TW202134266A

TW202134266A - 藉由投予重組vwf治療患有嚴重馮威里氏病之患者之經血過多

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Publication number: TW202134266A
Application number: TW110104257A
Authority: TW
Inventors: 柏提娜普洛德; 貝多茲法索瓦多隆
Original assignee: 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2020-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-09-16
Also published as: WO2021158777A1; KR20220150303A; CA3169996A1; JP2023514541A; BR112022015326A2; US20230398188A1; AU2021216945A1; CN115335074A; AR121268A1; EP4100048A1; MX2022009492A

Abstract

本發明係關於一種用於治療患有馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多之方法，該方法包含向該個體投予治療量之重組馮威里氏因子(rVWF)。

Description

藉由投予重組VWF治療患有嚴重馮威里氏病之患者之經血過多

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2020年2月4日申請之美國臨時專利申請案第62/969,998號之優先權，該臨時專利申請案特此以全文引用的方式併入。對序列表之引用

隨此提交之序列表文本副本創建於2021年2月3日，標題為008073-5215-WO_Sequence_Listing.txt，大小為53,961位元且以全文引入之方式併入本文中。

諸如馮威里氏病(VWD)之凝血疾病一般由凝血級聯之缺乏引起。馮威里氏病(VWD)係指由馮威里氏因子之缺乏引起的一組疾病。馮威里氏因子(VWF)促進血液血小板叢聚在一起且黏在血管壁上，這對於正常的血液凝結係必需的。

馮威里氏病(VWD)係最常見的遺傳性出血病症，估計患病率為1% (Veyradier A等人, Medicine (Baltimore). 2016, 95(11):e3038)。然而，排除該疾病之較輕形式，實際上僅約1/10,000患者需要治療。此等凝血病之當前治療包括使用包含正常凝血因子之醫藥製劑的替代療法。

VWF係以大小在約500至20,000 kD範圍內之一系列多聚體的形式在血漿中循環之醣蛋白。VWF之cDNA的全長已經選殖；多肽原對應於全長前原VWF之胺基酸殘基23至764 (Eikenboom等人 (1995) Haemophilia 1, 77 90)。多聚體形式之VWF由藉由二硫鍵連接在一起之250 kD多肽次單元構成。VWF介導初始血小板黏附至受損血管壁之內皮下膜，其中較大的多聚體展現增強之止血活性。多聚VWF經由VWF之A1結構域中的相互作用與血小板表面醣蛋白Gp1bα結合，從而促進血小板黏附。VWF上之其他位點介導與血管壁的結合。因此，VWF在血小板與血管壁之間形成橋，這對於高剪切應力條件下之血小板黏附及原發性止血係必不可少的。通常，內皮細胞分泌大聚合物形式之VWF且具有較低分子量之VWF形式由蛋白水解裂解產生。具有超大分子質量之多聚體儲存於內皮細胞之Weibel-Pallade小體中且在受刺激後由諸如凝血酶及組織胺之促效劑釋出。

對於VWD患者，考慮到需要長時間止血，建議該等患者用VWF替代進行治療，尤其在大手術中(Mannucci PM及Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH公開案第08-5832號; 2007年12月)。血漿源性VWF (pdVWF)療法含有因子VIII (FVIII)且在重複給藥時具有FVIII積聚之可能性。重組VWF (rVWF)濃縮物(亦稱作VONVENDI^® 、VEYVONDI^® 、vonicog alfa，Takeda Pharmaceutical Company Limited)提供與血漿源性VWF療法相比改善之臨床益處(Turecek PL等人 Hamostaseologie. 2009;29(增刊1):S32-38；Mannucci PM等人 Blood, 2013;122(5):648-657；Gill JC等人 Blood, 2015;126(17):2038-2046)。

患有VWD之女性的最常見症狀為月經大出血(HMB)或經血過多，其影響高達80%患有VWD之女性，其中20%患有中度或嚴重VWD之女性主要由於HMB而需要子宮切除術。經血過多/HMB常與症狀性缺鐵性貧血、心理壓力及生活品質下降有關。其可不利地影響工作、求學及日常活動，且導致醫療費用增加。

在患有VWD之女性中，關於經血過多之診斷及有效治療的缺乏係未滿足之健康需求。當用於患有嚴重VWD之成年患者的出血發作(BE)之按需治療時，rVWF已證明止血功效及積極的效益-風險輪廓。然而，關於用rVWF管理經血過多的特別資訊則存在有限。因此，需要使用rVWF來治療患有嚴重VWD之女性之改良方法。

本發明提供一種用於治療患有嚴重馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多出血發作之方法，其包含向該個體投予至少一個劑量之介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內的重組馮威里氏因子(rVWF)。

在一些實施方式中，經血過多出血發作係選自由輕微經血過多出血發作及嚴重經血過多出血發作組成之群。

在一些實施方式中，VWD係選自由1型VWD、2型VWD、及3型VWD組成之群。

在一些實施方式中，向該個體投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量，且經血過多出血發作係輕微經血過多出血發作。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。

在一些實施方式中，向該個體投予40-50 IU/kg rVWF之第一劑量，且經血過多出血發作係輕微經血過多出血發作。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予40-50 IU/kg rVWF之第二劑量。

在一些實施方式中，VWD為1型VWD。在一些實施方式中，VWD係選自由2A型、2B型、2N型、2M型VWD、及3型VWD組成之群。

在一些實施方式中，向該個體投予40-90 IU/kg rVWF之第一劑量，且經血過多出血發作係嚴重經血過多出血發作。在一些實施方式中，VWD為1型VWD。在一些實施方式中，VWD係選自由2A型VWD、2B型VWD、2N型VWD、2M型VWD、及3型VWD組成之群。

在一些實施方式中，向該個體投予40-90 IU/kg rVWF之第一劑量，且VWD為1型VWD。在一些實施方式中，向該個體投予50-90 IU/kg VWF之第一劑量且VWD係選自由2A型VWD、2B型VWD、2N型VWD、2M型VWD、及3型VWD組成之群。

在一些實施方式中，所描述之方法進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之第一劑量的複數個劑量。在一些實施方式中，每8至12小時投予各劑量持續約3天。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。

在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-60 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。

在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之第一劑量及40-60 IU/kg rVWF之第二劑量的複數個劑量。在一些實施方式中，該方法進一步包含每天向該個體投予30-70 IU/kg rVWF之第三劑量持續出血發作之剩餘持續時間。在一些實施方式中，該方法之總持續時間不超過約7天。

在一些實施方式中，向該個體投予之rVWF之第一劑量為50-80 IU/kg rVWF，且經血過多出血發作係嚴重經血過多出血發作。

在一些實施方式中，VWD為1型VWD。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予複數個劑量之rVWF。在一些實施方式中，所描述之方法進一步包含向該個體投予包含50-80 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含50-80 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-60 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。在一些實施方式中，該方法進一步包含每天向該個體投予30-70 IU/kg rVWF之第三劑量持續出血發作之剩餘持續時間。在一些實施方式中，該方法之總持續時間不超過約7天。

在一些實施方式中，向該個體投予之rVWF之第一劑量為60-80 IU/kg，且VWD係選自由2A型VWD、2B型VWD、2N型VWD、2M型VWD、及3型VWD組成之群。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予複數個劑量之rVWF。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-80 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之第一劑量及40-80 IU/kg rVWF之第二劑量的複數個劑量。在一些實施方式中，該方法進一步包含每天向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續出血發作之剩餘持續時間。在一些實施方式中，該方法之總持續時間不超過約7天。

在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予重組因子VIII (rFVIII)。在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之一或多個劑量同時或依序投予。

在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之第一劑量及/或第二劑量同時或依序投予。在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之各劑量同時或依序投予。在一些實施方式中，rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。

在一些實施方式中，向該個體投予rFVIII，使得rVWF對FVIII比率係選自由約1.5:0.8；約1.3:1；約1.1:0.8；約1.5:1；及約1.1:1.2組成之群。

在一個方面，提供一種用於治療患有嚴重1型馮威里氏病(VWD)之個體的嚴重經血過多出血發作之方法，該方法包含：(a)向該個體投予50-75 IU/kg rVWF之第一劑量；(b)向該個體投予複數個40-60 IU/kg rVWF之第二劑量，其中每8-12小時投予該等劑量之各者持續3天，使得VWF:RCo谷底水平維持於至少0.30 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.30 IU/mL之VWF:RCo谷底水平；及(c)每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續出血發作之剩餘持續時間；其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過約7天。

在一些實施方式中，VWF:RCo谷底水平維持於至少0.40 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.40 IU/mL之VWF:RCo谷底水平。

在一些實施方式中，VWF:RCo谷底水平維持於至少0.50 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.50 IU/mL之VWF:RCo谷底水平。

在一些實施方式中，步驟(a)–(c)之總持續時間不超過6天。在一些實施方式中，步驟(a)–(c)之總持續時間不超過5天。在一些實施方式中，步驟(a)–(c)之總持續時間不超過4天。

在一些方面，提供一種用於治療患有嚴重2型或3型馮威里氏病(VWD)之個體的嚴重經血過多出血發作之方法，該方法包含：(a)向該個體投予60-80 IU/kg rVWF之第一劑量；(b)向該個體投予複數個40-60 IU/kg rVWF之第二劑量，其中每8-12小時投予該等劑量之各者持續3天，使得VWF:RCo谷底水平維持於至少0.30 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.30 IU/mL之VWF:RCo谷底水平；及(c)每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續出血發作之剩餘持續時間；其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過約7天。

在一些實施方式中，VWF:RCo谷底水平維持於至少0.40 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.40 IU/mL之VWF:RCo谷底水平。在一些實施方式中，VWF:RCo谷底水平維持於至少0.50 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.50 IU/mL之VWF:RCo谷底水平。

在一些實施方式中，該方法進一步包含向該個體投予重組因子VIII (rFVIII)。在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之至少一個劑量同時或依序投予。在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之第一劑量及/或複數個第二劑量同時或依序投予。在一些實施方式中，rFVIII與rVWF之第一劑量及複數個第二劑量兩者同時或依序投予。在一些實施方式中，投予至v個體之rFVIII之劑量為約20 IU/kg至約50 IU/kg。

在一些實施方式中，向該個體投予rFVIII，使得rVWF對FVIII比率係選自由約1.5:0.8；約1.3:1；約1.1:0.8；約1.5:1；及約1.1:1.2組成之群。在一些實施方式中，rVWF對FVIII比率為約1.5:0.8。在一些實施方式中，rVWF對FVIII比率為約1.3:1。在一些實施方式中，rVWF對FVIII比率為約1.1:0.8。在一些實施方式中，rVWF對FVIII比率為約1.5:1。在一些實施方式中，rVWF對FVIII比率為約1.1:1.2。

在一些實施方式中，rVWF具有在約20 mU/μg至約150 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，rVWF具有在約20 IU/mg蛋白質至約150 IU/mg蛋白質之間的比活性。在一些實施方式中，rVWF具有在約20 IU rVWF:RCo/mg蛋白質至約150 IU rVWF:RCo /mg蛋白質之間的比活性，或如使用另一VWF活性量測所測定之其相等值。

在一些實施方式中，向該個體投予rFVIII及rVWF，使得rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)對rVWF瑞斯特黴素輔因子活性(IU rVWF:RCo)之比率係在約3:1與約1:5之間。

又，本文提供一種用於治療患有嚴重馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多出血發作之方法，該方法包含向該個體投予至少一個劑量之介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內的重組馮威里氏因子(rVWF)，其中與不投予rVWF時該個體遭受的出血發作之持續時間及/或嚴重程度相比，該個體遭受的出血發作之持續時間及/或嚴重程度降低。

在所描述之方法之任何者的一些實施方式中，在出血發作之持續時間內投予一個劑量之rVWF。在一些實施方式中，在出血發作之持續時間內投予兩個劑量之rVWF。在一些實施方式中，在出血發作之持續時間內投予三個劑量之rVWF。在一些實施方式中，在出血發作之持續時間內投予四個劑量之rVWF。在其他實施方式中，在出血發作之持續時間內投予五個或五個以上劑量之rVWF。

在一些實施方式中，在出血發作之持續時間內向該個體投予約20 IU/kg至約200 IU/kg範圍之rVWF。在多個實施方式中，在出血發作之持續時間內向該個體投予約40 IU/kg至約200 IU/kg範圍之rVWF。在一些實施方式中，在出血發作之持續時間內向該個體投予約20 IU/kg至約100 IU/kg範圍之rFVIII。

在多個實施方式中，本文所概述之rVWF具有與序列SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之胺基酸序列。在一些實施方式中，rVWF具有與序列SEQ ID No:3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致性之胺基酸序列。在多個實施方式中，rVWF具有與序列SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之胺基酸序列且該胺基酸序列由與SEQ ID NO:1或其片段具有至少80%序列一致性之核酸序列編碼。

在多個實施方式中，所描述之rVWF為rVWF之片段，其中rVWF具有與序列SEQ ID NO:3具有至少90%一致性之胺基酸序列。在一些實施方式中，rVWF為rVWF之片段，其中rVWF具有與序列SEQ ID No:3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致性之胺基酸序列。

在一些實施方式中，rVWF使用來自由泛蛋白化、醣基化、綴合至治療劑或診斷劑、標記、共價聚合物附接、引入不可水解鍵、以及藉由化學合成一或多個胺基酸進行的插入或取代組成之群之一或多種技術經化學修飾。

引言

本發明提供用於治療患有馮威里氏病(VWD)之女性之經血過多之方法。此類治療包含投予重組馮威里氏因子(rVWF)。根據本發明且針對嚴重VWD患者之出血發作(BE)之按需治療的rVWF之投予為該等患者提供了止血功效及積極的效益-風險型態。定義

除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「一抗體」包括複數個此類抗體，且提及「一宿主細胞」包括提及一或多個宿主細胞及熟習此項技術者已知之其相等物，等等。應進一步注意申請專利範圍可經起草以排除任何視情況選用之要素。因此，此陳述旨在用作關聯申請專利範圍之要素的描述使用如「僅僅」、「僅」及其類似術語之此類排他性術語或使用「負性」限制的先行基礎。

在進一步描述本發明之前，應瞭解本發明不限於所述特定實施方式，因而當然可有所變化。亦應理解，本文所用之術語係僅出於描述特定實施方式之目的，而無意於限制本發明，因為本發明之範疇將僅受隨附申請專利範圍限制。

如本文所用，「rVWF」係指重組VWF。

如本文所用，「rFVIII」係指重組FVIII。

當參考例如細胞或核酸、蛋白質或載體使用時，術語「重組」指示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或改變原生核酸或蛋白質而經修飾，或該細胞係源於如此修飾之細胞。因此，例如，重組細胞表現在細胞之原生(非重組)形式內未發現之基因，或表現在其他情況下異常表現、表現不足或根本不表現之原生基因。

如本文所用，「重組VWF」包括經由重組DNA技術獲得之VWF。在某些實施方式中，本發明之VWF蛋白可包含構築體，例如，如WO 1986/06096及US 8,597,910中所製備，該等專利中關於製造重組VWF之方法的內容以引用之方式併入本文中。本發明中之VWF可包括所有潛在形式，包括單體形式及多聚體形式。亦應理解，本發明涵蓋欲組合使用之不同形式之VWF。例如，本發明之VWF可包括不同多聚體、不同衍生物以及生物活性衍生物及非生物活性衍生物兩者。

在本發明之上下文中，重組VWF包括來自例如哺乳動物(諸如靈長類動物、人類、猴、兔、豬、囓齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬科動物、貓科動物)之VWF家族的任何成員，及其生物活性衍生物。亦包括具有活性之突變型及變異VWF蛋白，以及該等VWF蛋白之功能性片段及融合蛋白。此外，本發明之VWF可進一步包含有助於純化、偵測或兩者之標籤。本文所述之VWF可進一步用治療部分或適於活體外或活體內成像之部分修飾。

如本文所用，「血漿源性VWF (pdVWF)」包括在血液中發現的該蛋白質之所有形式，包括獲自哺乳動物之成熟VWF，其具有活體內穩定(例如，結合)至少一種FVIII分子之特性。

術語「高度多聚VWF」或「高分子量VWF」係指包含至少10個次單元，或12、14或16個次單元至約20、22、24或26個次單元或更多次單元之VWF。術語「次單元」係指VWF單體。如此項技術中已知，其一般為VWF之二聚體，該等二聚體聚合形成更高階多聚體(參見Turecek等人, Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36(5): 510-521，出於所有目的且尤其對於關於VWF之多聚體分析的所有教示，其由此以全文引用之方式併入)。

如本文所用，術語「因子VIII」或「FVIII」係指具有凝血因子VIII之典型特徵的任何形式之因子VIII分子(患者內源性的、源於血漿或藉由使用重組DNA技術製造)，且包括因子VIII之所有經修飾形式。因子VIII (FVIII)天然存在且作為源自單一基因產物之多肽的非均勻分佈存在於治療製劑中(參見例如Andersson等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979-2983 (1986))。含有因子VIII之治療製劑的市售實例包括以商標名稱HEMOFIL M^® 、ADVATE^® 及RECOMBINATE^® (Takeda Pharmaceutical Company Limited, Lexington, MA)出售之彼等。

如本文所用，「血漿FVIII活性」及「活體內FVIII活性」可互換使用。使用標準分析量測之活體內FVIII活性可為內源性FVIII活性、治療性投予之FVIII (重組或血漿源性)的活性或內源性及投予之FVIII活性兩者。同樣，「血漿FVIII」係指內源性FVIII或投予之重組或血漿源性FVIII。

如本文所用，「馮威里氏病」係指由馮威里氏因子之缺乏引起的一組疾病。馮威里氏因子促進血小板叢聚在一起且黏在血管壁上，這對於正常的血液凝結係必需的。如本文更詳細描述，存在數種類型之馮威里氏病，包括1型、2A型、2B型、2M型、2N型及3型。

術語「經分離」、「經純化」或「生物學純的」係指實質上或基本上不含如原生狀態下發現通常伴隨之組分的材料。純度及均質性典型地使用分析化學技術，諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析來測定。VWF係實質上經純化之製劑中存在的主要物質。在一些實施方式中，術語「經純化」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生基本上一條色帶。在其他實施方式中，其意謂該核酸或蛋白質為至少50%純，更佳地至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%純或更純。在其他實施方式中，「純度」或「純化」意謂自欲純化之組成物中移除至少一種污染物。在此意義上，純化不需要經純化化合物為均質的，例如100%純。

如本文所用，「投予」(及所有語法相等物)包括對個體進行靜脈內投予、肌肉內投予、皮下投予、經口投予、呈栓劑形式投予、表面接觸、腹膜內、病變內或鼻內投予或緩釋器件(例如微型滲透泵)植入。投予係藉由任何途徑，包括非經腸及經黏膜(例如經口、鼻、陰道、直腸或經皮)。非經腸投予包括例如靜脈內、肌肉內、小動脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內及顱內。其他遞送模式包括但不限於使用脂質體調配物、靜脈內輸注、經皮貼片等。

術語「治療有效量或劑量」或「治療充足量或劑量」或「有效或充足量或劑量」係指產生投予時欲達成之治療效應之劑量。例如，可用於治療血友病之藥物的治療有效量可為能夠預防或緩解與血友病相關之一或多種症狀之量。精確劑量將取決於治療目的，且將可由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第1-3卷, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, 2003, Gennaro編, Lippincott, Williams & Wilkins)。

如本文所用，術語「患者」及「個體」可互換使用且係指患有疾病或具有染上疾病之可能的哺乳動物(較佳地人類)。

如本文所用，術語「約」表示自規定值加或減10%之近似範圍。例如，措辭「約20%」涵蓋18-22%之範圍。

如本文所用，術語「半衰期」係指經歷衰減(或自樣品或自患者清除)之物質的量減少一半所耗用之時期。

如本文所用，術語「谷底水平」係指剛好在下一劑量之前在血漿中之藥物濃度，或在兩個劑量之間的最低藥物濃度。例如，對於每12小時投予之方案，谷底水平一般將在最後一次劑量之後12小時出現。谷底水平很重要，因為已指示谷底水平可與臨床結果相關，例如，低谷底水平可引起抗性發展，這可負面地影響治療方案之功效。例如，谷底水平可維持於≥30%之血漿水平下，例如，低谷底水平將由＜30%之水平指示。例如，谷底水平可維持於≥35%之血漿水平下，例如，低谷底水平將由＜35%之水平指示。例如，谷底水平可維持於≥40%之血漿水平下，例如，低谷底水平將由＜40%之水平指示。例如，谷底水平可維持於≥45%之血漿水平下，例如，低谷底水平將由＜45%之水平指示。例如，谷底水平可維持於≥50%之血漿水平下，例如，低谷底水平將由＜50%之水平指示。在一些情況下，推薦之目標谷底血漿水平及最短治療持續時間包括≥30 IU/dL (輕微)及＞50 IU/dL (嚴重)之VWF:RCo目標谷底血漿水平。在一些情況下，推薦之目標谷底血漿水平及最短治療持續時間包括≥35 IU/dL (輕微)及＞55 IU/dL (嚴重)之VWF:RCo目標谷底血漿水平。在一些情況下，推薦之目標谷底血漿水平及最短治療持續時間包括≥40 IU/dL (輕微)及＞65 IU/dL (嚴重)之VWF:RCo目標谷底血漿水平。在一些情況下，推薦之目標谷底血漿水平及最短治療持續時間包括≥45 IU/dL (輕微)及＞70 IU/dL (嚴重)之VWF:RCo目標谷底血漿水平。

如本文所用，術語「經血過多」係指月經出血發作(週期性子宮出血事件)，其中每個週期月經失血為約80 mL或更多。在一些情況下，經血過多包括持續超過7天之月經大出血。I. 投予 rVWF 用於治療嚴重 VWD 患者之經血過多之方法

本文提供一種治療患有嚴重VWD之個體之經血過多(亦即，異常子宮出血)之方法。向此類個體投予rVWF之優點之一係如與pdVWF相比，rVWF的較高比活性允許rVWF之投予量及對個體再給藥之次數存在靈活性。應理解且如本文中更詳細討論，共投予之FVIII可為重組或血漿源性的。

在一些方面，rVWF以30-100 IU/kg之範圍投予至個體，例如30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、30-60、30-70、40-100、40-80、50-80、60-80、70-80、40-50、40-60、40-70、40-50、50-60、50-75、60-70、70-80、40-90、50-90、60-90、70-90、80-90或90-100 IU/kg。在一些實施方式中，rVWF在經血過多出血發作期間投予至少一次。在其他實施方式中，rVWF在出血發作期間投予兩次或兩次以上，例如2、3、4、5次或更多次。在一些情況下，向該個體投予rVWF之一或多次輸注。各輸注可包括約30-90 IU/kg rVWF之範圍，例如30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、30-60、30-70、60-70、40-50、40-60、40-70、40-75、50-75、60-75、40-80、50-75、50-80、60-80、70-80、40-85、50-85、60-85、70-85、45-50、45-60、45-70、50-60、40-90、50-90、60-90、70-90或80-90 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，該等輸注之rVWF量可實質上相等。例如，第一次輸注及第二次輸注(亦即，第一劑量及第二劑量)之rVWF量可實質上相等。在一些實施方式中，第二次輸注及第三次輸注(亦即，第二劑量及第三劑量)之rVWF量可實質上相等。在一些實施方式中，每次出血發作投予至個體之rVWF的總劑量為約30-150 IU/kg，例如40-50、40-90、40-150、40-125、40-100、40-90、40-75、50-150、50-100、75-150或100-150 IU/kg。

在一些實施方式中，對於輕微及中度經血過多出血事件，僅需要比估計值多1-2次輸注來控制彼出血發作且不需要額外含VWF之產品。在一些實施方式中，對於嚴重出血事件，需要比估計值更多且＜1.5倍輸注來控制彼出血發作且不需要額外含VWF之產品。在一些實施方式中，輕微、中度及嚴重出血事件之實際輸注次數小於或等於治療該出血事件所需的估計次數，且不需要額外含VWF之產品。

在一些實施方式中，每天至少一次、每天至少兩次、每8-12小時及其類似時間投予rVWF。在一些情況下，投予rVWF持續總計1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天及其類似時間。在一些實施方式中，每8小時、每9小時、每10小時、每11小時或每12小時投予rVWF。在一些實施方式中，每8至12小時投予rVWF持續約3天至約7天。

在一些實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有1型VWD。在一些實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有2型VWD。在一些進一步實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有2A型VWD。在一些進一步實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有2B型VWD。在一些進一步實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有2M型VWD。在一些進一步實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有2N型VWD。在其他實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有3型VWD。在其他實施方式中，患有嚴重VWD之個體患有嚴重非3型VWD。

在一些實施方式中，該個體經診斷患有3型VWD。在一些實施方式中，該個體經診斷患有3型VWD且具有＜ 3 IU/dL之基線VWF抗原水平。在一些實施方式中，該個體具有介於3 IU/dL或更小範圍內之基線VWF抗原水平。在一些實施方式中，該個體經診斷患有嚴重非3型VWD。在一些實施方式中，該個體經診斷患有1型或2A型VWD。在一些實施方式中，該個體具有＜ 20 IU/dL或20%之基線VWF瑞斯特黴素輔因子活性(VWF:RCo)。在一些實施方式中，該個體具有介於＜ 20 IU/dL或更小(亦即，＜ 0.2 IU/mL或20%或更小)範圍內之基線VWF:RCo。在一些實施方式中，該個體具有與介於＜ 20 IU/dL或更小(亦即，＜ 0.2 IU/mL或20%或更小)範圍內之基線VWF:RCo可相當或相等之基線VWF:GPIbM或VWF:GPIbR。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2B型VWD。在一些實施方式中，該個體患有2B型VWD，如藉由基因分型所診斷。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2N型VWD。在一些實施方式中，該個體具有＜ 10%或介於10%或更小範圍內之基線FVIII活性(FVIII:C)。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2N型VWD且具有＜ 10%之基線FVIII活性(FVIII:C)。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2M型VWD。

在一些實施方式中，根據ASH ISTH NHF WFH 2021指南(James等人, Blood Advances, 2021, 5(1):280-300)，該個體經診斷患有VWD，該文獻之內容(包括圖及表格)以引用之方式併入本文中。在一些實施方式中，該個體患有1型VWD，如藉由VWF抗原活性(VWF:Ag)、血小板依賴性VWF活性(例如，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)及/或FVIII凝血活性(FVIIlI:C)所診斷，使得VWF水平＜30 (其係指＜0.30 IU/mL之VWF水平)且血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率＞0.7。在一些情況下，患有1型VWD之個體具有＜0.30 IU/mL之VWF水平(無論出血型態如何)，如臨床醫師所測定。在一些情況下，患有1型VWD之個體具有＜0.60 IU/mL之VWF水平及異常出血型態，如臨床醫師所測定。在一些實施方式中，VWF水平係指VWF:Ag。在一些實施方式中，VWF水平係指血小板依賴性VWF活性(例如，VWF:GPIbM或VWF:GPIbR)。在一些實施方式中，VWF水平係指VWF:Ag及/或血小板依賴性VWF活性(例如，VWF:GPIbM或VWF:GPIbR)。在一些實施方式中，該個體患有1C型VWD，如藉由VWF抗原活性(VWF:Ag)、血小板依賴性VWF活性(例如，VWF醣蛋白IbM (VWF:GPIbM)及VWF醣蛋白IbR (VWF:GPIbR))、FVIII凝血活性(FVIIlI:C)及/或去氨加壓素(DDAVP)試驗所診斷，使得VWF水平＜30 (其係指＜0.30 IU/mL之VWF水平)且血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率＞0.7。在一些實施方式中，DDAVP試驗包括輸注後1小時及4小時血液工作，以證實1C型個體中增強之VWF清除。在一些實施方式中，該個體患有2型VWD，如藉由VWF:Ag、血小板依賴性VWF活性及FVIII:C評估所診斷，使得VWF水平＜30 (＜0.30 IU/mL之VWF水平)且血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率＜0.7。在一些實施方式中，該個體患有2A或2B型VWD，如藉由VWF:Ag活性、血小板依賴性VWF活性、FVIII:C活性、VWF膠原蛋白結合對抗原之比率(VWF:CB/Ag)分析、VWF多聚體分析及/或基因分型所診斷，使得VWF水平＜30 (＜0.30 IU/mL之VWF水平)，血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率＜ 0.7，且VWF多聚體型態異常。在一些情況下，該個體患有2B型，如藉由基因測試進一步證實。在一些實施方式中，該個體患有2M型VWD，如藉由VWF:Ag活性、血小板依賴性VWF活性、FVIII:C活性、VWF膠原蛋白結合對抗原之比率(VWF:CB/Ag)分析、VWF多聚體分析及/或基因分型所診斷，使得VWF水平＜30 (＜0.30 IU/mL之VWF水平)，血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率＜0.7，且VWF多聚體型態異常。在一些實施方式中，該個體患有2N型VWD，如藉由VWF FVIII結合(VWF:FVIIIB)及/或基因測試所診斷。在一些情況下，患有2N型VWD之個體亦基於FVIII ＜ VWF水平或異常水平來診斷。在一些情況下，該基因測試偵測出一或多種2N型VWD基因變異體之存在。用於評估VWF分析(包括針對VWF醣蛋白IB結合、VWF膠原蛋白結合、VWF多聚體、DDAVP攻擊試驗之分析)之方法係熟習此項技術者已知的且描述於例如Patzke及Favaloro, Methods Mol Biol, 2017, 1646:453-460；Higgins及Goodwin, Am J Hematol, 2019, 94:496-503；Stufano等人, Haemophilia, 2020, 26(2):298-305；Ni等人, Int J Lab Hematol, 2013, 35(2):170-176；Michiels等人, Clinical and Applied Thrombosis/Hemostatis, 2017, 23(6):518-531；Mohammed及Favaloro, Methods Mol Biol, 2017, 1646:461-472中。

在一些實施方式中，在過去12個月中，該個體已經投予血漿源性VWF (pdVWF)以治療一或多次出血發作。在一些實施方式中，在過去12個月中，該個體已經投予pdVWF。在一些實施方式中，在過去12個月中，該個體已經投予pdVWF以治療1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次或更多次出血發作。在一些實施方式中，在初次投予rVWF之前的過去12個月中，該個體已經投予pdVWF。換言之，在接受rVWF以治療經血過多出血發作之前的過去12個月內，該個體經投予pdVWF。

在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之VWF:RCo活性介於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL)或更大範圍內。在一些實施方式中，投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之VWF:RCo活性大於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR活性與介於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL)或更大範圍內之VWF:RCo活性相等或可相當。

在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之FVIII:C活性介於0.4 IU/mL (亦即，40 IU/dL)或更大範圍內。在一些實施方式中，投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之FVIII:C活性大於0.4 IU/mL (亦即，40 IU/dL)。

在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之VWF:RCo活性介於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL或正常水平的60%)或更大範圍內(或個體之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR活性與介於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL)或更大範圍內之VWF:RCo活性相等或可相當)且FVIII:C活性介於0.4 IU/mL (亦即，40 IU/dL或正常水平的40%)或更大範圍內。在一些實施方式中，投予一定劑量之rVWF，使得在投予之後，個體之VWF:RCo活性大於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL或正常水平的60%)或更大(或個體之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR活性與介於0.6 IU/mL (亦即，60 IU/dL或正常水平的60%)或更大範圍內之VWF:RCo活性相等或可相當)且FVIII:C活性大於0.4 IU/mL (亦即，正常水平的40%)。

熟習此項技術者認識到，本文所涵蓋之VWF的谷底水平可根據VWF:RCo以及VWF:GPIbM、VWF:GPIbR及其他已知方法量度。因而，儘管VWF谷底水平以VWF:RCo陳述，應理解本文中之任何實施方式均涵蓋藉由VWF:GPIbM或VWF:GPIbR量度之VWF的谷底水平，其等於藉由VWF:RCo量度之所陳述谷底水平。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少30% (亦即，30 IU/dL或0.3 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少35% (亦即，35 IU/dL或0.35 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少40% (亦即，40 IU/dL或0.4 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少45% (亦即，45 IU/dL或0.45 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少50% (亦即，50 IU/dL或0.5 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少55% (亦即，55 IU/dL或0.55 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少60% (亦即，60 IU/dL或0.6 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少65% (亦即，65 IU/dL或0.65 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少70% (亦即，70 IU/dL或0.70 IU/mL)。在一些實施方式中，該個體經投予一定劑量之rVWF，使得個體之VWF:RCo谷底水平為至少75% (亦即，75 IU/dL或0.75 IU/mL)。

在一些實施方式中，rVWF之投予維持大於0.6 IU/mL或60 IU/dL之VWF:RCo谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持實質上等於大於0.6 IU/mL或60 IU/dLL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持大於0.5 IU/mL或50 IU/dL之VWF:RCo谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持實質上等於大於0.5 IU/mL或50 IU/dLL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持大於0.4 IU/mL或40 IU/dL之VWF:RCo谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持實質上等於大於0.4 IU/mL或40 IU/dLL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持大於0.3 IU/mL或30 IU/dL之VWF:RCo谷底水平。在一些實施方式中，rVWF之投予維持實質上等於大於0.3 IU/mL或30 IU/dLL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。

在一些實施方式中，若該個體正在經歷嚴重經血過多發作，則投予一或多個劑量之rVWF以維持大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續約1-7天或更長時間。在一些實施方式中，維持大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續約1-2天、約1-3天、約2-5天、約1-5天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天或更長時間。在一些實施方式中，大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續1週、2週、3週或更長時間，直至消除出血發作。在一些實施方式中，若該個體正在經歷嚴重經血過多發作，則投予一或多個劑量之rVWF持續約1-7天或更長時間以維持實質上等於大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。在一些實施方式中，維持實質上等於大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平持續約1-2天、約1-3天、約2-5天、約1-5天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天或更長時間。在一些實施方式中，維持實質上等於大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平持續1週、2週、3週或更長時間，直至消除出血發作。

在一些實施方式中，若該個體正在經歷輕微至中度經血過多發作，則投予一或多個劑量之rVWF以維持大於0.3 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續約1-7天或更長時間。在一些實施方式中，維持大於0.3 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續約1-2天、約1-3天、約2-5天、約1-5天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天或更長時間。在一些實施方式中，維持大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平持續1週、2週、3週或更長時間，直至消除出血發作。在一些實施方式中，若該個體正在經歷輕微至中度經血過多發作，則投予一或多個劑量之rVWF持續約1-7天或更長時間以維持實質上等於大於0.3 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平。在一些實施方式中，維持實質上等於大於0.3 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平持續約1-2天、約1-3天、約2-5天、約1-5天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天或更長時間。在一些實施方式中，維持實質上等於大於0.5 IU/mL之VWF:RCo谷底水平之VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平持續1週、2週、3週或更長時間，直至消除出血發作。

在一些實施方式中，亦向患有嚴重VWD之個體投予重組因子VIII (rFVIII)以治療經血過多出血發作。在一些情況下，所投予之治療包含rVWF及rFVIII。在其他情況下，所投予之治療不包括rFVIII。在一些實施方式中，向該個體投予在約10-70 IU/kg範圍內之rFVIII，例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60或60-70 IU/kg。在一些情況下，rFVIII以初始(第一)劑量或初始(第一次)輸注投予。在一些情況下，rFVIII未作為第二劑量或第二次輸注之一部分投予。在一些實施方式中，正在經歷經血過多出血發作的患有VWD之個體經投予rVWF及rFVIII之單次輸注。在一些實施方式中，rVWF之第二次投予未與rFVIII一起投予。

在該方法之一些實施方式中，當rVWF及FVIII一起投予時，rVWF對FVIII比率為約1.5:0.8。在該方法之一些實施方式中，當rVWF及FVIII一起投予時，rVWF對FVIII比率為約1.3:1。在該方法之一些實施方式中，當rVWF及FVIII一起投予時，rVWF對FVIII比率為約1.1:0.8。在該方法之一些實施方式中，當rVWF及FVIII一起投予時，rVWF對FVIII比率為約1.5:1。在該方法之一些實施方式中，當rVWF及FVIII一起投予時，rVWF對FVIII比率為約1.1:1.2。

在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予40–50 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予約40 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予約45 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予約50 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，投予1或2個劑量之40–50 IU/kg rVWF，其中經血過多為輕微或中度經血過多。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予1或2個劑量之約40 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予1或2個劑量之約45 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多時，投予1或2個劑量之約50 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多，且其中該個體患有嚴重1型或2型VWD時，投予1或2個劑量之40–50 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予1或2個劑量之約40 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予1或2個劑量之約45 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予1或2個劑量之約50 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為2型VWD時，投予1或2個劑量之約40 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為2型VWD時，投予1或2個劑量之約45 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，當經血過多為輕微或中度經血過多且該嚴重VWD為2型VWD時，投予1或2個劑量之約50 IU/kg rVWF。

在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予約40-90 IU/kg或約50-80 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，約40-90 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，約50-75 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些進一步實施方式中，約50 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些進一步實施方式中，約55 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些進一步實施方式中，約60 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些進一步實施方式中，約65 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些進一步實施方式中，約70 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在進一步實施方式中，約75 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些實施方式中，約80 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在進一步實施方式中，約85 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些實施方式中，約90 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，在投予第一劑量之rVWF之後，每8至12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。

在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約50 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約50 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約50 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約50 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約50 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約55 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約55 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約55 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約55 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約55 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為1型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。

在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予約50-80 IU/kg rVWF或約60-80 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，約60-80 IU/kg rVWF之第一劑量在一些進一步實施方式中，約60 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時。在一些進一步實施方式中，約65 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時。在一些進一步實施方式中，約70 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時。在一些進一步實施方式中，約75 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時。在一些進一步實施方式中，約80 IU/kg rVWF之第一劑量且當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，在投予第一劑量之rVWF之後，每8至12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。

在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之初始劑量(亦稱作第一劑量)，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約60 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約65 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約70 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約75 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約80 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約40 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約80 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約45 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約80 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約50 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約80 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約55 IU/kg rVWF持續約3天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多且該嚴重VWD為2型或3型VWD時，投予約80 IU/kg rVWF之第一劑量，且接著每8至12小時投予約60 IU/kg rVWF持續約3天。

在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予約50-80 IU/kg rVWF或約60-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予40-60 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予50-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予約40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予約40 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予50-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予約45 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予50-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予約50 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予50-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予約55 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。在一些進一步實施方式中，當經血過多為嚴重或嚴重經血過多時，投予50-80 IU/kg rVWF之第一劑量，接著每8-12小時投予40-60 IU/kg rVWF持續約3天，且接著進一步投予約60 IU/kg rVWF，直至治療之總持續時間為7天。

一般而言，1型VWD係由＜30 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、＜30 IU/dL VWF:Ag、低或正常FVIII及＞0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。2A型VWD係由＜30 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、＜30-200 IU/dL VWF:Ag、低或正常FVIII及＜0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。2B型VWD係由＜30-200 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、＜30 IU/dL VWF:Ag、低或正常FVIII及通常＜0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。2M型VWD係由＜30 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、＜30-200 IU/dL VWF:Ag、低或正常FVIII及＜0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。2N型VWD係由30-2000 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、30-200 IU/dL VWF:Ag、極低FVIII及＞0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。3型VWD係由＜3 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、＜3 IU/dL VWF:Ag、極低(＜10 IU/dL) FVIII所測定，且VWF:RCo/VWF:Ag比率不適用。正常係由50-200 IU/dL VWF:RCo或其相等值指示，如藉由VWF之血小板結合活性(亦即，VWF:GPIbM及VWF:GPIbR)、50-200 IU/dL VWF:Ag、正常FVIII及＞0.5-0.7 IU/dL VWF:RCo/VWF:Ag比率或基於血小板結合活性VWF/VWF:Ag比率之其相等值所測定。在一些實施方式中，該個體患有3型VWD。在一些實施方式中，該個體患有嚴重1型VWD。在一些實施方式中，該個體患有嚴重2型VWD。

在一些實施方式中，該個體在先前12個月內已針對至少1次出血事件進行治療。在一些實施方式中，該個體在先前12個月內已針對超過1次出血事件進行治療。

在一個方面，患有VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多。在一些實施方式中，患有VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療輕微經血過多。在一些實施方式中，患有VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療中度經血過多。在一些實施方式中，患有VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療嚴重經血過多。在一些實施方式中，患有1型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有2型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有2A型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有2B型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有2M型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有2N型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有3型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有嚴重3型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。在一些實施方式中，患有非嚴重3型VWD之個體經投予介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內之至少一個劑量的rVWF以治療經血過多，包括輕微、中度或嚴重經血過多發作。

在一些實施方式中，患有VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量及30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。在一些實施方式中，患有1型VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量及30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。在一些實施方式中，患有2型VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量及30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。在一些實施方式中，患有3型VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有VWD及輕微經血過多之個體經投予30–60 IU/kg rVWF之第一劑量及30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。

在一些實施方式中，患有VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量及每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之後續劑量持續約3天。在一些實施方式中，患有VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量、每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之額外劑量持續約3天及每天一次30-70 IU/kg rVWF之後續劑量，其中rVWF治療之總持續時間不超過7天。在特定實施方式中，至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。

在特定實施方式中，rVWF之各劑量與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，第一劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每8-12小時投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每天投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些情況下，rVWF及rFVIII同時或依序投予至該個體。在一些實施方式中，rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。

在一些實施方式中，患有1型VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有1型VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量及每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之後續劑量持續約3天。在一些實施方式中，患有1型VWD及嚴重經血過多之個體經投予40–90 IU/kg rVWF之第一劑量、每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之額外劑量持續約3天及每天一次30-70 IU/kg rVWF之後續劑量，其中rVWF治療之總持續時間不超過7天。在特定實施方式中，至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在特定實施方式中，rVWF之各劑量與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，第一劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每8-12小時投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每天投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些情況下，rVWF及rFVIII同時或依序投予至該個體。在一些實施方式中，rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。

在一些實施方式中，患有2型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有2型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量及每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之後續劑量持續約3天。在一些實施方式中，患有2型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量、每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之額外劑量持續約3天及每天一次30-70 IU/kg rVWF之後續劑量，其中rVWF治療之總持續時間不超過7天。在特定實施方式中，至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在特定實施方式中，rVWF之各劑量與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，第一劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每8-12小時投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每天投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些情況下，rVWF及rFVIII同時或依序投予至該個體。在一些實施方式中，rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。

在一些實施方式中，患有3型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量。在一些實施方式中，患有3型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量及每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之後續劑量持續約3天。在一些實施方式中，患有3型VWD及嚴重經血過多之個體經投予50–90 IU/kg rVWF之第一劑量、每8至12小時30-70 IU/kg rVWF之額外劑量持續約3天及每天一次30-70 IU/kg rVWF之後續劑量，其中rVWF治療之總持續時間不超過7天。在特定實施方式中，至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在特定實施方式中，rVWF之各劑量與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，第一劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每8-12小時投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些實施方式中，每天投予的至少一個劑量之rVWF與重組因子VIII一起投予。在一些情況下，rVWF及rFVIII同時或依序投予至該個體。在一些實施方式中，rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。

在一些實施方式中，患有嚴重1型VWD且經歷嚴重經血過多發作之個體經投予持續不超過7天之總持續時間：(a) 50-75 IU/kg rVWF之第一劑量；(b)每8-12小時40-60 IU/kg rVWF之第二組劑量持續3天，使得個體的VWF:RCo谷底水平為至少50%；及(c)每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三組劑量。

在一些實施方式中，患有嚴重2型VWD且經歷嚴重經血過多發作之個體經投予持續不超過7天之總持續時間：(a) 60-80 IU/kg rVWF之第一劑量；(b)每8-12小時40-60 IU/kg rVWF之第二組劑量持續3天，使得個體的VWF:RCo谷底水平為至少50%；及(c)每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三組劑量。

在一些實施方式中，若該個體正在經歷輕微至中度經血過多發作，則投予一或多個劑量之rVWF。在一些實施方式中，對於輕微至中度出血發作，該個體經投予一個劑量之rVWF。在一些實施方式中，對於輕微至中度出血發作，該個體經投予兩個劑量之rVWF。在一些實施方式中，對於嚴重經血過多出血發作，該個體經投予一個劑量之rVWF。在一些實施方式中，對於嚴重出血發作，該個體經投予兩個劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之劑量之rVWF。在一些實施方式中，患有嚴重經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之劑量之rVWF。在一些實施方式中，患有中度經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或40-60 IU/k範圍內之劑量之rVWF。在一些實施方式中，患有輕微經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之劑量之rVWF。在一些實施方式中，該個體經投予1、2個或更多個劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第一劑量之rVWF。在某些實施方式中，該個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第二劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有嚴重經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第一劑量之rVWF。在某些實施方式中，該個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第二劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有中度經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第一劑量之rVWF。在某些實施方式中，該個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第二劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有輕微經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第一劑量之rVWF。在某些實施方式中，該個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第二劑量之rVWF。

在一些實施方式中，患有經血過多發作之個體經投予介於約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之第一劑量。在一些實施方式中，rVWF之後續劑量介於每4-12小時約30-90 IU/kg、約30-60 IU/kg、約40-80 IU/kg、約50-75 IU/kg、約50-90 IU/kg、約50-80 IU/kg、約70-90 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內。

在一些實施方式中，rVWF之後續劑量介於每4-12小時、6-12小時、8-12小時、10-12小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時及12小時約30-70 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內。在一些實施方式中，rVWF之後續劑量在出血發作之持續時間內經投予。在一些實施方式中，投予rVWF之後續劑量，直至消除出血發作。在一些實施方式中，投予rVWF之後續劑量持續約1-2天、約1-3天、約2-5天、約1-5天、約1-7天、約2-7天、約3-7天、約4-7天、約5-7天、約6-7天或更長時間。在一些實施方式中，在第一劑量之後，每8-12小時以介於約30-70 IU/kg或約40-60 IU/kg範圍內之劑量投予rVWF持續約3天。

在一些實施方式中，在治療之第一天投予第一劑量之rVWF，且投予後續劑量持續總計達7天之治療。在一些實施方式中，在第1天投予第一劑量之rVWF，且投予其後劑量持續2天、3天、4天、5天或更長時間。在某些實施方式中，rVWF之投予維持0.5 IU/mL或更大之VWF:RCo谷底水平或其相等值，如藉由可相當VWF活性分析，諸如但不限於VWF:GPIbM分析及VWF:GPIbR分析所測定。

在一些實施方式中，患有輕微或中度經血過多發作之個體經投予40-50 IU/kg，呈一或兩個劑量(亦即，一或兩次輸注)。在一些實施方式中，該個體經診斷患有嚴重1型VWD。在一些實施方式中，該個體經診斷患有嚴重1型VWD且具有20%之基線VWF:RCo活性或其相等值，如藉由可相當VWF活性分析，諸如但不限於VWF:GPIbM分析及VWF:GPIbR分析所測定。

在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約50-75 IU/kg之初始劑量(亦即，第一劑量或第一組劑量)、每8-12小時約40-60 IU/kg之第二劑量或第二組劑量持續3天及每日約40-60 IU/kg之第三劑量或第三組劑量持續總計達7天之治療。在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約60-80 IU/kg之第一劑量，及每8-12小時約40-60 IU/kg之額外後續劑量持續3天。在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約60-80 IU/kg之第一劑量，及每天約40-60 IU/kg之額外後續劑量持續總計達7天之治療。在一些情況下，在第一劑量之後的額外劑量保持0.5 IU/mL或更大之VWF:RCo谷底水平或其相等值，如藉由可相當VWF活性分析所測定。在一些實施方式中，該個體經診斷患有嚴重1型VWD。在一些實施方式中，該個體經診斷患有嚴重1型VWD且具有20%之基線VWF:RCo活性或其相等值，如藉由可相當VWF分析，諸如但不限於VWF:GPIbM分析及VWF:GPIbR分析所測定。

在一些實施方式中，患有輕微或中度經血過多發作之個體經投予40-50 IU/kg，呈一或兩個劑量(亦即，一或兩次輸注)。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2型VWD，包括但不限於2A型、2B型、2N型或2M型。在一些實施方式中，該個體經診斷患有3型VWD。

在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約60-80 IU/kg之第一劑量(亦即，第一劑量或第一組劑量)、每8-12小時約40-60 IU/kg之第二劑量或第二組劑量持續3天及每天約40-60 IU/kg之第三劑量或第三組劑量持續總計達7天之治療。在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約60-80 IU/kg之第一劑量，及每8-12小時約40-60 IU/kg之額外後續劑量持續3天。在一些實施方式中，患有嚴重或嚴重經血過多發作之個體經投予約60-80 IU/kg之第一劑量，及每天約40-60 IU/kg之額外後續劑量持續總計達7天之治療。在一些情況下，在第一劑量之後的劑量保持0.5 IU/mL或更大之VWF:RCo谷底水平或其相等值，如藉由可相當VWF活性分析所測定。在一些實施方式中，該個體經診斷患有2型VWD，包括但不限於2A型、2B型、2N型或2M型VWD。在一些實施方式中，該個體經診斷患有3型VWD，亦即嚴重或非嚴重3型VWD。

在一些實施方式中，患有經血過多發作之個體在出血發作過程(亦即，持續時間)中經投予介於約40 IU/kg至約200 IU/kg範圍(例如，約40 IU/kg至約200 IU/kg、約40 IU/kg至約195 IU/kg、約40 IU/kg至約190 IU/kg、約40 IU/kg至約185 IU/kg、約40 IU/kg至約180 IU/kg、約40 IU/kg至約175 IU/kg、約40 IU/kg至約170 IU/kg、約40 IU/kg至約165 IU/kg、約40 IU/kg至約160 IU/kg、約40 IU/kg至約155 IU/kg、約40 IU/kg至約150 IU/kg、約41 IU/kg至約200 IU/kg、約42 IU/kg至約200 IU/kg、約43 IU/kg至約200 IU/kg、約44 IU/kg至約200 IU/kg、約45 IU/kg至約200 IU/kg、約46 IU/kg至約200 IU/kg、約47 IU/kg至約200 IU/kg、約48 IU/kg至約200 IU/kg、約49 IU/kg至約200 IU/kg、約50 IU/kg至約200 IU/kg、約52 IU/kg至約200 IU/kg、約55 IU/kg至約200 IU/kg、約58 IU/kg至約200 IU/kg、約60 IU/kg至約200 IU/kg、約62 IU/kg至約200 IU/kg、約64 IU/kg至約200 IU/kg、約66 IU/kg至約200 IU/kg、約68 IU/kg至約200 IU/kg、約69 IU/kg至約200 IU/kg、約70 IU/kg至約200 IU/kg、約72 IU/kg至約200 IU/kg、約74 IU/kg至約200 IU/kg、約75 IU/kg至約200 IU/kg、約77 IU/kg至約200 IU/kg、約79 IU/kg至約200 IU/kg、約80 IU/kg至約200 IU/kg、約40 IU/kg至約160 IU/kg、約40 IU/kg至約159 IU/kg、約44 IU/kg至約185 IU/kg及其類似範圍)內之rVWF。

在一些實施方式中，患有經血過多發作之個體在出血發作過程中經投予介於約15 IU/kg至約100 IU/kg範圍(例如，約15 IU/kg至約100 IU/kg、約17 IU/kg至約100 IU/kg、約18 IU/kg至約100 IU/kg、約19 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約100 IU/kg、約21 IU/kg至約100 IU/kg、約22 IU/kg至約100 IU/kg、約23 IU/kg至約100 IU/kg、約24 IU/kg至約100 IU/kg、約25 IU/kg至約100 IU/kg、約26 IU/kg至約100 IU/kg、約27 IU/kg至約100 IU/kg、約28 IU/kg至約100 IU/kg、約29 IU/kg至約100 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約31 IU/kg至約100 IU/kg、約32 IU/kg至約100 IU/kg、約33 IU/kg至約100 IU/kg、約34 IU/kg至約100 IU/kg、約35 IU/kg至約100 IU/kg、約36 IU/kg至約100 IU/kg、約37 IU/kg至約100 IU/kg、約38 IU/kg至約100 IU/kg、約39 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約41 IU/kg至約100 IU/kg、約42 IU/kg至約100 IU/kg、約43 IU/kg至約100 IU/kg、約44 IU/kg至約100 IU/kg、約45 IU/kg至約100 IU/kg、約46 IU/kg至約100 IU/kg、約47 IU/kg至約100 IU/kg、約48 IU/kg至約100 IU/kg、約49 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約15 IU/kg至約75 IU/kg、約20 IU/kg至約75 IU/kg、約25 IU/kg至約75 IU/kg、約30 IU/kg至約75 IU/kg、約25 IU/kg至約45 IU/kg、約28 IU/kg至約40 IU/kg、約25 IU/kg至約74 IU/kg、約30 IU/kg至約74 IU/kg、約31 IU/kg至約74 IU/kg及其類似範圍)內之rFVIII。

在一些實施方式中，投予rVWF以治療經血過多發作之個體先前已經投予激素療法以治療先前經血過多發作。在多個實施方式中，先前經血過多發作使用聯合避孕或左炔諾孕酮子宮內釋放系統來治療。在一些實施方式中，先前經血過多發作使用胺甲環酸來治療。在其他實施方式中，先前經血過多發作使用去氨加壓素來治療。對用於治療患有VWD之個體之經血過多發作之其他方法之描述可見於例如Connell等人, Blood, 2021, 5(1):301-325；Rimmer等人, Haemophilia, 2013, 19(6):933-938；Adeyemi-Fowode等人,; J Pediatr Adolesc Gynecol, 2017, 30(4):479-483；Chi等人, Contraception, 2011, 83(3): 242-247；Kouides等人, Br J Haematol, 2009, 145(2):212-220；Kingman等人, BJOG, 2004, 111(12):1425-1428；Amesse等人, J Pediatr Hemaltol Oncol, 2005, 27(7):357-363；及Lukes等人, Fertil Steril, 2008, 90(3):673-677中；該等文獻之內容藉此以全文引用之方式併入。

在一些實施方式中，該個體用單獨rVWF治療。在一些實施方式中，該個體未用血漿源性VWF治療。在一些實施方式中，該個體經投予重組FVIII。在一些實施方式中，該個體未經投予重組FVIII以治療經血過多發作。

在一些實施方式中，該個體針對經血過多發作經投予一個劑量之rVWF。在一些實施方式中，該個體針對經血過多發作經投予至少一個劑量之rVWF。在一些實施方式中，該個體針對經血過多發作經投予2-6個劑量，例如2個劑量、3個劑量、4個劑量、5個劑量或6個劑量之rVWF。在一些實施方式中，該個體針對經血過多發作經投予2-6次輸注，例如2次輸注、3次輸注、4次輸注、5次輸注或6次輸注之rVWF。

經血過多或月經大出血(HMB)係患有諸如VWD經歷之出血病症之女性的常見症狀。對於未患出血病症之女性，平均月經失血為25–80 ml，無顯著凝塊。在一些情況下，基於個體之自我報告症狀及此類症狀對生活品質的影響，而非個體之平均月經失血，個體被認為經歷經血過多。因而，患有經血過多之個體可具有每次經血過多出血發作少於80 ml之平均失血。經血過多之分類及管理指南可見於例如National Institute for Health and Care Excellence (NICE) Heavy menstrual bleeding: assessment and management. NICE guideline, 2018；Quinn及Higham, Women’s Health (Lond.), 2016, 122(1):21-26；及Magnay等人, BMC Women’s Health, 2020, 20:24中。在一些情況下，經血過多係根據PALM–COEIN系統(Management of acute abnormal uterine bleeding in nonpregnant reproductive-aged women. Committee Opinion No. 557. American College of Obstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol 2013;121:891–6.)來分類。

經血過多出血發作可藉由熟習此項技術者認可之量測及評估來評價。評估之非限制性實例包括Ruta經血過多評分、FIGO AUB系統1、FIGO AUB系統2、血液評估圖(PBAC)、循環嚴重程度評分(CSR)、循環長度(CL)、問卷、健康調查及其任何組合。

在一些實施方式中，輕微經血過多係指月經出血發作，使得個體之血紅蛋白水平大於12 g/dL。在一些實施方式中，中度經血過多係指月經出血發作，使得個體之血紅蛋白水平為約9-12 g/dL。在一些實施方式中，嚴重或嚴重經血過多係指月經出血發作，使得個體之血紅蛋白水平約小於9 g/dL。在一些情況下，經血過多係基於以下因素中之一或多者：(a)基於個體的自身經歷之月經出血量，(b)經血過多發生率，(c)月經頻率，(d)流量持續時間，及(e)每月失血量。

在一些實施方式中，輕微經血過多包括特徵在於與嚴重經血過多相比具有較低出血嚴重程度之月經出血發作。在一些實施方式中，嚴重或嚴重經血過多包括特徵在於與輕微經血過多相比具有較高出血嚴重程度之月經出血發作。在一些情況下，個體在評價/評估出血發作對個體之身體、社交、情感及/或物質生活品質的影響時確定輕微、中度或嚴重經血過多出血發作。

一般而言，輕微出血之特徵在於急性或亞急性臨床明顯出血，其不滿足嚴重出血(major hemorrhage/major bleeding)及/或臨床上相關的非嚴重出血(CRNM出血) (亞里斯多德臨床定義)之準則。一般而言，嚴重出血之特徵在於國際血栓與止血學會(International Society on Thrombosis and Haemostasis；ISTH)標準，且包括任何危及生命及/或致命的出血以及關鍵區域或器官中的症狀性出血。嚴重出血事件可包括其中存在至少20 g/L之血紅蛋白下降或＞ 2個單位全血之輸血的彼等事件(危及生命之出血定義中提及的填充細胞；危及生命之出血的RE-LY定義：以下準則≥ 1：至少5.0 g/L之血紅蛋白水平降低；至少4 U血液或填充細胞之輸血；與低血壓相關，需要使用靜脈內強心劑；＞ 2 g/dL之血紅蛋白下降或＞ 2個單位全血/紅細胞之輸血(ISTH或Rocket-AF臨床定義)；及/或需要手術或≥2 U輸血或伴隨≥ 2.0 g/L之血紅蛋白減少發作的出血。參見例如Rodeghiero等人, Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2010, 8:2063-2065及關於ISTH血液評估工作之補充材料; 「The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease,」 NIH公開案第08-5832號, 2007年12月；及Connell等人, Blood Advances, 2021, 5(1):301-325。II. rVWF 投予用於治療嚴重 VWD 患者之經血過多之治療功效

在一些實施方式中，本發明提供治療患有嚴重馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多發作。在一些實施方式中，該治療包括向該個體投予重組馮威里氏因子(rVWF)以便控制經血過多發作。在一些實施方式中，控制經血過多發作包括但不限於降低出血嚴重程度、出血持續時間、出血頻率及消除經血過多發作所耗用的時間。在一些實施方式中，控制經血過多發作指示治療功效。

在一些實施方式中，rVWF投予之治療功效係由如與用rVWF治療之前的水平相比，在用rVWF治療之後的FVIII、FVIII:C、VWF:RCo、VWF:GPIbM、VWF:GPIbR、血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率、VWF膠原蛋白結合對抗原之比率(VWF:CB/VWF:Ag比率)及/或VWF:Ag活性水平之改善指示。在一些實施方式中，FVIII、FVIII:C、VWF:RCo、VWF:GPIbM、VWF:GPIbR、血小板依賴性VWF活性/VWF:Ag比率、VWF膠原蛋白結合對抗原之比率(VWF:CB/VWF:Ag比率)及/或VWF:Ag活性水平之改善包括該等活性水平之改變，使得該等活性水平更接近正常水平(亦即，未患VWD之個體的水平)。

在一些實施方式中，治療功效根據臨床等級量表來確定。在一些實施方式中，臨床等級量表包括3、4或5個分類層級或準則。在一些實施方式中，臨床等級量表包括「優良」、「良好」、「中等」及「無」等級。

在一些實施方式中，根據本文所提供之方法向經歷嚴重或嚴重經血過多發作的患者投予rVWF提供了歸類為「優良」或「良好」之治療功效。在一些情況下，rVWF投予之治療功效係定義為「中等」。在一些實施方式中，根據本文所提供之方法向經歷輕微及/或中度經血過多發作的患者投予rVWF提供了歸類為「優良」或「良好」之治療功效。在一些情況下，rVWF投予之治療功效係定義為「中等」。

在一些實施方式中，當輸注次數等於或小於治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之估計輸注次數時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療輕微及/或中度經血過多發作之治療功效等級為「優良」。在一些實施方式中，當與治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之次數相比需要多1-2次額外輸注來消除發作時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療輕微及中度經血過多發作之治療功效等級為「良好」。在一些實施方式中，當與治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之次數相比需要3次或3次以上額外輸注來消除發作時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療輕微及中度經血過多發作之治療功效等級為「中等」。在一些實施方式中，當藉由rVWF治療未改變嚴重及不受控制出血且需要額外含VWF之凝血因子療法時，指示治療輕微及中度經血過多發作之治療功效等級為「無」。

在一些實施方式中，當輸注次數等於或小於治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之估計輸注次數時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療嚴重或嚴重經血過多發作之治療功效等級為「優良」。在一些實施方式中，當與治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之次數相比需要更多且不足1.5倍輸注來消除發作時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療嚴重或嚴重經血過多發作之治療功效等級為「良好」。在一些實施方式中，當與治療未患1型、2A型、2B型、2M型、2N型或3型VWD之個體的可相當發作所需之次數相比需要更多且至少1.5倍(例如，＞ 1.5倍)輸注來消除發作時，且當不需要額外含VWF之凝血因子療法來消除經血過多發作時，指示治療嚴重或嚴重經血過多發作之治療功效等級為「中等」。

在一些實施方式中，當藉由rVWF治療未改變嚴重及不受控制出血或出血強度且需要額外含VWF之凝血因子療法時，指示治療嚴重或嚴重經血過多發作之治療功效等級為「無」。

治療功效亦可使用可用於評價經血過多之以下量度中的一或多者來評估：PBAC引起之月經出血、循環嚴重程度、循環持續時間以及健康相關生活品質(HRQoL)問卷，包括Rand簡式36項健康調查(Rand Short Form 36-Question Health Survey；SF-36)、Ruta經血過多嚴重程度量表、疾病控制中心健康相關生活品質-14項表格(CDC-HRQoL14)及流行病學研究中心抑鬱量表(CES-D)。 III. 重組馮威里氏因子(rVWF)

本發明利用包含rVWF之組成物來治療已經歷或正在經歷經血過多出血發作的患有嚴重VWD之個體。在一些實施方式中，該包含rVWF之組成物係用於預防患有嚴重VWD之個體之經血過多出血發作之發作。

在某些實施方式中，本發明之VWF蛋白可包含構築體，諸如WO 1986/06096及US 8,597,910中針對製造重組VWF所描述之彼等。所提供之可用VWF包括所有可能形式，包括單體及多聚體形式。VWF之一種特別可用形式係至少兩個VWF之同源多聚體。該等VWF蛋白可為生物活性衍生物，或者當欲單獨用作FVIII之穩定劑時，VWF可為非生物活性形式。亦應理解，本發明涵蓋欲組合使用之不同形式之VWF。例如，可用於本發明之組成物可包括不同多聚體、不同衍生物以及生物活性衍生物及非生物活性衍生物兩者。

所提供之rVWF組成物優於pdVWF的優勢在於rVWF展現高於pdVWF之比活性。pdVWF之比活性可介於約40 mU/μg至約70 mU/μg (亦即，約40 IU VWF:RCo/mg蛋白至約70 IU VWF:RCo/mg蛋白)範圍內。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有至少約20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150 mU/μg或更高之比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約20至約30 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約30至約40 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約40至約50 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約50至約60 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約60至約70 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約70至約80 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約80至約90 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約90至約100 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約100至約110 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約110至約120 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約120至約130 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約130至約140 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有在約140至約150 mU/μg之間的比活性。在一些實施方式中，本發明之rVWF具有超過約150 mU/μg之比活性。

在一些實施方式中，根據本文所概述之方法純化的rVWF具有至少約20、22.5、25、27,5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、1 15、120、125、130、135、140、145、150 mU/µg或更高之比活性。在一些實施方式中，用於本文所描述之方法中的rVWF具有20 mU/μg至150 mU /μg之比活性。在一些實施方式中，該rVWF具有30 mU/μg至120 mU/μg之比活性。在一些實施方式中，該rVWF具有40 mU/μg至90 mU/μg之比活性。在一些實施方式中，該rVWF具有選自下表1中可見之變化形式1至133的比活性，該表係WO 2012/171031之表1的再現。表1. 該等組成物中可見且用於本文所提供之方法中的rVWF之比活性之例示性實施方式。

(mU/µg)		(mU/µg)		(mU/µg)		(mU/µg)
20	Var. 1	110	Var. 35	40-150	Var. 68	70-120	Var. 101
22.5	Var. 2	115	Var. 36	40-140	Var. 69	70-110	Var. 102
25	Var. 3	120	Var. 37	40-130	Var. 70	70-100	Var. 103
27.5	Var. 4	125	Var. 38	40-120	Var. 71	70-90	Var. 104
30	Var. 5	130	Var. 39	40-110	Var. 72	70-80	Var. 105
32.5	Var. 6	135	Var. 40	40-100	Var. 73	80-150	Var. 106
35	Var. 7	140	Var. 41	40-90	Var. 74	80-140	Var. 107
37.5	Var. 8	145	Var. 42	40-80	Var. 75	80-130	Var. 108
40	Var. 9	150	Var. 43	40-70	Var. 76	80-120	Var. 109
42.5	Var. 10	20-150	Var. 44	40-60	Var. 77	80-110	Var. 110
45	Var. 11	20-140	Var. 45	40-50	Var. 78	80-100	Var. 111
47.5	Var. 12	20-130	Var. 46	50-150	Var. 79	80-90	Var. 112
50	Var. 13	20-120	Var. 47	50-140	Var. 80	90-150	Var. 113
52.5	Var. 14	20-110	Var. 48	50-130	Var. 81	90-140	Var. 114
55	Var. 15	20-100	Var. 49	50-120	Var. 82	90-130	Var. 115
57.5	Var. 16	20-90	Var. 50	50-110	Var. 83	90-120	Var. 116
60	Var. 17	20-80	Var. 51	50-100	Var. 84	90-110	Var. 117
62.5	Var. 18	20-70	Var. 52	50-90	Var. 85	90-100	Var. 118
65	Var. 19	20-60	Var. 53	50-80	Var. 86	100-150	Var. 119
67.5	Var. 20	20-50	Var. 54	50-70	Var. 87	100-140	Var. 120
70	Var. 21	20-40	Var. 55	50-60	Var. 88	100-130	Var. 121
72.5	Var. 22	30-150	Var. 56	60-150	Var. 89	100-120	Var. 122
75	Var. 23	30-140	Var. 57	60-140	Var. 90	100-110	Var. 123
77.5	Var. 24	30-130	Var. 58	60-130	Var. 91	110-150	Var. 124
80	Var. 25	30-120	Var. 59	60-120	Var. 92	110-140	Var. 125
82.5	Var. 26	30-110	Var. 60	60-110	Var. 93	110-130	Var. 126
85	Var. 27	30-100	Var. 61	60-100	Var. 94	110-120	Var. 127
87.5	Var. 28	30-90	Var. 62	60-90	Var. 95	120-150	Var. 128
90	Var. 29	30-80	Var. 63	60-80	Var. 96	120-140	Var. 129
92.5	Var. 30	30-70	Var. 64	60-70	Var. 97	120-130	Var. 130
95	Var. 31	30-60	Var. 65	70-150	Var. 98	130-150	Var. 131
97.5	Var. 32	30-50	Var. 66	70-140	Var. 99	130-140	Var. 132
100	Var. 33	30-40	Var. 67	70-130	Var. 100	140-150	Var. 133
105	Var. 34

Var. =變化形式

本文所概述之rVWF組成物係高度多聚體，包含約10至約40個次單元。在一些實施方式中，使用下文所概述之方法製造的多聚體rVWF包含約10-30、12-28、14-26、16-24、18-22、20-21個次單元。在進一步實施方式中，該rVWF以大小變化之多聚體形式存在，自二聚體至超過40個次單元之多聚體(＞1000萬道爾頓)。最大多聚體提供可與血小板受體及內皮下基質損傷位點相互作用之多個結合位點且係VWF之最具止血活性的形式。ADAMTS13之應用將隨時間裂解超大rVWF多聚體，但在製造(一般地藉由細胞培養物中之表現)期間，本發明之rVWF組成物一般地不暴露於ADAMTS13且保持其高度多聚體結構。有關VWF多聚體之額外細節可見於以下部分。

在特定方面，該rVWF未藉由任何綴合、轉譯後或共價修飾經修飾。在特定實施方式中，本發明之rVWF未經水溶性聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羥基乙基澱粉、聚碳水化合物部分及其類似物修飾。

在其他方面，該rVWF藉由綴合、轉譯後修飾或共價修飾經修飾，包括N端或C端殘基之修飾以及所選擇之側鏈的修飾，例如在遊離巰基、一級胺及羥基處。在一實施方式中，水溶性聚合物藉由離胺酸基團或其他一級胺連接至該蛋白質(直接或經由連接體)。在一實施方式中，本發明之rVWF蛋白可藉由綴合水溶性聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羥基乙基澱粉、聚碳水化合物部分及其類似物經修飾。

可用於修飾rVWF及/或FVIII之水溶性聚合物包括直鏈及分支鏈結構。綴合之聚合物可直接附接至本發明之凝血蛋白，或替代地可經由連接部分進行附接。蛋白與水溶性聚合物之綴合之非限制性實例可見於美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號及第4,179,337號，以及Abuchowski及Davis 「Enzymes as Drugs,」 Holcenberg及Roberts編, 第367 383頁, John Wiley and Sons, New York (1981)，及Hermanson G., Bioconjugate Techniques第2版, Academic Press, Inc. 2008中。 IV. 重組VWF之製造

本發明之遊離成熟重組馮威里氏因子(rVWF)可重組製造。熟習此項技術者認識到可用於在宿主細胞中表現重組蛋白之方法。在一些情況下，該方法包括在諸如CHO細胞之宿主細胞中表現編碼rVWF之核酸序列，及在某些條件下培養所得宿主細胞以製造rVWF、前原VWF、原VWF及其類似物。

在某些實施方式中，包含編碼VWF之序列之核酸序列可為表現載體。該載體可由病毒遞送，或可為質體。編碼該蛋白質之核酸序列可為特定基因或其生物功能部分。在一實施方式中，該蛋白質至少為VWF之生物活性部分。該核酸序列可進一步包含適用於蛋白質(諸如啟動子序列、增強子、TATA盒、轉錄起始位點、聚連接體、限制位點、poly-A-序列、蛋白質加工序列、選擇標記及一般技術者一般已知的其類似物)之受控表現之其他序列。

多種載體可用於VWF表現且可選自真核表現載體。用於真核表現之載體之實例包括：(i)關於酵母中的表現，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET之載體，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等啟動子；(ii)關於昆蟲細胞中的表現，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等載體，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等啟動子，及(iii)關於哺乳動物細胞中的表現，諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等載體，及衍生自病毒系統(諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、逆轉錄病毒等)之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。

在一些實施方式中，用於本發明方法中之rVWF係藉由使用此項技術已知之方法在哺乳動物細胞培養物中表現而製造的。在特定實施方式中，哺乳動物培養物包含CHO細胞。在進一步實施方式中，rVWF與重組因子VIII (rFVIII)共表現於同一培養物中。在此類實施方式中，rVWF及rFVIII使用此項技術中已知之方法一起(共純化)或單獨經純化。在其他實施方式中，rVWF表現於不含rFVIII之培養物中。

在一些實施方式中，rVWF自合適的真核宿主系統中表現且分離。真核細胞之實例包括但不限於哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2；昆蟲細胞，例如SF9細胞、SF21細胞、S2細胞及High Five細胞；及酵母細胞，例如酵母或裂殖酵母細胞。在一實施方式中，該VWF可表現於酵母細胞、昆蟲細胞、禽細胞、哺乳動物細胞及其類似細胞中。例如，人類細胞株、倉鼠細胞株或鼠科動物細胞株中。在一特定實施方式中，細胞株為CHO、BHK或HEK細胞株。典型地，哺乳動物細胞(例如來自傳代細胞株之CHO細胞)可用於表現本發明之VWF。在某些情況下，VWF蛋白自CHO細胞表現系統表現且分離。

VWF可在細胞培養系統中或根據熟習此項技術者認可之任何細胞培養方法製造。在一些實施方式中，細胞培養可在大型生物反應器中在適用於提供高體積-比培養表面積以實現高細胞密度及蛋白質表現之條件下執行。一種用於提供此類生長條件之方法係使用微載體在攪拌槽生物反應器中進行細胞培養。微載體上之細胞生長的概念首先由van Wezel (van Wezel, A. L., Nature, 1967, 216:64-5)描述且允許細胞附著於懸浮於生長培養基中之小固體顆粒之表面上。此等方法提供高表面積-體積比率且因此允許有效養分利用。此外，關於真核細胞株中分泌之蛋白質之表現，增加的表面積-體積比率允許較高水平之分泌且因此允許培養物之上清液中的較高蛋白質產率。最後，此等方法允許容易地按比例增加真核表現培養物。

表現VWF之細胞可在細胞培養生長期間結合於球形或多孔微載體。該微載體可為選自基於葡聚糖、膠原蛋白、塑膠、明膠及纖維素以及如Butler (1988. Spier及Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303)所述之其他物質之微載體之群的微載體。亦可能使細胞在球形微載體上生長成生物質，且在細胞已實現最終酵原生物質時且在多孔微載體上製造表現之蛋白質之前對細胞進行繼代培養，或反之亦然。合適之球形微載體可包括光滑表面微載體，諸如Cytodex™ 1、Cytodex™ 2及Cytodex™ 3 (GE Healthcare)，及大孔微載體，諸如Cytopore™ 1、Cytopore™ 2、Cytoline™ 1及Cytoline™ 2 (GE Healthcare)。

在另一實施方式中，VWF肽原經由使原VWF暴露於弗林蛋白酶而活體外自非成熟VWF裂解。在一些實施方式中，用於肽原裂解之弗林蛋白酶為重組弗林蛋白酶。

在某些實施方式中，rVWF在製造高分子量rVWF之細胞培養基中培養之細胞中表現。術語「細胞培養溶液」、「一種或多種細胞培養基」及「細胞培養上清液」係指此項技術中一般熟知之細胞培養過程的各方面。在本發明之上下文中，細胞培養溶液可包括細胞培養基及細胞培養上清液。細胞培養基視情況與補充劑一起自外部添加至細胞培養溶液中，以提供用於培養表現VWF之細胞之養分及其他組分。細胞培養上清液係指細胞培養溶液，其包含來自細胞培養基之養分及其他組分以及在培養期間自細胞釋放、代謝及/或排出之產物。在進一步實施方式中，該等培養基可為無動物蛋白的且為化學成分確定的。製備無動物蛋白且化學成分確定的培養基之方法係此項技術中，例如US 2006/0094104、US 2007/0212770及US 2008/0009040中已知的，該等文獻均出於所有目的且尤其針對與細胞培養基有關之所有教示併入本文中。「無蛋白」及相關術語係指蛋白質來自培養物外部或除培養物中的細胞以外之來源，該來源在生長期間自然地排出蛋白質。在另一實施方式中，培養基不含多肽。在另一實施方式中，培養基不含血清。在另一實施方式中，培養基不含動物蛋白。在另一實施方式中，培養基不含動物組分。在另一實施方式中，培養基含有蛋白質，例如來自諸如胎牛血清之血清的動物蛋白。在另一實施方式中，培養物具有外源添加之重組蛋白。在另一實施方式中，該等蛋白質來自合格的無病原體動物。如本文所用，術語「化學成分確定」應意謂培養基不包含任何未確定之補充物，諸如動物組分、器官、腺體、植物或酵母之提取物。因此，化學成分確定的培養基之各組分係精確確定的。在一較佳實施方式中，培養基不含動物組分且不含蛋白質。

在某些實施方式中，表現VWF之細胞之培養物可維持至少約7天，或至少約14天、21天、28天，或至少約5週、6週、7週，或至少約2個月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個月或更長時間。細胞培養物為了製造重組VWF蛋白而維持之細胞密度將取決於培養條件及用於蛋白質表現之培養基。熟習此項技術者將能夠容易地確定用於製造VWF之細胞培養物的最佳細胞密度。在一實施方式中，培養物維持於約0.5x10⁶ 與4x10⁷ 個細胞/ml之間的細胞密度下持續一段延長時期。在其他實施方式中，細胞密度維持於約1.0x10⁶ 與約1.0x10⁷ 個細胞/ml之間的濃度下持續一段延長時期。在其他實施方式中，細胞密度維持於約1.0x10⁶ 與約4.0x10⁶ 個細胞/ml之間的濃度下持續一段延長時期。在其他實施方式中，細胞密度維持於約1.0x10⁶ 與約4.0x10⁶ 個細胞/ml之間的濃度下持續一段延長時期。在其他實施方式中，細胞密度可維持於約2.0x10⁶ 與約4.0x10⁶ 之間，或約1.0x10⁶ 與約2.5x10⁶ 之間，或約1.5x10⁶ 與約3.5x10⁶ 之間，或任何其他相似範圍的濃度下持續一段延長時期。在適當時間之細胞培養之後，rVWF可使用此項技術中已知之方法自表現系統分離。

在一特定實施方式中，用於製造rVWF之傳代細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5x10⁶ 個細胞/mL的濃度下持續一段延長時期。在其他特定實施方式中，細胞密度維持於不超過2.0x10⁶ 個細胞/mL、1.5x10⁶ 個細胞/mL、1.0x10⁶ 個細胞/mL、0.5x10⁶ 個細胞/mL或更低濃度下。在一實施方式中，細胞密度維持於1.5x10⁶ 個細胞/mL與2.5x10⁶ 個細胞/mL之間。

在上述細胞培養物之一實施方式中，細胞培養溶液包含包括銅之培養基補充劑。此類細胞培養溶液描述於例如美國專利第8,852,888號及美國專利第9,409,971號中，該等美國專利由此出於所有目的且尤其針對與細胞培養方法及用於製造重組VWF之組成物有關的所有教示以全文引用之方式併入。

前原VWF之聚核苷酸及胺基酸序列分別以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2陳述，且分別可在GenBank寄存編號NM_000552 (智人馮威里氏因子(VWF) mRNA)及NP_000543處獲得。對應於成熟VWF蛋白之胺基酸序列以SEQ ID NO:3 (對應於全長前原VWF胺基酸序列之胺基酸764-2813)陳述。在一些實施方式中，VWF展現與序列SEQ ID NO:3之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%一致性。在一些實施方式中，本發明之rVWF展現與序列SEQ ID NO:3之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%一致性。參見例如美國專利第8,597,910號、美國專利公開案第2016/0129090號，以及圖6。

可用rVWF之一種形式至少具有如下特性：活體內穩定(亦即，結合)至少一種因子VIII (FVIII)分子且視情況具有藥理學上可接受之醣基化模式。其特定實例包括不含A2結構域，因此抵抗蛋白水解之VWF (Lankhof等人, Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997)，及來自Val 449至Asn 730之VWF片段，包括醣蛋白lb結合結構域及用於膠原蛋白及肝素之結合位點(Pietu等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989)。在一個方面，根據當前技術中已知之方法在缺乏VWF之哺乳動物中進行VWF使至少一種FVIII分子穩定之能力的確定。

本發明之rVWF可藉由此項技術中已知之任何方法製造。因此，此項技術中已知如下方法：(i)藉由遺傳工程改造，例如經由RNA逆轉錄及/或DNA擴增來製造重組DNA，(ii)藉由轉染，例如經由電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞中，(iii)例如以連續或分批方式培養該等經轉型細胞，(iv)例如組成性或在誘導後表現VWF，及(v)例如自培養基或藉由收集經轉型細胞來分離該VWF，以便(vi)例如經由陰離子交換層析或親和層析來獲得經純化之rVWF。在一個方面，重組VWF係使用此項技術中熟知之重組DNA技術在經轉型宿主細胞中製備。例如，可使用合適之限制酶自DNA切除編碼該多肽之序列。或者，在另一方面，使用化學合成技術，諸如胺基磷酸酯方法合成該DNA分子。又，在另一方面，使用此等技術之組合。

本發明亦提供在適當宿主中編碼本發明多肽之載體。該載體包含編碼可操作性連接至適當表現控制序列有之多肽之聚核苷酸。在該聚核苷酸插入至該載體中之前或之後實現此操作性連接之方法係熟知的。表現控制序列包括啟動子、活化子、增強子、操縱子、核糖體結合位點、起動信號、停止信號、帽信號、聚腺苷酸化信號及與轉錄或轉譯控制有關之其他信號。其中具有該聚核苷酸之所得載體用於使適當宿主轉型。此轉型可使用此項技術中熟知之方法執行。

大量可用且熟知之宿主細胞中的任一者均用於本發明之實踐。特定宿主之選擇取決於此項技術認可的多種因素，包括例如與所選表現載體之可相容性、由該DNA分子編碼之肽的毒性、轉型速率、肽之回收容易性、表現特徵、生物安全性及成本。應理解並非所有宿主細胞均對特定DNA序列之表現同樣有效，必須在此等因素之間達成平衡。在此等一般指南內，可用微生物宿主細胞包括但不限於細菌、酵母及其他真菌、昆蟲、植物、培養中之哺乳動物(包括人類)細胞或此項技術中已知之其他宿主。

在習知發酵條件下培養經轉型宿主細胞，使得表現所需化合物。此類發酵條件係此項技術中熟知的。最後，藉由此項技術中熟知之方法自培養基或宿主細胞自身純化該等多肽。

取決於用於表現本發明化合物之宿主細胞，碳水化合物(寡醣)基團視情況附接至已知為蛋白質中之醣基化位點的位點。一般而言，O連接之寡醣附接至絲胺酸(Ser)或酥胺酸(Thr)殘基，而N連接之寡醣附接至天冬醯胺(Asn)殘基，此時其為序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可為除脯胺酸以外之任何胺基酸。X較佳為未計入脯胺酸的19種天然存在之胺基酸之一。N連接及O連接之寡醣的結構以及各類型中可見之糖殘基係不同的。在N連接及O連接之寡醣上均通常可見的一種類型之糖為N-乙醯基神經胺酸(稱作唾液酸)。唾液酸通常為N連接及O連接之寡醣的末端殘基且在一個方面，由於其負電荷而向醣基化化合物賦予酸性特性。該(等)位點可併入本發明化合物之連接體中且較佳地，在該等多肽化合物之重組製造期間由細胞醣基化(例如，在諸如CHO、BHK、COS之哺乳動物細胞中)。在其他方面，該等位點藉由此項技術中已知之合成或半合成程序醣基化。

在一些實施方式中，唾液酸化(sialysation/sialylation)可作為本文所述之純化程序(包括陰離子交換、陽離子交換、尺寸排阻及/或免疫親和方法)之一部分在管柱上執行。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，唾液酸化導致增加之rVWF穩定性。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，唾液酸化導致血液循環中增加之rVWF穩定性(例如，在投予至個體之後)。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，增加之唾液酸化rVWF穩定性導致10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高增加。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，唾液酸化導致增加之rVWF半衰期。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，唾液酸化導致血液循環中增加之rVWF半衰期(例如，在投予至個體之後)。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，增加之唾液酸化rVWF半衰期導致10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高增加。在一些實施方式中，如與未經歷唾液酸化之rVWF相比，增加之唾液酸化rVWF半衰期導致rVWF在血液循環中穩定1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、12小時、24小時或更長時間(例如，在投予至個體之後)。在一些實施方式中，唾液酸化增加2,3唾液酸化及/或2,6唾液酸化之數目。在一些實施方式中，藉由添加2,3唾液酸轉移酶及/或2,6唾液酸轉移酶及CMP-NANA (胞嘧啶核苷-5'-單磷酸-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽)作為額外緩衝步驟來增加唾液酸化。在一些實施方式中，藉由添加2,3唾液酸轉移酶及CMP-NANA (胞嘧啶核苷-5'-單磷酸-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽)作為額外緩衝步驟來增加唾液酸化。在一些實施方式中，藉由添加2,3唾液酸轉移酶及CMP-NANA (胞嘧啶核苷-5'-單磷酸-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽)作為額外緩衝步驟來增加2,3唾液酸化。

在一些實施方式中，藉由添加2,6唾液酸轉移酶及CMP-NANA (胞嘧啶核苷-5'-單磷酸-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽)作為額外緩衝步驟來增加2,6唾液酸化。在一些實施方式中，藉由添加2,3唾液酸轉移酶及/或2,6唾液酸轉移酶及CMP-NANA (胞嘧啶核苷-5'-單磷酸-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽)作為額外緩衝步驟來增加2,3唾液酸化及/或2,6唾液酸化。在一些實施方式中，CMP-NANA係經化學或酶修飾以將經修飾之唾液酸轉移至潛在遊離位置。在一些實施方式中，藉由將rVWF裝載至樹脂上，用一或多種如本文所述之緩衝液洗滌以耗盡不需要的雜質，在允許額外唾液酸化之條件下應用一或多種含有唾液酸轉移酶及CMP-NANA之緩衝液，且用一或多種緩衝液洗滌以耗盡過量唾液酸化試劑，且用一或多種緩衝液溶離增強之rVWF (例如，具有增加之唾液酸化的rVWF)來執行唾液酸化。在一些實施方式中，唾液酸化過程作為如本文所述之陽離子交換方法、陰離子交換方法、尺寸排阻方法或免疫親和純化方法之一部分來執行。

或者，該等化合物藉由使用例如固相合成技術之合成方法來製備。合適技術係此項技術中熟知的，且包括描述於Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, 第335-61頁(Katsoyannis及Panayotis編)；Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149；Davis等人 (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414；Stewart及Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis；US 3,941,763；Finn等人 (1976), The Proteins (第3版) 2: 105-253；及Erickson等人 (1976), The Proteins (第3版) 2: 257-527中之彼等。固相合成係製備個別肽之較佳技術，因為其為製備小肽之最具成本效益的方法。

VWF之片段、變異體及類似物可根據此項技術中熟知之方法製造。多肽之片段可使用但不限於酶裂解(例如，藉由胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶裂解)且亦使用重組方法產生具有特定胺基酸序列之多肽片段來製備。可產生包含該蛋白質中具有特定活性之區域(諸如多聚結構域或此項技術中已知的任何其他可鑑別VWF結構域)之多肽片段。

製備多肽類似物之方法亦為熟知的。多肽之胺基酸序列類似物可為取代、插入、添加或缺失類似物。缺失類似物(包括多肽之片段)缺乏原生蛋白質之一或多個殘基，該等殘基並非功能或免疫原活性所必需的。插入類似物涉及在多肽中之非末端點添加例如胺基酸。此類似物可包括例如且不限於免疫反應性抗原決定基或僅單一殘基之插入。添加類似物(包括多肽之片段)包括在蛋白質之任一或兩個末端處添加一或多個胺基酸，且包括例如融合蛋白。亦預期前述類似物之組合。

取代類似物典型地在該蛋白質內之一或多個位點處將野生型之一胺基酸交換為另一胺基酸，且可經設計以調節該多肽之一或多種特性而不會完全喪失其他功能或特性。在一個方面，取代為保守取代。「保守胺基酸取代」係用具有側鏈或相似化學特性之胺基酸取代胺基酸。用於進行保守取代之相似胺基酸包括具有酸性側鏈(麩胺酸、天冬胺酸)；鹼性側鏈(精胺酸、離胺酸、組胺酸)；極性醯胺側鏈(麩醯胺、天冬醯胺)；疏水性、脂族側鏈(白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸)；芳族側鏈(苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸)；小側鏈(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、酥胺酸、甲硫胺酸)；或脂族羥基側鏈(絲胺酸、酥胺酸)之彼等。

在一個方面，類似物與衍生該等類似物之重組VWF實質上同源或實質上一致。類似物包括保留野生型多肽之至少一些生物活性，例如凝血活性之彼等。

預期之多肽變異體包括但不限於藉由如下該等技術經化學修飾之多肽：泛蛋白化、醣基化(包括聚唾液酸化(polysialation/polysialylation))、綴合至治療劑或診斷劑、標記、共價聚合物附接(諸如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化))、引入不可水解的鍵以及藉由通常未出現於人類蛋白質中之胺基酸(諸如鳥胺酸)的化學合成實現之插入或取代。變異體保留本發明之未經修飾分子之相同或基本上相同的結合特性。此類化學修飾可包括劑直接或間接(例如，經由連接體)附接至VWF多肽。在間接附接之情況下，預期該連接體可為可水解的或不可水解的。

在一個方面，製備聚乙二醇化多肽類似物將包括步驟(a)使該多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使得結合構築體多肽附接至一或多個PEG基團之條件下反應，及(b)獲得反應產物。一般而言，用於醯化反應之最佳反應條件係基於已知參數及所需結果來確定。例如，PEG:蛋白質之比率愈大，聚乙二醇化產物之百分率愈大。在一些實施方式中，結合構築體在N端具有單一PEG部分。聚乙二醇(PEG)可附接至凝血因子以例如提供較長活體內半衰期。該PEG基團可具有任何便利分子量且為直鏈或分支鏈的。PEG之平均分子量介於約2千道爾頓(「kD」)至約100 kDa、約5 kDa至約50 kDa或約5 kDa至約10 kDa範圍內。在某些方面，該等PEG基團經由藉由PEG部分上的天然或經工程改造之反應性基團(例如醛、胺基、硫醇或酯基團)至凝血因子上之反應性基團(例如醛、胺基或酯基)實現的醯化或還原性烷基化或藉由此項技術中已知之任何其他技術附接至凝血因子。

用於製備聚唾液酸化多肽之方法描述於US 2006/160948, Fernandes et Gregoriadis；Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997，及Saenko等人, Haemophilia 12:42-51, 2006中。簡言之，含有0.1 M NaIO₄ 之聚乙醯神經胺酸(CA)溶液在室溫下於暗處攪拌以氧化CA。經活化之CA溶液在暗處針對例如0.05 M磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)進行透析且此溶液添加至rVWF溶液中且在室溫下於暗處在輕微震盪下培育持續18 h。遊離試劑視情況藉由例如超濾/透濾與rVWF-聚唾液酸綴合物分離。rVWF與聚唾液酸之綴合使用戊二醛作為交聯試劑來實現(Migneault等人, Biotechniques 37: 790-796, 2004)。

在另一方面，亦預期前原VWF及原VWF多肽將在本發明之調配物中提供治療益處。例如，美國專利第7,005,502號描述一種醫藥製劑，其包含大量的活體外誘導凝血酶產生之原VWF。除天然存在之成熟VWF的重組生物活性片段、變異體或其他類似物以外，本發明亦預期前原VWF (以SEQ ID NO:2陳述)或原VWF多肽(SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基23至764)之重組生物活性片段、變異體或類似物在本文所述之調配物中的使用。

編碼片段、變異體及類似物之聚核苷酸可容易地由技術人員產生，以編碼與天然存在之分子具有相同或相似生物活性的天然存在之分子之生物活性片段、變異體或類似物。在種種方面，此等聚核苷酸使用PCR技術、DNA編碼分子之消化/接合及其類似技術來製備。因此，使用此項技術中已知之任何方法，包括但不限於位點特異性突變誘發，熟習此項技術者將能夠在DNA鏈中產生單一鹼基改變，從而導緻密碼子改變及錯義突變。如本文所用，措辭「中等嚴格雜交條件」意謂例如在42℃下在50%甲醯胺中雜交及在60℃下在0.1 x SSC、0.1% SDS中洗滌。熟習此項技術者應理解，此等條件之變化係基於欲雜交之序列的長度及GC核苷酸鹼基含量而發生。此項技術中之公式標準適合於確定精確雜交條件。參見Sambrook等人, 9.47-9.51, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)。 A. VWF多聚體

在一實施方式中，用於本文所述之方法中的rVWF組成物具有rVWF寡聚物之分佈，其特徵在於95%寡聚物具有6個次單元與20個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有6個次單元與10個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有10個次單元與15個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有15個次單元與20個次單元之間。在其他實施方式中，rVWF組成物具有rVWF寡聚物之分佈，其特徵在於95%寡聚物具有選自下表2中可見的變化形式458至641之一系列次單元，該表係WO 2012/171031之表2的再現。

在一些實施方式中，藉由本文所述之純化方法製備的rVWF組成物具有rVWF寡聚物之分佈，其特徵在於95%寡聚物具有6個次單元與20個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF組成物具有rVWF寡聚物之分佈，其特徵在於95%寡聚物具有選自下表2中可見的變化形式458至641之一系列次單元，該表係WO2012/171031之表2的再現。表2. 該等組成物中可見且用於本文所提供之方法中的rVWF寡聚物之分佈之例示性實施方式。

次單元		次單元		次單元		次單元
2-40	Var. 458	6-16	Var. 504	12-20	Var. 550	20-28	Var. 596
2-38	Var. 459	6-14	Var. 505	12-18	Var. 551	20-26	Var. 597
2-36	Var. 460	6-12	Var. 506	12-16	Var. 552	20-24	Var. 598
2-34	Var. 461	6-10	Var. 507	12-14	Var. 553	20-22	Var. 599
2-32	Var. 462	6-8	Var. 508	14-40	Var. 554	22-40	Var. 600
2-30	Var. 463	8-40	Var. 509	14-38	Var. 555	22-38	Var. 601
2-28	Var. 464	8-38	Var. 510	14-36	Var. 556	22-36	Var. 602
2-26	Var. 465	8-36	Var. 511	14-34	Var. 557	22-34	Var. 603
2-24	Var. 466	8-34	Var. 512	14-32	Var. 558	22-32	Var. 604
2-22	Var. 467	8-32	Var. 513	14-30	Var. 559	22-30	Var. 605
2-20	Var. 468	8-30	Var. 514	14-28	Var. 560	22-28	Var. 606
2-18	Var. 469	8-28	Var. 515	14-26	Var. 561	22-26	Var. 607
2-16	Var. 470	8-26	Var. 516	14-24	Var. 562	22-24	Var. 608
2-14	Var. 471	8-24	Var. 517	14-22	Var. 563	24-40	Var. 609
2-12	Var. 472	8-22	Var. 518	14-20	Var. 564	24-38	Var. 610
2-10	Var. 473	8-20	Var. 519	14-18	Var. 565	24-36	Var. 611
2-8	Var. 474	8-18	Var. 520	14-16	Var. 566	24-34	Var. 612
4-40	Var. 475	8-16	Var. 521	16-40	Var. 567	24-32	Var. 613
4-38	Var. 476	8-14	Var. 522	16-38	Var. 568	24-30	Var. 614
4-36	Var. 477	8-12	Var. 523	16-36	Var. 569	24-28	Var. 615
4-34	Var. 478	8-10	Var. 524	16-34	Var. 570	24-26	Var. 616
4-32	Var. 479	10-40	Var. 525	16-32	Var. 571	26-40	Var. 617
4-30	Var. 480	10-38	Var. 526	16-30	Var. 572	26-38	Var. 618
4-28	Var. 481	10-36	Var. 527	16-28	Var. 573	26-36	Var. 619
4-26	Var. 482	10-34	Var. 528	16-26	Var. 574	26-34	Var. 620
4-24	Var. 483	10-32	Var. 529	16-24	Var. 575	26-32	Var. 621
4-22	Var. 484	10-30	Var. 530	16-22	Var. 576	26-30	Var. 622
4-20	Var. 485	10-28	Var. 531	16-20	Var. 577	26-28	Var. 623
4-18	Var. 486	10-26	Var. 532	16-18	Var. 578	28-40	Var. 624
4-16	Var. 487	10-24	Var. 533	18-40	Var. 579	28-38	Var. 625
4-14	Var. 488	10-22	Var. 534	18-38	Var. 580	28-36	Var. 626
4-12	Var. 489	10-20	Var. 535	18-36	Var. 581	28-34	Var. 627
4-10	Var. 490	10-18	Var. 536	18-34	Var. 582	28-32	Var. 628
4-8	Var. 491	10-16	Var. 537	18-32	Var. 583	28-30	Var. 629
6-40	Var. 492	10-14	Var. 538	18-30	Var. 584	30-40	Var. 630
6-38	Var. 493	10-12	Var. 539	18-28	Var. 585	30-38	Var. 631
6-36	Var. 494	12-40	Var. 540	18-26	Var. 586	30-36	Var. 632
6-34	Var. 495	12-38	Var. 541	18-24	Var. 587	30-34	Var. 633
6-32	Var. 496	12-36	Var. 542	18-22	Var. 588	30-32	Var. 634
6-30	Var. 497	12-34	Var. 543	18-20	Var. 589	32-40	Var. 635
6-28	Var. 498	12-32	Var. 544	20-40	Var. 590	32-38	Var. 636
6-26	Var. 499	12-30	Var. 545	20-38	Var. 591	32-36	Var. 637
6-24	Var. 500	12-28	Var. 546	20-36	Var. 592	32-34	Var. 638
6-22	Var. 501	12-26	Var. 547	20-34	Var. 593	34-40	Var. 639
6-20	Var. 502	12-24	Var. 548	20-32	Var. 594	36-38	Var. 640
6-18	Var. 503	12-22	Var. 549	20-30	Var. 595	38-40	Var. 641

Var. =變化形式

在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有460個次單元與500個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有500個次單元與550個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有550個次單元與600個次單元之間。在一些實施方式中，rVWF寡聚物之分佈的特徵在於95%寡聚物具有600個次單元與640個次單元之間。

在一實施方式中，rVWF組成物可根據存在於特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體中之rVWF分子之百分率加以表徵。例如，在一實施方式中，用於本文所述之方法中的rVWF組成物中之至少20% rVWF分子存在於至少10個次單元之寡聚物複合物中。在另一實施方式中，用於本文所述之方法中的rVWF組成物中之至少20% rVWF分子存在於至少12個次單元之寡聚物複合物中。在其他實施方式中，根據下表3-5中可見的變化形式134至457中之任一者，用於本文所提供之方法中的rVWF組成物具有最小百分率(例如，具有至少X%)之存在於特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體(例如，至少Y個次單元之多聚體)中之rVWF分子，該等表係WO2012/171031之表3至表5的再現。

在一些實施方式中，藉由本文所提供之方法製備的rVWF組成物可根據存在於特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體中之rVWF分子之百分率加以表徵。例如，在一實施方式中，用於本文所述之方法中的rVWF組成物中之至少20% rVWF分子存在於至少10個次單元之寡聚物複合物中。在另一實施方式中，用於本文所述之方法中的rVWF組成物中之至少20% rVWF分子存在於至少12個次單元之寡聚物複合物中。在其他實施方式中，根據下表3至5中可見的變化形式134至457中之任一者，用於本文所提供之方法中的rVWF組成物具有最小百分率(例如，具有至少X%)之存在於特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體(例如，至少Y個次單元之多聚體)中之rVWF分子，該等表自WO2012/171031之表3-5再現。表3. 存在於該等組成物中可見且用於本文所提供之方法中之特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體中之rVWF分子之百分率的例示性實施方式。

		rVWF 多聚體中之次單元的最小數目
		6	8	10	12	14	16
rVWF 分子之最小百分率	10%	Var. 134	Var. 152	Var. 170	Var. 188	Var. 206	Var. 224
15%	Var. 135	Var. 153	Var. 171	Var. 189	Var. 207	Var. 225
20%	Var. 136	Var. 154	Var. 172	Var. 190	Var. 208	Var. 226
25%	Var. 137	Var. 155	Var. 173	Var. 191	Var. 209	Var. 227
30%	Var. 138	Var. 156	Var. 174	Var. 192	Var. 210	Var. 228
35%	Var. 139	Var. 157	Var. 175	Var. 193	Var. 211	Var. 229
40%	Var. 140	Var. 158	Var. 176	Var. 194	Var. 212	Var. 230
45%	Var. 141	Var. 159	Var. 177	Var. 195	Var. 213	Var. 231
50%	Var. 142	Var. 160	Var. 178	Var. 196	Var. 214	Var. 232
55%	Var. 143	Var. 161	Var. 179	Var. 197	Var. 215	Var. 233
60%	Var. 144	Var. 162	Var. 180	Var. 198	Var. 216	Var. 234
65%	Var. 145	Var. 163	Var. 181	Var. 199	Var. 217	Var. 235
70%	Var. 146	Var. 164	Var. 182	Var. 200	Var. 218	Var. 236
75%	Var. 147	Var. 165	Var. 183	Var. 201	Var. 219	Var. 237
80%	Var. 148	Var. 166	Var. 184	Var. 202	Var. 220	Var. 238
85%	Var. 149	Var. 167	Var. 185	Var. 203	Var. 221	Var. 239
90%	Var. 150	Var. 168	Var. 186	Var. 204	Var. 222	Var. 240
95%	Var. 151	Var. 169	Var. 187	Var. 205	Var. 223	Var. 241

Var. =變化形式表4. 存在於該等組成物中可見且用於本文所提供之方法中之特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體中之rVWF分子之百分率的例示性實施方式。

		rVWF 多聚體中之次單元的最小數目
		18	20	22	24	26	28
rVWF 分子之最小百分率	10%	Var. 242	Var. 260	Var. 278	Var. 296	Var. 314	Var. 332
15%	Var. 243	Var. 261	Var. 279	Var. 297	Var. 315	Var. 333
20%	Var. 244	Var. 262	Var. 280	Var. 298	Var. 316	Var. 334
25%	Var. 245	Var. 263	Var. 281	Var. 299	Var. 317	Var. 335
30%	Var. 246	Var. 264	Var. 282	Var. 300	Var. 318	Var. 336
35%	Var. 247	Var. 265	Var. 283	Var. 301	Var. 319	Var. 337
40%	Var. 248	Var. 266	Var. 284	Var. 302	Var. 320	Var. 338
45%	Var. 249	Var. 267	Var. 285	Var. 303	Var. 321	Var. 339
50%	Var. 250	Var. 268	Var. 286	Var. 304	Var. 322	Var. 340
55%	Var. 251	Var. 269	Var. 287	Var. 305	Var. 323	Var. 341
60%	Var. 252	Var. 270	Var. 288	Var. 306	Var. 324	Var. 342
65%	Var. 253	Var. 271	Var. 289	Var. 307	Var. 325	Var. 343
70%	Var. 254	Var. 272	Var. 290	Var. 308	Var. 326	Var. 344
75%	Var. 255	Var. 273	Var. 291	Var. 309	Var. 327	Var. 345
80%	Var. 256	Var. 274	Var. 292	Var. 310	Var. 328	Var. 346
85%	Var. 257	Var. 275	Var. 293	Var. 311	Var. 329	Var. 347
90%	Var. 258	Var. 276	Var. 294	Var. 312	Var. 330	Var. 348
95%	Var. 259	Var. 277	Var. 295	Var. 313	Var. 331	Var. 349

Var. =變化形式表5. 存在於該等組成物中可見且用於本文所提供之方法中之特定的更高階rVWF多聚體或更大多聚體中之rVWF分子之百分率的例示性實施方式。

		rVWF 多聚體中之次單元的最小數目
		30	32	34	36	38	40
rVWF 分子之最小百分率	10%	Var. 350	Var. 368	Var. 386	Var. 404	Var. 422	Var. 440
15%	Var. 351	Var. 369	Var. 387	Var. 405	Var. 423	Var. 441
20%	Var. 352	Var. 370	Var. 388	Var. 406	Var. 424	Var. 442
25%	Var. 353	Var. 371	Var. 389	Var. 407	Var. 425	Var. 443
30%	Var. 354	Var. 372	Var. 390	Var. 408	Var. 426	Var. 444
35%	Var. 355	Var. 373	Var. 391	Var. 409	Var. 427	Var. 445
40%	Var. 356	Var. 374	Var. 392	Var. 410	Var. 428	Var. 446
45%	Var. 357	Var. 375	Var. 393	Var. 411	Var. 429	Var. 447
50%	Var. 358	Var. 376	Var. 394	Var. 412	Var. 430	Var. 448
55%	Var. 359	Var. 377	Var. 395	Var. 413	Var. 431	Var. 449
60%	Var. 360	Var. 378	Var. 396	Var. 414	Var. 432	Var. 450
65%	Var. 361	Var. 379	Var. 397	Var. 415	Var. 433	Var. 451
70%	Var. 362	Var. 380	Var. 398	Var. 416	Var. 434	Var. 452
75%	Var. 363	Var. 381	Var. 399	Var. 417	Var. 435	Var. 453
80%	Var. 364	Var. 382	Var. 400	Var. 418	Var. 436	Var. 454
85%	Var. 365	Var. 383	Var. 401	Var. 419	Var. 437	Var. 455
90%	Var. 366	Var. 384	Var. 402	Var. 420	Var. 438	Var. 456
95%	Var. 367	Var. 385	Var. 403	Var. 421	Var. 439	Var. 457

Var. =變化形式

根據上文，投予至個體之rVWF組成物(具有或不具有FVIII)一般包含顯著百分率之高分子量(HMW) rVWF多聚體。在進一步實施方式中，HMW rVWF多聚體組成物包含至少10%-80% rVWF十聚體或更高階多聚體。在進一步實施方式中，該組成物包含約10-95%、20-90%、30-85%、40-80%、50-75%、60-70%十聚體或更高階多聚體。在進一步實施方式中，HMW rVWF多聚體組成物包含至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%十聚體或更高階多聚體。

在進一步實施方式中，本發明之更高階rVWF多聚體在投予後穩定持續約1至約90小時。在進一步實施方式中，該等更高階rVWF多聚體在投予後穩定持續約5-80、10-70、15-60、20-50、25-40、30-35小時。在進一步實施方式中，該等更高階rVWF多聚體在投予後穩定持續至少3、6、12、18、24、36、48、72小時。在某些實施方式中，活體外評估該等rVWF多聚體之穩定性。

該rVWF係高度多聚的，包含約10至約40個次單元。在進一步實施方式中，使用本發明方法製造之多聚體rVWF包含約10-30、12-28、14-26、16-24、18-22、20-21個次單元。在一些實施方式中，該rVWF以大小變化之多聚體形式存在，自二聚體至超過40個次單元之多聚體(＞ 1000萬道爾頓)。最大多聚體提供可與血小板受體及內皮下基質損傷位點相互作用之多個結合位點且係VWF之最具止血活性的形式。在一些實施方式中，本發明之rVWF包含超大型多聚體(ULM)。一般而言，大及超大型多聚體被認為在止血方面最有效(參見例如Turecek, P.,Hämostaseologie , (第37卷):增刊1, 第S15-S25頁(2017))。在一些實施方式中，該rVWF係在500 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，可使用所述方法獲得任何所需多聚體模式。在一些實施方式中，當使用陰離子交換及/或陽離子交換劑方法時，可操縱一或多個洗滌步驟中之緩衝液或梯度緩衝液之pH、傳導率及/或抗衡離子濃度以獲得所需多聚體模式。在一些實施方式中，當使用尺寸排阻層析方法時，可使用收集準則以獲得所需多聚體模式。在一些實施方式中，所述多聚體模式包含超大型多聚體。在一些實施方式中，該等超大型多聚體為至少10,000 kDa、至少11,000 kDa、至少12,000 kDa、至少13,000 kDa、至少14,000 kDa、至少15,000 kDa、至少16,000 kDa、至少17,000 kDa、至少18,000 kDa、至少19,000 kDa、至少20,000 kDa。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約10,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約11,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約12,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約13,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約14,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約15,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約16,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約17,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約18,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，該等超大型多聚體係在約19,000 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施方式中，使用本發明方法獲得之rVWF包括存在於該rVWF之加載樣品中的任何多聚體模式。在一些實施方式中，使用本發明方法獲得之rVWF包括生理性出現之多聚體模式以及超大型VWF-多聚體模式。

根據上文，該rVWF包含顯著百分率之高分子量(HMW) rVWF多聚體。在進一步實施方式中，HMW rVWF多聚體組成物包含至少10% - 80% rVWF十聚體或更高階多聚體。在進一步實施方式中，該組成物包含約10-95%、20-90%、30-85%、40-80%、50-75%、60-70%十聚體或更高階多聚體。在進一步實施方式中，HMW rVWF多聚體組成物包含至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%十聚體或更高階多聚體。

在一實施方式中，用於本文所提供之組成物及方法中的更高階rVWF多聚體具有投予後至少12小時之半衰期。在另一實施方式中，該等更高階rVWF多聚體具有投予後至少24小時之半衰期。在其他實施方式中，該等更高階rVWF多聚體具有選自下表6中可見的變化形式642至1045之半衰期，該表係WO2012/171031之表6的副本。表6. 藉由本文所提供之方法製備的組成物中可見之更高階rVWF多聚體之半衰期的例示性實施方式。

小時		小時		小時		小時
至少1	Var. 642	4-22	Var. 743	14-78	Var. 844	24-30	Var. 945
至少2	Var. 643	4-20	Var. 744	14-72	Var. 845	24-27	Var. 946
至少3	Var. 644	4-18	Var. 745	14-66	Var. 846	27-90	Var. 947
至少4	Var. 645	4-16	Var. 746	14-60	Var. 847	27-84	Var. 948
至少5	Var. 646	4-14	Var. 747	14-54	Var. 848	27-78	Var. 949
至少6	Var. 647	4-12	Var. 748	14-48	Var. 849	27-72	Var. 950
至少7	Var. 648	4-10	Var. 749	14-45	Var. 850	27-66	Var. 951
至少8	Var. 649	4-8	Var. 750	14-42	Var. 851	27-60	Var. 952
至少9	Var. 650	4-6	Var. 751	14-39	Var. 852	27-54	Var. 953
至少10	Var. 651	6-90	Var. 752	14-36	Var. 853	27-48	Var. 954
至少11	Var. 652	6-84	Var. 753	14-33	Var. 854	30-90	Var. 955
至少12	Var. 653	6-78	Var. 754	14-30	Var. 855	30-84	Var. 956
至少14	Var. 654	6-72	Var. 755	14-27	Var. 856	30-78	Var. 957
至少16	Var. 655	6-66	Var. 756	14-24	Var. 857	30-72	Var. 958
至少18	Var. 656	6-60	Var. 757	14-22	Var. 858	30-66	Var. 959
至少20	Var. 657	6-54	Var. 758	14-20	Var. 859	30-60	Var. 960
至少22	Var. 658	6-48	Var. 759	14-18	Var. 860	30-54	Var. 961
至少24	Var. 659	6-45	Var. 760	14-16	Var. 861	30-48	Var. 962
至少27	Var. 660	6-42	Var. 761	16-90	Var. 862	30-45	Var. 963
至少30	Var. 661	6-39	Var. 762	16-84	Var. 863	30-42	Var. 964
至少33	Var. 662	6-36	Var. 763	16-78	Var. 864	30-39	Var. 965
至少36	Var. 663	6-33	Var. 764	16-72	Var. 865	30-36	Var. 966
至少39	Var. 664	6-30	Var. 765	16-66	Var. 866	30-33	Var. 967
至少42	Var. 665	6-27	Var. 766	16-60	Var. 867	33-90	Var. 968
至少45	Var. 666	6-24	Var. 767	16-54	Var. 868	33-84	Var. 969
至少48	Var. 667	6-22	Var. 768	16-48	Var. 869	33-78	Var. 970
至少54	Var. 668	6-20	Var. 769	16-45	Var. 870	33-72	Var. 971
至少60	Var. 669	6-18	Var. 770	16-42	Var. 871	33-66	Var. 972
至少66	Var. 670	6-16	Var. 771	16-39	Var. 872	33-60	Var. 973
至少72	Var. 671	6-14	Var. 772	16-36	Var. 873	33-54	Var. 974
至少78	Var. 672	6-12	Var. 773	16-33	Var. 874	33-48	Var. 975
至少84	Var. 673	6-10	Var. 774	16-30	Var. 875	33-45	Var. 976
至少90	Var. 674	6-8	Var. 775	16-27	Var. 876	33-42	Var. 977
2-90	Var. 675	8-90	Var. 776	16-24	Var. 877	33-29	Var. 978
2-84	Var. 676	8-84	Var. 777	16-22	Var. 878	33-36	Var. 979
2-78	Var. 677	8-78	Var. 778	16-20	Var. 879	36-90	Var. 980
2-72	Var. 678	8-72	Var. 779	16-18	Var. 880	36-84	Var. 981
2-66	Var. 679	8-66	Var. 780	18-90	Var. 881	36-78	Var. 982
2-60	Var. 680	8-60	Var. 781	18-84	Var. 882	36-72	Var. 983
2-54	Var. 681	8-54	Var. 782	18-78	Var. 883	36-66	Var. 984
2-48	Var. 682	8-48	Var. 783	18-72	Var. 884	36-60	Var. 985
2-45	Var. 683	8-45	Var. 784	18-66	Var. 885	36-54	Var. 986
2-42	Var. 684	8-42	Var. 785	18-60	Var. 886	36-48	Var. 987
2-39	Var. 685	8-39	Var. 786	18-54	Var. 887	36-45	Var. 988
2-36	Var. 686	8-36	Var. 787	18-48	Var. 888	36-42	Var. 989
2-33	Var. 687	8-33	Var. 788	18-45	Var. 889	36-39	Var. 990
2-30	Var. 688	8-30	Var. 789	18-42	Var. 890	39-90	Var. 991
2-27	Var. 689	8-27	Var. 790	18-39	Var. 891	39-84	Var. 992
2-24	Var. 690	8-24	Var. 791	18-36	Var. 892	39-78	Var. 993
2-22	Var. 691	8-22	Var. 792	18-33	Var. 893	39-72	Var. 994
2-20	Var. 692	8-20	Var. 793	18-30	Var. 894	39-66	Var. 995
2-18	Var. 693	8-18	Var. 794	18-27	Var. 895	39-60	Var. 996
2-16	Var. 694	8-16	Var. 795	18-24	Var. 896	39-54	Var. 997
2-14	Var. 695	8-14	Var. 796	18-22	Var. 897	39-48	Var. 998
2-12	Var. 696	8-12	Var. 797	18-20	Var. 898	39-45	Var. 999
2-10	Var. 697	8-10	Var. 798	20-90	Var. 899	39-42	Var. 1000
2-8	Var. 698	10-90	Var. 799	20-84	Var. 900	42-90	Var. 1001
2-6	Var. 699	10-84	Var. 800	20-78	Var. 901	42-84	Var. 1002
2-4	Var. 700	10-78	Var. 801	20-72	Var. 902	42-78	Var. 1003
3-90	Var. 701	10-72	Var. 802	20-66	Var. 903	42-72	Var. 1004
3-84	Var. 702	10-66	Var. 803	20-60	Var. 904	42-66	Var. 1005
3-78	Var. 703	10-60	Var. 804	20-54	Var. 905	42-60	Var. 1006
3-72	Var. 704	10-54	Var. 805	20-48	Var. 906	42-54	Var. 1007
3-66	Var. 705	10-48	Var. 806	20-45	Var. 907	42-48	Var. 1008
3-60	Var. 706	10-45	Var. 807	20-42	Var. 908	42-45	Var. 1009
3-54	Var. 707	10-42	Var. 808	20-39	Var. 909	45-90	Var. 1010
3-48	Var. 708	10-39	Var. 809	20-36	Var. 910	45-84	Var. 1011
3-45	Var. 709	10-36	Var. 810	20-33	Var. 911	45-78	Var. 1012
3-42	Var. 710	10-33	Var. 811	20-30	Var. 912	45-72	Var. 1013
3-39	Var. 711	10-30	Var. 812	20-27	Var. 913	45-66	Var. 1014
3-36	Var. 712	10-27	Var. 813	20-24	Var. 914	45-60	Var. 1015
3-33	Var. 713	10-24	Var. 814	20-22	Var. 915	45-54	Var. 1016
3-30	Var. 714	10-22	Var. 815	22-90	Var. 916	45-48	Var. 1017
3-27	Var. 715	10-20	Var. 816	22-84	Var. 917	48-90	Var. 1018
3-24	Var. 716	10-18	Var. 817	22-78	Var. 918	48-84	Var. 1019
3-22	Var. 717	10-16	Var. 818	22-72	Var. 919	48-78	Var. 1020
3-20	Var. 718	10-14	Var. 819	22-66	Var. 920	48-72	Var. 1021
3-18	Var. 719	10-12	Var. 820	22-60	Var. 921	48-66	Var. 1022
3-16	Var. 720	12-90	Var. 821	22-54	Var. 922	48-60	Var. 1023
3-14	Var. 721	12-84	Var. 822	22-48	Var. 923	48-54	Var. 1024
3-12	Var. 722	12-78	Var. 823	22-45	Var. 924	54-90	Var. 1025
3-10	Var. 723	12-72	Var. 824	22-42	Var. 925	54-84	Var. 1026
3-8	Var. 724	12-66	Var. 825	22-39	Var. 926	54-78	Var. 1027
3-6	Var. 725	12-60	Var. 826	22-36	Var. 927	54-72	Var. 1028
3-4	Var. 726	12-54	Var. 827	22-33	Var. 928	54-66	Var. 1029
4-90	Var. 727	12-48	Var. 828	22-30	Var. 929	54-60	Var. 1030
4-84	Var. 728	12-45	Var. 829	22-27	Var. 930	60-90	Var. 1031
4-78	Var. 729	12-42	Var. 830	22-24	Var. 931	60-84	Var. 1032
4-72	Var. 730	12-39	Var. 831	24-90	Var. 932	60-78	Var. 1033
4-66	Var. 731	12-36	Var. 832	24-84	Var. 933	60-72	Var. 1034
4-60	Var. 732	12-33	Var. 833	24-78	Var. 934	60-66	Var. 1035
4-54	Var. 733	12-30	Var. 834	24-72	Var. 935	66-90	Var. 1036
4-48	Var. 734	12-27	Var. 835	24-66	Var. 936	66-84	Var. 1037
4-45	Var. 735	12-24	Var. 836	24-60	Var. 937	66-78	Var. 1038
4-42	Var. 736	12-22	Var. 837	24-54	Var. 938	66-72	Var. 1039
4-39	Var. 737	12-20	Var. 838	24-48	Var. 939	72-90	Var. 1040
4-36	Var. 738	12-18	Var. 839	24-45	Var. 940	72-84	Var. 1041
4-33	Var. 739	12-16	Var. 840	24-42	Var. 941	72-78	Var. 1042
4-30	Var. 740	12-14	Var. 841	24-39	Var. 942	78-90	Var. 1043
4-27	Var. 741	14-90	Var. 842	24-36	Var. 943	78-84	Var. 1044
4-24	Var. 742	14-84	Var. 843	24-33	Var. 944	84-90	Var. 1045

Var. =變化形式

rVWF多聚體之數目及百分率的評估可使用此項技術中已知之方法進行，包括但不限於使用電泳之方法及尺寸排阻層析方法以按尺寸分離VWF多聚體，例如，如Cumming等人所討論(J Clin Pathol., 1993年5月; 46(5): 470-473，其由此出於所有目的且尤其針對與VWF多聚體之評估有關的所有教示以全文引用之方式併入)。此類技術可進一步包括免疫印跡技術(諸如Western印跡)，其中凝膠用經放射性標記之針對VWF之抗體進行免疫印跡，隨後進行化學發光偵測(參見例如Wen等人, J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7: 317-323，其由此出於所有目的且尤其針對與VWF多聚體之評估有關的所有教示以全文引用之方式併入)。在一些實施方式中，使用本發明方法獲得之rVWF包括存在於該rVWF之加載樣品中的任何多聚體模式。在一些實施方式中，使用本發明方法獲得之rVWF包括生理性出現之多聚體模式以及超大型VWF-多聚體模式。 b VWF分析

在原發性止血中，VWF充當血小板與細胞外基質之特定組分(諸如膠原蛋白)之間的橋。VWF在此過程中之生物活性可藉由不同活體外分析加以量測(Turecek等人, Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160, 2002)。瑞斯特黴素輔因子分析係基於在VWF存在下由抗生素瑞斯特黴素誘導之新鮮或福馬林固定之血小板的凝集。血小板凝集程度取決於VWF濃度且可藉由比濁方法，例如藉由使用凝集儀(Weiss等人, J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973；Macfarlane等人, Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975)加以量測。如本文所提供，本發明之VWF的瑞斯特黴素輔因子比活性(VWF:RCo)一般以mU/μg VWF或IU/mg VWF蛋白描述，如使用活體外分析所量測。

第二種方法係VWF膠原蛋白結合(VWF:CB)分析，該分析係基於ELISA技術(Brown et Bosak, Thromb. Res. 43: 303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83: 127-135, 2000)。微量滴定板經I型或III型膠原蛋白塗佈。接著，該VWF結合於膠原蛋白表面且隨後用酶標記之多株抗體進行偵測。最後步驟為受質反應，該反應可用ELISA讀取器進行光度監測。在一些實施方式中，使用VWF膠原蛋白結合(VWF:CB)/VWF:Ag (亦稱作VWF膠原蛋白結合對抗原之比率)來評估VWF及/或VWD診斷。

用於VWF之其他分析包括VWF:抗原(VWF:Ag)、VWF:瑞斯特黴素輔因子(VWF:RCo)及VWF:膠原蛋白結合活性分析(VWF:CB)，其通常用於馮威里氏病之診斷及分類。用於評估VWF分析之額外可用方法(包括用於VWF醣蛋白IB結合、VWF膠原蛋白結合、VWF多聚體、DDAVP攻擊試驗之分析)係熟習此項技術者已知的且描述於例如Patzke及Favaloro, Methods Mol Biol, 2017, 1646:453-460；Higgins及Goodwin, Am J Hematol, 2019, 94:496-503；Stufano等人, Haemophilia, 2020, 26(2):298-305；Ni等人, Int J Lab Hematol, 2013, 35(2):170-176；Michiels等人, J Hematol Thrombo Dis, 2019, 6:299；Michiels等人, Clinical and Applied Thrombosis/Hemostatis, 2017, 23(6):518-531；Mohammed及Favaloro, Methods Mol Biol, 2017, 1646:461-472；Favaloro等人, Pathology, 1997, 29(4): 341-456中，該等內容由此以全文引用之方式併入，包括與用於VWF之分析有關的所有教示。

在一些實施方式中，使用VWF膠原蛋白結合(VWF:CB)/VWF:Ag (亦稱作VWF膠原蛋白結合對抗原之比率)來評估VWF及/或VWD診斷。

在一些實施方式中，關於根據本發明方法製備之rVWF，rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)對rVWF瑞斯特黴素輔因子活性(IU rVWF:RCo)之比率係在3:1與1:5之間。在進一步實施方式中，該比率係在2:1與1:4之間。在進一步實施方式中，該比率係在5:2與1:4之間。在進一步實施方式中，該比率係在3:2與1:3之間。在進一步實施方式中，該比率為約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:4或3:5。在進一步實施方式中，該比率係在1:1與1:2之間。在進一步實施方式中，該比率為1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。在某些實施方式中，可用於本文所述之方法中的組成物中之rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)對rVWF瑞斯特黴素輔因子活性(IU rVWF:RCo)之比率係選自下表7中可見的變化形式1988至2140，該表係WO2012/171031之表7的副本。表7. 在組成物中且用於本文所提供之方法中的rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)對rVWF瑞斯特黴素輔因子活性(IU rVWF:RCo)之比率之例示性實施方式。

(IU rFVIII:C) 對(IU rVWF:RCo)		(IU rFVIII:C) 對(IU rVWF:RCo)		(IU rFVIII:C) 對(IU rVWF:RCo)		(IU rFVIII:C) 對(IU rVWF:RCo)
4:1	Var. 1988	3:1-3:5	Var. 2027	4:3-1:4	Var. 2065	4:5-2:3	Var. 2103
3:1	Var. 1989	3:1-2:3	Var. 2028	4:3-1:3	Var. 2066	4:5-3:4	Var. 2104
2:1	Var. 1990	3:1-3:4	Var. 2029	4:3-2:5	Var. 2067	3:4-1:6	Var. 2105
3:2	Var. 1991	3:1-4:5	Var. 2030	4:3-1:2	Var. 2068	3:4-1:5	Var. 2106
4:3	Var. 1992	3:1-5:6	Var. 2031	4:3-3:5	Var. 2069	3:4-1:4	Var. 2107
1:1	Var. 1993	3:1-1:1	Var. 2032	4:3-2:3	Var. 2070	3:4-1:3	Var. 2108
5:6	Var. 1994	3:1-4:3	Var. 2033	4:3-3:4	Var. 2071	3:4-2:5	Var. 2109
4:5	Var. 1995	3:1-3:2	Var. 2034	4:3-4:5	Var. 2072	3:4-1:2	Var. 2110
3:4	Var. 1996	3:1-2:1	Var. 2035	4:3-5:6	Var. 2073	3:4-3:5	Var. 2111
2:3	Var. 1997	2:1-1:6	Var. 2036	4:3-1:1	Var. 2074	3:4-2:3	Var. 2112
3:5	Var. 1998	2:1-1:5	Var. 2037	1:1-1:6	Var. 2075	2:3-1:6	Var. 2113
1:2	Var. 1999	2:1-1:4	Var. 2038	1:1-1:5	Var. 2076	2:3-1:5	Var. 2114
2:5	Var. 2000	2:1-1:3	Var. 2039	1:1-1:4	Var. 2077	2:3-1:4	Var. 2115
1:3	Var. 2001	2:1-2:5	Var. 2040	1:1-1:3	Var. 2078	2:3-1:3	Var. 2116
1:4	Var. 2002	2:1-1:2	Var. 2041	1:1-2:5	Var. 2079	2:3-2:5	Var. 2117
1:5	Var. 2003	2:1-3:5	Var. 2042	1:1-1:2	Var. 2080	2:3-1:2	Var. 2118
1:6	Var. 2004	2:1-2:3	Var. 2043	1:1-3:5	Var. 2081	2:3-3:5	Var. 2119
4:1-1:6	Var. 2005	2:1-3:4	Var. 2044	1:1-2:3	Var. 2082	3:5-1:6	Var. 2120
4:1-1:5	Var. 2006	2:1-4:5	Var. 2045	1:1-3:4	Var. 2083	3:5-1:5	Var. 2121
4:1-1:4	Var. 2007	2:1-5:6	Var. 2046	1:1-4:5	Var. 2084	3:5-1:4	Var. 2122
4:1-1:3	Var. 2008	2:1-1:1	Var. 2047	1:1-5:6	Var. 2085	3:5-1:3	Var. 2123
4:1-2:5	Var. 2009	2:1-4:3	Var. 2048	5:6-1:6	Var. 2086	3:5-2:5	Var. 2124
4:1-1:2	Var. 2010	2:1-3:2	Var. 2049	5:6-1:5	Var. 2087	3:5-1:2	Var. 2125
4:1-3:5	Var. 2011	3:2-1:6	Var. 2050	5:6-1:4	Var. 2088	1:2-1:6	Var. 2126
4:1-2:3	Var. 2012	3:2-1:5	Var. 2051	5:6-1:3	Var. 2089	1:2-1:5	Var. 2127
4:1-3:4	Var. 2013	3:2-1:4	Var. 2052	5:6-2:5	Var. 2090	1:2-1:4	Var. 2128
4:1-4:5	Var. 2014	3:2-1:3	Var. 2053	5:6-1:2	Var. 2091	1:2-1:3	Var. 2129
4:1-5:6	Var. 2015	3:2-2:5	Var. 2054	5:6-3:5	Var. 2092	1:2-2:5	Var. 2130
4:1-1:1	Var. 2016	3:2-1:2	Var. 2055	5:6-2:3	Var. 2093	2:5-1:6	Var. 2131
4:1-4:3	Var. 2017	3:2-3:5	Var. 2056	5:6-3:4	Var. 2094	2:5-1:5	Var. 2132
4:1-3:2	Var. 2018	3:2-2:3	Var. 2057	5:6-4:5	Var. 2095	2:5-1:4	Var. 2133
4:1-2:1	Var. 2019	3:2-3:4	Var. 2058	4:5-1:6	Var. 2096	2:5-1:3	Var. 2134
4:1-3:1	Var. 2020	3:2-4:5	Var. 2059	4:5-1:5	Var. 2097	1:3-1:6	Var. 2135
3:1-1:6	Var. 2021	3:2-5:6	Var. 2060	4:5-1:4	Var. 2098	1:3-1:5	Var. 2136
3:1-1:5	Var. 2022	3:2-1:1	Var. 2061	4:5-1:3	Var. 2099	1:3-1:4	Var. 2137
3:1-1:4	Var. 2023	3:2-4:3	Var. 2062	4:5-2:5	Var. 2100	1:4-1:6	Var. 2138
3:1-1:3	Var. 2024	4:3-1:6	Var. 2063	4:5-1:2	Var. 2101	1:4-1:5	Var. 2139
3:1-2:5	Var. 2025	4:3-1:5	Var. 2064	4:5-3:5	Var. 2102	1:5-1:6	Var. 2140
3:1-1:2	Var. 2026

Var. =變化形式

在一些實施方式中，原VWF及/或根據本發明經純化之經純化rVWF未藉由任何綴合、轉譯後或共價修飾經修飾。在特定實施方式中，原VWF及/或本發明之經純化rVWF未經水溶性聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羥基乙基澱粉、聚碳水化合物部分及其類似物修飾。

在一些實施方式中，原VWF及/或根據本發明經純化之經純化rVWF藉由綴合、轉譯後修飾或共價修飾經修飾，包括N端或C端殘基之修飾以及所選擇之側鏈的修飾，例如在遊離巰基、一級胺及羥基處。在一實施方式中，水溶性聚合物藉由離胺酸基團或其他一級胺連接至該蛋白質(直接或經由連接體)。在一些實施方式中，原VWF及/或本發明之經純化rVWF可藉由綴合水溶性聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羥基乙基澱粉、聚碳水化合物部分及其類似物經修飾。

可用於修飾原VWF及/或經純化rVWF之水溶性聚合物包括直鏈及分支鏈結構。綴合之聚合物可直接附接至本發明之凝血蛋白，或替代地可經由連接部分進行附接。蛋白質與水溶性聚合物之綴合的非限制性實例可見於美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號及第4,179,337號，以及Abuchowski及Davis 「Enzymes as Drugs,」 Holcenberg及Roberts編, 第367 383頁, John Wiley and Sons, New York (1981)，及Hermanson G., Bioconjugate Techniques第2版, Academic Press, Inc. 2008中。

蛋白質綴合可藉由此項技術中之多種熟知技術執行，例如參見Hermanson G., Bioconjugate Techniques第2版, Academic Press, Inc. 2008。實例包括經由凝血蛋白或水溶性聚合物部分之一上的羧基與另一者之胺基之間的肽鍵，或經由一者之羧基與另一者之羥基之間的酯鍵連接。可使本發明之凝血蛋白綴合至水溶性聚合物化合物之另一連接係經由希夫鹼，在聚合物部分上之遊離胺基與藉由過碘酸鹽氧化在該聚合物之非還原端形成的醛基之間反應形成(Jennings及Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8；Femandes及Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34)。所產生之希夫鹼可藉由用NaCNBH₃ 特異性還原以形成二級胺來穩定化。替代方法係在預先氧化之後藉由用NH₄ Cl進行還原胺化而在該聚合物上產生末端遊離胺基。雙官能試劑可用於連接兩個胺基或兩個羥基。例如，含有胺基之聚合物可藉由如BS3 (雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯/Pierce, Rockford, Ill.)之試劑偶合至該凝血蛋白之胺基。此外，如磺基-EMCS (N-ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯/Pierce)之異雙官能交聯試劑亦可用於例如連接胺與硫醇基。在其他實施方式中，醛反應性基團可用於凝血蛋白之綴合，諸如PEG醇鹽加上溴乙醛之二乙縮醛；PEG加上DMSO及乙酸酐，及PEG氯化物加上4-羥基苯甲醛之酚鹽、琥珀醯亞胺基活性酯、經活化之二硫代碳酸酯PEG、經2,4,5-三氯苯基氯甲酸酯及對硝基苯基氯甲酸酯活化之PEG。

用於量測VWF之生物活性的另一方法係膠原蛋白結合分析，該分析係基於ELISA技術(Brown及Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135)。微量滴定板經I型或III型膠原蛋白塗佈。接著，該VWF結合於膠原蛋白表面且隨後用酶標記之多株抗體進行偵測。最後步驟為受質反應，該反應可用ELISA讀取器進行光度監測。

馮威里氏因子(VWF:Ag)之免疫分析係量測血漿中之VWF蛋白濃度之免疫分析。其未提供有關VWF功能之指示。存在多種用於量測VWF:Ag之方法且此等方法包括酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)或自動乳膠免疫分析(LIA)。許多實驗室現在使用全自動乳膠免疫分析。歷史上存在之實驗室使用了多種技術，包括Laurell電免疫分析『Laurell Rockets』，但此等技術如今在大多數實驗室中很少使用。 V. 套組

作為額外方面，本發明包括包含一或多種凍乾組成物之套組，該等組成物以有助於其用於投予至個體之方式經封裝。在一實施方式中，此類套組包括封裝於諸如密封瓶或器皿之容器中的本文所述之醫藥調配物(例如，包含治療蛋白或肽之組成物)，其中標籤貼附於該容器上或包括於該封裝中，該標籤描述該化合物或組成物在實施該方法中之用途。在一實施方式中，該醫藥調配物經封裝於該容器中，使得該容器中之頂部空間的量(例如，液體調配物與容器頂部之間的空氣量)非常小。較佳地，頂部空間之量可忽略不計(例如，幾乎沒有)。在一實施方式中，該套組含有具有治療蛋白或肽組成物之第一容器及具有用於該組成物的生理學上可接受之復水溶液之第二容器。在一個方面，該醫藥調配物以單位劑型經封裝。該套組可進一步包括適用於根據特定投予途徑投予該醫藥調配物之器件。較佳地，該套組含有描述該等醫藥調配物之用途之標籤。

在某些實施方式中，所提供之組成物係藉由使用注射器或其他儲存器皿投予之液體調配物。在進一步實施方式中，此等液體調配物由復水為水溶液之本文所述之凍乾材料製造。 VI. 用於治療嚴重VWD患者之經血過多之方法的rVWF

向患有嚴重VWD之個體投予rVWF的優勢之一係如與pdVWF相比，rVWF的較高比活性允許rVWF之投予量及對個體再給藥之次數存在靈活性。應理解且如本文中更詳細討論，共投予之FVIII可為重組或血漿源性的。

以治療醫師選擇之劑量水平及模式進行rVWF之單一或多次投予。為了預防或治療疾病，適當劑量取決於欲治療之疾病(例如馮威里氏病)的類型、疾病之嚴重程度及過程、藥物出於預防抑或治療目的經投予、先前療法、患者之臨床史及對藥物之反應以及主治醫師之判斷。

在一些方面，rVWF以20-90 IU/kg之範圍投予至個體，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、20-90、30-60、30-70、35-70、20-40、35-60、40-50、40-60、40-85、45-60、45-55、45-50、50-55、50-60、50-75、50-90、55-60或60-80 IU/kg。

在一些實施方式中，rVWF以-90 IU/kg之範圍投予至個體，例如5-90、5-50、10-90、15-90、20-90、30-60、30-70、30-90、40-50、40-60、40-85、40-90、50-75、50-90、60-80、60-90、70-90、80-90、5-80、10-70、20-60、30-50、35-60、5-50、5-40、5-30. 5-20、10-90、10-50或20-40 IU/kg。在其他實施方式中，rVWF以70-200 IU/kg之劑量經投予，例如70-200、80-200-、90-200、100-200、110-200、120-200、130-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、70-170、80-180、60-160、50-150、40-140、30、130、20-120、10-110、70-100或70-90 IU/kg。

在一些實施方式中，該個體經投予30-60 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，該個體經投予40-50 IU/kg rVWF。

在一些實施方式中，該個體經投予40-85 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，該個體經投予50-75 IU/kg rVWF。在其他實施方式中，該個體經投予55-70 IU/kg rVWF。

在一些實施方式中，該個體經投予30-70 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，該個體經投予40-60 IU/kg rVWF。在其他實施方式中，該個體經投予45-55 IU/kg rVWF。

在一些實施方式中，該個體經投予50-90 IU/kg rVWF。在一些實施方式中，該個體經投予60-80 IU/kg rVWF。在其他實施方式中，該個體經投予65-85 IU/kg rVWF。

rVWF之組成物可含於如本文所述之醫藥調配物中。該等調配物可經口、經表面、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射投予。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦涵蓋藉由靜脈內、真皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及或手術植入於特定位點處來投予。一般而言，組成物基本上不含熱原，以及可能對接受者有害之其他雜質。

在一個方面，本發明調配物藉由初始快速注射、繼而連續輸注以維持藥物產品之治療循環水平來投予。作為另一實例，本發明化合物以單次給藥形式投予。一般技術者將容易最佳化如藉由良好醫學實踐及個別患者之臨床疾患所確定之有效劑量及投予方案。投予途徑可為但不限於藉由靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投予。給藥頻率取決於劑之藥物動力學參數及投予途徑。最佳醫藥調配物係由熟習此項技術者視投予途徑及所需劑量來確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 第1435-1712頁，其揭示內容藉此出於所有目的且尤其針對與醫藥產品之調配物、投予途徑及劑量有關的所有教示以全文引用之方式併入。此類調配物影響所投予之劑之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。視投予途徑而定，根據體重、體表面積或器官尺寸計算合適劑量。適當劑量可經由使用測定血液含量劑量之確定分析連同適當劑量-反應資料來確定。最終劑量方案由主治醫師決定，考慮到修飾藥物之作用的多種因素，例如藥物之比活性、損傷之嚴重程度及患者之反應性、患者之年齡、狀態、體重、性別及飲食、任何感染的嚴重程度、投予時間及其他臨床因素。舉例而言，本發明之重組VWF的典型劑量為大約50 IU/kg，等於500 μg/kg。在進行研究時，將出現關於用於多種疾病及疾患之適當劑量水平及治療持續時間之其他資訊。 a. 凍乾之VWF調配物

本發明方法亦提供用於本文所提供之治療方法的rVWF之調配物。在一些實施方式中，該rVWF組成物用於製造醫藥組成物。在一些實施方式中，該rVWF可經調配為凍乾調配物。

在一些實施方式中，包含本發明之VWF多肽之調配物在純化之後且在投予至個體之前經凍乾。凍乾使用此項技術中常見之技術進行且應針對正在開發之組成物最佳化(Tang等人, Pharm Res. 21:191-200, (2004)及Chang等人, Pharm Res. 13:243-9 (1996))。

在一個方面，凍乾循環由三個步驟構成：冷凍、初次乾燥及二次乾燥(A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977))。在冷凍步驟中，冷卻溶液以起始冰形成。此外，此步驟誘導增積劑之結晶。冰在初次乾燥階段中昇華，該昇華藉由使用真空使腔室壓力降至低於冰之蒸氣壓且引入熱量以促進昇華來進行。最終，在二次乾燥階段，在降低之腔室壓力下且在升高之擱板溫度下移除吸附或結合水。該過程製造稱作凍乾餅之材料。此後，該餅可用無菌水或適用於注射之稀釋劑復水。

凍乾循環不僅決定賦形劑之最終物理狀態，而且影響其他參數，諸如復水時間、外觀、穩定性及最終水分含量。在冷凍狀態下之組成物結構經由在特定溫度下發生之數種轉變(例如玻璃轉變、潤濕及結晶)繼續進行，且該結構可用於理解及最佳化凍乾過程。玻璃轉變溫度(Tg及/或Tg’)可提供有關溶質之物理狀態之資訊，且可藉由差示掃描量熱法(DSC)確定。Tg及Tg'係設計凍乾循環時必須考慮之重要參數。例如，Tg'對於初次乾燥很重要。此外，在乾燥狀態下，玻璃轉變溫度提供有關最終產物之儲存溫度之資訊。 b. 一般醫藥調配物及賦形劑

賦形劑係賦予或增強藥物產品(例如蛋白質)之穩定性及遞送之添加劑。不考慮其納入原因，賦形劑係調配物之整體組分且因此需要對患者安全且耐受性良好。關於蛋白質藥物，賦形劑之選擇尤為重要，因為其可影響該藥物之功效及免疫原性。因此，需要適當選擇提供合適穩定性、安全性及可銷售性之賦形劑來開發蛋白質調配物。

在一個方面，凍乾調配物至少包含緩沖液、增積劑及穩定劑中之一或多者。在此方面，在凍乾步驟期間或在復水期間之聚集成為問題的情況下，評價且選擇界面活性劑之效用。包括適當緩沖劑以使該調配物在凍乾期間維持於pH之穩定區域內。表8提供液體及凍乾之蛋白質調配物中預期的賦形劑組分之比較。表8：凍乾之蛋白質調配物的賦形劑組分

賦形劑組分	在凍乾調配物中之功能
緩衝液	o 在凍乾期間且在復水後維持調配物之pH
張力劑/穩定劑	o 穩定劑包括冷凍及凍乾保護劑 o 實例包括多元醇、糖及聚合物 o 冷凍保護劑保護蛋白質免受冷凍脅迫 o 凍乾保護劑使蛋白質在冷凍乾燥狀態下穩定
增積劑	o 用於增強產品美觀度且防止井噴 o 向凍乾餅提供結構強度 o 實例包括甘露糖醇及甘胺酸
界面活性劑	o 若凍乾過程期間之聚集成為問題，則加以使用 o 可用於減少復水時間 o 實例包括聚山梨醇酯20及80
抗氧化劑	o 通常不使用，一般會延遲凍乾餅中之分子反應
金屬離子/螯合劑	o 若僅包括特定金屬離子作為蛋白酶活性所需之金屬的輔因子，則可包括在內 o 凍乾調配物中一般不需要螯合劑
防腐劑	o 僅用於多劑量調配物 o 提供針對調配物中之微生物生長的保護 o 通常包括於復水稀釋劑(例如bWFI)中

開發蛋白質調配物之主要挑戰係針對製造、運輸及儲存壓力使產物穩定化。調配物賦形劑之作用係針對此等壓力提供穩定化。賦形劑亦用於降低高濃度蛋白質調配物之黏度以便能夠進行其遞送且增強患者便利性。一般而言，賦形劑可基於其針對多種化學及物理脅迫使蛋白質穩定之機制進行分類。一些賦形劑用於減輕特定脅迫之效應或調節特定蛋白質之特定易感性。其他賦形劑對蛋白質之物理及共價穩定性具有更一般影響。本文所述之賦形劑藉由其化學類型或其在調配物中之功能作用加以組織。當討論各賦形劑類型時，提供對穩定化模式之簡要描述。

鑒於本文所提供之教示及指導，熟習此項技術者應知曉在任何特定調配物中可包括何種量或範圍之賦形劑來實現本發明之生物醫藥調配物，該賦形劑促進生物醫藥(例如蛋白質)之穩定性的保留。例如，欲包括於本發明之生物醫藥調配物中之鹽的量及類型係基於最終溶液之所需重量滲透濃度(例如，等滲、低滲或高滲)以及欲包括於該調配物中之其他組分的量及重量滲透濃度加以選擇。

舉例而言，約5%山梨糖醇之納入可實現等滲性，而蔗糖賦形劑需要約9%來實現等滲性。上文已參考鹽、多元醇及糖例示了可包括於本發明之生物醫藥調配物內的一或多種賦形劑之濃度之量或範圍的選擇。然而，熟習此項技術者應理解，本文所述且藉由參考特定賦形劑進一步例示之考慮因素同樣適用於所有類型及組合之賦形劑，包括例如鹽、胺基酸、其他張力劑、界面活性劑、穩定劑、增積劑、冷凍保護劑、凍乾保護劑、抗氧化劑、金屬離子、螯合劑及/或防腐劑。

此外，在特定賦形劑以莫耳濃度進行報導時，熟習此項技術者應認識到，亦預期溶液之當量百分比(%) w/v (例如，(溶液樣品中之物質的克數/mL溶液) X 100%)。

當然，一般技術者應認識到，本文所述之賦形劑在特定調配物內之濃度共享互依性。舉例而言，在例如存在高蛋白質濃度時或在例如存在高穩定劑濃度時，增積劑之濃度可降低。另外，一般技術者應認識到，為了維持其中不存在增積劑之特定調配物的等滲性，將相應地調節穩定劑之濃度(例如，將使用之穩定劑的「張力調節」量)。常見賦形劑係此項技術中已知的且可見於Powell等人, Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311中。 c. 醫藥緩衝液及緩沖劑

通常觀察到藥理活性蛋白質調配物之穩定性在狹窄pH範圍內最大。需要在調配前研究期間的早期鑑別最佳穩定性之此pH範圍。諸如加速穩定性研究及量熱篩選研究之數種方法可用於此努力方向中(Remmele R.L. Jr.等人, Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999))。一旦調配物經敲定，該蛋白質必須在其儲存期限內加以製造且維持。因此，幾乎始終使用緩沖劑來控制調配物中之pH。

緩衝物質之緩衝容量在等於pKa之pH下最大且隨著pH遠離此值增大或減小而減小。90%之緩衝容量存在於其pKa之一pH單位內。緩衝容量亦隨著緩衝液濃度增加而成比例地增加。

選擇緩衝液時需要考慮數種因素。首先，需要基於緩衝液之pKa及所需調配物pH確定緩衝液種類及其濃度。同樣重要的是，確保該緩衝液與該蛋白質及其他調配物賦形劑可相容，且不催化任何降解反應。欲考慮之第三個重要方面係該緩衝液在投予後可誘導之刺痛及刺激感覺。例如，已知檸檬酸鹽在注射後引起刺痛(Laursen T等人, Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006))。對於經由皮下(SC)或肌肉內(IM)途徑投予之藥物，發生刺痛及刺激之可能性較大，其中與藉由IV途徑投予時相比，藥物溶液在該位點處保持相對較長時期，其中該調配物在投予後快速地稀釋至血液中。對於藉由直接IV輸注投予之調配物，需要監測緩衝液(及任何其他調配物組分)之總量。必須特別注意以磷酸鉀緩衝液形式投予之鉀離子，其可誘導患者之心血管效應(Hollander-Rodriguez JC等人, Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006))。

用於凍乾調配物之緩衝液需要額外考慮。一些緩衝液(如磷酸鈉)可在冷凍期間自蛋白質非晶相中結晶出來，導致pH改變。諸如乙酸鹽及咪唑之其他常見緩衝液可在凍乾過程期間昇華或蒸發，由此在凍乾期間或在復水之後改變調配物pH。

存在於該等組成物中之緩沖劑系統係經選擇為生理學上可相容的且維持醫藥調配物所需之pH。在一實施方式中，該溶液之pH係在pH 2.0與pH 12.0之間。例如，該溶液之pH可為2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。

pH緩衝化合物可以適合使該調配物之pH維持於預定水平下的任何量存在。在一實施方式中，pH緩衝濃度係在0.1 mM與500 mM之間。例如，預期pH緩衝劑為至少0.1、0.5、0.7、0.8 0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500 mM。

用於緩衝如本文所陳述之調配物的例示性pH緩沖劑包括但不限於有機酸、甘胺酸、組胺酸、麩胺酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、HEPES及胺基酸或胺基酸混合物(包括但不限於天冬胺酸、組胺酸及甘胺酸)。在本發明之一實施方式中，該緩沖劑為檸檬酸鹽。 d. 醫藥穩定劑及增積劑

在本發明醫藥調配物之一個方面，添加穩定劑(或穩定劑之組合)以防止或減少儲存誘導之聚集及化學降解。復水後混濁或渾濁之溶液指示該蛋白質已沉澱或至少已聚集。術語「穩定劑」意謂能夠防止水性狀態下之聚集或物理降解，包括化學降解(例如自溶、去醯胺、氧化等)之賦形劑。預期之穩定劑包括但不限於蔗糖、海藻糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纖維二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘胺酸、精胺酸HCL、多羥基化合物(包括多醣，諸如葡聚糖、澱粉、羥基乙基澱粉、環糊精)、N-甲基吡咯啶、纖維素及透明質酸、氯化鈉(Carpenter等人, Develop. Biol. Standard 74:225, (1991))。在本發明調配物中，穩定劑以約0.1、0.5、0.7、0.8 0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000 mM之濃度併入。在本發明之一實施方式中，甘露糖醇及海藻糖用作穩定劑。

必要時，該等調配物亦包括適量之增積劑及重量滲透濃度調節劑。增積劑包括例如且不限於甘露糖醇、甘胺酸、蔗糖、聚合物(諸如葡聚醣)、聚乙烯吡咯啶酮、羧甲基纖維素、乳糖、山梨糖醇、海藻糖或木糖醇。在一實施方式中，增積劑為甘露糖醇。該增積劑以約0.1、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000 mM之濃度併入。 e. 醫藥界面活性劑

蛋白質高度傾向於與表面相互作用，從而使其易於在空氣-液體、小瓶-液體及液體-液體(矽油)界面處經受吸附及變性。已觀察到此降解路徑反向依賴於蛋白質濃度且導致可溶性及不溶性蛋白質聚集體之形成或蛋白質經由吸附至表面而在溶液中損失。除了容器表面吸附以外，物理攪拌亦加劇表面誘導之降解，如在產物之運輸及處理期間將經歷。

界面活性劑通常用於蛋白質調配物中以防止表面誘導之降解。界面活性劑為兩親性分子，關於界面位置具有勝出蛋白質之能力。界面活性劑分子之疏水性部分佔據界面位置(例如，空氣/液體)，而該等分子之親水性部分保持朝向主體溶劑定向。在充足濃度下(典型地在清潔劑之臨界膠束濃度附近)，界面活性劑分子之表面層用於防止蛋白質分子吸附於界面處。由此，表面誘導之降解降至最低。本文預期之界面活性劑包括但不限於山梨醇酐聚乙氧基化物之脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。該兩者之區別僅在於脂族鏈之長度，該脂族鏈分別向分子C-12及C-18賦予疏水特性。因此，聚山梨醇酯-80比聚山梨醇酯-20更具表面活性且具有較低臨界膠束濃度。

清潔劑亦可影響蛋白質之熱力學構形穩定性。又，既定的清潔劑賦形劑之效應將為蛋白質特異性的。例如，聚山梨醇酯已顯示降低一些蛋白質之穩定性且增加其他蛋白質之穩定性。蛋白質之清潔劑去穩定化可根據清潔劑分子之疏水性尾合理化，該等疏水性尾可與部分或完全未折疊之蛋白質狀態進行特異性結合。此等類型之相互作用可能導致構形平衡朝向更擴展之蛋白質狀態移動(例如，作為結合聚山梨醇酯之補充，增加該蛋白質分子之疏水性部分的暴露)。或者，若蛋白質原生狀態展現一些疏水性表面，則清潔劑結合於該原生狀態可使彼構形穩定。

聚山梨醇酯之另一方面在於其固有地易於經受氧化降解。通常，作為原材料，其含有足量過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈、尤其甲硫胺酸之氧化。添加穩定劑可能引起氧化性損傷，這強調重點在於調配物中應使用最低有效濃度之賦形劑。關於界面活性劑，既定蛋白質之有效濃度將取決於穩定化機制。

亦添加適量界面活性劑以防止冷凍及乾燥期間之表面相關聚集現象(Chang, B, J., Pharm. Sci., 85:1325, (1996))。因此，例示性界面活性劑包括但不限於陰離子、陽離子、非離子、兩性離子及兩性界面活性劑，包括衍生自天然存在之胺基酸之界面活性劑。陰離子界面活性劑包括但不限於月桂基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉及二辛基磺酸鈉、鵝去氧膽酸、N-月桂醯肌胺酸鈉鹽、十二烷基硫酸鋰、1-辛烷磺酸鈉鹽、膽酸鈉水合物、去氧膽酸鈉及甘去氧膽酸鈉鹽。陽離子界面活性劑包括但不限於苯紮氯銨或芐索氯銨、西吡氯銨單水合物及十六烷基三甲基溴化銨。兩性離子界面活性劑包括但不限於CHAPS、CHAPSO、SB3-10及SB3-12。非離子界面活性劑包括但不限於洋地黃皂苷、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20及TWEEN-80。界面活性劑亦包括但不限於聚桂醇400、聚烴氧40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、40、50及60、單硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65及80、大豆卵磷脂，及其他磷脂，諸如二油基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)及(二油基磷脂醯甘油) OPG；蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。因此，進一步提供包含此等界面活性劑(單獨地或作為呈不同比率之混合物)之組成物。在本發明之一實施方式中，界面活性劑為TWEEN-80。在本發明調配物中，界面活性劑以約0.01至約0.5 g/L之濃度併入。在所提供之調配物中，界面活性劑濃度為0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0 g/L。 f. 醫藥鹽

通常添加鹽以增加該調配物之離子強度，這對於蛋白質溶解性、物理穩定性及等滲性可至關重要。鹽可以多種方式影響蛋白質之物理穩定性。離子可藉由結合於蛋白質之表面上的帶電殘基使蛋白質之原生狀態穩定。或者，鹽可藉由結合於沿蛋白質主鏈之肽基團(-CONH-)使變性狀態穩定。鹽亦可藉由遮蔽蛋白質分子內之殘基之間的排斥性靜電相互作用使蛋白質原生構形穩定。蛋白質調配物中之鹽亦可遮蔽蛋白質分子之間有吸引力的靜電相互作用，該等相互作用可導致蛋白質聚集及不溶性。在所提供之調配物中，鹽濃度係在0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300與500 mM之間。 g. 其他常見賦形劑組分：醫藥胺基酸

在蛋白質調配物中已發現胺基酸作為緩沖劑、增積劑、穩定劑及抗氧化劑之多種用途。因此，在一個方面，組胺酸及麩胺酸分別用於在5.5 - 6.5及4.0 - 5.5之pH範圍內緩衝蛋白質調配物。組胺酸之咪唑基具有pKa = 6.0且麩胺酸側鏈之羧基具有pKa 4.3，這使得此等胺基酸適用於在其各別pH範圍內進行緩衝。麩胺酸尤其可用於此類情況下。組胺酸通常可見於市售蛋白質調配物中，且此胺基酸提供檸檬酸鹽(已知在註射後會刺痛之緩衝液)之替代。有趣的是，組胺酸亦已報導當以高濃度用於液體及凍乾呈現物中時關於聚集具有穩定化效應(Chen B等人, Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003))。其他人亦觀察到組胺酸降低高蛋白濃度調配物之黏度。然而，在同一研究中，作者在不銹鋼容器中之抗體的冷凍-解凍研究期間觀察到含組胺酸之調配物中增加之聚集及變色。組胺酸之另一注意事項在於其在金屬離子存在下經歷光-氧化(Tomita M等人, Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969))。甲硫胺酸在調配物中作為抗氧化劑之用途似乎很有希望；已觀察到其對多種氧化脅迫有效(Lam XM等人, J Pharm Sci, 86(11): 1250-5 (1997))。

在種種方面，提供包括胺基酸甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸、精胺酸及丙胺酸中之一或多者之調配物，其已顯示藉由優先排除機制使蛋白質穩定。甘胺酸亦為凍乾調配物中常用之增積劑。精胺酸已顯示作為抑制聚集之有效劑且已用於液體及凍乾調配物中。在所提供之調配物中，胺基酸濃度係在0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300與500 mM之間。在本發明之一實施方式中，該胺基酸為甘胺酸。 h. 其他常見賦形劑組分：醫藥抗氧化劑

蛋白質殘餘物之氧化由許多不同來源引起。除了添加特定抗氧化劑外，防止氧化性蛋白損傷亦涉及在產物之製造過程及儲存中仔細控制多種因素，諸如大氣氧、溫度、曝光及化學污染。因此，本發明預期醫藥抗氧化劑之用途，包括但不限於還原劑、氧/自由基清除劑或螯合劑。在一個方面，治療蛋白調配物中之抗氧化劑係水溶性的且在產物儲存期限內保持活性。還原劑及氧/自由基清除劑藉由消除溶液中之活性氧起作用。諸如EDTA之螯合劑藉由結合促進自由基形成之痕量金屬污染物而有效。例如，EDTA用於酸性成纖維細胞生長因子之液體調配物中，以抑制金屬離子催化之半胱胺酸殘基的氧化。

除了多種賦形劑防止蛋白質氧化之有效性以外，抗氧化劑自身誘導蛋白質發生其他共價或物理改變之可能性亦值得關注。例如，還原劑可引起分子內二硫鍵之破壞，這可導致二硫化物改組。在過渡金屬離子存在下，抗壞血酸及EDTA已顯示促進多種蛋白質及肽中之甲硫胺酸氧化(Akers MJ及Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard編輯. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999))；Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997)；Yin J等人, Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004))。硫代硫酸鈉已報導降低rhuMab HER2中光及溫度誘導之甲硫胺酸-氧化之水平；然而，此研究中亦報導硫代硫酸鹽-蛋白質加合物之形成(Lam XM, Yang JY等人, J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997))。根據該蛋白質之特定脅迫及敏感性進行適當抗氧化劑之選擇。某些方面預期之抗氧化劑包括但不限於還原劑及氧/自由基清除劑、EDTA及硫代硫酸鈉。 i. 其他常見賦形劑組分：醫藥金屬離子

一般而言，蛋白質調配物中不需要過渡金屬離子，因為其可催化蛋白質中之物理及化學降解反應。然而，當特定金屬離子為蛋白質之輔因子時，其包括於調配物中，且在蛋白質之懸浮液調配物中，其形成配位錯合物(例如胰島素之鋅懸浮液)。最近，已提出鎂離子(10 -120 mM)抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸之用途(WO 2004039337)。

其中金屬離子在蛋白質中賦予穩定性或增加之活性的兩個實例為人類去氧核糖核酸酶(rhDNase, Pulmozyme®)及因子VIII。在rhDNase之情況下，Ca⁺² 離子 (高達100 mM)經由特定結合位點增加該酶之穩定性(Chen B等人, / Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999))。實際上，用EGTA自溶液移除鈣離子導致去醯胺化及聚集之增加。然而，僅用Ca⁺² 離子觀察到此效應；觀察到其他二價陽離子Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 使rhDNase去穩定。在因子VIII中觀察到相似效應。Ca⁺² 及Sr⁺² 離子使該蛋白質穩定，而如Mg⁺² 、Mn⁺² 及Zn⁺² 、Cu⁺² 及Fe⁺² 之其他離子使該酶去穩定(Fatouros, A.等人, Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997)。在用因子VIII進行之獨立研究中，在Al⁺³ 離子存在下觀察到聚集速率之顯著增加(Derrick TS等人, Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004))。作者指出其他賦形劑(如緩衝鹽)通常被Al⁺³ 離子污染且說明在經調配之產物中需要使用適當品質之賦形劑。 j. 其他常見賦形劑組分：醫藥防腐劑

當開發涉及自同一容器抽取一次以上之多用途非經腸調配物時，防腐劑為必需的。其主要功能在於在藥物產品之儲存期限或使用條款中抑制微生物生長且確保產品無菌。常用防腐劑包括但不限於苯甲醇、苯酚及間甲酚。儘管防腐劑具有悠久使用歷史，但開發包括防腐劑之蛋白質調配物可具有挑戰性。防腐劑對蛋白質幾乎始終具有去穩定效應(聚集)，且此已變為限制其在多劑量蛋白質調配物中使用之主要因素(Roy S等人, J Pharm Sci, 94(2): 382-96 (2005))。

迄今為止，大多數蛋白質藥物已經調配僅供單次使用。然而，當可能為多劑量調配物時，其具有使得實現患者便利性及增加之可銷售性的附加優勢。良好實例為人類生長激素(hGH)之多劑量調配物，其中開發防腐調配物已使得更便利之多用途注射筆呈現物商業化。至少四種含有hGH防腐調配物之此類筆器件目前可在市場上獲得。Norditropin® (液體，Novo Nordisk)、Nutropin AQ® (液體，Genentech)及Genotropin (凍乾--雙腔室藥筒，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚，而Somatrope® (Eli Lilly)係用間甲酚調配。

在防腐劑型之調配物開發期間需要考慮數個方面。必須使藥物產品中之有效防腐劑濃度最佳化。此需要以賦予抗微生物有效性而不損害蛋白質穩定性之濃度範圍測試該劑型中之既定防腐劑。例如，使用差示掃描量熱法(DSC)，在用於介白素-1受體(I型)之液體調配物的開發中成功地篩選出三種防腐劑。該等防腐劑基於其在市售產品中常用之濃度下對穩定性之影響進行排序(Remmele RL Jr.等人, Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998))。

開發含有防腐劑之液體調配物比凍乾調配物更具挑戰性。冷凍乾燥產品可在無防腐劑下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復水。此舉縮短防腐劑與蛋白質接觸之時間，從而使相關穩定性風險顯著地降至最低。就液體調配物而言，防腐劑有效性及穩定性必須歷經整個產品儲存期限(約18-24個月)得到維持。一個需注意之重點在於防腐劑有效性必須在含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中得到證明。

一些防腐劑可引起注射位點反應，這是選擇防腐劑時需要考慮之另一因素。在專注於評價Norditropin中之防腐劑及緩沖液的臨床試驗中，如與含有間甲酚之調配物相比，觀察到含有苯酚及苯甲醇之調配物的疼痛感更低(Kappelgaard A.M., Horm Res. 62增刊3:98-103 (2004))。有趣的是，在常用防腐劑中，苯甲醇具有麻醉特性(Minogue SC及Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005))。在種種方面，防腐劑之使用提供超過任何副作用之益處。 k. 醫藥調配物之製備方法

本發明進一步預期用於製備醫藥調配物之方法。

本發明方法進一步包括以下步驟中之一或多者：在凍乾之前向混合物中添加如本文所述之穩定劑，在凍乾之前向混合物中添加選自增積劑、重量滲透濃度調節劑及界面活性劑(其等之各者均如本文所述)之至少一種劑。

關於凍乾材料之標準復水實踐係將一定體積之純水或無菌注射用水(WFI) (典型地等於凍乾期間移除之體積)添加回去，不過抗細菌劑之稀溶液有時用於製造用於非經腸投予之醫藥劑(Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992))。相應地，提供用於製備復水之rVWF組成物之方法，該等方法包括將稀釋劑添加至本發明之凍乾rVWF組成物中的步驟。

凍乾材料可經復水為水溶液。多種水性載劑，例如無菌注射用水、針對多劑量用途之含防腐劑之水或含適量界面活性劑之水(例如，含有與適用於製造水性懸浮液之賦形劑混合的活性化合物之水性懸浮液)。在種種方面，此類賦形劑為懸浮劑，例如且不限於羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或潤濕劑為天然存在之磷脂，例如且不限於卵磷脂或環氧烷與脂肪酸之縮合產物，例如且不限於聚氧乙烯硬脂酸酯，或環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物，例如且不限於十七碳伸乙基氧基鯨蠟醇，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物，諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇酐之偏酯的縮合產物，例如且不限於聚乙烯山梨醇酐單油酸酯。在種種方面，水性懸浮液亦含有一或多種防腐劑，例如且不限於對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯。 l. 用於投予之例示性rVWF調配物

在一些實施方式中，本發明方法提供一種增強之調配物，其允許最終產物具有高效能(高rVWF濃度及增強之長期穩定性)以便減少用於治療之體積(100 IU/ml至10000 IU/ml)。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約100 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約500 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約1000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約2000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約3000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約4000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約5000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約6000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約7000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約8000 IU/ml至10000 IU/ml。在一些實施方式中，用於投予之調配物中的rVWF濃度為約9000 IU/ml至10000 IU/ml。

在一些實施方式中，用於投予之調配物包含一或多種兩性離子化合物，包括例如胺基酸，如組胺酸、甘胺酸、精胺酸。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含具有兩親性特徵之組分，該組分具有最少一個疏水性基團及一個親水性基團，包括例如聚山梨醇酯80、辛基吡喃糖苷、二肽及/或兩親性肽。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含非還原糖或糖醇或二醣，包括例如山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含產生生理學重量滲透濃度之無毒水溶性鹽，包括例如氯化鈉。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含在6.0至8.0範圍內之pH。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含約6.0、約6.5、約7、約7.5或約8.0之pH。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含使rVWF穩定之一或多種二價陽離子，包括例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+及/或其組合。在一些實施方式中，用於投予之調配物包含約1 mM至約50 mM甘胺酸、約1 mM至約50 mM組胺酸、約零至約300 mM氯化鈉(例如小於300 mM鈉)、約0.01%至約0.05%聚山梨醇酯20 (或聚山梨醇酯80)及約0.5%至約20% (w/w)蔗糖，具有約7.0之pH且在投予之時間點具有生理學重量滲透濃度。

在特定方面，rVWF含於含有緩沖液、糖及/或糖醇(包括但不限於海藻糖及甘露糖醇)、穩定劑(諸如甘胺酸)及界面活性劑(諸如聚山梨醇酯80)之調配物中。在進一步實施方式中，對於含有rFVIII之調配物，該調配物可進一步包括鈉、組胺酸、鈣及麩胱甘肽。

在一些實施方式中，用於投予之調配物可經冷凍乾燥。在一些實施方式中，用於投予之調配物係穩定的且可呈液態儲存於約2℃至約8℃下，以及約18℃至約25℃下。在一些實施方式中，用於投予之調配物係穩定的且可呈液態儲存於約2℃至約8℃下。在一些實施方式中，用於投予之調配物係穩定的且可呈液態儲存於約18℃至約25℃下。

為向人類或測試動物投予VWF組成物，在一個方面，該等組成物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。措辭「醫藥學上」或「藥理學上」可接受係指分子實體及組成物係穩定的，抑制蛋白質降解，諸如聚集及裂解產物，且另外如下所述在使用此項技術中熟知之途徑投予時不產生過敏，或其他不良反應。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床上適用之溶劑、分散介質、塗料、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延緩劑及其類似物，包括上文所揭示之彼等劑。

該等醫藥調配物係經口、經表面、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射投予。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦預期藉由靜脈內、真皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後及/肺內注射於特定位點處來投予。一般而言，組成物基本上不含熱原，以及可能對接受者有害之其他雜質。

在一個方面，調配物藉由初始快速注射、繼而連續輸注以維持藥物產品之治療循環水平來投予。作為另一實例，本發明化合物以單次給藥形式投予。一般技術者將容易最佳化如藉由良好醫學實踐及個別患者之臨床疾患所確定之有效劑量及投予方案。投予途徑可為但不限於藉由靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投予。給藥頻率取決於劑之藥物動力學參數及投予途徑。最佳醫藥調配物係由熟習此項技術者視投予途徑及所需劑量來確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.18042 第1435-1712頁，其揭示內容藉此出於所有目的且尤其針對與醫藥產品之調配物、投予途徑及劑量有關的所有教示以全文引用之方式併入。該等調配物影響所投予之劑之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。視投予途徑而定，根據體重、體表面積或器官尺寸計算合適劑量。適當劑量可經由使用用於測定血液水平劑量之確定分析連同適當劑量-反應資料來確定。最終劑量方案由主治醫師決定，考慮到修飾藥物之作用的多種因素，例如藥物之比活性、損傷之嚴重程度及患者之反應性、患者之年齡、狀態、體重、性別及飲食、任何感染的嚴重程度、投予時間及其他臨床因素。

除非另有指示，否則本發明之實踐可使用習知技術及對有機化學、聚合物技術、分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學及免疫學之描述，其在此項技術之技能內。此類習知技術包括聚合物陣列合成、雜交、接合及使用標記偵測雜交。合適技術可藉由參考下文實例進行特定描述。然而，當然亦可使用其他等效的習知程序。此類習知技術及描述可見於標準實驗室手冊，諸如Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (第I-IV卷), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (均來自Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (第4版) Freeman, Highly stabilized York, Gait, 「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」 1984, IRL Press, London, Nelson及Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry第3版, W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y.及Berg等人 (2002) Biochemistry, 第5版, W. H. Freeman Pub., Highly stabilized York, N.Y.，其均出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。

應注意，如本文所用且在隨附申請專利範圍中，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，例如，提及「聚合酶」係指一種劑或此類劑之混合物，且提及「方法」包括提及熟習此項技術者已知的等效步驟及方法，等等。

除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。為了描述且揭示出版物中所描述且可與當前描述之發明結合使用的器件、組成物、調配物及方法，本文所提及之所有出版物均以引用之方式併入本文中。

在提供數值範圍之情況下，應瞭解除非上下文另外明確規定，否則在彼範圍之上限與下限之間的各中間值至下限單位之十分之一及在彼陳述範圍中之任何其他陳述值或中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，亦涵蓋於本發明內，受所陳述範圍內的任何特定排除之極限的限制。當所陳述範圍包括該等極限中之一者或兩者時，排除彼等所包括之極限中之任一者兩者之範圍亦包括於本發明內。

在以上描述中，陳述許多特定細節來提供對本發明之更透徹理解。然而，熟習此項技術者將顯而易知，本發明可在不具有此等特定細節中之一或多者的情況下實踐。在其他情況下，未描述熟習此項技術者熟知之熟知特徵及程序以便避免使本發明晦澀難懂。

儘管本發明主要參考特定實施方式加以描述，但亦預見在閱讀本發明之後，其他實施方式對於熟習此項技術者將變得顯而易知，且預期此類實施方式含於本發明方法內。實施例 實施例1 –在嚴重馮威里氏病(VWD)患者之重組馮威里氏因子(RVWF)的第3期開放標籤研究中管理經血過多：事後分析引言

患有馮威里氏病(VWD)之女性的最常見症狀為月經大出血(HMB)或經血過多，其影響高達80%患有VWD之女性，其中20%患有中度或嚴重VWD之女性主要由於HMB而需要子宮切除術。^1,2

經血過多/HMB通常導致症狀性缺鐵性貧血、心理壓力及生活品質下降。其可不利地影響工作、求學及日常活動，且導致醫療費用增加。^3,4

在患有VWD之女性中，關於經血過多之診斷及有效治療的缺乏係未滿足之健康需求。³

當用於患有嚴重VWD之成年患者的出血發作(BE)之按需治療時，重組馮威里氏因子(rVWF，vonicog alfa，VEYVONDI™；Baxalta Innovations GmbH, a Takeda company, Vienna, Austria)已證明止血功效及積極的效益-風險型態。^5,6 然而，關於用rVWF管理經血過多，特定地存在有限資訊。目標

此研究之目的係確定嚴重VWD患者之經血過多發作之按需rVWF治療的功效及安全性。方法

進行一項第3期、多中心、部分隨機研究(NCT01410227；EudraCT 2010-024108-84)，以評估rVWF治療患有嚴重VWD之成人之BE的藥物動力學、安全性及止血功效。⁶

此研究之納入準則包括以下因素：男性或女性；18-65歲；診斷出3型VWD (VWF抗原≤3 IU/dL)；或以下類型之嚴重非3型VWD： ● 1型或2A型(VWF瑞斯特黴素輔因子活性[VWF:RCo] ＜20 IU/dL)； ● 2B型(如藉由基因型所診斷)； ● 2N型(因子VIII [FVIII]活性[FVIII:C] ＜10%，且有歷史記載之遺傳學)； ● 2M型；及在過去12個月內接受VWF濃縮物來治療≥1次BE。

排除準則包括對rVWF或rFVIII之任何組分具有超敏性的經歷；VWF或FVIII抑制劑之經歷；免疫病症；或血栓栓塞事件。研究設計

患者加入4個治療群組中之1個以接受具有或不具有重組FVIII (rFVIII；抗血友病因子[重組] [ADVATE®；Baxalta US Inc., a Takeda company, Lexington, MA, USA])之rVWF，用於藥物動力學評估及/或BE治療(圖1)。⁶ 治療

一般而言，初始劑量(亦稱作第一劑量)旨在以VWF:RCo ＞0.6 IU/mL (60%)且FVIII:C ＞0.4 IU/mL (40%)之水平進行VWF完全替代。

在嚴重BE中，後續劑量旨在保持VWF:RCo谷底水平＞50%持續3天且接著如研究人員認為必需持續隨後數天(圖2)。

在中度BE中，目標係VWF:RCo谷底水平＞30%，只要研究人員認為必需即持續。輕微BE之治療大多數僅由1或2個劑量組成(圖2)。經血過多發作之事後資料分析

對用rVWF治療之女性患者中在12個月研究期期間報告≥1例經血過多發作之子集進行事後資料分析。僅用rVWF治療之經血過多發作包括於分析中。

研究人員對作為BE之經血過多的評估包括： ● BE之數目及嚴重程度(輕微、中度或嚴重) ● rVWF之總劑量及每次BE之輸注次數 ● 自首次輸注開始之日期及時間以及BE消除之日期及時間取得消除各BE所耗用的時間；僅可獲得日期及時間之BE包括於分析中。

在BE消除之後，研究人員基於客觀等級量表確定總體臨床療效(圖3)。

由患者、患者之醫療提供者(針對遠離主要研究位點之治療)、患者之法定代表(針對家庭治療)或在參與位點處由授權合格人員(針對基於醫院之治療)記錄以下資訊： ● BE之位置(例如，關節、軟組織、肌肉)；BE之類型(例如，自發的、創傷性、未知的)；及BE之嚴重程度(例如，輕微、中度、嚴重) ● BE之發作及消除之日期及時間 ● 用於治療BE之rVWF-rFVIII或rVWF之各輸注的日期及時間 ● 主觀評估止血功效之日期及時間 ● 所需鎮痛劑之類型及數目。

在首次輸注之後8小時內，由患者對BE進行主觀定級；輸注之後8小時內的最後一次可用評估用於分析中。對於藉由多次輸注治療之BE，首次輸注之止血功效等級用於分析中。

記錄研究期間服用之針對經血過多及經血過多相關貧血之伴隨藥劑。

安全性評估包括不良事件(AE)之數目、類型、嚴重性及嚴重程度，以及AE與研究治療之間的因果關係。

分類變數係報導為n (%)且連續變數係報導為中值(範圍)。結果患者

6名患者患有用rVWF治療之46例經血過多發作(每名患者2-15例BE) (圖4)，其中45例僅用rVWF (例如，非血漿源性VWF)治療且包括於此等分析中。

1名患者患有2例經血過多發作，其中1例用血漿源性VWF及rVWF兩者治療且因此自分析中排除。

大多數經血過多發作由醫師或患者(家庭治療)定級為輕微(圖5)。針對經血過多之因子消耗及治療結果

控制經血過多發作所需之rVWF劑量隨出血嚴重程度而增加且在3型VWD中高於2A型(圖6)。

用於治療各經血過多發作之rVWF輸注的次數一般隨著出血嚴重程度而增加(圖6)，在45例經血過多發作中，有30例僅需要1次輸註。

關於需要超過1次輸注之經血過多發作。rFVIII在15次首次輸注中有12次(80%)、15次第二次輸注中有4次(26.7%)、6次第三次輸注中有1次(16.7%)且1次第四次輸注中有0次共投予。

自首次輸注開始至消除經血過多發作(n=43)之中值(範圍)時間為24.3 (0.3-202.7)小時。rVWF用於治療經血過多發作之止血功效大多數由研究人員定級為「優良」(圖7)。患者將39例(90.7%)經血過多發作中之rVWF止血功效定級為「優良」，將3例(7.0%)發作中之rVWF止血功效定級為「良好」，且將1例(2.3%)發作中之rVWF止血功效定級為「中等」。伴隨藥劑及研究治療之安全性

3名患者使用胺甲環酸且3名患者使用口服避孕藥作為經血過多之伴隨治療。

所有6名患者均進行鐵替代療法以治療因經血過多所致之貧血。

6名患者中有4名報告了15例AE總數(圖8)。 ● 研究人員認為所有AE均與研究治療無關。 ● 1例子宮息肉AE被認為嚴重及嚴重的。 ● 1例自然流產AE被認為嚴重的，但嚴重程度為輕微。 ● 13例AE被認為不嚴重：12例輕微且1例中等嚴重程度。注意事項

對來自此第3期、部分隨機rVWF研究之資料進行的事後分析涉及在12個月的研究中針對經血過多/HMB發作經治療之少數嚴重VWD患者。結論

每例HMB(月經大出血或經血過多)發作需要1次輸注之中值，且患者及研究人員將rVWF用於管理大多數HMB發作之臨床治療功效定級為「優良」。

此分析提供證據顯示rVWF按需用於管理患有嚴重VWD之女性的HMB發作之功效及安全性。

將執行進一步研究來確認rVWF治療方案是否可幫助始終如一地管理患有嚴重VWD之女性之此虛弱狀況。參考文獻

無

[圖1]描繪嚴重VWD之患者之rVWF的第3期開放標籤研究之總體過程。 [圖2]描繪在rVWF之第3期開放標籤研究期間關於出血事件(BE)之治療的rVWF給藥建議。rVWF劑量以IU VWF:RCo/kg體重量度。 [圖3]描繪研究人員對rVWF治療BE之臨床功效定級所用的總體準則。 [圖4]描繪研究中用rVWF治療之經血過多患者的人口統計特徵。 [圖5]描繪輕微、中度或嚴重經血過多發作之百分率，以佔僅用rVWF (例如，非血漿源性VWF)治療之45例經血過多發作總數之百分比形式。 [圖6]顯示45例經血過多發作之rVWF治療的概述。 [圖7]顯示由研究人員確定之針對rVWF治療之臨床功效等級。該等等級係基於僅用rVWF (亦即，非血漿源性VWF)治療之45例經血過多發作總數。 [圖8]顯示在伴隨rVWF服用藥劑之經血過多患者之研究期間報告的不良事件(AE)。各AE由1名患者報告。 [圖9A-C]描繪前原VWF之核酸序列。 [圖10A-J]描繪前原VWF之胺基酸序列。 [圖11]描繪成熟VWF之胺基酸序列(對應於全長前原VWF之胺基酸殘基764-2813)。

Claims

一種用於治療患有嚴重馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多出血發作之方法，其包含向該個體投予至少一個劑量之介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內的重組馮威里氏因子(rVWF)。
如請求項1之治療方法，其中該經血過多出血發作係選自由輕微經血過多出血發作及嚴重經血過多出血發作組成之群。
如請求項1或2之治療方法，其中該VWD係選自由1型VWD、2型VWD、及3型VWD組成之群。
如請求項1至3中任一項之治療方法，其中向該個體投予30-60 IU/kg rVWF之第一劑量，且該經血過多出血發作係輕微經血過多出血發作。
如請求項4之治療方法，其進一步包含向該個體投予30-60 IU/kg rVWF之第二劑量。
如請求項1至3中任一項之治療方法，其中向該個體投予40-50 IU/kg rVWF之第一劑量，且該經血過多出血發作係輕微經血過多出血發作。
如請求項6之治療方法，其進一步包含向該個體投予40-50 IU/kg rVWF之第二劑量。
如請求項1至7中任一項之治療方法，其中該VWD為1型VWD。
如請求項1至7中任一項之治療方法，其中該VWD係選自由2A型、2B型、2N型、2M型VWD、及3型VWD組成之群。
如請求項1至3中任一項之治療方法，其中向該個體投予40-90 IU/kg rVWF之第一劑量，且該經血過多出血發作係嚴重經血過多出血發作。
如請求項10之治療方法，其中該VWD為1型VWD。
如請求項10之治療方法，其中該VWD係選自由2A型VWD、2B型VWD、2N型VWD、2M型VWD、及3型VWD組成之群。
如請求項10至12中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予複數個劑量之rVWF。
如請求項10至13中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。
如請求項10至13中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-60 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。
如請求項10至13中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含40-90 IU/kg rVWF之該第一劑量及40-60 IU/kg rVWF之第二劑量的複數個劑量。
如請求項10至16中任一項之治療方法，其進一步包含每天向該個體投予30-70 IU/kg rVWF之第三劑量持續該出血發作之剩餘持續時間。
如請求項10至17中任一項之治療方法，其中該方法之總持續時間不超過約7天。
如請求項1至3中任一項之治療方法，其中向該個體投予之rVWF之第一劑量為50-80 IU/kg rVWF，且該經血過多出血發作係嚴重經血過多出血發作。
如請求項19之治療方法，其中該VWD為1型VWD。
如請求項19或20之治療方法，其進一步包含向該個體投予複數個劑量之rVWF。
如請求項19至21中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含50-80 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。
如請求項19至21中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含50-80 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-60 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。
如請求項19至21中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含50-80 IU/kg rVWF之第一劑量及40-60 IU/kg rVWF之第二劑量的複數個劑量。
如請求項19至24中任一項之治療方法，其進一步包含每天向該個體投予30-70 IU/kg rVWF之第三劑量持續該出血發作之剩餘持續時間。
如請求項19至25中任一項之治療方法，其中該方法之總持續時間不超過約7天。
如請求項19之治療方法，其中向該個體投予之rVWF之該第一劑量為60-80 IU/kg，且該VWD係選自由2A型VWD、2B型VWD、2N型VWD、2M型VWD、及3型VWD組成之群。
如請求項19或27之治療方法，其進一步包含向該個體投予複數個劑量之rVWF。
如請求項19、27及28中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者每8至12小時投予持續約3天。
如請求項19、27及28中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之該第一劑量及複數個第二劑量之複數個劑量，其中該等第二劑量之各者為40-80 IU/kg rVWF且每8至12小時投予持續約3天。
如請求項19、27及28中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予包含60-80 IU/kg rVWF之第一劑量及40-80 IU/kg rVWF之第二劑量的複數個劑量。
如請求項19至31中任一項之治療方法，其進一步包含每天向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續該出血發作之剩餘持續時間。
如請求項19至32中任一項之治療方法，其中該方法之總持續時間不超過約7天。
如請求項1至33中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予重組因子VIII (rFVIII)。
如請求項34之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之一或多個劑量同時或依序投予。
如請求項34或35之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之該第一劑量及/或該第二劑量同時或依序投予。
如請求項34至36中任一項之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之各劑量同時或依序投予。
如請求項1至37中任一項之治療方法，其中該rFVIII以約20 IU/kg至約50 IU/kg之劑量投予至該個體。
如請求項1至38中任一項之治療方法，其中向該個體投予該rFVIII，使得rVWF與FVIII之比率係選自由約1.5:0.8；約1.3:1；約1.1:0.8；約1.5:1；及約1.1:1.2組成之群。
一種用於治療患有嚴重1型馮威里氏病(VWD)之個體的嚴重經血過多出血發作之方法，該方法包含： a) 向該個體投予50-75 IU/kg rVWF之第一劑量； b) 向該個體投予複數個40-60 IU/kg rVWF之第二劑量，其中每8-12小時投予該等劑量之各者持續3天，使得VWF:RCo谷底水平維持於至少0.30 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.30 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平；及 c) 每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續該出血發作之剩餘持續時間；其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過約7天。
如請求項40之治療方法，其中該VWF:RCo谷底水平維持於至少0.40 IU/mL下或者該VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.40 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平。
如請求項40或41之治療方法，其中該VWF:RCo谷底水平維持於至少0.50 IU/mL下或者該VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.50 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平。
如請求項40至42中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過6天。
如請求項40至42中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過5天。
如請求項40至42中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過4天。
一種用於治療患有嚴重2型或3型馮威里氏病(VWD)之個體的嚴重經血過多出血發作之方法，該方法包含： a) 向該個體投予60-80 IU/kg rVWF之第一劑量； b) 向該個體投予複數個40-60 IU/kg rVWF之第二劑量，其中每8-12小時投予該等劑量之各者持續3天，使得VWF:RCo谷底水平維持於至少0.30 IU/mL下或者VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.30 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平；及 c) 每天一次向該個體投予40-60 IU/kg rVWF之第三劑量持續該出血發作之剩餘持續時間；其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過約7天。
如請求項46之治療方法，其中該VWF:RCo谷底水平維持於至少0.40 IU/mL下或者該VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.40 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平。
如請求項46或47之治療方法，其中該VWF:RCo谷底水平維持於至少0.50 IU/mL下或者該VWF:GPIbM或VWF:GPIbR谷底水平維持等於至少0.50 IU/mL之該VWF:RCo谷底水平。
如請求項46至48中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過6天。
如請求項46至48中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過5天。
如請求項46至48中任一項之治療方法，其中步驟(a)–(c)之總持續時間不超過4天。
如請求項46至51中任一項之治療方法，其進一步包含向該個體投予重組因子VIII (rFVIII)。
如請求項52之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之該至少一個劑量同時或依序投予。
如請求項52至53中任一項之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之該第一劑量及/或該複數個第二劑量同時或依序投予。
如請求項52至54中任一項之治療方法，其中該rFVIII與rVWF之該第一劑量及該複數個第二劑量兩者同時或依序投予。
如請求項52至55中任一項之治療方法，其中投予至v個體之rFVIII之該劑量為約20 IU/kg至約50 IU/kg。
如請求項52至56中任一項之治療方法，其中投予至該個體之該rFVIII係在選自由約1.5:0.8；約1.3:1；約1.1:0.8；約1.5:1；及約1.1:1.2組成之群的rVWF對FVIII比率下。
如請求項1至57中任一項之治療方法，其中該rVWF具有在約20 mU/μg至約150 mU/μg之間的比活性。
如請求項1至58中任一項之治療方法，其中投予至該個體之該rFVIII及該rVWF具有在約3:1與約1:5之間的rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)對rVWF瑞斯特黴素輔因子活性(IU rVWF:RCo)比率。
一種用於治療患有嚴重馮威里氏病(VWD)之個體之經血過多出血發作之方法，該方法包含向該個體投予至少一個劑量之介於約30 IU/kg至約90 IU/kg範圍內的重組馮威里氏因子(rVWF)，其中與不投予該rVWF時該個體遭受的該出血發作之持續時間及/或嚴重程度相比，該個體遭受的該出血發作之持續時間及/或嚴重程度降低。
如請求項1至60中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予一個劑量之rVWF。
如請求項1至61中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予兩個劑量之rVWF。
如請求項1至62中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予三個劑量之rVWF。
如請求項1至63中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予四個劑量之rVWF。
如請求項1至64中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予五個劑量或更多之rVWF。
如請求項1至65中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予至該個體之該rVWF係在約20 IU/kg至約200 IU/kg rVWF範圍內。
如請求項1至66中任一項之治療方法，其中在該出血發作之持續時間內投予至該個體之該rVWF係在約20 IU/kg至約100 IU/kg rVWF範圍內。
如請求項1至67中任一項之治療方法，其中該rVWF具有與序列SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致性之胺基酸序列。
如請求項1至68中任一項之治療方法，其中該rVWF為rVWF之片段，其中該rVWF具有與序列SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%一致性之胺基酸序列。
如請求項1至69中任一項之治療方法，其中該rVWF使用來自由泛蛋白化、醣基化、綴合至治療劑或診斷劑、標記、共價聚合物附接、引入不可水解鍵、以及藉由化學合成一或多個胺基酸進行的插入或取代組成之群之一或多種技術經化學修飾。