CN111012898A

CN111012898A - 纽兰格林制剂的配方

Info

Publication number: CN111012898A
Application number: CN201911390381.8A
Authority: CN
Inventors: 周明东
Original assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Current assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2020-04-17
Also published as: KR102522140B1; CN104758922A; KR20160105443A; JP7479068B2; BR112016015660A2; WO2015101182A1; CA2935607A1; JP2020143101A; JP6703483B2; EP3090756A4; JP7100083B2; JP2017502969A; JP2022130627A; RU2016131667A3; US20170007671A1; US20210113661A1; RU2016131667A; KR20230054749A; CN110946993A; RU2738158C2

Abstract

本发明涉及一种治疗心血管疾病的药物制剂。特别地，本发明提供了纽兰格林药物制剂的配方。该配方由纽兰格林多肽、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、盐等成分组成，能够保证纽兰格林多肽的长期稳定性，用于治疗心力衰竭患者或者处在心衰风险中的患者。

Description

纽兰格林制剂的配方

技术领域

一般来说，本发明涉及治疗心血管疾病比如心力衰竭的药物制剂。特别地，本发明涉及纽兰格林药物制剂的配方。

发明背景

在美国，大约有5百万人患有心衰，并且每年新增病人在55万以上。目前治疗心衰的药物主要集中于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，这些血管舒张剂引起血管扩张、降低血压并减少心脏负荷。虽然使用ACE抑制剂后死亡率的百分数下降是具有统计学差异的，但实际的死亡率仅平均下降3％-4％，并且还有一些潜在的副作用。其他预防或治疗心衰的选择亦有相应的局限。比如，心脏移植显然比药物治疗更昂贵且更具侵入性，并且还进一步受有无供体心脏的限制。使用机械装置，比如双心室心脏起搏器，同样具有侵入性并且比较昂贵。因此，由于当前治疗手段的不足，人们需要有新的治疗方法。

一种很有前途的新的治疗手段涉及给心衰患者或有心衰风险的患者施用纽兰格林(此后称为“NRG”)。NRGs属于表皮生长因子样(EGF-like)家族，是一类结构上相似的生长分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其异构体。NRGs涉及一系列生物学反应：刺激乳腺癌细胞分化和分泌乳汁蛋白；诱导神经嵴细胞分化成Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；并且促进心肌细胞成活和DNA合成。用纽兰格林基因严重缺陷的纯合子小鼠胚胎做活体研究证明纽兰格林对于心脏和神经发育是必须的。

NRGs与EFG受体家族的成员结合，该受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4，其中每一个受体在多种细胞功能中都发挥重要的作用，包括细胞生长、分化和存活。它们都是蛋白酪氨酸激酶受体，由一个胞外配体结合域、跨膜激酶域和胞浆的酪氨酸激酶结构域组成。NRG结合至ErbB3或ErbB4的细胞外结构域后，能够诱导构象改变从而引起ErbB3、ErbB4和ErbB2之间形成异二聚体，或者ErbB4自身形成同源二聚体，这样就会导致受体细胞内C-末端结构域的磷酸化。然后磷酸化的胞内结构域与细胞内其他的信号蛋白结合，活化相应的下游AKT或ERK信号传导途径，并诱导一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞粘附。在这些受体中，ErbB2和ErbB4主要在心脏表达。

已有研究表明NRG-1的EGF类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些受体。以前的研究表明纽兰格林-1β(NRG-1β)能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。孤儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源二聚体要高。神经发育的研究结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG-1β、ErbB2和ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG-1β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导致胚胎致死。最近的研究也突显了NRG-1β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年正常心脏功能方面具有重要作用。研究表明NRG-1β能增强成年心肌细胞的肌小节的组织结构。短期施用一种重组的NRG-1βEGF类似区能显著改善或防止不同心衰动物模型的心肌功能的恶化。这些效应使得NRG-1有望成为一种治疗多种普通疾病导致的心衰的广谱治疗物或先导化合物。通常，蛋白质类药物制剂的给药方式为静脉注射。然而众所周知，一些活性蛋白存在着稳定性差的问题。因此，开发一种稳定的纽兰格林药物制剂是非常必要的。

发明概述

本发明所提供的一种纽兰格林的药物配方包含：(a)纽兰格林多肽；(b)一种缓冲剂，使所述配方pH值为3-7。在一些实施例中，纽兰格林配方进一步包括：(c)一种稳定剂。在一些实施例中，纽兰格林还包括：(d)一种盐。在一些实施例中，该配方为一种液体制剂。在一些实施例中，该配方为一种冻干制剂。

配方中所述纽兰格林多肽选自以下物质：a)一种包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；b)一种包含纽兰格林的EGF类似区的多肽；c)一种a)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；d)一种由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的多肽；e)一种d)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；f)一种由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID NO:1所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽。在一些实施例中，纽兰格林多肽是指包含SEQID NO:2所示氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，纽兰格林多肽的浓度范围约为0.01g/L-1g/L。在一些实施例中，本发明所述配方中纽兰格林多肽为包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽且浓度约为0.25g/L。

在一些实施例中，本发明所述配方包含一种pH缓冲剂。在所述实施例中，pH缓冲剂的浓度范围约为0.1mM-500mM。缓冲剂选自柠檬酸盐，磷酸盐，醋酸盐，组氨酸，甘氨酸，碳酸氢盐，HEPES，Tris，稀盐酸，稀氢氧化钠溶液或以上物质的组合。在一种实施例中，本发明所述配方中的缓冲剂是磷酸盐。在一些实施例中，本发明所述配方的pH值约为6.0。在一些实施例中，本发明所述配方的pH值约为3.4。

在一些实施例中，本发明所述配方包含一种稳定剂。在进一步的实施例中，稳定剂的浓度范围约为0.1g/L-200g/L。在另外的实施例中，稳定剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇，蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，阿拉伯糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白及或以上物质的组合。在一些实施例中，稳定剂指浓度约为2g/L的人血清白蛋白。

在另外一些实施例中，本发明所述配方包含一种盐。在一些实施例中，盐的浓度约为100mM-500mM。在一特定实施例中，盐是指氯化钠。在相关实施例中，配方中盐的浓度约为150mM。

在一些实施例中，本发明所述配方中的纽兰格林多肽包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，其中缓冲剂约为10mM的磷酸盐，pH值约为6.0。

在一些实施例中，本发明所述配方中所含的NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽且浓度约为0.25g/L，所含的缓冲剂是浓度约为10mM的磷酸盐且pH值约为6.0，所含的稳定剂是浓度约为2g/L的人血清白蛋白，所含的盐是氯化钠且浓度约为150mM。

在一些实施例中，本发明所述配方是液体药物制剂。在进一步实施例中，本发明所提供的纽兰格林液体药物制剂配方包含的纽兰格林多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽且浓度约为0.25g/L，所述缓冲剂约为10mM磷酸盐且其中所述pH约为3.4。

在一些实施例中，本发明所述配方是由上述任一配方加入赋形剂后冻干而成的冻干药物配方。在一些实施例中，赋形剂选自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上物质的组合。在一特定实施例中，赋形剂为甘露醇。在相关实施例中，约60mg的所述配方用1ml重悬溶液重悬后赋形剂的浓度约为0.1g/L-200g/L。在一特定实施例中，约60mg的所述配方用1ml重悬溶液重悬后甘露醇的浓度约为50g/L。

在进一步实施例中，本发明所提供的纽兰格林冻干药物配方包含：(a)一种纽兰格林多肽；(b)一种缓冲剂；(c)一种赋形剂。在另外一些实施例中，冻干的药物制剂配方进一步包含一种稳定剂。在另外一些实施例中，冻干的药物制剂配方进一步包含一种盐。

在一特定实施例中，本发明所述的冻干药物制剂配方包含：(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)磷酸盐缓冲剂；(c)赋形剂甘露醇；(d)稳定剂人血清白蛋白和(e)盐氯化钠，约60mg的所述配方用1ml重悬溶液重悬后(a)的浓度约为0.25g/L；(b)的浓度约为10mM且pH值约为6；(c)的浓度约为50g/L；(d)的浓度约为2g/L；(e)的浓度约为150mM。

附图简述

图1：重组人纽兰格林(rhNRG-1)稀释液和浓度为0.25mg/mL标准溶液的色谱图

图2：pH3-10的SDS-PAGE色谱图

图3：在温度为40℃、pH3-8条件下的浓度-时间图

图4：在温度为40℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间图

图5：在温度为50℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间图

图6：在温度为60℃、pH3-8条件下的浓度-时间图

图7：储存在温度为60℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间图

图8：在pH3-8条件下的pH值-降解速率图

图9：在pH2.3-4.3条件下的pH值-降解速率图

图10：在pH2.3-8条件下的pH值-降解速率图

图11：pH值-预期保质期T(90)图

图12：pH3-8、40℃条件下储存77h的色谱图

图13：pH2.3-3.8条件下的色谱图

图14：被强力破坏的溶液色谱图(从上到下依次为：标准溶液0.255mg/mL，加入H₂O₂20分钟，加入H₂O₂ 2小时25分钟，加入H₂O₂ 4小时30分钟，加入H₂O₂ 7小时7分钟)

发明详述

本发明在某种程度上是基于发现了能够出乎意料的保证纽兰格林多肽稳定性的特定药物配方。就此而言，研究发现比较低的pH值可使纽兰格林配方的稳定性显著提高。虽然在本发明的实施例中能够使用任何相似或等同的方法，但以下描述的是首选的方法和材料。

除非在上下文中明确表明，否则本说明书及其所附权利要求书中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括相应的复数参考。例如，关于“一种缓冲剂”包含两种或更多缓冲剂的混合物。以此类推。

术语“约”，特别是涉及一个给定的量，是指正负偏差在10％以内的量。

除非在上下文中明确表明，否则本说明书及其所附权利要求书中，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括相应的复数参考，并与“至少一个”或“一个或多余一个”可互换使用。

此处所使用的术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”及其任何变体旨在涵盖非独占性的包含物，例如包含、包括或含有一种元素或一列表的元素的过程、方法、加工产品或物质的组合物不仅包括那些元素还可能包括没有明确地列出的或该过程、方法、加工产品或物质的组合物的固有的其它元素。

此处所用的术语“多肽”是指由氨基酸残基、结构变体、相关自然产生的结构变体、及其合成的非天然产生的类似物通过肽键连接组成的聚合物。合成多肽可通过如使用自动多肽合成仪来制备。术语“蛋白质”通常指较大的多肽。术语“肽”通常是指较短的多肽。

除非在上下文中明确表明，否则此处所用“蛋白质”等同于“多肽”、“肽”。

此处使用的多肽的“片段”是指任何一种多肽或蛋白质中任何比全长多肽或蛋白质表达产物小的部分。

此处所用的术语“类似物”是指结构大致相同、并具有相同生物活性但可以有不同程度活性的任何两个以上的多肽、或者是整个分子或者是其中片段。基于一个或多个涉及一个或多个氨基酸对其它氨基酸取代、删除、插入和/或添加的突变，类似物的氨基酸序列的组成不同。基于被替换的氨基酸以及替换它的氨基酸之间理化或功能性的相关度，取代可以是保守性或非保守性的。

此处所用“变体”是指多肽、蛋白质或其类似物被修饰为包含其它的通常不是该分子一部分的化学部分。这些部分可以调节分子的溶解度、吸收性、生物半衰期、等等。或者，这些部分可以降低分子的毒性并消除或减轻分子的任何不期望有的副作用等。适于介入这些效果的部分在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1980)中已公开。把这些部分偶联到分子上的工艺是本领域已知的。例如但不限于，在一个方面，变体是具有赋予蛋白更长体内半衰期的化学修饰的凝血因子。在其它方面，多肽通过糖基化、聚乙二醇化、和/或聚唾液酸化而被修饰。

编码片段、变体和类似物的多核苷酸可以由本领域技术人员容易地产生，以便编码具有与天然产生的分子相同或相似生物活性的天然产生的分子的生物学活性片段、变体或类似物。这些多核苷酸能够通过使用PCR技术、消化/连接编码分子的DNA等制备。因此，通过使用本技术领域任何已知的方法，包括但不限于定点突变，本领域的技术人员将能在DNA链中产生单一碱基的改变，从而得到改变的密码子和错义突变。这里使用的术语“适度严格的杂交条件”，是指，例如，在42℃下在50％甲酰胺中杂交并且在60℃下在0.1x SSC、0.1％SDS中洗涤。本领域的技术人员应理解，基于待杂交序列的长度和其中GC核苷酸碱基的含量，这些条件可发生变化。本技术领域的规则标准适合用于确定精确的杂交条件。参见Sambrook等，《分子克隆》，9.47-9.51节(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。

此处所用“心力衰竭”是指一种心脏功能的异常，在这种情况下，心脏不能按照组织代谢的需要进行供血。心力衰竭包括多种疾病状态比如充血性心力衰竭，心肌梗死，心律失常，家族性肥厚性心肌病，缺血性心脏病，特发性心肌病和心肌炎等之类的。心力衰竭可由多种因素导致，包括但不限于缺血性，先天性，风湿性，病毒性、毒性或特发性心力衰竭。慢性心脏肥大是一种显著的充血性心力衰竭前期的疾病状态，其可以引起心脏停搏。此处所用“纽兰格林”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括纽兰格林的异构体、纽兰格林中的EGF样功能域、包含纽兰格林EGF样功能域的多肽、纽兰格林的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的纽兰格林样的基因产物。纽兰格林还包括NRG-1，NRG-2，NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。本发明所用纽兰格林可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心肌细胞的分化、存活以及DNA合成。纽兰格林还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本领域技术人员熟知合适的氨基酸保守替换并不影响蛋白质的生物活性。本技术领域中普通技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,The Bejacmin/Cummings Pub.co.,p.224)。优选的，纽兰格林是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并非为了限制的目的，本发明的纽兰格林是NRG-1β2异构体的一个片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了EGF样功能域。该片段的氨基酸序列为：SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELY Q(SEQ ID NO:2)。

此处所用“表皮生长因子样功能域”或“EGF样功能域”是指由神经调节蛋白基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性：WO 00/64400；Holmes等，Science,256:1205-1210(1992)；美国专利5,530,109和5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.,13:1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387:509-512(1997)；Carraway等，Nature，387:512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.,122:675-680(1997)；以及WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样功能域结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-1的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域是指NRG-1的第177-226位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-2的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-3的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-4的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含美国专利5,834,229中描述的氨基酸序列：Ala Glu Lys Glu Lys ThrPhe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。

本发明提供了纽兰格林配方，产生一种高度稳定的药物组合物。该稳定的药物组合物可用作一种治疗剂来治疗心力衰竭患者或者处在患心力衰竭危险中的患者。

在一个实施例中，本发明所提供的一种纽兰格林的药物配方包含：(a)纽兰格林多肽；(b)一种或多种缓冲剂。纽兰格林蛋白或多肽选自于：a)一种包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；b)一种包含纽兰格林的EGF类似区的多肽；c)一种a)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；d)一种由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的多肽；e)一种d)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；f)一种由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID NO:1所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽。纽兰格林多肽或蛋白的浓度范围约为0.01g/L-1g/L。在一些优选的实施例中，该浓度范围约为0.01g/L-0.8g/L,0.01g/L-0.6g/L,0.01g/L-0.4g/L,0.01g/L-0.2g/L。在另外一些实施例中，纽兰格林蛋白或多肽的浓度约为1.0g/L,约为0.90g/L,约为0.80g/L,约为0.70g/L,约为0.60g/L,约为0.50g/L,约为0.45g/L,约为0.40g/L,约为0.35g/L,约为0.30g/L,约为0.25g/L,约为0.20g/L,约为0.15g/L,约为0.10g/L,约为0.05g/L或更低的浓度。

在一个优选的实施例中，纽兰格林蛋白或多肽的浓度约为0.25g/L。缓冲剂是一种浓度范围在0.1mM-500mM的pH缓冲剂，所述pH值的范围约为2.0-12.0。缓冲剂选自柠檬酸盐，磷酸盐，醋酸盐，组氨酸，甘氨酸，碳酸氢盐，HEPES,Tris,稀盐酸，稀氢氧化钠溶液及以上物质的组合物。在一些优选的实施例中，pH值的范围约为3.0-10.0，约为3.0-7.0,约为2.3-3.8.在一些实施例中，pH值约为2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.33,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9或约为4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9或约为5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9或约为6.0。在一个优选的实施例中，缓冲剂是磷酸盐，pH值约为6。在一个优选的实施例中，缓冲剂是磷酸盐，pH值约为3-4。在另一个优选的实施例中，缓冲剂是磷酸盐，pH值约为3.4。

在一个特定的实施例中，纽兰格林配方包含一个氨基酸序列为SEQ ID NO:2的纽兰格林多肽，磷酸盐为缓冲剂，pH值约为6.0。在一个特定的实施例中，纽兰格林配方包含一个氨基酸序列为SEQ ID NO:2的纽兰格林多肽，磷酸盐为缓冲剂，pH值约为3.4。

在另一个实施例中，一种稳定的纽兰格林配方包含：(a)纽兰格林蛋白或多肽；(b)一种或多种缓冲剂；(c)一种或多种稳定剂。稳定剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇，蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，阿拉伯糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白及以上物质的组合物。稳定剂的浓度约为0.1g/L-200g/L。在一些优选的实施例中，稳定剂是浓度约为50g/L的甘露醇。在一些优选的实施例中，稳定剂是浓度约为2g/L-8g/L的人血清白蛋白。

在一个特定的实施例中，纽兰格林配方包含一个氨基酸序列为SEQ ID NO:2的纽兰格林多肽，浓度约为10mM的磷酸盐为缓冲剂，pH值约为6.0，稳定剂是浓度约为2g/L的人血清白蛋白。

在另一个实施例中，一种稳定的纽兰格林配方包含：(a)纽兰格林蛋白或多肽；(b)一种或多种缓冲剂；(c)一种或多种赋形剂，赋形剂选自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上物质的组合。一种或多种赋形剂的浓度约为0.1g/L-200g/L。在一些优选的实施例中，赋形剂是浓度约为2g/L-8g/L的人血清白蛋白。在一些优选的实施例中，赋形剂是浓度约为50g/L的甘露醇。

在另一个实施例中，一种稳定的纽兰格林配方包含：(a)纽兰格林蛋白或多肽；(b)一种或多种缓冲剂；(c)一种或多种稳定剂和(d)一种或多种赋形剂。在一些优选的实施例中，稳定剂是人血清白蛋白。在一些优选的实施例中，赋形剂甘露醇。

在另一个实施例中，一种稳定的纽兰格林配方包含：(a)纽兰格林蛋白或多肽；(b)一种或多种缓冲剂；(c)一种或多种稳定剂；(d)一种或多种赋形剂和(e)一种或多种盐。

在一些实施例中，本发明所述配方是由上述任一配方加入赋形剂后冻干而成的冻干药物配方。在一些实施例中，赋形剂选自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上物质的组合。在一特定实施例中，赋形剂为甘露醇。

在另一实施例中，冻干的纽兰格林配方包含：(a)纽兰格林蛋白或多肽；(b)一种或多种缓冲剂；(c)一种或多种赋形剂；(d)一种或多种稳定剂和(e)一种或多种盐；约60mg的所述配方用1ml重悬溶液重悬后(a)的浓度范围约为0.01g/L-1g/L；(b)的浓度约为0.1mM-500mM且pH值约为3-7；(c)的浓度约为0.1g/L-200g/L；(d)的浓度约为0.1g/L-200g/L；(e)的浓度约为100mM-500mM。

冷冻干燥

在一个方面，本发明包含NRG多肽的配方可被冷冻干燥制成冻干药物制剂。使用本领域通用技术进行冷冻干燥，并应针对所开发的组合物进行优化[Tang等，Pharm Res.21：191-200，(2004)和Chang等，Pharm Res.13：243-9(1996)]。

在一个方面，冻干周期由三个步骤组成：冷冻、初级干燥以及二级干燥[APMackenzie，Phil Trans R Soc London，Ser B，Biol 278：167(1977)]。在冷冻步骤中，溶液被冷却，以便启动冰的形成。此外，这一步引起填充剂的结晶。通过采用抽真空并导入热量来促进升华，把腔室内压力降至冰点蒸气压以下，进行冰在初级干燥阶段的升华。最后，在二级干燥阶段，在降低的腔内压力和升高的存放温度下除去吸附或结合的水。这一过程生产出被称为冻干块的材料。其后，冻干块可以用无菌水或合适的注射用稀释剂重新配制。

冻干周期不但决定赋形剂的最终物理状态，还影响到其它参数如重新配制时间、外观、稳定性和最终水分含量。组合物在冷冻状态下的结构经过几次在特定温度下发生的转变(如玻璃态转化、润湿和结晶化)，所述结构可以用来理解和优化冻干工艺。玻璃态转变温度(Tg和/或Tg′)可以提供关于溶质物理状态的信息，并且可以通过差示扫描量热法(DSC)来确定。Tg和Tg′是在设计冻干周期中必须考虑的重要参数。例如，Tg′对于初级干燥很重要。此外，在干燥状态下，玻璃态转变温度提供了最终产品的储存温度信息。

缓冲液和缓冲剂

此处所指的“缓冲液”或“缓冲剂”包含能够维持溶液在可容许的pH值范围为2.0-9.0的物质或组合物。适当的缓冲剂不会和其他原料发生化学反应，并且能够起到所需的pH缓冲作用。

药理活性蛋白配方的稳定性通常在一个狭窄的pH值范围内观察到最大。这种稳定性的最适pH范围需要在预配方研究中确定。几种办法比如加速稳定性研究和比热筛选研究对这一尝试是有用的(Remmele R.L.Jr.，et al.，Biochemistry，38(16)：5241-7(1999))。一旦配方被确定，蛋白质必须在其保质期内生产并保持。因此，缓冲剂几乎总被用来控制配方的pH值。

缓冲体系的缓冲能力在pH等于pKa值时最大，并随着pH值的升高或降低而下降。若pH值与pKa相差在1个单位内，则有百分之九十的缓冲能力。缓冲能力也随缓冲液浓度的增加而成比例地增加。

选择缓冲剂时有几个因素需要考虑。第一个也是最重要的，需要根据pKa及所需的配方pH来确定缓冲体系及其浓度。同样重要的是要确保该缓冲体系与蛋白质和其他剂型赋形剂相兼容，且不催化任何降解反应。第三个要考虑的重要方面是缓冲剂可能在给药时引起的刺痛和刺激的知觉。例如，已知柠檬酸盐会在注射时导致刺痛(Laursen T，etal.，Basic Clin Pharmacol Toxicol.，98(2)：218-21(2006))。对于那些通过皮下(SC)或肌内注射(IM)途径给药的药物来说，刺痛和刺激可能性会更大，与静脉注射(IV)途径相比这些途径中药物溶液在给药部位会停留相对较长的时间，IV途径中制剂在给药后被迅速稀释到血液中。对于那些通过直接静脉输液给药的配方，需要监测缓冲剂(和任何其他配方成分)的总量。对于以磷酸钾形式使用的钾离子必须特别小心，它会引起患者的心血管效应(Hollander-Rodriguez JC，et al.，Am.Fam.Physician.，73(2)：283-90(2006))。

用于冻干配方的缓冲剂需要额外考虑。一些常见的缓冲剂如醋酸和咪唑可能在冻干过程中升华或蒸发，从而改变冻干中或重新配制后配方的pH值。

组合物中出现的缓冲体系选定为具有生理上的兼容性并维持所期望的药物配方pH值。在一种实施方式中，溶液的pH值在pH 2.0和pH值12.0之间。例如，溶液的pH值可以是2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0.

pH缓冲性化合物的存在可以是任何能使配方的pH维持在预定水平的适当的量。在一个实施方式中，pH值缓冲浓度在约0.1mM和500mM之间。例如，设想的pH缓冲剂至少为约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或500mM。

本文罗列的用来缓冲配方的pH缓冲剂包括但不限于：有机酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、Tris、HEPES和下述氨基酸或氨基酸混合物：包括但不限于天门冬氨酸、组氨酸和甘氨酸。在本发明的一种实施方式中，缓冲剂是磷酸盐。

稳定剂和填充剂

在本发明药物配方的一个方面，添加稳定剂(或稳定剂的组合)以避免或降低由储存引起的聚集和化学降解。重新配制后的模糊或混浊的溶液表明蛋白质发生沉淀或者至少发生聚集。术语“稳定剂”是指一种能防止水溶液中聚集或物理降解、包括化学降解(例如：自溶、去酰胺化，氧化等)的赋形剂。考虑的稳定剂包括但不限于：蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，阿拉伯糖，葡萄糖胺，果糖，甘露醇，山梨醇，甘氨酸，精氨酸盐酸盐，下述多羟基化合物：包括多糖如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷酮(N-methyl pyrollidene)、纤维素和透明质酸[Carpenteret al.，Develop.Biol.Standard 74：225，(1991)]。在本发明的配方中，包含的稳定剂的浓度为约0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200g/L。在本发明的一种实施例中，甘露醇被用作稳定剂。

如果需要，配方还包括适量的填充剂和渗透压调节剂。填充剂包括，例如但不限于，甘露醇、甘氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨醇、海藻糖、木糖醇。

配方和赋形剂

赋形剂是赋予或增强药物产品(如蛋白质)稳定性和释放性能的添加剂。无论其被包含的原因如何，赋形剂成为配方中不可缺的组成部分，因此需要是安全的并且患者耐受性良好的。对于蛋白质药物，赋形剂的选择尤为重要，因为它们影响药物的疗效和免疫原性。因此，蛋白质配方需要通过赋形剂的适当选择来进行开发，以提供合适的稳定性、安全性、适销性。

在蛋白质配方的开发中的主要挑战是稳定产品，以对抗制造、运输和贮存中的压力。剂型赋形剂的作用在于提供稳定化来应对这些压力。赋形剂还被用来降低高浓度蛋白质配方的粘度以便于其释药并加强患者的便利。一般来说，赋形剂可根据它们稳定蛋白质应对各种化学和物理压力的机理进行分类。一些赋形剂被用来减轻特定压力的影响或调节特定蛋白质的特定易感性。其它赋形剂对于对蛋白质的物理和共价稳定性有更广泛的影响。此处所述的赋形剂按照其化学类型或它们在配方中的功能作用来安排。在讨论每个赋形剂类型时，提供了其稳定模式的简要说明。

为获得本发明的生物药物配方，在任何特定配方中可以包括什么样的赋形剂用量或范围能促进保留生物药物(如蛋白质)的稳定性。例如本发明的生物药物配方中包含的盐的量和种类是根据最终溶液的所需渗透浓度(即：等渗、低渗或高渗)和配方内包含的其它成分的量和渗透浓度来选择的。

此外，如果在一个特定的赋形剂以摩尔浓度被报道，则本领域的技术人员将认识到，等效的溶液的百分浓度(％)w/v(如(溶液样品中物质的克数/溶液毫升数)×100％)也已考虑到。

赋形剂浓度在特定配方中相互依赖。举例来说，当例如有较高的蛋白质浓度时或者当例如有较高的稳定剂浓度时，填充剂的浓度可能会较低。在没有填充剂时，为了维持特定配方的等渗性，稳定剂的浓度会被相应调整(即使用“张力性”剂量的稳定剂)。赋形剂包括，例如但不限于，人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇及这些物质的组合物。

盐

盐往往被添加以提高配方的离子强度，离子强度对于蛋白质的溶解度、物理稳定性、等渗性很重要。盐能以各种方式影响蛋白质的物理稳定性。离子能通过结合的蛋白质表面的带电残基的来稳定蛋白质的天然状态。另外，盐能通过与沿蛋白质基干(-CONH-)的肽群结合来稳定蛋白质的变性状态。盐也能通过屏蔽稳定在一个蛋白质分子内残基之间的静电斥力相互作用来稳定蛋白质的天然构象。蛋白质配方中的盐也能屏蔽蛋白质分子之间能导致蛋白质聚集和不溶性的吸引性静电相互作用。在提供的配方中，盐浓度在约1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300、和500mM之间。

制备方法

本发明还进一步考虑用于制备药物配方的方法。

本方法进一步包括下列步骤中的一个或多个：冻干之前向所述混合物中添加本文所述稳定剂，冻干之前向所述混合物中添加填充剂、渗透压调节剂、以及赋形剂剂中的至少一种试剂，其中每种试剂都如本文所述。

冻干材料的标准重配做法是回加一定体积(通常相当于冻干过程中除去的体积)的注射用(WFI)纯水或无菌水，尽管抗菌剂的稀释溶液有时会在肠胃外给药的药物生产中使用[Chen，Drug Development and Industrial Pharmacy，18：1311-1354(1992)]。因此，提供的用于制备重新配制NRG组合物的方法包括添加稀释剂到本发明的冻干NRG组合物中。

冻干材料可以重新配制为水溶液。各种水性载体，如无菌注射用水、用于多剂量使用的含防腐剂的水、或含适量表面活性剂的水(如水悬液，其中混合物中含有活性化合物，该混合物中有适于用在水悬浮液生产的赋形剂)。在各种实施方式中，这些赋形剂是悬浮剂，例如但不限于：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂是一种天然产生的磷脂，例如但不限于：卵磷脂、或烯氧化物与硬脂酸的缩合产物，例如但不限于聚氧乙烯硬脂酸、或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如但不限于十七乙基-苯氧基十六烷醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)、或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇所衍生的偏酯的缩合产物比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或环氧乙烷与脂肪酸和无水己糖醇所衍生的偏酯的缩合产物，例如但不限于聚乙烯山梨醇单油酸酯。在各种实施方式中，水悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如但不限于：乙基苯甲酸、或正丙基苯甲酸、对羟基苯甲酸。

给药

在一个方面，为了对人体或测试动物使用组合物，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。如下所述，短语“药学”或“药理学”可接受的是指，在使用本领域公知的途径给药时，分子实体和组合物是稳定的、可抑制蛋白降解比如产物聚合和裂解、并且还不产生过敏、或其他不良反应。“药学上可接受的载体”包括任何及所有对临床有用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和延缓吸收剂等等，包括上文公开的试剂。本文提到的“重悬溶液”是指无菌去离子水或生理盐水等可用于临床，且不产生过敏、或其他不良反应的溶液。

药物配方经口服、外用、透皮、非内服(肠胃外)、吸入喷雾、阴道、直肠、或颅内注射给药。此处所用术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、脑池内注射或输液技术。还考虑到通过静脉注射、皮内、肌肉、乳内、腹腔内、鞘内、眼球后、肺内注射和或手术植入特定的部位。一般来说，组合物基本上不含热原及其它对受体有害的杂质。

组合物的单次或多次给药按主治医师选择的剂量水平和方式进行。为预防或治疗疾病，适当的剂量取决于如上定义的被治疗疾病的类型、严重程度和病程、药物是否用于预防或治疗目的、此前的治疗、病人的临床病史以及对药物的反应、以及主治医师的决定。

试剂盒

作为一种补充的方面，本发明包括试剂盒，其中包含以有利于向对象给药的方式包装的一种以上的冻干组合物。在一种实施方式中，所述试剂盒包括本文所述的药物配方(例如，含有治疗性蛋白质或肽的组合物)，所述配方被包装在一种容器比如密封的瓶子或容器中，所述试剂盒还具有被粘贴在容器上或收入包装内的标签，其描述实施该方法时化合物或组合物的具体使用。在一种实施方式中，该试剂盒包含了装有治疗性蛋白质或肽的组合物的第一容器和装有用于组合物的药学上可接受重新配制溶液的第二容器。在一个方面，药物配方以单位剂量的形式包装。所述试剂盒可以进一步包括一种适用于按特定给药途径进行所述药物配方给药的装置。优选地，所述试剂盒含有标签来介绍所述药物配方的使用。

剂量

考虑到各种因素会影响药物的作用，例如年龄、身体状况、体重、性别及患者的饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其他临床因素，本文所述的治疗病症的方法中涉及的剂量方案由主治医生决定。

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。

从以上描述可知，不同的变化和修饰可以使本发明产生不同的用法和条件。这些实施例包含在以下权利要求的范围内。

本文中用一系列要素列表所定义的变量包括定义该变量所列要素的任何单个元素或组合(或变形)。这里的一个实施例的记载包括该实施方案作为任何单一实施方案或与任何其他实施方案或其部分的组合。

本详述中所有的专利和出版物特此引入作为参考，其参考程度如同每一篇参考文献被单独并具体地说明引入作为参考。

下列实施例仅作为本发明具体实施方式的示例而不是作为限定。

实施例

下列实施例仅用于举例说明本发明，不以任何方式对本发明进行限制。本文实施例中所用“重组人纽兰格林-1(rhNRG-1)”是指氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白质或多肽。

实施例1：rhNRG-1的pH-稳定性分析

1.实验目标

1.1SDS-PAGE法检测rhNRG-1在不同pH值缓冲液中(pH3-10)的稳定性，并绘制pH-稳定性曲线

1.2RP-HPLC法检测rhNRG-1在不同pH值缓冲液(pH3-8)和去离子水中的稳定性，并绘制pH-稳定性曲线

1.3根据目标1.2的发现，确定精密的pH范围(pH2.3-4.3)内的pH-稳定性曲线

1.4根据精密的pH稳定性研究，确定rhNRG-1配方的最优pH值。

2.实验步骤

2.1建立RP-HPLC法检测rhNRG-1原料药的纯度

表1：该方法的条件

批号201204001的RhNRG-1，含1.24mg/mL rhNRG-1，20mM磷酸盐缓冲溶液和0.5MNaCl，pH为5.5(“原液”)被用于制备HPLC分析中的标准溶液。

图1所示为RhNRG-1稀释液和0.25mg/mL标准溶液的典型色谱图(分别位于上面和下面)

表2：0.25mg/mL的标准溶液进样6次验证方法的精确性

标准溶液0.25mg/mL	峰面积
		Inj#1	9929
Inj#2	9901
		Inj#3	9819
Inj#4	9924
		Inj#5	9781
Inj#6	9663
		平均值	9874
相对标准偏差*	0.4

*峰面积的相对标准偏差为0.4，小于2.0，在精确度可接受标准的范围内。

2.2制备pH3-10的缓冲溶液

在一个15mL的塑料试管中，加入原液和去离子水或者新的缓冲液。混合成一种含0.25mg/mL rhNRG-1，10mM新的缓冲液，4mM磷酸盐(来自于原液)和0.1M NaCl(来自于原液)的溶液。

表3：最终的pH值和新的缓冲溶液

pH(最初)	新缓冲液
		3.19	磷酸钠
4.17	醋酸钠
		5.08	醋酸钠
5.47	组氨酸
		6.02	柠檬酸钠
7.00	磷酸钠
		8.07	碳酸氢钠
9.02	甘氨酸和氢氧化钠稀释液
		10.05	甘氨酸和氢氧化钠稀释液
5.63	无新的缓冲溶液加入，pH无调节

表4：每种溶液被密封在玻璃瓶中并贮存的情况

贮存温度	#瓶数
		2-8℃	2
40℃	3
		60℃	3

2.3SDS-PAGE法检测纯度

在40℃温度下贮存10天，用SDS-PAGE法检测纯度。用45％水，45％甲醇，10％乙酸配制的溶液脱色，用0.1％考马斯蓝染色，电泳胶(12％-15％)用来将不同的多肽分离成不连续的条带。

2.4用反相-高效液相法(RP-HPLC)检测溶液

在60℃温度下贮存，于时间点0，7.5，24，48，65和77小时分别取150μL溶液，用HPLC检测。

在40℃温度下贮存，于时间点28.5，49和77小时分别取150μL溶液，用HPLC检测。

精密的pH(pH2.3-4.3)范围研究的准备：

在一个15mL的塑料试管中，加入原料药和去离子水或者新的缓冲液。混合成一种含0.25mg/mL rhNRG-1，4mM磷酸盐(来自于原液)和0.1M NaCl(来自于原液)，用稀释的HCl下调pH值，依次达到pH 4.29，3.90，3.78，3.47，3.36，3.17，3.02，2.85，2.58，2.37和2.33。一旦达到第一个pH值，移取8mL溶液到另一个塑料试管中，继续滴定至下一个pH值，每个pH值要保留8mL溶液。将每个pH值的溶液分成5份装入玻璃瓶中，分别放置于2-8，25，40，50和60℃条件下。

在60℃温度下贮存，于0，3.7，4.7和5.7天后分别取200μL溶液，用HPLC检测。

在50℃温度下贮存，于0，4.7和11天后分别取200μL溶液，用HPLC检测。

在40℃温度下贮存，于0，5.7，7和11天后分别取200μL溶液，用HPLC检测。

在每个温度下构建一个精密范围的pH-稳定性曲线

根据阿伦纽斯方程，预测5℃下的保质期。

3.结果和结论

图2所示为pH3-10的典型色谱图

rhNRG-1的最初浓度和被强力破坏后的溶液浓度由反相HPLC法检测并列表如下：

表5：在40℃、pH3-8条件下的结果

表6：在60℃、pH3-8条件下的结果

NT：没有检测(Not Tested)

表7：在40℃、pH2.3-4.3条件下的结果

表8：在50℃、pH2.3-4.3条件下的结果

NA：无数据(Not available)

表9：在60℃、pH2.3-4.3条件下的结果

NA：无数据(Not available)

图3所示为40℃、pH3-8条件下的浓度-时间曲线。

图4所示为40℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间曲线。

图5所示为50℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间曲线。

图6所示为60℃、pH3-8条件下的浓度-时间曲线。

图7所示为贮存在60℃、pH2.3-4.3条件下的浓度-时间曲线。

每个浓度-时间曲线都要符合线性回归方程，假定降解遵循零级动力学规律，线性回归方程的斜率表示降解的速率(mg/mL/hr)。

图8所示为pH3-8条件下pH-降解速率(斜率)曲线

图9所示为pH2.3-4.3条件下pH-降解速率(斜率)曲线

图10所示为pH2.3-8条件下pH-降解速率(斜率)曲线

表10所示为在不同的pH值(3-8)和温度下，估算的降解速率和T90(降解初浓度的10％或0.025mg/mL所需的时间)。

利用pH(2.3-3.9)、温度为40、50和60℃时的数据，通过阿伦纽斯方程预期在5℃时不同pH值下的贮藏时间。通过阿伦尼乌斯方程计算出来的T90值如下表(表11)：

表11

pH	T90(天)	T90(月)
			2.37	166	6
2.58	317	11
			3.02	612	20
3.36	1092	36
			3.90	239	8

图11为pH值-预期保质期T(90)图示

图12所示为在pH3-8、40℃条件下贮存77小时的色谱图

图13所示为在pH2.3-3.8条件下的色谱图

结论：

1.RhNRG-1在溶液中的稳定性对pH值是高度依赖的，rhNRG-1在酸性溶液(pH3.0-7.0)中比在碱性溶液(pH8.0-10.0)中更稳定。

2.RhNRG-1在最低pH值(3.2)时有最佳稳定性。

3.在较低的pH值条件下的T90是pH为4.2时的两倍，是原始缓冲液(pH5.5)时的20倍。因此可预期通过降低rhNRG-1溶液的pH值来提高其稳定性。

4.窄区间的pH研究表明在pH3.4(+0.2)条件下稳定性最好。

实施例2：强力破坏实验

1.实验目标

研究rhNRG-1的稳定性

2.实验步骤

原液被如下强力破坏降解(表12)：

样品按时间点采集并用反相HPLC分析。

3.结果和结论

表13：氧化作用结果

氧化作用	rhNRG-1浓度(mg/mL)
		0.3小时	0.24
2.4小时	0.15
		4.5小时	0.10
7.1小时	0.07

图14所示为被强力破坏的溶液的典型色谱图(从上到下依次为：标准溶液0.255mg/mL,加入H₂O₂ 20分钟，加入H₂O₂ 2小时25分钟，加入H₂O₂ 4小时30分钟，加入H₂O₂,7小时7分钟)结论：

1.rHNRG-1对过氧化物非常敏感，易于被氧化。

2.需要考虑加入抗氧化剂和稳定剂来提高配方的稳定性。

实施例3：不同的赋形剂对rHNRG-1配方稳定性的影响

1.实验目的

研究不同的赋形剂对rHNRG-1配方稳定性的影响

2.实验材料

2.1表14列出了16种rhNRG-1配方

2.2SHELLAB/Model1535恒温培养箱(Sheldon制造公司)

2.3HPLC Angilent 1200(Angilent公司)

2.4凝胶柱ZORBAX GF-250(4.6mm×250mm)

表14：试验配方清单

3.实验步骤

3.1将样品置于37℃保存5天

3.2用SEC-HPLC检测样品浓度

流动相：0.7M NaCl,30mM PB(pH7.0)

HPLC色谱条件：流速0.5ml/min，进样量20μl，检测波长450nm，记录时间20min。

4.结果

用面积归一法计算每份样品的纯度，rhNRG-1配方的检测结果如表15所示。

表15:5天后试验配方的纯度

葡聚糖配方(C1&C2)，精氨酸配方(E1&E2)，蔗糖配方(F1&F2)中的纯度数据不一致，因此葡聚糖、精氨酸和蔗糖在rhNRG-1配方中不是好的赋形剂。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是一种填充剂，含PVP的rhNRG-1配方不能提供SEC-HPLC检测的纯度数据。结果显示，乳糖、海藻糖、甘露醇和甘氨酸被认为是比较好的rhNRG-1配方的赋形剂。

实施例4：人血清白蛋白(HAS)浓度对纽兰格林配方生物活性的影响

1.实验原理

HER2/neu基因编码一种跨膜蛋白p185，为酪氨酸蛋白激酶。NRG-1与ErbB3或ErbB4结合，诱导ErbB3-ErbB2和ErbB4-ErbB2异质二聚体的形成，从而激活HER2编码酪氨酸蛋白激酶，介导NRG-1功能信号的传递。基于NRG-1与其受体结合可激发ErbB2蛋白的磷酸化作用的事实，建立了一种快速、灵敏、高通量体外定量检测重组人纽兰格林-1生物活性的方法。

2.实验目的

研究不同浓度的人血清白蛋白(HAS)对纽兰格林配方生物活性的影响

3.实验材料

3.1rhNRG-1配方

标准样品：0g/L HSA,250μg/mL rhNRG-1,10mM磷酸盐缓冲试剂,150mM NaCl,50g/L甘露醇

试验样品A：0.5g/L HSA,250μg/mL rhNRG-1,10mM磷酸盐缓冲液,150mM NaCl,50g/L甘露醇

试验样品B：2g/L HSA,250μg/mL rhNRG-1,10mM磷酸盐缓冲液,150mM NaCl,50g/L甘露醇

试验样品C：8g/L HSA,250μg/mL rhNRG-1,10mM磷酸盐缓冲液,150mM NaCl,50g/L甘露醇

3.2 96孔细胞培养板(Corning公司)，Costar 96孔ELISA检测板

3.3人乳腺癌细胞株，引自美国ATCC公司，于37℃、50％CO₂条件下在培养基中培养。

3.4量取一定量的DMEM，定量到相应的体积，加入3.7g/L NaHCO₂,0.1g/L谷氨酰胺和5.5g/L HEPES

3.5基础培养基DMEM培养基加入10％胎牛血清和9mg/L胰岛素，4℃保存。

3.6无菌的PBS(0.01M,pH 7.4).

3.7用含Ca²⁺和Mg²⁺离子的PBS制备0.25％胰酶

3.8抗ErBb2单克隆抗体包被缓冲液，洗涤液。选择与ErbB3和ErbB4无交叉反应的鼠抗人ErbB2胞外功能域H4单克隆抗体。包被缓冲液：pH 9.6,0.05M碳酸盐缓冲液。洗液：0.01MPBS+0.05％Tween-20。

3.9辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗人磷酸化蛋白酶单克隆抗体(anti-P-tyr-HRP)

3.10底物，底物缓冲液底物(TMB)：2mg/ml TMB(用无水乙醇配制)。底物缓冲液：0.2M柠檬酸+0.1M Na₂HPO₄(pH 5.0)。工作用底物：底物缓冲液9ml+TMB 1ml+3％H₂O₂10ul(即配即用)。

3.11终止剂2N H₂SO₄

3.12细胞裂解液：150mM NaCl+50mM HEPES+1％Triton-X 100+2mM(钒酸钠)+0.01％(硫柳汞)。临用前每25mL加一片混合蛋白酶抑制剂。

4.实验步骤

4.1样品置于37℃恒温中4天。

4.2细胞接种

将MCF-7细胞扩增至一定数量，用无菌PBS溶液洗涤，然后用0.25％胰蛋白酶消化。计数后，用基础培养基调整细胞浓度。将细胞加至96孔板中，每孔100μl，5×10⁴个细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

4.3细胞饥饿

吸净96孔板中的培养基，用37℃温育后的PBS清洗每个孔，然后加100μl DMEM培养基(不含牛血清和胰岛素)。再置于37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。

4.4包被

用包被缓冲液稀释抗ErbB2胞外功能域H4抗体至6μg/ml，每孔加50μl至96酶标板中，置于4℃过夜(16-18小时)。

4.5标准液和待测样品的稀释

分别用DMEM培养基(不含小牛血清和胰岛素)稀释标准液和待测样品至2μg/ml，再作3倍梯度稀释，共做9个稀释度。

4.6细胞的磷酸化

将饥饿后的96孔细胞培养基吸净，分别加入标准品和待测样品，100μl每孔，每个浓度设置2孔，同时设置阴性对照(即加DEME培养基的空白对照)。37℃下作用20min。

4.7细胞裂解

迅速吸去样品并用PBS洗一遍，每孔加入100μl细胞裂解液，置于4℃冰箱裂解30min。冰浴条件下水平摇动至贴壁细胞完全脱落，4℃，15,000rpm离心15min。

4.8封闭酶标板

洗板5次，用洗涤液制备5％的脱脂牛奶，每个孔中加200μl，置于37℃ 2hr。

4.9加样

将封闭的酶标板洗3次，加入标准细胞裂解液和待测样品裂解液，每孔90μl，同时设阴性对照组，置37℃ 1hr。

4.10加酶标抗体

洗板5次，用洗液按1:500稀释HRP酶联鼠抗磷酸化酪氨酸蛋白抗体(根据产品使用说明和使用时间决定)，每孔加100μl，置37℃1hr。

4.11底物显色

洗板5次，每孔加入100μl临时配制的底物工作液，置37℃10min。

4.12终止

每孔加入50μl的2N H₂SO₄终止反应。

4.13读OD值

于酶标仪上比色，测定波长450nm，参比波长655nm，记录测定结果。

5.结果

构建重组人纽兰格林-1浓度-OD值曲线，用线性回归法分析并计算每种待测样品的半数有效剂量。4种rhNRG-1配方的检测结果如表16所示。

表16：待测样品的生物活性

样品B和样品C的生物活性(见表16)明显高于标准样品和样品A。结果表明，HAS的浓度在2g/L(样品B)或者8g/L(样品C)为rhNRG-1配方的优选浓度。

实施例5：加速稳定性试验和长期稳定性试验

1.实验目的

研究rhNRG-1最终药物产品的稳定性

2.实验步骤

实验材料：泽生生产的4个批次的rhNRG-1最终药物产品(FDP)。rhNRG-1FDP由约250μg/mL的rhNRG-1，浓度约为10mM且pH值约为6.0的磷酸盐缓冲液,约50g/L甘露醇,约2g/L HSA和约150mM NaCl的溶液冻干而成，冻干后每瓶的产品总量约为60mg。

研究并评价rhNRG-1最终药物产品贮存在推荐条件和升温条件下的稳定性，见表17。样品溶解在1ml水中，在测试间隔期检测其pH值，生物活性和rhNRG-1的量。

目前的规格是≤3.0％的残余水分(采用卡尔费希尔法确定)。批号rhNRG#1,rhNRG#2,rhNRG#3和rhNRG#4释出的水分含量分别为1.49％,1.51％,1.62％,和1.35％。根据过去其他使用相似药瓶和瓶塞配置的产品的经验，预期任何批次rhNRG-1在所推荐的保存期限内(即在预期的储存温度5℃±3℃下储存24个月)的残余水分大约为1.7％，可满足≤3.0％的规格。

泽生生产的4个批次的rhNRG-1最终药物产品(FDP)进行了在推荐的储存条件下(即5℃±3℃)和高温条件下(即25℃±2℃)的长期稳定性研究。该研究已经提供了足够的数据来表明单个临床批次的稳定性表现。

表17：储存条件&每个批次的试验间隔

3.结果和结论

每个批次检测的项目包括在试验间隔期的外观，pH值，残余水分，生物活性和rhNRG-1含量。

表18所示为稳定性试验，包括稳定性要求试验，稳定性验收标准和评价rhNRG-1FDP稳定性的相关信息。

表18所示为试验结果。

表18：每个批次的稳定性测试结果

批次rhNRG#1,rhNRG#2,rhNRG#3和rhNRG#4中的残余水分量低于验收标准≤3.0％，不影响生物活性。对于为适用于非临床研究和临床研究而生产的批次，采用定性分析技术(即外观，SDS-PAGE电泳分析等)检测未见明显变化。同样，对总蛋白和rhNRG-1含量进行分析，未见在储存期内稳定性下降的趋势。

将rhNRG-1药物成品储存于5℃±3℃环境下24个月，能够保持rhNRG-1的生物活性。在高温试验的储存条件下储存6个月的结果可推测，在冷藏条件下，药物的保质期在2年以上。

推荐的贮存条件和保质期

推荐的rhNRG-1FDP储存条件为5℃±3℃，因此，建议若保存在推荐储存条件下，暂定的保质期为24个月。基于更长保存时间获得的补充数据，rhNRG-1FDP的保质期可能会进一步延长。

以上实施例仅作为本发明具体实施方式的示例而不是限定本发明的范围。对本领域的技术人员而言，可以对本发明进行各种显而易见的修改和变化。因此只要其不背离本发明的精神和范围，其它实施方案仍在权利要求书的范围之内。

序列表

<110> 上海泽生科技开发股份有限公司

<120> 纽兰格林制剂的配方

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 183

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc 60

ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt 120

actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac 180

cag 183

<210> 2

<211> 61

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn

1 5 10 15

Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr

35 40 45

Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln

50 55 60

Claims

1.一种纽兰格林(NRG)药物配方，其包含：(a)NRG多肽；(b)一种缓冲剂，其中所述配方的pH值约为3-7；(c)一种稳定剂；(d)一种盐。

2.如权利要求1所述的配方，其特征在于，所述NRG多肽是选自下组中的多肽：a)一种包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；b)一种包含纽兰格林的EGF类似区的多肽；c)一种a)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；d)一种由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列编码的多肽；e)一种d)所述多肽的生物活性类似物，片段或突变体；f)由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID NO:1所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽。

3.如权利要求2所述的配方，其特征在于，所述NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求1所述的配方，其特征在于，所述缓冲剂是一种pH缓冲剂。

5.如权利要求1所述的配方，其特征在于，所述配方是液体药物制剂配方。

6.如权利要求1所述的配方，其特征在于，所述稳定剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇，蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，树胶醛糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白或这些稳定剂的组合。

7.如权利要求1所述的配方，其特征在于，所述盐是氯化钠。

8.如权利要求3所述的配方，其特征在于，所含的NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽且浓度约为0.25g/L，所含的缓冲剂是浓度约为10mM的磷酸盐且pH值约为6.0，所含的稳定剂是浓度约为2g/L的人血清白蛋白，所含的盐是氯化钠且浓度约为150mM。

9.一种纽兰格林(NRG)冻干药物制剂配方，其特征在于由上述任一权利要求1-8的配方加入赋形剂后冻干而成。

10.如权利要求9所述的配方，其特征在于，其包含：(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；(b)磷酸盐缓冲剂；(c)赋形剂甘露醇；(d)稳定剂人血清白蛋白和(e)盐氯化钠，约60mg的所述配方用1ml重悬溶液重悬后(a)的浓度为0.25g/L；(b)的浓度为10mM且pH值约为6；(c)的浓度为50g/L；(d)的浓度为2g/L；(e)的浓度为150mM。