirigida no DNA que codifica a proteína nativa ou por técnicas de exibição por fago, produzindo assim o DNA que codifica a variante e, posteriormente, expressando o DNA na cultura celular recombinante.
Enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência de aminoácido é pré-determinado, a mutação por si mesma não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para melhorar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, mutagênese aleatória pode ser conduzida no códon ou região alvo e os variantes expressos são selecionados para a combinação mais adequada para a atividade desejada. Técnicas para produzir mutações de substituição em sítios pré-determinados no DNA tendo uma seqüência conhecida são bem conhecidas, como, por exemplo, mutagêneses específicas ao sítio. A preparação dos variantes, descrita no presente pedido, pode ser alcançada por técnicas de exibição por fago, como aquelas descritas na publicação PCT documento WO 00/63380.
Após tal clone ser selecionado, a região da proteína mutante podeser removida e colocada em um vetor, apropriado para produção de proteína, geralmente um vetor de expressão do tipo que pode ser empregado para transformação de um hospedeiro apropriado.Deleções de seqüência de aminoácido geralmente variam de aproximadamente 1 a 30 resíduos, opcionalmente 1 a 10 resíduos, opcionalmente 1 a 5 resíduos ou menos, e tipicamente estão próximos.
Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões nas terminações amino e/ou carboxila de um resíduo a polipeptídeos de comprimento essencialmente irrestrito, bem como inserções dentro da seqüência de resíduos de aminoácido único ou múltiplo. Inserções intra-seqüência (isto é, inserções dentro da seqüência da proteína nativa) podem variar, geralmente, de cerca de 1 a 10 resíduos, opcionalmente 1 a 5, ou 1opcionalmente 1 a 3. Um exemplo de uma inserção terminal inclui uma fusão de uma seqüência sinal, heteróloga ou homóloga à célula hospedeira no N-terminal, para facilitar a secreção a partir dos hospedeiros recombinantes.
Variantes adicionais são aquelas em que pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína nativa foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Tais substituições podem ser feitas de acordo com aquelas mostradas na Tabela 1. Variantes podem também compreender aminoácidos não naturais, como descrito no presente pedido.
Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda edição, páginas 73-75, Worth Publishers, Nova York (1975)):
(1) não polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polar não carregada: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N)1 Gln (Q)
(3) ácida: Asp (D), Glu (E)
(4) básica: Lys (K), Arg (R), His(H)
Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem serdivididos em grupos, com base nas propriedades comuns das cadeias laterais:
(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácida: Asp, Glu;
(4) básica: His, Lys, Arg;
(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly1 Pro;
(6) aromática: Trp, Tyr, Phe.
Tabela 1
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"Resíduos de aminoácido de ocorrência natural" (isto é, resíduosde aminoácidos codificados pelo código genético) podem ser selecionados do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (lie): Ieucina (Leu); Lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr) e valina (Vai). Um "resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente" refere-se a um resíduo diferente daqueles resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente listados acima, que são capazes de se ligar covalentemente a resíduo(s) de aminoácido(s) adjacente(s) em uma cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, por exemplo, norleucina, ornitina, norvalina, homoserina e outros resíduos de aminoácidos análogos, como aqueles descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) e publicações de pedido de patente US 20030108885 e 20030082575. Resumidamente, estes procedimentos envolvem ativação de um supressor de tRNA com um resíduo de aminoácido que não ocorre naturalmente seguido por transcrição e tradução do RNA, in vitro ou in vivo. Ver, por exemplo, publicações de pedido de patente US 20030108885 e 20030082575; Noren et al. Science 244:182 (1989) e Ellman et al., acima.
O efeito da substituição, deleção ou inserção pode ser avaliadofacilmente por um técnico no assunto, usando-se testes de seleção de rotina. Por exemplo, um variante do VEGF selecionado pela exibição por fago pode ser expresso na cultura celular recombinante e, opcionalmente, purificado a partir da cultura celular. O VEGF variante pode então ser avaliado para afinidade de ligação ao receptor de KDR ou Flt-1 e outras atividades biológicas, como aquelas conhecidas na técnica ou divulgadas no pedido. As propriedades ou atividades de ligação do Iisado celular ou variante do VEGF purificado podem ser selecionadas em um teste de seleção adequado para uma característica desejada. Por exemplo, uma alteração no caráter imunológico do VEGF variante, quando comparado ao VEGF nativo, como afinidade para um dado anticorpo, pode ser desejável. Tal alteração pode ser medida por um imunensaio competitivo, que pode ser conduzido de acordo com técnicas conhecidas. A afinidade de ligação do respectivo receptor do VEGF variante pode ser determinada por testes ELISA, RIA, e/ou BIAcore, conhecidos na técnica e descritos nos Exemplos abaixo. Em uma realização da invenção, VEGF variantes da invenção também exibirão atividade nos testes KIRA1 refletivos da capacidade para induzir fosforilação do receptor de KDR. Em uma realização da invenção, VEGF variantes da invenção, adicionalmente ou alternativamente, irão induzir proliferação de células endoteliais (que pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, como teste de proliferação de HUVEC). Além dos VEGF variantes específicos divulgados no presente pedido, os VEGF variantes descritos em Keyt et ai J. Bioi Chem. 271:5638-5646 (1996) são também contemplados para uso na invenção.
"Porcentagem (%) de identidade de seqüência aminoácido" nopresente pedido é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em uma seqüência selecionada, após alinhamento das seqüências eintrodução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência, sem considerar qualquer substituição conservativa como parte da identidade de seqüência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de seqüência de aminoácido, pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da na técnica, por exemplo, usando-se programas de computador publicamente disponíveis, como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento sobre o comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos no presente, no entanto, valores de % de identidade de seqüência de aminoácido são obtidos conforme descrito abaixo, pelo uso do programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e foi depositado com documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais Americano, Washington, D.C., 20559, onde está registrado sob Registro de Direito Autoral Americano N0 TXU510087, e está publicamente disponível pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, por exemplo, UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de seqüência são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Para os propósitos no presente pedido, a % de identidade de seqüência de aminoácido de uma dada seqüência de aminoácido A, em comparação a uma dada seqüência de aminoácido B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada seqüência de aminoácido A que possui ou compreende uma certa % de identidade de seqüência de aminoácido idêntica ou em comparação a uma dada seqüência de aminoácidoΒ) é calculada como a seguir:
100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácido conseguidos como partidas idênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B1 e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Estima-se que onde o comprimento da seqüência de aminoácido A não seja igual ao comprimento da seqüência de aminoácido B1 a % da identidade de seqüência de aminoácido de A para B não seja igual a % da identidade de seqüência de aminoácido B para A.
O termo "modelula" ou "modulação", como usado no presentepedido, refere-se à diminuição, inibição, redução, melhora, aumento ou aprimoramento de uma função, expressão, atividade do gene VEGF ou alternativamente um fenótipo associado com o gene VEGFR.
O termo "modulador do VEGFR" ou "agente que modula o VEGFR" ou "composto que modula o VEGFR" refere-se a uma molécula que pode ativar sua expressão, por exemplo, um agonista, ou que pode inibir sua expressão, por exemplo, um antagonista, ou que pode inibir a atividade de um VEGFR ou sua expressão, por exemplo, um antagonista (ou inibidor). O termo "agonista" é usado para se referir a um agente que tem a capacidade de sinalizar através de um receptor VEGFR nativo. O termo "agonista" é definido no contexto do papel biológico de um receptor VEGFR. Em certas realizações da invenção, um modulador do VEGFR inclui, mas não se limita a, um agonista do VEGFR, por exemplo, um agonista do Flt1, um Iigante que se liga ao receptor VEGFR, por exemplo, VEGF, variantes seletivos do VEGF, PIGF, 25 VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D. Agonistas adicionais da invenção incluem, mas não se limitam a, por exemplo, VEGFR variantes com atividade agonística, anticorpos agonistas do VEGF, etc.
Um antagonista do VEGFR refere-se a uma molécula capaz deneutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir, ou interferir nas atividades do VEGFR, por exemplo, proliferação ou crescimento celular, migração, adesão ou metabolismo, incluindo sua ligação ao ligante, por exemplo, VEGF, seletivos do VEGF, PIGF e VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D Antagonistas de VEGFR incluem, por exemplo, anticorpos anti-VEGFR e fragmentos de ligação de antígeno destes, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente ao VEGFR, dessa forma, seqüestrando sua ligação para um ou mais ligantes, anticorpos receptores anti-VEGFR e antagonistas do VEGFR, como inibidores de molécula pequena do receptor. Antagonistas do VEGFR também incluem antagonistas variantes do VEGFR, moléculas antisense (por exemplo, VEGFR -SiRNA), aptâmeros de RNA e ribozimas contra VEGFR ou seus receptores. Em certas realizações, anticorpos antagonistas do VEGFR são anticorpos que inibem ou reduzem a atividade do VEGFR pela ligação a uma subseqüência ou região do VEGFR específica.
O termo "anticorpo anti-VEGFR" é um anticorpo que se liga aoVEGFR com afinidade e especificidade suficiente. Em certas realizações da invenção, o anticorpo anti-VEGFR da invenção pode ser usado como um agente terapêutico no direcionamento e interferência em doenças ou condições em que a atividade do VEGFR está envolvida. Geralmente, o anticorpo anti-VEGFR não se ligará a outros homólogos do VEGFR.
O termo "anticorpo" é usado no senso mais amplo e inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos (ver abaixo), contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
A menos que indicado de outra forma, a expressão "anticorpo multivalente" é usada ao longo desta especificação para denotar um anticorpoque compreende três ou mais sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente é tipicamente modificado geneticamente para conter três ou mais sítios de ligação de antígeno e, geralmente, não é um anticorpo IgM ou IgA de seqüência nativa.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem somente uma porçãode um anticorpo intacto, geralmente incluindo um sítio de ligação de antígeno do anticorpo intacto e, dessa forma, mantendo a habilidade de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos englobados pela presente definição incluem: (i) o fragmento Fab1 tendo domínios VL1 CL, VH e CH1; (ii) o fragmento Fab', que é um fragmento Fab que possui um ou mais resíduos cisteína no C-terminal do domínio CH1; (iii) o fragmento Fd que possui domínios VH e CH1; (iv) o fragmento Fd' que possui domínios VH e CH1 e um ou mais resíduos cisteína no C-terminal do domínio CH1; (ν) o fragmento Fv que possui os domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; (vi) o fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste de um domínio VH; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que inclui dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte bissulfeto na região de dobradiça; (ix) moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, cadeia única Fv; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); e Huston et ai, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacorpos" com dois sítios de ligação de antígeno, que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectados a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia do polipeptídeo (ver, por exemplo, patente EP 404,097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticorpos lineares" que compreendem um par de segmentos acoplados (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com polipeptídeos da cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígeno (Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057 1062 (1995); e patente US 5.641.870).O termo "anticorpo monoclonal", como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto pela possível ocorrência natural de mutações que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único antígeno. Além disto, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" não será interpretado como exigindo produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem 15 ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo em fago que utilizam as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente pedido especificamenteincluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção das cadeias pesadas e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567 e Morrison et al., Proc. Nati Acad.Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nos quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disso, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência deaminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazer anticorpos humanos, conforme divulgado no presente pedido. Estadefinição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando-se várias técnicas conhecidas. Em uma realização, o anticorpo humano é selecionado de uma 5 biblioteca de fago, em que esta biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan et ai Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Bioi, 227:381 (1991); Marks et ai, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Anticorpos humanos também podem ser feitos pela introdução de Ioci de imunoglobulina 10 humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos cujos genes endógenos de imunoglobulina foram parcialmente ou completamente inativados. Sob desafio, observa-se produção de anticorpo humano, que intimamente lembra aquela vista em humanos sob todos os aspectos, incluindo rearranjo do gene, montagem e repertório de anticorpo. Esta abordagem está 15 descrita, por exemplo, nas patentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et ai, Bio/Technology 10: 779-783 (1992), Lonberg et ai, Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et ai, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 20 (1996); Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado via imortalização de linfócito B humano que produz um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ser imunizados in vitro). Ver, por exemplo, Cole et ai, Monoclonal Antibodies and 25 Câncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunoi, 147 (1):86-95 (1991) e patente US 5.750.373.
O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções do domínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpose são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis, ambos nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas compreendem quatro FRs1 adotando amplamente uma configuração folha dobrada beta, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam alças que se conectam, e em alguns casos formando parte da estrutura folha dobrada beta. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos, (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).
O termo "região hipervariável" quando usado no presente refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinada por complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alçahipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos de "região de estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável, exceto os resíduos da região hipervariável, como definido no presente pedido.
Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser designados para diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG1 e IgM, e várias destas podem, ainda, ser divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgG1 (incluindo alótipos não A e A), IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As subunidades de estruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramente distintos, chamados kappa (κ) e lambda(A), baseados na seqüência de aminoácidos de seus domínios constantes.
O termo "região Fc" é usado para definir a região C-terminal deuma cadeia pesada da imunoglobulina, que pode ser gerada pela digestão por papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc variante. No entanto os limites da região Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina podem variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para alcançar desde um resíduo de aminoácido, aproximadamente na posição Cys226 ou aproximadamente na posição Pro230, até a terminação carboxila da região Fe. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínioCH2 e um domínio CH3, e opcionalmente compreende um domínio CH4. Por "cadeia da região Fc" no presente pedido entende-se uma das duas cadeias polipeptídicas de uma região Fc.
O "domínio CH2" de uma região Fc de IgG humana (também denominado domínio "Cg2") usualmente estende-se de um resido de aminoácido aproximadamente na posição 231 até aproximadamente a posição 340. O domínio CH2 é o único que não é intimamente pareado com outro domínio. De preferência, duas cadeias de carboidrato ramificadas N-Iigadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Foi especulado que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. /mmuno/.22:161 -206 (1985). O domínio CH2 no presente pedido pode ser um domínio CH2 de seqüência nativa ou domínio CH2 variante.
O "domínio CH3" compreende a distância dos resíduos C-terminal até um domínio CH2 em uma região Fc (isto é, aproximadamente do resíduo de aminoácido na posição 341 até aproximadamente o resíduo de aminoácido na posição 447 de uma IgG). A região CH3 pode ser um domínio CH3 de seqüência nativa ou um domínio CH3 variante (por exempo, um domínio CH3 com uma "protuberância" em uma cadeia deste e uma "cavidade" correspondente introduzida em outra cadeia deste; ver patente US 5.821.333, expressamente incorporada ao presente como referência). Tais domínios CH3 variantes podem ser usados para fabricar anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), como descrito no presente pedido.
"Região de dobradiça" é geralmente definida como uma distância de aproximadamente Glu216, ou aproximadamente Cys226, até aproximadamente Pro230 da IgGI humana (Burton, Molec. lmmunol.22A61-206 (1985)). Regiões de dobradiça de outros isotipos IgG podem ser alinhadas com a seqüência IgGI pela colocação do primeiro e último resíduos decisteína, formando ligação S-S entre cadeias pesadas nas mesmas posições. A região de dobradiça no presente pedido pode ser uma região de dobradiça de seqüência nativa ou uma região de dobradiça variante. A duas cadeias polipeptídicas de uma região de dobradiça variante geralmente mantêm pelo 5 menos um resíduo de cisteína por cadeia polipeptídica, de forma que as duas cadeias polipeptídicas da região de dobradiça variante possam formar uma ponte bissulfeto entre as duas cadeias. A região de dobradiça no presente pedido pode ser uma região de dobradiça de seqüência nativa humana ou uma região de dobradiça de IgGI humana nativa.
A "região Fc funcional" possui pelo menos uma "função efetora"de uma região Fc de seqüência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC)1 ligação de receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infra-regulação de receptores de superfície celular (por 15 exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente exigem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável do anticorpo) e podem ser avaliadas usando-se vários testes conhecidos na técnica, para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo. Em certas realizações da invenção, um anticorpo da invenção pode 20 ter uma região Fc alterada, resultando na função efetora alterada, por exemplo, aumento ou redução da função.
Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüência de aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza.
Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência deaminoácido que difere daquela região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Preferencialmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido, comparada a umaregião Fc de seqüência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de aproximadamente uma a aproximadamente dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente de aproximadamente uma a aproximadamente cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fe variante no presente pedido, tipicamente irá possuir, por exemplo, aproximadamente 80% de identidade de seqüência com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, ou pelo menos aproximadamente 90% de identidade de seqüência com esta, ou pelo menos aproximadamente 95% ou mais de identidade de seqüência com esta.
"Citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se à reação mediada por célula, na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e, subseqüentemente, causam Iise da célula alvo. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse, um teste ADCC in vitro, como descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337, pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, como divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Tipicamente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e desempenham função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos, com PBMCs e células NK sendo geralmente preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa destas, por exemplo, do sangue ou PBMCs, como descrito no presente pedido.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em uma realização, FcR é um FcR humano de seqüência nativa. Em uma realização, FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui as subclasses dos receptores FcyRI, FcyRI I e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similares de aminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes. Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático (analisado em Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et ai, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro, estão englobados pelo termo "FcR" no presente pedido.
Os termos "receptor Fc" ou "FcR" também incluem o receptorneonatal, FcRN, que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et ai, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regular a homeostase de imunoglobulinas. Métodos para medirligação ao FcRn são conhecidos (ver, por exemplo, Ghetie e Ward, Immunol Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et ai, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et ai, J. Bioi Chem 279(8):6213-6216 (2004); e documento WO 2004/92219 (Hinton et ai).
Ligação ao FcRn humano in vivo e meia-vida do soro depolipepídeos de ligação com alta afinidade ao FcRn humano podem ser testados, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas, nos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. O documento WO 00/42072 descreve anticorpos variantes com ligação aos FcRs melhoradas ou reduzidas. Ver, também, por exemplo, Shields et al. J. Bioi Chem. 9(2): 6591-6604(2001).
"Citotoxicidade dependente de complemento" e "CDC" referem-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A via de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) à uma molécula complexa (por exemplo, um anticorpo) com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC pode ser realizado, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste, o que resulta em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação a um anticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidades picomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por processos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem maturação da afinidade por mistura de domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por:Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et ai, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) e Hawkins et al, J. Mol. Bioi 226:889-896 (1992).
Um "sítio de ligação de antígeno funcinal" de um anticorpo éaquele que é capaz de se ligar a um antígeno alvo. A afinidade de ligação ao antígeno do sítio de ligação de antígeno não é necessariamente tão forte quanto aquela do anticorpo parental a partir do qual o sítio de ligação de antígeno é derivado, mas a habilidade para se ligar ao antígeno deve ser mensurável usando-se qualquer um dos diversos métodos conhecidos para avaliação da ligação do anticorpo a um antígeno. Além disso, a afinidade de ligação de antígeno, de cada um dos sítios de ligação de antígeno de um anticorpo multivalente no presente pedido, precisa ser quantitativamente a mesma. Para os anticorpos multiméricos no presente pedido, o número de 15 sítios de ligação de antígeno funcionais pode ser estimado usando-se análise por ultracentrifugação. De acordo com este método de análise, diferentes proporções de antígeno alvo para anticorpo multimérico são combinadas e a média do peso molecular dos complexos é calculada, assumindo-se diferentes números de sítios de ligação funcionais. Estes valores teóricos são comparados aos valores experimentais atuais, obtidos com o objetivo de avaliar o número de sítios de ligação funcionais.
Um anticorpo que tem uma "característica biológica" de um dado anticorpo é aquele que possui uma ou mais características biológicas daquele anticorpo, que diferencia este anticorpo dos outros anticorpos que se ligam ao 25 mesmo antígeno. Com o objetivo de selecionar anticorpos que se ligam a um epitopo em um antígeno ligado por um anticorpo de interesse, um teste rotineiro de interbloqueio; como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), podeser realizado.
Uma "cadeia polipeptídica" é um polipeptídeo em que cada um dos domínios deste está unido a outro(s) domínio(s) por ponte(s) peptídicas, em oposição a interações não covalentes ou pontes bissulfeto.
Um "ligante flexível" no presente pedido refere-se a um peptídeoque compreende dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e fornece mais liberdade de rotaçãp para dois polipeptídeos (como duas regiões Fd) ligados através deste. Tal liberdade de rotação permite que dois ou mais sítios de ligação de antígeno unidos pelo ligante flexível acessem o(s) antígeno(s) de forma mais eficiente. Exemplos de seqüências peptídicas de Iigantes flexíveis incluem gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser e gly-gly-gly-ser.
Um "domínio de dimerização" é formado pela associação de pelo menos dois resíduos de aminoácidos (geralmente resíduos de cisteína) ou de pelo menos dois peptídeos ou polipeptídeos (que podem ter as mesmas seqüências ou diferentes seqüências de aminoácidos). Os peptídeos ou polipeptídeos podem interagir entre si através de associação(ões) covalente(s) ou não covalente(s). Exemplos de domínios de dimerização no presente pedido incluem uma região Fc1 uma região de dobradiça, um domínio CH3, um domínio CH4, um par CH1-CL1 uma "interface" modificada geneticamente com um "botão" e/ou "protuberância", como descrito na patente US 5.821.333, expressamente incorporada ao presente como referência, um zíper de Ieucine (por exemplo, um zíper de Ieucina jun/fos, ver Kostelney et ai, J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992); ou um zíper de Ieucina de levedura GCN4, um zíper de isoleucina, um par de dímeros receptores (por exemplo, receptor interleucina-8 (IL-8R) e heterodímeros de integrina, como LFA-1 e GPIIIb/llla), ou a(s) região(ões) de dimerização destes; polipeptídeos Iigantes diméricos (por exempl, fator de crescimento do nervo (NGF), neurotrofina-3 (NT-3), interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), membrosVEGF-C1 VEGF-D1 PDG, e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ver Arakawa et al. J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994) e Radziejewski et al. Biochem. 32(48): 1350 (1993)), ou a(s) região (ões) de dimerização deste, um par de resíduos de cisteína capazes de formar uma ponte bissulfeto, um par de peptídeos ou polipeptídeos, cada um destes compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína (por exemplo, de cerca de um, dois ou três a cerca de dez resíduos de cisteína), de forma que tais pontes bissulfeto possam ser formadas entre os peptídeos ou polipeptídeos (deste ponto em diante no presente pedido "uma dobradiça sintética) e domínios variáveis do anticorpo. O domínio de dimerização preferido no presente pedido é uma região Fc ou uma região de dobradiça.
A frase "estimular a proliferação de uma célula" abrange a etapa de aumento da extensão de crescimento e/ou reprodução da célula, relativo a uma célula não tratada ou uma célula tratada reduzida, tanto in vitro como in vivo. Um aumento na proliferação celular na cultura celular pode ser detectado pela contagem do número de células, antes e após exposição a uma molécula de interesse. A extensão da proliferação pode ser quantificada via exame microscópico do grau de confluência. A proliferação celular também pode ser quantificada usando-se testes conhecidos na técnica, por exemplo, teste de incorporação de timidina e testes comercialmente disponíveis. A frase "inibir a proliferação de uma célula" abrange a etapa de aumento de redução da extensão de crescimento e/ou reprodução da célula, relativo a uma célula não tratada ou uma célula tratada reduzida, tanto in vitro como in vivo. Pode ser quantificada conforme descrito acima.
"Sujeito" para os propósitos de tratamento refere-se a qualqueranimal. Geralmente, o animal é um mamífero. "Mamífero" para os propósitos de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, de zoológico, paraesportes, ou animais de estimação, como cachorros, cavalos, gatos, gado, ovelhas, porcos, etc. Tipicamente, o mamífero é humano.
Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e/ou 5 consecutiva, em qualquer ordem.
O termo "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade de uma droga efetiva para tratar uma doença ou disfunção em um sujeito. No caso de doença renal, a quantidade efetiva da droga pode reduzir os sintomas, diminuir ou eliminar a doença.
"Tratamento" refere-se a ambos os tratamentos, terapêutico eprofilático, ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles já com a doença, bem como aqueles em que a doença deve ser prevenida.
Uma "disfunção" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com uma molécula da invenção, por exemplo, ver as disfunções renais descritas no presente pedido. Isto inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõe o sujeito à disfunção em questão.
"Transfecção" refere-se ao recolhimento de um vetor de expressão por uma célula hospedeira, se quaisquer seqüências codificadoras são ou não expressas de fato. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos para os técnicos no assunto, por exemplo, CaPO4 e eletroporação. A transfecção correta é geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira.
"Transformação" refere-se à introdução de DNA em umorganismo, de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomal como por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita com o uso de técnicas padrão,apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio emprega cloreto de cálcio, conforme descrito por Cohen1 Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 69: 21101972 (1991); e Marks et al., J. Moi Biol. 53: 154 (1970), é geralmente usado para procariontes ou outras células que contenham barreiras substanciais na parede celular. Para células de mamíferos sem tais paredes celulares, o método de precipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)), é freqüentemente utilizado. Aspectos gerais de sistemas de transfecção de célula hospedeira foram descritos na patente US 4.399.216, emitida em 16 de agosto de 1983. Tranformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) e Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76: 3829 (1979). No entanto, outros métodos para introdução de DNA em células, como por microinjeção nuclear ou por fusão protoplástica, também podem ser usados.
Doença Renal
Um determinante crítico do acúmulo de matriz glomerular é o equilíbrio entre a síntese e a dissolução de ECM (ver, por exemplo, Schnaper, H. W. (1995). Balance between matrix synthesis and degradation: a determinant of glomerulosclerosis. Pediatr Nephrol 9, 104-111). Quando este equilíbrio é rompido, desenvolve-se uma disfunção renal. Por exemplo, glomeruloesclerose é um processo pelo qual o tecido glomerular normal funcional é substituído pelos depósitos acumulados da matriz extracelular (ECM). Exposições de longo prazo aos tratamentos atuais para glomeruloesclerose (por exemplo, esteróides, ciclosporina, etc) freqüentemente causa efeitos colaterais a diversos órgãos. Além disso, os tratamentos atuais não necessariamente interrompem ou revertem a progressão da doença, dessa forma, ainda exigindo tratamentos como diálise renal ou transplante de rim.
Doenças renais com infra-regulação do VEGF freqüentementeestá correlacionada com glomeruloesclerose e depósitos auto-imunes. Ver, por exemplo, Shulman, K., et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) is altered in manv qlomerular diseases. J Am Soc Nephrol 7:661-666 (1996a); Noguchi1 K., et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998); Shulman, K., et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) is altered in manv qlomerular diseases. J-Am-Soc-Nephrol 7:661-666 issn: 1046-6673 (1996b); Wada, Y., et al. (2002). Impairment of vascular regeneration precedes progressive glomerulosclerosis in anti-Thy 1 glomerulonephritis. Kidney Int 61:432-443); e Yuan, H. T., et al. (2002). Angiopoietin correlates with glomerular capillary Ioss in anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. Kidney Int 61:2078-2089).
O pedido descreve uma função do VEGF-A e do VEGFR em células renais durante o desenvolvimento renal. A interferência em tais funções induz glomeruloesclerose em camundongos. A invenção fornece métodos para tratamento da condição renal patológica em um sujeito com um modulador do VEGFR. A frase "condição renal patológica" é usada alternadamente com "disfunção do rim", "doença no rim" ou "doença renal" para indicar qualquer anomalia estrutural ou funcional no rim. Um modulador do VEGFR inclui, mas não se limita a um Iigante do VEGFR, por exemplo, VEGF (A, B, C, D e/ou E), um agonista do Flt-1 (por exemplo, um VEGF variante seletivo para Flt, VEGF-B, PIGF), anticorpos agonistas do VEGFR, moléculas pequenas agonistas do VEGFR, etc., que podem ser um terapêutico para tratamento de doença renal, por exemplo, doença renal inflamatória, glomeruloesclerose, etc. Em certas realizações, a doença renal é causada por uma infecção. Em certas realizações, o sujeito está sendo tratado para a doença renal com outros agentes, por exemplo, esteróides, ciclosporina, etc.).Em certas realizações da invenção, uma quantidade efetiva de um agonista do Fltl é administrado a um sujeito para tratar a condição renal patológica. Em uma realização da invenção, um agonista do KDR ou outro fator angiogênico pode ser administrado em combinação com um agonista do Fltl1 por exemplo, em uma proporção mais baixa do que Flt1, a qual possa resultar em máximo benefício terapêutico, pelo fornecimento de estímulo à angiogênese. Em certas realizações da invenção, um agonista do KDR ou outro fator angiogênico pode ser administrado em combinação com um agonista do Fltl, por exemplo, em uma proporção mais alta ou igual, em relação a Flt1. Em outra realização, um VEGF variante que preferencialmente ativa Flt-1 versus KDR pode ser usado para combinar características mais favoráveis de segurança e eficácia. Em certas realizações, o VEGF é administrado em combinação com um agonista do Flt1.
Tratamento da condição renal patológica pode ser avaliado pelos 1técnicos no assunto, por exemplo, por análise histológica e imunocitoquímica, análise de urina, por exemplo, nitrogênio da uréia sangüínea (B.U.N), creatina no soro, etc, pela medição da pressão arterial média, etc. Em certas realizações da invenção, a doença renal inflamatória é caracterizada por um tratamento e é avaliada pelas alterações nas células inflamatórias, deposições do complexo imune, por exemplo, deposição de IgM ou ativação de complemento em glomérulos afetados, por exemplo, ativação de C1q, C3 e C4. Em certas realizações da invenção, a doença renal compreende alterações nas células mesangiais renais, por exemplo, uma redução nos níveis do VEGF, ao mesmo tempo em que o tratamento teria um efeito contrário. Em certas realizações da invenção, a glomerulonefrite é determinada e o tratamento é avaliado pela medição da proteinúria, esclerose glomerular, hipertensão ou uma combinação destes. Também pode ser avaliada pela determinação da sobrevida das células renais, por exemplo, células mesangiais renais,expressão gênica da síntese da ECM ou degradação da matriz. Em tais casos, a glomerulonefrite pode ser determinada pela sobrevida reduzida das células mesangiais renais, um aumento na expressão gênica da síntese da ECM, uma redução na degradação da matriz ou uma combinação destes, ao mesmo tempo em que o tratamento teria efeitos contrários.
Composições Da Invenção E Sua Produção
A invenção refere-se ao uso de vários agentes capazes de modular as atividades no rim do VEGFR, por exemplo, VEGFR-1 and VEGFR-2. O termo "agente" ou alternativamente "composto", como usado no presente pedido, refere-se amplamente a qualquer substância com estrutura molecular e propriedade fisioquímica identificável. Exemplos não Iimitantes de agentes capazes de modular as atividades do VEGFR incluem anticorpos, proteínas, peptídeos, glicoproteínas, glicopeptídeos, glicolipídeos, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucléicos, moléculas bio-orgânicas, peptidomiméticos, 15 agentes farmacológicos e seus metabólitos, seqüências controle de transcrição e tradução e similares.
Os agentes moduladores do VEGFR englobados pela invenção podem ser também um agonista de um VEGFR. Por exemplo, um agonista do VEGFR pode ser um Iigante do fator de crescimento (por exemplo, VEGF, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF E, PIGF1 etc. (typically, VEGF, VEGF B e/ou PIGF)) ou um anticorpo que se liga ao domínio extracelular do VEGFR e aciona sua atividade sinal de transdução. Alternativamente, um agonista do VEGFR pode ser um composto de molécula pequena que se liga ao domínio citoplasmático do VEGFR e media sua fosforilação de tirosina. Em uma realização, o agonista da invenção é "seletivo" ou"específico" para Flt-1, isto é, modula, exclusivamente ou preferencialmente Flt-1 em relação a outros receptores tirosina quinase, como KDR. Em outra realização, o agonista da invenção é "seletivo" ou "específico" para KDR, isto é,modula, exclusivamente ou preferencialmente KDR em relação a outros receptores tirosina quinase, como Flt-1. Em um aspecto, o agonista do VEGFR da invenção compreende um polipeptídeo VEGF variante capaz de se ligar seletivamente ao Flt-1 (denominado deste ponto em diante de "VEGF variante seletivo para Flt-1" ou "Flt1-sel" ou "Flt1Sei"). Em um aspecto, o agonista do VEGFR é VEGF-B ou PIGF, que se liga seletivamente ao Fltl.
Flt-sel e métodos para fabricar o mesmo são conhecidos e estão descritos na seção de Exemplos abaixo. Divulgações adicionais relacionadas ao Flt-sel podem ser encontradas em, por exemplo, publicação PCT documento WO 00/63380 e Li et ai J. Biol. Chem. 275:29823-29828 (2000). Em certas realizações da invenção, Flt-sel variantes incluem uma ou mais mutações de aminoácidos e exibem afinidade de ligação para o receptor Flt-1 que é igual ou maior (>) do que a afinidade de ligação do VEGF nativo para o receptor Flt-1, e até mais preferencialmente, tais VEGF variantes exibem menor afinidade de ligação (<) para o receptor KDR do que a afinidade de ligação exibida pelo VEGF ou KDR nativo. Quando a afinidade de ligação de tal VEGF variante para o receptor Flt-1 é aproximadamente igual (inalterada) ou maior que (aumentada), quando comparada ao VEGF nativo, e a afinidade de ligação do VEGF variante para o receptor KDR é menor que ou quase eliminada, quando comparada ao VEGF nativo, a afinidade de ligação do VEGF variante, para os propósitos no presente pedido, é considerada "seletiva" para o receptor do Flt-1. Em uma realização da invenção, uma VEGF variante seletivo para Flt-1 da invenção terá pelo menos 10 vezes menos afinidade de ligação para o receptor KDR (quando comparado ao VEGF nativo) e até mais preferencialmente, terá pelo menos 100 vezes menos afinidade de ligação ao receptor KDR (quando comparado ao VEGF nativo). A afinidade de ligação respectiva do VEGF variante pode ser determinada por testes ELISA, RIA e/ou Biacore, conhecidos na técnica e descritos na publicação PCT documento WO00/63380.
Em alguns aspectos da invenção, vários métodos para o tratamento do rim, ainda compreende a administração de um agente capaz de modular as atividades de KDR. Por exemplo, um agonista de KDR pode ser administrado em combinação com um agonista de Flt-1 para tratar a doença renal. KDR foi identificado como principal receptor tirosina quinase, que media as atividades do VEGF na proliferação celular endotelial.
Em um aspecto, o agonista de KDR compreende VEGF (bem como VEGF-C ou VEGF-D) ou um polipeptídio VEGF variante capaz de se ligar 10 seletivamente ao KDR (denominado a partir deste ponto de "VEGF variante seletivo para KDR", "KDR-sel" ou "KDRsei"). Os VEGF KDR-sei variantes e os métodos de fabricação dos mesmos estão descritos em detalhes, por exemplo, na publicação PCT documento WO 00/63380 e Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823-29828 (2000). Em uma realização, o KDR-sel inclui um ou mais mutações de aminoácidos e exibe afinidade de ligação ao receptor KDR, que é maior ou igual (>) que a afinidade de ligação de VEGF nativo ao receptor KDR e até mais preferencialmente, os VEGF variantes exibem menor afinidade de ligação (<) para o receptor de Flt-1 do que a afinidade de ligação exibida pelo VEGF nativo ao Flt-1. Quando a afinidade de ligação de tal VEGF variante ao receptor KDR é aproximadamente igual (invariável) ou maior que (aumentada), quando comparada ao VEGF nativo e a afinidade de ligação do VEGF variante ao receptor Flt-1 é menor que ou quase nula, quando comparada ao VEGF nativo, a afinidade de ligação ao VEGF variante, para os propósitos no presente pedido, é considerada "seletiva" para o receptor KDR. Em uma 25 realização da invenção, um KDR-sel da invenção terá pelo menos 10 vezes menos afinidade de ligação ao receptor Flt-1 (quando comparado ao VEGF nativo) e até mais preferencialmente, terá pelo menos 100 vezes menos afinidade de ligação ao receptor Flt-1 (quando comparada ao VEGF nativo). Aafinidade de ligação respectiva do VEGF variante pode ser determinada por testes ELISA, RIA e/ou Biacore1 que são conhecidos na técnica. Em uma realização da invenção, uma KDR-sel da invenção também exibirá atividade em testes KIRA que refletem a capacidade para induzir a fosforização do receptor KDR. Em uma realização da invenção, os VEGF variantes seletivos para KDR da invenção, adicionalmente ou alternativamente induzirão a proliferação de célula endotelial (que pode ser determinado por métodos conhecidos, como o teste de proliferação HUVEC).
Em um aspecto, os agentes moduladores do VEGFR da invenção são produzidos por métodos recombinantes. Entende-se no presente pedido que o DNA isolado usado nesses métodos seja um DNA sintetizado quimicamente, cDNA, DNA cromossomal ou extracromossomal com ou sem as regiões flanqueadoras 3' e/ou 5'. Em certas realizações da invenção, os agentes moduladores do VEGFR são fabricados pela síntese em cultura celular recombinante.
Para tal síntese, um ácido nucléico que codifica um VEGF1 VEGFR ou variantes destes é necessário. O DNA que codifica uma molécula VEGF pode ser obtido a partir das células foliculares hipofisárias, por exemplo, células foliculares hipofisárias bovinas, por (a) preparação de uma biblioteca de DNA a partir dessas células, (b) análise da condução da hibridização com DNA marcado que codifica o VEGF ou fragmentos destes (até ou mais de 100 pares de bases de comprimento) para detectar clones na biblioteca contendo seqüências homólogas e (c) análise dos clones pela análise da enzima de restrição e seqüenciamento de ácido nucléico para identificar clones completos.
Se clones completos não estão presentes em uma biblioteca de cDNA, então fragmentos apropriados podem ser recuperados de vários clones usando-se a informação da seqüência de ácido nucléico divulgada no presente pedido para a primeira vez e ligado a sítios de restrição comuns aos clones para montar umclone completo codificador do VEGF. De maneira alternativa, as bibliotecas genômicas fornecerão o DNA desejado. Uma vez que o DNA foi identificado e isolado da biblioteca, é ligado em um vetor replicável para, além disso, clonagem e expressão.
Em um exemplo de um sistema de expressão recombinante, umpolipeptídio da invenção, por exemplo, um gene que codifica o VEGF etc., é expresso em um sistema celular pela transformação com um vetor de expressão que compreende o DNA codificador, por exemplo, do VEGF. Em certas realizações da invenção, é preferível transformar as células hospedeiras capazes de realizar tal processamento de forma a se obter o polipeptídio no meio de cultura ou periplasma da célula hospedeira, isto é, obter uma molécula secretada.
Em alguns aspectos da invenção, o agonista do Flt-1 compreende um fator de crescimento que se liga seletivamente e ativa o Flt-1. Vários homólogos do VEGF de ocorrência natural que se ligam especificamente ao Flt-1, mas não ao KDR foram identificados, incluindo sem limitação, o fator de crescimento placentário (PIGF) e VEGF-B. O PIGF tem uma seqüência de aminoácido que compartilha 53% de identidade com o domínio do VEGF semelhante ao fator de crescimento derivado de plaquetas. Park et al. J. Biol. Chem. 269:25646-54 (1994); Maglione et al. Oncogene 8:925-31 (1993). Como com o VEGF, diferentes espécies de PIGF surgem a partir do splicing alternativo de mRNA, e a proteína existe em forma dimérica. Ver, por exemplo, Park et al., acima. Tanto PIGF-1 como PIGF-2 se ligam ao Flt-1 com alta afinidade, mas não são capazes de interagir com KDR. Ver, por exemplo, Park et al., acima.
O VEGF-B é produzido como duas isoformas (167 e 185 resíduos) que também parecem se ligar especificamente ao Flt-1. Pepper et al. Proc. Nati Acad. Sei. USA 95:11709-11714 (1998). Semilar às formas longasdo VEGF1 o VEGF-B é expresso como uma proteína de membrana, que pode ser liberada na forma solúvel após adição de heparina. O VEGF-B e o VEGF também são capazes de formar heterodímeros, quando co-expresso. Olofsson etal. Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:2576-2581 (1996).
Os compostos úteis na invenção incluem pequenas moléculasorgânicas que exercem suas funções moduladoras no domínio intracelular tirosina quinase de RTKs. Em certas realizações preferidas, pequenas moléculas agonistas são empregadas para estimular a fosforização da tirosina, através disto a ativação da via de sinalização correspondente.
Os compostos úteis na invenção incluem os anticorpos agonistas.
Os anticorpos da invenção presente são tipicamente específicos contra um receptor (como Flt-1). Em certas realizações da invenção, anticorpos da invenção incluem anticorpos Flt-1. Em uma realização da invenção, o anticorpo anti-Flt-1 se liga seletivamente e modula Flt-1, sem afetar a função de KDR. Em uma realização da invenção, o anticorpo anti-FItl é um anticorpo agonista.
Usos
A invenção fornece método para tratamento de doença renal, por exemplo, por promoção da sobrevida de célula mesangial pela administração de uma quantidade efetiva de agonistas de VEGFR. Os efeitos da promoção da sobrevida da invenção podem ser avaliados tanto in vitro como in vivo, usando-se métodos conhecidos na técnica e aquelas descritos no presente pedido. Por exemplo, a indução da síntese de colágeno pode ser avaliada (ver, por exemplo, Amemiya, T., et ai. Vascular endothelial qrowth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)) e a produção de oxido nítrico pode ser monitorada (ver, por exemplo, Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide produetion bv cultured rat mesangialcells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998)). A proliferação celular é avaliada durante a cultura usando-se métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, medida da proporção de síntese de DNA1 contagem de exclusão/hemacitômetro por coloração de trypan blue ou citometria de fluxo. Ver também, por exemplo, Onozaki, A., et al. Rapid chanqe of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione. Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004).
Em um aspecto, a invenção fornece métodos de uso de agonistas do VEGFR para supra-regular ou infra-regular a expressão gênica de fatores que são importantes nas atividades regulatórias do rim, por exemplo, Tabela 2. Os métodos e técnicas para detectar os níveis de expressão do mRNA ou de proteína em células/tecidos alvos são conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, o nível de expressão gênica pode ser detectado por testes de 15 hibridização de ácido nucléico conhecidos, usando-se sondas capazes de hibridizar a polinucleotídeos, sob condições adequadas para a hibridização e subseqüente detecção e medição Os métodos úteis para a detecção de expressão gênica incluem, mas não se limitam a hibridização por southern (Southern J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)), hibridização por northern (ver, por exemplo, Freeman et al. Proc. Nati Acad. Sei. USA 80:4094-4098 (1983)), mapeamento de endonuclease de restrição (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), os testes de proteção de RNase (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova York, 1997), a análise da seqüência de DNA e a reação de amplificação em cadeia da polimerease (PCR; patentes US 4.683.202, 4.83.195 e 4,889,818; Gyllenstein et al. Proc Nati Acad. Sei. USA 85:7652-7657 (1988); Ochman et al. Genetics 120:621-623 (1988); e Loh et ai Science 243:217-220 (1989) seguido pela hibridização por Southern comsondas específicas para o gene, em vários tipos celulares. Outros métodos de amplificação comumente conhecidos na técnica podem ser empregados. A estringência das condições de hibridização para análises de northen ou Southern blot podem ser manipuladas para assegurar a detecção de ácidos nucléicos com o grau desejado de relações para as sondas específicas utilizadas. A expressão do gene em uma amostra de célula ou tecido também pode ser detectada e quantificada usando-se as técnicas de hibridização in situ, de acordo com, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova York, 1997.
Os níveis de proteína podem ser detectados por imunoensaiosusando-se anticorpos específicos para a proteína. Vários imunoensaios conhecidos na técnica podem ser usados, incluindo, mas não se limitando a sistemas de teste competitivo e não competitivo usando-se técnicas como radioimunoensaio, ELISA (teste imunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduíche", testes imunoradiométricos, reações de precipitina de difusão em gel, testes de imunodifusão, imunoensaios in situ (usando-se ouro coloidal, marcadores enzimáticos ou radioisótopos), análise western blot, reações de precipitação, testes de aglutinação (por exemplo, ensaios de aglutinação em gel, teste de aglutinação), testes de fixação complementar, testes de imunofluorescência, testes de proteína A, testes de imununoeletroforese etc. Em uma realização, a ligação do anticorpo é detectada pela detecção de um marcador sobre o anticorpo primário. Em outra realização, o anticorpo primário é detectado pela detecção da ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário. Em uma realização adicional, o anticorpo secundário é marcado. Muitos meios são conhecidos na técnica para detecção da ligação em um imunoensaio e estão dentro do escopo da presente invenção.
Anticorpos
Anticorpos da invenção incluem anticorpos anti-VEGFR oufragmentos do VEGFR de ligação de antígeno, ou outros anticorpos descritos no presente pedido. Anticorpos exemplares incluem, por exemplo, anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, fragmentos, multiespecíficos, heteroconjugados, multivalentes, de função efetora, etc. Em certas realizações 5 da invenção, o anticorpo é um anticorpo agonista.
Anticorpos Policlonais Os anticorpos da invenção podem compreender anticorpos policlonais. Métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos para os técnicos no assunto. Por exemplo, anticorpos policlonais contra VEGFR são cultivados em animais por múltiplas injeções, subcutânea (sc) ou intraperitonial (ip) com antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa californiana, soro de albumina, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, usando-se um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de sulfosuccinimida maleimidobenzoil (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidróxisuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR1 onde R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra VEGFR, conjugados 20 imunogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou pg de proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou conjugado em adjuvante 25 completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a quatorze dias depois, os animais são sangrados e o soro é analisado por titulação de anticorpo. Os animais são estimulados até a titulação platô. Tipicamente, o animal é estimulado com o conjugado do mesmo antígeno, masconjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente reticulante diferente. Conjugados também podem ser feitos na cultura celular recombinante como fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação como alúmen são usados adequadamente para aumentar a resposta imune.
Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando-se o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et ai, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser fabricados por métodos de DNA recombinante (patente US 4.816.567).
No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, como hamster ou macaco macaque, é imunizado da forma como descrito acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligar especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células de mieloma, usando-se um agente de fusão apropriado, como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura adequado, que contém tipicamente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contêm a enzima hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.
Células de mieloma típicas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio, como meio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas são as linhagens de mieloma murino, como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e SP-2 ou células X63-Ag8-653 disponíveis pela Coleção Americana de Tipos de Cultura, Rockville, Maryland, EUA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).
O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra VEGFR. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Tais técnicas e testes são conhecidos. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Bioehem., 107:220 (1980).
Após células de hibridoma serem identificadas para produção de anticorpos com especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitantes e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). O meio de cultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro, por procedimentos de purificação de imonuglobulina convencionais, como por exemplo, proteína A Sefarose, cromatografia sobre hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálises ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, como aqueles descritos na patente US 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que em seguida são transfectados em células hospedeiras, como células E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína da imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos será descrita em maiores detalhes abaixo:
Em outra realização, anticorpos ou fragmentos de anticorpospodem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos, geradas com o uso de técnicas descritas em McCafferty et ai, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et aí., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando-se bibliotecas de fago. Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (variação de nM) por meio de mistura de cadeias (Marks et ai, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, comoestratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et ai, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Dessa forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pelasubstituição das seqüências de domínio constante das cadeias humanas, leve e pesada, no lugar das seqüências homólogas de murino (patente US 4.816.567; Morrison, et ai, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou pela união covalente à seqüência que codifica a imunoglobulina de toda ou parte da 10 seqüência codificadora para um polipeptídeo não-imunoglobulina.
Tipicamente, tais polipeptídeos não-imunoglobulina são substituídos pelo domínio constante de um anticorpo, ou são substituídos pelo domínio variável de um sítio de combinação de um anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno diferente.
Anticorpos Humanizados E Humanos Anticorpos da invenção podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos a partir de uma fonte não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente chamados de resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores ((Jones et ai, Nature, 25 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de CDRs ou seqüências CDR de roedores, por seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, t ais anticorpos "humanizados" sãoanticorpos quiméricos (patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A escolha de domínios variáveis humano, tanto leve como pesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o método também conhecido como "melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em relação à biblioteca completa das seqüências de domínio variável humana conhecida. A seqüência humana mais próxima daquela do roedor é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et ai, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada a partir da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico da cadeia leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et ai, J. Immunol., 151:2623 (1993)).
É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método típico, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais, usando-se modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais da imunoglobulina estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles técnicos no assunto. Programas de computador queilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional das seqüências de imunoglobulina candidata selecionada estão disponíveis. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de 5 resíduos que influenciam na habilidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e de seqüências importadas, de forma que as características desejadas do anticorpo, como o aumento de afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s), sejam atingidas. Em geral, os resíduos CDR são 10 diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antígeno.
Alternativamente, é agora possível se produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na 15 ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (Jh) da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes e quiméricos de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do conjunto de gene de imunoglobulina da linhagem germinativa 20 humana em tais linhagens germinativas de camundongo mutante resultará na produção de anticorpos humanos, mediante desafio com antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et ai, Year in Immuno., 7:33 (1993) e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Anticorpos humanos podem ser derivados de bibliotecas de exibição por fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et ai, J. Mol. Bioi1 222:581 (1991)); Vaughan et ai Nature Biotech 14:309 (1996)).
Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando-sevárias técnicas conhecidas, incluindo bibliotecas de exibição por fago (Hoogenboom e Winter1 J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et ai, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados em quadro, tanto em um gene de proteína de revestimento maior como menor, de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA fita simples do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Dessa forma, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. A exibição por fago pode ser realizada em uma série de formatos; analisados em, por exemplo, Johnson, K.S. e Chiswell, David J., Cur. Opin. in Struct. Biol. 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição por fago. Por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V, derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados, seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, também, patentes US 5.565.332 e 5.573.905. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) e Boernerefa/., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). Anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas in vitro (ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).Fragmentos De Anticorpos
Fragmentos de anticorpos estão também incluídos na invenção. Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 2 4:107-117 (1992) e Brennan et ai, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab-SH podem ser recuperados diretamente a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/07378 , patente US 5.571.894 e patente US 5.587.458. Fv e sFv são os únicos tipos com sítios de combinação intactos desprovidos de regiões constantes, então, eles são adequados para ligação não específica reduzida durante o uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora, tanto na terminação amina como carboxila de um sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, acima. Os fragmentos de anticorpos também podem ser um "anticorpo linear", por exemplo, descritos na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.
Anticorpos Multiespecíficos (Por exemplo, Biespecíficos)
Os anticorpos da invenção também incluem, por exemplo,anticorpos biespecíficos, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Enquanto tais moléculas normalmente se ligam somente a dois antígenos (isto é, anticorpos biespecíficos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais, como anticorpos triespecíficos, são incluídos por esta expressão, quando usados no presente pedido. Exemplos de BsAbs incluem aqueles com um braço dirigido contra um antígeno da célula e o outro braço dirigido contra uma molécula de acionamento citotóxico, anti-FcYRI/anti-CD15, anti-p 185HER2/FcyRI11 (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-célula de carcinoma renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de cólon), anti-CD3/anti-análogo de hormônio estimulante de melanócito, receptor anti-EGF /anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adesão de célula neural (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de ligação de folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno associado a pan carcinoma (AMOC- 31)/anti-CD3; BsAbs com um braço que se liga especificamente a um antígeno em uma célula e um braço que se liga a uma toxina como anti-saporina/anti-ld-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadeia A de ricina, anti-interferon-a(IFN-a)/antiidiotipo de hibridoma, anti-CEA/anti-alcalóide da vinca; BsAbs para pró-drogas ativadas por enzima de conversão como anti-CD30/anti-fosfatase alcalina (que catalisa conversão da pró-droga fosfato de mitomicina em miomicina); BsAbs que podem ser usados como agentes fibrinolíticos, como anti-fibrina/anti-ativador plasminogênico de tecido (uPA); BsAbs para atingir complexos imunes para receptores de superfície celular, como anti-lipoproteína de baixa densidade (LDL)/anti-receptor Fc (por exemplo, FcyRI1 FcyRII ou FcyRIII); BsAbs para uso em terapia de doenças infecciosas como anti-CD3/anti-vírus herpes simplex (HSV), complexo anti-receptor de célula T:CD3/anti-influenza, anti-FcYR/anti-HIV; BsAbs para detecção de tumor in vitro ou in vivo, como anti-CEA/anti-EOTUBE1 anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185HER2/anti-hapteno; BsAbs adjuvantes de vacinas; e BsAbs como ferramentas diagnosticas como anti-lgG de coelho/anti-ferritina, anti-peroxidase de rábano silvestre (HRP)/anti-hormônio, anti-somatostatina/anti-substância P1 anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-β-5 galactosidase.Exemplos de anticorpos triespecíficos incluem, anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Em uma realização da invenção, um anticorpo biespecífico é um agonista de anti-FItl /anti-lntegrina a-8. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, 10 anticorpos biespecíficos F(ab')2).
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos completos é baseada na coexpressão de dois pares da cadeia leve e cadeia pesada da imunoglobulina, onde as duas cadeias possuem especificidades 15 diferentes (Millstein et ai, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à escolha aleatória das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada pelas etapas de 20 cromatografia de afinidade, é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação 25 de anticorpos e antígenos) são fundidos às seqüências de domínio constante da imunoglobulina. A fusão é, preferencialmente, com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constantede cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões da cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos do polipeptídeo em realizações onde razões desiguais das três cadeias do polipeptídeo utilizadas no constructo fornecem o máximo de rendimento. É possível, no entanto, inserir seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um único vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias do polipeptídeo em razões iguais resulta em altos rendimentos ou quando as razões não são de significância específica.
Em uma realização desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada da imunoglobulina híbrida com a primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia leve e pesada da imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado, a partir das combinações da cadeia da imunoglobulina indesejadas, pois a presença da cadeia leve da imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil para separação. Esta abordagem está descrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita no documento WO96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser modificada geneticamente para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interfacepreferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula do anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano).
"Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo de aumento de produção do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, como homodímeros.
As técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando-se ligações químicas. Brennan et aí., Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteolicamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação de bissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é então reconvertido em Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab1-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et aí., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula do anticorpo F(ab')2 biespecífico humanizado em sua totalidade. Cada fragmento Fab' foi secretadoseparadamente de Ε. coli e sujeitado ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor do VEGF e células T humanas normais, bem como acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos.
Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos, diretamente a partir de cultura celular recombinante, também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando-se zíper de leucina. Kostelny et ai, J. ImmunoI., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos do zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros do anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável da cadeia leve (Vl) por um Ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, através disto, formando dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et ai, J. Immunol., 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et ai, J.lmmunol. 147: 60 (1991).
Anticorpos Heteroconjugados Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados", que são anticorpos da invenção. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico a células indesejadas (patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/200373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e estão divulgados na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.
Anticorpos Multivalentes Anticorpos da invenção incluem um anticorpo multivalente. Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucléico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminal para a região Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente pedido compreende de (ou consiste de) três a cerca de oito, mais preferencialmente, quatro sítios de ligação de antígeno. O anticorpomultivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, sendo que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc1 X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e η é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreender: VH-CHI-Iigante flexível-VH-CH1-cadeia da região Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia da região Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente pedido, além disso, compreende pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. O anticorpo multivalente no presente pedido pode, por exemplo, compreender aproximadamente dois a oito polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve, aqui contemplados, compreendem um domínio variável da cadeia leve e, opcionalmente, também compreendem um domínio CL.
Engenharia De Função Efetora Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento da doença, por exemplo. Por exemplo, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc1 através disso, permitindo formação de ponte bissulfeto entre cadeias nesta região. O anticorpo homodimérico gerado dessa forma pode ter sua capacidade de internalização aumentada. Ver Caron et ai, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Para aumentar a meia vida de soro do anticorpo, pode-se incorporar um epitopo de ligação do receptor de resgate no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na patente US 5.739.277, por exemplo. Como usado no presente, o termo "epitopo de ligaçãodo receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar in vivo a meia vida de soro da molécula de IgG.
Outras Modificações Do Anticorpo
Outras modificações do anticorpo estão contempladas nopresente pedido. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo também pode ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas coloidais de distribuição de droga (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).
Lipossomos E Nanopartículas
Os polipeptídeos da invenção podem ser formulados em lipossomos. Por exemplo, os moduladores do VEGF da invenção podem ser formulados como imunolipossomos. Lipossomos contendo o polipeptídeo são preparados por métodos conhecidos na técnica, como descrito em Epstein et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980) e patentes US 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com aumento no tempo de circulação estão divulgados na patente US 5.013.556. Geralmente, a formulação e o uso de lipossomos são conhecidos pelos técnicos no assunto.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica quecompreende fosfatidicolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrudados através de filtros com tamanho de poro definido, para produzir Iipossomos com o diâmetro desejado. Um polipeptídeo da invenção pode ser conjugado aos lipossomos, como descrito em Martin et 5 al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) (por exemplo, fragmentos Fab' de um anticorpo) via uma reação de troca de bissulfeto. Nanopartículas ou nanocápsulas também podem ser usadas para capturar os polipeptídeos da invenção. Em uma realização, nanopartículas biodegradáveis de polialquil-cianocrilato podem ser usadas com os polipeptídeos da invenção.
Outros Usos
Os anticorpos anti-VEGFR têm várias utilidades. Por exemplo, anticorpos anti-VEGFR podem ser usados em testes dignósticos, para VEGFR ou fragmentos de VEGFR, por exemplo, detecção de sua expressão em células específicas, tecidos ou soro, para detecção de doença, por exemplo, das 15 disfunções descritas no presente pedido, etc. Em uma realização, anticorpos VEGFR são usados para selecionar a população de pacientes para tratamento com os métodos fornecidos no presente pedido. Várias técnicas para testes disgnósticos conhecidos podem ser usadas, como testes de ligação competitiva, testes sanduíche, diretos ou indiretos, e testes de 20 imunoprecipitação conduzidos tanto nas fases heterogêneas como homogêneas (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) páginas 147-158). Os anticorpos usados nos testes disgnósticos podem ser marcados com um componente detectável. O componente detectável seria capaz de produzir, tanto diretamente como 25 indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, o componente detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P1 35S, ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano silvestre. Qualquer método conhecido na técnica para conjugação do anticorpo ao componente detectável pode ser empregado, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. lmmunol. Meth., 40:219 (1981) e Nygren1 J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982).
Anticorpos anti-VEGFR também são úteis para a purificação de afinidade de VEGFR a partir de cultura celular recombinante ou fontes naturais. Neste processo, os anticorpos contra VEGFR são imobilizados em um suporte adequado, como resina Sephadex ou filtro de papel, usando-se métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é então contatado com uma amostra contendo o VEGFR a ser purificado e, posteriormente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material da amostra, exceto o VEGFR a ser purificado, que é ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, que irá liberar o VEGFR do anticorpo.
Vetores. Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes
Os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos de forma recombinante, usando-se técnicas e materiais facilmente obtidos.
Para produção recombinante de um polipeptídeo da invenção, porexemplo, um agente modulador do polipeptídeo VEGFR, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicante para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o polipeptídeo da invenção é facilmente isolado e seqüenciado, usando-se procedimentos convencionais. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é isolado e seqüenciado, por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Muitos vetores estão disponíveis. Os componentesdo vetor geralmente incluem, mas não se limitam a um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, um promotor e uma seqüência de terminação de transcrição.
Componente Seqüência Sinal
Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como uma fusão do polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N- terminal da proteína ou polipeptídeo maduro. A seqüência sinal heteróloga selecionada, tipicamente, é aquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e não processam a seqüência sinal do polipeptídeo, a seqüência sinal é substituída por uma seqüência sinal selecionada de procarionte, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes enterotoxina Il estáveis ao calor. Para secreção em levedura, a seqüência sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, por um líder invertase da levedura, líder fator α (incluindo Saccharomyces e líderes fator α Kluyveromyces), ou líder fosfatase ácida, o líder glucoamilase C. albicans, ou o sinal descrito no documento WO 90/13646. Na expressão em células de mamíferos, a seqüência sinal de mamíferos, bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.
O DNA para tal região precursora é ligado no quadro de leitura ao DNA que codifica o polipeptídeo da invenção.
Componente Origem De Replicação Ambos, vetores de expressão e vetores de clonagem contêm uma seqüência de ácido nucléico que permite a replicação do vetor em uma ou maiscélulas hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, esta seqüência é aquela que permite a replicação do vetor independentemente do DNA cromossomal do hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüências replicantes independentes. Tais seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídio pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídio 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode, tipicamente, ser usada somente porque esta contém o promotor inicial).
Seleção Do Componente Gene Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também chamado de marcador selecionável. A seleção típica de genes codifica proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.
Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga parainterromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células, que são sucessivamente transformadas com um gene heterólogo, produzem uma proteína que confere resistência à droga e, dessa forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para as células de mamíferos são aqueles capazes de identificar células competentes para ocupar o ácido nucléico do anticorpo, como DHFR1 timidina quinase,metalotioneína-l e II, tipicamente, genes da metalotioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.
Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DHFR são as primeiras identificadas pelo cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx)1 um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR tipo selvagem é empregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês (CHO), deficiente na atividade de DHFR.
Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codificam um polipeptídeo da invenção, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável, como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (ΑΡΗ), podem ser selecionadas pelo crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável, como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Ver patente US 4.965.199.
Uma gene de seleção adequado para uso em leveduras é o gene frpl, presente no plasmídio de levedura YRp7 (Stinchcomb et ai, Nature, 282:39 (1979)). O gene frpl fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante desprovida da habilidade de crescimento em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 Jones1 Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura então fornece um ambiente efetivo para detecção da transformação pelo crescimento na ausência de triptofano. De maneira similar, linhagens de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que produzem o gene Leu2.
Além disso, vetores derivados do plasmídeo pKD1 circular de 1,6 μm podem ser usados para transformação de leveduras Kluyveromuces.Alternativamente, um sistema de expressão para produção em grande escala de bezerro chymosin foi relatado por K.lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vetores de expressão multi-cópias, estáveis para secreção de albumina do soro humano recombinante madura por linhagens industriais de Kluyveromyces, foram também divulgados. Fleer et ai, Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
Componente Promotor
Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operacionalmente ligado ao ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da invenção. Promotores adequados para o uso em hospedeiros procariontes incluem o promotor phoA, β-lactamase e os sistemas promotores lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridos, como o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também irão conter uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptídeo da invenção.
Seqüências promotoras são conhecidas para eucariontes. Virtualmente, todos os genes eucariontes têm uma região rica em AT1 localizada aproximadamente de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes está uma seqüência AATAAA, que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas estas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão de eucariontes.
Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso emleveduras hospedeiras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis que possuem vantagens adicionais de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, iso-citocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativa associada com metabolismo 10 do nitrogênio, metalotionein, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose . Vetores e promotores adequados para uso na expressão em levedura estão também descritos na patente EP 73.657. Enhancers de levedura usados com promotores de levedura são também vantajosos.
A transcrição de polipeptídeos da invenção a partir de vetores emcélulas hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus, como vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e vírus Simian 40 (SV40), promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor imunoglobulina, promotores de choque térmico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
Os promotores iniciais e finais do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40, que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em mamíferos hospedeiros, usando-se o vírus de papiloma bovino como um vetor, édivulgado na patente US 4.419.446. A modificação deste sistema está descrita na patente US 4.601.978. Ver também Reyes et ai, Nature 297:598-601 (1982) na expressão de cDNA de β-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor timidina quinase de vírus herpes simplex. Alternativamente, a repetição da terminação longa do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como promotor.
Componente Elemento Enhancer A transcrição de um DNA que codifica um polipeptídeo desta invenção por eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentada pela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüências enhancerde genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina) são agora conhecidas. Tipicamente, poderá ser usado um enhancer de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotor inicial do citomegalovírus, o enhancer do polioma no último lado da origem de replicação e enhancers de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) nos elementos enhancing para ativação de promotores de eucariontes. O enhancer pode ser unido no vetor na posição 5' ou 3' para a seqüência codificadora do polipeptídeo, mas está geralmente localizado em um sítio 5' do promotor.
Componente Terminação Da Transcrição
Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes (leveduras, fungos, insetos, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também irãoconter seqüências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilização do mRNA.
Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas de eucariontes 5' e, ocasionalmente 3', ou DNAs ou cDNAs virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o polipeptídeo da invenção.Um componente da terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver documento WO 94/11026 e o vetor de expressão divulgado no presente pedido.
Seleção E Transformação De Células Hospedeiras
Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão deDNA que codifica os polipeptídeos da invenção, nos vetores no presente pedido, incluem células procariontes, leveduras ou eucariontes superiores descritos acima. Procariontes adequados para este propósito incluem eubactérias, como organismos Gram-negativo ou Gram-positivo, por exemplo, Enterobacteriaceae, como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo., Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgadas em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, como P. aeruginosa e Streptomyces. Tipicamente, o hospedeiro E. coli para clonagem é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras linhagens, como E coli Β, E. co//X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Estes exemplos são mais ilustrativos do que limitantes.
Além de procariontes, micróbios eucariontes, como fungofilamentoso ou levedura são hospedeiros para clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam polipeptídeos da invenção. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de padaria, é o mais comumente usado entre os microorganismos hospedeiros eucariontes inferiores. No entanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e linhagens estão comumente disponíveis e são úteis no presente pedido, como Schizosaccharomyces pombe\ hospedeiros Kluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wiekeramii(ATCC 24.178), Κ. waltii (ATCC 56.500), Κ. drosophilarum (ATCC 36.906), Κ. thermotolerans, e K. manxianus: yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, como Schwanniomyces occidentalis e fungos filamentosos como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, como A. nidulans e A. Niger.
Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos glicosilados da invenção são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais 10 e de insetos. Muitas linhagens de baculovírus e variantes, e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de linhagens virais para transfecção está 15 publicamente disponível, por exemplo, variante L-1 de Autographa Califórnia NPV e linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o vírus no presente pedido de acordo com a invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser usadas como hospedeiros.
No entanto, o interesse em células de vertebrados tem aumentado, e a propagação de células na cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são as linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et ai, J. Gen Virol. 36:59 (1977))células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células ovarianas de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub etai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK1 ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai, Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima, para produção do polipeptídeo da invenção e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado, como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.
Cultura De Células Hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir polipeptídeos da invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Modificado de Eagle de Dulbecco ((DMEM), Sigma), meio de crescimento normal para células de rim, etc., são adequados para o cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. BiochemA02:255 (1980), patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, conforme necessário, com hormônios e/ou outros fatores decrescimento (como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidermal), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definidos como componentes inorgânicos usualmente presentes em concentração final na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário também pode ser incluído na concentração apropriada que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto.
Purificação De Polipeptídeo Quando se utilizam técnicas recombinantes, um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um agente modulador do polipeptídeo VEGFR pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático ou secretado diretamente em um meio. Polipeptídeos da invenção podem ser recuperadas do meio de cultura ou das células hospedeiras lisadas. Se ligado à membrana, pode ser liberado da membrana usando-se uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton-Xl 00) ou por clivagem enzimática. Células empregadas para expressão de um polipeptídeo da invenção podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, como ciclo de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico ou por agentes de Lise celular.
Pode ser desejado purificar o polipeptídeo da invenção a partir de proteínas ou polipeptídeos celulares recombinantes. Os procedimentos a seguir são procedimentos de purificação adequados exemplares: fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia de heparina, cromatografia em SEPHAROSE™ ou em resina de troca aniônica ou catiônica, (como uma coluna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.); chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel, por exemplo, Sephadex G-75, colunas de proteínas A Sefarose para remover contaminantes como IgG e colunas de metais quelados para ligar formas de polipeptídeos marcados da invenção aos epitopos. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes1 Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nova York (1982). As etapas de purificação selecionadas dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e o polipeptídeo específico da invenção produzido.
Por exemplo, uma composição de anticorpo preparada a partir de células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação típica. A adequação da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et ai, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de camundongo e para γ3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz para a qual o Iigante de afinidade é unido é freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, como vidro poroso controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno, permitem velocidades mais rápidas de fluxo e tempo de processamento mais curto do que aquele que pode ser atingido com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para purificação de proteína, por exemplo, aquelas indicadas acima, estão também disponíveis dependendo doanticorpo a ser recuperado. Ver também, Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992) que descreve um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E.coli.
Modificações Covalentes Para Polipeptídeos Da Invenção
Modificações covalentes de um polipeptídeo da invenção, porexemplo, um agente modulador do polipeptídeo VEGFR1 estão incluídas dentro do escopo desta invenção. Elas podem ser feitas por síntese química, por clivagem enzimática ou química do polipeptídeo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do polipeptídeo são introduzidos na molécula, pela reação de resíduos de aminoácidos alvo do polipeptídeo com um agente de derivação, que é capaz de reagir com as cadeias laterais ou com os resíduos N ou C terminais selecionados, ou pela incorporação de um aminoácido modificado ou aminoácido não natural na cadeia polipeptídica em crescimento, por exemplo, Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Noren et al. Science 244:182 (1989); e, pedidos de patente US 20030108885 e 20030082575.
Resíduos cisteinil, mais comumente, reagem com a-haloacetatos (e aminas correspondentes), como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para fornecer carboximetil ou derivados carboxiamidometil. Resíduos cisteinil também são derivados pela reação com bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-P-(5-imidozoi)propiônico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil bissulfeto, metil 2-piridil bissulfeto, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola.
Resíduos de histidina são derivados pela reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0, porque este agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Para-bromofenacil brometo também é útil, a reação é tipicamente realizada em 0,1 M de cacodilato de sódio em pH 6,0.Lisinil e resíuos amino-terminais reagem com anidridos de ácido carboxílico ou succínico. A derivação com estes agentes possui efeito de reversão de carga dos resíduos lisinil. Outros reagentes adequados para derivação de resíduos que contêm α-amino incluem imidoésteres, como metil picolinimidato, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenosulfônico, O-metilisouréia, 2,4-pentanediona e reação catalisada por transaminase com glioxilato.
Resíduos arginil são modificados pela reação com um dos diversos reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina exige que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos da Iisina como também o grupo arginina épsilon-amino.
A modificação específica de resíduos tirosil pode ser feita, com interesse específico na introdução de marcas espectrais nos resíduos tirosil pela reação com compostos aromáticos diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizola e tetranitrometano são usados para formar espécies O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente. Resíduos tirosil são tratados com iodo usando-se 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio.
Grupos laterais carboxila (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R-N=C=N-R'), onde ReR' são diferentes grupos alquil, como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos aspartil e glutamil são convertidos para resíduos asparaginil e glutaminil pela reação com íons amônio.
Resíduos glutaminil e asparaginil são freqüentemente deamidados para os resíduos glutamil e aspartil correspondentes,respectivamente. Estes resíduos são deamidados sob condições neutras ou básicas. A forma deamidada destes resíduos esta incluída dentro do escopo desta invenção.
Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina e cadeias laterais de histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, páginas 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente envolve glicosídeosacoplados, quimicamente ou enzimaticamente, a um polipeptídeo da invenção, por exemplo, um agente modulador do polipeptídeo VEGFR, etc. Estes procedimentos são vantajosos já que eles não necessitam de produção do polipeptídeo em uma célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação N ou O-ligadas. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode ou podem ser unidos a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidril livres, como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres, como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos estão descritos no documento WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas. 259-306 (1981).
A remoção de qualquer componente carboidrato presente em um polieptídeo da invenção pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. Deglicosilação química requer exposição do polipeptídeo ao composto ácido trifluormetanosulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos os açúcares, exceto a ligação de açúcar (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), e ao emsmo tempo deixandoo polipeptídeo intacto. Deglicosilação química está descrita por Hakimudddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et aí., Anal.Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de componentes carboidratos, por exemplo, nos polipeptídeos (por exemplo, anticorpos), pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo e exoglicosidases, como descrito por Thotakura et al., Meth.Enzymol. 138:350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente de um polipeptídeo da invenção compreende ligação do polipeptídeo a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquileno, das formas apresentadas nas patentes US 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337.
Composições Farmacêuticas Para usos in vivo, de acordo com os métodos da invenção, um composto terapêutico da invenção é administrado a um sujeito usando-se métodos e técnicas conhecidas, adequadas para o uso específico. Em uma realização preferida, o composto é administrado na forma de composições farmacêuticas em uma dosagem farmaceuticamente adequada.
Em um aspecto, a invenção contempla o uso de preparações protéicas do agente protéico terapêutico para administração de um agente protéico terapêutico (por exemplo, preparações protéicas recombinantes). Em um aspecto, a invenção contempla o uso de preparações com células de mamífero para administração de um agente protéico terapêutico (por exemplo, agente modulador do polipeptídeo VEGFR). As células de mamífero usadas no presente pedido foram transfectadas com o gene heterólogo que codifica a proteína, conforme descrito em detalhes acima. Em uma realização, as células hospedeiras usadas para administração são células CHO.
Formulações terapêuticas das moléculas da invenção, (como agente modulador do VEGFR, por exemplo, VEGF, VEGFR variante, VEGFvariante, por exemplo, FtH-sei ou KDR-sel, anticorpo VEGFR, modulador do VEGFR de molécula pequena, etc.), usados de acordo com a invenção, são preparadas para armazenamento pela mistura de uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo ou molécula pequena, tendo o grau desejado de pureza com carreadores opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (2000)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis e não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluindo tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butil ou álcool benzílico, alcil parabenos, como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexo Zn-proteína); e/ou surfactantes não-iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).
Os ingredientes ativos também podem ser colocados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas coloidais de distribuição de droga (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 20a edição, Osol, A. Ed. (2000). Ver também Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland1 "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylaetide Polyglycolide Mierosphere Systems," em Vaccine Design: Th e Subunit and Adjuvant Approach, Powell e Newman, eds, (Plenum Press: Nova York, 1995), páginas 439-462; documento WO 97/03692, documento WO 96/40072, documento WO 96/07399 e patente US 5.654.010.
Em certas realizações, as formulações a serem usadas para administração in vivo são estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Preparações de liberação contínua podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo um polipeptídeo da invenção, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis, compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), polímero de ácido polilático-coglicólico (PLGA) e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros como acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitem liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Polipeptídeos quando encapsuladaspermanecem no corpo por um longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é revelado como sendo de formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-bissulfeto, a estabilização pode ser alcançada pela modificação de resíduos sulfidril, liofilização de soluções ácidas, controle da umidade do conteúdo, uso apropriado dos aditivos e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específica. Ver também, por exemplo, patente US 6.699.501, que descreve cápsulas com revestimento de polieletrólitos.
É ainda contemplado que um agente protéico terapêutico da invenção (por exemplo, modulador do VEGFR, por exemplo, VEGF, VEGFR variante, VEGF variante (por exemplo, Flt1-sel ou KDR-sel), anticorpo VEGFR, etc.) pode ser introduzido em um sujeito por terapia gênica. Terapia gênica refere-se à terapia realizada pela administração de um ácido nucléico a um sujeito. Nas aplicações de terapia gênica, os genes são introduzidos nas células com o objetivo de alcançar a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente efetivo, por exemplo, pela substituição de um gene defeituoso. "Terapia gênica" inclui tanto a terapia gênica convencional, onde um efeito durável é alcançado por um único tratamento, como administração dos agentes terapêuticos do gene, que envolve administração única ou repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente efetivo. RNAs e DNAs antisense podem ser usados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de certos genes in vivo. Já foi mostrado que oligonucleotídeos curtos antisense podem ser importados para células onde eles agem como inibidores, apesar das baixas concentrações intracelulares ocasionadas pela percepção restrita da membrana celular. (Zamecnik etal., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 83:4143-4146 (1986)). Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar sua absorção, por exemplo, pela substituição de seus grupos fosfodiésteres por grupos não carregados. Para revisões gerais dos métodos de terapia gênica, ver, por exemplo, Goldspiel et al. Clinicai Pharmacy 12:488- 505 (1993); Wu e Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacoi Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan e Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); e May TIBTECH 11:155-215 (1993). Métodos comumente conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados estão descritos em Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; e Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
Existem diversas técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam, dependendo se o ácido 15 nucléico é transferido para células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucléico em células de mamíferos, in vitro, incluem o uso de lipossomos, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Por exemplo, técnicas de transferência de 20 gene in vivo incluem, mas não se limitam a, por exemplo, trasnfecção com vetores virais (tipicamente retroviral) e transfecção mediada por Iipossomo revestido com proteína (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). Por exemplo, técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo incluem transfecção com vetores virais (como adenovírus, vírus Herpes simplex 25 I, lentivírus, retrovírus ou vírus adeno-associados) e sistemas baseados em lipídeos (lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Exemplos de vetores virais úteis na terapia gênica podem ser encontrados em Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman e Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3:110-114 (1993); Bout et ai Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994); Rosenfeld et ai. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 9 1:225-234 (1993); e Walsh etal. Proc. Soe. Exp. Bioi Med. 204:289-300 (1993).
Em algumas situações é desejável fornecer a fonte de ácido nucléico com um agente que atinge as células alvo, como um anticorpo específico para uma proteína de superfície de membrana celular ou da célula alvo, um Iigante para um receptor na célula alvo, etc. Quando são empregados lipossomos, proteínas que se ligam a uma proteína de superfície da membrana celular associada com endocitose podem ser usadas para direcionar e/ou facilitar a absorção, por exemplo, proteínas capsídeo ou fragmentos destas que influenciam um tipo celular específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclos, e proteínas que atingem locais intracelulares e aumentam a meia vida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Bioi Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner etal., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 87:3410-3414 (1990). Para revisão de marcação de gene e terapia gênica atualmente conhecida, ver Anderson et ai, Science 256:808-813 (1992).
Por exemplo, vetores virais e não virais para terapia gênica, bem como células renais geneticamente modificadas foram usadas para a entrega de genes estranhos. Vários vetores foram injetados em células renais por diferentes rotas, injeções por via intra-arterial, intra-uretral ou intraparenquimal (Bosch R J ef ai, (1993) Exp Nephrol 1: 49-54; e Ye X et ai, (2001) Hum Gene Ther 12: 141-148). A principal limitação da injeção intraparenquimal é que esta causa alguma lesão renal. A entrega de um transgene para o rim, ex vivo, antes do transplante em um receptor também poderia ser usada em algunscasos.
Dosagem E Administração
Dosagens e concentrações desejadas de droga, das composições farmacêuticas da invenção, podem variar dependendo do uso específico previsto. A determinação da dosagem apropriada ou rota de administração é bem conhecida por médicos técnicos no assunto. Experimentos animais fornecem uma orientação confiável para a determinação das doses efetivas para terapia humana. A escala de doses efetivas entre espécies pode ser realizada seguindo-se os princípios estabelecidos por Mordenti, J. e Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et aí., Eds., Pergamon Press, Nova York 1989, páginas 42-96.
Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de modulador do VEGFR é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, para uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Quando administração in vivo de um modulador do VEGFR é empregada, quantidades normais de dosagem podem variar de aproximadamente de 10 ng/kg até 100 mg/kg por peso corporal do mamífero ou mais por dia, preferencialmente cerca de 1 pg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da rota de administração. Guia para dosagens específicas e métodos de distribuição são fornecidos na literatura; ver, por exemplo, patentes US 4.657.760, 5.206.344 ou 5.225.212. Antecipa-se que diferentes formulações serão efetivas para diferentes compostos do tratamento e diferentes disfunções, que a administração que atinge um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar distribuição de uma forma diferente daquela para outro órgão ou tecido. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou por mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão dos sintomasda doença No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. Tipicamente, o médico irá administrar uma molécula da invenção até alcançar uma dosagem que forneça o efeito biológico necessário. O progresso desta terapia da invenção é facilmente monitorado por técnicas e testes 5 convencionais.
A composição terapêutica da invenção pode ser administrada por diversos meios, incluindo, mas não limitando a, administração parenteral, subcutânea, intraperitonial, intrapulmonar, intra cérebro-espinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica e intranasal. Infusões 10 parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonial ou subcutânea. Além disso, a composição terapêutica é adequadamente administrada por infusão de pulso, especialmente com declínio de doses do modulador. Preferencialmente, a dosagem é fornecida por injeções, mais preferencialmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou contínua.
O uso de múltiplos agentes também está incluído na invenção. Conforme descrito no presente pedido, o modulador do VEGFR pode ser combinado com um ou mais agentes terapêuticos. A administração combinada inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma única 20 formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem. Por exemplo, um agonista do VEGFR pode preceder, seguir ou se alternar com a administração do agente terapêutico adicional (por exemplo, agente angiogênico) ou pode ser fornecido simultaneamente com este. Em uma realização, há um período de tempo para ambos (ou todos) os agentes ativos 25 exercerem simultaneamente suas atividades biológicas.
Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada do modulador do VEGFR da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, da severidade e curso da doença, se oagente é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, histórico clínico do paciente e resposta ao agente e da discrição do médico. O agente é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Em um regime de combinação de terapia, as composições da invenção são administradas em uma quantidade terapeuticamente efetiva ou em uma quantidade terapeuticamente sinérgica. Como usado no presente pedido, uma quantidade terapeuticamente efetiva é aquela que a co-administração do modulador do VEGFR e um ou mais agentes terapêuticos, ou administração de uma composição da invenção, resulte na redução ou inibição da doença ou condição alvo. Uma quantidade terapeuticamente sinérgica é aquela quantidade de modulador do VEGFR e um ou mais agentes terapêuticos, por exemplo, descritos no presente pedido, necessária para, significativamente ou de forma sinérgica, reduzir ou eliminar condições ou sintomas associados com uma doença específica.
Artigos De Fabricação
Em outra realização da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para os métodos e tratamento das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente, um rótulo e uma bula. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recepientes podem ser formados por uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a doença renal e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um modulador do VEGFR. O rótulo no recipiente, ou associado ao mesmo, indica que a composição é usada para tratar doença renal. O artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo recipiente que compreende um tampãofarmaceuticamente aceitável, como fosfato salino tamponado, solução de Ringer e solução de dextrose. Este pode, ainda, incluir outros materiais comercialmente desejáveis do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. Opcionalmente, é incluído um 5 conjunto de instruções, geralmente instruções escritas, relacionadas ao uso e dosagem do modulador do VEGFR para uma disfunção descrita no presente pedido. As intruções incluídas com o kit geralmente incluem informações para dosagem, programação de dosagem e rota de administração para o tratamento da disfunção. Os recipientes com o modulador do VEGFR podem ser de dose 10 única, embalagens grandes (por exemplo, embalagens multi-dose) ou subunidades de dose.
Exemplos
Deve-se entender que os exemplos e realizações descritas no presente pedido são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças em consideração a estas serão sugeridas para os técnicos no assunto e devem ser incluídas dentro do espírito e limite deste pedido, e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente pedido são integralmente incorporados ao presente como referência para todos os propósitos.
Exemplo 1
Identificação De Uma Nova Alça Reguladora Autócrina Pelo VEGF-A Em Células Mesangiais Mediada Por Flt1/VEGFR-1 Nós geramos camundongos transgênicos, pelos quais o gene VEGF foi removido nas células que expressam o receptor-1 do VEGF (Flt1/VEGFR-1). Nós descobrimos que a retirada do gene VEGF-A em células mesangiais do rim resultou em insuficiência renal progressiva caracterizada por proteinúria, esclerose glomerular, hipertensão e morte dos camundongos com 1 a 3 meses de idade. Os glomérulos afetados exibiram expressão reduzida doVEGF-A em podócitos e aumento do número de células inflamatórias, deposições do complexo imune e ativação de complemento. A intereferência da alça autócrina nas células mesangiais induz alterações renais distintas, similares a um subgrupo de patologias renais associadas com níveis reduzidos de VEGF nos rins. In vitro, células mesangiais deficientes em VEGF-A e Flt-1 exibiram redução na sobrevida das células, uma mudança na expressão gênica com relação à síntese de ECM e redução na degradação da matriz. Estas descobertas identificam uma nova alça de sinalização autócrina entre VEGF-A e VEGFR-1 que regula a produção de ECM e expressão de VEGF nos podócitos. A estimulação do VEGFR1 em células renais, por exemplo, células mesangiais, pode ser uma estratégia terapêutica para o tratamento de glomeruloesclerose progressiva associada com níveis reduzidos de VEGF-A.
Flt-1: tirosina quinase similar a fms] GBM: membrana basal glomerular; VEGF: fator de crescimento endotelial vascular; VEGFR: receptor do VEGF; VEGFR-1: receptor do VEGF; Flt-1: tirosina quinase similar a fms] VEGFR-2: receptor do VEGF, KDR (ou Flk1); WT: tipo selvagem; WT-1: proteína-1 do núcleo de tumor de Wilm; ECM: matriz extracelular.
Materiais ε Métodos Geração De Camundongos VEGF-LoxP E FltI-Cre E Cruzamento Com 20 Linhagem Repórter ROSA26
Camundongos VEGF-loxP foram gerados conforme descrito anteriormente acima (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et ai VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159(1999a)). Resumidamente, nos camundongos VEGF-loxP, o exon 3 do VEGF é ladeado pelos sítios IoxP, resultando em um alelo null VEGF nas células que sofrem recombinação de loxP. Camundongos VEGF-loxP foram cruzados com camundongos Fltl-Cre, nos quais um fragmento de 3,1 kb do promotor Fltl (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et ai Differential transcriptional reguIation ofthe two vascular endothelial qrowth factor receptor genes. Flt-1. but not Flk-1/KDR. is up-regulated bv hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667 (1997)) dirige a expressão de Cre-recombinase. Camundongos Fltl-Cre foram gerados por microinjeção de um constructo contendo um fragmento de 3,1 kb do promotor Fltl promotor, que dirige a expressão de Cre-recombinase no pró-núcleo dos óvulos de camundongos, conforme descrito anteriormente. Ver, Hogan, B., et al. (eds.). Manipulating the mouse embryo, (Cold Spring Harbor Laborator Press, 1994). Para monitorar a expressão de Cre-recombinase, camundongos FIt-CRE+; vEGF-loxP/loxP) ou Flt-Cre+ foram cruzados com linhagem repórter ROSA26 (ver, por exemplo, Mao, X., et al. Improved repórter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5037-5042(1999)), pelos quais a expressão onipresente de β-galactosidase é inibida por sinais de terminação de transcrição/tradução. Este "fragmento de parada" é ladeado pelos sítios IoxP e sofre excisão mediada por Cre, resultando na expressão do gene β-galactosidase nas células que expressam Cre-recombinase.
Geração De Camundongos Flt1-loxP Um clone de DNA genômico de 16-kb Flt-1 incluindo o exon 1 no Iocus do gene Fltl murino foi isolado seguindo seleção de uma biblioteca de cromossomos artificiais de bactéria, usando-se os seguintes primers: um fragmento de DNA genômico Hind\\\ de 1,4 kb com extensão de 3,0 a 1,6 kb a montante do códon de iniciação de tradução de Fltl foi retirado e as terminações abruptas foram clonadas no sítio Not\ do vetor de direcionamento de TNLOX1-3. Subseqüentemente, um fragmento de DNA genômico H//?dlll/SsfXI de 2,0 kb foi clonado pela ligação da terminação abrupta no único sítio >4scl de TNLOX1-3, a jusante do cassette PGK-neoR e imediatamente 5' de LoxP3. Este fragmento de 2,0 kb incluiu uma região promotora do gene Flt1, um sítio de iniciação de transcrição e exon 1 do gene Flt1. Finalmente,um fragmento de DNA genômico BstX\/Bsm\ de 2,0 kb foi deixado com terminação abrupta e clonado no sítio Pmel imediatamente 3' do terceiro sítio de IoxP, para gerar o vetor de direcionamento designado TKNeoFItI-1. TKNeoFItI-1 foi seqüenciado e sujeito à digestão por endonuclease de restrição para verificar a seqüência e orientação dos sítios IoxP e insertos de DNA genômico.
O vetor de direcionamento foi Iinearizado pela digestão de Sa/I e 20 pg foram eletroporados em células ES TCL1 e R1, derivadas da linhagem 129Sv. Células ES e fibroblastos embrionários de camundongo foram mantidos em cultura na presença do fator inibitório de leucemia de murino (LIF)1 conforme previamente descrito (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159(1999a)). Células ES foram sujeitas à seleção positiva com G418 (400 Mg/ml), 24 horas após a eletroporação, e após nove dias desta seleção, colônias individuais foram colhidas, cultivadas e selecionadas para eventos de recombinação positiva por análise Southern blot. O DNA genômico dos clones resistentes foi digerido tanto com EcoRI (para análise da termnação 5' do evento alvo) como com Hinú\\\ e Kpnl (para análise da termnação 3' da região genômica atingida). As sondas usadas para seleção das terminações 5' e 3' da região atingida foram geradas por PCR1 usando-se os seguintes pares de prímer: Sonda 5' (639 nts): Flt-LOX.1123F (GAT GGC CTT GAG TAT ATC CTG (SEQ ID NO:1)) e Flt-LOX.1762R (CAG CTC TGG ACT CCA GCT TGC (SEQ ID NO:2)); sonda 3' (834 nts): Flt-LOX.9733F (GGA AAC TAT GTG GCT GAT CTC (SEQ ID NO:3)) e Flt-LC>X.10567R (GTG AGA GCC AAG ATC GAG GAG (SEQ ID NO:4)). Dois clones independentes de células ES, designados #15 e #F7 foram identificados como recombinantes homólogos e transfectados temporariamente com um vetor de expressão que codifica Cre-recombinase (pMC-Cre), conforme descrito anteriormente (ver, por exemplo, Gerber, H. P.,et ai VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159(1999a)). Os clones ES transfectados foram colhidos, para se obter colônias indivduais, e selecionados por Southern blote PCR para deleção do cassette PGK-neoR e da recombinação entre LoxPI e LoxP2. Além da 5 análise Southern blot, as colônias selecionadas também foram analisadas por PCR1 usando-se os primers Flt-LOX.236F (TAG ACT CTG CGC GCC ATA ACT (SEQ ID N0:5)) e Flt-LOX.2629R (CAC TAA GAA GGC AGA GGC CAA (SEQ ID N0:6)). Flt-LOX.236F se anela ao DNA imediatamente 5' e se sobrepõe com os 6 primeiros nucleotídeos de LoxP3, e usado em combinação com Flt-10 LOX.2629R (que é homólogo ao DNA a jusante do braço 3' de homologia) somente irá gerar um produto de PCR a partir do DNA contendo LoxP3. Estes primers foram usados para confirmar, ainda, se o terceiro sítio IoxP não sofreu recombinação.
Um clone de célula ES derivado de #15 e #F7, em que o cassette 15 PGK-neoR foi removido (designado #15.C1.H1 e #F7.A.E11, respectivamente), foi injetado na cavidade blastocélica de blastócitos C57BI/6J com 3,5 dias (ver, por exemplo, Hogan et ai, (eds.). Manipulating the mouse embryo, (Cold Spring Harbor Laborator Press) (1994)). Machos quiméricos foram cruzados com camundongos fêmeas C57BI/6J e a prole foi selecionada para transmissão 20 de linhagem germinativa pela análise PCR para detectar LoxPI/2 e LoxP3. Os primers de PCR usados para selecionar a presença de LoxP 1/2 foram Flt-LOX.1335F (CCT GCA TGA TTC CTG ATT GGA (SEQ ID N0:7)) e Flt-LOX.3207R (GCC TAA GCT CAC CTG CGG (SEQ ID NO: 8)). Os primers de PCR usados para selecionar a presença de LoxP3 foram Flt-LOX.236F e Flt-25 LOX.2629R. Camundongos Flt1-LoxP(+/~) foram então cruzados para gerar camundongos Flt1-LoxP(-/~), que não carrega o alelo floxed Flt1, Fltl-LoxP(+/~) que carrega um único alelo Fltl que é floxed e Fltl-LoxP(+/+) em que ambos os alelos de Fltlcontêm sítios IoxP. Camundongos FItI-IoxP foram tipicamentegenotipados por PCR usando-se oligonucleotídeos Flt-LOX.1335F e Flt-LOX.3207R.
Hibridizacão In Situ
A hibridização iη situ para VEGF e TGF-β foi realizada usando-se sondas antisense e sense geradas por amplificação por PCR com o uso de primers específicos para TGF-β murino (Forward: 5'-CACCGCGACTCCTGCTGCTTT (SEQ ID NO: 9); Reverso:5'-GGGGGTTCGGGCACTGCTT (SEQ ID NO: 10); tamanho da sonda: 609 nt) e VEGF de rato (Forward: 5'-CAACGTCACTATGCAGATCATGCG (SEQ ID NO: 11); Reverso: 5'-TCACCGCCTTGGCTTGTCA (SEQ ID NO:12); tamanho da sonda: 348 nt). O tecido renal foi retirado dos camundongos com 7,5 semanas de idade, fixados em formalina a 4% e embebidos em parafina. Os cortes com 5 μηι foram desparafinados, desproteinados em 4 pg/ml de proteinase K por 30 min a 37 0C e então processados para hibridização in situ, conforme descrito anteriormente (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodelinq, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5:623-628(1999b)). Sondas sense e antisense marcadas 33P-UTP foram hibridizadas aos cortes a 55°C durante a noite. A sonda não hibridizada foi removida por incubação em 20pg/ml de RNase A por 30 min a 37°C, seguido por uma lavagem de alta estringência a 55°C em 0,1 X citrato salino padrão (SSC) por 2 horas e desidratação através de graduações de etanol. As lâminas foram mergulhadas em emulsão de sinal nuclear NBT2 (Eastman Kodak), exposta em caixas plásticas fechadas contendo desecante para 4-6 semanas a 4°C, reveladas e contra-coradas com hematoxilina e eosina (Η & E).
Microscopia Eletrônica Pedaços do tecido do córtex renal de camundongos VEGF-loxP, Fltl-Cre com 4 a 5 semanas de idade foram fixados durante a noite a 4 0C em2% de formaldeído, 2,5% de glutaraldeído em 0,1 M de tampão cacodilato. Após lavagem, as amostras foram pós-fixadas por 2 horas, lavadas com água, desidratadas através de graduações de etanol e óxido de propileno, e embebidas em EPONATE 12 (Ted Pella, Inc. Redding, Ca). Foram realizados 5 cortes ultra-finos em um micrótomo Reichert Ultracut UCT1 contra-corados com acetato de chumbo e examinado por microscópio eletrônico de transmissão Philips CM12 a 80 kV. As imagens foram capturadas com uma câmera digital GATAN Retractable Multiscan.
Coloração LacZ
Para coloração LacZ embrionária completa de embriões com 9,5dias ou tecidos de camundongos com 1 semana de idade, os tecidos foram dissecados em tampão fosfato salino (PBS) e fixados com formaldeído a 4% (PFA) em PBS por 1 hora a 4 0C. Após três lavagens de 30 minutos em tampão de enxágüe (5 mM de ácido etileno glicol-bis(amino etileter)-tetra acético (EGTA), 0,01% de desoxicolato, 0,02% de NP-40, 2 mM de MgCI2 em PBS), os embriões foram incubados durante a noite a 37 °C em solução corante (tampão de enxágüe contendo 5 mM de K3Fe(CN)6, 5 mM de K4Fe(CN)G, 1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactosido (X-gal)). Os tecidos foram então pós-fixados em 4% de PFA em PBS por 30 minutos a 4° C, transferidos para etanol 70% e fotografados usando-se um microscópio de dissecação Leica MZFLIII, com câmera digital SPOT e programa avançado de fotografia SPOT ou processado por embebimento em parafina e corte.
Análise Histológica E Imunohistoquímica Para análise histológica, os tecidos foram fixados com formalina tamponada neutra a 10% por 12 a 16 horas, transferidos para etanol 70% e embebidos em parafina. Foram feitos cortes com 5 pm, usando-se um micrótomo (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Os cortes embebidos em parafina foramanalisados por imunohistoquímica, usando-se anticorpos desenvolvidos para Cre-recombinase (EMD Biosciences.Novagen1 San Diego, Califórnia), CD31 (MEC 13.3, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Califórnia) que detecta todas as células endoteliais, VEGFR-2/Flk-1 (MALK-1, Genentech, Inc. South San Francisco, Califórnia) que primeiramente marca o endotélio não vascular arterial e actina alfa de músculo liso (DakoCytomation Califórnia, Inc., Carpinteria, CA) que detecta o desenvolvimento e células mesangiais ativadas, e células musculares lisas. Para detectar os componentes da matriz extracelular, anticorpos cultivados contra colágeno IV (Chemicon Internation, Temecula, Califórnia) e Iaminina (Chemicon) foram utilizados. A coloração foi realizada conforme descrito anteriormente acima (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et ai VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)).
Para estudos de imunofluorescência, os rins excisados foram dissecados longitudinalmente, embebidos em composto O.C.T (Tissue Tek, Sakura Finetek U.S.A., Inc., Torrance1 CA) e seccionados a 5 a 10 μm. Para identificar tipos celulares glomerulares que expressam VEGF de camundongo, os cortes congelados foram incubados com anticorpo monoclonal humanizado que reconhece VEGF de camundongo (α-VEGF, Genentech Inc.) a uma concentração de 20 pg/ml, em combinação tanto com anti-soro de coelho purificado para afinidade à integrina a8 (a 1/200 para detectar células mesangiais, gentilmente fornecidas pela Ulrich Muller, The Scripps Research lnstitute, La Jolla, CA), rato a-CD31 de camundongo (BD Pharmingen) (para detectar células endoteliais) ou coelho α-proteína nuclear de Tumor de Wilm de camundongo (WT-1; Santa Cruz Biotechnology Inc., 2 pg/ml) (para detectar podócitos). Os cortes foram subseqüentemente lavados e incubados com AlexaFluor-594 conjugados a IgG de cabra anti-humano e AlexaFluor-488 conjugado a IgG de cabra anti-rato ou anticorpos secundários IgG de cabraanti-coelho 4 Mg/ml (Invitrogen). Para identificar tipos celulares glomerulares que expressam o transgene Fltl-Cre1 cortes congelados foram incubados com anti-beta-galactosidase (Rockland Immunochemicals Inc.; 200 Mg/ml), seguido por AlexaFluor-594 conjugado a IgG de cabra anti-coelho. O anticorpo WT-1 e anti-lntegrina a8 foram marcados com AlexaFluor-488 usando-se a técnica de marcação Zenon para IgG de coelho (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo CD31, o a-WT-1 marcado com AlexaFluor-488 ou anti-lntegrina a8 foram aplicados aos cortes lavados. Neste estudo, a coloração anti-beta-Gal reflete a expressão do transgene Fltl-Cre durante qualquer um dos estágios de desenvolvimento, como excisão mediada por Cre-recombinase remove de forma irreversível a supressão do promotor do gene ROSA26 onipresente, expresso de outro modo, que dirige a expressão de anti-beta-Gal nestes camundongos (Mao et.al., Improved repórter strain for monitorinq Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Natl Acad SciUSA 96:5037-42 (1999)).
Para detectar a expressão de depósitos de imunoglobulina, uma série de anticorpos monoclonias de rato, conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC), específicos para cada classe e isotipo de imunoglobulina de camundongo (Ig) (BD Biosciences Pharmingen, San Jose1 CA) foram incubados com cortes congelados bloqueados por 1,5 h a uma concentração de 4 Mg/ml. A deposição de Ig foi confirmada usando-se anticorpos policlonais conjugados com FITC purificado, desenvolvidos para Igs de camundongo de classe e isotipo específicos (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). Componentes C1q, C3 e C4 do sistema de complemento de camundongo foram detectados usando-se anticorpos monoclonais de rato (HyCuIt Biotechnology b.v., Uden, The Netherlands) a 5 pg/ml e IgG de cabra anti-rato conjugado a AlexaFluor-594 (Invitrogen) como reagente secundário.
Células da linhagem de células T e monócito-macrófagos foramidentificadas usando-se anticorpos desenvolvidos para CD4 (BD Biosciences1 Pharmingen, San Jose1 Califórnia) e F4/80 (Serotec Inc., Raleigh1 NC), respectivamente, e protocolos de coloração padrão. Para todos os estudos imunohistoquímicos, os controles negativos foram incluídos pela substituição de anticorpos primários com Igs purificadas, compatíveis à concentração, espécie e isotipo do anticorpo primário omitido.
Para detectar hipóxia em rins de camundongos, camundongos Fltl-Cre- e Fltl-Cre+; VEGF(loxP/loxP) com 4 semanas de idade foram injetados intraperitonialmente com hipocloreto de pimonidazola (Hypoxyprobe™-1, Chemicon International, Temecula1 Califórnia, 60 mg/kg). Uma hora após a injeção, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, os rins foram fixados durante a noite com formalina a 10% e então desidratados e embebidos em parafina. Cortes com 5 μιτι embebidos em parafina foram então processados e corados com Hypoxyprobe™ -1Mab1, conforme descrito pelo fabricante do Kit Hypoxyprobe™-1 (Chemicon International), excluindo-se a incubação com estreptavidina peroxidase que foi substituída por estreptavidina-AlexaFluor594 (Invitrogen) para permitir detecção fluorescente. IgGI de camundongo que era compatível com a concentração, em relação àquela usada para Hypoxyprobe™-Mab1, foi usada como um isotipo controle para coloração não específica do anticorpo primário. Como um controle negativo adicional, os cortes de rim isolados de camundongos que não foram injetados com Hypoxyprobe™-1 foram incubados com Hypoxyprobe™-Mab1.
Análise De PCR Quantitativo Em Tempo Real
O RNA foi isolado dos tecidos de camundongos com 5 a 7.5semanas de idade, usando-se o método STAT 60 (TEL-TEST "B", Friendswood1 TX) e purificados em colunas de giro Rneasy Quick (Qiagen, Valencia1 CA). A análise de RT-PCR em tempo real foi realizada conformedescrito anteriormente (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et al. Complete inhibition of rhabdomvosarcoma xenoqraft qrowth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial qrowth factor. Câncer Res 60:6253-6258 (2000)) usando-se 100 ng do RNA total, reagentes para RT-PCR Applied Biosystems e um detector de Seqüência Modelo 7700 em placa de 96 poços (Applied Biosystems). As condições de RT-PCR foram 30 min e 48°C, 10 min em 95°C e 40 ciclos de 30 s em 95°C e 90 s em 60 0C. Os resultados foram analisados usando-se o Programa de Detecção de Seqüência (Applied Biosystems) e foi realizada análise estatística por ANOVA usando-se o programa StatView (SAS Institute Inc. Cary,. Carolina do Norte). Os RNAs relativos equivalentes para cada amostra foram obtidos pela padronização para níveis de gliceraldeídos-3-desidrigenase (GAPDH).
Parâmetros Hematológicos E De Química Sérica Camundongos com 7,5 semanas de idade foram sacrificados por inalação de CO2 e o sangue coletado por punção cardíaca em tubos revestidos com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes1 Nova Jersey). As contagens de célula hematológica foram medidas usando-se um Cell Dyn 3700 (Abbott Laboratories, Abbott Park1 Illinois). O soro foi obtido pela coleta em tubos separadores de soro (Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes1 New Jersey) e os parâmetros séricos foram medidos usando-se um instrumento Roche Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics1 Indianápolis, Indiana).
Análise De Urina A urina foi coletada passivamente de camundongos com idade de 4 a 5 semanas. As amostras representativas de urina dos camundongos de cada genótipo foram testadas para a presença de proteína, sangue, glicose e cetonas, usando-se tiras de teste de urina (Chemstrip 10 with SG, Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, Indiana1EUA). Proteinúria foi, ainda,confirmada por carregamento de 1 μΙ_ em um gel de tris/glicina de gradiente de 4 a 20% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) e sujeito a SDS-PAGE, seguido por silver satining ou Western blotting para albumina de camundongo usando-se anti-soro de cabra de afinidade purificada a 200 pg/mL (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery1 TX).
Medição Da Pressão Sangüínea Arterial Média Os camundongos foram anestesiados com inalação de isoflurano (Aerrane, Baxter Caribe Inc.). Por meio de uma incisão mediana ventral realizada no pescoço, um catéter (tubo de polietileno, PE-10, Becton-Dickinson) foi colocado na artéria carótica comum direita e mantido no local com sutura de seda. As medições da pressão sangüínea foram coletadas digitalmente por 15 minutos usando-se hardware e programa AcqKnowIedge (Biopac Systems, Inc., Santa Bárbara, CA).
Análises Estatísticas
Todas as análises estatísticas, exceto as análises dos dados demicroarranjo de DNA complementar (ver seção separada), foram realizadas pela análise da variância (ANOVA) usando-se o programa StatView (SAS Institute Inc., EUA), a menos que estabelecido de outro maneira.
Isolamento De Cultura Celular Mesangial E Do Glomérulo
Os glomérulos de camundongo foram isolados de acordo com ométodo de (Takemoto et a!., A new method for Iarge scale isolation of kidney qlomeruli from mice. Am J Pathol 161:799-805 (2002)) e plaqueados em placas revestidas com 20 pg/mL de fibronectina (Sigma Corp, St Louis, Missouri) em meio de célula mesangial (Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM), soro fetal bovino a 20% (FCS), 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina). Os glomérulos foram encubados em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%, 95% de ar em 37 0C, por 6 a 7 dias durante o tempo em que o glomérulo aderiu à placa e uma monocamada confluente de célulasrevestiu a placa. Usando-se essa técnica, as culturas homogêneas de células mesangiais glomerulares foram obtidas e que poderiam ser passadas, pelo menos, cinco vezes. A morfologia da célula mesangial glomerular parecia consistente com os artigos publicados de células mesangiais usando-se microscópio de luz (Mene et ai, Phospholipids in siqnal transduction of mesangial cells. Am J Physiol 256:F375-386(1989)). As células mesangiais glomerulares imunocoradas foram positivas para α-vimentina (DakoCytomation) e anti-miosina (Zymed Laboratories, lnc, South San Francisco, Califórnia), e foram negativas para CD31 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, Califórnia) e para percepção de lipoproteína de baixa densidade acetilada (Biomedical Technologies, Inc, Stoughton, Massachusetts). Além disso, todas as células mesangiais foram cultivadas em meio essencial mínimo substituído por D-valina (MEM) por pelo menos 3 dias, que bloqueia o crescimento de fibroblastos in vitro (Gilbert and Migeon, (1975). D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Cell 5:11-17).
As culturas de célula mesangial glomerular foram estabelecidas a partir de camundongos VEGF(loxP/loxP) e Fltl (loxP/loxP) e camundongos WT da mesma colônia que não carregavam sítios de IoxP genômicos. Para estudos de sobrevida de célula mesangial, as células mesangiais foram plaqueadas em placas de seis poços em uma densidade de 105 células/poço e encubadas durante a noite em meio de célula mesangial contendo FCS a 20%. O meio foi então aspirado e substituído por meio livre de soro contendo adenovírus expressando tanto LacZ(Ad-LacZ) como um controle, como Cre-recombinase (Ad-Cre) que induz a recombinação entre os sítios de IoxP e resulta na ablação do gene VEGF ou Fltl em células VEGF(loxP/loxP) e Flt1(loxP/loxP), respectivamente. O adenovírus foi usado em múltiplas infecções (MOI) de 1000 nos estudos de sobrevida. Um anticorpo VEGF anti-murino neutralizante (α-VEGF, G6-23-lgG) (Genentech, Inc. South SanFrancisco, Califórnia) ou um anticorpo compatível para isotipo controle (IgG controle) foi adicionado ao meio a 10 pg/mL e com Ad-LacZ em MOI de 1000. Depois de quatro dias da adição do adenovírus, as células que permaceram aderidas foram lavadas com PBS1 tripsinizadas e contadas usando-se um Contador de Partícula e Analisador de Tamanho Z2 Coulter (Beckman Coulter1 Inc. Fullerton, Califórnia). As células mesangiais foram isoladas dos camundongos de cada genótipo (n= 5 a 7 camundongos por genótipo). Entre dois a cinco poços replicados foram contados para cada vírus em cada camundongo de cujas células foram derivadas. A proporção de contagem de células entre os tratamentos Ad-LacZ e Ad-Cre foi calculada e normalizada como uma porcentagem do valor obtido para o grupo controle.
Microarranjos De DNA Complementares As células mesangiais foram preparadas a partir de 4 camundongos WT e 4 WEGF(loxP/loxP). Na passagem dois ou três, as células mesangiais foram cultivadas em um meio livre de soro contendo Ad-LacZ ou Ad-Cre em MOI de 100 por cinco dias. O RNA foi isolado usando-se o método de STAT60 e Colunas Rneasy Quick como descrito na seção "RT-PCR quantitativo em tempo real". Os métodos para a preparação de RNA complementar (cRNA) e a hibridização/varredura dos arranjos foram fornecidos por Affymetriz (Affymetriz, Inc. Santa Clara, Califórnia). 5 pg do RNA total foi convertido em cDNA de dupla fita usando-se um kit de síntese de cDNA (SuperScript Choice, GIBCO/BRL, Grand Island1 Nova York) e um primer oligomérico T7-(dT)24 (Biosearch Technologies, Inc, Novato, Califórnia, Custom Synthesis). O cDNA de dupla fita foi purificado em resina de afinidade (Kit Módulo de Limpeza de Amostra, Affymetrix, Inc. Santa Clara, Califórnia) e por precipitação em etanol. Depois da síntese da segunda fita, o cRNA marcado foi gerado a partir da amostra de cDNA pelo uso de uma RNA polimerase T7 e nucleotídeo marcado com biotina em uma reação de transcrição in vitro (EnzoBiochem, Inc. Farmingdale1 Nova York). O cRNA marcado foi purificado em uma resina de afinidade (kit módulo de limpeza de amostra, Affymetrix). A quantidade de cRNA marcado foi determinada pela medida de absorbância a 260 nm e com base na convenção de que 10D a 260 nm corresponde a 40 Mg/ml de RNA. Vinte pg de cRNA foi fragmentada por incubação em 94°C por 30 minutos em 40 mM de Tris-acretato (pH 8,1), 100 mM de acetato de potássio e 30 nM de acetato de magnésio. As amostras foram então hibridizadas para arranjos 430 2.0 do Genoma de Camundongo a 45°C por 19 horas em um forno giratório ajustado em 60 rpm. Os arranjos foram lavados e corados na estação Affymetrix Fluidics e submetidos à varredura por um scanner. As análises dos dados foram realizadas usando-se o programa Affymetrix GeneChip Analysis. A expressão gênica foi resumida por valores de sinais do Affymetrix MAS 5.0, os quais foram analisados em escala logarítmica. Uma análise da variância foi aplicada pela consideração dos efeitos do vírus (Ad-LAcZ ou Ad-Cre), efeitos do genótipo (WT ou VEGF (loxP/loxP)) e o efeito da ablação gênica do VEGF para cada conjunto da sonda. As alteraçõeso no número da média na expressão gênica de Ad-LacZ a Ad-Cre nas células VEGF (loxP/loxP) versus a alteração no número correspondente nas células WT, a força da evidência para a diferença na expressão gênica (do valor ρ do teste t) e o sinal absoluto mínimo da expressão gênica foram usados como uma combinação de critérios para seleção de conjuntos de sonda afetadas significativamente pelos efeitos da ablação gênica. Esses critérios foram unidos em uma alteração de número mínimo de 2 vezes, um valor ρ < 0,05 e um sinal absoluto em > 50. As alterações na expressão gênica entre WT e células mesangiais deficientes em VEGF foram comparadas.
Para classificar significativamente os genes desregulados de acordo com as classificações de ontologia gênica fornecida pela Affymetriz, nós obtivemos a versão de 9 de agosto de 2004 das hierarquias da OntologiaGênica (GO). A base de dados NetAffy foi usada para associar cada conjunto de sonda Affymetriz com as identificações gênicas LocusLink. O arquivo loc2go foi baixado do website NCBI LocusLink (disponível na internet em ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/LocusLink/), o qual foi usado para associar genes e conceitos GO. A distribuição das associações gênicas foi computada em hierarquias GO pelo uso do conjunto completo de genes com anotações GO1 e o conjunto de genes afetados pela ablação gênica do VEGF. Para cada conceito GO, uma tabela de contingência 2 a 2 foi gerada para representar a presença ou ausência do conceito GO versus a presença ou ausência dos efeitos da ablação gênica. Uma análise de qui-quadrado da associação foi realizada para determinar a significância estatística. A razão das probabilidades foi computada pela divisão do número observado dos genes afetados por nocaute para o conceito GO pelo número esperado. Um intervalo de confiança de 95% para as razões de probabilidade foi obtido de 1000 amostras autônomas.
Os dados de microarranjo foram também analisados pelo uso da análise de Ingenuity Pathways (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Os identificadores para sondas, cuja expressão foi regulada significativamente de forma diferencial (valor p< 4e-3) foram carregadas na pedido ondem eles foram mapeados para os genes. Os genes dos quais essas sondas mapeadas foram usadas para gerar as redes moleculares usando-se a informação contida no Ingenuity Pathways Knowledge Base (IPKB). Para a análise funcional, os mesmos genes foram associados com as funções biológicas e/ou doenças usando-se IPKB. O teste de exatidão de Fischer foi usado para calcular um valor ρ na determinação da probabilidade de cada função biológica e/ou doença designada para aquele conjunto de dados que é devido ao acaso.
ResultadosExpressão Do Transgene FltI-Cre Durante O Desenvolvimento Recapitula A Expressão Se FltI Endógeno Um fragmento promotor de 3,1 kb do gene Fltl foi anteriormente identificado e caracterizado como sendo suficiente para mediar a expressão aumentada do gene repórter em células endoteliais transfectadas provisoriamente ou células Hep3 B expostas para as condições hipóxica (ver, por exemplo, Gerber, H. P., et al. Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated bv hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667(1997)). Um constructo que consiste do mesmo fragmento promotor do Flt-1 de 3,1 kb foi inserido a montante do gene Cre-recombinase e foi usado para gerar camundongos transgênicos. A linhagem com expressão mais alta de LacZ em rins de adultos foi selecionada para análise detalhada da expressão do transgene. A coloração do grupo completo de embriões transgênicos no dia 9,5 revelou um padrão de expressão vascular consistente com a expressão do gene Fltl endógeno. Ver também, por exemplo, Fong, G.H., et al. Regulation of flt-1 expression during mouse embrvogenesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium. Developmental Dynamics 207:1-10 (1996). Em camundongos recém-nascidos, as células positivas para LacZ estavam presentes em uma variedade de tecidos, incluindo coração, baço, pulmão, testículos e pele. Consistente com os artigos anteriores descrevendo a expressão de Flt-1 nas células mesangiais e do endotélio renal (ver, por exemplo, Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226(1995)), as células positivas LacZ foram encontradas nas células endoteliais peritubulares e células dentro da região central do glomérulo do rim, onde as células mesangiais e endoteliais estão localizadas tipicamente em um camundongo Fltl-Cre+;ROSA com idadede 5 dias.
Camundongos Flt-CRE+: vegf(Loxp/Loxp) Desenvolvem Glomerulonefrite E Sucumbem Para Estágio Final De Insuficiência Renal Com 4 A12 Semanas
De Idade
Os camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) nasceram nasproporções mendelianas experadas (Fig. 1, Painel a), entretanto, a sobrevida diminuída foi evidente em 4 semanas de idade, com mais de 95% de camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) mortos em 12 semanas (Fig. 1, Painel b). Uma inspeção mais completa revelou que os camundongos FIt-CRE+; 10 vEGF(loxP/loxP> tinham uma massa renal e de baço significativamente reduzida. Ver Fig. 1, Painel c. Houve também a vascularização reduzida do rim e apareceram lesões císticas renais, indicativas da doença renal bilateral. Ver Fig. 1, Painel d. Outros órgãos com vasculaturae positiva LacZ como pulmão, fígado, coração, cérebro e músculo esquelético nao exibiram quaisquer 15 alterações significativas na morfologia, peso ou vascularização.
A análise de urina revelou proteinúria excedendo 500 mg/dl_ em camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) com 4 a 5 semanas de idade. As análises silver staining e western blotting revelaram quantidades enormes de albumina, indicativa de funções de barreira de filtração glomerular defeituosas, 20 na urina de camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP), mas não nos camundongos FIt-CRE+; VEGF(ioxpa) ou Fltl-Cre. See, Fig. Ver Fig. 1, Painel e. A análise de química sérica revelou um aumento de 4 vezes nos níveis de nitrogênio de uréia sangüínea (BUN) e de creatinina no soro nos camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/(oxP), comparados com os camundongos controle (ver Fig. 1, Painéis 25 f e g), enquanto que os níveis de sódio, potássio, cloreto e cálcio no soro não foram afetados. Consistente com a patologia associada à insuficiência renal, a pressão sangüínea estava significativamente elevada em camundongos transgênicos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) relativo às ninhadas controle FIt-CRE-.Ver Fig. 1, Painel h. Combinado, esses resultados podem indicar que os camundongos FIt-CRE+; vEGF(loxP/loxP) progressivamente desenvolvem mal funcionamento renal associado à proteinúria e hipertensão, culminando em insuficiência renal de estágio final.
Expressão Do Transgene FltI-Cre E Ablacão Do Gene VEGF-A EmCélulas Mesangiais Do Rim
Usando-se abordagens imunohistoquímicas, nós co-localizamos a expressão do VEGF-A e podócitos que expressam proteína nuclear de Tumor de Wilms α (ver, por exemplo, Haas, C. et aí. MHC antiqens in interferon qamma (IFN qamma) receptor deficient mice: IFN gamma-dependent up-requlation of MHC class Il in renal tubules. Kidney-Int 48:1721-7 issn: 0085-2538(1995)) em glomérulos de camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) com 4 semanas de idade, destacando que a maior parte da expressão do VEGF-A foi restrita aos podócitos. VEGF-A foi detectado em podócitos glomerulares e células mesangiais quando os cortes congelados de rins de camundongos Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP);ROSA26+ com idade de 4 semanas foram coradas com anticorpos para detectar as células mesangiais (anti-lntegrina a8), as células endoteliais (anti-CD31) e podócitos (anti-WT-1) junto com a co-coloração dos cortes com α-VEGF para identificar os tipos celulares glomerulares que expressam VEGF-A. As imagens mescladas indicaram que a expressão do VEGF-A é detectável em podócitos WT-1 positivos e significativa, mas a expressão reduzida de VEGF-A é detectável em células mesangiais glomerulares. A hibridização in situ de VEGF-A confirmou os altos níveis da expressão de VEGF-A em podócitos, como mostrado pela abundância de grânulos de prata na periferia dos glomérulos de camundongos Fltl-Cre com 7 semanas de vida. Ver Fig. 2, Painel a. A co-coloraçãp das células mesangiais a8 positivas para integrina (ver, por exemplo, Hartner, A., et aí., Alpha8 integrin in qlomerular mesanqial cells and in experimental glomerulonephritis. Kidney Int56:1468-80(1999)) com VEGF-A revelou-se expressão mais fraca, porém significativa em células mesangiais em camundongos com 4 semanas de vida. Ver 2, Painel a. Entretanto, nós fomos incapazes de detectar as células VEGF-A/CD31 endoteliais duplamente positivas em qualquer um dos cortes de rim analisados, consistentes com a ausência de VEGF-A nas células endoteliais glomerulares descritas anteriormente. Ver, por exemplo, Simon, M. et al. Expression of vascular endothelial qrowth factor and its receptors in human renal ontoqenesis and in adult kidnev. Am-J-Physiol 268:F240-50 issn: 0002-9513(1995); e Noguchi, K. et al. Activated mesanqial cells produce vascular pêrmeabilitv factor in earlv-staqe mesanqial proliferative qlomerulonephritis. JAm Soc Nephrol 9:1815-25 (1998).
Para determinar os tipos de células glomerulares que expressam Cre-recombinase durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal , histoquímica imunofluorescente foi empregada, usando-se um anticorpo para deteção de β-galactosidase (anti-beta-Gal). A análise dos cortes de rim de camundongos Fltl-Cre+, VEGF(loxP/loxP) com 4 semanas de vida aumentou os números e a coloração de células mesangiais a8 duplamente positivas para β-Gal/ integrina comparada com ninhadas Flt1-Cre+;VEGF(loxP/+). Entretanto, nós não detectamos as células duplamente positivas para β-Gal e o marcador de podócito WT-1 ou marcador de célula endotelial CD31. A imunohistoquímica revelou que o transgene Fltl-Cre foi detectado em células mesangiais, mas não em células endoteliais, enquanto que as células endoteliais tubulares, conhecidas por expressar Flt-1, foram positivas. Ver Fig. 2, Painel b. O PCR genômico revelou níveis significativos de ablação do VEGF em rins durante o desenvolvimento embrionário (E17.5 e E18.5) e na célula mesangial explantada de rins de camundongos Fltl-Cre+; VEGF(loxP/wt) com uma semana de vida, seguindo a expansão por 7 a 10 dias. Essas descobertas são consistentes com um artigo anterior (ver, por exemplo,Takahashi, Τ. et al. Protein tvrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26(1995)), o que sugere que as células mesangiais dentro dos glomérulos do rim podem expressar tanto VEGF-A como Fltl e ainda suportar a noção de que a ablação do gene VEGF nos glomérulos de camundongos Fltl-Cre+; VEGF(loxP/loxP) ocorre pelo menos nas células mesangiais. A anulação do gene VEGF-A pode ocorrer em outras células glomerulares ou em células de fora do compartimento glomerular, as quais não são detectadas em nossos testes, e podem contribuir indiretamente com as alterações glomerulares observadas. A análise da expressão gênica quantitativa de RNA confirmou que a lesão no tecido e os processos de reparo em andamento no rim Flt1-Cre+;VEGF(loxP/loxP) provoca supra-regulação marcada de Cre-recombinase (ver Fig. 2, Painel c). Concomitantemente, uma infra-regulação de Flkl (9VEGFR-2) e VEGF-A foi detectada (Fig. 2, Painel c), consistente com a anulação do gene VEGF-A e uma redução na vascularidade glomerular (Fig. 3, Painel g e h), enquanto os níveis de Flt-1 permaneceram inalterados. Os experimentos de hibridização in situ de rins Fltl-Cre+; VEGF(loxP/loxP) revelaram expressão acentuadamente reduzida de VEGF-A em todos os tipos de célula glomerular por 7 sete semanas de idade. A análise imunohistoquímica de rins com uma semana de idade para expressão de VEGF e B-Gal identificou 3 classes principais de glomérulos: 1.) glomérulos que expressam níveis normais do VEGF na ausência de coloração β-Gal. 2.) glomérulos que exibem expressão reduzida do VEGF e pontual de β-Gal e 3.) níveis indetectáveis do VEGF na presença de alta colcoração de β-Gal. A ablação do gene VEGF nas células mesangiais do rim pode ocorrerm por meio do desenvolvimento pós-natal e pode estar associada com a redução da expressão do VEGF de podócitos e/ou morte da célula de podócito. Nesses experimentos, as descobertas identificam aexpressão do VEGF por podócitos como um alvo a jusante da alça regulatória autócrina pelo VEGF em células mesangiais do rim.
Descobriu-se que a hipóxia supra-regula a expressão do VEGF-A e do VEGFR-1 (ver, por exemplo, Gerber, H.P., et ai Differential transcriptional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1. but not Flk-1/KDR, is up-regulated bv hypoxia. J Biol Chem 272:23659-67(1997)) e hipóxia renal aumentada foi relatada em glomerulonefríte. Ver, por exemplo, Nangaku, M. Mechanisms of tubulointerstitial iniury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med 43:9-17(2004). Quando analisados os glomérulos do rim de Fltl-Cre+; VEGF (loxP/loxP) de 4 semanas para regiões hipóxicas usando-se (Hypoxyprobe™-Mab1), hipóxia aumentada foi consistentemente encontrada em camundongos nocaute condicional, em comparação às ninhadas do tipo selvagem, indicando que a hipóxia pode acelerar a ablação do gene VEGF via supra-regulação de Flt-CRE. As variações regionais na hipóxia, combinadas com variações na gravidade da progressão da doença dentro dos glomérulos individuais podem explicar a freqüente expressão focai com o transgene Fltl-Cre e a falta da expressão do transgene em células endoteliais glomerulares, as quais estão em contato ditero com a circulação normóxica.
Alterações Patofisiológicas Em Glomérulos De camundongosTrangénicos Flt-CRE+; VEGF-(Loxp/Loxp)
As alterações histopatológicas que ocorrem em camundongos Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) foram analisados para entender os eventos celulares que levam à insuficiência renal. As estruturas glomerulares anormais estavam evidentes em camundongos Flt-Cre+; VEGF(loxP/loxP) examinados por microscópio de luz nas semanas 2, 3 e 7. Em camundongos com idade de 2 semanas, os cistos estavam presentes por todo córtex renal (Fig. 3, Painel a) e 2 tipos de estruturas glomerulares poderiam ser diferenciadas daquelas queestavam distintas na aparência para os glomérulos da suas ninhadas WT compatíveis em idade (Fig. 3, Painel b). Em camundongos Fit-Cre+; VEGF (loxP/loxP) com 2 semanas de idade, glomérulos subdesenvolvidos consistindo de podócitos ao redor do núcleo acelular foram freqüentemente observados 5 (Fig. 3, Painéis a e c). Os glomérulos com essa aparência podem falhar na função, devido a uma ausência das alças capilares e eles podem falhar no desenvolvimento a partir deste estágio, já que não há evidencia de uma estrutura similar no rim de camundongos com idade de 7 semanas (Fig. 3, Painéis e & f). Numerosos glomérulos no rim de camundongos Flt-Cre+; 10 VEGF (loxP/loxP) com 2 a 3 semanas de idade estavam acentuadamente aumentados e exibiram depositos proteináceos, eosinofílicos abundantes por todo o glomérulo, além da ausência e colapso de alças capilares existentes (Fig. 3, Painel d). Esses glomérulos têm uma aparência semelhante à dos glomérulos típicos de camundongos Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) com idade de 7 semanas, que exibem glomerulosclerose, fibrose e nefrite intersticial focai (Fig. 3, Painel f). Dentro de cada rim, glomérulos individuais são afetados em diferentes graus, com alterações evidentes, de moderada a grave. Além disso, grandes cistos alinhados com o epitélio de transição (Fig. 3, Painel a), e grupos dispersos de túbulos corticais dilatados preenchidos com material protéico foram observados (comparar Fig. 3, Painéis e & f). Celularidade diminuída estava evidente po todo glomérulo dos camundongos Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) quando comparados com aqueles rins observados em WT, que atribuídos, em parte, a números reduzidos de células endoteliais (comparar Fig. 3, Painéis g e h). A coloração de CD31 diminuída nos rins Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) foi acompanhada por deposições focais de colágeno IV e Iaminina em muitos glomérulos escleróticos, como determinado por RT-PCR (Fig. 6, a-d) e coloração imunohistoquímica. Por exemplo, no corte de rim de camundongos de 7 semanas de idade, a deposição de Iaminina foi detectadanos túbulos e por todos os glomérulos dos renais doentes, e a coloração para colágeno IV aumentada foi detectada em tecido doente comparado com a ninhada do tipo selvagem. Além disso, o fator β de transformação do crescimento de (TGF-β, Fig. 3, Painéis i e j), um mediador de fibrose glomerular e lesão do tecido freqüentemente estava supra-regulado na doença renal (análise por Schnaper, H.W., et ai TGF-beta siqnal transduction and mesanqial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-52(2003)), bem como a actina alfa do músculo liso (Fig. 3, Painéis k e I), um marcador para as células mesangiais ativadas, ambas estavam acentuadamente elevadas nos rins lesionados.
A análise ultraestrutural dos cortes de rim pelo microscópio eletrônico de transmissão identificou defeitos no mesângio e outras características consistentes com glomerulosclerose focai incluindo fusão do processo base do podócito da matriz mesangial em rins FIt-CRE+; vEGF(loxP/loxP) (Fig. 3, Painel m). Embora o endotéliio pareça saudável em alguns glomérulos, a perda de fenestrações e a expansão em massa da membrana basal glomerular são observadas nos glomérulos com lesões mais avançadas. Além disso, a perda de células mesangiais e depósitos eletrodensos estavam presentes (Fig. 3, Painel m) no glomérulo subdesenvolvido.
Ablacão Do Gene VEGF Em Células Mesangiais Glomerulares Está Associada Com Depósitos De Imunoglobulina M (Igm) E AtivaçãoGlomerular
A evidência de uma resposta imune aumentada nos rins de camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) foi sugerida por elevações nos linfócitos circulantes. A análise RT-PCR quantitativa em tempo real do RNA do rim para marcadores de monócito/macrófago, linhagens de célula-B e célula-T (CD11b, F4/80, CD45R e Thy-1, respectivamente) detectou infiltrados imunes em rins decamundongos FIt-CRE+; VEGFiloxpi1oxf^1 mas não nas ninhadas controle (Fig.4, Painel a). A análise imunohistoquímica revelou números aumentados de células que expressam F4/80 e CD4, um marcador de um subgrupo de células T1 nos rins de camundongos FIt-CRE+; VEGF (loxP/loxP). Ver Fig. 4, Painel b.
Infiltrações de células imunes pareceram ser específicas para tecidos renais, já que estes marcadores não estavam elevados nos pulmões ou corações de camundongos transgênicos Flt-Cre+; VEGF(loxP/loxP).
Entre as subclasses de anticorpos analisados, IgM, mas não IgG1 IGA, IgD ou IgE foram encontrados, depositados em glomérulos doentes, por 10 exemplo, por coloração de imunofluorescencia do tecido cortical renal de camundongos Fltl-Cre+;VEGF(loxP/loxP) com idade de 5 semanas, usando-se anticorpos monoclonais específicos para IgM e cada isotipo de murino de IgG. Além disso, um aumento acentuado nas proteínas C1q, C3 e C4 da via de complemento foi detectado (por exemplo, por imunofluorescência empregando 15 anticorpos monoclonais específicos para componentes da via C1q, C3 e C4), particularmente nos glomérulos de rim FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) comparados com o rim WT. C1q, C3 e C4 aumentadas foram detectadas em camundongos com idade de 1 semana, o que sugere que a Iise de célula mediada por complemento pode contribuir significativamente para a lesão do rim em 20 camundongos FIt-CRE+; VEGF(loxP/loxP). A evidência da lesão mediada por complemento nos rins de camundongos com deleção seletiva do podócito haplo-insuficiente do VEGF não foi detectada.
Ablacão Do Gene VEGF in vitro Afeta contrariamente A Sobrevida Da Célula Mesangial:
Evidência Do VEGF Atuando Via Alça Autócrina
Interna Nas Células Mesangiais
Para investigar os efetos da ablação do gene VEGF-A e Fltl na célula mesangial cultivada in vitro, nós geramos camundongos com um alelo condicional para o alelo Fltl (Fltl-lox/loxP). Consulte Fig. 5, Painel a. Umvetor de direcionamento no qual o exon 1 do gene Fltl de camundongo está flanqueado pelos sítios IoxP foi gerado e usado para a recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo. Camundongos Flt1(loxP/loxP) nasceram em freqüencias mendelianas esperadas, indicando que a presença 2 sítios IoxP nao interferem no desenvolvimento do camundongo. As preparações homogêneas de células mesangiais de camundongos WT VEGF(loxP/loxP) e Fltl (loxP/loxP) foram obtidas de isolados glomerulares e infectados com adenovírus controle que expressa LacZ (Ad-LacZ) ou adenovírus que expressa Cre-recombinase (Ad-Cre). As freqüências de ablação dos genes Fltl e VEGF-A in vitro foram monitoradas pela análise de Southern blot (Fig.. 5, Painel b) e RT-PCR em tempo real (Fig. 5, Painéis c e d) e com resultado >95 %. A ablação do gene Flt-1 ou VEGF-A em células mesangiais provocou uma redução significativa na sobrevida de célula (Fig. 5, Painel e), indicando que o VRGF regula a sobrevida da célula mesangial de uma maneira autônoma à célula, mediada por Flt1. A adição de um anticorpo VEGF neutralizante (α-VEGF, G6-23) não provocou impacto na sobrevida da célula mesangial (Fig. 5, Painel f). Como G6-23 está excluído do compartimento intracelular, a falha para recapitular a diminuição na sobrevida da célula mesangial observada em células mesangiais deficientes em Fltl e VEGF-A indica que o VEGF-A pode atuar via uma alça autócrina interna. A redução na sobrevida das células mesangiais deficientes em Fltl é maior que aquela provocada pela deficiência do VEGF-A isolado, o que sugere que outros Iigantes para Fltl1 como PIGF ou VEGF-B também podem contribuir.
Ablação Do Gene VEGF Em Células Mesangiais Induz Alterações NaExpressão Gênica De Acordo Com A Produção Aumentada De ECM
Nós conduzimos uma análise de ontologia gênica (GO) de genes que são expressos de forma diferente nas células mesangiais deficientes em VEGF-A. Quando selecionados para alterações maiores que 2 vezes (valorabsoluto) e valores ρ < 0,05 (teste t do estudante), nós encontramos 480 de 11810 genes analisados sendo significativamente supra-regulados em células mesangiais deficientes em VEGF-A quando comparados com as células mesangiais WT. A comparação das anotações GO entre a classe de genes supra-regulados e um conjunto controle de todos os genes revelou diferenças significativas em genes envolvidos na regulação de quimiotaxia, integridade estrutural ou produção de EMC1 mecanismos de migração celular e de defesa humoral estavam significativamente supra-representados (Tabela 2). Nós realizamos uma análise idêntica para genes infra-regualdos em células mesangiais deficientes em VEGF-A e identificamos seis categorias que estavam significativamente supra-representadas. Três de seis categorias fizeram parte da super classe de genes proteolíticos e uma incluiu genes envolvidos na comunicação celular (Tabela 2). A análise da via de sinalização, realizada usando-se a análise de Ingenuity Pathways ainda revelou que a expressão dos genes pertencentes às subclasses definidas como crescimento celular e proliferação, montagem celular, via de organização e comprometimento, estavam significativamente modificadas em células mesangiais deficientes em VEGF (Tabela 2). Nós também identificamos que a expressão de 46% a 57% dos genes que pertencem às categorias de redes moleculares envolvidas na síntese de proteínas, morte celular, sinalização célula-célula e resposta imune foram significativamente afetados pela deficiência em VEGF (Tabela 2). Os genes candidatos associados com o acúmulo da matriz mesangial ou doença glomerular estavam também desregulados significativamente nas células mesangiais deficientes em VEGF-A. Entre eles, tgf-βΐ (ver, também,, Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252(2003)), angiopoietina-1 (ver, por exemplo, Satchell, S. C., e Mathieson, P. W. Angiopoietins: microvascular modulators with potential rolesin glomerular pathophysiology. J Nephrol 16:168-178(2003)), e COX-2 (analisado em (Nasrallah, R. & Hebert, R.L. Prostacvclin signalinq in the kidnev: implications for health and disease. Am J Physiol Renal Physiol 289:F235-46 (2005)) estavam supra-regulados, enquanto que o receptor β do fator de crescimento derivado de plaquetas (Pdgfr-β) e Pdgf-c (analisado em (Betsholtz, C. et al. Role of platelet-derived growth factor in mesangium development and vasculopathies: Iessons from platelet-derived growth factor and platelet-derived growth factor receptor mutations in mice. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:45-52 (2004))) estavam infra-regulados. As alterações na expressão gênica em células mesangiais deficientes em VEGF-A in vitro destaca uma mudança na direção do acúmulo dos componentes do mesângio de ECM e identificou VEGF-A para regular esses processos de uma maneira autônoma à célula.
Tabela 2
Alterações Na Expressão Gênica Associada Com A Deficiência Do VEGF
Em Células Mesangiais
Classes de ontologia gênica que estavam significativamente supra-representadas naqueles genes infra ou supra regulados nas células mesangiais deficientes de VEGF-A.
Famílias De Ontologia Gênica Supra-Reguladas Em Células Mesangiais
Deficientes Em VEGF
<table>table see original document page 125</column></row><table>Ontologia QUANTIDADE DE VALOR P MELHORAMENTO
<table>table see original document page 126</column></row><table>
A Análise de Ingenuity Pathways identificou as vias funcionais represenadas pelos genes cuja expressão foi significativamente regulada de maneira diferencial nas células mesangiais deficientes em VEGF-A.
Genes Classificados Pelas Vias Funcionais Que São Significativamente Alterados Na Expressão Em Células Mesangiais Deficientes Em VEGF
<table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table>Patologias Renais Associadas Com A Expressão Diminuída Do VEGF Durante O Desenvolvimento Do Rim
Uma função autônoma celular do VEGF-A nas células mesangiais do rim, mediadas por Flt-1, é identificada e uma função do seu mecanismo regulatório durante o desenvolvimento do rim está descrita. A evidência estabelece que a interferência com esse mecanismo regulatório pode provocar algumas das características patofisiológicas associadas com a glomeruloesclerose. A insuficiência renal progressiva nesse modelo representa um modelo de lesão no desenvolvimento, ao invés de um modelo 1 de gromerulonefrite em adulto. Há algumas semelhanças na patologia do rim neste modelo e nas doenças renais humanas associadas com os níveis mais baixos do VEGF nos rins (ver, por exemplo, Schrijvers, B.F., et ai, The role of vascular endothelial qrowth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65:2003-17(2004)), por exemplo, na lesão glomerular, esclerose, depósitos inflamatórios e ativaçao de complemento. Ver, por exemplo, Isselbacher, K.J. et al. Harrison's Princip Ies of Internai Medicine, (1994) (McGraw-HiII Inc., Nova York). O camundongo Flt-Cre+; VEGF(loxP/loxP) é um modelo genético que exibe o acúmulo dos depósitos e ativação de C1q, C3 e C4 nos rins doentes. Nossas descobertas são diferentes das observações anteriores em camundongos com idades de 9 a 12 semanas com haplodeficiência ao VEGF-A que desenvolveram a insuficiência renal de estágio final na ausência da formação do complexo imune. Ver, por exemplo, Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression Iead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003).
A maioria dos artigos que investigam a expressão do VEGFR1e/ou VEGF-A nas células primárias isoladas e nos rins saudáveis e doentes, identificaram as células mesangiais como as mais prováveis para co-expressar ambos os genes (ver, por exemplo, Thomas, S. et al. Vascular endothelialqrowth factor receptors in human mesanqium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000); Gruden1 G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of siqnal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 bv human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001); Takahashi1 T. et al. Protein tvrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995); Simon1 M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogenesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268 (1995); e Noguchi1 K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 9:1815-25 (1998)), ao invés de podócitos, que são conhecidos por expressar níveis mais altos do VEGF-A (ver, por exemplo, Berse1 B. et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentiallv in normal tissues, macrophages, and tumors. Molecular Biology ofthe Cell 3:211-20 (1992); e Brown1 L.F. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) bv epidermal keratinocytes during wound healing. Journal of Experimental Medicine 1 76:1375-9 (1992)), ou células endoteliais que expressam VEGFR-1 (ver, por exemplo, Thomas1 S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000)). Os podócitos Cre-positivos não foram detectados em camundongos transgênicos composto de Fltl-Cre+, VEGF (LoxP/LoxP),ROSA26 em vários estágios durante o desenvolvimento. A ausência da expressão de VEGFR-1/2 em podócitos não transformados está consistente com os artigos anteriores (ver, por exemplo, Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangialcells: mechanisms of signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et ai Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001); e Takahashi1 T. et ai. Protein tvrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)) e com nossas observações. Entretanto, a transformação dos podócitos de murino primário com antígeno T grande SV40 resultou na expressão de VEGFR-1 e VEGF-A em algumas linhagens celulares de podócito transformadas. Ver, por exemplo, Chen1 S. et al. Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV) collagen production by transforming growth factor-betal in mouse podocvtes. Diabetes 53:2939-49 (2004).
É fornecido evidência para a existência de dois mecanismos regulatórios no desenvolvimento dos glomérulos renais controlados por VEGF: 1) o mecanismo parácrino entre o podócito e as células endoteliais dos capilares glomerulares, os quais sugeriu-se estarem envolvidos na indução e manutenção das taxas de filtração glomerular e/ou fenestradas (analisadas em Schrijvers1 B.F., et al. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophvsiology. Kidney Int 65:2003-17 (2004)); e 2.) a alça autócrina nas células mesangiais que regulam a produção de EMC e as funções dos podócitos, incluindo a expressão do VEGF. O modelo em que a produção do VEGF em podócitos é uma função a jusante da função autócrina do VEGF em células mesangiais, podem contar com a sobreposição nos fenótipos em camundongos com deficiência em VEGF em todos os tipos de célula. A deficiência em VEGF mesangial também levou a um conjunto adicional de alterações renais não encontradas especificamente no podócito em camundongos haplo-insuficientes para VEGF, incluindo a presença de células inflamatórias de infiltração (Fig. 4 a-b) e a expansão da membrana basalglomerular (Fig. 3m). Essas descobertas sugerem que o tipo celular afetado, além da redução geral na expressão do VEGF-A, pode representar um determinante essencial para a patologia renal. A administração dos compostos que estimulam a sinalização do VEGF1 em particular VEGFR-1, pode ser benéfico para o tratamento de um subgrupo de doenças renais associadas com a esclerose glomerular.
Efeitos Diferenciais Entre A Inativacão Genética E Bioquímica Do VEGF Nas Células Mesangiais: Evidências Adicionais Para As Funções Efetoras Internas Autócrinas Do VEGF-A Como Um Mecanismo Regulatório
Um pré-requisito para a detecção da função do VEGF autônoma àcélula nas células mesangiais foi a falha aparente do VEGF-A derivado do podócito em resgatar as células mesangiais deficientes em VEGF-A via sinalizaçao justácrina. Sem se limitar a um modelo simples, a identificação da expressão do VEGF no podócito como sendo uma função a jusante da alça autócrina do VEGF nas células mesangiais fornece uma razão para a incapacidade dos podócitos em resgatar as células mesangiais deficientes em VEGF-A. Uma função autônoma da célula para VEGF-A na regulação da sobrevida de célula-tronco hematopoiética (HSCS) foi relatada anteriormente. Ver, por exemplo, Gerber1 H.P. et al. VEGF regulates haematopoietic stem cell survival bv an internai autocrine Ioop mechanism. Nature 417, 954-8 (2002). Em analogia, a administração de um anticorpo que neutraliza o VEGF-A (G6-23) para a célula mesangial crescida em cultura não provocou impacto sobre o número de célula mesangiais, ao contrário das células deficientes em VEGF-A ou Flt1. Sem se limitar a uma teoria, as descobertas sugerem que a sinalização autócrina pode representar um mecanismo regulatório geral para separar as funções parácrinas do VEGF que controlam a formação dos vasos sangüíneos das funções efetoras angiogênicas (analisados em, por exemplo, Gerber, H.P. & Ferrara, N. The role of VEGF in normal and neoplastichematopoiesis. J Mol Med 81:20-31(2003)) em múltiplos tipos celulares.
Exemplo 2 VEGFR Variantes Seletivos Do VEGF A geração e caracterização de VEGF variantes que se ligam seletivamente e ativam um receptor VEGF específico (como KDR ou Flt-1) foi conhecida na técnica e descrita em, por exemplo, Li et ai J. Biol. Chem. 275:29823 (2000); Gille et al. J. Biol. Chem. 276:3222-3230 (2001); publicações PCT documentos WO 00/63380 e 97/08313; e patente US 6057428, a divulgação desta é expressamente incorporada ao presente como referência.
Especificadamente, um VEGF variante de alta seletividade para oreceptor Flt-1 foi gerado pela combinação de quatro mutações que afetam bastante a KDR, mas não a ligação a Flt-1. A mutação de Ile 43, Ile 46, Gln 79 e/ou Ile 83 mostrou que as cadeias laterais desses resíduos são críticos para a ligação compacta da KDR, mas não importante para a ligação Flt-1. Li et al. (2000) acima. Um Flt-sel variante foi construído com substituições de alanina nas posições Ile 43, Ile 46, Gln 79 e llê 83, usando-se os métodos de mutagênese diregido ao sítio, descritos por Kunkel et al. Methods Enzymol. 204:125-139 (1991). Esse variante Flt-sel específico também pode ser representado pelo identificador I43A/I46A/Q79A/I83A. Os códons correspondentes para essas quatro substituições de alanina nas posições 43, 46, 79 e 83 são GCC/GCC/GCG/GCC, respectivamente.
Vários testes foram conduzidos para examinar as propriedades e atividades biológicas de Flt-sel variante I43A/I46A/Q79A/I83A. Li et al. (2000) acima. Por exemplo, as medições de ligação quantitativa foram realizadas usando-se um teste de ligação do receptor rádio-imuno solúvel (RIA). No teste,o VEGF(8-109) nativo tem afinidades para KDR e Flt-1 de 0,5 nM e 0,4 nM, respectivamente. Flt1-sel foi encontrada como tendo pelo menos afinidade de ligação a KDR reduzida 470 vezes nesse teste. Pequenas reduções naligação Flt-1 foi observada a partir dos pontos mutantes individuais em ELISA, a afinidade dos variantes Flt-sel para Flt-1 foi essencialmente idêntica àquela da proteína nativa.
A especificação é considerada suficiente para permitir um técnico no assunto praticar a invenção. Entende-se que os exemplos e realizações descritos no presente pedido são apenas para propósitos ilustrativos. Realmente, várias modificações da invenção, além daquelas apresentadas e descritas no presente pedido se tornarão aparentes para os técnicos no assunto a partir das descrições anteriores, e se incluem no escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente pedido estão integralmente incorporados para todos os propósitos.Listagem de Seqüências
<110> GENENTECH, INC. Baldwi η, Megan Ferrara, Napoleone Gerber, Hans-Peter
<120> Métodos Para Tratar Desordens no Rim
<130> P2B46R1
<141> 26-03-2007
<150> US 60/786,246 <151> 27-03-2006
<160> 12
<210> 1 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 1 gatggccttg agtatatcct g 21
<210> 2 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 2 cagctctgga ctccagcttg c 21
<210> 3 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 3 ggaaactatg tggctgatct c 21
<210> 4 <211> 21 <212> DNA<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 4 gtgagagcca agatcgagga g 21
<210> 5 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 5 tagactctgc gcgccataac t 21
<210> 6 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 6 cactaagaag gcagaggcca a 21
<210> 7 <211> 21 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 7 cctgcatgat tcctgattgg a 21
<210> 8 <211> 18 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência ê sintetizada
<400> 8 gcctaagctc acctgcgg 18
<210> 9 <211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 9 caccgcgact cctgctgctt t 21
<210> 10 <211> 19 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 10 gggggttcgg gcactgctt 19
<210> 11 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 11 caacgtcact atgcagatca tgcg 24
<210> 12 <211> 19 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência é sintetizada
<400> 12 tcaccgcctt ggcttgtca 19

Claims (20)

1. MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UMA DOENÇA RENAL, que compreende: administrar uma quantidade efetiva de um agente modulador do VEGFR a um sujeito com doença renal, em que o agentemodulador do VEGFR compreende um agonista de Fltl.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista de Fltl é um anticorpo agonista de Fltl.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista de Fltl é um agente seletivo Fltl VEGFA.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o agonista de Fltl é VEGF A, PIGF ou VEGFB.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista de Fltl é um agonista de Fltl de molécula pequena.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicaçãol, caracterizado pelo fato de que a doença renal é caracterizada por uma redução nos níveis doVEGF.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença é doença inflamatória renal.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória renal é caracterizada por alterações nascélulas inflamatórias, deposições do complexo imune ou ativação de complemento nos glomérulos afetados.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, em que a deposição de complexo imune é deposição de IgM.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a ativação de complemento compreende ativação de C1q, C3 eC4.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a doença renal compreende gIomeruIonefrite.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a glomerulonefrite é determinada por proteinúria, esclerose glomerular ou hipertensão.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a glomerulonefrite é determinada pela diminuição da sobrevida das células mesangiais renais, aumento na expressão gênica da síntese de ECM ou redução na degradação da matriz.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado 10 pelo fato de que a glomerulonefrite é glomeruloesclerose segmentai (FSGS).
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, que compreende, ainda, administrar uma quantidade efetiva de um segundo agente, em que o segundo agente é um agente angiogênico.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, que 15 compreende, ainda, administrar uma quantidade efetiva de um segundoagente, em que o segundo agente é um agonista de Fltl.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente angiogênico é VEGF.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado 20 pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 25 pelo fato de que o sujeito tem uma infecção que causa doença renal.
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