MX2008012276A

MX2008012276A - Metodos para el tratamiento de alteraciones del riñon.

Info

Publication number: MX2008012276A
Application number: MX2008012276A
Authority: MX
Inventors: Napoleone Ferrara; Hans-Peter Gerber; Megan Baldwin
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2008-10-08
Also published as: JP2009541207A; NO20084487L; WO2007112364A1; CN101454018A; US20070264259A1; BRPI0709411A2; RU2008142374A; KR20080108570A; CA2647268A1; EP2015768A1; AU2007230580A1; IL194373A0; US20080206243A1

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de alteraciones del riñón en un sujeto mediante la administración de una cantidad efectiva de un agonista de VEGFR, por ejemplo, un agonista de Fltl a un sujeto. Los agonistas están compuestos de composiciones que comprenden agonistas de VEGFR, por ejemplo, VEGF, anticuerpos dirigidos a Fiti, ligandos de Fltl, activadores de molécula pequeña de Fltl o agentes selectivos de Fltl en un portador aceptable farmacéuticamente para uso en la activación de Fiti.

Description

METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE ALTERACIONES DEL RIÑON CAMPO DE LA INVENCION La invención es concerniente con usos terapéuticos de agentes moduladores de VEGFR, en los que se incluyen métodos para utilizar agonistas de VEGFR para el tratamiento de alteraciones del riñon (renales) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) regula una variedad de funciones vasculares, en las que se incluyen diferenciación de célula endotelial y supervivencia (véase, por ejemplo, Ferrara, N., et al. The biology of VEGF and its receptors . Nat Med 9:669-676 (2003)) vía la activación de dos receptores de cinasa de tirosina, Fltl (VEGFR-1) y Flkl ( KDR/VEGFR-2 ) expresados en células endoteliales . Estudios recientes identificaron la expresión del receptor de VEGF en varias células no endoteliales, en las que se incluyen células de tallo hematopoyéticas , sugiriendo funciones reguladoras no vasculares para el sistema de ligando/receptor de VEGF. Véase, por ejemplo, Autiero, M., et al. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders . J Thromb Haemost 1: 1356-1370 (2003) . En el riñon, los receptores de VEGF son encontrados principalmente en células pre-glomerulares , glomerulares , pos-glomerulares (véase, por ejemplo, Thomas, S., et . al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-12433 (2000)) y células endoteliales peritubulares también como en células mesangiales glomerulares, pero no en podocitos . Véase, por ejemplo, Gruden, G., et al., 1997. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduct ion . Proc Nati Acad Sci U S A 94:12112-12116 (1997) ; Harper, S.J., et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-446 (2001) y Takahashi, T., et al . Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226 (4-6) (1995) . En el riñon adulto normal, la expresión del VEGF-A es más prominente en podocitos glomerulares y células epiteliales tubulares, más baja en células mesengiales pero indetectable en células endoteliales. Véase, por ejemplo, Noguchi, K., et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferat ive glomerulonephrit is . J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998) y Simón, M . , et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogénesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268:F240-250 articulo: 0002-9513 (1995) . En base a la ubicación de expresión, se pensó que VEGF-A juega un papel regulador en la homeostasis de riñon y filtración glomerular via principalmente funciones efectoras para- o yuxtácrinas adjuntando las células endoteliales glomerulares y peritubulares . Varios estudios han evaluado el papel de VEGF-A durante el desarrollo del riñon y en modelos de lesión renal. Véase por ejemplo, de Vriese, A.S. et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol 12: 993-1000 (2001); Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003); Kang, D.H., et al . Impaired angiogenesis in the remnant kidney model : II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J Am Soc Nephrol 12:1448-57 (2001); asuda, Y. et al. Vascular endothelial growth factor enhances glomerular capillary repair and accelerates resolut ion of experimental ly induced glomerulonephritis . Am J Pathol 159, 599-608 (2001) y Ostendorf, T. et al. VEGF(165) mediates glomerular endothelial repair. J Clin Invest 104:913-23 (1999) . La desregulación de VEGF-A es un elemento común en modelos experimentales de enfermedades renales, en los que se incluyen tumores, diabetes y glomerulonefritis (véase, por ejemplo, Khamaisi, M., et al. The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 18:1427-1430 (2003) y Schrijvers, B. F. , et al. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology . Kidney Int 65:2003-2017 (2004)) . VEGF-A y sus receptores son regulados ascendentemente en animáis experimentales o humanos con diabetes tipo I y tipo II por al menos un cierto periodo de tiempo, en tanto que los niveles de VEGF-A disminuidos fueron asociados con el desarrollo de glomerulosclerosis y fibrosis tubulointerst icial en ríñones restantes en una variedad de enfermedades de riñon progresivas. Véase por ejemplo, Honkanen, E., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor in idiopathic membranous glomerulonephritis : relat ionships to clinical course. Am J Kidney Dis 42:1139-1148 (2003) ; Korbet, S.M., et al. The racial prevalence of glomerular lesions in nephrotic adults. Am J Kidney Dis 27:647-51 (1996) ; Sivridis, E . , et al. Platelet endothelial cell adhesión molecule-1 and angiogenic factor expression in idiopathic membranous nephropathy. Am J Kidney Dis 41:360-365 (2003) y Srivastava, T., et al. High incidence of focal segmental glomerulosclerosis in nephrotic syndrome of childhood. Pediatr Nephrol 13:13-8 (1999) . Una de las características histopatológicas principales de FSGS es la acumulación de depósitos de matriz extracelular (ECM) o glomerulosclerosis. La patogénesis de la glomerulosclerosis es desconocida y no se sabe cual de los tres tipos de células presentes dentro del glomérulo (podocitos, células endoteliales o mesangiales) participan en el proceso fibrótico. Las células mesangiales se replican con producción incrementada de matriz extracelular (ECM) como parte de la respuesta glomerular a la región renal, sin consideración del tipo de lesión, por ejemplo, en glomerulonefrit is o neuropatía diabética. Este proceso imparte ultrafiltración glomerular, dando como resultado esclerosis glomerular e insuficiencia renal de etapa final. Véase por ejemplo, Buschhausen, L., et al. Kidney fibrosis impairs glomerular ultrafiltrat ion and results in glomerular sclerosis and end-stage renal failure. Regulation of mesangial cell function by vasodilatory signaling molecules . Cardiovasc Res 51:463-469 (2001) . Las anormalidades de podocitos identificadas en núcleos transgénicos de glomerulosclerosis (véase por ejemplo., Shih, N. Y., et al. Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein Science 286:312-315 (1999)) o en pacientes (véase por ejemplo, Srivastava, T., et al. Synaptopodin expression in idiopathic nephrotic syndrome of childhood . Kidney Int 59:118-125 (2001)), sugieren que estas células pueden jugar un papel en el inicio de la cicatrización glomerular. Otros modelos han implicado células endoteliales o mesangiales en el proceso esclerótico (véase por ejemplo, Schnaper, H. W. , et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis . Am J Physiol Renal Physiol 284:F243-252 (2003) ) . EDn muchos modelos de glomerulosclerosis (también como en FSGS clínicamente) , la acumulación de ECM frecuentemente aparece al comenzar en el mesangio. Todos los tres tipos de células en los glomérulos de riñon están asociados y pueden de alguna manera contribuir a la base de la enfermedad. Se piensa que el VEGF-A tiene un papel funcional en células mesangiales en base a estudios que demostraron proliferación incrementada de células mesangiales humanas primarias en respuesta a la estimulación de VEGF (Onozaki, A., et al. Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione . Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004)), inducción de síntesis de colágeno (Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates AP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)) y producción de óxido nítrico incrementada (Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 245:443-446 (1998)) . Véase también, por ejemplo, Thomas, S., et al . Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-1243 (2000) . Sin embargo, a pesar de la sensibilidad de las células mesangiales a la estimulación de VEGF-A in Vitro, la naturaleza del (los) receptor (es) de VEGF involucrado ( s ) y el efecto de alteraciones en la producción de VEGF-A en células mesangiales durante el desarrollo del riñon sigue siendo desconocida. Hay necesidad de descubrir y entender las funciones biológicas VEGF y receptores de VEGF en el riñon y en los tipos de células del riñon. El entendimiento de la función biológica de estas moléculas puede conducir a tratamientos por enfermedades de riñon. La invención trata estas y otras necesidades, como será evidente a partir de la revisión de la siguiente revelación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona métodos para el tratamiento de enfermedad renal en un sujeto. Por ejemplo, un método de la invención comprende administrar al sujeto con enfermedad renal una cantidad efectiva de un agente modulador de VEGFR. El agente modulador de VEGFR útil para la invención incluye pero no está limitado a, por ejemplo, un agonista especifico a por lo menos uno o más de los receptores de VEGF, tales como VEGF, VEGFR-1 (Flt-1) agonista, una variante de VEGF Flt-1 selectiva (Flt-sel) que se enlaza selectivamente a Flt-1, un factor de crecimiento que se enlaza y activa a Flt-1 tal como PIGF o VEGF-B, un anticuerpo agonístico anti- VEGFR-1 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal, policlonal, fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humano, humanizado o quimérico) , un agonista de Fltl de molécula pequeña, etc. En una modalidad de la invención, el modulador de VEGFR es un agonista de Fltl. En una modalidad, el agonista de VEGFR-1 es administrado en combinación con un agente angiogénico, por ejemplo, VEGF, un ligando o agonista de VEGFR1 adicional, ligando de VEGFR2, una variante selectiva de VEGFR-2 (KDR) del mismo, un anticuerpo agonista de anti-VEGFR-2, VEGF-C, VEGF-D, un factor de crecimiento que se enlaza y activa VEGFR1 y/o VEGFR2, etc. Las enfermedades de riñon que puede ser tratadas mediante la invención incluyen pero no están limitadas a, enfermedad inflamatoria del riñon, (por ejemplo, caracterizada por alteraciones en células inflamatorias, deposiciones complejas inmunes (por ejemplo, deposición de IgM) , activación del complemento (por ejemplo, activación de Clq, C3 y C4) o una combinación de los mismos), nefritis, glomerulosclerosis, glomerulonefrit is (falla renal) (por ejemplo, que puede ser determinada por proteinuria, esclerosis glomerular, hipertensión, supervivencia reducida de células de riñon mesangial, un aumento en la expresión génica de la síntesis de ECM, una reducción en la degradación de matriz y/o una combinación de estos factores), glomerulosclerosis focal segmentaria (FSGS), etc. En ciertas modalidades de la invención, el sujeto tiene una infección que resulta en enfermedad renal. En ciertas modalidades, la enfermedad renal está caracterizada por una reducción en los niveles VEGF. En ciertas modalidades de la invención, la enfermedad comprende alteraciones en los tipos celulares del riñon (por ejemplo, células mesangiales, podocitos y/o células endoteliales) . En ciertas modalidades de la invención, el agente de la invención, que es suministrado al sujeto, es una proteina o polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, un agente de la invención puede ser administrado al sujeto a través de un sistema de administración sistémico. El sistema de administración sistémico puede comprender una preparación de lenta liberación que comprende un agente, por ejemplo, agente purificado y una matriz de polímero. En una modalidad, una preparación celular comprende células de mamífero (por ejemplo, células CHO) que expresan una forma recombinante del agente que es administrado, alternativamente, el agente tema de la invención puede ser administrado vía la administración de un vector de gen dirigido al riñon que comprende un ácido nucleico que codifica para el agente. Está bien establecido que los vectores virales o no virales para terapia génica pueden ser usados, por ejemplo, un vector de gen dirigido al riñon. Un artículo de fabricación y equipo que comprende un agente regulador VEGFR son también proporcionados, así como equipos y métodos de diagnóstico.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura la - h, ilustran la caracterización de ratones transgénicos Fltl-Cre utilizando la cepa de reportero ROSA26 LacZ y generación de ratones Fltl-Cre; VEGF-loxP. (a) Frecuencia de genotipo de progenie que surge de cruces de ratones Fltl-Cre+, VEGF<loxP/+> y Fltl-Cre-; ^£GF oxP/ioxP> . Los ratones de todos los genotipos resultantes son nacidos a la frecuencia mendeliana esperada, (b) Curva de supervivencia para ratones Fltl-Cre+ ; vEGFlloxP/loxP> . La sobrevivencia disminuida es evidente 4 semanas después del nacimiento y >95% de estos ratones fallecieron a las 12 semanas de edad, (c) Porcentaje de proporción de riñon a masa corporal en ratones Fltl-Cre+ en comparación con Fltl-Cre+; VEGF<I XP/IOXP> enriquecidos 7.5 semanas. Los ríñones de Fltl-Cre+; VEGF<IOXP/IOXP> PESAN significativamente menos que aquellos de los controles. Fltl-Cre', n = 25; Fltl-Cre+ ; VEGFtloxP/loxP' , n = 10; *p = < 0.0001. (d) (Derecha) . Apariencia típica de un riñon extirpado de un ratón Fltl-Cre+; VEGF<1OXP/1OXP) a 4 semanas de edad en comparación con (izquierda) un WT y riñon fenotípicamente normal. Los ríñones Fltl-Cre+ ; VEGF<1OXP/1OXP> son frecuentemente císticos y pálidos en apariencia, (e) (parte superior). Teñido de plata para detectar proteína presente en la orina de ratones Fltl-Cre-loxP de 4-5 semanas de edad. Un microlitro de orina de tres ratones representativos para cada genotipo mostrados en la parte superior del panel, fue sometido a SDS-PAGE y teñido de plata. Se detecta proteína abundante en la orina de ratones Fltl-Cre+; yE F<loxP loxP> f pero no en ratones Fltl-Cre+; VEGF(loxP/+) o Ftll-Cre, indicando proteinuria severa en las expulsiones de VEGF condicionales. El análisis de Western blot (fondo) de la orina de ratones Ftll-Cre ; VEGF-loxP utilizando un anticuerpo criado contra albúmina. (f) niveles de nitrógeno de urea en sangre (B.U.N.) en ratones Ftll-Cre; VEGF-loxP de 7.5 semanas de edad. Fltl-Cre+ ; VEGF<loxP/loxP> , n = 9; Fltl-Cre+ ; VEGF(loxP/+> , n = 8; Fltl-Cre' , n = 16; valor **p < 0.0001. (g) Niveles de creatinina en el suero en ratones de Fltl-Cre; VEGF-loxP de 7.5 semanas de edad. Fltl-Cre+ ; VEGF<L°*P/L°*P> n = 9; Fltl-Cre+ ; VEGF<loxP/+> , n = 8; Fltl-Cre', n = 16; valor *p < 0.05. (h) Presión sanguínea arterial media (MAP) y ritmo cardíaco promedio durante la medición de MAP. (Eje izquierdo y columnas) MAP +/- desviación estándar es ilustrada como columnas negras. MAP es elevado significativamente en ratones Fltl-Cre+ ; VEGF(1 XP/IOXP) en comparación con ratones Fltl-Cre+ ; VEGF(loxP/+> . (Ejes derecho y cuadrados) . El ritmo cardíaco de cada ratón fue registrado durante el curso de la medición de MAP y la medición promedio es mostrada como cuadrados negros +/- desviación estándar. Los ritmos cardíacos promedios no fueron significativamente diferentes en las exclusiones del VEGF condicionales en comparación con los controles. Fltl-Cre+ ; VEGFdoxp/ioxP) ^ n = 5; Fltl-cre', n = 10; valor **p < 0.005. Figura 2a - 2c, ilustran que el transgénico Ftll-Cre y VEGF-A son co-expresados en células mesangiales en glomérulo de riñon: (a) (Izquierdo) Imágenes de campo brillante teñido con H y E de secciones de riñon de ratones de 7.5 semanas de edad sometidos a hibridización in situ utilizando una sonda anti-sentido de VEGF-A. (Derecho) Fotografías de campo oscuro de las imágenes mostradas en los paneles izquierdos. La expresión de VEGF-A es marcadamente producida dentro de los glomérulos de riñon de ratones Fltl-Cre+ ; vEGF<loxP/loxP> , de edad coincidente, (b) Teñido inmunohistoquímico sobre secciones de riñon de ratones de Fltl-Cre+ ; VEGF(loxP/+) embriónicos de 18.5 días de edad utilizando un antisuero purificado por afinidad contra Cre-recombinasa . (Parte superior) Expresión de Cre-recombinasa (café), impulsada por el promotor genético Ftll, es detectada tanto en células endoteliales como mesalgiales (me) dentro del glomérulo. (Fondo) La expresión de Ftll-Cre es mostrada en células endoteliales (en) en todo el compartimiento tubulo-intersticial/medular como control, (c) Análisis de RT-PCR en tiempo real de ARN de riñon total aislado de ratones Ftll-Cre; VEGF-loxP de 7 semanas de edad. Las unidades de ARN relativas (RRU) para Cre recombinasa , Fltl , Flkl y VEGF-A fueron niveles de GAPDH normalizados y calculados a partir de curvas estándar (Gerber et al., 2000) . Fltl-Cre+ ; VEGF<loxP/XoxP) , n = 6; Fltl-Cre+; VEGF(loxP/+> , n = 6; Fltl-Cre' r n = 6; *p valué < 0.05. Figura 3a - 3m, Ilustran esquemáticamente el análisis histológico de los ríñones de ratones Fltl-Cre;VEGF-LoxP de 2 a 7 semanas de edad y micrografías electrónicas de transmisión de ríñones aislados de ratones Fltl-Cre ;VEGF-LoxP de 5 semanas de edad: (a) Corteza de riñon de un ratón Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP> de 2 semanas de edad teñido con H y E fotografiado a baja amplificación. La frontera de un quiste cortical es marcada (línea de punto) y los glomérulos, que consisten de células periféricas y que carecen aparentemente de bucles capilares glomerulares, son evidentes, (b) Sección teñida de H y E de un glomérulo de riñon WT a 2 semanas de edad, (c) Sección teñida con H y E de glomérulos de riñon en un ratón Fltl-Cre+ ;VEGF(loxP/loxP> de 2 semanas de edad. Bucles capilares herméticos como se observa en su compañero WT en (b) parecen estar ausentes, (d) Sección teñida de H y E de un glomérulo de riñon en un ratón Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP) de 2 semanas de edad que es. ampliado con capilares glomerulares que son oscurecidos por abundante deposición de ECM. (e) Apariencia típica de un glomérulo de un ratón Fltl-Cre' de 7 semanas de edad teñido con H y E. (f) Sección teñida con H y E de un glomérulo Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP> de 7 semanas de edad. En esta edad, los glomérulos de las exclusiones de VEGF condicionales son ampliados marcadamente y la deposición de ECM abundante choca sobre los capilares glomerulares y espacio urinario. (g y h) Teñido inmunohistoquímico de células endoteliales en Fltl-Cre' (g) y Fltl-Cre+ ;VEGFaoxP/loxP> (h) ríñones de 7 semanas de edad utilizando un oc-CD31. Menos células endoteliales CD31-positivas son detectadas en ríñones mutantes. (i y j) Expresión de TGF-ß en Fltl-Cre' (i) y Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP> (j) Ríñones de 7 semanas de edad detectados mediante hibridización in situ. La regulación ascendente marcada de TGF-ß es detectada en los ríñones de exclusión VEGF-A condicionales. (k y 1) Teñido inmunohistiquímico para detector actina de músculo liso alfa ( -SMA) en ríñones de Fltl-Cre' (k) y Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP) (1) ratones de 7 semanas de edad. El teñido de oc-SMA incrementado es detectable en todos los glomérulos de la exclusión de VEGF condicional, reflejando la activación de las células mesangiales restantes. (m) (Parte superior) Las micrografías electrónicas de transmisión demuestran numerosos defectos en ríñones Fltl-Cre+ ;VEGF<loxP/loxP> en comparación con ríñones de Fltl-Cre~ (fondo) . (Izquierda) Hay áreas de fusión de proceso de pata de podocito (fp) (flechas) en los ratones enfermos, mientrasque hay procesos de patas distintos en los controles. (Parte media) En el mesangio (me) , numerosos depósitos dentro de electrones (de) que no están presentes en el riñon Flt-Cre' , pueden ser observados en una ubicación sub-endotelial consistente con la glomerulonefritis inmune-moderada . (Derecho) En glomérulos con lesiones avanzadas, una membrana basal glomerular marcadamente espesa y arrugada es vista en ríñones Fltl-Cre+ ;VEGF(loxP/loxP> . Células endoteliales fenestradas (en) son observadas en los controles pero no están en las exclusiones del VEGF condicionales. Figura 4a -4b, ilustran esquemáticamente el avance de insuficiencia renal en ratones Fltl-Cre+ ;VEGF(1OKP/1OXP> está asociado con la deposición de IgM y activación de complemento: (a) Cambio en veces en los niveles de ARN de genes expresados sobre células del monolito/macrófago (MAC-1, F4/80) , célula B (CD45R) y linajes de célula T (Thy-1), en Fltl-Cre+ ;VEGF(loxP/loxP> en comparación con riñon de Fltl-Cre', pulmón y tejido de corazón (barras negras) y en Fltl-Cre* ;VEGF<LOXP/+> en comparación con órganos Fltl-Cre' coincidentes (barras grises). Los niveles de expresión han sido estandarizados a los conjuntos de sonda/cebador específicos para GAPDH murino. Cambios de veces estadísticamente significativos en expresión son indicados por asteriscos, valor p < 0.005. Fltl-Cre+; VEGF(1OXP/1OXP> , n = 6; Fltl-Cre+ ; VEGF(loxP/+> , n = 6; Fltl-Cre~, n = 6. (b) (Izquierdo) Teñido inmunohistoquímico/fluorescente para células de los linajes de monocito/macrófago y célula T (derecho) en los ríñones de ratones de Fltl-Cre~ y Fltl-Cre+ ,VEGF(loxP/loxP> de 5 semanas de edad, utilizando un anticuerpo de a-F4/80 y a-CD4 respectivamente. Los monocitos/macrófagos y un subconjunto de células T son reclutados al tejido de riñon de las exclusiones VEGF-A condicionales. Figura 5a -5f, ilustran el análisis in vitro de VEGF-A y células mesangiales Fl tl-deficientes : (a) Estrategia de apuntamiento genético para crear ratones Flt-loxP. El vector de apuntamiento fue diseñado para introducir un cásete de PGK-Neo flanqueado por 2 sitios loxP (LoxPl y LoxP2) corriente arriba del primer exón que contiene el codón de inicio de traducción (ATG) del gen Fltl y para introducir un tercer sitio de loxP (LoxP3) 3' al primer exón. En seguida de la expresión de Cre-recombinasa, los clones de célula de tallo embriónico (ES) que han sufrido recombinación entre LoxPl y LoxP2 fueron seleccionados y usados para generar ratones Fltl-loxP. Las posiciones de las sondas de ADN genómicas PCR-amplificadas (5' Pr, 3' Pr) usadas para seleccionar por eventos de apuntamiento y recombinación mediante Southern blotting son mostrados. La posición de sitios de enzima de restricción usados en esta selección y el tamaño de las regiones del vector de apuntamiento (en kilobases) son como se indica. E: EcoRI; H: HindIII; K: Kpnl; kb: kilobases. (b) Análisis de Southern blot ADN genómico extraído de WT y clones de célula ES apuntada (Objetivo) y de células mesangiales Fl tl(i xP/ioxP> (Mes. ) infectadas con adenovirus que codifica genes LacZ (LZ) o Cre-recombinase (Cre) . El AND genómico de las células respectivas fue sometido a digestión ya sea con EcoRI o con HindIII y Kpnl para analizar eventos de apuntamiento y recombinación de loxP ya sea en el extremo 5' o el extremo 3' de las regiones apuntadas del gen Ftll respectivamente. Los tamaños de los fragmentos esperados detectados en cada uno de los carriles son indicados (en kilobases) a la izquierda y derecha de cada panel respectivamente, (c) Expresión de VEGF-A en células mesangiales infectadas con adenovirus. Las células mesangiales fueron aisladas de ratones WT y VEGFnoxP/ioxP> e infectadas con adenovirus que codifica LacZ (Ad-LacZ) o Cre-recombinasa (Ad-Cre) . El ARN total fue aislado y sometido a PCR en tiempo real cuantitativa para el análisis de expresión de VEGF-A. Los resultados son expresados en unidades de ARN relativas (RRU) en seguida de la estandarización de la GAPDH y curvas estándar para cada conjunto de cebador /sonda fueron generadas utilizando el ARN de riñon total de ratones WT . (d) La expresión de Fltl en células mesangiales infectadas con adenovirus. Células mesangiales de ratones WT y Fltia xP/ioxP) fueron aisiadas e infectadas con Ad-LacZ y Ad-Cre. El ARN fue aislado y analizado en cuanto a expresión Fltl mediante RT-PCR cuantitativa. Los resultados son expresados en C. (e) Sobrevivencia de VEGF-A y células mesangiales Flt 1-deficientes in vitro. La proporción de conteo celular entre tratamientos de Ad-LacZ y Ad-Cre fue calculada y normalizada como un porcentaje del valor obtenido par alas células WT . Ambas células mesangiales VEGF-A y Fltl-deficientes exhibieron una supervivencia significativamente reducida in Vitro en comparación con células mesangiales W . Diferencias estadísticamente significativas en supervivencia en comparación con células WT son anotadas por asteriscos: valor *p < 0.05; valor **p < 0.01. Las células mesangiales Fltl-deficientes y VEGF-deficientes también exhiben una diferencia estadísticamente significativamente diferente in vitro, p < 0.05. (f) Sobrevivencia de células mesangiales Ad-LacZ infectadas cultivadas en presencia de un anticuerpo de VEGF neutralizante ( -VEGF) o anticuerpo de control (IgG de control). La disminución en supervivencia de células mesangiales evidente cuando ya sea VEGF-A o Fltl es sometido a ablación genéticamente no fue recapitulado al cultivar células mesangiales en presencia de a-VEGF. Figura 6a - 6d, ilustran el análisis de RT-PCR en tiempo real de ARN de riñon total aislado de ratones Fltl-Cre;VEGF-loxP de 7 semanas de edad para detectar la expresión de diferentes formas de colágenos. Las unidades de ARN relativas (RRU) para tipo I al de colágeno (a) , colágeno a2 tipo II (b) , colágeno a2 tipo IV (c) y colágeno al tipo XVIII (d) fueron normalizados a niveles de gliceraldehidos-3-dehidrogenasa (GAPDH) y calculados de curvas estándar.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Antes de describir la presente invención en detalle, se comprenderá que la presente invención no está limitada a composiciones o sistemas biológicos particulares que pueden por supuesto variar. También se comprenderá que la terminología usada en la presente es por el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretenden ser limitantes. Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales, a no ser que el contenido lo determine claramente de otra manera. Asi por ejemplo, la referencia a "una molécula" incluye opcionalmente una combinación de dos o más de tales moléculas y los semejantes. La nefritis es una inflamación en los ríñones. La evidencia, por ejemplo, sangre y/o proteína en la orina y función deteriorada del riñon, etc., de nefritis depende del tipo, ubicación e intensidad de la respuesta inmune, inflamación que afecta los glomérulos, los túbulos, el tejido alrededor de los túmulos o vasos sanguíneos. "Enfermedad nefritis-relacionada" incluye pero no está limitada a, por ejemplo, glomerulopat ías primarias (es decir, glomerulonefrit is proliferativa difusa aguda, glomerulopatía pos-estreptococal , glomerulopat ía no pos-estreptococal, glomerulonefrit is crescéntica, glomerulopatía membranosa, nefrosis lipoide, glomerulosclerosis sedimental focal, glomerulonefrit is membranoproliferativa, neuropatía IgA, glomerulonefrit is proliferativa focal y glomerulonefritis crónica), enfermedades sistémicas (lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus, amiloidosis, síndrome de Goodpasture, poliarterit is nodosa, granulomatosis de elgener, púrpura de Henoch-Schonlein y endocarditis bacteriana) y alteraciones hereditarias (síndrome de Alpont, enfermedad de membrana delgada y enfermedad de Fabry) . "Síndrome nefrótico" es una colección de síntomas provocados por muchas enfermedades que afectan los ríñones, dando como resultado una pérdida prolongada de proteína a la orina, niveles de sangre disminuidos de proteínas (especialmente albúmina), retención de sal y agua en exceso en el cuerpo y niveles incrementados de grasas (lípidos) en la sangre. El síndrome nefrótico puede ser provocado por muchas de las glomerulopatías o un vasto arreglo de enfermedades. Comúnmente, el síndrome avanza a insuficiencia renal completa en tres o cuatromeses. "Síndrome nefrítico agudo" o "glomerulonefritis aguda" se refiere a una inflamación de los glomérulos que frecuentemente da como resultado la aparición repentina de sangre en la orina, con grupos de células de sangre roja (moldes) de cantidades variables de proteína en la orina. El síndrome nefrítico agudo puede seguir a una infección estreptococal , tal como estreptogarganta . Los glomérulos son dañados por la acumulación de antígeno de los estreptococos muertos agrupados conjuntamente con los anticuerpos que los neutralizan. Estos grupos (complejos inmunes) recubren las membranas de los glomérulos e interfieren con su función de filtración. El síndrome nefrítico agudo puede también ser provocado por una reacción a otras infecciones, tales como infección de una parte del cuerpo artificial (prótesis), endocarditis bacteriana, neumonía, abcesos de órganos abdominales, viruela de pollo, hepatitis infecciosa, sífilis y malaria. Estas tres últimas infecciones pueden provocar síndrome nefrótico en lugar de síndrome nefrítico agudo. "Síndrome nefrítico crónico" o "glomerulonefrit is crónica" se refiere a una alteración que se presenta en varias enfermedades en las cuales los glomérulos son dañados y la función del riñon se degenera en un período de años. La glomerulopat ía es una enfermedad glomerular, que es una enfermedad de un plexos de capilares. En la enfermedad glomerular de riñon, es una enfermedad del grupo formado de bucles capilares al inicio de cada túbulo nefrítico. Los tipos de glomerulopat ías incluyen pero no están limitadas a, por ejemplo, (i) Síndrome nefrítico agudo; (2) Síndrome nefrítico rápidamente progresivo; (3) Síndrome nefrótico y (4) Síndrome nefrítico crónico. Debido a que los glomérulos son bañados, las sustancias no filtradas normalmente de la corriente sanguínea, tales como proteínas, sangre, células de sangre blanca y desechos pueden pasar a través del glomérulo y entrar a la orina. Coágulos pequeños de sangre (microtrombos ) se pueden formar en los capilares que suministran el glomérulo. La glomerulosclerosis es una enfermedad degenerativa del riñon que da como resultado depósitos en hialina o cicatrización dentro de los glomérulos renales frecuentemente asociados con arteriosclerosis renal o diabetes. Comúnmente, antes de la infiltración de células inflamatorias circulantes, fibrosis de intersticio y atrofia tubular, La lesión glomerular provocada por varios factores efectúa la proteinuria en la cual las proteínas se enlazan con inmunoglobulina A soluble (slgA) , slgG y slgM formando complejos inmunes sobre la membrana basal. Estos complejos inmunes funcionan como un factor quimiotáct ico para linfocitos inflamatorios, que provocan respuestas inmunes excesivas en las áreas afectadas (Bohle A et al., Kidney Int 67 (Suppl . ) : 186S-188S (1998) ) . Cuando los túmulos son dañados por células inflamatorias, los vasos sanguíneos conectados con glomérulos son también lesionados y ocluidos. Como consecuencia, los glomérulos son afectados adversamente y se deterioran. Estos cambios glomerulares son acompañados por fibrosis del tejido y avance a insuficiencia renal eventual (véase por ejemplo, Ratscchek M et al., Clin Nephrol 25: 221-226 (1986); Bohle A et al, Clin Nephrol 29: 28-34 (1998); Bohle A et al., Kidney Blood Press Res 19:191-195 (1996) ) . Un tipo es glomerulosclerosis segmental focal (FSGS) que es un colapso segmental de los capilares glomerulares con membranas básales engrosadas y matriz mesangial incrementada, que frecuentemente da como resultado proteinuria e insuficiencia renal. Véase por ejemplo, Kamanna et al., Histol. Histopathol. 13: 169-179(1998); Wehrmann et al., Clin. Nephrol. 33:115-122 (1990); Mackensen-Haen, et al., Clin. Nephrol. 37:70-77 (1992) . Puede provocar falla permanente del riñon.

El término "mesangio" se refiere a un tejido que soporta bucles de capilares en el glomérulo de riñon y compuesto de células mesangiales y matriz mesangial. Se sabe que las células mesangiales mantienen la estructura de bucle del glomérulo, también como tienen una función fagocitica o la habilidad de regular el flujo sanguíneo glomerular. Las células mesangiales tienen receptores de angiotensina II y producen factor de activación de plaquetas, prostaglandina , colágeno IV, fibronectina , etc. La matriz mesangial es un componente de matriz extracelular que rodea las células mesangiales. El término "receptor VEGF" o "VEGFR" como se usa en la presente, se refiere a un receptor celular para VEGF, ordinariamente un receptor de superficie celular encontrado sobre células endoteliales vasculares, también como fragmentos y variantes de los mismos que retienen la habilidad para enlazarse a VEGF (tales como fragmentos o formas truncadas de dominio extracelular). Algunos ejemplos de VEGFR incluyen los receptores de cinasa de proteína al que se hace referencia en la literatura como Flt-1 (también usado intercambiablemente en la presente como "VEGFR-1" ) y KDR/Flk-1 (también usado intercambiablemente en la presente como "VEGFR-2"). Véase por ejemplo, DeVries et al. Science, 255:989 (1992); Shibuya et al. Oncogene, 5:519 (1990); Matthews et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 88:9026 (1991); Terman et al. Oncogene, 6:1677 (1991) y Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Co mun . , 187:1579 (1992). Los receptores de Flt-1 (cinasa de tirosina semejante a fms) y KDR (región de dominio de cinasa) se enlazan a VEGF con alta afinidad. Flk-l (cinasa-1 de hígado fetal) , el homólogo murino de KDR, comparte 85% de identidad de secuencia con KDR humano. Ferrara Kidney Intl. 56:794-814 (1999). Tanto Flt-1 y KDR/Flk-1 tienen siete dominios semejantes a inmunoglobulina (Ig) en el dominio extracelular (ECD) , una sola región de transmembrana y una secuencia de cinasa de tirosina (TK) de consenso, que es introducida por un dominio de inserción de cinasa. Flt-1 tiene la afinidad más alta por rhVEGFi65, con una Kd de aproximadamente 10 a 20 pM. KDR tiene una afinidad más baja para VEGF, con una Kd de aproximadamente 75 a 125 pM. Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de VEGFR están fácilmente accesibles y obtenibles por aquel de habilidad en el arte. Otros receptores de VEGF incluyen aquellos que pueden ser marcados de manera reticulada con VEGF o que pueden ser pos-inmunoprecipitados con KDR o Flt-1. Un receptor de VEGF adicional que se enlazaz a VEGFRi65 pero no VEGFR121 ha sido identificado, que es neuropilina 1. Soker et al., Cell 92:735-45 (1998) . El receptor de enlace de VEGFR121 de isoforma-específico es también un receptor para la familia de colapsina/semaforina que modera la guía de célula neuronal. Los receptores de Flt-1 y KDR existen principalmente como un receptor enlazado sobre la superficie de células endoteliales vasculares, aunque pueden también estar presentes en células no endoteliales. Algunas formas solubles de VEGFR también han sido encontradas. Por ejemplo, un cADN que codifica una forma soluble alternativamente empalmada de Flt-1 (sFlt-1) , que carece del séptimo dominio semejante a Ig, secuencia de transmembrana y el dominio citoplásmico, ha sido identificado en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) . Kendall et al., Biochem. Biophys. Res. Comía. 226:324-328 (1996) . Los términos "VEGF" y "VEGFA" son usados intercambiablemente para referirse al factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos y factores de crecimiento de célula endotelial vascular de 121-, 145-, 183-, 189- y 206- aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al., Science, 246:1306 (1989), Houck et al., Mol. Endocrin., 5:1806 (1991) y Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144 (5) : 853-865 (2001), junto con las formas alélicas que se presentan de manera estable en la naturaleza y formas procesadas de los mismos. El término "VEGF" es también usado para referirse a fragmentos del polipéptido, que comprenden los aminoácidos 8 a 109 o l a 109 de factor de crecimiento de célula endotelial vascular humano de 165 aminoácidos, que retiene la actividad biológica. La referencia a cualesquiera de tales formas de VEGF pueden ser identificadas e la solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" o "VEGF165" .

Las posiciones de aminoácidos para un "fragmento" de VEGF natural son numeradas como se indica en la secuencia VEGF natural. Por ejemplo, la posición del aminoácido 17 (metionina) en VEGF natural de fragmento es también la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El fragmento de VEGF natural puede tener afinidad de enlace por los receptores de KGR y/o Flt-1 comparables con VEGF natural. Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promueve la angiogénesis , crecimiento de célula endotelial, estabilidad de vaso sanguíneo y/o vasculogénesis , etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia de VEGF (A, B, C, D y E) , PIGF, familia de PDFG, familia del factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), ligandos de TIE (angiopoyetinas) , ANGPTL3, ANGPTL4, efrinas, etc. También incluiría factores que aceleran la cicatrización de heridas, tales como hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento semejante a insulina (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico ) EGF) , CTGF y miembros de su familia y TGF-a y TGF-ß. Véase por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu . Rev. Physiol., 53:217-39 (1991) ; Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5 ( 12 ) : 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo., Tabla 1 que enlista factores angiogénicos conocidos) y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) . Un polipéptido de "secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como un polipéptido derivado de la naturaleza. Asi, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido que se presenta de manera estable en la naturaleza de cualquier mamífero. Tal polipéptido de secuencia natural puede ser aislado de la naturaleza o puede ser producido mediante medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas que se presentan de manera estable en la naturaleza del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular ) , formas variantes que se presentan de manera estable en la naturaleza (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que se presentan de manera estable en la naturaleza del polipéptido. Un polipéptido "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que interferirían con los otros de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas modalidades, el polipéptido será purificado (1) a mayor de 95% en peso de polipéptido, tal como se determina por el método de Lowry, o más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando teñido de azul de Coomassie o plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes , puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del polipéptido no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación. Una "variante" de polipéptido significa un polipéptido biológicamente activo que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural correspondiente o fragmento del mismo. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son agregados o cancelados, en el término N y/o término C del polipéptido. Ordinariamente, una variante tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos o por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos o por lo menos aproximadamente 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural o fragmento del mismo. El término "variante" como se usa en la presente se refiere a una variante de proteina como se describe en la presente y/o que incluye una o más mutaciones de aminoácidos en la secuencia de proteina natural. Opcionalmente , la una o más mutaciones de aminoácidos incluyen sustitución (es ) de aminoácidos. Variantes de las mismas para uso en la invención pueden ser preparadas mediante una variedad de métodos bien conocidos en el arte. En ciertas modalidades de la invención, el VEGF empleado en los métodos de la invención comprende VEGF165 recombinante . Variantes de secuencia de aminoácidos pueden ser preparadas mediante mutaciones, por ejemplo en el ADN de VEGF o ADN de VEGFR. Tales variantes incluyen, por ejemplo, cancelaciones de, inserciones a o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de VEGF o VEGFR. Se puede hacer cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución para llegar al constructo final que tiene la actividad deseada. Las mutaciones se efectuarán en el ADN que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera de cuadro de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que producirían una estructura de mARN secundaria. EP 75,444A. Las variantes son preparadas opcionalmente mediante mutagénesis dirigida al sitio de nucleótidos al ADN que codifica la proteína natural o técnicas de despliegue de fago, produciendo mediante esto ADN que codifica la variante y después de esto expresando el ADN en el cultivo de célula recombinante .

En tanto que el sitio para introducir variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se puede efectuar mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes expresadas seleccionadas en cuanto a la combinación óptima de actividad deseada. Técnicas para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, tales como por ejemplo, mutagénesis especifica del sitio. La preparación de las variantes descritos en la presente se puede obtener mediante técnicas de despliegue de fago, tales como aquellas descritas en la publicación de PCT WO 00/63380. Después de que tal clon es seleccionado, la región de proteina mutada puede ser removida y colocada en un vector apropiado para la producción de proteina, en general un vector de expresión del tipo que puede ser empleado para transformación de un huésped apropiado. Las cancelaciones de secuencias de aminoácidos fluctúan en general de aproximadamente 1 a 30 residuos, opcionalmente 1 a 10 residuos, opcionalmente 1 a 5 o menos y comúnmente son contiguas. Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminal desde un residuo a polipéptidos de esencialmente una longitud sin restricción, también como inserciones de intersecuencia de un solo residuo o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones de intra-secuencia (esto es, inserciones dentro de la secuencia de proteina natural) pueden fluctuar en general de aproximadamente 1 a 10 residuos, opcionalmente 1 a 5 u opcionalmente 1 a 3. Un ejemplo de una inserción terminal incluye una fusión de una secuencia de señal, ya sea heteróloga u homologa a la célula huésped, al término N para facilitar la secreción de huéspedes recombinantes . Variantes adicionales son aquellas en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido en la proteina natural ha sido removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Tales sustituciones se pueden efectuar de acuerdo con aquellas mostradas en la Tabla 1. Las variantes pueden también comprender aminoácidos no naturales como se describe en la presente . Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry , segunda ed., pp . 73-75, orth Publishers, New York (1975)) : (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares sin cargar: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C), Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H) Alternativamente, los residuos que se presentan de manera estable en la naturaleza pueden ser divididos en grupos basados en las propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofilicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe .

Tabla 1 "Residuos de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza" (esto es, residuos de aminoácidos codificados por el código genético) pueden ser seleccionados del grupo que consiste de: alanina (Ala); arginina (Arg) ; asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteina (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His) ; isoleucina (lie) : leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro); serina (Ser) ; treonina (Thr) ; triptófano (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Un "residuo de aminoácido que se presentan de manera estable en la naturaleza" se refiere a un residuo, diferente a aquellos residuos de aminoácidos que se presentan de manera estable en la naturaleza enlistados anteriormente, que es apto de enlazarse covalentemente a residuo (s) de aminoácido ( s ) adyacentes en una cadena de polipéptido. Ejemplos de residuos de aminoácidos que no se presentan de manera estilo en la naturaleza incluyen, por ejemplo, norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos tales como aquellos descritos en Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) y publicaciones de solicitud de patente estadounidense 20030108885 y 20030082575. Brevemente, estos procedimientos involucran la activación de un tARN supresor con el residuo de aminoácido que no se presenta de manera estable en la naturaleza seguido por transcripción y traducción in vitro o in vivo del ARN . Véase, por ejemplo, publicaciones de solicitudes de patentes estadounidenses 20030108885 y 20030082575; Noren et al. Science 244:182 (1989); y Ellman et al., supra . El efecto de la sustitución, cancelación o inserción puede ser evaluado fácilmente por aquel experimentado en el arte utilizando análisis de selección de rutina. Por ejemplo, una variante de VEGF despliegue de fago-seleccionada puede ser seleccionada en cultivo de célula recombinante , y opcionalmente , purificada del cultivo celular. Luego la variante de VEGF puede ser evaluada en cuanto a afinidad de nlc al receptor de KDR o Flt-1 y otras actividades biológicas, tales como aquellas conocidos en el arte o reveladas en la solicitud. Las propiedades de enlace o actividades del lisado celular o variante de VEGF purificada pueden ser seleccionadas en un análisis de selección apropiado en cuanto a una característica deseable. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la variante de VEGF en comparación con VEGF natural, tal como afinidad para un anticuerpo dado, puede ser deseable. Tal cambio puede ser medido mediante un inmunoanálisis tipo competitivo, que puede llevado a cabo de acuerdo con técnicas conocidas en el arte. La afinidad de enlace del receptor respectivo de la variante de VEGF puede ser determinada mediante alss de ELISA, RIA, y/o BIAcore, conocidos en el arte y descritos adicionalmente en los ejemplos posteriormente en la presente. En una modalidad de la invención, las variantes de VEGF de la invención también exhibirán actividad en análisis de KIRA que reflejan la capacidad de inducir la fosforilación del receptor de KDR. En una modalidad de la invención, las variantes de VEGF de la invención inducirán adicional o alternativamente la proliferación de célula endotelial (que puede ser determinada mediante métodos conocidos en el arte tales como el análisis de proliferación de HUVEC) . Además de las variantes de VEGF especificas reveladas en la presente, las variantes de VEGF descritas en Keyt et al. J. Biol . Chem. 271:5638-5646 (1996) son también contempladas para uso en la invención. "Por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos (%)" en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el máximo por ciento de identidad de secuencia y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el por ciento identidad de secuencia de aminoácidos puede ser obtenida de varias maneras que están dentro de la habilidad de aquellos experimentados en el arte, por ejemplo, utilizando elementos de programación de computadora disponible públicamente tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ó Megalign (DNASTAR) . Aquellos experimentados en el arte pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, en los que se incluyen cualesquier algoritmos necesarios para obtener la alineación máxima en la plena longitud de las secuencias que son comparadas. Sin embargo, para los propósitos en la presente, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos son obtenidos como se describe posteriormente en la presente al utilizar el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 es propiedad de Genentech, Inc. ha sido presentado con documentación del usuario en la oficina de Derechos Reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el No. de Registro de Derechos Reservados de los Estados Unidos TXU510087 y está disponible públicamente por medio de Genentech, Inc., San Francisco Sur, California. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, por ejemplo, UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían. Para los propósitos de la presente, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede denominada alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende una cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) es calculada como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos qu tienen puntuación como coincidencias o correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en aquella alineación de programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. El término "modula" o "modulación" como se usan en la presente se refieren a la disminución, inhibición, reducción, mejora, incremento o realce de una función, expresión, actividad genética de VEGFR o alternativamente un fenotipo asociado con el gen de VEGFR. El término "modulador de VEGFR" o "agente modulador de VEGFR" o "compuesto modulador de VEGFR" se refiere a una molécula que puede activar, por ejemplo, un agonista, su expresión o que puede inhibir, por ejemplo, un antagonista (o inhibidor), la actividad de un VEGFR o su expresión. El término "agonista" es usado para referirse a un agente que tiene la habilidad para señalar a través de un receptor de VEGFR natural. El término "agonista" es definido en el contexto del papel biológico de un receptor de VEGFR. En ciertas modalidades de la invención, un modulador de VEGFR incluye, pero no está limitado a, un agonista de VEGFR, por ejemplo, un agonista de Fltl, un ligando que se enlaza a un receptor de VEGFR, por ejemplo, VEGF, variantes selectivas de VEGF, P1GF, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. Agonistas adicionales de la invención incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, variantes de VEGFR con actividad agonista, anticuerpos agonistas de VEGFR, etc. Un antagonista de VEGFR se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de VEGFR, por ejemplo, proliferación o crecimiento celular, migración, adhesión o metabólica, en los que se incluye su enlace a ligando, por ejemplo, VEGF, variantes selectivas de VEGF, P1GF y VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. Los antagonistas de VEGFR incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-VEGFR y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, moléculas receptoras y derivados que se enlazan específicamente a VEGFR secuestrando mediante esto su enlace a uno o más ligandos, anticuerpos anti-VEGFR y antagonistas de VEGFR tales como inhibidores de molécula pequeña del receptor. Otros antagonista de VEGFR también incluyen variantes antagonistas de VEGFR, moléculas antisentido (por ejemplo, VEGFR -SiRNA) , aptámero de ARN y ribozimas contra VEGFR o su receptor. En ciertas modalidades, los anticuerpos VEGFR antagonistas son anticuerpos que inhiben o reducen la actividad de VEGFR al enlazarse a una secuencia o región específica del VEGFR.

El término "anticuerpo anti-VEGFR" es un anticuerpo que se enlaza a VEGFR con afinidad y especificidad suficientes. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGFR de la invención puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferir con enfermedades o condiciones en donde está involucrada a la actividad de VEGFR. En general, un anticuerpo anti-VEGFR no se enlazará usualmente a otros homólogos de VEGFR. El término "anticuerpo" es usado en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (en los que se incluyen anticuerpos monoclonales de plena longitud o intactos), anticuerpos policlonales , anticuerpos multivalentes , anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos bisespecificos ) , y fragmentos de anticuerpos (véase posteriormente en la presente) en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. A no ser que se indique de otra manera, la expresión "anticuerpo multivalente" es usada en toda esta especificación para denotar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de enlace de antigeno. El anticuerpo multivalente está comúnmente diseñado para tener los tres o más sitios de enlace de antigeno y en general no es un anticuerpo de IgM o IgA de secuencia natural . "Fragmentos de anticuerpo" comprende solamente una porción de un anticuerpo intacto, que incluye en general un sitio de enlace de antigeno del anticuerpo intacto y asi retienen la habilidad para enlazarse al antigeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo abarcados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene los dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab' , que es un fragmento de Fab que tiene uno o más residuos de cisteina en el término C del dominio de CH1; (iii) el fragmento de Fd que tiene dominios de VH y CHl; (iv) el fragmento Fd' que tiene dominios VH y de CH1 y uno o más residuos de cisteina en el término C del dominio de CHl; (v) el fragmento de Fv que tiene los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste de un dominio de VH; (vii) regiones de CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmento de Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de engozne; (ix) moléculas de anticuerpo de una sola cadena (esto es, Fv de una sola cadena; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); y Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos sitios de enlace de antigeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que comprenden un par de fragmentos de Fd en tándem (VH-CHl-VH-CHl) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarias, forman un par de regiones de enlace de antigeno (Zapata et al. Protein Eng . 8(10) : 1057 1062 (1995); y patente estadounidense No. 5, 641, 870) . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan de manera estable en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no será interpretado que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la invención pueden ser elabrados mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales" pueden también ser aislados de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352 : 624 - 628 (1991) o Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ej emplo . Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en las cuales una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o sub-clase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hace para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) . Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos. Anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte. En una modalidad, el anticuerpo humano es seleccionado de una biblioteca de fago, en donde la biblioteca de fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996) : Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)) ; Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol . , 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)) . Los anticuerpos humanos pueden también ser elaborados a introducir sitios de inmunoglobulina humanos a animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido parcial o completamente desactivados. Después de ataque, se observa la producción de anticuerpo humano, que se asemeja estrechamente a aquella observada en humanos en todos los aspectos, en los que se incluyen rearreglo genético, ensamble y repertorio de anticuerpos. Este procedimiento es descrito, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995) . Alternativamente, el anticuerpo humano puede ser preparado vía inmortalización de linfocitos humanos B que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno objetivo (tales linfocitos B pueden ser recuperados de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Véase, por ejemplo, Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (l) :86-95 (1991); and US Pat No. 5,750,373. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como los dominios variables de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y cadenas ligeras naturales comprenden cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja beta, unidas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que unen y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las regiones hipervariables en cada cadena son retenidas conjuntamente en proximidad estrecha por las FR y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (véase Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por el enlace de antigeno. La región hipervariable comprende en general residuos de aminoácido de una "región que determina la complementareidad" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Los residuos de "región de estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definen en la presente. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a "clases" diferentes. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM y varios de estos pueden ser divididos adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgGl (en los que se incluyen alotipos sin A y A alotipos), IgG2, IgG3, IgG4, IgA y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes clases de anticuerpos son llamados , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras y configuraciones tridimensionales de sub-unidad de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (6) y lambda (8), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. El término "región de Fe" es usado para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede ser generada mediante digestión de papaina de un anticuerpo intacto. La región de Fe puede ser una región de Fe de secuencia natural o una región de Fe variante. Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de IgG cadena pesada región de Fe humana es usualmente definida para estirarse desde un residuo de aminoácidos en posición aproximadamente Cys226 o de aproximadamente posición Pro230, al término carboxilo de la región Fe. La región de Fe de una inmunoglobulina comprende en general dos dominios constantes, un dominio de CH2 y un dominio CH3 y opcionalmente comprende un dominio de CH4. "Cadena de región de Fe" en la presente significa una de las cadenas de polipéptido de una región de Fe. El "dominio de CH2" de un una región de IgG de Fe humana (también denominado como dominio "Cg2") usualmente se extiende desde un residuo de aminoácido en aproximadamente posición 231 a un residuo de aminoácido en aproximadamente posición 340. El dominio de CH2 es único en que no es apareado estrechamente con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificada N-enlazadas son interpuestas entre los dos dominio de CH2 de una molécula de IgG natural intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el apareamiento de dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio de CH2. Burton, Molec. Immunol . 22:161-206 (1985) . El dominio de CH2 en la presente puede ser un dominio de CH2 de secuencia natural o dominio de CH2 variante. El "dominio de CH3" comprende el estiramiento de los residuos C-terminales a un dominio de CH2 en una región de Fe (esto es, desde un residuo de aminoácido en aproximadamente posición 341 a un residuo de aminoácido en aproximadamente posición 447 de una IgG) . La región de CH3 en la presente puede ser un dominio de CH3 de secuencia natural o un dominio de CH3 variante (por ejemplo, un dominio de CH3 con una "protuberancia" introducida en una cadena del mismo y una "cavidad" introducida correspondiente en la otra cadena de la misma, véase patente estadounidense No. 5,821,333, incorporada expresamente en la presente por referencia) . Tales dominios de CH3 variantes pueden ser usados para elaborar anticuerpos mult iespecifico (por ejemplo, bisespecifico) como se describe en la presente. "Región de engozne" es definida en general como estiramiento de aproximadamente Glu216 o aproximadamente Cys226, a aproximadamente Pro230 de IgGl humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)) . Las regiones de engozne de otros isotipos de IgG pueden ser alineadas con la secuencia de IgGl al colocar los primeros y últimos residuos de cisteina que forman ¦ enlaces de S-S de cadena inter-pesada en las mismas posiciones. La región de engozne en la presente puede ser una región de engozne de secuencia natural o una región de engozne variante. Las dos cadenas de polipéptidos de una región de engozne variante retienen en general por lo menos un residuo de cisteina por cadena de polipéptido, de tal manera que las dos cadenas de polipéptidos de la región de engozne variante pueden formar un enlace de disulfuro entre las dos cadenas. La región de engozne preferida en la presente es una región de engozne humana de secuencia natural, por ejemplo una región de engozne de IgGl humana de secuencia natural. Una región de "Fe funcional" posee por lo menos una "función efectora" de una región de Fe de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen enlace de Clq; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ; enlace de receptor de Fe; citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. Tales funciones efectoras requiere en general que la región de Fe sea combinada con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden ser determinadas utilizando varios análisis conocidos en el arte para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpo. En ciertas modalidades de la invención, un anticuerpo de la invención puede tener una región de Fe alterada que da como resultado una función efectora alterada, por ejemplo, función mejorada o función reducida. Una "región de Fe de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región de Fe de secuencia natural en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido. Preferiblemente, la región de Fe variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fe de secuencia natural o con la región de Fe de un polipéptido padre, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y preferiblemente de alrededor de una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región de Fe de secuencia natural o en la región de Fe del polipéptido padre. La región Fe variante en la presente poseerá comúnmente, por ejemplo por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con una región de Fe de secuencia natural y/o con una región de Fe de un polipéptido padre o por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con el mismo o por lo menos aproximadamente 95% de secuencia o más de identidad con el mismo. "Citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción moderada por la célula en la cual células citotóxicas no especificas que expresan los receptores de Fe (FcR) (por ejemplo, células exterminadoras naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetivo y subsecuentemente provocan lisis de la célula objetivo. Las células primarias para moderar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyét icas es resumido en Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) . Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, un análisis de ADCC in vitro, tal como aquel descrito en la patente estadounidense No. 5,500,362 o 5,821,337 puede ser efectuado. Células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células exterminadoras naturales (NK) . Alternativamente o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) . "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y efectúan funciones efectoras. Comúnmente, las células expresan por lo menos FcyRIII y efectúan la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células exterminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos ; las células PBMC y células NK son en general preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente natural de las mismas, por ejemplo de sangre o PBMC como se describe en la presente . Los términos "receptor de Fe" y "FcR" son usados para describir un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En una modalidad, el FcR es un FcR de secuencia natural. En una modalidad, el FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un rceptor gamma) e incluye los receptores de las sub-clases FcyRI, FcyRII y FcyRII I, en las que se incluyen variantes alelicas y Immunol . Today. Alternativamente, las formas empalmadas de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en el dominio citoplásmico de los mismos. El FcyRIIA receptor de activación contiene una porción de activación a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor receptor FcyRIIB contiene una por de inhibición a base de tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) ) . Los FcR son revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) ; Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) ; y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcR, en los que se incluyen aquellos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente. El término "receptor de Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRN, que es responsable por la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994) y la regulación de homeostasis de inmunoglobulinas . Métodos de medición de enlace a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol Today 18 ( 12 ) : 592-598 (1997) ; Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 (7 ) : 637-640 (1997) ; Hinton et al., J. Biol. Chem 279 ( 8 ) : 6213-6216 (2004); y O2004/92219 (Hinton et al . ) . El enlace a FcRn humano in vivo y vida media en el suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad de FcRn humanos puede ser analizada, por ejemplo en ratones transgénicos o lineas celulares humanas transíectadas que expresan FcRn o en primates a los cuales los polipéptidos con una región de Fe variante son administrados. WO2000/42072 describe variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2) : 6591-6604(2001) . "Citotoxicidad dependiente de complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de un objetivo en presencia de complemento. La ruta de activación de complemento es iniciada por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) acomplejada con un antigeno cognato. Para determinar la activación de complemento, se puede efectuar un análisis de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996) .

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee aquella (s) alteración (es) . Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares por el antigeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL . La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura es descrita por: Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994) ; Schier et al. Gene 169:147-155 (1995) ; Yelton et al. J. Immunol . 155:1994-2004 (1995) ; Jackson et al., J. Immunol. 154 ( 7 ) : 3310-9 (1995) ; y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) . Un "sitio de enlace de antigeno funcional" de un anticuerpo es uno que es apto de enlazarse a antigeno objetivo. La afinidad de enlace de antigeno del sitio de enlace de antigeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo padre del cual el sitio de enlace de antigeno es derivado, pero la habilidad para enlazarse al antigeno debe ser mensurable utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar el enlace del anticuerpo a un antigeno. Además, la afinidad de enlace de antigeno de cada uno de los sitios de enlace de antigeno de un anticuerpo multivalente en la presente no necesitan ser cuantitativamente los mismos. Para los anticuerpos multiméricos en la presente, el número de sitios de enlace de antígeno funcionales pueden ser evaluados utilizando análisis de ultracentrifugación . De acuerdo con este método de análisis, diferentes proporciones de antígeno objetivo a anticuerpo multimérico son combinadas y el peso molecular promedio de los complejos es calculado suponiendo diferentes números de sitios de enlace funcionales. Estos valores típicos son comparados con los valores experimentales reales obtenidos con el fin de evaluar el número de sitios de enlace funcionales. Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es uno que posee una o más de la características biológicas de aquel anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno. Con el fin de seleccionar anticuerpos que se enlazan a un epítopo sobre un anticuerpo enlazado con un anticuerpo de interés, análisis de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988), pueden ser efectuados . Una "cadena de polipéptidos" es un polipéptido, en donde cada uno de los dominios del mismo está unido a otro(s) dominio (s) por enlace (s) de péptido(s), en contraposición a interacciones no covalentes o enlaces de disulfuro. Un "enlazador flexible" en la presente se refiere a un péptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlace (s) de péptido (s) y proporciona más libertad rotational para dos polipéptidos (tales como dos regiones de Fd) enlazados mediante el mismo. Tal libertad rotacional permite que dos o más sitios de enlace de antigeno unidos por el enlazador flexible tengan acceso a cada uno del (de los) antigeno (s) objetivo más eficientemente. Ejemplos de secuencias de péptido de enlazador flexibles apropiados incluyen gly-ser, gly-ser-gly-ser , ala-ser y gly-gly-gly-ser. Un "dominio de dimerización" es formado por la asociación de por lo menos dos residuos de aminoácido (en general residuos de cisteina) o de por lo menos dos péptidos o polipéptidos (que pueden tener la misma o diferente secuencias de aminoácidos). Los péptidos o polipéptidos pueden interactuar entre si por medio de asociación ( es ) covalente(s) y/o no covalente ( s ) . Ejemplos de dominios de dimerización en la presente incluyen una región de Fe; una región de engozne; un dominio de CH3; un dominio de CH4; un par CH1-CL; una "inferíase" con una "perilla" y/o "protuberancia" diseñada, como se describe en la patente estadounidense No. 5,821,333, incorporada expresamente en la presente por referencia; una cremallera de leucina (por ejemplo, una cremallera de leucina jun/fos, véase Kostelney et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992) ; o una cremallera de leucina de GCN4 de levadura); una cremallera de isoleucina; un par de dímero de receptor (por ejemplo, receptor de interleucina-8 (IL-8R); y heterodimeros de integrina tales como LFA-1 y GPIIIb/IIIa) o la (s) región (es) de dimerización de los mismos; polipéptidos de ligando diméricos (por ejemplo, factor de crecimiento de nervio (NGF) , neurotrofina-3 (NT-3) , interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , VEGF-C, VEGF-D, miembros de PDGF y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) ; véase Arakawa et al. J. Biol. Chem. 269(45) : 27833-27839 (1994) y Radziejewski et al. Biochem. 32(48) : 1350 (1993) ) o la(s) región (es) de dimerización de los mismos; un par de residuos de cisteina aptos de formar un enlace de disulfuro; un par de péptidos o polipéptidos, cada uno que comprende por lo menos un residuo de cisteina (por ejemplo, de aproximadamente uno, dos o tres a aproximadamente diez residuos de cisteina) de tal manera que enlace (s) de disulfuro se pueden formar entre los péptidos o polipéptidos (de aquí en adelante en la presente "un engozne sintético"); y dominios variables de anticuerpo. El dominio de dimerización más preferido en la presente es una región de Fe o una región de engozne. La frase "proliferación estimulante de una célula" abarca la etapa de incrementar la extensión de crecimiento y/o reproducción de la célula en relación con una célula sin tratar o una célula tratada reducida ya sea in vitro o in vivo. Un incremento en proliferación celular en cultivo celular puede ser detectado al contar el número de células antes y después la exposición a una molécula de interés. La extensión de proliferación puede ser cuantificada vía examen microscópico del grado de confluencia. La proliferación celular puede también ser cuantificada utilizando análisis conocidos en el arte, por ejemplo, análisis de incorporación de timidina y anlls disponibles comercialmente . La frase "inhibir la proliferación de un célula" abarca la etapa de disminuir la extensión de crecimiento y/o reproducción de la célula en relación con una célula sin tratar o una célula tratada reducida ya sea in vitro o in vivo. Puede ser cuantificada como se describe anteriormente. "Sujeto" por propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal. En general, el animal es un mamífero. "Mamífero" por propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, en los que se incluyen humanos, animales domésticos y de granja y de zoológico, deportivos o animales de mascota, tales como perros, caballos, gatos, vacas, oveja, puercos, etc. Comúnmente, el mamífero es un humano. La administración "en combinación con" de uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y/o consecutiva en cualquier orden.

El término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectiva para tratar una enfermedad o alteración en un sujeto. En el caso de enfermedad del riñon, la cantidad efectiva del fármaco puede reducir los síntomas o disminuir o eliminar la enfermedad. "Tratamiento" se refiere tanto a medidas de tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la alteración, también como aquellos en los cuales la alteración va a ser prevenida. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una molécula de la invención, por ejemplo, véase las alteraciones de riñon descritas en la presente. Estas incluyen alteraciones o enfermedades crónicas y agudas en las que se incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al sujeto a la alteración en cuestión. "Transfección" se refiere a la toma de un vector de expresión por una célula huésped ya sea o no de cualesquier secuencias de codificación sean en efecto expresadas. Numerosos métodos de transfección son conocidos para el técnico con experiencia ordinaria en el arte, por ejemplo CaP04 y electroporación . La transfección exitosa es en general reconocida cuando cualquier indicación de la operación de este vector ocurre dentro de la célula huésped.

"Transformación" se refiere a la introducción de ADN a un organismo, de tal manera que el ADN es replicable, ya sea como un elemento extracromosomal o mediante integrante cromosomal. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se hace utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe por Cohén, Proc. Nati. Acad. Sci . (USA), 69: 2110 (1972); y, Mandel et al. J. Mol. Biol., 53: 154 (1970), es en general usado para procariontes u otras células que contienen barreras de célula-pared sustanciales. Para células mamiferas sin tales paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978), es usado frecuentemente. Aspectos generales de transformaciones de sistema huésped de célula mamifera han sido descritos por Axel en la patente estadounidense No. 4,399,216 expedida el 16 de agosto de 1983. Transformaciones a levadura se llevan a cabo comúnmente de acuerdo con el método de Van Solingen et al. J. Bact . , 130: 946 (1977) y Hsiao et al. Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979) . Sin embargo, otros métodos para introducir ADN a células tales como inyección nuclear mediante fusión de protopolasto pueden también ser usados.

Enfermedad de Riñon Un determinante crítico de acumulación de matriz glomerular es el equilibrio entre la síntesis y sustitución de ECM (véase, por ejemplo, Schnaper, H. W. (1995) . Balance between matrix synthesis and degradation: a determinant of glomerulosclerosis . Pediatr Nephrol 9, 104-111) . Cuando este equilibrio es alterado se desarrolla una alteración del riñon. Por ejemplo, la glomerulosclerosis es un proceso mediante el cual el tejido glomerula funcinal normal es reemplazado por depósitos acumulados de matriz extracelular (ECM) . La exposición a largo plazo de los tratamientos actuales para la glomerulosclerosis (por ejemplo, esteroides, ciclosporina , etc.) frecuentemente induce efectos secuntarioa a varios órganos. Además, los tratamientos actuales no interrumpen necesariamente o invierten el avance de la enfermedad requiriendo así todavía tratamientos adicionales tales como diálisis de riñon o trasplante de riñon. Las enfermedades renales con regulación descendente de VEGF frecuentemente se correlacionan con glomerulosclerosis y depósitos autoinmunes. Véase, por ejemplo, Shulman, K., et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) is altered in many glomerular diseases. J Am Soc Nephrol 7:661-666 (1996a); Noguchi, K. , et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferat ive glomerulonephrit is . J Am Soc Nephrol 9:1815-1825 (1998); Shulman, K. , et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) is altered in many glomerular diseases. J-Am-Soc-Nephrol 7:661-666 issn: 1046-6673 (1996b) ; Wada, Y., et al. (2002) . Impairment of vascular regeneration precedes progressive glomerulosclerosis in anti-Thy 1 glomerulonephritis . Kidney Int 61:432-443) ; and, Yuan, H. T., et al. (2002) . Angiopoietin correlates with glomerular capillary loss in anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. Kidney Int 61:2078-2089) . La solicitud describe una función de VEGF-A y VEGFR en células de riñon durante el desarrollo del riñon. La interferencia con tal función induce glomerulosclerosis en ratones. La invención proporciona métodos para el tratamiento de una condición de riñon patológica en un sujeto con un modulador de VEGFR. La frase "condición de riñon patológica" es usada intercambiablemente con "alteración de riñon" o "enfermedad de riñon" o "enfermedad renal" para indicar cualesquier anormalidades del riñon estructurales y/o funcinales. Un modulador de VEGFR incluye, pero no está limitado a un ligando de VEGFR, por ejemplo, VEGF (A, B, C, D y/o E) , un agonista de Flt-1 (por ejemplo, una variante de VEGF Flt-selectiva, VEGF-B, P1GF) , anticuerpos agonistas de VEGFR, moléculas pequeñas de agonista de VEGFR, etc., que pueden ser un terapéutico para el tratamiento de enfermedad de riñon, por ejemplo, enfermedad de riñon inflamatoria, glomeruloesclerosis , etc. En ciertas modalidades, la enfermedad de riñon es provocada por una infección. En ciertas modalidades, el sujeto que es tratado para la enfermedad de riñon con otros agentes, por ejemplo, esteroides, ciclosporina , etc.) . En ciertas modalidades de la invención, una cantidad efectiva de un agonista de Fltl es administrada a un sujeto con el fin de treat la condición de riñon patológica. En una modalidad de la invención, un agonista de KDR u otro factor angiogénico puede ser administrado en combinación con un agonista de Fltl, por ejemplo, a una proporción más baja que Fltl, que puede dar como resultado en un beneficio terapéutico máximo, al proporcionar estimulación de angiogénesis . En ciertas modalidades de la invención, un agonista de KDR u otro factor angiogénico puede ser administrado en combinación con un agonista de Fltl, por ejemplo, a una proporción más alta que Fltl o una proporción igual. En otra modalidad, una variante de VEGF que activa preferiblemente Flt-1 contra KDR puede ser usado para combinar características óptimas de seguridad y eficacia. En ciertas modalidades, el VEGF es administrado en combinación con un agonista de Fltl. El tratamiento de una condición de riñon patológica puede ser determinado por aquellos de habilidad en el arte, por ejemplo mediante análisis histológico es inmnocitoquímica, mediante análisis de orina, por ejemplo nitrógeno de urea en sangre (B.U.N), creatinina en el suero, etc., al medir la presión sanguínea arterial promedio, etc. En ciertas modalidades de la invención, la enfermedad de riñon inflamatorio es caracterizada por y el tratamiento es determinado por alteraciones en células inflamatorias, deposiciones complejas inmune, por ejemplo, deposición de IgM o activación de complemento en glomerulos afectados, por ejemplo, activación de Clq, C3 y C4. En ciertas modalidades de la invención, la enfermedad renal comprende alteraciones en células mesangiales de riñon, por ejemplo, una disminución en los niveles de VEGF, en tanto que el tratamiento tendría el efecto opuesto. En ciertas modalidades de la invención, la glomerulonefritis es determinada por y el tratamiento es determinado al medir proteinuria, esclerosis glomerular, hipertensión o una combinación de los mismos. También puede ser determinad al determinar la sobrevivencia de células de riñon, por ejemplo, células mesangiales de riñon, expresión genética de síntesis de ECM o degradación de matriz. En tales casos, la glomerulonefritis puede ser determinada por la supervivencia disminuida de células mesangiales de riñon, un incremento en la expresión genética de síntesis de ECM, una reducción en la degradación de matriz o una combinación de los mismos, en tanto que el tratamiento tendría los efectos opuestos.

Composiciones de la invención y su producción La invención es concerniente con usos de varios agentes capaces de modular VEGFR, por ejemplo, actividades de VEGFR-1 y VEGFR-2 , en el riñon. El término "agente" o, alternativamente "compuesto", como se usan en la presente se refieren ampliamente a cualquiera sustancia con estructura molecular y propiedades fisicoquímicas identificables . Ejemplos no limitantes de agentes aptos de modular actividades de VEGFR incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y traducción y los semejantes. Agentes moduladores de VEGFR abarcados por la invención pueden ser ya sea un agonista de un VEGFR. Por ejemplo, un agonista de VEGFR puede ser un ligando de factor de crecimiento (por ejemplo, VEGF, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF E, P1GF, etc. (comúnmente, VEGF, VEGF B y/o P1GF) ) o un anticuerpo que se enlaza al dominio extracelular de los VEGFR y dispara su actividad de transducción de señal. Alternativamente, un agonista de VEGFR puede ser un compuesto de molécula pequeña que se enlaza al dominio citoplásmico de VEGFR y modera su fosforilación de tirosina. En una modalidad, el agonista de la invención es "selectivo" o "específico" a Flt-1, esto es, modula exclusiva o preferiblemente Flt-1 con respecto a otras cinasas de tirosina receptoras tales como KDR. En otra modalidad, el agonista de la invención es "selectivo" o "especifico" a KDR, esto es, modula exclusiva o preferiblemente KDR con respecto a otras quinasas de tirosina receptoras tales como Flt-1. En un aspecto, el agonista de VEGFR de la invención comprende un polipéptido variante de VEGF capaz de enlazarse selectivamente a Flt-1 (denominado posteriormente en la presente como "variante de VEGF Flt-1 selectiva" o "Fltl-sel" o "Fltlsel") . En un aspecto, el agonista de VEGFR es VEGF-B o P1GF, que se elnaza selectivamente a Fltl. Flt-sel y métodos de fabricación del mismo han sido conocidos y son descritos en las secciones de ejemplos posteriormente en la presente. Revelaciones adicionales concernientes con Flt-sel se pueden encontrar en, por ejemplo, la publicación de PCT WO 00/63380 y Li et al. J. Biol . Chem. 275:29823-29828 (2000) . En ciertas modalidades de la invención, las variantes de Flt-sel incluyen una o más mutaciones de aminoácidos y exhiben afinidad de enlace al receptor de Flt-1 que es igual o mayor (>) que la afinidad de enlace de VEGF natural al receptor de Flt-1, y aún más preferiblemente, tales variantes de VEGF exhiben menos afinidad de enlace (<) al receptor de KDR que la afinidad de enlace exhibida por VEGF natural a KDR. Cuando la afinidad de enlace de tal variante de VEGF al receptor de Flt-1 es aproximadamente igual (sin cambios) o mayor que (incrementada) en comparación con el VEGF natural y la afinidad de enlace de variante de VEGF al receptor de KDR es menor que o casi eliminada en comparación con VEGF natural, la afinidad de enlace de la variante de VEGF, por propósitos de la presente, se considera "selectiva" por el recepto de Flt-1. En una modalidad de la invención, las variantes de VEGF selectivas de Flt-1 de la invención tendrán por lo menos una afinidad de enlace por lo menos 10 veces menor al receptor de KDR (en comparación con VEGF natural), y aún más preferiblemente, tendrán por lo menos una afinidad de enlace 100 veces menor al receptor de KDR (en comparación con VEGF natural) . La respectiva afinidad de enlace de la variante de VEGF puede ser determinada mediante análisis de ELISA, RIA, y/o BIAcore, conocidos en el arte y descritos en la publicación de PCT WO 00/63380. En algunos aspectos de la invención, varios métodos para el tratamiento de riñon comprenden además administrar un agente capaz de modular las actividades de KDR. Por ejemplo, un agonista de KDR puede ser administrado en combinación con un agonista de Flt-1 para tratar la enfermedad de riñon. KDR ha sido identificado como la cinasa de tirosina de receptor mayor que modera las actividades de VEGF en proliferación de célula endotelial . En un aspecto, el agonista de KDR comprende VEGF (también como VEGF-C o VEGF-D) o un polipéptido variante de VEGF capaz de enlazarse selectivamente a KDR (de aquí en adelante en la presente denominado como "variante de VEGF KDR selectiva" o "KDR-sel" o "KDRsel" ) . Variantes de VEGF KDR-sel y métodos de fabricación de los mismos son descritos en detalle por ejemplo, en la publicación de PCT WO 00/63380 y Li et al. J. Biol. Chem. 275:29823-29828 (2000) . En una modalidad, los KDR-sel incluyen una o más mutaciones de aminoácidos y exhiben afinidad de enlace al receptor de KDR que es mayor o igual (>) que la afinidad de enlace de VEGF natural al receptor de KDR, y aún más preferiblemente, las variantes de VEGF exhiben menos afinidad de enlace (<) al receptor de flt-1 que la afinidad de enlace exhibida por VEGF natural a Flt-1. Cuando la afinidad de enlace de tal variante de VEGF al receptor de KDR es aproximadamente igual (sin cambio) o mayor de (incrementada) en comparación con VEGF natural y la afinidad de enlace de la variante de VEGF al receptor de flt-1 es menor que o casi eliminada en comparación con VEGF natural, la afinidad de enlace de la variante de VEGF, por propósitos de la presente, es considerada "selectiva" para el receptor de KDR. En una modalidad de la invención, un KDR-sel de la invención tendrá por lo menos 10 veces menos afinidad de enlace al receptor de Flt-1 (en comparación con VEGF natural), y aún más preferiblemente, tendrá por lo menos 100 veces menos afinidad de enlace al receptor de Flt-1 (en comparación con VEGF natural) . La respectiva afinidad de enlace de la variante de VEGF puede ser determinada mediante análisis de ELISA, RIA, y/o BIAcore que son conocidos en el arte. En una modalidad de la invención, un KDR-sel de la invención también exhibirá actividad en análisis de KIRA que reflejan la capacidad de inducir fosforilación del receptor de KDR. En una modalidad de la invención, variantes de KDR selectivas de la invención inducirán adicional o alternativamente proliferación de célula endotelial (que puede ser determinada mediante métodos conocidos tales como el análisis de proliferación de HUVEC) . En un aspecto, los agentes moduladores de VEGFR de la invención son producidos mediante mercados recombinantes . Se entiende en la presente que el ADN aislado usado en estos métodos significa ADN sintetizado químicamente, cADN, ADN cromosomal o extracromosomal con o sin las regiones de flanqueo 3'- y/o 5' . En ciertas modalidades de la invención, los agentes moduladores de VEGFR son elaborados mediante síntesis en cultivo celular recombinante . Para tal síntesis, un ácido nucleico que codifica un VEGF o VEGFR o variante de los mismos es necesario. El ADN que codifica una molécula de VEGF puede ser obtenido de células foliculares de pituitaria, por ejemplo, células foliculares pituitarias bovinas al (a) preparar una biblioteca de cADN de estas células, (b) llevar a cabo el análisis de hibridización con ADN marcado que codifica el VEGF o fragmentos del mismo (de hasta o más de 100 pares de bases de longitud) para detectar clones en la biblioteca que contienen secuencias homologas y (c) analizar los clones msnt análisis de enzima de restricción y secuenciación de ácido nucleico para identificar clones de plena longitud. Si no están presentes clones de plena longitud en una biblioteca de cADN, entonces los fragmentos apropiados pueden ser recuperados de los varios clones utilizando a información de secuencia de ácidos nucleicos revelada en la presente por primera vez y ligados en los sitios de restricción comunes a los clones para ensamblar un clon de plena longitud que codifica el VEGF. Alternativamente, las bibliotecas genómicas proporcionarán el ADN deseado. Una vez que este ADN ha sido identificado y aislado de la biblioteca, es ligado a un vector replicable para clonación o para expresión adicional. En un ejemplo de un sistema de expresión recombinante , un polipéptido de la invención, por ejemplo, un gen que codifica VEGF, etc., es expresado en un sistema de célula mediante transformación con un vector de expresión que comprende ADN que codifica, por ejemplo, el VEGF. En ciertas modalidades de la invención, es preferible transformar células huésped capaces de llevar a cabo tal procesamiento para obtener el polipéptido en el medio de cultivo o periplasma de la célula huésped, esto es, obtener una molécula secretada. En algunos aspectos de la invención, el agonista de Flt-1 comprende un factor de crecimiento que se enlaza selectivamente a y activa Flt-1. Varios homólogos de VEGF que se presentan de manera estable en la naturaleza que se enlazan específicamente a Flt-1 pero no KDR han sido identificados, en los que se incluyen sin limitación a, factor de crecimiento placental (PIGF) y VEGF-B. PIGF tiene una secuencia de aminoácidos que comparte 53% de identidad con el dominio semejante a factor de crecimiento derivado de plaquetas de VEGF. Park et al. J. Biol. Chem. 269:25646-54 (1994) ; Maglione et al. Oncogen 8:925-31 (1993) . Como con VEGF, surgen diferentes especies de PIGF de empalmar alternativamente el mARN y la proteína existe en forma dimérica. Véase, por ejemplo, Park et al., supra. Tanto PIGF-1 como PIGF-2 se enlazan a Flt-1 con alta afinidad, pero ni uno ni otro es apto de interactuar con KDR. Véase, por ejemplo, Park et al., supra. VEGF-B es producido como dos isoformas (residuos 167 y 185) que también parece enlazarse específicamente a Flt-1. Pepper et al. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 95:11709-11714 (1998) . Similar a las formas largas de VEGF, VEGF-B es expresado como una proteína enlazada a la membrana que puede ser liberada en una forma soluble después de la adición de heparina. VEGF-B y VEGF son también aptos de formar heterodímeros , cuando son coexpresados. Olofsson et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:2576-2581 (1996) . Los compuestos útiles en la invención incluyen moléculas orgánicas pequeñas que ejercen sus funciones moduladores en el dominio de cinasa de tirosina intracelular de los RTK. En ciertas modalidades preferidas, se emplean agonistas de molécula pequeña para estimular la fosforilación de tirosina, activando mediante esto la ruta de señalización correspondiente . Los compuestos útiles en la invención incluyen anticuerpos agonistas. Los anticuerpos de la presente invención son comúnmente específicos contra un receptor (tal como Flt-1) . En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos anti-Flt-1. En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-Flt-1 se enlaza selectivamente a y modula Flt-1, sin afectar la función de KDR. En una modalidad de la invención, el anticuerpo anti-Fltl es un anticuerpo agonista.

Usos La invención proporciona métodos para el tratamiento de enfermedad del riñon, por ejemplo, al promover la supervivencia de células mesangial mediante la administración una cantidad efectiva de agonistas de VEGFR. Los efectos promotores de supervivencia de la invención pueden ser determinados ya sea in vitro o in vivo, utilizando métodos conocidos en el arte y aquellos descritos en la presente. Por ejemplo, la inducción de síntesis de colágeno puede ser determinada (véase, por ejemplo, Amemiya, T., et al. Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells. Kidney Int 56:2055-2063 (1999)) y la producción de óxido nítrico pdser monitoreada (véase por ejemplo, Trachtman, H., et al. Effect of vascular endothelial growth factor on nitric oxide production by cultured rat mesangial cells. Biochem Biophys Res Comraun 245:443-446 (1998)) . La proliferación celular es determinada durante el cultivo utilizando métodos conocidos en el arte, en los que se incluye pero no limitados a, medir la proporción de síntesis de ADN, conteo de exclusión de tinte de azul t rypan/hemacitómetro o citometría de flujo. Véase también, por ejemplo, Onozaki, A., et al. Rapid change of glucose concentration promotes mesangial cell proliferation via VEGF: inhibitory effects of thiazolidinedione . Biochem Biophys Res Commun 317:24-29 (2004) . En un aspecto, la invención proporciona métodos para usar agonistas de VEGFR para regular ascendentemente o regular descendentemente la expresión genética de factores que son importantes para regular las actividades del riñon, por ejemplo, Tabla 2. Métodos y técnicas para detectar niveles de expresión de mARN o expresión de proteína en células/tejidos objetivos son conocidos para aquellos experimentados en el arte. Por ejemplo, el nivel de expresión genética puede ser detectado mediante análisis de hibridización de ácido nucleico conocidos, utilizando sondas capaces de hibridización a polinucleót idos , bajo condiciones apropiadas para la hibridización y detección y medición subsecuentes. Métodos útiles para la detección de expresión genética incluyen pero no están limitados a hibridización de southern (Southern J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)), hibridización northern (véase, por ejemplo, Freeman et al. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 80:4094-4098 (1983)), mapeo de endonucleasa de restricción (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) , Análisis de protección de RNasa (Current Protocols in Molecular Biology, John iley y Sons, New York, 1997), análisis de secuencia de ADN y amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR; patentes estadounidenses Nos. 4,683,202, 4,683,195 y 4,889,818; Gyllenstein et al. Proc Nati. Acad. Sci. USA 85:7652-7657 (1988) ; Ochman et al. Genetics 120:621-623 (1988); y, Loh et al. Science 243:217-220 (1989) seguido por hibridización de Southern con sondas especifica para el gen, en varios tipos de células. Otros métodos de amplificación comúnmente conocidos en el arte pueden ser usados. La severidad de las condiciones de hibridización para análisis de northern o Southern blot pueden ser manipuladas para asegurar la detección de ácidos nucleicos con el grado deseado de relación con las sondas especificas usadas. La expresión del gen en una muestra de célula o tejido puede también ser detectada y cuantificada utilizando técnicas de hibridización in situ de acuerdo con, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, New York, 1997. Los niveles de proteína pueden ser detectados mediante inmunoanálisis utilizando anticuerpos específicos a la proteína. Varios inmunoanálisis conocidos en el arte pueden ser usados, en los que se incluye pero no limitados a sistemas de análisis competitivo y no competitivo utilizando técnicas tales como radioinmunoanálisis , ELISA (análisis inmunoasborbente enlazado a enzima), inmunoanálisis de "emparedado", análisis inmunoradiométrico, reacciones de precipitina de difusión de gel, análisis de inmunodifusión, inmunoanálisis in situ (utilizando oro coloidal, enzima o marcadores de radioisótopo), análisis de western blot, reacciones de precipitación, análisis de aglutinación (por ejemplo, análisis de aglutinación de gel, análisis de hemaglutinación) , análisis de fijación de complemento, análisis de inmunofluorescencia , análisis de proteína A, análisis de inmunoelectroforesis , etc. En una modalidad, el enlace de anticuerpo es detectado al detectar un marcador sobre el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario es detectado al detectar el enlace de un anticuerpo o reactivo secundario al anticuerpo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario es marcado. Muchos medios son conocidos en el arte para detectar el enlace en un inmunoanálisis y están dentro del alcance de la presente invención.

Anticuerpos Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos anti-VEGFR o fragmentos de enlace de antigeno de VEGFR u otros anticuerpos descritos en la presente. Anticuerpos ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales , humanizados, fragmentos, multiespecificos , heteroconj ugados , multivalentes , de función efectora, etc. En ciertas modalidades de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo agonista.

Anticuerpos policlonales Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el experimentado en el arte. Por ejemplo, anticuerpos policlonales contra VEGFR son criados en animales mediante una o múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antigeno relevante a una proteina que es inmunogénica en la especie a ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o agente derivatizante, por ejemplo, maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación por medio de residuos de cisteina) , N-hidroxisuccinimida (por medio de residuos de lisina) , glutaraldehido, anhídrido succinico, S0C12 ó R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo. Los animales son inmunizados contra VEGFR, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la proteina o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días más tarde, los animales son sangrados y el suero es analizado en cuanto a titulo de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta que el titulo se estabiliza en meseta. Comúnmente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antigeno, pero conjugado a una proteina diferente y/o por medio de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden ser elaborados en cultivo de célula recombinante como fusiones de proteina. También, agentes agregantes tales como alumbre o alum son usados apropiadamente para mejorar la respuesta inmune.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden ser eaborados utilizando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinante (patente estadounidense No. 4, 816, 567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco, es inmunizado como se describe anteriormente en la presente para producir linfocitos que producen o son aptos de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego los linfocitos son fusionados con células de mieloma utilizando un agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) . Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de clave apropiado que contiene comúnmente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma padres sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma padres carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio de HAT) , tales sustancias impiden el crecimiento de células HGPRT-deficientes . Las células de mieloma típicas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpo mediante las células que producen anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio de HAT. Entre estas, las lineas celulares de mieloma preferidas son lineas de mieloma murinas, tales como aquellas derivadas de tumores de raon de MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA y células SP-2 ó X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las lineas celulares de mieloma humana y heteromieloma de ratón-humanas también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas es analizado en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra VEGFR. La especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma puede ser determinada mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) . Tales técnicas y análisis son conocidos en el arte. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede ser determinada por ejemplo mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. , 107:220 (1980) . Después que las células de hibridoma son identificadas que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden ser sub-clonados mediante procedimientos de dilución limitante y cultivado mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen por ejemplo medio de D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados apropiadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante proeds de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como por ejemplo proteina A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales pueden también ser elaborados mediante métodos de ADN recombinantes , tales como aquellos descritos en la patente estadounidense No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleót idos que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifica las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales ) . Las células de hibridoma sirven como fuente de tal ADN . Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son luego transíectados a células huésped tales como células de E. coli, células de COS simias, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteina de inmunoglobulina , para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos será descrita en más detalle posteriormente en la presente. En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante entremezcla de cadena (Marks et al., Bio/Technology , 10:779-783 (1992) ), también como infección combinatorial y recombinación in vivo como estrategia para construcción de biblioteca de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Ácidos. Res., 21:2265-2266 (1993) ) . Así, estas técnicas son alternatvas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (patente estadounidense No. 4,816,567; orrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina. Comúnmente tales polipéptidos sin inmunoglobulina son sustituidos por dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables del sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende uno sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno y otro sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno diferente .

Anticuerpos humanizados y humanos Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos al mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son denominados frecuentemente como residuos de "importación" que son tomados comúnmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Asi, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a ser usados en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad . De acuerdo con el llamado método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a aquella del roedor es luego aceptada como la estructura humana (FR) del anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993) ; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)) . Otro método utiliza una estructura particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un sub-grupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151 : 2623 (1993) ) . Es importante además que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método típico, los anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias padre y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secas parental y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos experimentados en el arte. Están disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, esto es, el análisis de residuos que influencian la habilidad de la inmunoglobulina candidata para enlazarse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR pueden ser seleccionados y combinados de las secuencias de receptor y secuencias de importación, de tal manera que la característica de anticuerpo deseada, tal como afinidad incrementada por el (los) antígeno(s) objetivo es obtenida. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente involucrados en influenciar el enlace de antígeno . Alternativamente, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son aptos, después de la inmunización, de producir un pleno repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la cancelación homociga del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo genético de inmunoglobulina de línea germinal humano en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos después del ataque de antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993) ; Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992) . Anticuerpos humanos pueden también ser derivados de bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al . , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al . Nature Biotech 14:309 (1996) ) . Los anticuerpos humanos pueden también ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, en las que se incluyen bibliotecas de despliegue de fago (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)) . De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo son clonados en cuadro ya sea a un gen de proteina de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y desplegados como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede ser efectuado en una variedad de formatos, revisado sen, por ejemplo, Johnson, K S. y Chiswell, D J., Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993) . Varias fuentes de segmentos de gen V pueden ser usadas para el despliegue de fago. Por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatorial aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos sin inmunizar puede ser construido y los anticuerpos a un diverso arreglo de antigenos (en los que se incluyen auto-antigenos) pueden ser aislados, por ejemplo, al seguir esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véase, también, patentes estadounidenses Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Las técnicas de Colé et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol . , 147(1): 86-95 (1991)). Anticuerpos humanos pueden también ser generados mediante células B activadas in vitro (véanse patentes estadounidenses 5,567,610 y 5,229,275).

Fragmentos de anticuerpo Fragmentos de anticuerpo también están incluidos en la invención. Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos eran derivados vía digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal de Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora ser producidos directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fago de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, fragmentos de Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) . De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos de F(ab')2 pueden ser aislados directamente del cultivo de célula huésped recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el técnico experimentado en el arte. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv) . Véase WO 93/16185; patente estadounidense No. 5,571,894; y patente estadounidense No. 5, 587, 458. Fv y sFv son la unida especie con sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes; así, son apropiados para el enlace no específico reducido durante el uso in vivo. Proteínas de fusión de SFv pueden ser construidas para producir fusión de una proteína efectora ya sea en el término amino o el término carboxi de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecí fieos o bisespecí fieos .

Anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, bisespecíficos) Los anticuerpos de la invención también incluyen, por ejemplo, anticuerpos multiespecificos , que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos antigenos diferentes. En tanto que tales moléculas solamente se enlazarán normalmente a dos antigenos (esto es, anticuerpos bisespecíficos , BsAb) , anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos tris-específicos son abarcados por esta expresión cuando se usa en la presente. Ejemplos de BsAb incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un anti de célula y el otro brazo dirigido contra una molécula de gatillo citotóxica tal como anti-FcyRI /anti-CD15 , anti-pl85HER2/FcYRIII (CD16) , célula B anti-CD3/anti-maligna (1D10), anti-CD3/anti-pl85HER2, anti-CD3/anti-p97 , anti-CD3/carcinoma de célula anti-renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-Dl (carcinoma anti-colon) , análogo de hormona estimulante anti-CD3/anti-melanocito, recptor anti-EGF/anti-CD3 , anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18 , molécula de adhesión de célula anti-neural (NCAM) /antÍ-CD3 , proteína de enlace anti-foliato ( FBP) /anti-CD3, antígeno asociado a carcinoma anti-pan (AMOC-31 ) /anti-CD3 ; BsAb con un brazo que se enlaza específicamente a un antígeno sobre una célula y un brazo que se enlaza a una toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1 , anti-CD22 /anti-saporina , anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38 /anti-saporina, anti-CEA/cadena de anti-ricino A, idiotipo de anti- interferón- ( IFN-a) /ant i-hibridoma , alcaloide anti-CEA/ant i-vinca; BsAb para convertir profármacos activados por enzima tales como una anti-CD30/anti-alcalina fosfatasa (que cataliza la conversión del profármaco de fosfato de mitomicina a alcohol mitomicinico) ; BsAb que pueden ser usados como agentes fibrinoliticos tales como activador de plasminogeno anti-fibrina/ant i-tej ido (tPA) , activador de plasminogeno tipo anti-fibrina/anti-urocinasa (uPA) ; BsAb para apuntamiento de complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como lipoproteina anti-baja densidad (LDL) /receptor anti-Fc (por ejemplo, FcyRI, FCYRII O FCYRIII); BsAb para uso en terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/virus anti-herpes simplex (HSV), complejo de receptor anti-célula T:CD3/anti-influenza, anti-FcYR/anti-VIH ; BsAb para detección de tumor in vitro o in vivo tal como ant i-CEA/anti-EOTUBE, ant i-CEA/ant i-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAb como adyuvantes de vacuna; y BsAb como herramientas de diagnóstico tales como IgG ant i-conej o/anti-ferritina , anti-peroxidasa de rábano (HRp) /anti-hormona , anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti^-galactosidasa . Ejemplos de anticuerpos t riespecificos incluyen anti-CD3/anti-CD4 /anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. En una modalidad de la invención, un anticuerpo bisespecifico es una anti-Fltl agonista/anti-Integrina ot-8. Anticuerpos bisespecificos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos bisespecificos F(ab')2) . Métodos para la fabricación de anticuerpos bisespecificos son conocidos en el arte. La producción tradicional de anticuerpos bisespecificos de plena longitud está basada en la co-expresión de dos pares de cuando pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , en donde las dos cadenas tienen dis especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983) ) . Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura bisespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien molesta y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son revelados en WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655-3659 (1991) . De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de ant icuerpo-ant ígeno ) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende por lo menos parte de las regiones de engozne, CH2 y CH3. Es preferido tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados a los vectores de expresión separados yy son co-transfectados a un organismo huésped apropiado. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión, cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significado particular. En una modalidad de este procedimiento, los anticuerpos bisespecificos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto bisespecifico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula bisespecifica proporciona una manera fácil de separación. Este procedimiento es revelado en WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos bisespecificos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . De acuerdo con otro procedimiento descrito en W096/27011, la inferíase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo celular recombinante . La inferíase preferida comprende por lo menos parte del dominio de CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la inferíase de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral grande son creadas sobre la inferíase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos grandes con más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodimeros . Técnicas para generar anticuerpos bisespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también an sido descritas en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos bisespecificos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente acomplejante de ditiol arsenita de sodio para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Luego los fragmentos de Fab' generados son convertidos a derivados de t ionitrobenzoato (TNB) . Luego uno de los derivados de Fab' -TNB es reconvertido al Fab' -tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo bisespecif ico . Los anticuerpos bisespecificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmento de Fab' -SH de E. coli, que pueden ser acoplados químicamente para formar anticuerpos bisespecificos . Shalaby et al., J. Exp . Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab')2 bisespecifico plenamente humanizada. Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo bisespecifico . El anticuerpo bisespecifico así formado fue apto de enlazarse a células que sobreexpresan el receptor de VEGF y células T humanas normales, también como disparar la actividad litica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de pecho humano. Varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpo bisespecificos directamente a partir del cultivo celular recombinante han también sido descritas. Por ejemplo, anticuerpos bisespecificos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina . Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y luego re-oxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar anticuerpo bisespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Así, los dominios de VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpo bisespecificos mediante el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) también se ha reportado. Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) . Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos trisespecificos . Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos bisespecificos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconj ugados" , que son anticuerpos de la invención. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido por ejemplo propuestos para apuntar a células del sistema inmune a células indeseables (patente estadounidense No. 4,676,980) y para el tratamiento de infección por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconj ugados pueden ser elaborados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación apropiados son bien conocidos en el arte y son revelados en la patente estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación.

Anticuerpos multivalentes Los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo multivalente . Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antigeno al cual los anticuerpos se enlazan. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos mult ivalentes (que son diferentes a la clase de IgM) con tres o más sitios de enlace de antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden ser producidos fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antigeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región de Fe o una región de engozne. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región de Fe y tres o más sitios de enlace de antigeno amino-terminales a la región de Fe. El anticuerpo multivalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero preferiblemente cuatro sitios de enlace de antigeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena de polipéptido (y preferiblemente dos cadenas de polipéptidos), en donde la(s) cadena (s) de polipéptido ( s ) comprende (n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido ( s ) puede (n) comprender VDl- (XI ) n-VD2- (X2 ) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región de Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido ( s ) puede (n) comprender: cadena de región de VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl-Fc; o cadena de región de VH-CH1-VH-CH1-Fc . El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferiblemente por lo menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente puede comprender por ejemplo de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El polipéptido de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente , comprenden además un dominio de CL.

Diseño de función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento de la enfermedad, por ejemplo. Por ejemplo, se puede introducir residuo (s) de cisteina en la región de Fe, permitiendo mediante esto la formación de enlace de disulfuro de inter-cadena en esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener capacidad de internalización mejorada. Véase Carón et al., J. Exp ed. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148:2918-2922 (1992) . Para incrementar la vida media en el suero del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de enlace del receptor de salvamento al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente estadounidense 5,139,211, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término "epítopo de enlace del receptor de salvamento" se refiere a un epítopo de la región de Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ó IgG4) que es responsable por incrementar la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG.

Otras modificaciones de anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo son contempladas en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros on proteináceos , por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y propilenglicol. El anticuerpo también puede ser atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente), en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Liposomas y nanoparticulas Los polipéptidos de la invención pueden ser formulados en liposomas. Por ejemplo, moduladores de CEGFR de la invención pueden ser formulados como inmunoliposomas . Liposomas que contienen el polipéptido son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. EUA, 77:4030 (1980) y Patentes Estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Liposomas con tiempo de circulación mejorado son revelados en la Patente Estadounidense No. 5,013,556. En general, la formulación y uso de liposomas son conocidos para aquellos de habilidad en el arte . Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lipido que comprende fosfatidilcolina , colesterol y fosfatidiletanolamina PEG-derivada (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Un polipéptido de la invención puede ser conjugado a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) (por ejemplo, fragmentos de Fab' de un anticuerpo) vía una reacción de intercambio de disulfuro. Nanoparticulas o nanocápsulas pueden también ser usadas para atrapar los polipéptidos de la invención. En una modalidad, nanoparticulas de polialqui-cianoacrilato biodegradables pueden ser usadas con los polipéptídos de la invención.

Otros usos Los anticuerpos anti-VEGFR tienen varias utilidades.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGFR pueden ser usados en análisis de diagnóstico en cuanto a VEGFR o fragmentos de VEGFR, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o suero especifico, para la detección de enfermedad, por ejemplo de las alteraciones descritas en la presente, etc. En una modalidad, los anticuerpos VEGFR son usados para seleccionar la población de pacientes para el tratamiento con los métodos provistos en la presente. Varias técnicas de análisis de diagnóstico conocidas en el arte pueden ser usadas, tales como análisis de enlace competitivo, análisis de emparedado directo o indirecto y análisis de inmunoprecipitación llevados a cabo ya sea en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodíes : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158) . Los anticuerpos usados en los análisis de diagnóstico pueden ser marcados con una porción detectable. La porción detectable debe ser apta de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detyectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente , tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano. Cualquier método conocido en el arte para conjugar el anticuerpo a la porción detectable puede ser usado, en los que se incluyen aquellos métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) y Nygren, J. Histoche . And Cytochem . , 30:407 (1982). Los anticuerpos anti-VEGFR también son útiles para la purificación por afinidad de VEGFR a partir de cultivo celular recombinante o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra VEGFR son inmovilizados sobre un soporte apropiado, tal como una resina de Sephadex o papel filtro, utilizando métodos bien conocidos en el arte. Luego, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el VEGFR a ser purificado y después de esto el soporte es lavado con un solvente apropiado que removerá sustancialmente todo el material en la muestra excepto el VEGFR, que es enlazado al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte es lavado con otro solvente apropiado que liberará el VEGFR del anticuerpo.

Vectores , células huésped y métodos recombinantes Los polipéptidos de la invención pueden ser producidos recombinantemente, utilizando técnicas y materiales que se pueden obtener fácilmente. Para la producción recombinante de un polipéptido de la invención, por ejemplo, un agente modulador de VEGFR de polipéptido, el ácido nucleico que lo codifica es aislado e insertado a un vector replicable para clonación adicional (a purificación del ADN o para excreción) . El ADN que codifica el polipéptido de la invención es aislado fácilmente y secuenciado utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, un ADN que codifica un anticuerpo monoclonal es aislado y secuenciado, por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótidos que forman bases para enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. Muchos vectores están disponibles. Los componentes de vector incluyen en general pero no están limitados a uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción.

Componentes de secuencias de señal Los polipéptidos de la invención pueden ser producidos recombinantemente no solo de manera directa, si no también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es comúnmente una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el término N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es comúnmente una que es reconocida y procesada (esto es, escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Por las células huésped procariónticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del polipéptido natural, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procarióntica seleccionada, por ejemplo, del grupo líder de fosfatasa alcalina, penicilinasa , lpp o enterotoxina II estable térmicamente. Para secreción de levaduras, la secuencia de señal natural puede ser sustituida por, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, un líder de factor alfa (en los que se incluyen líderes de factor a Saccharomyces y Kluyveromyces) o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de célula mamífera, secuencias de señal mamíferas también como líderes secretorios virales, por ejemplo, la señal de gD de herpes simplex están disponibles. El ADN para tal región precursora es ligado en el cuadro de lectura al ADN que codifica el polipéptido de la invención.

Componentes de origen de replicación Tanto vectores de expresión como de clonación que contienen una secuencia de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas.

En general, en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomal huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de bacterias Gram-negat ivas , el origen del plásmido 2µ es apropiado para levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma , adenovirus , VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células mamíferas. En general, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión mamíferos (el origen SV40 puede comúnmente ser usado solamente debido a que contiene el promotor prematuro) .

Componente de gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable . Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan deficiencias autotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-amina racemasa para bacilos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped.

Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteina que confieren resistencia a fármaco y asi sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico de anticuerpo, tal como DHFR, timidita cinasa, metalotioneina-I y -II, comúnmente genes de metalot ioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa , etc. Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección de DHFR son identificadas primero al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se usa DHFR tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente de actividad de DHFR. Alternativamente, las células huésped (particularmente huésped tipo silvestre que contiene DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de la invención, proteína de DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglicósido 3 ' -fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados mediante cultivo celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Véase Patente Estadounidense No. 4,965,199. Un gen de selección apropiado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)) . El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977) . La presencia de la lesión trpl en el genoma de célula huésped de levadura proporciona entonces un medio ambiente efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura Lei2-deficientes (ATCC 20,622 o 38,626) son complementadas mediante plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2. Además, vectores derivados del plásmido circular de 6µp? pKDl pueden ser usados para transformación de levaduras de Kluyveromyces . Alternativamente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimiocina de becerro recombinante fue reportado para K. lactis. Van den Berg, Blo/Technology, 8:135 (1990) . Vectores de expresión de multi-copias estables para secreción de albúmina de suero humano recombinante maduras mediante cepas industriales de Kluyveromyces también se han revelado. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991) .

Componente de promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y es enlazado operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Promotores apropiados para uso con huéspedes procariónticos incluyen el promotor phoA, sistemas de promotor de ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos son apropiados. Promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine Dalgarno (S.D.) elazada operativamente al ADN que codifica el polipéptido de la invención. Secuencias de promotor son conocidas para eucariontes. Virtualmente todos los genes eucariónticos tienen una región rica en AT ubicada a aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región de CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariónticos se encuentra una secuencia de AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias son insertadas apropiadamente a vectores de expresión eucariónticos.

Ejemplos de secuencias de promoción apropiadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para cinasa de 3-fosfoglicerato u otras enzimas glicoliticas , tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada, exocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-e-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, cinasa de piruvato, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa . Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de cultivo son las regiones de promotor para alcohol deshidrogenada 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina , gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores apropiados para uso en la expresión de levadura son descritos adicionalmente en EP 73,657. Los mejoradores de levadura también son usados ventajosamente con promotores de levadura. La transcripción de polipéptidos de la invención a partir de vectores en células huésped mamiferas es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de pustulación avícola, adenovirus (tal como adenovirus II), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B y comúnmente Virus 40 de Simio (SV40) , de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. Los promotores prematuros y tardíos del virus SV40 son obtenidos convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor prematuro inmediato del citomegalovitus humano es obtenido convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII. Un sistema para expresión de ADN en huéspedes mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como vector es revelado en la Patente Estadounidense No. 4,419,446. Una modificación de este sistema es descrita en la Patente Estadounidense No. 4,601,978. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en cuanto a la expresión de cADN de ß-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de cinasa de timidita de virus de herpes simplex. Alternartivamente , la repetición terminal larga del virus de sarcoma de rous puede ser usado como promotor.

Componente de elemento mejorador La transcripción de un ADN que codifica un polipéptido de esta invención mediante eucariontes superiores es frecuentemente incrementada al insertar una secuencia de mejorador al vector. Muchas secuencias de mejorador son ahora conocidas de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-cetoproteína e insulina) . Comúnmente, se usará un mejorador de un virus de célula eucarióntica . Ejemplos que incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270) , el mejorador del promotor prematuro de citomegalovirus , el mejorador de polioma sobre el lado tardío del origen de replicación y mejoradores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en cuanto a elementos mejoradores para activación de promotores eucariónticos . El mejorador puede ser empalmado al vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de codificación del polipéptido, pero está ubicado comúnmente en un sitio 5' del promotor.

Componentes de terminación de transcripción Los vectores de expresión usados en células huésped eucariónticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilización del mARN . Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones 5' y ocasionalmente 3' sin traducir de ADN o cADN eucariónticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del mARN que codifica el polipéptido de la invención.

Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino. Véase Wo 94/11026 y el vector de expresión revelado en la misma .

Selección y transformación de células huésped Células huésped apropiadas para clonar o expresar ADN que codifica los polipéptidos de la invención en los vectores en la presente son las células procariónt icas , de levadura o células eucariónticas superiores descritas en la presente. Procariontes apropiados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negat ivos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia , por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella , asi como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P revelado en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa y Streptomyces . Comúnmente, el huésped de clonación de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325) sin apropiadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Además de los procariontes, los microbios eucariónt icos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para el polipéptido de los vectores de la invención. Saccharomyces cerevisiae o levadura de panadero común, es la más usada comúnmente entre los microorganismos huéspedes eucariónticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe huéspedes de Kluyveromyces tales como por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424) , K. bulgaricus (ATCC 16,045) , K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226) ; Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidental is y hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora , Penicillium, Tolypocladíum y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans y A. Níger. Células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos glicosilados de la invención son derivadas de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas y variantes baculovirales y células huésped de insectos permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori han sido identificados. Una variedad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa cali fornica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y tales virus pueden ser usados como el virus en la presente de acuerdo con la invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Cultivos celulares de plantas de algodón, maíz, pastasa, soya, petunia, tomate y tabaco pueden también ser utilizados como huéspedes. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de lineas de células huésped mamiferas son linea CV1 de riñon de chango transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de riñon de hámster bebé (BHK, /ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)) ; células de riñon de chango (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamariio de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y un linea de hematoma humano (Hep G2 ) . Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del polipéptido de la invención y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados como se a apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Cultivos de las células huésped Las células huésped usadas para producir los polipéptidos de la invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente tales como FIO de Ham (Sigma) , Medio Esencial Mínimo (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Sigma), medio de cultivo normal para células de riñon, etc., son apropiados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth . Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem .102 : 255 (1980), Patentes Estadounidenses Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90/03430; O 87/00195o Patente Estadounidense No. Referencia 30,985 pueden ser usados como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden ser complementados como sea necesario con hormonas y/u otros factores de cultivo (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales, (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones reguladoras del pH (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidita) , antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™) , elementos de entrada (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera de los complementos necesarios pueden también ser incluidos a concentraciones apropiadas que serían conocidas por aquellos experimentados en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y los semejantes son aquellos usados apropiadamente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán aparentes para el técnico de experiencia extraordinaria en el arte.

Purificación del polipéptido Cuando se usan técnicas recombinantes , un polipéptido de la invención, por ejemplo, un agente modulador de VEGFR de polipéptido, pueden ser producidos intracelularmente , en el espacio periplásmico o secretado directamente al medio. Los polipéptidos de la invención pueden ser recuperados del medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si están enlazados a la membrana, pueden ser liberados de la membrana utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión de un polipéptido de la invención pueden sometidas a disrupción mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-deshielo, sonificación, disrupción mecánica o agentes de lisis celulares. Puede ser deseable purificar un polipéptido de la invención a partir de proteínas de células recombinantes o polipéptidos . Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía de SEPHAROSE™ sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.) ; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel utilizando por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para remover los contaminantes tales como IgG y columnas quelantes de metal para enlazar formas de epítopos-marcadas de polipéptidos de la invención. Varios métodos de purificación de proteínas pueden ser usados y tales métodos son conocidos en el arte y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . La(s) etapa (s) de purificación seleccionada ( s ) dependerá (n) por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el polipéptido particular de la invención producido. Por ejemplo, una composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede ser purificada utilizando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, la cromatografía por afinidad es la técnica de purificación representativa. La conveniencia de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser usada para purificar anticuerpos que son a base de cadenas pasadas ??, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)) . La proteína G es recomendada para todos los estereotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)) . La matriz a la cual el ligando de afinidad es anexado, es más frecuentemente agarosa, petro otras matrices están disponibles. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli ( est iren-divinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden obtener con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina de Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteibnas, por ejemplo, aquellas indicadas anteriormente, son también apropiadas dependiendo del anticuerpo a ser recuperado. Véase también Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) que describe un procedimiento para aislar anticuerpo que son secretados al espacio periplásmico de E. coli.

Modificaciones covalentes a polipéptidos de la invención Modificaciones covalentes de un polipéptido de la invención, por ejemplo, un agente modulador de VEGFR de polipéptido, etc., están incluidas dentro del alcance de esta invención. Se pueden hacer mediante síntesis química o mediante escisión enzimática o química del polipéptido, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido son introducidas a la molécula al hacer reaccionar los residuos de aminoácido objetivos del polipéptido con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales o al incorporar un aminoácido purificado o aminoácido no natural a la cadena de polipéptidos creciente, por ejemplo, Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) ; Noren et al. Science 244:182 (1989) y solicitudes de patentes estadounidenses Nos. 20030108885 y 20030082575. Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con ct-haloacetato (y aminas correspondientes) , tal como ácido cloroacético o cloroacetamida para dar derivados de carboxietilo o carboxiamidometilo . Los residuos de cisteinilo también son derivados mediante reacción con bromo trifluoroacetona , ácido a-bromo-ß- ( 5-imidozoil ) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l , 3-diazol . Los residuos de histidilo son derivados mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 debido a que este agente es relativamente especifico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenancilo también es útil; la reacción es efectuada comúnmente en cacodilato de sodio 0.1 M a pH 6.0. Los residuos de lisinilo y amino-terminales se hacen reaccionar con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de glicinilo. Otros reactivos apropiados para derivar residuos que contienen a-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencensulfónico, 0-metil lisourea, 2,4-pentandiona y reacción transaminasa-catalizada con glioxilato. Los residuos de arginilo son modificados mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal , 2 , 3-butandiona , 1 , 2-ciclohexandiona y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción sea efectuada en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, también como el grupo e-amino de arginina. En la modificación especifica de residuos de tirosilo se puede hacer con particular interés al introducir marcadores espectrales a residuos de tirosilo mediante la reacción de compuestos de diazonio aromáticos o tet ranitrometano . Más comúnmente, N-acet ilimidazol y tetranitrometano son usados para formar especies de O-acet il-t irosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo son llevados utilizando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en radioinmunoanálisis . Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) son mosificados selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , en donde R y R' son grupos alquilo diferente, tales como l-ciclohexil-3- ( 2-morfolinil-4 -etil ) carbodiimida o l-etil-3- ( -azonia-4 , 4-dimetilpentil ) -carbodiimida . Además, los residuos de aspartilo y glutamilo son convertidos a residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo son comúnmente desanidados a los residuos glitaminilo y asparaginilo, respectivamente. Estos residuos son desanidados bajo condiciones neutras o básicas. La forma desanidada de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo y treonilo, mutilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp . 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal . Otro tipo de modificación covalente involucra el acoplamiento química o enzimát icamente de glicósidos a un polipéptido de la invención, por ejemplo, un agente modulador VEGFR, etc. Estos procedimientos son ventajosos en que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped porque tienen la capacidad de glicosilación para la glicosilación N- u O-enlazada. Dependiendo del tipo de acoplamiento usado, el (los) azúcar (es) puede (n) estar unido (s) a (a) argionina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidrociprolina , (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos son descritos en WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) . El retiro de cualesquier porciones de carbohidratos en un polipéptido de la invención puede ser realizado química o enzimáticamente . La desglicosilación química requiere de la exposición del polipéptido en el compuesto de ácido trifluorometansulfónico o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de la mayor parte de todos los azúcares, con excepción del enlace de azúcar (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina ) , mientras que queda intacto el polipéptido. La desglicosilación química es descrita por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y por Edge et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981) . La escisión enzimática de las porciones carbohidrato, por ejemplo, sobre polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos), pueden ser obtenidas mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138:350 (1987) . Cualquier otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de la invención comprende el enlace del polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, poliet ilenglicol , polipropilenglicol o polioxialquilenos , de la forma expuesta en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337.

Composiciones farmacéuticas Para usos in vivo de acuerdo con los métodos de la invención, un compuesto terapéutico de la invención es suministrado a un sujeto utilizando métodos y técnicas conocidos en el arte y apropiados para el uso particular. En una modalidad preferida, el compuesto es suministrado en forma de composiciones farmacéuticas a una dosificación farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención contempla el uso de preparaciones de proteínas del agente de proteína terapéutico para la administración de un agente de proteína terapéutico (por ejemplo, preparaciones de proteínas recombinantes ) . En un aspecto, la invención contempla el uso de preparaciones de células mamíferas para la administración de un agente de proteína terapéutico (por ejemplo, un agente modulador de VEGFR de polipéptido, etc.) . las células mamíferas usadas en la presente han sido transíectadas con el gen heterólogo que codifica la proteína, como se describe en detalle anteriormente, en una modalidad, las células huésped usadas para la administración son células CHO. Formulaciones terapéuticas de las moléculas de la invención (tales como agente modulador de VEGFR, por ejemplo, VEGF, variante VEGFR, variante VEGF (por ejemplo, Fltl-sel o KDR) , anticuerpo VEGFR, modulador de molécula pequeña de VEGFR, etc.), usado de acuerdo con la invención son preparados para almacenamiento al mezclar una molécula, por ejemplo, un polipéptido o molécula pequeña, que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales {Remington' s Pharmaceutical Sciences 20a edición, Osol, A. Ed. (2000) ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes en los que se incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimet ilbencilamonio ; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenolburilo o alcohol bencílico; alquil parabenos tales como metil propil parabenos; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contrapones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo, mediante técnicas de conservación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina o microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceuti.cal Sciences 20th edition, Osol, A. Ed. (2000) . Véase también Johnson et al., Nat. Med. , 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther . , 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/'Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," en Vaccíne Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, editores, (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 y Patente Estadounidense No. 5,654,010. En ciertas modalidades, las formulaciones a ser usadas para administración in vivo son estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen un polipéptido de la invención, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) ) , polilacturos (Patente Estadounidense No, 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-acetarto de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT™ (microes feras inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuproluro) , polímero de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutírico . En tanto que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas de tiempos más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad . Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de acción en formación de enlace S-S intermolecular por medio de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede ser obtenida al modificar los residuos de sulfhidrilo, liofilización de soluciones ácidas, control del contenido de humedad utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz poliméricas especificas. Véase también, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,699,501 que describe cápsulas con cubierta de polielectrólito. Se contempla además que un agente de proteina terapéutico de la invención (por ejemplo, un modulador de VEGFR, por ejemplo, VEGF, variante de VEGFR, variante de VEGFG (por ejemplo, Fltl-sel o KDR-sel), anticuerpo de VEGFR, etc.) pueden ser introducidos a un sujeto mediante terapia genética. La terapia genética se refiere a la terapia efectuada mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En aplicaciones de terapia genética, los genes son introducidos a células con el fin de obtener la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, para reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia genética" incluye tanto terapia genética convencional, en donde se obtiene un efecto duradero mediante un solo tratamiento y la administración de agentes terapéuticos genéticos, que involucra la administración por una vez o administración repetida de un ADN o mARN terapéuticamente efectivo. ARN y ADN antisentido pueden ser usados como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que oligonucleótidos antisentido cortos pueden ser importados a células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares provocadas por su absorción restringida por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 83:4143-4146 (1986)) . Los oligonucleótidos pueden ser modificados para mejorar su absorción, por ejemplo, al sustituir sus grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos sin cargar. Para revisiones generales de métodos de terapia genética, véase por ejemplo, Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu Biotherapy 3:87-95 (1991) ; Tolstoshev Ann . Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993) ; Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan y Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993) y May TIBTECH 11:155-215 (1993) . Métodos comúnmente conocidos en el arte de tecnología de ADN recombinante que pueden ser usados como se describe en Ausubel et al. editores. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY y Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo si el ácido nucleico es transferido a células cultivadas in Vitro o in vivo en las células del huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácidos nucleicos a células martilieras in Vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrana , el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Por ejemplo, técnicas de transferencia genética in vivo incluyen pero no están limitadas a, por ejemplo, transfección con vectores virales (comúnmente retrovirales ) y transfección moderada por proteina-liposoma de recubrimienti viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)) . Por ejemplo, técnicas de transferencia de ácidos nucleicos in vivo incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simples I, lentivirus, retrovirus o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lipidos (lipidos útiles para transferencia moderada por lipidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Ejemplos de uso en vectores virales en terapia genética se pueden encontrar en Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); Grossman y Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993) ; Bout et al. Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994) ; Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993) y alsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunta a las células objetivo, tal como un anticuerpo especifico para una proteina de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. En donde se emplean liposomas, las proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis pueden ser usados para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo, proteínas de cápside o fragmentos de los mismos o trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en la realización de ciclos, proteínas que apuntan a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular . La técnica de endocitosis moderada por receptor es descrita por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987) y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de marcación genética y terapia genética véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) . Por ejemplo, vectores virales o no virales para terapia genética también como células renales modificadas genéticamente han sido usados para la administración de genes extraños en el riñon. Varios vectores fueron inyectados a células renales por medio de rutas diferentes, vía inyecciones intraarterial , intraureteral o intraparenquimal (Bosch R J et al., (1993) Exp Nephrol 1: 49-54 ; y Ye X et al., (2001) Hum Gene Ther 12: 141-148) . La alimentación principal de la inyección intraparenquimal fue que provoca algo de lesión renal. La administración de un transigen al riñon ex vivo antes del trasplante a un receptor podría también ser usada en algunos casos.

Dosificación y administración Las dosificaciones y dosificaciones de fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas de la invención pueden variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosificación o ruta de administración apropiada está dentro de la habilidad del médico ordinario. Experimentos en animales proporcionan guía confiable para la determinación de dosis efectivas para terapia humana. Se puede efectuar escalamiento de interespecie de dosis efectivas siguiendo los principios resumidos por Mordenti, J. y Chappell, . "The use of interspecies scaling in toxicokinet ics " In Toxícokinetics and New Drug Development , Yacobi et al., Editores., Pergamon Press, Nueva York 1989, pp . 42-96. Dependiendo del tipo, y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/Kg a 50 mg/Kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/Kg) de modulador de VEGFR es una modificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Cuando se usa la administración in vivo de un modulador de un VEGFR, las cantidades de administración normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/Kg hasta 100 ng/Kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferiblemente alrededor de 1 µ?/Kg/día a 10 mg/Kg/día, dependiendo de la ruta de administración. Se proporciona guía en cuanto a dosificaciones y métodos particulares de administración en la literatura; véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 4,657,760; 5,206,344 o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes alteraciones, que la administración que apunta a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la administración de manera diferente de aquella a otro órgano o tejido. Para la administración repetida por varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es obtenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Comúnmente, el clínico administrará una(s) molécula (s) de la invención hasta que se alcanza una dosificación (es ) que proporciona (n) el efecto biológico requerido. El avance de la terapia de la invención es monitoreado fácilmente mediante técnicas y análisis convencionales. La composición terapéutica de la invención puede ser administrada mediante cualesquier medios apropiados, en los que se incluyen pero no limitados a administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal , intrapulmonar, intracerebroespinal , subcutánea, intra-art icular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica e intranasal. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intra-arterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, la composición terapéutica es administrada apropiadamente mediante infusión de impulso, particularmente con dosis detonantes del modulador. En ciertas modalidades, la composición terapéutica es dada mediante inyecciones, por ejemplo, inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. El uso de múltiples agentes también está incluido en la invención. Como se describe en la presente, el modulador de VEGF puede ser combinado con uno o más agentes terapéuticos. La administración combinada incluye la co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y administración consecutiva ya sea en un orden u otro. Por ejemplo, un agonista de VEGFR puede preceder, seguir, alternar con la administración del agente terapéutico adicional (por ejemplo, un agente angiogénico) o puede ser dado simultáneamente con el mismo. En una modalidad, hay un periodo de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del modulador de VEGF dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el agente es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al agente y la discreción del médico que atiende. El agente es administrado apropiadamente al paciente en un tiempo o en una serie de tratamientos. En un régimen de terapia de combinación, las composiciones de la invención son administradas en una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad terapéuticamente sinergística . Como se usa en la presente, una cantidad terapéuticamente efectiva es de tal manera que la co-administración del modulador de VEGFR y uno o más de otros agentes terapéuticos o la administración de una composición de la invención, da como resultado la reducción o inhibición de la enfermedad o condición de apuntamiento. Una cantidad terapéuticamente sinergística es aquella cantidad del modulador de VEGFR y uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo, como se describe en la presente, necesaria para reducir sinergística o significativamente o eliminar condiciones o síntomas asociados con una enfermedad particular.

Artículos de manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para los métodos y tratamiento de las alteraciones descritas anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente, una etiqueta y un inserto de empaque. Recipientes apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la enfermedad del riñon y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición es un modulador de VEGFR. La etiqueta sobre o asociada con el recipiente indica que la composición es usada para el tratamiento de enfermedad del riñon. El articulo de manufactura puede comprende además un segundo recipiente que comprende una solución reguladora del pH aceptable farmacéuticamente, tal como solución salina de pH regulado de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales desde un punto de vista comercial y del usuario, en los que .se incluyen otra soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Opcionalmente , un conjunto de instrucciones, en general instrucciones escritas, están incluidas, que describe el uso y dosificación del modulador de VEGFR para una alteración descrita en la presente. Las instrucciones incluidas con el equipo incluyen en general información en cuanto a dosificación, horario de dosificación y ruta de administración para el tratamiento de la enfermedad. Los recipientes del modulador de VEGFR pueden ser dosis unitarias, empaques a granel (por ejemplo, empaques de multi-dosis) o dosis sub-unitarias .

EJEMPLOS Se comprenderá que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son por propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos para personas experimentadas en el arte y serán incluidas en el espíritu y alcance de esta solicitud y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Ejemplo 1 : Identificación de un nuevo bucle regulatorio autocrino mediante VEGF-A en células mesangiales de riñon moderada por Flti/VEGFR-1 Se generaron ratones transgénicos mediante los cuales el gen de VEGF fue sometido a ablación en células que expresan el receptor-1 de VEGF 1 ( Flt 1/VEGFR-l ) . Se encontró que la ablación del gen de VEGF-A en células mesangiales de riñon dieron como resultado una falla renal progresiva caracterizada por proteinuria, esclerosis glomerular, hipertensión y muerte en ratones de 1-3 meses de edad. Los glomerulos afectados exhibieron expresión de VEGF-A reducida en podocitos y números incrementados de células inflamatorias, deposiciones de complejo inmune y activación de complemento. La interferencia con el bucle autocrino en células mesangiales induce cambios renales distintos reminiscentes de un sub-conjunto de patologías de riñon humanas asociadas con niveles de VEGF renales reducidos. In vitro, las células mesangiales VEGF-A- y Flt-1-deficientes mostraron supervivencia de célula disminuida y un desplazamiento en expresión genética hacia la síntesis de ECM y degradación de matriz reducida. Estos hallazgos identifican un nuevo bucle de señalización autocrino entre la producción de ECM que regula VEGF-A y VEGFR-1 y la expresión de VEGF en podocitos. La estimulación de VEGFR1 en células de riñon, por ejemplo, células mesangiales, puede ser una estrategia terapéutica para el tratamiento de glomerulosclerosis progresiva asociada con niveles de VEGF-A disminuidos . Flt-1: cinasa de tirosina semejante a fms; GBM: membrana basal glomerular; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular; VEGFR: receptor de VEGF; VEGFR-1: receptor de VEGF receptor; Flt-1: cinasa de tirosina semejante a fms ; VEGFR-2: receptor de VEGF, KDR (o Flkl); WT : tipo silvestre; WT-1: proteína-1 nuclear de tumor de Wilm; ECM: matriz extracelular Materiales y métodos Generación de ratones VEGF-loxP y Fltl-Cre y cruza a la cepa reportaro de ROSA26: ratones VEGF-loxP fueron generados como se describe previamente (véase, por ejemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126 : 11 9-1159 ( 1999a )) . Brevemente, en ratones VEGF-loxP, el exón 3 de VEGF es flanqueado por sitios loxP, dando como resultado un alelo de VEGF nulo en células que sufren recombinación de loxP. Los ratones VEGF-loxP fueron cruzados con ratones Fltl-Cre en los cuales un fragmento de 3.1 kb del promotor de Fltl (véase, por ejemplo, Gerber, H. P., et al. Differential transcript ional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-1/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667 (1997) ) impulsa la expresión de cre-recombinasa . Ratones Fltl-Cre fueron generados al microinyectar un constructo que contiene un fragmento de 3.1 kb del promotor Fltl, impulsando la expresión de Cre-recombinasa, a los núcleos de huevo de ratón como se describe previamente. Véase, Hogan, B., et al. (eds.) . Manipulating the mouse embryo, (Cold Spring Harbor Laborator Press, 1994) . Para monitorear la expresión de Cre-recombinasa, ratones Flt-CRE+; VEGF-loxP/loxP) o Flt-Cre+ fueron cruzados a la cepa reportaro ROSA26 (véase, por ejemplo, Mao, X., et al. Improved repórter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Nati Acad Sci U S A 96, 5037-5042(1999) ), mediante lo cual la expresión ubicua de ß-galactosidasa es inhibida por señales de terminación de transcripción/traducción. Este "fragmento de retención" es flanqueado por sitios loxP y sufre extirpación Cre-moderada dando como resultado la expresión del gen ß-galactosidasa en células que expresan Cre-recombinasa . Generación de ratones Fltl-loxP: Un clon de ADN de Flt-1 genómico de 16 kb que abarca el exón 1 del sitio de gen Fltl murino fue aislado enseguida de la selección de una biblioteca de cromosoma artificial bacteriana utilizando los siguientes cebadores: un fragmento de ADN genómico HindIII de 1.4 kb que abarca 3.0 a 1.6 kb corriente arriba del codón de inicio de traducción de Fltl fue extirpado y clonado con extremos embotados al sitio Notl del vector de apuntamiento TNLOX1-3. Subsecuentemente, un fragmento de ADN genómico de HindIII/BstXI de 2.0 kb fue clonado mediante ligación de extremo embotado al sitio AscI unión de TNLOXl-3, corriente abajo del caset PGK-neoR e inmediatamente 5' de LoxP3. Este f agmento de 2.0 kb incluía una región del promotor de gen Fltl, sitio de inicio de transcripción y exón 1 del gen Fltl. Finalmente, un fragmento de ADN genómico de 2.0 kb BstXI/Bsml fue embotado de los extremos y clonado al sitio Pmel inmediatamente 3' del tercer sitio loxP, para generar el vector de apuntamiento denotado cmo TKNeoFltl-1. TKNeoFltl-1 fue secuenciado y sometido a digestión de endunucleasa de restricción para verificar la secuencia y orientación de los sitios loxP e insertos de ADN genómicos. El vector de apuntamiento fue linalizado mediante digestión de Salí y 20 g sometidos a electroporacion a células TCL1 y Rl ES que son derivadas de la cepa 129Sv. Las células ES y fibroblastos embriónicos de ratón fueron mantenidos en cultivo en presencia de facto inhibidor de leucemia murino (LIF) como se describe previamente (véase, por ejemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a) ) . Las células ES fueron sometidas a selección positiva con G418 (400 pg/ml) 24 horas después de la electroporacion y después de nueve días de esta selección, colonias individuales fueron recolectadas, cultivadas y seleccionadas en cuanto a eventos de recombinación positivos mediante análisis de Southern blot. El ADN genómico de clones resitentes fue sometido a digestión ya sea con EcoRI (para análisis del extremo 5' del evento de apuntamiento) o tanto con HindIII como Kpnl (para el análisis en el extremo 3' de la región genómica apuntada) . Las sondas usadas para seleccionar los extremos 5' y 3' de la región apuntada fueron generadas mediante PCR utilizando los siguientes pares de cebador: sonda 5' (639 nts) : Flt-LOX .1123F (GAT GGC CTT GAG TAT ATC CTG (SEQ ID NO: 1) ) y Flt-LOX .1762R (CAG CTC TGG ACT CCA GCT TGC (SEQ ID NO: 2) ); sonda 3' (834 nts) : Flt-LOX .9733F (GGA AAC TAT GTG GCT GAT CTC (SEQ ID NO: 3)) y Flt-LOX .10567R (GTG AGA GCC AAG ATC GAG GAG (SEQ ID NO: 4)) . Dos clones de célula de ES independientes, designados #15 y #F7 fueron identificados como recombinantes homólogos y transíectados transitoriamente con un vector de expresión que codifica Cre-recombinasa (pMC-Cre) como se describe previamente (véase, por ejemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a) ) . Los clones ES transíectados fueron captados para obtener colonias individuales y seleccionados mediante Southern blot y PCR para cancelación del caset PGK-neoR y recombinación entre LoxPl y LoxP2. Además del análisis de Southern blot, las colonias seleccionadas fueron también analizadas mediante PCR usando los cebadores Flt-LOX.236F (TAG ACT CTG CGC GCC ATA ACT (SEQ ID NO: 5)) y Flt-LOX .2629R (CAC TAA GAA GGC AGA GGC CAA (SEQ ID NO: 6)) . Flt-LOX-236F se recoce a ADN inmediatamente 5' y traslapante con los primeros 6 nucleotidos de LoxP3 y usado en combinación con Flt-LOX .2629R (que es homólogo al ADN corriente abajo del brazo 3' de homología) solamente generará un producto de PCR del ADN que contiene LoxP3. Estos cebadores fueron usados para confirmar adicionalmente que el tercer sitio LoxP no había sufrido recombinación. Un clon de célula ES derivado de #15 y #F7, en el cual el cassette PGK-neoR fue removido (denotado #15.C1.H1 y #F7.A.E11 respectivamente), fue inyectado a la cavidad de blastocele de blastoquistes C57B1/6J de 3.5 días (véase, por ejemplo, Hogan et al., et al. (eds.) . Manipulating the mouse embryo, (Cold Spring Harbor Laborator Press) (1994)) . Los machos quiméricos fueron apareados con ratones hembra C57B1/6J y la progenie seleccionada en cuanto a transmisión de linea germinal mediante análisis de PCR para detectar LoxPl/2 y LoxP3. Los cebadores de PCR usados para seleccionar en cuanto a la presencia de LoxPl/2 fueron Flt-LOX .1335F (CCT GCA TGA TTC CTG ATT GGA ( SEQ ID NO : 7 ) ) y Flt-LOX .3207R (GCC TAA GCT CAC CTG CGG (SEQ ID NO: 8)) . Los cebadores de PCR usados para seleccionar en cuanto a la presencia de LoxP3 fueron Flt-LOX.236F y Flt-LOX.2629R. Luego, los ratones Fltl-LoxP (+/-) fueron cruzados para generar Fltl-LoxP (-/'-) que no porta un alelo Fltl floxed, Fltl-LoxP { + /'-) que porta un solo alelo Fltl que es floxed y ratones Fltl-LoxP (+ /+) en los cuales ambos alelos de Fltl contienen sitios loxP. Los ratones Fltl-loxP fueron comúnmente sometidos a genotipo medíate PCR usando los oligonucleotidos Flt-LOX .1335F y Flt-LOX.3207R. Hibridización in situ: La hibridización in situ de VEGF y TGF-ß se llevó a cabo usando sondas antisentido y de sentido generadas mediante amplificación de PCR usando cebadores específicos para TGF-ß murino (Hacia adelante: 5'-CACCGCGACTCCTGCTGCTTT (SEQ ID NO: 9); Inverso: 5'-GGGGGTTCGGGCACTGCTT (SEQ ID NO: 10); tamaño de sonda: 609 nt) y VEGF de rata (Hacia adelante: 5 ' -CAACGTCACTATGCAGATCATGCG (SEQ ID NO: 11); Inverso: 5 ' -TCACCGCCTTGGCTTGTCA (SEQ ID NO: 12); tamaño de sonda: 348 nt) . El tejido del riñon fue extirpado de ratones de 7.5 semanas de edad, se fijó en formalina al 4% y fue embebido de parafina. Secciones de 5 µp? de espesor fueron desparafinizadas , desproteinadas en 4 µ?/p?? de proteinasa K durante 30 minutos a 37°C y procesadas adicionalmente para hibridización in situ como se describe previamente (véase, por ejemplo, Gerber, H. P. , et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5 : 623-628 ( 1999b) ) . Sondas de sentido y anti-sentido 33P-UTP marcadas fueron hibridizadas a las secciones a 55°C durante toda la noche. La sonda sin hibridizar fue removida mediante incubación en 20 µg/m de RNasa A durante 30 minutos a 37 °C, seguida por un lavado de alta severidad a 55°C en solución salina 0.1 X estándar de citrato (SSC) durante 2 horas y deshidratación por medio de etanoles gradados. Los portaobjetos fueron sumergidos en emulsión de rastreo nuclear NBT2 (Eastman Kodak) , expuestos en cajas de portaobjetos de plástico selladas que contienen disecante por 4-6 semanas a 4°C, revelados y contrateñidos con hematoxilina y eosina (H & E) . Microscopía electrónica: Piezas de tejido de riñon cortical de ratones VEGF-loxP, Fltl-Cre se fijaron durante toda la noche a 4°C en formaldehído al 2%, glutaraldehído al 2.5% en solución reguladora del pH de cacodilato 0.1 M. Después del lavado, las muestras se post-fijaron en osmio al 1% acuoso durante 2 horas, lavadas en agua, deshidratadas a través de etanoles gradados y óxido de propileno y embebidos en EPONATE 12 (Ted Pella, Inc. Redding, Ca) . Secciones ultra-delgadas fueron cortadas en un microtomo Reichert Ultracut UCT, contrateñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo y examinadas en un microscopio electrónico de transmisión Philips CM12 a 80 KV. Se capturaron imágenes con una cámara digital GATAN Retractable Multiscan. Teñido de LacZ : A embriones o tejidos de 9.5 días embriónicos enteros de teñido de LacZ de ratones de un mes de edad los tejidos fueron disectados en solución salina de pH regulado (PBS) y fijados con paraformaldehido (PFA) al 4% en PBS durante una hora a 4°C. Después de lavados de 30 minutos en solución reguladora del pH de enjuague (etilenglicol-bis (aminoetiléter) -ácido tetraacético (EGTA) (5 mM, desoxicolato al 0.01%, NP-40 al 0.02%, gCl2 2 mM en PBS), los embriones fueron incubados durante toda la noche a 37 °C en solución de teñido (solución reguladora del pH de enjuague que contiene la fórmula K3Fe(CN)6 5 mM, K4Fe(CN)6 5 mM, 1 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-galactósido (X-gal)) . Luego los tejidos fueron post-fijados en PFA al 4% en PVS durante 30 minutos a 4°C, transferidos a etanol al 70% y fotografiados utilizando un microscopio de disección MZFLIII, cámara digital SPOT y elementos de programación fotográficos SPOT avanzados o procesados para inhibición de parafina y seccionamiento .

Análisis histológico e inmunocitoquímica : Para análisis histológico, los tejidos se fijaron en formalina de pH regulado neutro al 10% durante 12 a 16 horas, transferidos a etanol al 70% y embebidos en parafina. Se cortaron secciones de 5 mieras utilizando un microtomo (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y teñido con hematoxilina y eosina (H y E) . Las secciones embebidas de parafina fueron analizadas mediante inmunohistoquímica , utilizando anticuerpos criados a Cre-recombinasa (EMD Biosciences . ovagen, San Diego, California), CD31 (MEC 13.3, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, California) que detecta todas las células endoteliales , VEGFR-2/Flk-l (MALK-1, Genentech, Inc. Sur de San Francisco, California) que marca principalmente endotelio vascular no arterial y actina de músculo liso alfa ( DakoCytomation California, Inc., Carpintería, CA) que detecta el desarrollo y células mesangiales activadas y células de músculo liso. Para detectar componentes de matriz extracelulares , se usaron anticuerpos criados contra colágeno IV (Chemicon Internation, Temecula, California) y laminina (Chemicon) . El teñido fue efectuado esencialmente como se describe previamente (véase por ejemplo, Gerber, H. P., et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126:1149-1159 (1999a)) . Para estudios de inmunofluorescencia, los ríñones extirpados fueron disectados longitudinalmente, embebidos en compuesto O.C.T. (Tissue Tek, Sakura Finetek E.U.A., Inc., Torrance, CA) y seccionados a 5 y 10 mieras. Para identificar tipos de células glomerulares que expresan VEGF de ratón, las secciones congeladas fueron incubadas con un VEGF de ratón que reconoce anticuerpo monoclonal humanizado (a-VEGF, Genentech Inc.) a una concentración de 20 µg/ml, en combinación ya sea con integrina de conejo purificada por afinidad ot8 (a 1/200 para detectar células mesangiales, una donación amable de Ulrich Muller, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA) , CD31 de a-ratón de rata (BD Pharmingen) (para detectar células endoteliales ) o proteina nuclear de tumor de Wilm de a-ratón de conejo (WT-1; Santa Cruz Biotechnology Inc., 2 pg/ml) (para detectar podocitos) . Las secciones fueron lavadas subsecuentemente e incubadas con IgG anti-humana de cabra AlexaFluor-594 conjugada y ya sea anticuerpos secundarios de IgG de anti-rata de cabra o anti-conejo de carba AlexaFluor-488 conjugados a 4 µg/ml (Invitrogen) . Para identificar tipos de células glomerulares que expresan el transgen Fltl-Cre, secciones congeladas fueron incubadas con anti- -galactosidasa (Rockland Immunochemicals Inc.; 200 g/ml), seguido por IgG de anrti-conejo de cabra AlexaFluor-594 conjugada. El anticuerpo WT-1 y anti-integrina a8 fueron marcados con AlexaFluor-488 utilizando la técnica de marcación de Zelón para IgG de conejo (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo CD31 o el a-WT-l AlexaFluor- 88-marcado o anti- integrina a8 fueron luego aplicados a las secciones lavadas. En este estudio, el teñido ant i-beta-Gal refleja la expresión del transgen Fltl-Cre durante cualquiera o todas las etapas de desarrollo ya que la extirpación moderada por Cre-recombinasa remueve irreversiblemente la supresión del promotor de gen ROSA26 de otra manera expresado ubicuamente que impulsa la expresión anti-beta-Gal en estos ratones (Mao et.al., Improved repórter strain for monitoring Cre recombinase-mediated DNA excisions in mice. Proc Nati Acad Sci U S A 96:5037-42 (1999)) . Para detectar depósitos de inmunoglobulina , una serie de anticuerpos monoclinales de rata isotiocianato de fluoresceina ( FITC) -conjugados específicos para cada clase e isotipo de inmunoglobulina de ratón (Ig) fueron incubados sobre secciones congeladas bloqueadas durante 1.5 horas a una concentración de 4 g/ml. La deposición de Ig fue confirmada utilizando anticuerpos policlonales FITC-conj ugados purificados por afinidad criados a Ig de ratón de clase e isotipo específico (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) . Los componentes Clq, C3 y C4 del sistema de complemento de ratón fueron detectados utilizando anticuerpos monoclonales de rata ( (HyCult Biotechnology b.v., Uden, The Países Bajos) a 5 g/ml y IgG de anti-rata de cabra AlexaFluor-594-conjugado como el reactivo secundario. Las células del linaje de monocitos-macrófagos y de células T fueron identificados utilizando anticuerpos criados a C D4 (BD Biosciences, Pharmingen, San José, California) y F4 / 80 (Serotec Inc., Raleigh, NC) respectivamente y protocolos de teñido estándar. Para todos los estudios inmunocitoquimicos , los controles negativos fueron incluidos al sustituir anticuerpos primarios con Ig purificada, que se hacen corresponder a la concentración, especie e isotipo del anticuerpo primario omitido. Para detectar hipoxia en ríñones de ratón, ratones Fltl-Cre- y Fltl-Cre+; VEGF (loxP/loxP) de cuatro semanas de edad fueron inyectados intraperitonealmente con clorhidrato de pimonidazol (Hypoxyprooe™-1, Chemicon International, Temecula, California, 60 mg/kg) . Una hora enseguida de la inyección, los ratones fueron sometidos a eutanasia mediante dislocación cervical, los ríñones fueron extirpados y se fijaron durante toda la noche en formalina al 10%, luego fueron deshidratados y embebidos en parafina. Luego, secciones embebidas con parafina de 5 µ?t? fueron procesadas y teñidas con Hypoxyprobe™ -lMabl como se describe por el fabricante del equipo Hypoxyprobe™-l Kit manufacturer (Chemicon International), excluyendo la incubación con peroxidasa de estreptavidina que fue sustituida con estreptavidina-AlexaFluor594 (Invitrogen) para permitir la detección fluorescente. IgGl de ratón, que se hace corresponder en concentración a aquella usada para Hypoxyprobe™-Mabl fue usada como control de isotipo para el teñido no específico del anticuerpo primario. Como control negativo adicional, secciones de riñon aisladas de ratones que no fueron inyectados con Hypoxyprobe™-l fueron incubadas con Hypoxyprobe™-l . Análisis de RT-PCR cuantitativo en tiempo real: El ARN fue aislado de tejidos de ratones de 5 a 7.5 semanas de edad usando el método STAT 60 (TEL-TEST "B", Friendswood, TX) y purificado en columnas de centrifugación Rneasy Quick (Qiagen, Valencia, CA) . El análisis de RT-PCR cuantitativo en tiempo real fue efectuado como se describe previamente (véase, por ejemplo, Gerber, H. P., et al. Complete inhibition of rhabdomyosarcoma xenograft growth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial growth factor. Cáncer Res 60:6253-6258 (2000) ) usando 100 ng de ARN total, reactivos de RT-PCR de Applied Biosystems y un detector de secuencia Modelo 7700 en formato de 96 cavidades (Applied Biosystems) . Las condiciones de RT-PCR fueron 30 minutos a 48°C, 10 minutos a 95°C y 40 ciclos de 30 segundos a 95°C y 90 segundos a 60°C. Los resultados fueron analizados usando los elementos de programación de detección de secuencia (Applied Biosystems) y el análisis estadístico mediante ANOVA fue efectuado usando elementos de programación StatView (SAS Institute Inc., Cary, . North Carolina) . Equivalentes de ARN relativos para cada muestra fueron obtenidos al estandarizar a niveles de gliceraldehídos-3-deshidrogenasa (GAPDH) . Química del suero y parámetros hematológicos : ratones de 7.5 semanas de edad fueron sometidos a eutanasia mediante inhalación de CO2 y la sangre fue recolectada mediante punción cardiaca a tubos recubiertos con ácido etilendiamintetraacét ico (EDTA) (Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey) . Los conteos celulares hematológicos fueron medidos usando un dispositivo Cell Dyn 3700 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) . El suero fue obtenido mediante recolección a tubos separadores de suero (Microtainer, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey) y los parámetros del suero medidos usando un instrumento de Roche Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics, Indianapolis , Indiana) . Análisis de orina: La orina fue recolectada de pasivamente d ratones de 4 a 5 semanas de edad. Muestras de orina representativas de ratones de cada genotipo fueron probadas en cuanto a la presencia de proteina, sangre, glucosa y cetonas usando bandas de prueba de orina (Chemstrip 10 con SG, Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, Indiana, USA) . La proteinuria fue confirmada adicionalmete al cargar 1 ul de orina a un gradiente de gel de tris/glicina 4-20% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) y sometido a SDS-PAGE, seguido por teñido de plata o Western blotting para albúmina de ratón usando anti-suero de cabra purificado por afinidad a 200 µg/ml (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX) . Medición de presión sanguínea arterial promedio: Los ratones fueron anestesiados con inhalación de isoflurance para el efecto (Aerrane, Baxter Caribe Inc.) . Por medio de una incisión de linea media ventral realizada en el cuello, un catéter (tubo de polietileno, Becton-Dickinson) fue colocado en la arteria carótida común derecha y asegurado en su lugar con sutura de seda. Mediciones de presión sanguina fueron recolectadas digitalmente durante 15 minutos usando elementos físicos y elementos de programación de AcqKnowledge (Biopac Systems, Inc., Santa Barbara, CA) . Análisis estadísticos: Todos los análisis estadísticos, excluyendo el análisis de datos de microarreglo de ADN complementario (véase sección separada) , fueron efectuados mediante análisis de varianza (ANOVA) usando software de StatView (SAS Institute Inc., Estados Unidos de América) a no ser que se afirme de otra manera. Aislamiento de glomérulos y cultivo de célula mesangial: Glomérulos de ratón fueron aislados de acuerdo con el método de (Takemoto et al., A new method for large scale isolation of kidney glomeruli f om mice. Am J Pathol 161:799-805 (2002)) y depositados sobre cajas recubiertas con 20 pg/ml de fibronectina (Sigma Corp, St Louis, Missouri) en un medio de célula mesangial (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), suero de becerro fetal (FCS) al 20%, glutamina 2 mM, 100 U/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina) . Los glomérulos fueron incubados en una atmósfera humidificada de 5% de C02, 95% de aire a 37 °C por 6-7 días, tiempo durante el cual los glomérulos se adhirieron a la placa y una monocapa confluente de células cubrió la caja. Usando esta técnica, se obtuvieron cultivos homogéneos de células mesangiales glomerulares que se podían hacer pasar por lo menos cinco veces. La morfología de célula mesangial apareció consistente con los reportes publicados de células mesangiales usando microscopía de luz (Mene et al., Phospholipids in signal transduction of mesangial cells . Am J Physiol 256 : F375-386 ( 1989 ) ) . Las células mesangiales glomerulares inmunoteñidas positivas para a-vimentina ( DakoCytomation) y anti-miosina (Zymed Laboratories, Inc, South San Francisco, California) y fueron negativas para CD31 (BD Biosciences Pharmingen, San José, California) y absorción de lipoproteína de baja densidad acetilada (Biomedical Technologies, Inc, Stoughton, Massachusett s ) . Además, todas las células mesangiales fueron cultivadas en medio esencial mínimo (MEM) D-valina sustituido por al menos 3 días, lo que bloquea el crecimiento de fibroblastos in Vitro (Gilbert and Migeon, (1975) . D-valine as a selective agent for normal human and rodent epithelial cells in culture. Ce11 5:11-17) . Cultivos celulares mesangiales glomerulares fueron establecidos de ratones VEGF ( loxP/loxP) y Fltl ( loxP/loxP) y ratones WT de la misma colonia que no portan sitios loxP genómicos. Para estudios de supervivencia de célula mesangial, las células mesangiales fueron depositadas a cajas de 6 cavidades a una densidad de 105 células/cavidad e incubadas durante toda la noche en medio de célula mesangial que contiene FCS al 20%. Luego el medio fue aspirado y reeemplazado con adenovirus que contiene medio libre de suero que expresa ya sea LacZ (Ad-LacZ) como testigo o Cre-recombinasa (Ad-Cre) que induce la recombinación entre sitios loxP y dé como resultado la ablación genética en células VEGF (loxP/loxP) y Flt 1 ( loxP/loxP) , respectivamente. El adenovirus fue usado en una multiplicidad de infección (MOI) de 1000 en los estudios de supervivencia. Un anticuerpo VEGF anti-murino neutralizante (ct-VEGF, G6-23-IgG) (Genentech, Inc. Sur de San Francisco, California) o un anticuerpo correspondiente de isotipo de control (IgG de control) fue agregado al medio a 10 µg/ml y con Ad-LacZ a MOI de 1000. Cuatro días en seguida de la adición de adenovirus, las células adherentes restantes fueron lavadas con PBS, tripsinizadas y contadas con un contador de partículas Coulter Z2 y analizador de tamaño (Beckman Coulter, Inc. Fullerton, California) . Las células mesangiales fueron aisladas de ratones de cada genotipo (n=5-7 ratones por genotipo) . Entre dos y cinco cavidades replicadas fueron contadas para cada virus en cada ratón del cual las células fueron derivadas. La proporción de conteo celular entre tratamientos de Ad-LacZ y Ad-Cre fue calculada y normalizada como un porcentaje del valor obtenido para el grupo de control. Microarreglos de ADN complementarios : Células mesangiales fueron preparadas de 4 ratones WT y 4 ratones VEGF ( ????/loxP) . Al paso de dos o tres, las células mesangiales fueron cultivadas en un medio libre de suero que contiene Ad-LacZ o Ad-Cre a MOI de 100 por cinco días. El ARN fue aislado utilizando el método de STAT60 y columnas de centrifigación Rneasy Quick que se describen en la sección de "RT-PCR cuantitativa en tiempo real". Los métodos para preparación de ARN complementario (cARN) e hibridización/barrido de los arreglos fueron proporcionados por Affymetrix (Affymetrix, Inc. Santa Clara, California) . Cinco de ARN total fueron compartidos a cADN de doble hebra y utilizando un equipo de síntesis de cADN (SuperScript Choice, GIBCO/BRL, Grand Island, Nueva York) y un cebador de oligómero T7-(dT)24 (Biosearch Technologies, Inc, Novato, California, Custom Synthesis) . El cADN de doble hebra fue purificado sobre una resina de afinidad (Sample Cleanup Module Kit, Affymetrix, Inc. Santa Clara, California) y mediante precipitación de etanol. Después de la síntesis de la segunda hebra, el cARN marcado fue generado de la muestra de cADN al utilizar un ARN polimerasa T7 nucleótido biotina-marcado en una reacción de transcripción in vitro (Enzo Biochem, Inc. Farmingdale, Nueva York) . El cARN marcado fue purificado sobre una resina de afinidad (equipo de módulo de limpieza de muestra, Affymetrix) . La cantidad de cARN marcado fue determinada al medir la absorbancia a 260 nm y utilizando la conversión de que 1 OD a 260 nm corresponde a 40 µq/ l de ARN. Veinte µg de cARN fueron fragmentados mediante incubación a 9 °C durante 30 minutos en Tris-acetato 40 mM (pH 8.1), acetato de potasio 100 mM y acetato de magnesio 30 mM . Luego las muestras fueron hibridizadas a arreglos 2.0 de genoma de ratón 430 a 45°C durante 19 horas en un horno de rosticeria ajustado a 60 rpm. Los arreglos fueron lavados, teñidos y explorados o barridos en una estación de Affymetrix Fluidics y escáner. El análisis de datos fue efectuado utilizando los elementos de programación de análisis de Affymetrix GeneChip. La expresión genética fue resumida mediante valores de señal Affymetrix MAS 5.0, que fueron analizadas en la escala logarítmica. Un análisis de varianza fue aplicado al considerar los efectos del virus (Ad-LacZ o Ad-Cre) , efectos de genotipo (WT o VEGF ( loxP/loxP) ) y el efecto de ablación genética de VEGF para cada conjunto de sondas. Las veces de cambio promedio en expresión genética de Ad-LacZ a Ad-Cre en las células VEGF ( loxP/loxP) contra las veces de cambio correspondientes en las células WT, la fuerza de la evidencia por diferencias de expresión genética (valor p de prueba t) y la señal absoluta mínima de la expresión genética fueron usados como una combinación de criterios para seleccionar conjuntos de sondas afectados simultáneamente por efectos de ablación genética. Estos criterios fueron ajustados a un mínimo de veces mínimo de 2 veces, un valor p < 0.05 y una señal absoluta a >50. Los cambios en expresión genética entre células mesangiales WT y VEGF-deficientes fueron comparados.

Para clasificar los genes significativamente desregulados de acuerdo con las clasificaciones de Ontologia Genética (GO) proporcionados por Affymetrix, se obtuvo la versión del 9 de agosto de 2004 de las jerarquías de Ontologia Genética (GO) . La base de datos NetAffy fue usada para asociar cada conjunto de sondas de Affymetrix con identificaciones genéticas de LocusLink. El archivo loc2go fue descargado del sitio web de NCBI LocusLink (disponible en Internet en ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/LocusLink/), que fue usado para asociar genes y conceptos de G0. La distribución de asociaciones genéticas fue calculada en jerarquías de G0 al utilizar todo el conjunto de genes con anotaciones de GO y el conjunto de genes afectados por la ablación genética de VEGF. Para cada concepto de GO, se generó una tabla de contingencia de 2 x 2 que representó la presencia o ausencia del concepto GO contra la presencia o ausencia de efectos de ablación genética. Un análisis de asociación de ji cuadrada fue efectuado para determinar el significado estadístico. La proporción de probabilidades fue calculada al dividir el número observado de genes que afectan la expulsión para el concepto de GO por el número esperado. Se obtuvo un intervalo de confianza del 95% para la proporción de probabilidades de 1000 muestras de inicio . Los datos de microarreglo fueron también analizados por medio del uso de análisis de trayectorias de ingenuidad (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) . Identificadores para sondas cuya expresión fue regulada significativamente de manera diferente (valor p < 4e-3) fueron cargados a la aplicación en donde fueron mapeados a genes. Los genes a los cuales estas sondas mapeadas fueron usadas para generar redes moleculares utilizando información contenida en la base de conocimiento de the Ingenuity Pathways (IPKB) . Para el análisis funcional, estos mismos genes fueron asociados con funciones biológicas y/o enfermedades utilizando la IPKB. La prueba exacta de Fischer fue usada para calcular un valor p que determina la probabilidad que cada función biológica y/o enfermedad asignada a un conjunto de datos es debido a probabilidad solamente.

Resultados Expresión de transgen de Fltl-Cre durante el desarrollo recapitula la expresión de Fltl endógena Un fragmento de promotor de 3.1 kb del gen Fltl fue identificado previamente y caracterizado para ser suficiente para moderar la expresión de gen reportero incrementada en células endoteliales transfectadas transitoriamente o células Hep B expuestas a condiciones hipóxicas (véase por ejemplo, Gerber, H. P., et al. Differential t ranscript ional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes.

Flt-1, but not Flk-l/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-23667(1997)) . Un constructo que consiste del mismo fragmento promotor de Flt-1 de 3.1 kb fue insertado corriente arriba del gen de Cre-recombinasa fue usado para generar ratones transgénicos . La cepa con expresión de LacZ más alta en ríñones adultos fue seleccionada para el análisis de expresión de transgen detallado. El teñido del montante entero de embriones transgénicos en el día 9.5 reveló un patrón de expresión vascular consistente con la expresión del Fltl endógeno. Véase por ejemplo, Fong, G.H., et al. Regulation of flt-1 expression during mouse embryogenesis suggests a role in the establishment of vascular endothelium. Developmental Dynamics 207:1-10 (1996) . En ratones neonatos, células positivas LacZ estuvieron presentes en una variedad de tejidos, en los que se incluyen corazón, bazo, pulmón, testículos y piel. Consistente con reportes previos se describe la expresión de Flt-1 en el endotelio de riñon y células mesangiales (véase por ejemplo, Takahashi, T., et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-226(1995)), células positivas LacZ fueron encontradas en células endoteliales peritubulares y células dentro de la región central del glomérulo de riñon, en donde las células endoteliales y mesangiales están ubicadas comúnmente en un ratón Fltl-Cre+; ROSA+ de 5 días de edad.

Ratones Flt-CRE+; VEGF (loxP loxp) desarrollan glomerulonefritis y sucumben a insuficiencia renal de etapa final a 4 -12 semanas de edad Ratones Flt-CRE+; vEGF,loxP loxP) fueron criados a proporciones mendelianas esperadas (Figura 1, Panel a), sin embargo, la supervivencia disminuida de 4 semanas de edad en adelante, con más de 95% de ratones Flt-CRE+; VEGF(loxP loxP> murieron a las 12 semanas (Figura 1, Panel b) . La inspección más cercana reveló que los ratones Flt-CRE+; VEGp<ioxP ioxP) carecían de bazo y la masa de riñon fue significativamente reducida. Véase Figura 1, Panel c. También hubo vascularización de riñon reducida y aparición de lesiones de riñon quística, indicadoras de enfermedad de riñon bilateral. Véase Figura 1, Panel d. Otros órganos con vasculatura LacZ positiva tales como pulmón, hígado, corazón, cerebro y músculo esqueletal, no exhibieron ningún cambio significativo en morfología, pesos o vascularización. El análisis de orina reveló proteinuria que excede de 500 mg/dL en ratones Flt-CRE+; VEGF(loxP/loxP de 4 a 5 semanas. La tinción con plata y análisis Western blot revelaron cantidades masivas de albúmina, indicadoras de funciones de barrera defectuosas en la filtración glomerular, en la orina de ratones Flt-CRE+; vEGF(loxP/loxP), pero no en ratones Flt-CRE+; VEGF(loxP/-> o Fltl-Cre-. Véase, Figura 1, Panel e. Los análisis de química sanguínea revelaron un incremento de 4 veces los niveles de nitrógeno en urea en sangre (B.U.N.) y creatinina en suero en ratones Flt-CRE+; VEGF(ioxP/ioxP) en comparación con ratones control (véase Figura 1, Paneles f y g) , en donde los niveles en suero de sodio, potasio, cloro y calcio no fueron afectados. Consistente con la patología asociada con falla renal, la presión sanguínea fue significativamente elevada en ratones transgénicos Flt-CRE+; vEGF(loxP loxP) en relación con las carnadas control Flt-CRE". Véase Figura 1, Panel h. En combinación, esto puede indicar que los ratones Flt-CRE+; vegfUOXP/IOXP) desarrollan progresivamente mala función del riñon asociada con proteinuria e hipertensión, que culmina en una etapa final de falla renal.

Expresión transgénica de Ftll-Cre y ablación génica VEGF en células mesangiales de riñon Utilizando procedimientos inmunohidtológicos , se localizí la expresión de VEGF-A y podocitos que expresan proteínas nucleares de tumor de a-Wilms (véase por ejemplo, Haas, C, et al. MHC antigens in interferon gamma (IFN gamma) receptor deficient mice: IFN gamma-dependent up-regulat ion of MHC class II in renal tubules. Kidney-Int 48:1721-7 issn: 0085-2538(1995) ) en glomérulos de ratones Fltl-Cre+ de 4 semanas de edad; en ratones VEGF (loxP/loxP) el incremento en la mayor parte de la expresión VEGF-A fue confinado a los podocitos. VEGF-A fue detectado en podocitos glomerulares y células mesangiales cuando las secciones congeladas de ríñones de ratones FUl-Cre ; VEGF(lmP lmP>;ROSA26+ de 4 semanas de edad fueron teñidos con anticuerpos para detectar las células mesangiales (anti-Integrina 8), células endoteliales (anti-CD31) y podocitos (anti- T-1) junto con la co-tinción de las secciones con a-VEGF para identificar los tipos celulares glomerulares que expresan CEGF-A. Las imágenes unidas indican que la expresión de VEGF-A es detectable en podocitos WT-1 positivos y de forma significativa, la menor expresión de VEGF-A es detectable en células mesangiales glomerulares. La hibridización in situ de VEGF-A confirmó altos niveles de expresión de VEGF-A en podocitos como se muestra por la abundancia de granos de plata en la periferia del glomérulo de ratones Fltl-Cre de 7 semanas de edad. Véase Figura 2, Panel a. La co-tinción de células mesangiales de integrina a8 positiva (véase por ejemplo, Hartner, A., et al., Alpha8 integrin in glomerular mesangial cells and in experimental glomerulonephritis . Kidney Int 56:1468-80(1999) ) con VEGF-A reveló una expresión débil pero significativa en células mesangiales en ratones de 4 semanas de edad. Véase Figura 2, panel a. Sin embargo, no fue posible detectar dobles positivos de VEGF-A/CD31 en células endoteliales en cualquiera de las secciones analizadas de riñon, consistente con la ausencia de VEGF-A en células endoteliales glomerulares descritas previamente. Véase por ejemplo, Simón, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogénesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268:F240-50 issn: 0002-9513(1995) y Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephritis . J Am Soc Nephrol 9: 1815-25 (1998) . Para determinar los tipos celulares glomerulares que expresan Cre-recombinasa durante el desarrollo embriónico y postnatal, la histoquimica de inmunofluorescencia fue usada utiliando un anticuerpo que detecta ß-galactosidasa (anti-beta-Gal) . El análisis de secciones de riñon de ratones Fltl-Cre+ de 4 semanas de edad; ratones VEGF ( loxP/loxP) revelaron cantidades incrementadas y tinción de ß-Gal/doble positivo de células mesangiales integrina oc8 en carnadas Fltl-Cre+ ; VEGF (loxP/loxP) en comparación con las carnadas Fltl-Cre+; VEGF (loxP/+) . Sin embargo, no se detectaron células doble positivo para ß-Gal y el marcador WT-1 de podocito o el marcador de célula endotelial CD31. La inmunohistiquímica reveló que el transgen Fltl-Cre fue detectado en células mesangiales, pero no en células endoteliales glomerulares, en donde las células endoteliales tubulares, conocidas por expresar Flt-1, fueron positivas. Véase Figura 2, panel b. PCR genómico reveló niveles significativos de ablación VEGFen ríñones durante el desarrollo embrionario (E17.5 y E18.5) y en células mesangiales explantes de ríñones en ratones Fltl-Cre+; VEGF ( loxP/wt ) de una semana de edad seguido de la expansión durante 7 a 10 días. Estos hallazgos fueron consistentes con el reporte anterior (véase por ejemplo, Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26(1995)) que sugiere que las células mesangiales dentro del glomérulo del riñon puede expresar tanto VEGF-A como Fltl y además apoyar la noción de que la ablación génica de VEGF en glomérulos de ratones Fltl-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) ocurre en por lo menos las células mesangiales. La ablación del gen CEGF-A puede ocurrir en otras célulñas glomerulares o en células externas al compartimiento del glomérulo que no son detectadas en estos análisis y pueden contribuir indirectamente a los cambios glomerulares observados. La expresión cuantitativa del análisis del gen de ARN confirma que el daño tisular y procesos de reparación subsecuente en ríñones de ratones Fltl-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) causa la sobrerregulación marcada de Cre-recombinasa (véase Figura 2, panel c) . concomitantemente , una baja regulación de Flkl (VEGR-2) y VEGF-A fue detectada (Figura 2, panel c) , que consiste de ablación del gen CEGF-A y una reducción en la vascularidad renal (Figura 3, paneles g y h) , mientras que los niveles de Flt-1 permanecieron sin cambio. La hibridización in situ experimentada con ríñones de Fltl-Cre+; VEGF (loxP/loxP) revelados marcadamente reducidos en la expresión de CEGF-A en todos los tipos celulares glomerulares por ratones de 7 semanas de edad. El análisis inmunohistoquímico en ríñones de ratones de una semana de edad para la expresión de CEGF y B-Gal identificó tres clases principales de glomérulos: 1) glomérulos que expresan niveles normales de VEGF en ausencia de tinción de ß-Gal 2) glomérulos que muestran VEGF reducida y picos de expresión de ß-Gal y 3) niveles no detectables de VEGF en presencia de elevada tinción de ß-Gal. La ablación del gen VEGF en células mesangiales de riñon puede ocurrir a través del desarrollo postnatal y puede estar asociado con la reducción de la expresión VEGF en podicitos y/o muerte celular de podocitos. En estos experimentos, la búsqueda identificó la expresión de VEGF por podocitos como un indicador corriente abajo del bucle regulador autócrino por VEGF en células mesangiales de riñon. Se encontró que la hipoxia regula ascendentemente la expresión tanto de VEGF-A como de VEGFR-1 (véase por ejemplo, Gerber, K.P., et al. Differential transcript ional regulation of the two vascular endothelial growth factor receptor genes. Flt-1, but not Flk-l/KDR, is up-regulated by hypoxia. J Biol Chem 272:23659-67(1997)) y se reportó hypoxia renal incrementada de glomerulonefritis . Véase por ejemplo, Nangaku, M . Mechanisms of tubulointerst itial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Interin Med 43:9-17(2004) . Cuando se analizan glomérulos de riñon de Eltl-Cre+; VEG ( ????/loxP) de 4 semanas para regiones hipóxicas al utilizar (Hypoxyprobe™-Mabl ) la hipoxia incrementada fue encontrada consistentemente en ratones expulsados condicionales a compañeros de cama tipo silvestre, indicando que la hipoxia puede acelerar la ablación genética de VEGF vía regulación ascendente de Flt-CRE. variaciones regionales en hipoxia combinadas con variaciones en la severidad de avance de enfermedad dentro de glomérulos individuales pueden explicar la expresión frecuentemente total del transgen Fltl-Cre y la carencia de expresión del transgen en células endoteliales glomerulares, que están en contacto directo con la circulación normóxica .

Cambios patofisiolóficos en flomérulos de ratones transgénicos Flt-CRE+; VEGF-loxP/loxP) Los cambios histopatológicos que ocurren en ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) fueron analizados para entender los eventos celulares que conducen a falla del riñon. Estructuras glomerulares anormales fueron evidentes en ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) examinados mediante microscopía de luz en las semanas 2, 3 y 7. En ratones de dos semanas de edad, estuvieron presentes quistes en toda la corteza renal (Figura 3, panel a) y dos tipos de estructuras glomerulares podrían ser discernidas que fueron distintas en apariencia a los glomérulos de sus compañeros de cama T de edad coincidente (Figura 3, panel b) .

En ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) de dos semanas de edad, glomérulos subdesarrollados consistentes de podocitos que rodean un núcleo acelular fueron observados frecuentemente (Figura 3, paneles a y c) . Los flomérulos con esta apariencia pueden fallar para funcionar, debido a una ausencia de bucles capilares que fallan en desarrollarse más allá de esta etapa, ya que no hay ninguna evidencia de una estructura similar en los ríñones de ratones de 7 semanas de edad (Figura 3, paneles e y f ) . Numerosos glomérulos en el riñon de ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) de 2-3 semanas de edad fueron ampliados marcadamente y existieron deposiciones eosinofi licas , proteináceas abundantes en todos los glomérulos y ausencia o colapso de bucles capilares existentes (Figura 3, panel d) . Estos glomérulos tienen una apariencia similar a los glomérulos típicos de ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) de 7 semanas de edad, que muestran glomerulosclerosis, fibrosis y nefritis intersticial total (Figura 3, panel f) . dentro de cada riñon, los glomérulos individuales son afectados a diferentes grados, con cambios moderados a severos. Además, quistes grandes revestidos con epitelio transcisional (Figura 3, panel a) y grupos dispersados de túmulos corticales enlazados llenos con material protináceo fueron observados (compárese Figura 3, paneles e y f ) . La celularidad disminuida fue evidente en todos los glomérulos de ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) cuando se compara con aquella observada en el riñon de WT, que puede ser atribuido en parte a números reducidos de células endoteliales (compárese Figura 3, paneles g y h) . El teñido de CD31 disminuido en los ríñones de Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) fue acompañado por deposiciones de laminina extensa y colágeno focal IV extensas en muchos glomérulos escleróticos, tal como se determina mediante RT-PCR (Figura 6, a-d) y teñido inmunohistoquímico . Por ejemplo, en la sección de riñon de ratones de 7 semanas de edad, se detectó deposición de laminina en los túmulos y estuvo en todos los glomérulos de los ríñones enfermos y el teñido de colágeno IV incrementado fue detectado en tejido enfermo en comparación con el compañero de cama tipo silvestre. Además, el factor-ß de crecimiento transformante (tgf-ß, Figura 3, paneles i y j), un mediador de fibrosis glomerular y daños al tejido frecuentemente regulado ascendentemente en enfermedad de riñon (revisado por Schnaper, H.W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 284 : F243-52 (2003) ) , también como actina de músculo liso alfa (Figura 3, paneles a y 1), un marcador para células mesangiales activadas, fueron ambos elevadamente marcados en ríñones dañados. El análisis estructural de secciones de riñon mediante microscopía electrónica de transmisión identificó defectos en el mesangio y otros elementos consistentes con la glomerulosclerosis total entre los que se incluyen fusión del proceso de para de podocito y expansión de matriz mesangial en ríñones Fltl-CRE+; VEGF(loxP/loxP) (Figura 3, panel m) . Aunque el endotelio aparece saludable en algunos glomérulos, la pérdida de fenestraciones y expansión masiva de la membrana basal glomerular es observada en glomérulos con lesiones más avanzadas. Además, la pérdida de células mesangiales y depósitos densos de electrones estuvo presente (Figura 3, panel m) , en donde los glomérulos subdesarrollados.

Ablación genética de VEGF en células mesangiales glomerulares está asociada con depósitos de inmunoglobulina M (IgM) y activación de complemento La evidencia en una respuesta inmune elevada en los ríñones de ratones Flt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) fue sugerida por elevaciones en linfocitos circulantes. El análisis de RT-PCR cuantitativo en tiempo real de ARN de riñon para marcadores de los linajes de célula B y célula T de monocitos/macrófago (CDllb, F4/80, CD45R y Thy-1, respectivamente) detectaron infiltrados inmunes en ríñones de ratones de Flt-CRE+; VEGF(loxP/loxP) , pero no en compañeros de cama de control (Figura 4, Panel a) . El análisis inmunohistoquímico reveló números incrementados de céluas que expresan F4/80 y CD40, un marcador de un subconjunto de células T en los ríñones de ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) . Véase Figura 4, panel b. Las infiltraciones de célula inmune parecieron ser específicas para tejidos de riñon, ya que estos marcadores de linaje celular no fueron elevados en los pulmones o corazones de ratones transgénicos Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) . Entre las subclases Ig de anticuerpos analizados, IgM, pero no IgG, IgA, IgD o IgE se encontrón depositado en los glomérulos enfermos, por ejemplo, mediante teñido inmunofluorescente de tejido cortical de riñon de ratones Flt-Cre+; VEGF(1 XP/IOKP> de cinco semanas de edad utilizando anticuerpos monoclonales específicos para IgM y cada isotipo murino de IgG. Además, un incremento marcado en proteínas Clq, C3 y C4 de la ruta de complemento fue detectado (por ejemplo, mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales específicos para los componentes de Clq, C3 y C4 de la ruta) , particularmente en los glomérulos de riñon Flt-Cre+; VEGF (loxP/loxP) en comparación con riñon WT . Clq, C3 y C4 incrementados fueron detectados en ratones de una semana de edad, sugiriendo que la lisis de célula moderada por complemento puede contribuir significativamente a los daños en el riñon en ratones Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) . La evidencia de los daños moderados en complemento en los ríñones de ratones con cancelación podocito-select iva haplo-insuficiente de VEGF no fue detectada.

Ablación genética de VEGF in Vitro afecta adversamente la supervivencia de célula mesangial : evidencia de VEGF que actúa vía un bucle autócrino interno en células mesangiales Para investigar los efectos de la ablación genética de VEGF y Fltl sobre célula mesangial cultivada in Vitro, se generaron ratones con alelos condicionales para el alelo Fltl (Fltl-lox/loxP) . Véase Figura 5, panel a. Un vector de apuntamiento en el cual el exón 1 del gen Fltl de ratón está flanqueado por sitios loxP fue generado y utilizado para la recombinación homologa en células de tallo embriónico de ratón. Ratones Fltl (loxP/loxP) fueron criados en la experiencia mendeliana esperada, indicando que la presencia de dos sitios loxP no interfiere con el desarrollo del ratón. Preparaciones homogéneas de células mesangiales WT de ratones VEGF ( loxP/loxP) fueron obtenidas a partir de aislados glomerulares e insertados ya sea con adenovirus de control que expresa LacZ (Ad-LacZ) o adenovirus que expresa Cre-recombinasa (Ad-Cre) . Las frecuencias de ablación genética de Fltl y VEGF-A in Vitro fueron monitoreadas mediante análisis de Southern blot (Figura 5, panel b) y RT-PCR en tiempo real (Figura 5, paneles c y d) y se encontró que es > 95% Flt-1 o ablación genética de VEGF-A en células mesangiales provocó una reducción significativa en la presencia de células (Figura 5, panel e) , indicando que VEGF regula la presencia de célula mesangial de manera autónoma a la célula, moderada por Fltl. Además de un anticuerpo VEGF neutralizante (a-VEGF, G6-23) no impactó sobre la sobrevivencia de célula mesangial (Figura 5, panel f) . Ya que G6-23 está excluido del compartimiento intracelular , la falla para recapitular la disminución en sobrevivencia de célula mesangial observada en células mesangiales VEGF-A o Fltl deficientes indica que VEGF-A pueed actuar vía un bucle autócrino interno. La reducción en superviviencia de células mesangiales Flt 1-deficientes es mayor que aquella provocada por la deficiencia de VEGF-a solas, sugiriendo que otros ligandos para Fltl, tal como PIGF o VEGF-B, pueden también contribuir.

Ablación genética de VEGF en células mesangiales induce cambios en la expresión genética consistente con la producción de FCM incrementada Se llevó a cavo un análisis de ontologia genética (GO) de genes que son expresados diferencialmente en células mesangiales VEGF-A-deficientes . Se seleccionaron por cambios mayor de dos veces (valor absoluto) y valores p de < 0.05 (prueba t de Stident), se encontraron 480 de 11810 genes analizados que son regulados ascendentemente de manera significativa en células mesangiales VEGF-A-deficientes cuando se comparan con células mesangiales WT . La comparación de las anotaciones de GO entre la clase de genes regulados ascendentemente y un conjunto de control de todos los genes reveló diferencias significativas en genes involucrados en regular la quimiotaxis, integridad estructural o producción de ECM, migración celular y el mecanismo de defensa humoral fueron sobre-representados significativamente (Tabla 2) . Se llevó a cabo un análisis idéntico para genes regulados descendentemente en células mesangiales VEGF-A deficientes y se identificaron seis categorías que fueron sobre-representadas significativamente. Tres de las seis categorías pertenecían a la superclase de genes proteolíticos y una incluía genes involucrados en la comunicación celular (Tabla 2) . El análisis de ruta de señal efectuado utilizando el sistema Ingenuity Pathways reveló además que la expresión de genes pertenecientes a las subclases definidas como cultivo celular y proliferación, ensamble celular, organización y ruta de compromiso fueron alteradas significativamente en células mesangiales VEGF-deficientes (Tavla 2) . También se identificó que la expresión de 46% a 57% de los genes pertenecientes a las categorías de redes moleculares involucradas en síntesis de proteínas, muerte celular, señalización de célula-célula y respuesta inmune fueron afectadas significativamente por la deficiencia de VEGF (Tabla 2) . Los genes candidatos asociados con la acumulación de matriz mesangial o enfermedad glomerular fueron también desregulados significativamente en células mesangiales VEGF-A-deficientes. Entre ellas, tgf-ß? (véase además, Schnaper, H. W., et al. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis . Am J Physiol Renal Physiol 284 : F243-252 (2003) ) , angiopoyet ina-1 (véase por ejemplo, Satchell, S. C. y Mathieson, P. W. Angiopoietins : microvascular modulators with potential roles in glomerular pathophysiology . J Nephrol 16:168-178(2003)) y COX-2 (revisado en (Nasrallah, R. & Hebert, R.L. Prostacyclin signaling in the kidney: implications for health and disease. Am J Physiol Renal Physiol 289:F235-46 (2005)) fueron reguladas ascendentemente , mientras que el factor-ß del factor de crecimiento derivado de plaquetas (Pdgfr-ß) y Pdgf-c (revisado en (Betsholtz, C. et al. Role of platelet-derived growth factor in mesangium development and vasculopathies : lessons from platelet-derived growth factor and platelet-derived growth factor receptor mutations in mice. Curr Opin Nephrol Hypertens 13:45-52 (2004))) fueron regulados descendentemente. Los cambios en la expression genética en células mesangiales VEGF-A-deficientes in vitro destacan un desplazamiento hacia la acumulación de los components del mesangio de ECM e identificaron que VEGF-A regula estos procesos de una manera autónoma de la célula.

Tabla 2. Cambios en expresión genética asociados con VEGF-deficiencia en células mesangiales. Las clases de ontologia genética que fueron significativa sobre-representadas en aquellos genes ya sea regulados ascendente o descendentemente en células mesangiales VEGF-A deficientes.

Familias de ontología genética REGULADAS ASCENDENTEMENTE en células mesangiales VEGF-deficientes Ontología VECES DE VALOR P ENRIQUECIMIENTO Actividad molecular 2.1 p=0.006 estructural Quimiotaxis 3.2 p=0.006 Regulación en 7.0 p=0.001 migración celular Mecanismo de defensa 8.9 p = 0.003 humoral Familias de ontología genética REGULADAS DESCENDENTEMENTE en células mesangiales VEGF-deficientes Ontología VECES DE VALOR P ENRIQUECIMIENTO Actividad de 6.6 0.0001 endopeptidasa serina Actividad de 6.5 0.0001 quimiotripsina Actividad de 6.3 =0.002 tripsina Comunicación 11.3 = 0.008 cellular El análisis de Ingenuity Pathways identificó rutas funcionales representadas por genes cuya expresión fue regulada diferenciadamente de manera significativa en células mesangiales VEGF-A deficientes.

Genes clasificados por rutas funcionales que son alterados significativamente en la expresión en células mesangiales VEGF-deficientes Ruta Genes regulados Genes regulados % de genes en genética /funetion ascendentemente descendentemente red representados Crecimiento celular y ADD3, APPBP2, ARF6, GPX1, HBEGF, 100 % proliferación ARID4A, CEACAM1, HSPA1B, LAMP1, celular, ensamble FCGR1A, FRAP1, LGALS1, MFGE8, celular y ING1, MC3R, NCL, PI 3R2, organización celular, NR3C1, PIK3R1, PPP1R15A, RHOD, compromiso celular PL 4, PRAP1, PTPRF, RPS6, SERPINE1, SDC2, TGFBR1, VAV3 SMARCA4 , SMARCB1, TMSB10, TNFRSF1A, TRIM28, VEGF Síntesis de proteína, UBE2V2 ACT 4, FAU, 57 % modificación posRPL12, RPL22, traducción, cáncer RPL26, RPL29, RPL18A, RPL23A, RPL37A, RPLP2, RPS2, RPS3, RPS13, RPS26, RPS28 Modificación posABCC3, CP, DBT, ATP5H, MAFF, 49% traducción, muerte FCGR1A, H2-D1, MYH9, NUTF2, celular, enfermedad KIF3C P4HB, PP1B, inmunológica RPS11, SLC7A1, ST3GAL3, TNK1, TPD52L2 Señalización e GAS7, ITGB4BP, E1F2S2, FCGR3A, 49% interacción de célula RIN2, STXPB5 GNB2L1, PDGFC, a célula, desarrollo PDGFRB, PFKP, del sistema PTPN11, RAPGEF1, hematológico y SLC9A3R1, SRP14, función inmune, TBC1D10A, YWHAB, respuesta inmune YWHAQ Muerte celular, EFNA4, ING1, PARC, CKAP , FLII, 46? expresión genética, PEX6, SESN1, GPI, HBEGF, ciclo celular TCF7L2, UBE2D3 HSPH1, PAXIP1L, PHC2, SSRP1, TADA3L Patologías renales asociadas con la expresión de VEGF disminuida durante el desarrollo del riñon Una función autónoma de célula de VEGF-A en células mesangiales de riñon, moderadas por Flt-1, es identificada y se describe un papel de ese mecanismo regulador durante el desarrollo del riñon. Se proporciona evidencia de que la interferencia con este mecanismo regulador puede provocar algunos de los aspectos patofisiológicos asociados con glomerulosclerosis . La falla renal progresiva en este modelo representa un modelo de lesión del desarrollo, en lugar de un modelo de inicio adulto de glomerulonefritis . Hay algunas similaridades en la patología del riñon en este modelo y enfermedades de riñon humanas asociadas con niveles de VEGF más bajos en los ríñones (véase, por ejemplo, Schrijvers, B.F., et al., The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology . Kidney Int 65:2003-17(2004)), por ejemplo, en lesión glomerular, esclerosis y depósitos inflamatorios y activación de complemento. Véase, por ejemplo, Isselbacher, K.J. et al. Harrison's Princip les of Interna! Medicine, (1994) (McGraw-Hill Inc., Nueva York) . El ratón Flt-Cre+; VEGF ( loxP/loxP) es un modelo genético que muestra acumulación de depósitos de IgM y activación de Clq, C3 y C4 en ríñones enfermos. Los hallazgos son diferentes de observaciones previas en ratones de 9-12 semanas de edad con haplo-deficiencia de VEGF-A podocito-especí fica, que desarrolla falla renal de etapa final en presencia de formación de complejo inmune. Véase por ejemplo, Eremina, V. et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. J Clin Invest 111:707-16 (2003) . La mayoría de reportes investigan la expresión de VEGFR1 y/o VEGF-A en células primarias y en ríñones saludables y enfermos, identificaron las células mesangiales como más probables para co-expresar ambos genes (véase por ejemplo, Thomas, S. et al. Vascular endothelial gro th factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000) ; Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduct ion . Proc Nati Acad Sci E U A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001) ; Takahashi, T. et a1. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995); Simón, M. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in human renal ontogénesis and in adult kidney. Am-J-Physiol 268 (1995) y Noguchi, K. et al. Activated mesangial cells produce vascular permeability factor in early-stage mesangial proliferative glomerulonephrit is . J Am Soc Nephrol 9:1815-25 (1998) ), en lugar de podocitos, que se sabe expresan niveles más altos de VEGF-A (véase por ejemplo, Berse, B., et al. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors . Molecular Biology of the Cell 3:211-20 (1992) y Brown, L.F. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal kerat inocytes during wound healing. Journal of Experimental Medicine 176:1375-9 (1992)) o células endoteliales que expresan VEGFR-1 (véase por ejemplo, Thomas, S. et al. Vascular endothelial growth factor receptors in human mesangium in vitro and in glomerular disease. J Am Soc Nephrol 11:1236-43 (2000)) . Podocitos Cre-posit ivos no fueron detectados en ratones transgénicos compuestos Fltl-Cre+, VEGF (LoxP/LoxP) , ROSA26 en varias etapas durante el desarrollo. La ausencia de la expresión de VEGFR-1/2 en podocitos no transformados es consistente con reportes previos (véase por ejemplo, Gruden, G. et al. Mechanical stretch induces vascular permeability factor in human mesangial cells: mechanisms of signal transduct ion . Proc Nati Acad Sci E U A 94:12112-6 (1997); Harper, S.J. et al. Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin Sci (Lond) 101:439-46 (2001) ,-and, Takahashi, T. et al. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells.

Biochem Biophys Res Commun 209:218-26 (1995)) y con nuestras observaciones. Sin embargo, la transformación de murinos primarios con antigeno T grande de SV40 dio como resultado la expresión de VEGFR-1 y VEGF-A en algunas lineas celulares de podocitos transformadas. Véase por ejemplo, Chen, S. et al. Podocyte-derived vascular endothelial growth factor mediates the stimulation of alpha3(IV) collagen production by transforming growth factor-betal in mouse podocytes. Diabetes 53:2939-49 (2004). Se proporciona evidencia por la existencia de dos mecanismos reguladores en el desarrollo de los glomérulos de riñon controlados por VEGF: 1) el mecanismo parácrino entre podocito y células endoteliales capilares glomerulares , que fue sugerido por estar involucrado en la inducción y mantenimiento de fenestros y/o velocidades de filtración glomerulares (revisado en Schrijvers, B.F., et al. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology . Kidney Int 65:2003-17 (2004)) y 2) el bucle autócrino en células mesangiales que regulan la producción de ECM y funciones de podocitos, que incluyen la expresión de VEGF. El modelo, en donde la producción de VEGF está en posicitos es una función corriente abajo de papel autócrino de VEGF en células mesangiales, se puede tomar en cuenta por la superposición en los fenotipos en ratones con deficiencia en VEGF y ya sea en otro tipo de células. La deficiencia de VEGF-A mesangial también conduce a un conjunto adicional de cambios renales no encontrados en ratones haplo-insuficientes de VEGF podocito-especificos, que incluyen la presencia de células inflamatorias infiltrantes (Figura 4 a- b) y la expansión de la membrana basal glomerular (Figura 3m) . Estos hallazgos sugieren que el tipo de célula afectada, además de la reducción global en la expresión de VEGF-A, puede representar un determinante clave para la patología del riñon. La administración de compuestos que estimulan la finalización de VEGF, en particular VEGFR-1, pueden ser benéficos para el tratamiento de un subconjunto de enfermedades de riñon asociadas con esclerosis glomerular.

Efectos diferenciales entre inactivación genética y bioquímica de VEGF sobre células mesangiales : Evidencia adicional por funciones VEGF-A efectoras internas-autócrinas como mecanismo regulador Un prerrequisito para la detección de la función autónoma de célula de VEGF en células mesangiales fue la falla evidente de VEGF-A derivado de podocito para rescatar células mesangiales CEGF-A deficientes vía para- o señalización yuxtacrina. Sin estar limitados a un solo modelo, la identificación de la expresión de CEGF de podocito para hacer una función corriente abajo del bucle autócrino de VEGF en células mesangiales proporciona un razonamiento con la finalidad de los procesos para rescatar células mesangiales VEGF-A deficientes. Una función autónoma de célula por VEGF-A en la regulación de la supervivencia de célula de tallo hematopoyética (HSC) fue reportada previamente. Véase por ejemplo, Gerber, H.P. et al. VEGF regulates haematopoiet ic stem cell survival by an interna! autocrine loop mechanism. Na ture 417, 954-8(2002) . En analogía, la administración de un anticuerpo neutralizante VEGF-A a células mesangiales cultivadas en cultivo no impactó sobre los números de células mesangiales, en contraste con células deficientes por VEGF-A o Fltl. Si estar limitados a una teoría, los hallazgos sugieren que la señalización autócrina puede representar un mecanismo regulador más general para separar funciones parácrinas de VEGF que controlan la formación de vasos sanguíneos en posiciones efectoras no angiogénicas (revisado en Gerber, H.P. y Ferrara, N. The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis . J Mol Med 81:20-31(2003)) en múltiples tipos de células.

Ejemplo 2 : Variantes selectivas de VEGFR de VEGF La generación y caracterización de las variantes de VEGF que se enlazan selectivamente y activan un receptor de VEGF específico (tal como KDR o Flt-1) han sido conocidas en el arte y descritas en por ejemplo Li et al., J. Biol. Chem. 275:29823 (2000); Gille et al. J. Biol. Chem. 276:3222-3230 (2001); Publicaciones de PCT WO 00/63380 y 97/08313 y patente Estadounidense No. 6,057,428, la revelación de las cuales es incorporada expresamente en la presente por referencia. Específicamente, una variante de VEGF con alta selectividad para el receptor de Flt-1 fue generada al combinar cuatro mutaciones que afectan extensamente KDR pero no el enlace de Flt-1. La mutación de lie 43, lie 46, Gln 79 y/o lie 83 mostró que las cadenas laterales de estos residuos son críticas para el fuerte enlace de KDR pero no importantes para el enlace de Flt-1. Li et al. (2000) supra. Una variante Flt-sel fue construida con sustituciones de alanina en posiciones lie 43, lie 46, Gln 79 y lie 83, utilizando métodos de mutagénesis dirigidos al sitio descritos por Kunkel et al. Methods Enzymol. 204:125-139 (1991) . Esta variante de Flt-sel en particular puede también ser representada por el identificador 143A/I 46A/Q79A/I83A. Los codones correspondientes para estas cuatro sustituciones de alanina en posiciones 43, 46, 79 y 83 son GCC/GCC/GCG/GCC, respectivamente. Ser llevaron a cabo varios análisis para examinar las propiedades y actividades biológicas de la variante I43A/I46A/Q79A/I83A Flt-sel. Li et al. (2000) supra. Por ejemplo, mediciones de enlace cuantitativas se llevaron a cabo utilizando un análisis de enlace de reductor radio-inmune soluble (RIA) . En el análisis, el VEGF natural (8-109) tuvo afinidades por KDR y Flt-1 de 0.5 nM y 0.4 nM, respectivamente. Se encontró que Fltl-sel tiene por lo menos una afinidad de enlace de KDR 470 veces reducida en este análisis. Pequeñas reducciones en el enlace de Flt-1 han sido observadas de los mutantes puntuales individuales en el ELISA, la afinidad de variante de Flt-1 para Flt-sel fue esencialmente idéntica a aquella de la proteina natural. Se considera que la especificación es suficiente para permitir al experimentado en el arte llevar a la práctica la invención. Se comprenderá que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son por propósitos ilustrativos solamente. Por supuesto, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente se harán evidentes para aquellos experimentados en el arte a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para el tratamiento de una enfermedad renal, el método está caracterizado porque comprende: administrar una cantidad efectiva de un agente modulador de VEGFR a un sujeto con enfermedad renal, en donde el agente modulador de VEGFR comprende un agonista de Fltl.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de Fltl es un anticuerpo agonista de Fltl.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de Fltl es un agente selectivo de VEGF A Fltl.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de Fltl es CEGF A, P1GF o VEGFB.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de Fltl es un agonista de molécula pequeña de Fltl.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad renal está caracterizada por una disminución en los niveles de VEGF.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad renal es enfermedad inflamatoria del riñon.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria del riñon está caracterizada por inflamaciones en células inflamatorias, deposiciones de complejo inmune o activación de complemento en los glomérulos afectados.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la deposición del complejo inmune es deposición de IgM.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la activación del complemento comprende la activación de Clq, C3 y C4.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad renal comprende glomerulonefritis (insuficiencia renal) .
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la glomerulonefritis es determinada por proteinuria, esclerosis glomerular o hipertensión.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la glomerulonefritis es determinada por la supervivencia disminuida de células mesangiales de riñon, un incremento en la expresión genética de síntesis de ECM o una reducción en degradación de matriz.
14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la glomerulonefritis es glomerulosclerosis segmental focal (FSGS) .
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la administración de una cantidad efectiva de un segundo agente, en donde el segundo agente es un agente angiogénico.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la administración de una cantidad efectiva de un segundo agente, en donde el segundo agente es un segundo agonista de Fltl.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente angiogénico es VEGF.
18. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
19. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.
20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sujeto tiene una infección que provoca la enfermedad renal.