KR20160105443A

KR20160105443A - 뉴레귤린 제제의 처방

Info

Publication number: KR20160105443A
Application number: KR1020167020428A
Authority: KR
Inventors: 밍동 쪼우
Original assignee: 젠순 (상하이) 사이언스 앤드 테크놀로지 리미티드
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2016-09-06
Also published as: KR102522140B1; CN104758922A; JP7479068B2; BR112016015660A2; WO2015101182A1; CN111012898A; CA2935607A1; JP2020143101A; JP6703483B2; EP3090756A4; JP7100083B2; JP2017502969A; JP2022130627A; RU2016131667A3; US20170007671A1; US20210113661A1; RU2016131667A; KR20230054749A; CN110946993A; RU2738158C2

Abstract

본 발명은 심혈관 질환을 치료하는 약물 제제를 제공한다. 특히, 본 발명은 뉴레귤린 약물 제제의 처방을 제공한다. 상기 제제는 뉴레귤린 폴리펩타이드, 완충제, 안정제, 부형제, 염 등 성분으로 구성되며, 뉴레귤린 폴리펩타이드의 장기적인 안정성을 보장할 수 있고, 심부전 환자 또는 심부전의 위험이 있는 환자의 치료에 적용된다.

Description

뉴레귤린 제제의 처방 {FORMULA OF NEUREGULIN PREPARATION}

일반적으로, 본 발명은 심부전과 같은 심혈관 질병을 치료하는 약물 제제에 관한 것으로서, 특히 뉴레귤린 제제의 처방에 관한 것이다.

미국에서는 대략 5백만 명이 심부전을 앓고 있으며, 또한 매년 새롭게 증가되는 환자가 55만 이상이다. 현재 심부전 치료 약물은 주로 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제에 집중되어 있으며, 이러한 혈관확장제는 혈관을 확장시키고, 혈압을 강하시키며 심장 부하를 감소시킨다. 비록 ACE 억제제를 사용한 후 사망률의 퍼센트 감소는 통계학적 차이가 있으나, 실제 사망률은 평균적으로 3%-4% 감소에 불과할 뿐만 아니라 약간의 잠재적인 부작용도 존재한다. 기타 심부전의 예방 또는 치료에 대한 선택 역시 이에 상응하여 제한적이다. 예를 들어 심장이식은 약물치료에 비해 훨씬 비싸고 또한 침습성이 더할 뿐만 아니라, 공여되는 심장의 유무 여부에 제한을 더 받는다. 기계장치, 예를 들어 양심실 조율기를 사용할 경우에도 마찬가지로 침습성이 존재하고 또한 값이 비싸다. 따라서 현재 치료수단이 부족하므로, 새로운 치료방법이 필요하다.

전망이 밝은 신규 치료 수단은 심부전 환자 또는 심부전을 앓을 위험이 있는 환자에게 뉴레귤린(이후 "NRG"라 칭함)을 투여하는 것이다. NRGs는 표피생장인자 유사(EGF-like) 가족에 속하며, 구조적으로 유사한 생장분화 인자로서, NRG1, NRG2, NRG3와 NRG4 및 그 이형체를 포함한다. NRGs는 유선암 세포분화와 유즙 단백질 분비를 자극하고; 신경능세포가 Schwann 세포로 분화되도록 유도하며; 골격근 세포가 아세틸콜린 수용체로 합성되도록 자극하고; 심근세포의 활성 및 DNA 합성을 촉진하는 등과 같은 일련의 생물학 반응과 관련이 있다. 뉴레귤린 유전자에 심각한 결함이 있는 동형접합자 마우스의 배태를 활성체로 한 연구에서 뉴레귤린이 심장 및 신경 발육에 필수적인 것임이 증명되었다.

NRGs는 EFG 수용체 가족의 구성원과 결합되며, 상기 수용체 가족은 EGFR, ErbB2, ErbB와 ErbB4를 포함하고, 그 중 각각의 수용체는 모두 다양한 세포 기능 중 세포의 생장, 분화와 생존을 포함하는 중요한 작용을 발휘한다. 이들은 모두 단백질 티로신 키나아제 수용체로서, 하나의 세포외 리간드 결합 영역, 막관통 키나아제 영역과 세포질 티로신 키나아제 영역으로 구성된다. NRG는 ErbB3 또는 ErbB4의 세포외 구조 영역과 결합된 후, 구조적 변경을 유도함으로써 ErbB3, ErbB4와 ErbB 사이에 헤테로다이머를 형성하거나, 또는 ErbB4 자체로 호모다이머를 형성하며, 이 경우 수용체 세포 내의 C-말단 구조 영역의 인산화를 초래할 수 있다. 이후 인산화된 세포 내 구조 영역은 세포 내 기타 신호 단백질과 결합하여 상응하는 다운스트림 AKT 또는 ERK 신호 전달 경로를 활성화하고, 일련의 세포 반응, 예를 들어 세포 증식의 자극 또는 억제, 세포 분화, 세포 사멸, 세포 이동 또는 세포 부착을 유도한다. 이러한 수용체 중, ErbB2와 ErbB4는 주로 심장에서 발현된다.

NRG-1의 EGF 유사 영역은 약 50 내지 64개의 아미노산 범위에서 이러한 수용체와 충분히 결합하여 활성화시킬 수 있음이 연구에서 밝혀졌다. 이전의 연구에서 뉴레귤린-1β(NRG-1β)는 높은 친화력으로 ErbB3와 ErbB4에 직접 결합될 수 있고, 희귀수용체 ErbB2는 ErbB3 또는 ErbB4와 헤테로다이머를 형성할 수 있으며 또한 그 친화력은 ErbB3 또는 ErbB4 호모다이머보다 높은 것으로 나타났다. 신경 발육 연구 결과 교감신경계통의 형성에는 완전한 NRG-1β, ErbB2와 ErbB3 신호 전달 계통이 필요한 것으로 밝혀졌으며, NRG-1β, 또는 ErbB2 또는 ErbB4가 표적 파괴된 후에는 심장 발육 결함으로 인해 배아가 사망에 이르게 된다. 최근 연구에서도 NRG-1β, ErbB2와 ErbB4가 심혈관 발육 및 성인의 정상적인 심장 기능을 유지하는 방면에 있어서 모두 중요한 역할을 한다는 것이 두드러지게 나타났다. 연구에서 NRG-1β가 성인의 심근세포 근절의 조직 구조를 강화시킬 수 있고, 재조합체 NRG-1β EGF 유사 영역을 단기간 투여할 경우 상이한 심부전 동물 모델의 심근 기능의 악화를 현저하게 개선 또는 방지할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 효과로 인하여 NRG-1은 다양한 보통 질병으로 인한 심부전을 치료하는 광역 스펙트럼의 치료 약물 또는 선도 화합물이 될 가능성이 있다.

통상적으로, 단백질류 약물 제제의 투여 방식은 정맥 주사이다. 그러나 잘 알려진 바와 같이, 약간의 활성 단백질에는 안정성이 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 안정적인 뉴레귤린 약물 제제의 개발이 매우 필요하다.

본 발명이 제공하는 뉴레귤린의 약물 제제는 (a) 뉴레귤린 폴리펩타이드; (b) 상기 제제의 pH값이 3-7이도록 하는 일종의 완충제를 포함한다. 약간의 실시예에서, 뉴레귤린 제제는 또한 (c) 일종의 안정제를 더 포함한다. 약간의 실시예에서, 뉴레귤린은 (d) 일종의 염을 더 포함한다. 약간의 실시예에서, 상기 제제는 액체 제제이다. 약간의 실시예에서, 상기 제제는 동결건조 제제이다.

제제 중 상기 뉴레귤린 폴리펩타이드는 이하 물질 중에서 선택된다: a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; b) 뉴레귤린의 EGF 유사 영역을 포함하는 폴리펩타이드; c) a)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; d) SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드; e) d)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; f) 적당히 엄격한 잡종형성 조건에서 SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리다이즈된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드. 약간의 실시예에서, 뉴레귤린 폴리펩타이드란 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 약간의 실시예에서, 뉴레귤린 폴리펩타이드의 농도 범위는 약 0.01g/L-1g/L이다. 약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제 중 뉴레귤린 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이면서 농도는 약 0.25g/L이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 pH 완충제를 포함한다. 상기 실시예에서, pH 완충제의 농도 범위는 약 0.1mM-500mM이다. 완충제는 시트르산염, 인산염, 아세트산염, 히스티딘, 글리신, 중탄산염, HEPES, Tris, 묽은 염산, 묽은 수산화나트륨 용액 또는 이상의 물질의 조합으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 본 발명의 상기 제제 중의 완충제는 인산염이다. 약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제의 pH값은 약 6.0이다. 약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제의 pH값은 약 3.4이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 안정제를 포함한다. 좀 더 구체적인 실시예에서, 안정제의 농도 범위는 약 0.1g/L-200g/L이다. 또 다른 실시예에서, 안정제는 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 수크로오스, 트레할로오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 라피노오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노오스, 글루코사민, 프룩토오스, 인간 혈청 알부민 및/또는 이상의 물질들의 조합으로부터 선택된다. 약간의 실시예에서, 안정제는 농도가 약 2g/L인 인간 혈청 알부민이다.

또 다른 약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 염을 포함한다. 약간의 실시예에서, 염의 농도는 약 100mM-500mM이다. 일 특정 실시예에서, 염은 염화나트륨을 가리킨다. 관련 실시예에서, 제제 중 염의 농도는 약 150mM이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제 중의 뉴레귤린 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하며, 그 중 완충제는 약 10mM의 인산염이고, pH값은 약 6.0이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제에 함유된는 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드이면서 농도는 약 0.25g/L이며, 함유되는 완충제는 농도가 약 10mM인 인산염이면서 pH값은 약 6.0이고, 함유되는 안정제는 농도가 약 2g/L인 인간 혈청 알부민이며, 함유되는 염은 염화나트륨이면서 농도는 약 150mM이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 액체 약물 제제이다. 더 구체적인 실시예에서, 본 발명이 제공하는 뉴레귤린 액체 제제에 포함된 뉴레귤린 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드이면서 농도는 약 0.25g/L이고, 상기 완충제는 약 100mM의 인산염이면서 그 중 상기 pH는 약 3.4이다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 상기 임의의 제제에 부형제를 첨가한 후 동결건조시켜 형성된 동결건조 약물 제제이다. 약간의 실시예에서, 부형제는 인간 혈청 알부민, 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이상의 물질의 조합으로부터 선택된다. 일 특정 실시예에서, 부형제는 만니톨이다. 관련 실시예에서, 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후의 부형제 농도는 약 0.1g/L-200g/L이다. 일 특정 실시예에서, 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후의 만니톨 농도는 약 50g/L이다.

좀 더 구체적인 실시예에서, 본 발명이 제공하는 뉴레귤린 동결건조 약물 제제는 (a) 뉴레귤린 폴리펩타이드; (b) 완충제; (c) 부형제를 포함한다. 또 다른 약간의 실시예에서, 동결건조 약물 제제는 안정제를 더 포함한다. 또 다른 약간의 실시예에서, 동결건조 약물 제제는 염을 더 포함한다.

일 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 동결건조 약물 제제는 (a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드; (b) 인산염 완충제; (c) 부형제로서의 만니톨; (d) 안정제로서의 인간 혈청 알부민 및 (e) 염으로서의 염화나트륨을 포함하며, 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후 (a)의 농도는 약 0.25g/L이고; (b)의 농도는 약 10mM이면서 pH값은 약 6이며; (c)의 농도는 약 50g/L이고; (d)의 농도는 약 2g/L이며; (e)의 농도는 약 150mM이다.

도 1은 재조합 인간 뉴레귤린(rhNRG-1) 희석액과 농도가 0.25mg/mL인 표준 용액의 크로마토그램이다.
도 2는 pH3-10인 SDS-PAGE 크로마토그램이다.
도 3은 온도가 40℃이고, pH가 3-8인 조건에서의 농도-시간도이다.
도 4는 온도가 40℃이고, pH가 2.3-4.3인 조건에서의 농도-시간도이다.
도 5는 온도가 50℃이고, pH가 2.3-4.3인 조건에서의 농도-시간도이다.
도 6은 온도가 60℃이고, pH가 3-8인 조건에서의 농도-시간도이다.
도 7은 온도가 60℃이고, pH가 2.3-4.3인 조건 하에 저장된 농도-시간도이다.
도 8은 pH가 3-8인 조건 하의 pH값-분해속도도이다.
도 9는 pH가 2.3-4.3인 조건 하의 pH값-분해속도도이다.
도 10은 pH가 2.3-8인 조건 하의 pH값-분해속도도이다.
도 11은 pH값- 보존기한 T(90)도이다.
도 12는 pH가 3-8이고, 40℃의 조건 하에 77h 동안 저장한 크로마토그램이다.
도 13은 pH가 2.3-3.8인 조건 하의 크로마토그램이다.
도 14는 강력하게 파괴된 용액 크로마토그램이다(위에서 아래로의 농도: 표준용액 0.255mg/mL, 20분간 H₂O₂ 첨가, 2시간 25분간 H₂O₂ 첨가, 4시간 30분간 H₂O₂ 첨가, 7시간 7분간 H₂O₂ 첨가).

본 발명은 어느 정도에 있어서 예상치 못한 뉴레귤린 폴리펩타이드의 안정성을 보장하는 특정 약물 제제의 발견을 기초로 한다. 이에 대하여, 연구는 비교적 낮은 pH값이 뉴레귤린 제제의 안정성을 현저히 높일 수 있음을 발견하였다. 비록 본 발명의 실시예에서는 임의의 유사하거나 동등한 방법을 사용할 수 있으나, 단 아래에서는 바람직한 방법 및 재료를 설명한다.

본문에 명확히 언급하지 않는 한, 본 명세서 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 단수 형식의 "하나", "일종" 및 "상기"는 상응하는 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어 "일종의 완충제"는 2종 이상의 완충제의 혼합물을 포함하며, 이와 같이 유추할 수 있다.

용어 "약"은 특히 하나의 특정한 양과 관련되며, 플러스 마이너스 편차가 10% 이내인 양을 가리킨다.

본문에서 명확히 언급하지 않는 한, 본 명세서 및 첨부되는 청구항 중 사용되는 단수 형식의 "하나", "일종" 및 "상기"는 상응하는 복수의 지시대상을 포함하며, 또한 "적어도 하나" 또는 "하나 또는 하나 이상의"는 서로 호환 사용될 수 있다.

여기에 사용되는 용어인 "포함(comprises)", "포함(Comprising)", "포함(includes)", "포함(including)", "함유(contains)", "함유(containing)" 및 임의의 변형체는 비독점적인 포함물을 포괄하고자 하는데 있으며, 예를 들어 하나의 원소 또는 하나의 리스트의 원소를 포함하거나 함유하는 과정, 방법, 가공제품 또는 물질의 조성물은 그러한 원소들을 포함할 뿐만 아니라 상기 과정, 방법, 가공제품 또는 물질의 조성물이 명확히 열거되지 않은 고유한 기타 원소를 더 포함할 가능성이 있다.

여기에 사용되는 용어인 "폴리펩타이드"란 아미노산 잔기, 구조적 이형체, 관련된 자연적으로 발생되는 구조적 변이체, 및 합성된 비자연적으로 발생된 유사물이 펩타이드 사슬을 통해 연결되어 구성된 중합체를 말한다. 폴리펩타이드의 합성은 자동 폴리펩타이드 합성기를 통해 제조될 수 있다. 용어 "단백질"은 통상적으로 비교적 큰 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "펩타이드"는 통상적으로 비교적 짧은 폴리펩타이드를 지칭한다.

본문에서 명확히 언급하지 않는 한, 여기서 사용되는 "단백질"은 "폴리펩타이드", "펩타이드"와 동등하다.

여기에 사용되는 폴리펩타이드의 "프래그먼트"란 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질 중 전장 폴리펩타이드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 부분을 가리킨다.

여기에 사용되는 용어 "유사물"이란 구조가 대체로 동일하고, 동일한 생물 활성을 지니나 상이한 정도의 활성을 갖는 임의의 2개 이상의 폴리펩타이드, 또는 전체 분자 또는 그 중의 프래그먼트를 가리킨다. 하나 또는 복수의 아미노산의 기타 아미노산에 대하여 대체, 삭제, 삽입 및/또는 첨가된 하나 또는 복수의 돌연변이를 바탕으로 한 유사물의 아미노산 서열의 구성은 상이하다. 교체된 아미노산 및 이를 교체한 아미노산 사이의 물리화학 또는 기능적인 관련성을 기초로 한 대체는 보수적이거나 또는 비보수적인 것일 수 있다.

여기에 사용되는 "변이체"란 폴리펩타이드, 단백질 또는 그 유사물이 기타 통상적으로 상기 분자의 일부분이 아닌 화학적 부분을 포함하도록 수식되는 것을 가리킨다. 이러한 부분들은 분자의 용해도, 흡수성, 생물 반감기 등등을 조절할 수 있다. 또는 이러한 부분들은 분자의 독성을 저하시키고 분자의 임의의 원치 않는 부작용 등을 제거하거나 또는 경감시킬 수 있다. 이러한 효과에 개입하기에 적합한 부분은 Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)에 이미 공개되어 있다. 이러한 부분을 분자에 커플링하는 공정은 본 분야에 이미 공지된 것이다. 예를 들어, 한편으로 변이체는 단백질에 더욱 긴 체내 반감기를 부여하는 화학 수식을 갖는 혈액 응고 인자이나, 단 이에 국한되지 않는다. 다른 한편으로는, 폴리펩타이드는 글리코실화, 페길레이션(pegylation)화 및/또는 폴리시알릴레이션(polysialylation)화를 통해 수식된다.

프래그먼트, 변이체와 유사물이 인코딩된 폴리뉴클레오타이드는 본 분야의 기술자가 자연적으로 생성되는 분자와 동일하거나 유사한 생물 활성을 지닌 자연적으로 생성되는 분자의 생물학적 활성 프래그먼트, 변이체 또는 유사물을 인코딩하여 용이하게 생성할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, 분자를 인코딩하는 DNA의 소화/연결 등을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 특이자리 돌연변이를 포함하되 단 이에 국한되지 않는 본 기술 분야의 임의의 공지의 방법을 통하여, 본 분야의 기술자라면 DNA 사슬 중 단일한 염기의 변화를 발생시켜 변경된 코돈과 과오 돌연변이를 획득할 수 있다. 여기에서 사용되는 용어 "적당히 엄격한 잡종형성 조건"이란, 예를 들어 42℃하에 50%의 포름아미드에서 하이브리다이즈하고 60℃하에 0.1×SSC, 0.1%의 SDS에서 세척하는 것을 말한다. 본 분야의 기술자라면 하이브리다이즈할 서열의 길이 및 그 중 GC 뉴클레오타이드기의 함량을 바탕으로, 이러한 조건에 변화가 발생할 수 있음을 이해하여야 할 것이다. 본 기술분야의 규칙 표준은 정확한 잡종형성 조건을 결정하는데 사용되기에 적합하다. Sambrook 등, 《분자 클로닝》, 9.47-9.51절(Cold Spring Harbor 실험실 출판사, Cold Spring Harbor, 뉴욕, 1989)을 참조한다.

여기에 사용되는 "심부전"이란 심장 기능의 이상을 말하며, 이러한 경우, 심장이 조직 대사의 요구대로 혈액을 공급할 수 없다. 심부전은 다양한 질병 상태, 예를 들어 충혈성 심부전, 심근경색, 빈맥성 부정맥, 가족성 비후성 심근증, 허혈성 심장병, 특발성 심근병 및 심근염 등을 포함한다. 심부전은 다양한 요인에 의해 유발되며, 허혈성, 선천성, 류마티즘성, 바이러스성, 독성 또는 특발성 심부전을 포함하나, 단 이에 국한되지 않는다. 만성 심장 비대는 일종의 현저한 충혈성 심부전 전기의 질병 상태로서, 심장 정지를 일으킬 수 있다. 여기에서 사용되는 "뉴레귤린" 또는 "NRG"란 ErbB2, ErbB3, ErbB4 또는 그 호모다이머 또는 헤테로다이머를 결합 및 활성화시킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭하며, 뉴레귤린의 이형체, 뉴레귤린 중의 EGF 유사 기능 영역, 뉴레귤린 EGF 유사 기능 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 뉴레귤린의 돌연변이체 또는 유전체 및 기타 상기 수용체를 활성화시킬 수 있는 뉴레귤린 유사 유전자 생성물을 포함한다. 뉴레귤린은 NRG-1, NRG-2, NRG-3 및 NRG-4 단백질, 폴리펩타이드, 프래그먼트 및 NRG 유사 기능을 갖는 복합물을 더 포함한다. 본 발명에서 사용되는 뉴레귤린은 골격근 세포 합성 아세틸콜린 수용체를 자극하며; 심근세포의 분화, 생존 및 DNA 합성을 촉진하는 등과 같이 상기 수용체를 활성화시키고 이들의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 뉴레귤린은 이러한 생물학적 기능에 실질적인 영향을 미치지 않는 보수적인 돌연변이의 신경조절 단백질 돌연변이체를 더 포함한다. 본 분야의 기술자라면 적합한 아미노산의 보수적인 교체가 단백질의 생물 활성에 영향을 미치지 않음을 숙지한다. 본 분야의 보통 기술자라면, 비핵심영역의 단일한 아미노산의 돌연변이는 일반적으로 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 기능의 변화를 일으키지 않음을 숙지한다(Watson 등, Molecular BZiology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub.co., p.224 참조). 바람직하게는, 뉴레귤린은 ErbB2/ ErbB4 또는 ErbB2/ ErbB3의 헤테로다이머를 결합 및 활성화시킬 수 있는 단백질 또는 펩타이드이다. 제한하기 위한 목적이 아닌 예로서, 본 발명의 뉴레귤린은 NRG-1 β2 이형체의 하나의 프레그먼트, 즉 177-237자리의 아미노산 프래그먼트이며, 그 중 EGF 유사 기능영역을 포함한다. 상기 프래그먼트의 아미노산 서열은 다음과 같다: SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKC PNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ (SEQ ID NO:2).

여기에 사용되는 "표피생장인자 유사 기능영역" 또는 "EGF 유사 기능 영역"이란 신경조절 단백질 유전자에 의해 인코딩된 ErbB2, ErbB3, ErbB4 또는 그의 헤테로다이머 또는 호모다이머를 결합 및 활성화시킬 수 있는 폴리펩타이드 프래그먼트를 말하며, 또한 하기의 참고문헌 중 묘사된 EGF 수용체 결합 영역과 구조적인 유사성을 갖는다: WO 00/64400; Holmes 등, Science, 256:1205-1210(1992); 미국 특허 5,520,109 및 5,716,930; Hijazi 등, Int.J.Oncol., 13:1061-1067(1998); Chang 등, Nature, 387:509-512(1997); Carraway 등, Nature, 387:512-516(1997); Higashiyama 등, J.Biochem., 122:675-680(1997); 및 WO97/09425. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능영역은 ErbB2/ErbB4 또는 ErbB2/ErbB3 헤테로다이머를 결합 및 활성화시킨다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능영역은 NRG-1의 수용체 결합 영역 아미노산을 포함한다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능 영역이란 NRG-1의 177-226번째 자리, 177-237번째 자리 또는 177-240번째 자리의 아미노산을 지칭한다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능 영역은 NRG-2의 수용체 결합 영역의 아미노산을 포함한다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능 영역은 NRG-3의 수용체 결합 영역의 아미노산을 포함한다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능 영역은 NRG-4의 수용체 결합 영역의 아미노산을 포함한다. 모종의 실시방안에서, EGF 유사 기능 영역은 미국 특허 5,834,229에 설명된 아미노산 서열: Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro을 포함한다.

본 발명은 고도로 안정적인 약물 조성물을 생성할 수 있는 뉴레귤린 제제를 제공한다. 상기 안정적인 약물 조성물은 심부전 환자 또는 심부전의 위험이 있는 환자를 치료하는 치료제로 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명이 제공하는 뉴레귤린의 약물 제제는 (a) 뉴레귤린 폴리펩타이드와; (b) 일종 또는 다종의 완충제를 포함한다. 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드는 a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; b) 뉴레귤린의 EGF 유사 영역을 포함하는 폴리펩타이드; c) a)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; d) SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드; e) d)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; f) 적당히 엄격한 잡종형성 조건에서 SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리다이즈된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드로부터 선택된다. 뉴레귤린 폴리펩타이드 또는 단백질의 농도 범위는 약 0.01g/L-1g/L이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 상기 농도 범위는 약 0.01g/L-0.8g/L, 0.01g/L-0.6g/L, 0.01g/L-0.4g/L, 0.01g/L-0.2g/L이다. 또한 약간의 실시예에서, 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드의 농도는 약 1.0g/L, 약 0.90g/L, 약 0.80g/L, 약 0.70g/L, 약 0.60g/L, 약 0.50g/L, 약 0.45g/L, 약 0.40g/L, 약 0.35g/L, 약 0.30g/L, 약 0.25g/L, 약 0.20g/L, 약 0.15g/L, 약 0.10g/L, 약 0.05g/L 또는 더욱 낮은 농도이다.

일 바람직한 실시예에서, 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드의 농도는 약 0.25g/L이다. 완충제는 농도 범위가 0.1mM-500mM인 pH 완충제이며, 상기 pH값의 범위는 약 2.0-12.0이다. 완충제는 시트르산염, 인산염, 아세트산염, 히스티딘, 글리신, 중탄산염, HEPES, Tris, 묽은 염산, 묽은 수산화나트륨 용액 또는 이상의 물질의 조성물로부터 선택된다. 약간의 바람직한 실시예에서, pH값의 범위는 약 3.0-10.0, 약 3.0-7.0, 약 2.3-3.8이다. 약간의 실시예에서, pH값은 약 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.33, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 약 4.0. 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 약 6.0이다. 일 바람직한 실시예에서, 완충제는 인산염이고, pH값은 약 6이다. 일 바람직한 실시예에서, 완충제는 인산염이고, pH값은 약 3-4이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 완충제는 인산염이고, pH값은 약 3.4이다.

일 특정 실시예에서, 뉴레귤린 제제는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2인 뉴레귤린 폴리펩타이드를 포함하며, 인산염이 완충제이고, pH값은 약 6.0이다. 일 특정실시예에서, 뉴레귤린 제제는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2인 뉴레귤린 폴리펩타이드를 포함하며, 인산염이 완충제이고, pH값은 약 3.4이다.

또 다른 일 실시예에서, 안정적인 뉴레귤린 제제는 (a) 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드; (b) 일종 또는 다종의 완충제; (c) 일종 또는 다종의 안정제를 포함한다. 안정제는 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 수크로오스, 트레할로오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 라피노오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노오스, 글루코사민, 프룩토오스, 인간 혈청 알부민 및/또는 이상의 물질들의 조성물로부터 선택된다. 안정제의 농도는 약 0.1g/L-200g/L이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 안정제는 농도가 약 50g/L인 만니톨이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 안정제는 농도가 약 2g/L-8g/L인 인간 혈청 알부민이다.

일 특정 실시예에서, 뉴레귤린 제제는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:2인 뉴레귤린 폴리펩타이드를 포함하며, 농도가 약 10mM인 인산염이 완충제이고, pH값은 약 6.0이며, 안정제는 농도가 약 2g/L인 인간 혈청 알부민이다.

또 다른 일 실시예에서, 안정적인 뉴레귤린 제제는 (a) 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드; (b) 일종 또는 다종의 완충제; (c) 인간 혈청 알부민, 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이상의 물질의 조합에서 선택되는 일종 또는 다종의 부형제를 포함한다. 일종 또는 다종의 부형제 농도는 약 0.1g/L-200g/L이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 부형제는 농도가 약 2g/L-8g/L인 인간 혈청 알부민이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 부형제는 농도가 50g/L인 만니톨이다.

또 다른 일 실시예에서, 안정적인 뉴레귤린 제제는 (a) 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드; (b) 일종 또는 다종의 완충제; (c) 일종 또는 다종의 안정제 및 (d) 일종 또는 다종의 부형제를 포함한다. 약간의 바람직한 실시예에서, 안정제는 인간 혈청 알부민이다. 약간의 바람직한 실시예에서, 부형제는 만니톨이다.

또 다른 일 실시예에서, 안정적인 뉴레귤린 제제는 (a) 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드; (b) 일종 또는 다종의 완충제; (c) 일종 또는 다종의 안정제; (d) 일종 또는 다종의 부형제 및 (e) 일종 또는 다종의 염을 포함한다.

약간의 실시예에서, 본 발명의 상기 제제는 상기 임의의 제제에 부형제를 첨가한 후 동결건조시켜 형성된 동결건조 약물 제제이다. 약간의 실시예에서, 부형제는 인간 혈청 알부민, 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이상의 물질의 조합으로부터 선택된다. 일 특정 실시예에서, 부형제는 만니톨이다.

또 다른 일 실시예에서, 동결건조된 뉴레귤린 제제는 (a) 뉴레귤린 단백질 또는 폴리펩타이드; (b) 일종 또는 다종의 완충제; (c) 일종 또는 다종의 안정제; (d) 일종 또는 다종의 부형제 및 (e) 일종 또는 다종의 염을 포함하며; 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후 (a)의 농도는 약 0.1g/L-200g/L이고; (b)의 농도는 약 0.1mM-500nM이면서 또한 pH값은 약은 3-7이며; (c)의 농도는 약 0.1g/L-200g/L이고; (d)의 농도는 약 0.1g/L-200g/L이며; (e)의 농도는 약 100mM-500mM이다.

일 특정 실시예에서, 본 발명의 상기 동결건조 약물 제제는 (a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드; (b) 인산염으로서의 완충제; (c) 부형제로서의 만니톨; (d) 안정제로서의 인간 혈청 알부민 및 (e) 염으로서의 염화나트륨을 포함하며, 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후 (a)의 농도는 약 0.25g/L이고; (b)의 농도는 약 10nM이면서 또한 pH값은 약은 6이며; (c)의 농도는 약 50g/L이고; (d)의 농도는 약 2g/L이며; (e)의 농도는 약 150mM이다.

동결건조

한편으로는, 본 발명인 NRG 폴리펩타이드를 포함하는 제제는 동결건조에 의해 약물 제제로 제조될 수 있다. 본 분야에서 통용되는 기술을 사용하여 동결건조를 실시하며, 또한 개발된 조성물은 최적화가 이루어져야 한다[Tang 등, Pharm Res.21:191-200, (2004) 및 Chang 등, Pharm Res.13: 243-9(1996)].

한편으로, 동결건조 주기는 냉동, 1차 건조 및 2차 건조의 3단계로 구성된다[APMackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167(1977)]. 냉동 단계에서, 용액이 냉각되어 얼음의 형성을 개시한다. 또한, 이 단계는 충전제의 결정화를 유발한다. 진공과 열에너지 도입을 통해 승화를 촉진시키고, 챔버 내의 압력을 빙점 증기압 이하로 강하시켜 얼음의 초기 건조 단계에서의 승화를 실시한다. 마지막으로, 2차 건조단계에서, 저하된 챔버 내의 압력과 상승한 저장 온도하에 흡착 또는 결합된 물을 제거한다. 이 과정에서 동결건조 케이크라고 칭하는 재료가 생성된다. 이후, 동결건조 케이크는 무균수 또는 적합한 주사용 희석제를 사용하여 재조제될 수 있다.

동결건조 주기는 부형제의 최종 물리 상태를 결정할 뿐만 아니라, 조제 시간, 외관, 안정성 및 최종 수분함량과 같은 기타 파라미터에도 더 영향을 미친다. 조성물의 동결건조 상태하의 구조는 몇 차례의 특정 온도하에 발생되는 전이(예를 들어 유리 전이, 윤습 및 결정화)를 거치며, 상기 구조는 동결건조 공정을 이해 및 최적화하는데 사용될 수 있다. 유리 전이 온도(Tg 및/또는 Tg')는 용질의 물리 상태에 관한 정보를 제공할 수 있으며, 또한 시차 주사 열량 측정법(DSC)을 통해 결정될 수 있다. Tg와 Tg'는 동결건조 주기 설계에서 반드시 고려해야 할 중요 파라미터이다. 예를 들어, Tg'는 일차 건조에 매우 중요하다. 또한, 건조 상태에서, 유리전이 온도는 최종 제품의 저장온도 정보를 제공한다.

완충액과 완충제

여기에서 말하는 "완충액" 또는 "완충제"는 용액의 허용 가능한 pH값 범위를 2.0-9.0로 유지시킬 수 있는 물질 또는 조성물을 포함한다. 적당한 완충제는 기타 원료와 화학 반응을 일으키지 않으며, 또한 필요한 pH 완충 작용을 일으킬 수 있다.

약리 활성 단백질 제제의 안정성은 통상적으로 하나의 협소한 pH값 범위 내에서 최대로 관찰된다. 이러한 안정성의 최적의 pH 범위는 사전제제(pre-formulation) 연구에서 결정되어야 한다. 예를 들어 가속 안정성 연구 및 열량측정 선별 연구와 같은 몇 가지 방법은 이러한 시도에 유용하다(Remmele R.L.Jr., et al., Biochemistry, 38(16):5241-7(1999)). 일단 제제가 결정되면, 단백질은 반드시 그 저장기한 내에 생성 및 유지되어야 한다. 따라서, 완충제는 거의 항상 제제의 pH값을 제어하는데 사용된다.

완충 체계의 완충 능력은 pH가 pKa값과 같을 때 최대이며, 또한 pH값이 상승 또는 저하됨에 따라 저하된다. 만약 pH값과 pKa의 차가 1개의 유닛 이내라면, 90퍼센트의 완충 능력이 있는 것이다. 완충 능력은 또한 완충액 농도가 증가에 비례하여 증가한다.

완충제 선택 시 몇 가지 요소를 고려해야 한다. 첫 번째이자 가장 중요한 요소는, pKa 및 필요한 제제의 pH를 근거로 완충 체계 및 그 농도를 결정해야 한다는 점이다. 마찬가지로 중요한 것은 상기 완충 체계가 단백질 및 기타 제형의 부형제와 친화적이면서, 어떠한 분해 반응도 촉진시키지 않아야 한다는 점이다. 예를 들어, 공지의 시트르산염은 주사 시 자통(stinging)을 유발할 수 있다(Laursen T, etal., Basic Clin Pharmacol Toxicaol., 98(2):218-21(2006)). 피하(SC) 또는 근육내 주사(IM) 경로를 통해 투여되는 약물의 경우, 자통과 자극의 가능성이 더욱 클 수 있으며, 정맥 주사(IV) 경로와 비교하여 이러한 경로 중의 약물 용액은 투약 부위에 비교적 장시간 동안 머무를 수 있으며, IV 경로 중의 제제는 투약 후 신속하게 혈액 내로 희석될 수 있다. 직접 정맥 주입 투여되는 제제의 경우, 완충제(및 임의의 기타 제제 성분)의 총량을 감시해야 한다. 인산칼륨 형식으로 사용되는 칼륨이온의 경우 특히 조심해야 하는데, 이는 환자의 심혈관 효과를 유발할 수 있기 때문이다(Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam.Physician., 73(2):283-90(2006)).

동결건조 제제에 사용되는 완충제는 별도로 고려해야 한다. 아세트산 및 이미다졸과 같은 약간의 통상적인 완충제는 동결건조 과정에서 승화 또는 증발됨으로써 동결건조 중 또는 재조제 후 제제의 pH값을 변경시킬 가능성이 있다.

조성물 중 나타나는 완충 체계는 생리학적 겸용성을 지니고 희망하는 약물 제제의 pH값을 유지하는 것으로 선택된다. 일 실시예에서, 용액의 pH값은 pH 2.0과 pH값 12.0 사이이다. 예를 들어, 용액의 pH값은 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11.0, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4, 11.5, 11.6, 11.7, 11.8, 11.9, 또는 12.0일 수 있다.

pH 완충성 화합물의 존재는 제제의 pH를 기설정 수준으로 유지시킬 수 있는 임의의 적당한 양일 수 있다. 일 실시예에서, pH값의 완충 농도는 약 0.1mM과 500mM 사이이다. 예를 들어 고려되는 pH 완충제는 적어도 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 또는 500 mM이다.

본문에 나열된 제제를 완충시키기 위한 pH 완충제는 유기산, 글리신, 히스티딘, 그루타민산, 호박산염, 인산염, 아세트산염, 시트르산염, Tris, HEPES 및, 이하 아미노산 또는 아미노산 혼합물: 아스파르트산염, 히스티딘과 글리신을 포함하되 단 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서, 완충제는 인산염이다.

안정제와 충전제

본 발명의 약물 제제의 일 방면에서, 저장으로 인한 응집과 화학적 분해를 방지 및 감소시키기 위하여 안정제(또는 안정제의 조합)를 첨가한다. 재조제 후의 모호하거나 혼탁한 용액은 단백질에 침전이 발생했거나 또는 적어도 응집이 발생하였음을 나타낸다. 용어 "안정제"란 수용액 중 화학적 분해(예를 들어 자가용해, 탈아미드화, 산화 등)를 포함하는 응집 또는 물리적 분해를 방지할 수 있는 부형제를 가리킨다. 고려되는 안정제는 수크로오스, 트레할로스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 라피노오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노오스, 글루코사민, 프룩토오스, 만니톨, 솔비톨, 글리신, 아르기닌 HCL, 이하 폴리하이드록시 화합물: 포도당, 전분, 하이드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, N-메틸 피롤리덴, 셀룰로오스와 히알루론산과 같은 다당을 포함하되, 단 이에 국한되지 않는다[Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)]. 본 발명의 제제 중, 포함되는 안정제의 농도는 약 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 200 g/L이다. 본 발명의 일 실시예에서, 만니톨이 안정제로 사용된다.

필요하다면, 제제는 적량의 충전제와 삼투압 조절제를 더 포함한다. 충전제는 예를 들어 만니톨, 글리신, 수크로오스 및, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 락토오스, 솔비톨, 트레할로스, 자일리톨과 같은 중합체를 포함하되, 단 이에 국한되지 않는다.

제제와 부형제

부형제는 약물 제품(예를 들어 단백질)에 안정성과 방출 성능을 부여하거나 강화시키는 첨가제이다. 부형제가 포함되는 원인이 무엇이든, 부형제는 제제 중 없어서는 안 될 성분이며, 따라서 안전한 것이면서 환자의 내성이 양호한 것이어야 한다. 단백질 약물의 경우, 부형제의 선택이 특히 중요한데, 이는 약물의 치료효과와 면역원성에 영향을 미치기 때문이다. 따라서, 단백질 제제는 부형제의 적절한 선택을 통해 적합한 안정성, 안전성, 시장성을 제공하도록 개발되어야 한다.

단백질 제제의 개발에 있어서 주요 도전과제는 제조, 운송 및 저장 중의 압력에 대항하기 위한 제품의 안정화이다. 제형 부형제의 역할은 이러한 압력에 대응하기 위한 안정화를 제공하는데 있다. 부형제는 또한 고농도 단백질 제제의 점도를 저하시켜 약물의 방출을 용이하게 하고 환자의 편리성을 강화시키기 위한 것이다. 일반적으로, 부형제는 각종 화학 및 물리적인 압력에 대응하여 단백질을 안정화시키는 메커니즘에 따라 분류될 수 있다. 약간의 부형제는 특정 압력의 영향을 경감시키거나 또는 특정 단백질의 특정 민감성을 조절하는데 사용된다. 기타 부형제는 단백질의 물리 및 공유결합 안정성에 대하여 보다 광범위한 영향을 미친다. 여기서 상기 부형제는 기타 화학적 유형 또는 이들의 제제 중에서의 기능에 따라 정리하였으며, 각각의 부형제 유형을 논할 때, 그 안정화 모드의 간단한 설명을 제공하였다.

본 발명의 생물 약제학적 제제를 획득하기 위하여, 임의의 특정 제제 중 생물 약제학적(예를 들어 단백질) 안정성 보유를 촉진할 수 있는 부형제의 용량 또는 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 생물 약제학적 제제 중 포함되는 염의 양과 종류는 최종 용액의 필요한 삼투압 농도(즉 등장성, 저장성 또는 고장성)와 제제 내에 포함되는 기타 성분의 양 및 삼투압 농도를 근거로 선택한다.

또한, 하나의 특정한 부형제가 몰 농도로 보고되는 경우, 본 분야의 기술자라면, 등가의 용액의 퍼센트 농도(%)w/v(예를 들어 (용액 샘플 중 물질의 그램수/용액의 밀리리터수)×100%) 역시 이미 고려된 것임을 인지할 것이다.

부형제 농도는 특정 제제 중 상호 의존적이다. 예를 들면, 단백질 농도가 비교적 높거나 또는 예를 들어 안정제 농도가 비교적 높은 경우, 충전제의 농도는 비교적 낮을 수 있다. 충전제가 없는 경우, 특정 제제의 등장성을 유지하기 위하여, 안정제의 농도는 상응하게 조정될 수 있다(즉 "장력성(tonicifying)" 용량의 안정제를 사용한다). 부형제는, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 이러한 물질의 조성물을 포함하되, 단 이에 국한되지 않는다.

염

염은 종종 제제의 이온 강도를 높이기 위하여 첨가되며, 이온 강도는 단백질의 용해도, 물리적 안정성, 등장성에 대해 매우 중요하다. 염은 각종 방식으로 단백질의 물리적 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이온은 결합되는 단백질 표면의 대전(charged) 잔기를 통해 단백질의 천연 상태를 안정화시킬 수 있다. 또한, 염은 단백질 백본(-CONH-)을 따르는 펩타이드군과의 결합을 통해 단백질의 변성 상태를 안정화시킬 수 있다. 염은 또한 하나의 단백질 분자 내의 잔기 사이의 정전기 척력의 상호작용을 차폐함으로써 단백질의 천연적 구조(native conformation)를 안정화시킬 수 있다. 단백질 제제 중의 염은 또한 단백질 분자 사이의 단백질의 응집과 불용성을 초래할 수 있는 흡인성 정전기 상호작용을 차폐할 수 있다. 제공되는 제제 중, 염의 농도는 약 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300과 500mM 사이이다.

제조 방법

본 발명은 또한 약물 제제를 제조하기 위한 방법을 더 고려하였다.

본 방법은 동결건조 전 상기 혼합물에 본문의 상기 안정제를 첨가하는 단계, 동결건조 전 상기 혼합물에 충전제, 삼투압 조절제, 및 부형제 중의 적어도 하나의 시약을 첨가하는 단계 중의 하나 이상을 더 포함하며, 그 중 각종 시약은 모두 본문에서 설명한 바와 같다.

동결건조 재료의 표준 재조제 방법은 일정 부피(통상적으로 동결건조 과정 중 제거되는 부피에 해당)의 주사용(WFI) 순수 또는 무균수를 재보충(add back)하는 것이나, 비경구적으로 투여되는 약물의 생산에 항균제의 희석 용액이 사용되기도 한다[Chen, Drug Development and Industrial P모금쵸, 18:1311-1354(1992)]. 따라서 제공되는 NRG 조성물을 재조제하기 위한 방법은 희석제를 본 발명의 동결건조 NRG 조성물에 첨가하는 단계를 포함한다.

동결건조 재료는 수용액으로 재조제될 수 있다. 각종 수성 담체는 예를 들어 무균주사용수, 다회 투여용으로 사용되는 방부제를 함유한 물, 또는 적량의 계면활성제를 포함하는 물(예를 들어 혼합물 중 활성 화합물이 함유되는 수성 현탁액, 상기 혼합물 중 수성 현탁액을 생산하기에 적합한 부형제가 함유된다)이다. 각종 실시예에서, 이러한 부형제는 현탁제이며, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 고무 및 아카시아 고무를 예로 드나, 단 이에 국한되지 않는다. 분산제 또는 습윤제는 천연적으로 발생되는 인지질로서, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸-에네옥시세타놀(heptadecaethyle-eneoxycentanol), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨에 의해 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트, 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 무수 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트를 포함하되, 단 이에 국한되지 않는다. 각종 실시예에서, 수성 현탁액은 일종 또는 다종의 방부제를 더 포함하며, 에틸벤조산, 또는 n-프로필벤조산, p-하이드록시벤조산을 예로 드나 단 이에 국한되지 않는다.

투여

한편으로는 인체 또는 실험동물에 조성물을 사용하기 위하여, 조성물에 일종 또는 다종의 약학적으로 허용 가능한 담체가 포함된다. 하기한 바와 같이, "약학" 또는 "약리학"적으로 허용 가능하다는 구문은, 본 분야의 공지의 경로로 약물을 투여 시, 분자의 실체와 조성물이 안정적이고, 생성물의 중합 및 분해와 같은 단백질의 분해를 억제할 수 있으며, 또한 알러지 또는 기타 불량반응을 발생시키지 않는 것을 말한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임상적으로 사용되며, 윗글에 공개된 시약을 포함하는 임의의 및 모든 용제, 분산매질, 코팅, 항균제와 항진균제, 등장 및 흡수지연제 등등을 포함한다. 본문에서 언급하는 "재현탁액"이란 무균이온제거수 또는 생리식염수 등 임상적으로 사용 가능하면서 알러지, 또는 기타 불량반응을 발생시키지 않는 용액을 말한다.

약물 제제는 내복, 외용, 피부 침투, 비내복(비경구투여), 흡입분무, 질, 직장, 또는 두개 내 주사를 통해 투여된다. 여기에서 사용되는 용어인 "비경구투여"는 피하주사, 정맥주사, 근육주사, 뇌지망막하 주사 또는 수액 기술을 포함한다. 또한 정맥주사, 피내, 근육, 유방내, 복강내, 척추강내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 수술을 통해 특정 부위에 이식하는 방법도 고려하였다. 일반적으로, 조성물은 기본적으로 발열인자 및 기타 수용체에 유해한 불순물을 함유하지 않는다.

조성물의 1회 또는 다회 투여는 주치의가 선택한 용량 수준과 방식에 따라 실시한다. 질병을 예방하거나 또는 치료하기 위한 적절한 용량은 위와 같이 정의된 치료될 질병의 유형, 중증 정도 및 병의 경과, 약물의 예방 또는 치료 목적 여부, 이전의 치료, 환자의 임상병력 및 약물에 대한 반응, 및 주치의의 결정에 의해 결정된다.

시약 키트

추가적인 측면에서, 본 발명은 시약 키트를 포함하며, 그 중 대상에게 약물을 투여하기 유리한 방식으로 포장된 일종 이상의 동결건조 조성물을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 시약 키트는 본문에 기술된 약물 제제(예를 들어 치료성 단백질 또는 펩타이드를 함유한 조성물)를 포함하며, 상기 제제는 밀봉된 병 또는 용기와 같은 일종의 용기에 포장된다. 상기 시약 키트는 또한 용기에 부착되거나 또는 포장 내에 삽입되는 라벨을 더 구비하며, 이는 상기 방법을 실시 시 화합물 또는 조성물의 구체적인 사용을 설명한다. 일 실시예에서, 상기 시약 키트는 치료성 단백질 또는 펩타이드 조성물이 담긴 제1 용기 및 조성물에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 재조제 용액이 담긴 제2 용기를 포함한다. 일 측면에서, 약물 제제는 단위용량의 형식으로 포장된다. 상기 시약 키트는 또한 특정 투여 경로에 따라 상기 약물 제제를 투여하는데 적용되는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 시약 키트에 상기 약물 제제의 사용을 소개하는 라벨이 포함되는 것이 바람직하다.

용량

각종 요인, 예를 들어 연령, 건강상태, 체중, 성별 및 환자의 식이, 감염의 중증 정도, 투약 시간 및 기타 임상요소와 같은 요인이 약물의 작용에 영향을 미칠 수 있음을 고려하여, 본문의 상기 질병 치료 방법에서 다루는 용량 방안은 주치의가 결정한다.

별도로 정의하지 않는 한, 여기에서 사용되는 모든 과학기술용어는 본 발명의 소속 기술분야의 보통 기술자가 이해하는 의미와 동일하다. 모든 특허 문헌, 특허 출원문헌, 공개된 특허 문헌 및 기타 출판물은 모두 참고용이다. 본 절에서 설명하는 정의가 상기 참고문헌의 정의와 일치하지 않거나 또는 반대인 경우, 본 절에서 설명하는 정의를 기준으로 한다.

이상의 설명으로 알 수 있듯이, 상이한 변화 및 수식은 본 발명에 상이한 용법과 조건을 발생시킬 수 있다. 이러한 실시예는 이하 청구항의 범위 내에 포함된다.

본문 중 일련의 요소 리스트를 사용하여 정의된 변수는 상기 변수에 열거된 요소 중의 어느 하나의 원소 또는 조합(또는 변형)의 정의를 포함한다. 여기서의 실시예의 기재는 임의의 단일한 실시방안 또는 임의의 기타 실시방안 또는 일부와의 조합으로써의 상기 실시방안을 포함한다.

본 명세서 중의 모든 특허 및 출판물은 참고용으로 인용되며, 그 참고정도는 각 편의 참고문헌이 단독 및 구체적으로 참고용으로 설명에 인용되는 정도와 같다.

이하 실시예는 단지 본 발명의 구체적인 실시예의 예시일뿐, 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예

이하 실시예는 단지 본 발명을 예를 들어 설명하기 위한 것일뿐, 임의의 방식으로 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본문의 실시예 중 "재조합 인간 뉴레귤린-1(rhNRG-1)"은 아미노산 서열이 SEQ IN NO:2인 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.

실시예 1: rhNRG -1의 pH-안정성 분석

1. 실험 목표

1.1 SDS-PAGE법으로 rhNRG-1의 pH값이 다른 완충액 중(pH3-10)에서의 안정성을 검출하고, pH-안정성 곡선을 제작한다.

1.2 RP-HPLC법으로 rhNRG-1의 pH값이 다른 완충액(pH3-8) 및 이온제거수 중에서의 안정성을 검출하고, pH-안정성 곡선을 제작한다.

1.3 목표 1.2의 발견에 따라, 정밀한 pH 범위(pH2.3-4.3) 내의 pH-안정성 곡선을 결정한다.

1.4 정밀한 pH 안정성 연구에 따라, rhNRG-1 제제의 최적의 pH값을 결정한다.

2. 실험 단계

2.1 RP-HPLC법에 의한 rhNRG-1 원료 약의 순도 구축

상기 방법의 조건

HPLC 시스템	Agilent 1050
크로마토그래피 컬럼	Phenomenex Jupiter, 5㎛ 4.6 x 250 mm, 5㎛, 300 Å (PN 00G-4167-E0)
유동상 (MP)	유동상 A: 0.1%의 TFA를 함유한 아세토니트릴 유동상 B: 0.1%의 TFA를 함유한 물(2종 유동상은 모두 0.45㎛의 필터로 여과하고 탈기한다)
경사도	시간 (min)	% 유동상 A	% 유동상 B
	0	0	100
	10	20	80
	40	32	68
	45	100	0
	50	0	100
	60	0	100
유속	1.0 mL/min
파장 검출	자외선 (UV): 214 nm
컬럼 온도	30℃
샘플 온도	5℃
주입 용량	80 ㎕
운행 시간	60 min
HPLC 표준액과 샘플 희석액 ("희석액")	이온제거수

배치(batch) 번호가 201204001이고, 1.24mg/mL의 rhNRG-1, 20mM의 인산염 완충액 및 0.5M의 NaCl을 함유하며, pH가 5.5("원액")인 rhNRG-1는 HPLC 분석 중의 표준 용액을 제조하는데 사용되었다.

도 1은 rhNRG-1 희석액과 0.25mg/mL 표준 용액의 전형적인 크로마토그램(각각 상부와 하부에 위치)이다.

0.25mg/mL의 표준 용액을 6회 주입한 검증 방법의 정확성

STD 0.25 mg/mL	피크 면적
Inj #1	9929
Inj #2	9901
Inj #3	9819
Inj #4	9924
Inj #5	9781
Inj #6	9663
평균값	9874
상대표준편차*	0.4

* 피크면적의 상대표준편차는 0.4로 2.0보다 작으며, 정확도는 허용 표준 범위 이내이다.

2.2 pH3-10의 완충용액 제조

15mL의 플라스틱 시험관에 원액과 이온제거수 또는 신규 완충액을 투입하고, 0.25mg/mL의 rhNRG-1, 10mM의 신규 완충액, 4mM의 인산염(원액으로부터 공급) 및 0.1M의 NaCl(원액으로부터 공급)을 함유한 용액으로 혼합한다.

최종 pH값과 신규 완충용액

pH (최초)	신규 완충액
3.19	인산나트륨
4.17	아세트산나트륨
5.08	아세트산나트륨
5.47	히스티딘
6.02	시트르산나트륨
7.00	인산나트륨
8.07	탄산수소나트륨
9.02	글리신과 수산화나트륨 희석액
10.05	글리신과 수산화나트륨 희석액
5.63	신규 완충용액 미투입, pH 미조절

각종 용액을 유리병에 밀봉하여 보관하는 상황

보관 온도	# 병 수량
2-8℃	2
40℃	3
60℃	3

2.3 SDS-PAGE법에 의한 순도 검출

40℃의 온도하에 10일 동안 보관하고, SDS-PAGE법으로 순도를 검출하였다. 45%의 물, 45%의 메탄올, 10%의 아세트산으로 조제한 용액으로 탈색하고, 0.1%의 Coomasic Blue로 염색하였다. 전기영동 겔(running gel)(12%-15%)은 상이한 폴리펩타이드를 불연속 밴드로 분리하기 위한 것이다.

2.4 역상-고효율 액상 크로마토그래피법(RP-HPLC)에 의한 용액 검출

60℃의 온도하에 보관하되, 시간점 0, 7.5, 24, 48, 65 및 77 시간에 각각 150㎕의 용액을 취하여, HPLC로 검출하였다.

40℃의 온도하에 보관하되, 시간점 28.5, 49 및 77 시간에 각각 150㎕의 용액을 취하여, HPLC로 검출하였다.

정밀한 pH(pH 2.3-4.3) 범위 연구의 준비:

15mL의 플라스틱 시험관에 원료약과 이온제거수 또는 신규 완충액을 투입하고, 0.25mg/mL의 rhNRG-1, 4mM의 인산염(원액으로부터 공급) 및 0.1M의 NaCl(원액으로부터 공급)을 함유하도록 혼합한 다음, 희석된 HCl로 pH값을 하향 조절하여, 순차적으로 4.29, 3.90, 3.78, 3.47, 3.36, 3.17, 3.02, 2.85, 2.58, 2.37 및 2.33에 이르도록 한다. 일단 첫 번째 pH값에 도달하면, 8mL의 용액을 다른 플라스틱 시험관으로 옮기고, 계속 다음 pH값까지 적정하며, 각각의 pH값마다 8mL의 용액을 남긴다. 각각의 pH값의 용액을 5부로 나누어 유리병에 담고, 각각 2-8, 25, 40, 50 및 60℃ 조건하에 방치한다.

60℃ 온도하에 보관하되, 0, 3.7, 4.7 및 5.7일 후 각각 200 ㎕의 용액을 취하여 HPLC로 검출한다.

50℃ 온도하에 보관하되, 0, 4.7 및 11일 후 각각 200 ㎕의 용액을 취하여 HPLC로 검출한다.

40℃ 온도하에 보관하되, 0, 5.7, 7 및 11일 후 각각 200 ㎕의 용액을 취하여 HPLC로 검출한다.

각각의 온도하에서 하나의 정밀한 범위의 pH-안정성 곡선을 구축한다.

아레니우스 방정식에 따라 5℃에서의 품질보존기한을 예측한다.

3. 결과 및 결론

도 2는 pH가 3-10인 전형적인 크로마토그램이다.

rhNRG-1의 최초 농도와 강력하게 파괴된 후의 용액 농도는 역상 HPLC법으로 검출하였으며, 하기 표와 같다.

40℃, pH가 3-8인 조건하에서의 결과

pH	최초농도 (mg/mL)	28.5 시간 (최초농도 점유 퍼센트)	49 시간 (최초농도 점유 퍼센트)	77 시간 (최초농도 점유 퍼센트)
3.19	0.241	97	97	96
4.17	0.247	97	97	93
5.08	0.242	94	94	86
6.02	0.251	94	94	86
7.00	0.251	92	87	82
8.07	0.253	89	83	68
5.63	0.251	92	91	38

60℃, pH가 3-8인 조건하에서의 결과

pH	최초농도 (mg/mL)	7.5 시간 (최초농도 점유 퍼센트)	24 시간 (최초농도 점유 퍼센트)	48 hr (최초농도 점유 퍼센트)	65 시간 (최초농도 점유 퍼센트)	77 시간 (최초농도 점유 퍼센트)
3.19	0.241	98	93	89	82	72
4.17	0.247	99	93	91	84	78
5.08	0.242	98	92	93	82	82
5.47	0.248	95	92	86	79	79
6.02	0.251	95	88	85	72	72
7.00	0.251	90	76	65	NT	NT
8.07	0.253	68	4	NT	NT	NT
5.63	0.251	95	84	82	69	64

NT: 검출되지 않았음(Not Tested)

40℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서의 결과

pH	최초농도(mg/mL)	5.7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	11 일 (최초농도 점유 퍼센트)
4.29	0.235	40℃, pH 3.8 조건하에서, 모든 크로마토그램은 피크가 공동 용리(co-eluted)되어, 단일한 피크를 분리할 수 없음을 나타낸다.
3.90	0.230	101	96	88
3.36	0.230	101	97	90
3.02	0.236	99	94	88
2.58	0.238	96	89	83
2.37	0.241	90	83	77

50℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서의 결과

pH	최초농도 (mg/mL)	5.7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	11 일 (최초농도 점유 퍼센트)
4.29	0.235	100	NA	78
3.90	0.230	102	88	79
3.36	0.230	99	85	76
3.02	0.236	95	79	70
2.58	0.238	90	54	35
2.37	0.241	82	53	36

NA: 데이터 없음(Not available)

60℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서의 결과

pH	최초농도(mg/mL)	3.7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	4.7 일 (최초농도 점유 퍼센트)	5.7 일 (최초농도 점유 퍼센트)
4.29	0.235	80	NA	72
3.90	0.230	83	81	73
3.36	0.230	77	69	63
3.02	0.236	70	68	0
2.58	0.238	62	60	55
2.37	0.241	55	57	43

NA: 데이터 없음(Not available)

도 3은 40℃, pH가 3-8인 조건하에서의 농도-시간 곡선이다.

도 4는 40℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서의 농도-시간 곡선이다.

도 5는 50℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서의 농도-시간 곡선이다.

도 6은 60℃, pH가 3-8인 조건하에서의 농도-시간 곡선이다.

도 7은 60℃, pH가 2.3-4.3인 조건하에서 보관된 농도-시간 곡선이다.

각각의 농도-시간 곡선은 모두 선형 회귀 방정식에 부합되어야 하며, 분해가 0차 동력학 규칙(zero order kinetics)을 따른다고 가정하면, 선형 회귀 방정식의 기울기는 분해 속도를 나타낸다(mg/mL/hr).

도 8은 pH가 3-8인 조건하에서 pH-분해 속도(기울기) 곡선이다.

도 9는 pH가 2.3-4.3인 조건하에서 pH-분해 속도(기울기) 곡선이다.

도 10은 pH가 2.3-8인 조건하에서 pH-분해 속도(기울기) 곡선이다.

표 10은 상이한 pH값(3-8) 및 온도하에서, 추산된 분해속도와 T90(초기 농도의 10% 또는 0.025mg/mL를 분해하는데 소요되는 시간)이다.

pH	40℃		60℃
pH	분해속도 (mg/mL/hr)	T90 (일)	분해 속도 (mg/mL/hr)	T90 (일)
3.19	0.0001	10.4	0.0006	1.7
4.17	0.0002	5.2	0.0006	1.7
5.08	0.0004	2.6	0.0006	1.7
5.47	-	-	0.0007	1.5
6.02	0.0004	2.6	0.0009	1.2
7.00	0.0006	1.7	0.0015	0.7
8.07	0.001	1.0	0.0061	0.2
5.63	0.0019	0.5	0.001	1.0

pH(2.3-3.9), 온도가 40, 50 및 60℃일 때의 데이터를 이용하여, 아레니우스 방정식을 통해 5℃일 때 상이한 pH값에서의 저장 시간을 예측한다. 아레니우스 방정식을 통해 산출된 T90값은 하기 표와 같다(표 11):

pH	T90 (일)	T90 (월)
2.37	166	6
2.58	317	11
3.02	612	20
3.36	1092	36
3.90	239	8

도 11은 pH값-예측 보존기한 T(90)을 도시한 것이다.

도 12는 pH가 3-8이고, 40℃의 조건하에 77시간 동안 보관 시의 크로마토그램이다.

도 13은 pH가 2.3-3.8인 조건하에서의 크로마토그램이다.

결론:

1. rhNRG-1의 용액 중에서의 안정성은 pH값에 대한 의존성이 매우 높으며, rhNRG-1는 알칼리성 용액(pH8.0-10.0)에서보다 산성 용액(pH3.0-7.0)에서 훨씬 안정적이다.

2. rhNRG-1는 최저 pH값(3.2)일 때 최적의 안정성을 갖는다.

3. 비교적 낮은 pH값 조건하의 T90은 pH가 4.2일 때의 2배이고, 최초의 완충액(pH 5.5)일 때의 20배이다. 따라서 rhNRG-1 용액의 pH값을 저하시켜 그 안정성을 향상시킬 수 있음을 예측할 수 있다.

4. 협소 구간의 pH 연구는 pH 3.4(±0.2) 조건하에서의 안정성이 가장 우수함을 나타낸다.

실시예 2: 강력 파괴 실험

1. 실험 목표

rhNRG-1의 안정성 연구

2. 실험 단계

원액이 아래와 같이 강력하게 파괴되어 분해된다(표 12)

조건	제조
산화	1.24mg/mL의 원액, 0.3%의 H₂O₂와 이온제거수를 1:1:3(v/v/v)의 비율로 혼합하고(최종 H₂O₂는 0.06%), 실온에서 약 0.3, 2, 4 및 7 시간 동안 보관한다.
일광	1.24 mg/mL의 원액을 이온제거수로 5배 희석하고, 태양광 아래에 약 1-4일 동안 직접 노출시킨다.

샘플은 시간점에 따라 수집하여 역상 HPLC로 분석하였다.

3. 결과 및 결론

산화 작용 결과

산화 작용	rhNRG-1 농도 (mg/mL)
0.3 시간	0.24
2.4 시간	0.15
4.5 시간	0.10
7.1 시간	0.07

도 14는 강력하게 파괴된 용액의 전형적인 크로마토그램이다(위에서 아래로 순차적으로 표준용액 0.255mg/mL에 H₂O₂ 투입 후 20분, H₂O₂ 투입 후 2시간 25분, H₂O₂ 투입 후 4시간 30분, H₂O₂ 투입 후 7시간 7분).

결론:

1. rhNRG-1는 과산화물에 매우 민감하여 산화되기 쉽다.

2. 제제의 안정성을 높이도록 항산화제와 안정제의 투입을 고려할 필요가 있다.

실시예 3: 상이한 부형제가 rhNRG -1 제제의 안정성에 미치는 영향

1. 실험 목적

상이한 부형제가 rhNRG-1 제제의 안정성에 미치는 영향 연구

2. 실험 재료

2.1 표 14에 열거된 16종의 rhNRG-1 제제

2.2 SHELLAB/Model 1535 항온기(Sheldon 제조사)

2.3 HPLC Angilent 1200(Angilent사)

2.4 겔 컬럼 ZORBAX GF-250(4.6 mm×250 mm)

실험 제제 리스트

부형제	농도 (%)	제제 번호	첨가량 (㎕)	rhNRG-1 (㎕)	10mM PH6.0 PB (㎕)	무균수 (㎕)
락토오스 (20%)	0.5	A1	25	200	50	725
락토오스 (20%)	5	A2	250			500
트레할로스 (40%)	0.5	B1	12.5			737.5
트레할로스 (40%)	8	B2	200			550
글루칸 (4%)	0.2	C1	50			700
글루칸 (4%)	2	C2	500			250
PVP (10%)	0.5	D1	50			700
PVP (10%)	5	D2	500			250
아르기닌 (1M)	50 mM	E1	50			700
아르기닌 (1M)	400 mM	E2	400			350
수크로오스 (50%)	0.5	F1	10			740
수크로오스 (50%)	10	F2	200			550
만니톨 (20%)	0.5	G1	25			725
만니톨 (20%)	5	G2	250			500
글리신 (2M)	0.1M	H1	50			700
글리신 (2M)	1M	H2	500			250

3. 실험 단계

3.1 샘플을 37℃에서 5일 동안 보관한다.

3.2 SEC-HPLC로 샘플 농도를 검출한다.

유동상: 0.7M의 NaCl, 30mM의 PB(pH 7.0)

HPLC 크로마토그래피 조건: 유속 0.5ml/min, 주입 용량 20㎕, 검출 파장 450nm, 기록 시간 20min.

4. 결과

면적환원법(area normalization method)으로 각 샘플의 순도를 계산하였으며, rhNRG-1 제제의 검출 결과는 표 15와 같다.

5일 후 실험 제제의 순도

안정제 또는 충전제	제제 번호	SEC-HPLC 순도 (%)
락토오스	A1	99.41
락토오스	A2	96.79
트레할로스	B1	99.37
트레할로스	B2	98.00
글루칸	C1	99.33
글루칸	C2	85.75
PVP	D1	No data
PVP	D2	No data
아르기닌	E1	98.22
아르기닌	E2	91.64
수크로오스	F1	98.70
수크로오스	F2	62.20
만니톨	G1	98.70
만니톨	G2	98.13
글리신	H1	98.55
글리신	H2	98.63

글루칸 제제(C1&C2), 아르기닌 제제(E1&E2), 수크로오스 제제(F1&F2) 중의 순도 데이터는 일치하지 않으며, 따라서 글루칸, 아르기닌과 수크로오스는 rhNRG-1 제제 중 좋은 부형제가 아니다. PVP(폴리비닐피롤리돈)은 일종의 충전제로서, PVP를 함유한 rhNRG-1 제제는 SEC-HPLC가 검출한 순도 데이터를 제공할 수 없다. 결과는 락토오스, 트레할로스, 만니톨과 글리신이 비교적 우수한 rhNRG-1 제제의 부형제임을 나타낸다.

실시예 4: 인간 혈청 알부민(HAS) 농도가 뉴레귤린 제제의 생물활성에 미치는 영향

1. 실험 원리

HER2/new 유전자는 티로신 단백질 키나아제인 막관통 단백질 p185를 인코딩한다. NRG-1은 ErbB3 또는 ErbB4와 결합하여 ErbB3-ErbB2 및 ErbB4-ErbB2 헤테로다이머의 형성을 유도함으로써, HER2가 티로신 단백질 키나아제를 인코딩하도록 활성화하고, NRG-1 기능 신호의 전달을 매개한다. NRG-1이 그 수용체와 결합하여 ErbB2 단백질의 인산화 작용을 유발할 수 있다는 사실을 기반으로, 신속하고, 민감하며, 고속(high flux)의 체외 정량 검출 재조합 인간 뉴레귤린-1 생물활성 방법을 구축한다.

2. 실험 목적

상이한 농도의 인간 혈청 알부민(HAS)이 뉴레귤린 제제의 생물 활성에 미치는 영향 연구

3. 실험 재료

3.1 rhNRG-1 제제

표준 샘플: 0g/L의 HSA, 250㎍/mL의 rhNRG-1, 10mM의 인산염 완충시약, 150mM의 NaCl, 50g/L의 만니톨

실험 샘플 A: 0.5g/L의 HSA, 250㎍/mL의 rhNRG-1, 10mM의 인산염 완충시약, 150mM의 NaCl, 50g/L의 만니톨

실험 샘플 B: 2g/L의 HSA, 250㎍/mL의 rhNRG-1, 10mM의 인산염 완충시약, 150mM의 NaCl, 50g/L의 만니톨

실험 샘플 C: 8g/L의 HSA, 250㎍/mL의 rhNRG-1, 10mM의 인산염 완충시약, 150mM의 NaCl, 50g/L의 만니톨

3.2 96웰 세포배양플레이트(Corning사), Costar 96웰 ELISA 검출플레이트

3.3 인간 유선암 세포주(미국 ATCC사로부터 도입)를 37℃, 50%의 CO₂ 조건하에 배지에서 배양하였다.

3.4 일정량의 DMEM을 취하여, 상응하는 부피로 정량화하고, 3.7g/L의 NaHCO2, 0.1g/L의 글루타민과 5.5g/L의 HEPES를 첨가하였다.

3.5 기초 배지 DMEN 배지에 10%의 소태아혈청과 9mg/L의 인슐린을 투입하고, 4℃에서 보관한다.

3.6 무균 PBS(0.01M, pH 7.4)

3.7 Ca² ⁺와 Mg² ⁺ 이온을 함유한 PBS로 0.25%의 췌장효소를 제조한다.

3.8 항ErBb2 모노클론 항체로 완충액, 세척액을 코팅한다. ErbB3 및 ErbB4와 교차 반응이 없는 쥐 항-인간 ErbB 세포외 기능 영역의 H4 모노클론 항체를 선택하여, pH가 9.6인 0.05M의 탄산염 완충액을 코팅한다. 세척액: 0.01M PBS+0.05% Tween-20.

3.9 호스 래디시 퍼옥시다아제(HRP) 표기된 쥐 항-인간 인산화 프로테아제 모노클론 항체(anti-P-tyr-HRP)

3.10 기질, 기질 완충액 기질(TMB): 2mg/ml의 TMB(무수에탄올로 조제). 기질 완충액: 0.2M의 시트르산+0.1M의 Na₂HPO₄(pH 5.0). 작업용 기질: 기질 완충액 9ml+TMB 1ml+3%의 H₂O₂ 10㎕(배합 즉시 사용).

3.11 중지제(Termination agent) 2N H₂SO₄

3.12 세포분해액: 150mM의 NaCl+50mM의 HEPES+1%의 Triton-X 100의 mM(바나듐산나트륨)+0.01%(타이메로졸). 사용 전 25mM당 혼합 프로테아제 억제제 1정을 첨가한다.

4. 실험 단계

4.1 샘플을 37℃의 항온에 4일간 방치한다.

4.2 세포 접종

MCF-7 세포를 일정 수량으로 증식시키고, 무균 PBS 용액으로 세척한 다음, 0.25%의 트립신효소로 소화시킨다. 계수 후, 기초 배지로 세포의 농도를 조정한다. 세포를 96웰 플레이트, 웰당 100㎕, 5×10⁴개의 세포를 주입하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 동안 배양한다.

4.3 세포 기아

96웰 플레이트 중의 배지를 모두 흡취하여, 37℃에서 온육한 후의 PBS로 각 웰을 세척한 다음, 100㎕의 DMEM 배지(소혈청과 인슐림 불포함)를 투입한다. 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한다.

4.4 코팅

코팅 완충액으로 항ErbB2 세포외 기능 영역 H4 항체를 6㎍/ml까지 희석하고, 각 웰당 50㎕로 96웰 ELISA 플레이트에 주입한 다음, 4℃에서 하룻밤 둔다(16-18시간).

4.5 표준액과 측정할 샘플의 희석

각각 DMEM 배지(소태아혈청과 인슐린 불포함)로 표준액과 측정할 샘플을 2㎍/ml까지 희석한 다음, 3배의 경사도로 희석하여, 총 9개의 희석도를 만든다.

4.6 세포의 인산화

기아 후의 96웰 세포 배지를 전부 흡취하여, 각각 표준품과 측정할 샘플을 각 웰당 100㎕씩 주입하며, 각각의 농도마다 2개의 웰을 설치하고, 이와 동시에 음성 대조군(즉 DEME 배지를 주입한 플라시보 대조군)을 설치한다. 37℃에서 20min간 작용시킨다.

4.7 세포 분해

샘플을 신속하게 흡취하고 PBS로 한 번 세척한 후, 각 웰마다 100㎕의 세포분해액을 주입하고, 4℃의 냉장고에서 30min 동안 분해시킨다. 빙욕 조건하에 부착 의존적 세포가 완전히 탈락할 때까지 수평으로 요동하고, 4℃, 15,000rpm으로 15분간 원심분리한다.

4.8 ELISA 플레이트 밀봉

플레이트를 6회 세척하고, 세척액으로 5%의 탈지우유를 제조한 후, 각 웰마다 200㎕씩 주입하고 37℃에서 2hr 동안 방치한다.

4.9 샘플 추가

밀폐된 ELISA 플레이트를 3회 세척하고, 표준 세포분해액과 측정할 샘플분해액을 각 웰당 90㎕씩 주입하고, 이와 동시에 음성대조군을 설치하여, 37℃에서 1hr 동안 방치한다.

4.10 효소라벨 항체 추가

플레이트를 5회 세척한 후, 세척액으로 1:500의 비율에 따라 HRP 효소결합 마우스 항인산화 티로신 단백질 항체(제품 사용설명서와 사용시간에 따라 결정)를 희석하여, 각 웰당 100㎕씩 주입하고 37℃에서 1hr 동안 방치한다.

4.11 기질 발색 현상

플레이트를 5회 세척하고, 각 웰당 100㎕씩 임시 제조된 기질 작업액을 주입하고 37℃에서 10min 동안 방치한다.

4.12 종료

각 웰당 50㎕의 2N H₂SO₄를 주입하고 반응을 종료한다.

4.13 OD값 판독

ELISA 판독기에서 비색 분석하여 450nm 파장을 측정하고, 655nm 기준파장을 비교하여 측정 결과를 기록한다.

5. 결과

재조합 인간 뉴레귤린-1의 농도-OD값 곡선을 구축하고, 선형 회귀법으로 분석하고 각종 측정할 샘플의 반수 유효 용량을 계산하였다. 4종 rhNRG-1 제제의 검출 결과는 표 16과 같다.

측정할 샘플의 생물 활성

샘플	OD₅₀ 값	EC₅₀ 값	표준샘플 EC₅₀/ 샘플EC₅₀	비활성 (×10⁴U/mg)	생물활성 (×10⁴U)
표준 샘플	0.391	0.0505	―	0.60	0.150
샘플 A	0.393	0.0439	1.15	0.69	0.173
샘플 B	0.406	0.0217	2.33	1.40	0.35
샘플 C	0.424	0.0189	2.67	1.60	0.40

샘플 B와 샘플 C의 생물 활성(표 16 참조)은 표준 샘플과 샘플 A에 비해 뚜렷하게 높다. 결과는 HAS의 농도가 2g/L(샘플 B) 또는 8g/L(샘플 C)인 것이 rhNRG-1 제제의 바람직한 농도임을 나타낸다.

실시예 5: 가속 안정성 실험 및 장기 안정성 실험

rhNRG-1 최종 약물 제품의 안정성 연구

2. 실험 단계

실험 재료: Zensun이 생산한 4개 차수의 rhNRG-1 최종 약물 제품(FDP)이다. rhNRG-1 FDP는 약 250㎍/mL의 rhNRG-1, 농도가 약 10mM이면서 pH값이 약 6.0인 인산염 완충액, 약 50g/L의 만니톨, 약 2g/L의 HSA 및 약 150mM의 NaCl을 함유한 용액을 동결건조시켜 형성되며, 동결건조 후 각 병당 제품의 총량은 약 60mg이다.

rhNRG-1 최종 약물 제품의 추천 조건 및 승온 조건하에서의 안정성을 연구 및 평가한 결과는 표 17을 참조한다. 샘플을 1mL의 물에 용해시키고, 테스트 간격기에 그 pH값, 생물활성과 rhNRG-1의 양을 측정하였다.

현재의 규격은 ≤3.0%의 잔여수분(칼피셔법으로 결정)이다. 배치 번호 rhNRG#1, rhNRG#2, rhNRG#3 및 rhNRG#4에서 석출된 수분 함량은 각각 1.49%, 1.51%, 1.62%, 및 1.35%이다. 과거 기타 유사 약병과 병마개가 배치된 제품을 사용한 경험에 따라, 어느 차수의 rhNRG-1의 추천된 보존 기한 내(즉 예측 저장 온도가 5℃±3℃하에서 24개월 보관)의 잔여 수분이 대략 1.7%라면 ≤3.0%의 규격을 만족시킬 수 있는 것으로 예측한다.

Zensun이 생산한 4개의 차수의 rhNRG-1 최종 약물 제품(FDP)에 대하여 추천된 저장 조건하(즉 5℃±3℃) 및 고온 조건하(즉 25℃±2℃)의 장기 안정성 연구를 실시하였다. 상기 연구는 이미 단일한 임상 차수의 안정적인 표현을 나타내는 충분한 데이터를 제공한다.

보관 조건 & 각 차수의 실험 간격

배치번호	저장 조건	완료된 테스트 간격
rhNRG#1	5±3℃	0,3,6,9,12,18,24 개월
rhNRG#1	25±2℃	0,1,2,4,6 months
rhNRG#2	5±3℃	0,3,6,9,12,18,24 개월
rhNRG#2	25±2℃	0,1,2,4,6 개월
rhNRG#3	5±3℃	0,3,6,9,12,18,24 개월
rhNRG#3	25±2℃	0,1,2,4,6 개월
rhNRG#4	5±3℃	0,3,6,9,12,18,24 개월
rhNRG#4	25±2℃	0,1,2,4,6 개월

3. 결과 및 결론

각 차수에 검출된 항목은 실험 간격기 동안의 외관, pH값, 잔여수분, 생물활성 및 rhNRG-1의 함량을 포함한다.

도 18은 안정성 실험으로서, 안정성 요구 실험, 안정성 검수 표준 및 rhNRG-1 FDP의 안정성 평가의 관련 정보를 포함한다.

표 18은 실험 결과이다.

각 차수의 안정성 테스트 결과

		검출 항목
저장조건	검출 시간 (월)	외관		PH값	잔여수분	생물활성 (U)	rhNRG-1 함량 (㎍)
검출 표준		백색의 성긴 고체		6.0±0.5	≤3.0%	3500-10000	225-275
rhNRG#1의 안정성 데이터
5±3℃	0	일치	5.98		1.49	4286		244
	3	일치	6.01		1.85	4300		249
	6	일치	6.02		1.93	4580		241
	9	일치	6.01		2.15	4475		235
	12	일치	6.03		2.26	4420		229
	18	일치	6.04		2.37	4285		232
	24	일치	6.03		2.62	4315		231
25±2℃	1	일치	6.01		1.95	4870		242
	2	일치	6.03		2.13	4650		239
	4	일치	6.02		2.37	4430		238
	6	일치	6.03		2.59	4543		234
rhNRG#2의 안정성 데이터
5±3℃	0	일치	5.89		1.51	4220		247
	3	일치	5.93		1.63	4040		252
	6	일치	5.95		1.78	4645		248
	9	일치	5.98		1.82	4500		237
	12	일치	6.01		1.95	4450		233
	18	일치	6.02		2.23	4728		234
	24	일치	6.03		2.57	4285		232
25±2℃	1	일치	5.95		1.98	4350		243
	2	일치	6.01		2.23	4950		242
	4	일치	6.03		2.35	4575		251
	6	일치	6.03		2.51	4674		232
rhNRG#3의 안정성 데이터
5±3℃	0	일치	5.92		1.62	4070		242
	3	일치	5.97		1.71	4115		245
	6	일치	5.95		1.82	4573		258
	9	일치	5.98		1.95	4323		235
	12	일치	6.01		2.03	4325		243
	18	일치	6.02		2.25	4239		247
	24	일치	6.01		2.37	4398		255
25±2℃	1	일치	5.98		1.83	4125		241
	2	일치	6.01		1.95	4539		252
	4	일치	6.01		2.15	4378		245
	6	일치	6.03		2.22	4585		259
rhNRG#4의 안정성 데이터
5±3℃	0	일치	6.1		1.35	4797		248
	3	일치	6.1		1.37	4809		252
	6	일치	6.2		1.42	4982		253
	9	일치	6.1		1.57	4756		255
	12	일치	5.9		1.69	4825		251
	18	일치	6.2		1.83	4760		250
	24	일치	6.3		2.12	4506		231
25±2℃	1	일치	6.1		1.35	4587		249
	2	일치	6.2		1.65	4621		251
	4	일치	6.1		1.83	4588		250
	6	일치	6.3		2.15	4844		253

차수 rhNRG#1, rhNRG#2, rhNRG#3 및 rhNRG#4 중의 잔여수분량은 검수 표준인 ≤3.0%보다 낮아 생물활성에 영향을 미치지 않았다. 비임상연구 및 임상연구에 적용되도록 생산되는 차수의 경우, 정성 분석 기술(즉 외관, SDS-PAGE 전기영동 분석 등)을 이용하여 검출한 결과 뚜렷한 변화가 발견되지 않았다. 마찬가지로, 총 단백질과 rhNRG-1 함량을 분석한 결과, 보존 기간 내에 안정성이 저하되는 추세가 발견되지 않았다.

rhNRG-1 약물 제품을 5℃±3℃의 환경에서 24개월 동안 보존할 경우, rhNRG-1의 생물활성을 유지할 수 있다. 고온 실험의 저장 조건하에 6개월간 보존한 결과, 냉장 조건하에, 약물의 보존기한은 2년 이상인 것으로 추측할 수 있다.

Claims

(a) NRG 폴리펩타이드; (b) 일종의 완충제를 포함하며, 그 중 상기 제제의 pH값은 약 3-7인 뉴레귤린(NRG) 약물 제제.
제1항에 있어서,
상기 NRG 제제는 (c) 일종의 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 NRG 제제는 (d) 일종의 염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 리펩타이드; b) 뉴레귤린의 EGF 유사 영역을 포함하는 폴리펩타이드; c) a)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; d) SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드; e) d)의 상기 폴리펩타이드의 생물활성 유사물, 프래그먼트 또는 돌연변이체; f) 적당히 엄격한 잡종형성 조건에서 SEQ ID NO:1에 표시된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리다이즈된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제4항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드의 농도 범위는 약 0.01g/L-1g/L인 것을 특징으로 하는 제제.
제6항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드이고, 또한 농도는 약 0.25g/L인 것을 특징으로 하는 제제.
제1항 내지 제3항에 있어서,
상기 완충제는 pH 완충제인 것을 특징으로 하는 제제.
제8항에 있어서,
상기 pH 완충제의 농도 범위는 약 0.1mM-500mM인 것을 특징으로 하는 제제.
제8항에 있어서,
상기 완충제는 시트르산염, 인산염, 아세트산염, 히스티딘, 글리신, 중탄산염, HEPES, Tris, 묽은 염산, 묽은 수산화나트륨 용액 또는 이러한 시약의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제10항에 있어서,
상기 완충제는 인산염인 것을 특징으로 하는 제제.
제11항에 있어서,
상기 pH값은 약 6인 것을 특징으로 하는 제제.
제11항에 있어서,
상기 pH값은 약 3-4인 것을 특징으로 하는 제제.
제1항에 있어서,
상기 제제는 액체 약물 제제인 것을 특징으로 하는 제제.
제14항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 제제.
제14항에 있어서,
상기 완충제는 인산염인 것을 특징으로 하는 제제.
제14항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드이면서 또한 농도는 약 0.25g/L이고, 상기 완충제는 약 10mM의 인산염이면서 또한 그중 상기 pH는 약 3.4인 것을 특징으로 하는 제제.
제2항에 있어서,
상기 안정제의 농도는 0.1g/L-200g/L인 것을 특징으로 하는 제제.
제2항에 있어서,
상기 안정제는 만니톨, 솔비톨, 자일리톨, 수크로오스, 트레할로오스, 만노오스, 말토오스, 락토오스, 글루코오스, 라피노오스, 셀로비오스, 젠티오비오스, 이소말토스, 아라비노오스, 글루코사민, 프룩토오스, 인간 혈청 알부민 또는 이러한 안정제의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제2항에 있어서,
상기 안정제는 농도가 약 2g/L인 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 제제.
제3항에 있어서,
상기 염의 농도 범위는 약 100mM-500mM인 것을 특징으로 하는 제제.
제3항에 있어서,
상기 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 제제.
제22항에 있어서,
상기 염화나트륨의 농도는 약 150mM인 것을 특징으로 하는 제제.
제3항에 있어서,
상기 NRG 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드이면서 또한 농도는 약 0.25g/L이고, 상기 완충제는 약 10mM의 인산염이면서 또한 그 중 상기 pH는 약 6.0이며, 함유된 안정제는 농도가 약 2g/L인 인간 혈청 알부민이고, 함유된 염은 염화나트륨이면서 농도는 약 150mM인 것을 특징으로 하는 제제.
상기 제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항의 제제에 부형제를 첨가한 후 동결건조시켜 형성되는 것을 특징으로 하는 뉴레귤린(NRG)동결건조 약물 제제.
제25항에 있어서,
상기 부형제는 인간 혈청 알부민, 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이러한 부형제의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제25항에 있어서,
약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁액으로 재현탁한 후의 부형제의 농도는 약 0.1g/L-200g/L인 것을 특징으로 하는 제제.
제25항에 있어서,
상기 부형제는 만니톨인 것을 특징으로 하는 제제.
제25항에 있어서,
약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁액으로 재현탁한 후의 부형제의 농도는 약 50g/L인 것을 특징으로 하는 제제.
제25항에 있어서,
(a) SEQ ID NO:2에 표시된 아미노산 서열의 폴리펩타이드; (b) 인산염 완충제; (c) 부형제로서의 만니톨; (d) 안정제로서의 인간 혈청 알부민 및 (e) 염으로서의 염화나트륨을 포함하며, 약 60mg의 상기 제제를 1ml의 재현탁 용액으로 재현탁한 후 (a)의 농도는 약 0.25g/L이고; (b)의 농도는 약 10mM이면서 pH값은 약 6이며; (c)의 농도는 약 50g/L이고; (d)의 농도는 약 2g/L이며; (e)의 농도는 약 150mM인 것을 특징으로 하는 제제.
제30항에 있어서,
상기 재현탁액은 생리식염수인 것을 특징으로 하는 제제.