KR20160083884A - 치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 봉입체 - Google Patents

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KR20160083884A
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루이스 루이즈-아빌라
아르탈 라몬 보세르
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스페리움 바이오메드 에스.엘.
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Abstract

본 발명은 봉입체 형태의 치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 방법, 조성물, 및 장치에 관한 것이다. 그러한 봉입체는 피부 장벽을 통해 치료제 및 미용제를 전달하여 피부 내의 깊은 위치에 도달할 수 있다. 본 개시된 조성물은 피부 질병 및 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 봉입체{INCLUSION BODIES FOR TRANSDERMAL DELIVERY OF THERAPEUTIC AND COSMETIC AGENTS}
본 발명은 봉입체 형태의 미용제(cosmetic agent) 및 치료제(therapeutic agent)의 경피 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
피부는 외래 물질 및 감염에 대해 보호 장벽을 제공한다. 포유동물에서, 이는 피부의 표면 상에, 각질층(stratum corneum)(SC)이라 불리는, 고도로 불용성인 단백질 및 지질 구조를 형성함으로써 주로 달성된다(문헌[Downing et al., Dermatology in General Medicine, Fitzpatrick, et al., eds., pp. 210-221 (1993)], 문헌[Ponec, M., The Keratinocyte Handbook, Leigh, et al., eds., pp. 351-363 (1994)]). 각질층은 아래에 놓인 조직을 감염, 탈수, 화학물질, 및 기계적 스트레스로부터 보호하는 장벽(때때로 피부 장벽으로 지칭됨)을 형성한다. 각질층의 세포는, 수분 증발을 방지함으로써 피부가 수화된 상태를 유지하도록 돕는 단백질인 케라틴의 조밀한 네트워크를 함유한다. 이들 세포는 또한 물을 흡수하여, 추가로 수화에 도움이 될 수 있다. 게다가, 이 층은 피부의 "스프링 백(spring back)" 또는 탄력성(elastic property)을 담당한다. 각질층의 두께는 신체 전체에 걸쳐 다양하다. 손바닥 및 발바닥에서(때때로, 무릎, 팔꿈치, 손가락 관절, 및 어딘가 다른 곳에서), 이 층은 투명층(stratum lucidum)(투명상(clear phase))에 의해 안정화되고 구축되는데, 이러한 투명층은 세포가 케라틴을 농축되게 하여 그것을 강인화할 수 있게 하며, 그 후에 그것은 전형적으로 더 두껍고 더 응집력 있는 SC로 되어 간다. 일반적으로, 각질층은 15 내지 20개의 죽은 세포 층을 함유한다. 각질층은 두께가 10 내지 40 μm이다.
피부의 접근성 및 큰 면적으로 인해, 진피 효과, 국부 효과, 또는 전신 효과 어느 것이 요구되든지 간에, 이는 약물 투여를 위한 유망한 경로인 것으로 오랫동안 여겨져 왔다. 비경구 치료의 위험 및 불편함을 피할 수 있기 때문에, 약물 투여의 국소 경로가 때때로 바람직하다. 또한, 경구 치료와 관련된 변동적인 흡수 및 대사를 피해갈 수 있고, 약물 투여가 연속적일 수 있으며, 그럼으로써 짧은 생물학적 반감기를 갖는 치료 활성제(therapeutically active agent)의 사용을 가능하게 한다. 추가의 이점은 많은 화합물과 관련된 위장 자극을 피할 수 있고; 질병의 피부 증상이 전신 접근에 의한 것보다 더 효과적으로 치료될 수 있다는 것이다. 그러나, 고분자량 치료제 또는 미용제, 특히 단백질 및 펩타이드의 표피 침투는 대부분의 경우에 실질적으로 제한된다.
대부분의 경피 전달 조성물(예를 들어, 치료 또는 미용 조성물)은 피부 침투 향상 담체 또는 비히클을 사용함으로써 표피 침투를 달성한다. 그러한 담체 또는 비히클(이는 화합물 또는 화합물들의 혼합물임)은 "침투 향상제" 또는 "피부 향상제"로서 당업계에 알려져 있다. 문헌에 있는 일부 피부 향상제는 경피 흡수를 향상시키지만, 이들은 다음과 같은 점에서 소정의 결점을 갖는다: (i) 일부는 독성인 것으로 간주됨; (ii) 일부는 피부를 자극함; (iii) 일부는 오랜 사용 후에 피부에 대한 박화 효과(thinning effect)를 가짐; (iv) 일부는 피부 구조의 온전성(intactness)을 변화시켜 약물 확산성의 변화를 가져옴; 및 (v) 모두가 고분자량 약제 및 미용제, 예를 들어 펩타이드 및 단백질을 전달할 수 있는 것은 아님.
다른 대안적인 접근은 마이크로펀처 또는 박리(abrasion)를 통해 피부를 국부적으로 손상시켜 단백질 또는 펩타이드의 침투를 용이하게 하는 것이다. 역시, 이들 방법은 피부를 자극하고 손상시키며, 장기간 피부 손상으로 이어질 수 있다. 따라서, 피부 장벽을 통해 광범위한 약제 및 미용제, 특히 고분자량 분자(예를 들어, 단백질 및 펩타이드)를 전달할 수 있는 경피 전달 조성물 및 방법의 개발에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 피부 장벽을 가로질러 미용제를 전달하는 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 미용제는 봉입체 형태로 피부 장벽을 가로지른다. 또한, 피부 장벽을 가로질러 치료제를 전달하는 방법을 제공하며, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 치료제는 봉입체 형태로 피부 장벽을 가로지른다.
게다가, 본 발명은 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제, 및 피부학적으로 허용되는 담체를 포함하는 미용 조성물의 미용적 유효량을 국소 적용하여 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물의 치료적 유효량을 국소 적용하여 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함한다. 또한, 미용제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 미용제의 침투는 가용성 형태의 동일한 미용제의 침투와 대비하여 증가된다.
또한, 치료제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 치료제의 침투는 가용성 형태의 동일한 치료제의 침투와 대비하여 증가된다.
본 발명은 또한 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 상기 조직에 도달하고 그의 재생을 자극한다. 진핵 세포 증식을 자극하는 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체의 피부에 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 진핵 세포 증식을 자극한다. 경피 전달 시스템의 제조 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 (i) 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 제공하는 단계, (ii) 봉입체를 담체와 혼합하는 단계, 및 (iii) 봉입체를 담체와 혼합함으로써 경피 전달 시스템을 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 일부 태양에서, 봉입체는 불용성이다. 다른 태양에서, 봉입체는 가용화되지 않는다. 일부 태양에서, 봉입체는 부분 가용화된다. 다른 태양에서, 봉입체는 미립자 형태이다. 일부 태양에서, 미립자 형태는 입자 크기가 약 20 nm 내지 약 1500 nm이다. 일부 태양에서, 미립자 형태는 입자 크기가 약 100 nm 내지 약 500 nm이다. 다른 태양에서, 미립자 형태는 입자 크기가 약 150 nm 내지 약 300 nm이다.
일부 태양에서, 미립자 형태는 수화된 비정질 형태이다. 일부 태양에서, 봉입체는 표적 세포에 의해 내재화된다. 일부 태양에서, 표적 세포는 표피 세포이다. 다른 태양에서, 표적 세포는 비-표피 세포이다. 일부 태양에서, 표적 세포는 뉴런이다. 다른 태양에서, 표적 세포는 근육 세포이다. 일부 태양에서, 표적 세포는 지방세포이다.
일부 태양에서, 봉입체는 적어도 하나의 피부 층을 침투할 수 있다. 다른 태양에서, 봉입체는 각질층(cornified layer(stratum corneum)), 반투명층(투명층)(translucent layer(stratum lucidum)), 과립층(granular layer(stratum granulosum)), 유극층(spinous layer(stratum spinosum)) 또는 기저층(basal/germinal layer(stratum basale/germinativum))을 침투할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 일부 태양에서, 미용제 또는 치료제는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성이다. 다른 태양에서, 폴리펩타이드는 전구약물이다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 천연 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 또는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드이다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 다른 태양에서, 폴리펩타이드는 단백질 접합체이다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 키메라(chimeric) 폴리펩타이드이다. 다른 태양에서, 재조합 폴리펩타이드는 세균, 효모, 곤충 세포, 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 내에서 발현된다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 봉입체-유도(inclusion-body inducing) 폴리펩타이드에 유전자 융합되거나 또는 접합된다. 일부 태양에서, 봉입체-유도 폴리펩타이드는 바이러스성 단백질이다. 일부 태양에서, 바이러스성 단백질은 캡시드 단백질이다. 일부 태양에서, 봉입체-유도 폴리펩타이드는 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus)(FMDV)의 VP1 오량체-형성 캡시드 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 단백질 정제 태그 또는 시각화 태그에 접합된다. 일부 태양에서, 단백질 정제 태그는 His6-태그이다. 다른 태양에서, 시각화 태그는 형광 태그이다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 에리트로포이에틴(EPO), 코르티코트로핀-방출 호르몬(CRH), 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH), 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 프로락틴-방출 호르몬(PRH), 멜라노트로핀-방출 호르몬(MRH), 프로락틴-억제 호르몬(PIH), 소마토스타틴, 부신피질자극 호르몬(ACTH), 소마토트로핀 또는 성장 호르몬(GH), 황체형성 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH), 티로트로핀(TSH 또는 갑상선-자극 호르몬), 프로락틴, 옥시토신, 항이뇨 호르몬(ADH 또는 바소프레신), 멜라토닌, 뮐러관 억제 인자(
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), 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 가스트린, 콜레시스토키닌(CCK), 세크레틴, I형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), II형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-II), 심방 나트륨이뇨 펩타이드(ANP), 인간 융모성 고나도트로핀(hCG), 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩타이드(PP), 렙틴, 신경펩타이드 Y, 레닌, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 인자 VIII, 인자 IX, 조직 인자, 인자 VII, 인자 X, 트롬빈, 인자 V, 인자 XI, 인자 XIII, 인터류킨 1(IL-1), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 16(IL-16), 인터페론 알파, 베타, 감마, 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-베타), 골 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 아교세포 성장 인자, 각질세포 성장 인자(KGF), 내피 성장 인자, 알파-1 항트립신, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 사이클로스포린, 피브리노겐, 락토페린, 조직-유형 플라스미노겐 활성제(tPA), 키모트립신, 이뮤노글로빈, 히루딘, 초과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase), 이미글루세라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)(DHFR), 카탈라제, 또는 샤페론. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 Hsp70 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 다른 태양에서, 폴리펩타이드는 IL-10 및/또는 EGF 및/또는 KGF 및/또는 VEGF, 및/또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 일부 태양에서, 미용제로 치료하고자 하는 피부 질환은 건선, 셀룰라이트, 심상성 여드름, 낭포성 여드름, 피부 노화, 피부 주름살, 과다색소침착, 각화증, 피부 흠(skin blemish), 건성 비강진, 사마귀, 광손상 피부, 만성 피부증, 피부염, 건조감, 비늘증, 바이러스성 감염, 진균성 감염, 및 세균성 피부 감염으로부터 선택된다. 일부 태양에서, 치료제로 치료하고자 하는 피부 질환은 건선, 여드름, 무좀, 아구창, 옹종, 칸디다증, 세균성 질염, 질증, 연조직염, 단순 포진, 건성 비강진, 피부염, 습진, 홍색음선, 단독(erysipelas), 다형 홍반, 부스럼(furuncle), 농가진, 및 감염으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템을 제공한다. 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템이 또한 제공된다. 일부 태양에서, 전달 시스템은 패치, 스프레이, 면봉, 스펀지, 스틱, 또는 샴푸이다.
어플리케이터에 결합된 용기 및 용기 내에 포함된 본 명세서에 개시된 경피 전달 시스템을 포함하는 기구가 또한 제공된다.
또한, 국소 미용 조성물이 제공되며, 본 국소 미용 조성물은 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있다. 또한, 국소 치료 조성물이 제공되며, 본 국소 치료 조성물은 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있다. 일부 태양에서, 본 조성물은 용액, 겔, 크림, 로션, 연고, 에멀젼, 현탁액, 에어로졸, 에어로졸 폼, 도찰제, 팅크제, 고약(salve), 습포제(poultice), 건조 분말, 또는 이들의 조합이다.
도 1은 인큐베이션 용액 중의 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI)의 3개의 삽입물에 상응하는 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 패널 A는 대조군을 나타내고, 패널 B는 봉입체(CI)와 함께 인큐베이션된 샘플을 나타내고, 패널 C는 가용성 GFP와 함께 인큐베이션된 샘플을 나타낸다.
도 2는 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플과 함께 인큐베이션한 후의 다음의 3개의 샘플에 상응하는 형광 현미경 이미지를 나타낸다: 대조군(CTRL)(패널 A), 가용성 GFP(GFP)(패널 B), 및 GFP 봉입체(CI)(패널 C). 배율 및 노출 시간이 각각의 샘플에 대해 표시되어 있다. 패널 D, E, 및 F는 패널 A, B, 및 C에서의 샘플의 투과 현미경 이미지에 각각 상응한다. 패널 D, E, 및 F는 또한 모델 표피를 성장시키는 데 사용되는 막 기질("m")의 위치 및 각질층(SC)의 위치를 나타낸다.
도 3은 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플과 함께 인큐베이션한 후의 GFP 봉입체 샘플(CI)의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 4는 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플과 함께 인큐베이션한 후의 GFP 봉입체 샘플(CI)의 형광 현미경법(패널 A) 및 투과광(패널 B) 이미지를 나타낸 것으로, 각질층(SC)의 일부가 부분적으로 떼어져 나갔음을 보여준다.
도 5는 상이한 초점 평면들에서 촬영된 동일한 시야의 3개의 형광 현미경 이미지로부터 생성된 합성 이미지(패널 A) 및 샘플의 투과 현미경 이미지에 겹쳐진 패널 A의 동일한 이미지(패널 B)를 나타낸다. 모델 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플을 GFP 봉입체와 함께 인큐베이션하였다.
도 6은 가용성 GFP와 함께 인큐베이션된 모델 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 패널 A 및 B는 4초의 노출 시간(패널 A) 또는 30초의 노출 시간(패널 B)으로 캡처된 동일한 시야를 나타낸다.
도 7은 모델 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 대조군 샘플의 형광 현미경 이미지를 나타낸다. 패널 A 및 B는 4초의 노출 시간(패널 A) 또는 30초의 노출 시간(패널 B)으로 캡처된 동일한 시야를 나타낸다.
도 8은 모델 재구성된 인간 피부(Straticell® RHE/EPI) 샘플과 인큐베이션된 M0037-CI(봉입체)(패널 A) 및 M00037-GFP(가용성 GFP)(패널 B)의 형광 이미지를 나타낸다.
도 9는 M0037-CI 샘플(봉입체)로부터의 형광 신호가 각질층(SC) 내에, 표피의 최외층 내에, 그리고 많은 경우에 또한 표피의 중간 및 깊은 영역 내에 위치된 형광 응집체인 것으로 검출되는 것을 나타낸다. 공초점 형광 현미경 이미지(패널 A), 투과 현미경 이미지(패널 B), 및 투과 현미경 이미지에 겹쳐진 공초점 형광 현미경 이미지(패널 C)가 나타나 있다.
도 10은 M0037-GFP 샘플(가용성 GFP)의 형광의 대부분이 오로지 각질층 영역 내에서만 분산되고 위치되었음을 나타낸다. 이 도면은 공초점 형광 현미경 이미지(패널 A), 투과 현미경 이미지(패널 B), 및 투과 현미경 이미지에 겹쳐진 공초점 형광 현미경 이미지(패널 C)를 나타낸다.
도 11은 인간 표피의 구조의 다이어그램(패널 A), 인간 표피의 구조를 나타낸 현미경 사진(패널 B), 및 Straticell® 재구성된 인간 표피 모델 시스템의 예시적인 현미경 사진(패널 C)을 나타낸다.
도 12는 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색된 SDS-PAGE 겔(패널 A) 및 웨스턴 블롯(패널 B)이 L. 락티스에서의 VEGF의 발현에 상응함을 나타낸다. 레인 1은 Blue Plus2 표준에 상응한다. 레인 2 내지 7은 가용성 추출물이다. 레인 8 내지 13은 불용성 추출물이다. 레인 2: 균주 UP1421(HCN, wt); 레인 3: 균주 UP1424(MCN, wt); 레인 4: 균주 UP1427(HCN, htrA); 레인 5: 균주 UP1430(MCN, htrA); 레인 6: 균주 UP1433(HCN, clpP); 레인 7: 균주 UP1436(MCN, clpP); 레인 8: 균주 UP1421(HCN, wt); 레인 9: 균주 UP1424(MCN, wt); 레인 10: 균주 UP1427(HCN, htrA); 레인 11: 균주 UP1430(MCN, htrA); 레인 12: 균주 UP1433(HCN, clpP); 레인 13: 균주 UP1436(MCN, clpP).
도 13은 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE 겔(패널 A) 및 웨스턴 블롯(패널 B)이 L. 락티스에서의 KGF의 발현에 상응함을 나타낸다. 레인 1은 Blue Plus2 표준에 상응한다. 레인 2 내지 7은 가용성 추출물이다. 레인 8 내지 13은 불용성 추출물이다. 레인 2: 균주 UP1422(HCN, wt); 레인 3: 균주 UP1425(MCN, wt); 레인 4: 균주 UP1428(HCN, htrA); 레인 5: 균주 UP1431(MCN, htrA); 레인 6: 균주 UP1434(HCN, clpP); 레인 7: 균주 UP1437(MCN, clpP); 레인 8: 균주 UP1422(HCN, wt); 레인 9: 균주 UP1425(MCN, wt); 레인 10: 균주 UP1428(HCN, htrA); 레인 11: 균주 UP1431(MCN, htrA); 레인 12: 균주 UP1434(HCN, clpP); 레인 13: 균주 UP1437(MCN, clpP).
본 발명은 저분자량, 중간 분자량, 및 고분자량 치료제 또는 미용제(예를 들어, 펩타이드 및 단백질)를 포함하는 조성물의 경피 전달을 위한 방법, 조성물, 시스템, 및 장치를 제공한다. 본 발명은 치료 및 미용 응용을 갖는 경피 전달 조성물, 그러한 경피 전달 조성물을 필요로 하는 대상체에게 그를 제공하기 위한 경피 전달 장치, 및 전술된 것의 제조 및 사용 방법을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 또한 진단에 사용될 수 있다.
I. 정의
본 발명을 상세히 기술하기에 앞서, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않으며, 그렇기 때문에 변동될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "하나의"("a"(또는 "an"))뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
더욱이, 본 명세서에 사용되는 경우 "및/또는"은 2개의 명시된 특징 또는 구성요소의 각각에 대해, 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이, 이들 각각의 구체적인 개시로서 받아들여져야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하고자 한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"은 다음 태양들 각각을 포함하고자 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 문헌[the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 당업자에게 본 개시내용에 사용된 용어들 중 다수에 대한 일반적인 사전을 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제단위체계(SI) 허용 형태로 기재된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 본 명세서에 제공된 표제는 다양한 태양을 제한하지 않으며, 이러한 태양은 전체로서의 본 명세서를 참조함으로써 확인될 수 있다. 따라서, 바로 아래에서 정의된 용어는 전체적으로의 본 명세서를 참조함으로써 더 완전히 정의된다.
태양이 "포함하는"이라는 표현과 함께 본 명세서에 기재되어 있는 곳은 어디든지, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어로 기재된 달리 유사한 태양이 또한 제공됨이 이해된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 전형적으로 언급된 값의 +/―5%, 더 전형적으로는 언급된 값의 +/―4%, 더 전형적으로는 언급된 값의 +/―3%, 더 전형적으로는, 언급된 값의 +/―2%, 더욱 더 전형적으로는 언급된 값의 +/―1%, 및 더욱 더 전형적으로는 언급된 값의 +/―0.5%를 의미한다.
본 개시내용 전체에 걸쳐, 소정의 실시 형태가 범위 형식으로 개시될 수 있다. 범위 형식으로의 기술은 단지 편의성 및 간결성을 위해서이고, 개시된 범위의 범주에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다.
"단리된" 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 단백질, 봉입체, 또는 다른 조성물은 천연에서 발견되지 않는 형태의 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 단백질, 봉입체, 또는 다른 조성물이다. 본 명세서에 개시된 단리된 폴리펩타이드, 단백질, 봉입체, 또는 다른 조성물은 그들이 더 이상 천연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 태양에서, 단리된 것으로서의 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 단백질, 봉입체, 또는 다른 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 앞서의 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 치료용, 예방용(prophylactic), 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 (예를 들어, 합성 폴리뉴클레오티드인) 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA)는 코돈 최적화되어 있다. 다수의 코돈 최적화 방법이, 예를 들어 문헌[Gould et al. (2014) Front Bioeng. Biotechnol. 2:21]; 문헌[Mauro & Chappell (2014) Trends Mol. Biol pii: S1471-4914(14)00140-3]; 또는 문헌[Elena et al. (2014) Front. Microbiol. 5:21]에 기재된 바와 같이 당업계에 알려져 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에서 관심있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 일부 태양에서는, 발현할 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예에는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 소정의 진핵 세포, 예컨대 생성 세포가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질은 하나 초과의 핵산에 의해 인코딩될 수 있으며, 핵산은 다시 하나 이상의 벡터 내에 있을 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질이 2개, 3개, 또는 그 이상의 하위단위를 포함하는 경우, 각각의 그러한 하위단위는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드들은 단일 프로모터의 제어 하에서 또는 다수의 프로모터들(예를 들어, 하위단위를 인코딩하는 각각의 핵산 서열에 대한 프로모터)의 제어 하에서 단일 벡터 내에 모두 삽입될 수 있다. 다른 태양에서, 폴리뉴클레오티드 각각은 상이한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 하나 초과의 벡터가 사용된다면, 벡터는 동일할 수 있거나, 또는 상이한 벡터가 각각의 폴리뉴클레오티드에 대해 사용될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이에는 비-아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 천연적으로 또는 개입에 의해 변형된, 아미노산 중합체를 포함하며; 예를 들어, 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분(예를 들어, 염료), 치료제(예를 들어, 항암제), 또는 미용제와의 접합을 갖는 것들이다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형체를 함유하는 폴리펩타이드가 이 정의 내에 또한 포함된다.
"재조합" 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 조작된 숙주 세포 내에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩타이드 및 단백질은 본 발명의 목적상 단리된 것으로 여겨지며, 이는 천연 또는 재조합 폴리펩타이드가 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 것인 바와 같다. 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 재조합으로 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 단백질 및 펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 재조합 치료제 및 미용제의 생성은 하기에 더 상세히 개시된다. 재조합 단백질은, 예를 들어 하기일 수 있다:
(a) 천연 단백질;
(b) 돌연변이 단백질(예를 들어, 점 돌연변이체 또는 결실/삽입 돌연변이체);
(c) 변이 단백질(예를 들어, 천연 단백질 내의 소정 위치에서 통상적으로 발생하는 아미노산이 일부 천연 하위집단에서 대안적인 아미노산에 의해 천연적으로 대체된 단백질);
(d) 스플라이스 변이체;
(e) 천연, 돌연변이, 변이, 또는 스플라이스 변이 단백질로부터의 단편(예를 들어, 재조합 기법을 사용하여 얻어진 단편);
(f) 2개 이상의 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질 모이어티(moiety)를 포함하는 융합 단백질;
(g) 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질 모이어티를 포함하고 약동학적 특성을 개선할 수 있는 적어도 추가의 모이어티, 예를 들어 혈청 반감기를 연장할 수 있는 펩타이드 모이어티, 예컨대 Fc 모이어티, 알부민, XTEN, HAP 등을 추가로 포함하는 융합 단백질(예를 들어, 문헌[Hwang et al. (2014) FEBS Letters 588:247-252] 참조);
(h) 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질 모이어티를 포함하고 진단적 방법을 위해 적어도 검출가능한 모이어티, 예를 들어 친화성 태그, 형광 단백질 등을 추가로 포함하는 융합 단백질(예를 들어, 문헌[Nahalka et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:454-461] 참조);
(i) 접합 단백질(예를 들어, 문헌[Talafova et al. (2013) Microbial Cell Factories 12:16]; 문헌[Shiber et al. (2013) Mol. Biol. Cell. 24: 2076-2087] 참조); 또는,
(j) 이들의 조합.
용어 재조합 단백질은 또한 비-단백질 모이어티, 예를 들어 탄수화물, 지질, 지질다당류, 핵산, 다른 생화학 실체, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "백신 면역원(vaccine immunogen)"은 동물 내로 주사될 때 체액성 면역 반응을 이끌어내고, 예를 들어 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 포함하는 단백질(예를 들어, 전술된 재조합 단백질)을 지칭하며, 이는 구체적으로는 백신을 제조하는 데 사용된다. 이종 단백질의 대부분은 유기체 내에서 면역 반응을 촉발할 수 있지만, 용어 면역원, 백신 면역원, 및 이들의 문법적 변이 형태는 본 개시내용의 맥락에서 (i) 대상체에서 면역 반응을 이끌어낼 수 있고, (ii) 백신 또는 백신-관련 조성물(예를 들어, 백신과 병용-투여되는 증진제 제제(booster preparation))에 사용되는 단백질을 지칭한다. 용어 "백신"은 감염의 효과를 예방 또는 개선하기 위하여 질병에 대한 능동 면역을 생성하는 데 사용되는 항원성 제제를 정의하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "봉입체" 또는 "IB"라는 표현은 미생물(예를 들어, 원핵 또는 진핵 유기체) 내에서 또는 적합한 재조합 발현 시스템(예를 들어, 세포 시스템 또는 무세포 시스템) 내에서 생성되는 불용성 응집체 형태의 재조합 단백질(들)의 부분 또는 완전 침적물을 지칭한다. 약어 "IB"는 일반적으로 봉입체(단수)를 지칭하는 데 사용될 것이고, 약어 "IB들"은 봉입체들(복수)을 지칭하는 데 사용될 것이다. IB는 통상 0.05 μm 내지 1 μm를 포함한 입자 크기를 갖지만, 상기 범위는 변동될 수 있다. 일부 태양에서, IB 입자 크기(예를 들어, 평균 직경 크기, IB의 최대 치수의 크기, 또는 IB의 소정 백분율, 예를 들어 5% 내지 20%를 초과하여 통과되지 않게 하는 체의 그리드 크기로 측정됨)는 약 0.05 μm, 약 0.06 μm, 약 0.07 μm, 약 0.08 μm, 약 0.09 μm, 약 0.1 μm, 약 0.2 μm, 약 0.3 μm, 약 0.4 μm, 약 0.5 μm, 약 0.6 μm, 약 0.7 μm, 약 0.8 μm, 약 0.9 μm, 약 1 μm, 약 2 μm, 약 3 μm, 약 4 μm, 약 5 μm, 약 6 μm, 약 7 μm, 약 8 μm, 약 9 μm, 약 10 μm, 약 11 μm, 약 12 μm, 약 13 μm, 약 14 μm, 약 15 μm, 약 16 μm, 약 17 μm, 약 18 μm, 약 19 μm 또는 약 20 μm일 수 있다.
일부 태양에서, IB 입자 크기는 20 내지 1500 nm이다. 일부 태양에서, IB 입자 크기는 약 25 μm, 약 30 μm, 약 35 μm, 약 40 μm, 약 45 μm, 약 50 μm, 약 55 μm, 약 60 μm, 약 65 μm, 약 70 μm, 약 75 μm, 약 80 μm, 약 85 μm, 약 90 μm, 약 95 μm, 약 100 μm, 약 150 μm, 약 200 μm, 약 250 μm, 약 300 μm, 약 350 μm, 약 400 μm, 약 450 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 700 μm, 약 800 μm, 약 900 μm, 약 1000 μm, 약 1100 μm, 약 1200 μm, 약 1300 μm, 약 1400 μm, 또는 약 1500 μm이다. 일부 태양에서, IB 입자 크기는 1500 μm 초과이다.
일부 경우에, 그러나 모든 경우는 아니지만, 이들 IB는 광학 현미경 하에서 밝은 굴절 스폿으로서 인식될 수 있다. IB는 외래 유전자의 생성물의 불용성 형태의 응집에 의해 통상 형성된다. 플라스미드 내로 도입되는 외래 유전자는 이종 또는 상동 단백질을 인코딩하는 유전자일 수 있다. 이종 단백질이 IB를 형성할 가능성이 더 높은데, 그것은 그것을 생성하는 세포에 대해 외래 단백질이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 상동 단백질이 또한 IB를 생성할 수 있는데, 이는, 예를 들어 봉입체 형태의 단백질의 생성을 증가시키는 특정 서열에 대한 융합에 기인한다. 과발현된 단백질은 치료제(예를 들어, 단백질 또는 펩타이드) 또는 미용제(예를 들어, 단백질 또는 펩타이드)일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "봉입체 형태"는 불용성 단백질 응집체 내에 포함되는 미용제 또는 치료제, 일반적으로 단백질을 지칭한다. 일부 태양에서, 비-단백질 미용제 또는 치료제(예를 들어, 핵산)가 봉입체 내로 포함되어 국소 전달가능한 입자를 생성할 수 있다. 그러한 경우에, 예를 들어, 그러한 치료제 또는 미용제(예를 들어, 핵산)는 "봉입체 형태"인 것으로 여겨질 것이다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제의 투여는 또한, 봉입체가 봉입체로서의 그의 완전성을 (전체적으로 또는 부분적으로) 유지하면서 피부 장벽을 침투할 수 있음을 의미한다.
"이종 단백질"은 이용되는 숙주 세포에 대해 외래인 단백질, 예를 들어 E. 콜라이(E. coli)에 의해 재조합으로 생성된 인간 단백질이다. 이종 단백질은 원핵생물성 또는 진핵생물성일 수 있지만, 바람직하게는 이는 진핵생물성, 더 바람직하게는 포유류, 그리고 가장 바람직하게는 인간이다. 소정의 태양에서, 이종 단백질은 재조합으로 생성된다(예를 들어, 이는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이다).
IB는 재조합 단백질이 세포질 내에 축적되도록 설계되었는지 또는 주변세포질에 분비되도록 설계되었는지에 따라, 원핵 세포의 세포질 내에 또는 주변세포질 내에 축적될 수 있다. 치료용 단백질은 상기 단백질이 내부에서 봉입체를 형성할 진핵 세포의 경우에 소정 세포 구획으로 또는 원핵 세포의 주변세포질로 안내될 수 있다.
단백질 위치는 신호 서열을 사용함으로써 안내될 수 있다. 사실상 임의의 신호 서열이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Galliciotti et al. (2001) J. Membrane Biology 183:175-182]; 문헌[Stampolidis et al. (2009) Arch. Biochem. Biophys. 484:8-15]; 문헌[
Figure pct00002
(2007) Methods Mol. Biol. 390:47-61]). 예를 들어, 발현된 단백질은 PTS(peroxisomal targeting sequence)(퍼옥시좀 표적화 서열)를 사용하여 퍼옥시좀으로, MTS(mitochondrial targeting signal)(미토콘드리아 표적화 신호)를 사용하여 미토콘드리아 기질로, NLS(nuclear localization signal)(핵 국재화 신호)를 사용하여 핵으로, 또는 SRP(signal recognition peptide)(신호 인식 펩타이드)를 사용하여 소포체로 방향전환될 수 있다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 용어 "단일 펩타이드"는 표적화 신호, 신호 서열, 수송 펩타이드 및 국재화 신호를 포함한다.
과발현된 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산 서열은 치료용 단백질에 작동가능하게 연결된 봉입체 융합 파트너(즉, 봉입체-유도 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드), 예를 들어 구제역 바이러스(FMDV)의 VP1 단백질, 인간 Ab-아밀로이드 단백질의 F19D 돌연변이체, 또는 배큘로바이러스 폴리헤드린을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Li et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 96:1183-1190] 참조). 봉입체 융합 파트너를 미리 선택된 폴리펩타이드에 연결함으로써 탠덤 폴리펩타이드가 봉입체를 형성하게 될 것임은 당업계에 알려져 있다. 봉입체 융합 파트너의 아미노산 서열이 유용한 특성을 나타내는 봉입체를 생성하도록 변경될 수 있음이 당업계에 또한 알려져 있다.
과발현된 단백질은 전형적으로 IB 재료의 70 내지 100%를 나타낼 수 있으며, IB 재료는 소량으로 다른 단백질(예를 들어, 막 단백질 등), 리보솜 성분, 및 소량의 인지질 및 핵산을 함유할 수 있는데, 이들은 세포 용해 후에 흡착된다. 일부 샤페론(chaperone) 또는 접힘 조절인자(folding modulator)(예컨대, DnaK, GroEL 및 IbpA/B)가 때때로, 그러나 항상은 아니고, IB 형성과 관련된다. 일부 태양에서, 과발현된 단백질은 IB 재료의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 나타낸다.
일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 봉입체는 인터류킨-10(Il-10), 표피 성장 인자(EGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "VEGF"는 성장 인자의 하위-패밀리, 더 상세하게는, 시스틴-노트(cystine-knot) 성장 인자의 혈소판-유래 성장 인자 패밀리를 지칭한다. VEGF 패밀리는 맥관생성(배아 순환계의 데 노보(de novo) 형성) 및 혈관생성(기존의 혈관계로부터의 혈관의 성장) 둘 모두에 관여하는 중요한 신호전달 단백질을 포함한다. VEGF 패밀리 구성원은 VEGF-A(일반적인 혈관생성과 관련됨), VEGF-B(배아 혈관생성과 관련됨), VEGF-C (림프관생성과 관련됨), VEGF-D(폐 세기관지를 둘러싼 림프 혈관계의 발생에 필요함), 및 P1GF(맥관생성에 중요하며, 허헐, 염증, 상처 치유, 및 암 동안 혈관생성과 관련됨)를 포함한다.
VEGF 패밀리의 모든 구성원들은, 상이한 부위, 횟수 및 정도로 행해지긴 하지만, 세포 표면 상의 티로신 키나제 수용체(VEGFR)에 결합함으로써 세포 반응을 자극하여, 그것이 이량화되게 하고 인산전이(transphosphorylation)를 통해 활성화되게 한다. 모든 VEGF 수용체는 7개의 면역글로불린-유사 도메인으로 이루어진 세포외 부분, 단일 막횡단 스패닝 영역, 및 분할된 티로신-키나제 도메인을 함유하는 세포내 부분을 갖는다. VEGF-A는 VEGFR-1(Flt-1) 및 VEGFR-2(DR FIk-l)에 결합한다. VEGF-C 및 VEGF-D는 림프관생성을 매개하는 제3 수용체(VEGFR-3)에 대한 리간드이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 VEGF"는, 문헌[Leung et al, Science 246: 1306 (1989)], 및 문헌[Houck et al, Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같은, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 관련 인간 121-, 189-, 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 이와 함께 그러한 성장 인자들의 천연 발생 대립유전자 및 가공된 형태를 지칭한다.
용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 VEGF 폴리펩타이드의 절두 형태를 지칭하는 데 사용된다. VEGF의 임의의 그러한 형태에 대한 언급은 본 출원에서, 예를 들어 "VEGF(8-109)", "VEGF(1-109)" 또는 "VEGF165"로 나타날 수 있다. 절두형 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 나타낸 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 절두형 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17(메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17(메티오닌)이다. 절두형 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화성이 천연 VEGF와 비견된다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO1997020925호, WO2007044534호, WO2008116111호, WO2005011722호, WO2001074317호, WO2006138468호; 유럽 특허 EP1692158B1호; 또는 유럽 특허 출원 공개 EP2447280호를 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. VEGF-A의 아미노산 서열은 유니프로트(Uniprot) 데이터베이스에서 등록 번호 P15692로 입수가능하며, 이에는 또한 하기 변이체의 서열이 포함된다: VEGF206(유니프로트: P15692-1), VEGF189(유니프로트: P15692-2), VEGF183(유니프로트: P15692-3), VEGF165(유니프로트: P15692-4), VEGF148(유니프로트: P15692-5), VEGF145(유니프로트: P15692-6), VEGF165B(유니프로트: P15692-8), VEGF121(유니프로트: P15692-9), VEGF111(유니프로트: P15692-10), L-VEGF165(유니프로트: P15692-11), L-VEGF121(유니프로트: P15692-12), L-VEGF189(유니프로트: P15692-13), L-VEGF206(유니프로트: P15692-14), VEGF 15(유니프로트: P15692-15), VEGF 16(유니프로트: P15692-16), VEGF 17(유니프로트: P15692-17), VEGF 18(유니프로트: P15692-18). 용어 VEGF는 또한 그 단백질의 비-인간 형태를 포함한다.
VEGF는 혈관 형성을 조절하도록 도움으로써 새로운 혈관 형성을 자극하는 데 도움이 된다. 혈관 형성은 상처 또는 손상된 피부를 회복시키는 데 중요하며, 이에 따라 VEGF 투여는 상처의 치료에 또는 손상된 피부의 치료에 사용될 수 있다. VEGF는 또한 혈관 침투성을 증가시키는 데, 그럼으로써 다른 국소 부위의 침투를 향상시키는 데 도움이 된다. VEGF 투여는 파손된 모세혈관의 형성을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 이에 따라, 이는 장미증과 같은 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인터류킨-10" 또는 "IL-10"은 (i) 미국 특허 제5,231,012호에 개시된 바와 같은 (예를 들어, 분비 리더 서열이 결여되어 있는) 성숙 IL-10의 아미노산 서열을 갖고, (ii) 천연 IL-10에 공통된 생물학적 활성을 갖는 단백질로서 정의된다. IL-10의 생물학적 활성을 보유하는 뮤테인 및 다른 유사체 - 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus) 단백질 BCRF1(바이러스 IL-10)을 포함함 - 가 또한 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 US5753218호, US5776451호, US6544504호, US7052686호, US5665345호; 미국 특허 출원 공개 US20050158760호; 또는 국제 특허 출원 공개 WO2013130913호, WO1997005896호, WO2014023673호를 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 인터류킨-10의 단백질 서열은 유니프로트 데이터베이스에서 기탁 번호 P22301로 확인될 수 있다. 용어 인터류킨-10은 또한 그 단백질의 비-인간 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "각질세포 성장 인자" 또는 "KGF"는 FGFR-2에 결합할 수 있고, 섬유아세포에 대한 유의한 활성이 결여되어 있고, 상피 세포에 고유하게 특이적이고, 각질세포에 대해 특히 활성인 단백질들의 FGF 패밀리 군의 구성원을 지칭한다. KGF, 그의 유사체 및 단편은 합성으로 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 더욱이, KGF는 천연 공급원으로부터, 예컨대 임의의 포유류 공급원의 여러 조직 중 임의의 것으로부터, 예를 들어 인간 조직으로부터 단리될 수 있다.
용어 "성숙한 전장 KGF", "긴 형태의 KGF", "FL-KGF", "천연 KGF" 또는 "KGF163"은 163개의 아미노산 잔기를 함유하는 성숙한 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "KGF 단편"은 KGF163으로부터 유래된 폴리펩타이드로서, KGF163의 전체 서열을 포함하지 않는 것을 지칭한다. 그러한 단편은 전장 분자의 절두형 버전뿐만 아니라 내부 결실 폴리펩타이드일 수도 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2003016505호, WO1995001434호, WO1998006844호, WO2002062842호; 미국 특허 US7265089호, US5773586호, US5863767호; 또는 유럽 특허 EP0871730B1호, 또는 EP1012186B호를 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. KGF의 단백질 서열은 유니프로트 데이터베이스에서 기탁 번호 P21781로 확인될 수 있다. 인간 KGF의 2가지 동형(isoform)이 알려져 있으며, 즉 동형 1(유니프로트: P21781-1) 및 동형 2(유니프로트: P21781-2)이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 KGF는 또한 그 단백질의 비-인간 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "EGF"는 완전 서열 표피 성장 인자 및 그의 생물학적 활성을 유지하는 EGF 분자의 임의의 단편, 예컨대 C-말단에서 절단된 형태(문헌[Calnan et al, Gut 2000, 47 molecules. 622 - 627]) 또는 절단된 N-말단(문헌[Svodoca et al, Biochim Biophys Acta 1994, 1206: 35-41]; 문헌[Shin et al, Peptides 1995, 16: 205-210])을 지칭한다. 용어 EGF는 또한 아미노산 치환을 갖는 변이체를 포함한다(문헌[Shiah et al, J. Biol Chem 1992, 267: 24034-24040]; 문헌[Lahti et al, FEBS Lett 2011, 585:1135-1139], 국제 특허 출원 공개 WO 2007/065 464호).
표피 성장 인자(EGF)는 천연 발생의 비교적 짧은 단일쇄 폴리펩타이드로, 이는 마우스 악하선으로부터 최초로 단리되었다. 마우스 및 인간 표피 성장 인자(후자는 일부 초기 간행물에서 우로가스트론으로도 불림) 둘 모두는 53개의 아미노산을 함유한다. 이들 중 37개는 마우스 표피 성장 인자(mEGF) 및 인간 표피 성장 인자(hEGF)의 아미노산 서열에서 동일한데, 이는 이 구조에 존재하는 3개의 이황화물 결합의 상대적 위치인 바와 같다. (문헌[Gregory, Nature, 257, 325 (1975)]; 문헌[Gregory et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 356, 1765 (1975)]). 이 폴리펩타이드는 또한 βhEGF에서 발견되는 C-말단 아르기닌 잔기가 결여되어 있는 52 아미노산 형태(감마-hEGF)로서 존재한다. hEGF의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 문헌[Hollenberg, "Epidermal Growth Factor-Urogastrone, A Polypeptide Acquiring Hormonal States"; eds., Academic Press, Inc., New York (1979), pp. 69-110]; 또는 문헌[Urdea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7461 (1983)]에 개시되어 있다.
(C-말단의 5개의 아미노산이 결여되어 있는) hEGF의 48 아미노산 함유 형태가 제63003791호로 1988년 2월 8일에 공개된 일본 특허 출원 제86146964호에 기재되어 있다. 천연 형태의 분자는 잔기 6-20, 14-31 및 33-42 사이에 이황화물 결합을 함유하고, 8개의 EGF-유사 영역으로 이루어진 약 1200 아미노산 전구체 분자를 발생시킨다(예를 들어, 문헌[Bell et al., Nucleic Acid Research, 14, 21, 8427 (1986)] 참조). 래트 EGF의 48 아미노산 함유 형태가 제63202387호로 1988년 8월 22일에 공개된 일본 특허 출원 제8736498호에 개시되어 있다. mEGF 및 hEGF 둘 모두뿐만 아니라 이들의 알려진 유사체는 유사한 약리학적 활성을 나타내지만, 활성의 정도 또는 스펙트럼은 상이한 물질에 대해 상이할 수 있다. 일반적으로, EGF는 위산의 분비를 억제하고 세포 성장을 촉진하며; 이에 따라, 이는 항궤양제로서 그리고 외적 상처 치유에서의 치료적 잠재성을 목표로 한다. 예를 들어, 미국 특허 US6191106호, US5034375호, US5102789호, US5183805호; 미국 특허 출원 공개 US20090081222호, US20060014684호; 또는 국제 특허 출원 공개 WO1992003476호를 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 용어 EGF는 또한 EGF의 비-인간 형태를 포함한다. 인간 EGF 단백질의 서열은 유니프로트 데이터베이스에서 기탁 번호 P01133으로 확인될 수 있다. 유니프로트 데이터베이스 내에는 다음과 같은 EGF 동형의 서열이 또한 포함되어 있다: 동형 1(유니프로트: P01133-1), 동형 2(유니프로트: P01133-2), 동형 3(유니프로트: P01133-3). 당업계에 알려진 천연 변이체는 다음 위치에서 치환을 갖는 변이체를 포함한다: S16R, H151Y, D257Y, L292H, R431K, S638R, M708I, G723R, D784V, M842T, E920V, D981E, L1043F, A1084G.
용어 "대상체"는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭하며, 이는 본 명세서에 개시된 경피 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물, 또는 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물)에 의한 특정 치료의 수령체가 될 것이다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체와 관련하여 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 국소 투여에 적합하고 원하는 생리학적 효과를 유도하는 화학 물질 또는 화합물을 지칭한다. 용어 "치료제"는, 예를 들어 치료용 폴리펩타이드(예를 들어, 치료용 단백질 또는 펩타이드)를 포함한다. "치료용 단백질" 또는 "치료용 폴리펩타이드"는 숙주에 투여될 때, 또는 그것이 숙주의 세포에서 발현될 때, 숙주에 치료적 이득을 부여함으로써 질병(예를 들어, 피부 질병)의 치료에 또는 예방용 의약에 유용할 수 있는 가치있는 생물학적 특성을 갖는 임의의 천연 또는 비-천연 발생 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명의 목적상, 치료용 단백질의 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상 완화, 질병의 정도의 감소, 안정화된 병리학적 상태(구체적으로는 악화되지 않음), 질병의 진행의 지연 또는 정지, 병리학적 상태의 개선 또는 고식 및 관해(부분 및 전체 둘 모두)를 포함하지만 이로 한정되지 않으며, 이때 이들은 검출가능한 것 및 검출 불가능한 것 둘 모두를 포함한다.
당업자는 유리하거나 원하는 임상 결과가 상기 열거된 것들로 제한되지 않음을 이해할 것이다. 일부 태양에서, 치료제는 면역원이다. 따라서, 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 치료 조성물은 백신을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미용제"는 대상체 피부의 냄새 또는 외관(예를 들어, 색, 질감, 모양, 감촉 등)의 향상 또는 보호를 돕는 물질, 예를 들어 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 미용제는 피부의 기본 구조를 변화시킬 수 있다. 특히, 용어 "미용제"는 대상체의 신체 또는 그의 임의의 부분을 문지르거나, 그에 붓거나, 그에 뿌리거나, 그에 분무되거나, 그 안으로 도입되거나 또는 달리 그에 적용되도록 의도된 임의의 물질, 마찬가지로 그의 임의의 성분을 의미한다.
미용제는 미국 식품의약품국(US Food and Drug Administration)에 의해 일반적으로 안전하다고 인식된(Generally Recognized as Safe)(GRAS) 물질, 식품 첨가제, 및 의사의 처방없이 판매되는 의약품(over-the-counter medication)을 비롯한 비-미용용 소비자 제품에 사용되는 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미용제는 피부에 대한 국소 적용에 적합한 피부학적으로 허용되는 담체를 포함하는 미용 조성물 내에 포함될 수 있다.
미용제는, 예를 들어 하기를 포함한다:
(i) 피부 조직에 대해 적어도 하나의 효과(긍정적 또는 부정적)를 유도하거나 야기하는 것으로 알려진 화학물질, 화합물, 소분자 또는 대분자, 추출물, 제형, 또는 이들의 조합;
(ii) 피부 조직에 대해 적어도 하나의 효과(긍정적 또는 부정적)를 유도하거나 야기하는 것으로 알려져 있고, 제공된 방법 및 시스템을 사용하여 피부 조직에 대해 이전에 알려지지 않은 적어도 하나의 효과(긍정적 또는 부정적)를 유도하거나 야기하는 것으로 밝혀진 화학물질, 화합물, 소분자, 추출물, 제형, 또는 이들의 조합; 및
(iii) 피부 조직에 대해 효과를 갖는 것으로 알려지지 않고, 제공된 방법 및 시스템을 사용하여 피부 조직에 대해 효과를 유도하거나 야기하는 것으로 밝혀진 화학물질, 화합물, 소분자, 추출물, 제형, 또는 이들의 조합.
미용제 또는 미용적으로 작용가능한 물질의 일부 예는, 예를 들어 미국 국립보건원(National Institutes of Health), USA W와 관련된 PubChem 데이터베이스(pubchem.ncbi.nlm.nih. gov); 미국 화장품협회(Personal Care Products Council)의 성분 데이터베이스(personalcarecouncil.org); 문헌[2010 International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 13lh Edition, published by The Personal Care Products Council]; 유럽 화장품 성분 및 물질 목록(EU Cosmetic Ingredients and Substances list); 일본 화장품 성분 목록(Japan Cosmetic Ingredients List); 미국 화장품협회(Personal Care Products Council), 스킨딥(SkinDeep) 데이터베이스(www.cosmeticsdatabase.com); FDA 승인 부형제 목록(FDA Approved Excipients List); FDA OTC 목록(FDA OTC List); 일본 의약외품 목록(Japan Quasi Drug List); 미국 FDA EAF(Everything Added to Food, 식품에 첨가되는 모든 물질) 데이터베이스; EU 식품 첨가제 목록(Food Additive list); 일본 기존 식품 첨가제(Japan Existing Food Additives), 향미제 GRAS 목록(Flavor GRAS list); 미국 FDA SCOGS(US FDA Select Committee on GRAS Substances); 미국 가정용 제품 데이터베이스(US Household Products Database); Global New Products Database (GNPD) Personal Care, Health Care, Food/Drink/Pet and Household 데이터베이스(www.gnpd.com)에서; 그리고 화장품 성분 및 식물의 공급업체로부터 찾아볼 수 있다.
용어 "치료 조성물"은 활성 성분(예를 들어, 봉입체 형태의 단백질 또는 폴리펩타이드)의 생물학적 활성이 효과적이게 될 수 있도록 하는 형태이고, 조성물이 투여될 대상체에게 허용 불가능할 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 치료제를 포함하는 제제를 지칭한다. 그러한 조성물은 멸균 상태일 수 있다.
용어 "미용 조성물"은 활성 성분(예를 들어, 봉입체 형태의 단백질 또는 폴리펩타이드)의 원하는 활성이 (예를 들어, 대상체의 피부의 냄새 또는 외관, 예컨대 색, 질감, 모양, 감촉 등의 향상 또는 보호를 돕기에) 효과적이게 될 수 있도록 하는 형태이고, 조성물이 투여될 대상체에게 허용 불가능할 정도로 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 미용제를 포함하는 제제를 지칭한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 일상적 방식으로 결정될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 "유효량"은 치료되는 질환에 대하여 치료를 제공하기에, 또는 소정의 미용적 효과(예를 들어, 주름살(wrinkle)의 감소 또는 피부 유연성(skin flexibility)의 증가)를 달성하기에 충분한 투여량을 지칭한다. 이는 대상체, 질환 및 달성되는 치료, 또는 예측되는 치료적 및/또는 미용적 효과에 따라 변동될 수 있다. 필요한 정확한 양은 대상체의 종별, 성별, 및 대상체의 일반적 상태, 사용되는 특정 담체 또는 애쥬번트, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 변동될 것이다. 그렇기 때문에, 유효량은 특정 상황에 기초하여 변동될 것이며, 특정한 경우에 단지 일상 실험을 사용하여 당업자에 의해 적절한 유효량이 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질병 또는 장애를 "치료"하기에 유효한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 봉입체 형태의 치료제의 단독으로의 또는 다른 약물과 조합한 상태에서의 그의 양을 지칭한다.
용어 "미용적 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 피부 질환을 "개선"하기에 유효한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 봉입체 형태의 미용제의 단독으로의 또는 다른 약물과 조합한 상태에서의 그의 양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용될 때, 단어 "표지"는 "표지된" 치료제 또는 미용제를 생성하도록 본 명세서에 개시된 치료제 또는 미용제에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 링커(linker)를 통해) 접합되거나 융합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체만으로 검출가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지의 경우에는, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피부"는, 예를 들어 얼굴, 목, 가슴, 등, 팔, 손, 다리, 및 두피 상의 피부를 포함한다. 점막 조직에 대한 투여가 마찬가지로 가능성이 있는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피부 장벽"은 피부 각질층에 의해 야기된, 환경과 더 깊은 피부 층 사이의 물리적 및 화학적 장벽을 지칭한다.
본 발명의 조성물, 방법, 및 장치에 적용될 때, 용어 "국소 투여"는, 예를 들어 다양한 피부 질환 또는 장애의 치료를 위하여, 피부에 대해 또는 점막 조직에 대해 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 적용하는 것을 지칭한다. "국소 조성물"은 국소 투여에 적합한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "경피"는, 예를 들어, 피부 내의 위치에, 피부 아래에, 또는, 적용 지점으로부터, 예를 들어 혈류를 통해 도달될 수 있는 먼 위치에 도달하기 위하여 (예를 들어, 치료제 또는 미용제 분자의 집단의 적어도 일부분이 피부의 아래에 놓인 층에 도달하도록) 피부 장벽을 통한 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제의 전달을 지칭한다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어 "경피 전달 조성물"(즉, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 포함하는 조성물), "경피 전달 시스템"(즉, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 포함하는 시스템), 및 "경피 전달 장치/기구"(즉, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 포함하는 장치 또는 기구)를 제공한다.
경피 전달은 미용제 및 치료제가, 예를 들어 피부 또는 대상체의 피부의 피하 영역을 표적으로 하는 것으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 점에서, 경피 전달은 또한 치료제 또는 미용제의 혈류로의 전달을 포함한다.
II. 봉입체의 경피 전달
본 발명은 봉입체 형태의 치료제 및 미용제를 그를 필요로 하는 대상체에게 제공하기 위한 경피 전달 방법, 조성물, 및 장치를 제공한다. 본 발명의 태양은 고분자량(또는 저분자량 및 고분자량 둘 모두) 약제, 예방제, 진단제, 및 미용제를 대상체에게 경피 전달하는 데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 봉입체 형태로 제조되고 잘 확립된 시험관내(in vitro) 인간 피부 침투 모델에 적용된 큰 폴리펩타이드, 예컨대 238개의 아미노산 잔기로 구성된 단백질(26.9 kDa)인 녹색-형광 단백질(GFP)이 각질층을 통해 침투하여 깊은 표피 층에 도달할 수 있음을 보여주었다. 대조적으로, 대부분의 가용성 단백질, 예컨대 가용성 GFP는 피부의 각질층 장벽을 가로지를 수 없다. 이들 GFP 봉입체는 평균 크기가 300 nm 길이 및 170 nm 직경인 구형 또는 원통형 실체이다(문헌[
Figure pct00003
. (2009) Advanced Materials 21:4249-4253]). 가용성 형태의 큰 단백질이 각질층에 의해 야기된 장벽으로 인해 피부를 가로질러 수동적으로 침투할 수 없으며, 이에 따라 이러한 장벽을 극복하기 위해 향상된 기법이 필요하다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Kalluri et al., (2011) AAPS PharmSciTech 12(1):431-441]). 따라서, 수백 나노미터 크기 범위의 고도로 순수한 단백질 침적물인 비가용화된 봉입체가 피부 장벽을 침투할 수 있다는 발견은 의약품 및 화장품에서의 오랜 동안의 필요성에 대한 해결책을 제공한다. 미국 특허 출원 제13/142,295호(미국 특허 출원 공개 US 2011-0268773호로서 공개됨), 및 미국 특허 출원 제13/319,772호(미국 특허 출원 공개 제2012-0148529호로서 공개됨)뿐만 아니라 그러한 2개의 미국 특허 출원에 인용된 모든 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 게다가, 본 발명자들은 봉입체 형태의 IL-10(이는 염증을 감소시킴으로써 치료제로서, 그리고 염증과 관련된 발적 및 종창을 감소시킴으로써 미용제로서 동시에 기능할 수 있음)과 같은 단백질이 피부 장벽을 침투하고 인간 건선성 피부 샘플에 효과적일 수 있음을 보여주었다.
본 발명은 피부 장벽을 가로질러 미용제를 전달하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 미용제는 봉입체 형태로 피부 장벽을 가로지른다. 따라서, 온전한 IB가 대상체의 피부에 적용된 후에, 이는 피부를 통해 침투하고, 피부 내에 깊이 위치될 때에도 IB는 여전히 그의 구조적 완전성을 유지한다. 이들 방법은 또한 피부 장벽을 가로지르는 봉입체 형태의 치료제의 전달에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 피부 장벽을 가로질러 치료제를 전달하기 위한 방법을 또한 제공하며, 본 방법은 그를 필요로 하는 대상체의 피부에 치료 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 치료 조성물은 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 적어도 하나의 치료제는 봉입체 형태로 피부 장벽을 가로지른다.
봉입체 형태로 전달되는 치료제 및 미용제는, 예를 들어 피부 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미용제는 주름살, 일광 손상, 또는 셀룰라이트와 같은 피부 질환을 개선하기 위해 전달될 수 있다. 일부 태양에서, 미용제는 (예를 들어, 미용제가 선스크린의 일부로서 적용될 때) 일광 손상과 같은 피부 질환을 예방하기 위해 전달될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명은 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제, 및 피부학적으로 허용되는 담체를 포함하는 미용 조성물의 미용적 유효량을 국소 적용하여 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 피부 질환, 예컨대 염증(예를 들어, 자가면역 반응을 비롯한 면역 반응 또는 감염에 의해 야기됨) 또는 암을 개선하기 위해 치료제가 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물의 치료적 유효량을 국소 적용하여 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함한다.
고분자 크기 분자, 예컨대 단백질은 일반적으로 피부 장벽을 통해 침투할 수 없기 때문에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 봉입체 형태의 치료제 및 미용제(예를 들어, 단백질)의 제공은 대체로 피부 비침투성인 치료제 및 미용제(예를 들어, 단백질)의 침투 능력을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 미용제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 미용제의 침투는 가용성 형태의 동일한 미용제의 침투와 대비하여 증가된다. 이러한 침투의 개선은 또한 치료제, 예를 들어 치료용 단백질에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법을 또한 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 치료제의 침투는 가용성 형태의 동일한 치료제의 침투와 대비하여 증가된다.
봉입체가 시험관내에서 조직 재생을 자극하고 진핵 세포 증식을 자극하는 능력이 미국 특허 출원 제13/142,295호(미국 특허 출원 공개 US 2011-0268773호로 공개됨)에 개시되어 있으며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 따라서, 본 발명은 조직 재생을 자극하는 방법을 제공하며, 본 방법은 대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 상기 조직에 도달하고 그의 재생을 자극한다. 진핵 세포 증식을 자극하는 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 대상체의 피부에 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 진핵 세포 증식을 자극한다.
본 명세서에 개시된 봉입체는 경피 전달 시스템(예를 들어, 패치, 스프레이, 면봉, 스펀지, 스틱, 샴푸 등) 내로 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 경피 전달 시스템의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 (i) 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 제공하는 단계, 및 (ii) 봉입체를 담체와 혼합함으로써 경피 전달 시스템을 제조하는 단계를 포함한다.
일부 태양에서, 봉입체는 불용성이다. 다른 태양에서, 봉입체는 가용성이지만, 이는 가용화되어 있지 않다. 또 다른 태양에서, 봉입체는 부분 가용화된다. 일부 경우에, 봉입체는, 예를 들어, 세제 또는 유기 용매와 같은 가용화제를 함유하는 용액에 의한 1회 이상의 세척에 의해 부분 가용화될 수 있다. 부분 가용화는, 예를 들어, 봉입체를 둘러싼 지질막을 제거하는 데, 또는 봉입체의 외부 층에 부착된 숙주 세포 오염물을 스트립핑하는 데 사용될 수 있다. 일부 태양에서, 외부 층의 부분 가용화는 봉입체의 순도를 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 태양에서, 봉입체는 미립자 형태이다. 특히, 본 명세서에 개시된 봉입체는 20 nm 내지 1500 nm의 입자 크기를 가질 수 있다. 입자 크기는 입자가 실질적으로 구형인 경우 입자의 직경을 지칭한다. 입자는 비구형일 수 있으며, 이 경우에 입자 크기 범위는 구형 입자에 대한 그 입자의 상당 직경을 지칭할 수 있다.
일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 110 nm, 약 120 nm, 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm, 약 160 nm, 약 170 nm, 약 180 nm, 약 190 nm, 약 200 nm, 약 210 nm, 약 220 nm, 약 230 nm, 약 240 nm, 약 250 nm, 약 260 nm, 약 270 nm, 약 280 nm, 약 290 nm, 약 300 nm, 약 350 nm, 약 400 nm, 약 450 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 약 800 nm, 약 850 nm, 약 900 nm, 약 950 nm, 약 1000 nm, 약 1050 nm, 약 1100 nm, 약 1150 nm, 약 1200 nm, 약 1250 nm, 약 1300 nm, 약 1350 nm, 약 1400 nm, 약 1450 nm, 또는 약 1500 nm이다.
일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 100 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 200 nm 내지 약 300 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 300 nm 내지 약 400 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 400 nm 내지 약 500 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 500 nm 내지 약 600 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 600 nm 내지 약 700 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 700 nm 내지 약 800 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 800 nm 내지 약 900 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 900 nm 내지 약 1000 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 1000 nm 내지 약 1100 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 1100 nm 내지 약 1200 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 1200 nm 내지 약 1300 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 1300 nm 내지 약 1400 nm이다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 1400 nm 내지 약 1500 nm이다.
일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 150 nm 내지 약 300 nm의 입자 크기를 갖는다. 일부 태양에서, 평균 봉입체 입자 크기는 약 100 nm 내지 약 500 nm의 입자 크기를 갖는다.
일부 태양에서, 봉입체는 수화된 비정질 형태이다. 일부 태양에서, 피부 장벽을 침투한 후에, 봉입체는 표적 세포에 의해 내재화될 수 있다. 일부 태양에서, 표적 세포는 표피 세포이다. 다른 태양에서, 표적 세포는 비-표피 세포이다. 일부 태양에서, 표적 세포는, 예를 들어 신경, 근육 세포, 지방세포, 멜라닌세포, 모낭 세포, 한선 세포, 피지선 세포, 혈관 내의 세포, 각질세포, 메르켈 세포, 랑게르한스 세포, 또는 이들의 조합이다. 제공된 목록은 비제한적이다.
일부 태양에서, 봉입체는 적어도 하나의 피부 층, 일반적으로 각질층을 침투할 수 있지만, 다른 태양에서 봉입체는 피부 내에 더 깊이 침투할 수 있다. 따라서, 일부 태양에서, 봉입체는 반투명층(투명층), 과립층, 유극층 또는 기저층을 침투할 수 있다. 일부 태양에서, 봉입체는 표피보다 더 깊이 침투할 수 있다. 일부 태양에서, 봉입체 내의 치료제는 피부를 침투하여 혈류로 전달될 수 있다.
일부 태양에서, 봉입체는 상피 조직 층, 예를 들어 표 1에 기재된 상피 조직들 중 하나의 층을 침투할 수 있다.
[표 1]
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 태양에서, 봉입체 형태의 미용제 또는 치료제는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성이지만; 다른 태양에서, 폴리펩타이드는 전구약물이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전구약물"은 부모 작용제(parent agent)의 불안정한 유도체 화합물(labile derivative compound)인 본 명세서에 개시된 바와 같은 치료제 또는 미용제로서, 생체내에서 대상체에게 투여될 때 화학적 및/또는 효소적 가수분해에 의해 절단되게 됨으로써 부모 치료제 또는 미용제를 형성하여, 대상체에게 전달되도록 의도된 그러한 작용제의 충분한 양이 지속 방출 방식으로 그의 의도된 치료 또는 미용 용도에 이용가능하도록 한, 상기의 치료제 또는 미용제를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "불안정한"은 생체내에서 효소적 및/또는 화학적 절단을 거침으로써 부모 작용제를 형성하는 전구약물의 능력을 지칭한다. 용어 "지속 방출"(때때로 당업계에서 "지속 전달" 또는 "연장 방출"로 지칭됨)은 전구약물이 흡수의 느린 1차 반응속도론 또는 흡수의 0차 반응속도론을 포함한 임의의 기전에 의해 부모 치료제 또는 미용제의 방출을 제공하여, 전구약물로부터 방출되는 부모 치료제 또는 미용제가 단독으로 투여될 때의(즉, 전구약물로서가 아닌) 부모 치료제 또는 미용제의 작용의 지속시간보다 작용의 더 긴 지속시간을 제공하도록 하는 것을 나타낸다.
일부 태양에서, 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 천연 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 또는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드이다. 봉입체를 생성하기 위한 단백질의 재조합 생성을 위한 방법이 당업계에 알려져 있다. 봉입체의 생성, 정제, 및 특성화를 위한 구체적인 방법이 하기에 상세히 개시되어 있다. 펩타이드의 화학적 합성을 위한 방법이 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 봉입체는 또한, 예를 들어 화학적으로 합성된 펩타이드 및 단백질로부터, 천연 공급원으로부터 얻어진 펩타이드 및 단백질로부터, 또는 인공 바이러스-유사 입자로부터 생성된 불용성 단백질 침전물 또는 나노입자를 포함한다(예를 들어 문헌[Domingo-Espin et al. (2011) Nanomedicine 6:1047-1061]; 문헌[Domingo-Espin et al. (2010) J. Biotechnol. 150:437-438] 참조).
일부 태양에서, 폴리펩타이드는 융합 단백질 또는 단백질 접합체이다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 다른 단백질에 화학적으로 접합된 치료제 또는 미용제, 예를 들어 봉입체-유도 펩타이드를 포함할 수 있다. 접합은 유도체화 가능한 기(derivatizable group) 및 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로 유도체화 가능한 기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 아미노 기, 설프하이드릴 기, 펜던트 옥시아미노 기, 또는 다른 친핵성 기이다. 유도체화 가능한 기는 하나 이상의 링커를 통해 폴리펩타이드 사슬에 결합될 수 있다. 리간드(예를 들어, 추가의 치료제 또는 미용제, 검출가능한 표지, 반감기 연장 중합체 등)가 적절한 부착 화학반응(attachment chemistry)을 사용하여 유도체화 가능한 기에 부착될 수 있다. 이러한 커플링 화학반응(coupling chemistry)은, 예를 들어 아미드, 우레아, 티오우레아, 옥심, 아미노아세틸아미드 등을 포함할 수 있다. 접합에 적합한 가교결합제는 적절한 스페이서(spacer)에 의해 분리된 2개의 별개의 반응성 기를 갖는 헤테로이작용성(heterobifunctional)인 것(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드산 에스테르) 또는 호모이작용성인 것(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트)을 포함한다. 그러한 가교결합제는, 예를 들어 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Chemical Company로부터 입수가능하다. 추가의 이작용성 커플링제는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 포함한다.
일부 태양에서, 폴리펩타이드는 키메라 폴리펩타이드이며, 즉 폴리펩타이드는 적어도 2개의 단백질 또는 그들의 단편을 융합하거나 또는 화학적으로 접합시킨 결과이다. 일부 태양에서, 그러한 단백질은 동일한 종으로부터 얻어지지만, 다른 경우에, 키메라 단백질의 성분들은 상이한 종으로부터의 단백질로부터 얻어질 수 있다. 일부 태양에서, 재조합 폴리펩타이드는 세포, 예를 들어 세균, 효모, 곤충 세포, 및 포유류 세포 내에서 발현된다. 당업자는 임의의 세포 발현 시스템, 무세포 발현 시스템, 또는 봉입체를 얻기 위한 대안적인 방법이, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용하기 위해 봉입체를 얻는 데 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 태양에서, 폴리펩타이드는 단백질 정제 태그 또는 검출가능한 표지, 예를 들어 시각화 태그에 접합된다. 일부 태양에서, 단백질 정제 태그는 His6-태그이다. 일부 태양에서, 시각화 태그는 형광 태그이다. 유용한 검출가능한 표지는 형광 화합물(예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 5-다이메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린, 란탄족 인광체 등), 검출에 유용한 효소(예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등), 방사성 표지, 또는 2차 리포터(secondary reporter)에 의해 인식되는 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequence), 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)를 포함한다. 일부 태양에서, 검출가능한 표지는 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착될 수 있다.
일부 구체적인 태양에서, 미용제는 IL-10, EGF, KGF, VEGF, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질이다. 다른 태양에서, 치료제는 IL-10, EGF, KGF, VEGF, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질이다.
III. 미용제 및 치료제
본 명세서에 개시된 방법, 조성물, 및 장치는 봉입체 형태의 치료제 및/또는 미용제를 사용할 수 있으며, 상기 작용제들은, 예를 들어 저분자량 또는 고분자량(또는 저분자량 및 고분자량 둘 모두) 약제, 예방제, 진단제, 및 미용제이다. 본 명세서에 개시된 치료제 및 미용제는, 예를 들어 핵산, 폴리펩타이드, 펩타이드, 변형된 펩타이드, 소분자, 면역원성 제제 등을 포함한다.
본 명세서에 개시된 봉입체는, 예를 들어 호르몬, 마취제, 콜라겐 제제, 심혈관 약제학적 화합물, 항감염성 화합물(예를 들어, 항생제 및 항바이러스성 화합물), 당뇨병-관련 치료제, 면역원성 조성물, 백신, 면역 반응 조절제, 효소 억제제, 진통제, 편두통 요법제, 진정제, 및 조영 화합물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 이들 예는 본 발명의 태양이 저분자량 및 고분자량 화합물 둘 모두를 경피 전달하는 데 사용될 수 있음을 개시하기 위해 제공되며, 많은 다른 분자들이 본 명세서에 기재된 분자를 사용하여, 치료적으로, 예방적으로, 또는 미용적으로 유익한 양으로 신체에 효과적으로 전달될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 태양에서, 봉입체는 하기와 같은 폴리펩타이드를 포함한다: 에리트로포이에틴(EPO), 코르티코트로핀-방출 호르몬(CRH), 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH), 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 프로락틴-방출 호르몬(PRH), 멜라노트로핀-방출 호르몬(MRH), 프로락틴-억제 호르몬(PIH), 소마토스타틴, 부신피질자극 호르몬(ACTH), 소마토트로핀 또는 성장 호르몬(GH), 황체형성 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH), 티로트로핀(TSH 또는 갑상선-자극 호르몬), 프로락틴, 옥시토신, 항이뇨 호르몬(ADH 또는 바소프레신), 멜라토닌, 뮐러관 억제 인자, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 가스트린, 콜레시스토키닌(CCK), 세크레틴, I형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), II형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-II), 심방 나트륨이뇨 펩타이드(ANP), 인간 융모성 고나도트로핀(hCG), 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩타이드(PP), 렙틴, 신경펩타이드 Y, 레닌, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 인자 VIII, 인자 IX, 조직 인자, 인자 VII, 인자 X, 트롬빈, 인자 V, 인자 XI, 인자 XIII, 인터류킨 1(IL-1), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 16(IL-16), 인터페론 알파, 베타, 감마, 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-베타), 골 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 아교세포 성장 인자, 각질세포 성장 인자(KGF), 내피 성장 인자, 알파-1 항트립신, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 사이클로스포린, 피브리노겐, 락토페린, 조직-유형 플라스미노겐 활성제(tPA), 키모트립신, 이뮤노글로빈, 히루딘, 초과산화물 불균등화 효소, 이미글루세라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 카탈라제, 또는 샤페론(예를 들어, Hsp70).
구체적인 태양에서, 봉입체 내의 단백질은 천연 단백질의 치료적, 예방적, 또는 미용적 특성의 적어도 일부를 보유하는 EGF, KGF, 또는 VEGF, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다.
일 태양에서, 봉입체는 EGF, EGF 단편, EGF 변이체, EGF 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일의 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질을 포함한다.
다른 태양에서, 봉입체는 KGF, KGF 단편, KGF 변이체, KGF 유도체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일의 치료용, 예방용, 또는 미용용 단백질을 포함한다.
또 다른 태양에서, 봉입체는 VEGF, VEGF 단편, VEGF 변이체, VEGF 유도체, 또는 이들의 조합으로 이루어진 단일의 치료제, 예방제, 또는 미용제를 포함한다.
다수의 성장 인자가 국소 피부 제형(예를 들어, 크림)에 사용될 수 있다. 국소 피부 제형(예를 들어, 크림)은 단일 성장 인자 또는 다수의 성장 인자 및 사이토카인을 함유할 수 있다. 그러한 제형은 또한 자유 라디칼을 중화시키기 위하여 가용성 콜라겐, 기질 단백질 및 항산화제를 함유할 수 있다. 국소 피부 제형 내에 포함될 수 있는 성장 인자의 예가 표 2(하기)에 열거되어 있다.
[표 2]
Figure pct00006
국소 제형 내에 포함될 때, 성장 인자는 (i) 자연 노화 과정에 의해 매개되는 내인성 노화, 및/또는 (ii) 환경적 인자에 의해 매개되는 외인성 노화의 징후 및 증상을 역전, 예방 또는 치료할 수 있다. 역전, 예방, 또는 치료될 수 있는 내인성 노화의 효과는 세포가 증식 또는 분화를 정지하는 경향, 피부 내의 콜라겐의 양의 감소, 피부 내의 콜라겐의 분해, 피부 박화, 탄력(elasticity)의 손실 및 피부 이완의 증가 등을 포함한다. 역전, 예방, 또는 치료될 수 있는 (예를 들어, 대기 건조, 또는 UV 방사선과 같은 환경적 인자, 또는 화학적 필링 또는 레이저 요법과 같은 인공적 인자에 의해 야기되는) 외인성 노화의 효과는 굵은 주름살, 파손된 혈관, 피부 이완, 건조감, 눈에 띄는 모공, 피부 변색, 고르지 않은 피부 톤 등을 포함한다. 따라서, 일부 태양에서, 성장 인자(예를 들어, VEGF, KGF, 또는 EGF)를 포함하는 국소 제형이 잔주름(fine line) 및/또는 주름살의 출현을 감소시키거나, 검버섯의 출현을 개선하거나, 색소침착을 균일하게 하거나, 피부 거칠기를 감소시키거나, 피부 질감을 개선하거나, 피부 탄력을 개선하거나, 피부 매끄러움을 개선하거나, 피부 팽팽함(tightness)을 증가시키거나 또는 이들의 조합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mehta et al. (2007) Dermatologic Therapy 20:350-359]; 문헌[Sundaram et al. (2009) J. Drugs Dermatol. 8:4-13]; 문헌[Michael et al. (2007) JH. Drugs Dermatol. 6:197-202]을 참조하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "성장 인자"는 또한 성장 인자 모방 펩타이드를 포함한다. CTFA(Cosmetic Toiletry, Fragrance Association)에 등록된 성장 인자 성분은, 예를 들어 EFG(노화방지), IF-1(노화방지, 모발-케어), bFGF(노화방지, 모발-케어), TRX(노화방지, 색소침착 방지, 모발-케어), KGF(노화방지, 모발-케어), SCF(모발-케어), TGF-베타3(모발-케어), IL10(항염증), PDGF(노화방지), VEGF(모발-케어), FGF10(모발-케어), aFGF(노화방지, 모발-케어), TGF-알파(노화방지), IL-4(항염증), 티모신(Thymosin)-베타4(노화방지, 모발-케어), 노긴(Noggin)(모발-케어), hNGF(모발-케어) 등을 포함한다. CTFA에 등록된 성장 인자 모방 펩타이드는, 예를 들어 CG-IDP2™(노화방지, 모발-케어), CG-IDP3™(노화방지), CG-IDP4™(노화방지), CG-IDP5™(노화방지, 모발-케어), CG-EDP1™(노화방지), Alopectin™(모발-케어), Retardrin™(모발-케어), Rejuline™(노화방지, 모발-케어) 등을 포함한다.
봉입체 형태의 많은 상이한 치료제 또는 미용제가 본 명세서에 기재된(그리고 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용된) 다양한 경피 전달 조성물, 시스템, 및 장치 내로 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "경피 전달 조성물"은 본 발명의 치료 조성물 및 미용 조성물 둘 모두를 포함한다. 저분자량 및 고분자량 치료제 또는 미용제는 본 발명의 태양을 사용하여 효과적으로 경피 전달될 수 있다.
본 명세서에 기재된 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 포함하는 경피 전달 조성물은 분자량이 50 달톤 내지 2,000,000 달톤 이하인 치료제 또는 미용제의 치료적, 예방적, 진단적, 또는 미용적으로 유익한 양을 제공할 수 있다. 즉, 본 명세서에 기재된 경피 전달 조성물은 바람직하게는 분자량이 50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000, 30,000, 31,000, 32,000, 33,000, 34,000, 35,000, 36,000, 37,000, 38,000, 39,000, 40,000, 41,000, 42,000, 43,000, 44,000, 45,000, 46,000, 47,000, 48,000, 49,000, 50,000, 51,000, 52,000, 53,000, 54,000, 55,000, 56,000, 57,000, 58,000, 59,000, 60,000, 61,000, 62,000, 63,000, 64,000, 65,000, 66,000, 67,000, 68,000, 69,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, 100,000, 125,000, 150,000, 175,000, 200,000, 225,000, 250,000, 275,000, 300,000, 350,000, 400,000, 450,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1,000,000, 1,500,000, 1,750,000, 및 2,000,000 달톤 미만 또는 상기 값 또는 상기 값 초과인 치료 또는 미용 전달제를 제공한다.
일부 태양에서, 아미노산, 펩타이드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 및 핵산이 본 명세서에 기재된 경피 전달 조성물 태양 및 방법의 태양을 사용하여 체내의 세포에 봉입체 형태로 경피 전달된다. 즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 7000, 또는 10,000개 이상, 미만, 초과 또는 상기 개수의 아미노산을 갖는 임의의 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 본 명세서에 기재된(그리고 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용된) 경피 전달 조성물, 시스템, 또는 장치 내로 포함될 수 있으며, 상기 치료 또는 미용 전달제는 조성물의 적용 직후에 체내의 세포에 전달될 수 있다. 이들 펩타이드 또는 폴리펩타이드는, 예를 들어 면역 반응을 자극하는 데, 염증을 감소시키는 데, 상처 치유를 촉진하는 데, 콜라겐 합성을 유도하는 데 등에 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 또한 펩타이드 호르몬을 포함한다. 소정 태양에서 전달제인 펩타이드 호르몬의 비제한적인 예에는 다음이 포함된다: 옥시토신, 바소프레신, 멜라닌세포-자극 호르몬, 코르티코트로핀, 리포트로핀, 티로트로핀, 성장 호르몬, 프로락틴, 황체형성 호르몬, 인간 융모성 고나도트로핀, 여포 자극 호르몬, 코르티코트로핀-방출 인자, 고나도트로핀-방출 인자, 프로락틴-방출 인자, 프로락틴-억제 인자, 성장-호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 티로트로핀-방출 인자, 칼시토닌, 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드, 부갑상선 호르몬, 글루카곤-유사 펩타이드 1, 글루코스-의존성 인슐린분비촉진 폴리펩타이드, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토키닌, 모틸린, 혈관작용성 장 펩타이드, 섭스턴스(substance) P, 췌장 폴리펩타이드, 펩타이드 티로신 티로신, 신경펩타이드 티로신, 암피레귤린, 인슐린, 글루카곤, 태반 락토겐, 렐락신, 인히빈 A, 인히빈 B, 엔도르핀, 안지오텐신 II, 또는 심방 나트륨이뇨 펩타이드.
적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 7000, 또는 10,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 갖는 임의의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 핵산이 본 명세서에 기재된(그리고 본 명세서에 개시된 방법에 따라 사용된) 경피 전달 조성물, 시스템, 또는 장치 내로 포함될 수 있으며, 상기 치료 또는 미용 전달제는 조성물의 적용 직후에 체내의 세포에 전달될 수 있다. 이들 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는, 예를 들어 면역 반응을 자극하는 데, 염증을 감소시키는 데, 상처 치유를 촉진하는 데, 또는 콜라겐 합성을 유도하는 데에 또한 사용될 수 있다.
몇몇 핵산 면역원 및/또는 백신 및 요법이 당업계에 알려져 있으며, 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물, 방법, 시스템, 및 장치의 태양에서 전달제로서 유용할 수 있다. 숙주에 투여 시에 면역 반응(체액성 및 세포성 둘 모두)을 유도하는 몇몇 핵산 면역원이 기재되어 있다. 몇몇 바이러스에 대한 DNA 백신뿐만 아니라 종양에 대한 DNA 백신도 알려져 있다. 당업자는 핵산 면역원이 본질적인 조절 요소를 함유하여, 숙주에 투여 시에, 면역원이 각각의 전달된 핵산들에 의해 인코딩된 번역 생성물을 생성하도록 숙주 세포 기계(host cellular machinery)를 안내할 수 있도록 한다는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 면역원은 치료제인 것으로 여겨지고, 면역원을 포함하는 조성물은 치료 조성물인 것으로 여겨진다.
저분자량 전달제 및 중간 분자량 전달제에 더하여, 몇몇 고분자량 전달제(예를 들어, 당단백질)가 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물, 방법, 시스템, 및 장치의 태양을 사용함으로써 체내의 세포에 전달될 수 있다. 당단백질은 보결 분자단(prosthetic group)으로서 하나 이상의 헤테로당류(heterosaccharide)를 함유하는 접합된 단백질로서 일반적으로 특징지어지는 고분자량 화합물이다. 몇몇 형태의 당단백질이 체내에서 확인된다. 예를 들어, 많은 막결합 단백질이 당단백질이고, 세포간 공간을 충전하는 물질(예를 들어, 세포외 기질 단백질)이 당단백질이고, 콜라겐, 프로테오글리칸, 뮤코다당류, 글리코사미노글리칸, 및 기질(ground substance)을 포함하는 화합물이 당단백질이다. 당단백질을 포함하는 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제를 신체의 세포에 투여할 수 있는 경피 전달 시스템은 몇몇 치료 및 미용 용도를 갖는데, 이에는 피부 탄력 및 탱탱함(firmness)의 회복(예를 들어, 잔주름 및 주름살의 출현의 감소), 및 유연 관절 및 강한 관절의 회복(예를 들어, 프로테오글리칸의 경피 전달에 의한 관절 내의 물 보유의 증가에 의해 야기됨)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
당업계에 알려진 미용용 펩타이드가 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물, 방법, 시스템, 및 장치에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 미용용 펩타이드는 미국 특허 출원 공개 US2009/0136595호; US2010/0196302호; US2005/0226839호; US2009/0155317호; US2006/0293227호; US2009/0143295호; US2007/0110686호; US2011/0305735호, US2010/0098769호, US2009/0155317호, US2011/0195102호, US2012/0021029호, US2012/0121675호, 및 미국 특허 US7943156호, US7022668호, US8114439호, US7473679호, US6875744호, US6333042호, 및 US7015192호에 개시되어 있다.
본 발명에 따라 전달될 수 있는 치료용 펩타이드는, 예를 들어 인슐린, 엑센딘 및 유도체, 예를 들어, 릭시세나티드(예를 들어, 미국 특허 US6989366호, US7297761호, US7115569호, US7138375호, 및 US6956026호, 및 미국 특허 출원 공개 US2005/0215469호에 개시된 것들), 근육 이완 펩타이드(예를 들어, US2009/0226387호에 개시된 것들), 항종양 펩타이드(예를 들어, US2003/0109437호, US2008/0027005호, US7241738호에 개시된 것들); 항세균 펩타이드(예를 들어, US2002/0035061호, US2003/0232750호, US6503881호, US5994306호, US7001983호에 개시된 것들); 뉴로엑소사이토시스 억제 펩타이드(예를 들어, US2010/0021510호, US2008/0241881호, US2011/0305735호에 개시된 것들) 등을 포함한다. 일부 태양에서, 치료용 펩타이드 및 단백질이 미용 목적으로 전달될 수 있는데, 예를 들어 보툴리눔 독소, 이의 변이체, 및 단편(예를 들어, 보툴리눔 신경독소 A 또는 US5837265호에 개시된 분자) 또는 보툴리눔 신경독소의 작용을 모방하는 펩타이드(예를 들어, US2010/0021510호, 또는 US7473679호에 개시된 것들)이다. 표정선(expression line)을 연화시키기 위해 또는 출현을 피하기 위해 시냅스 레벨에서의 신경근 접합의 억제를 겨냥한 상이한 미용 제품들이 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 EP 1180524 B1호 및 국제 특허 출원 공개 WO9734620호는 단백질 SNAP-25로부터 유래된 펩타이드의 용도를 기재하는데, 이는 SNARE 복합체의 형성에서 SNAP-25와 시냅스 전에(presynaptically) 경쟁하면서 작용하여, ACh의 방출의 감소를 야기하고 신경근 접합부에서의 신경 전달을 억제한다.
유럽 특허 공개 EP 1809652 A2호는 와글레린-1과 유사한 작용의 기전으로 시냅스 후에(post-synaptically) 작용하여 신경 전달을 차단하고 주름살의 출현을 방지하는 AChR의 길항제 펩타이드를 기재한다. 활성 미용용 펜타펩타이드-3이 또한, 투보쿠라린과 유사한 작용의 기전으로, AChR을 억제함으로써 시냅스 후에 작용하여 신경 전달을 차단하고 주름살의 출현을 방지한다.
IV. 치료 및 미용 조성물
본 명세서에 개시된 치료 및 미용 조성물은 각각 적어도 하나의 치료제 및/또는 적어도 하나의 미용제를 포함할 수 있으며, 담체(일반적으로, 피부학적으로 허용되는 담체)를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 국소 미용 조성물을 제공하며, 본 국소 미용 조성물은 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있고, 일부 태양에서, 그러한 미용 조성물은 적어도 하나의 담체를 포함한다.
또한, 국소 치료 조성물이 제공되며, 본 국소 치료 조성물은 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있고, 일부 태양에서, 그러한 치료 조성물은 적어도 하나의 담체를 포함한다.
따라서, 상기에 개시된 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제에 더하여, 본 명세서에 기재된 치료 또는 미용 조성물은, 예를 들어 담체 및 애쥬번트, 예컨대 물(증류수, 탈이온수, 여과수 또는 달리 준비된 물), 알코올, 비이온성 가용화제, 또는 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 친수성 성분은 물, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 다이메틸 폴리실록산(DMPX), 올레산, 카프릴산, 아이소프로필 알코올, 1-옥탄올, 에탄올(변성 또는 무수), 및 다른 약제학적 등급 또는 절대 알코올을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된 경피 전달 조성물의 일부 제형에는 담체, 예컨대 알코올, 물, 및 다른 수성 애쥬번트가 존재하지 않는다. 다른 재료가 또한 본 발명의 경피 전달 조성물의 성분일 수 있는데, 이에는 방향제, 크림, 연고, 착색제, 및 다른 화합물이 포함되며, 단 첨가된 성분은 봉입체 형태의 치료 또는 미용 전달제의 경피 전달에 유해하게 영향을 주지 않는 한에 있어서이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 작용제(예를 들어, 치료제 및/또는 미용제)와 함께 대상체에게 투여되어, 작용제의 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 향상시켜, 작용제의 생리학적 활성의 감소를 방지하는 분자(예를 들어, 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클), 또는 이들의 조합을 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 용어 "피부학적으로 허용되는 담체"는 본 명세서에 개시된 치료 및/또는 미용 조성물에 사용하기에 적합하고 인간 피부 조직과 접촉하여 사용하기에 안전해야 하는 담체를 지칭한다. 적합한 담체는 물 및/또는 수혼화성 용매를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제의 경피 전달을 위한 치료 및 미용 조성물은 중량 기준으로 약 1% 내지 약 95%의 물 및/또는 수혼화성 용매를 포함할 수 있다. 본 조성물은 약 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%. 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 내지 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%의 물 및/또는 수혼화성 용매를 포함할 수 있다. 적합한 수혼화성 용매는 1가 알코올, 2가 알코올, 다가 알코올, 글리세롤, 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물이 에멀젼 형태일 때, 물 및/또는 수혼화성 용매는 수성상(aqueous phase)과 전형적으로 관련된 담체이다.
적합한 담체는 또한 오일을 포함한다. 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 중량 기준으로 약 1% 내지 약 95%의 하나 이상의 오일을 포함할 수 있다. 본 조성물은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 내지 약 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 3%의 하나 이상의 오일을 포함할 수 있다. 오일은 물 또는 수용성 용매에 적합하지 않은 재료를 가용화, 분산, 또는 운반하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 오일은 실리콘, 탄화수소, 에스테르, 아미드, 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 오일은 휘발성 또는 비휘발성일 수 있다.
적합한 실리콘 오일은 폴리실록산을 포함한다. 구매가능한 폴리실록산은 폴리다이메틸실록산 - 이는 다이메티콘으로도 알려짐 - 을 포함하며, 이의 예에는 Shin-Etsu로부터의 DM-Fluid 시리즈, Momentive Performance Materials Inc.에 의해 판매되는 Vicasif 시리즈, 및 Dow Corning Corporation에 의해 판매되는 Dow Corning® 200 시리즈가 포함된다. 적합한 폴리다이메틸실록산의 구체적인 예에는 점도가 0.65, 1.5, 50, 100, 350, 10.000, 12,500 100,000, 및 300,000 센티스토크인 Dow Corning* 200 플루이드(Xiameter" PMX-200 실리콘 플루이드(Silicone Fluid)로도 판매됨)가 포함된다.
적합한 탄화수소 오일은 직쇄, 분지형, 또는 환형 알칸 및 알켄을 포함한다. 사슬 길이는 휘발성과 같은 원하는 기능적 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 적합한 휘발성 탄화수소는 5 내지 20개의 탄소 원자, 또는 대안적으로 8 내지 16개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 다른 적합한 오일은 에스테르를 포함한다. 적합한 에스테르는 전형적으로 적어도 10개의 탄소 원자를 함유한다. 이러한 에스테르는 지방산 또는 알코올로부터 유래된 하이드로카르빌 사슬을 갖는 에스테르(예를 들어, 모노-에스테르, 다가 알코올 에스테르, 및 다이- 및 트라이-카르복실산 에스테르)를 포함한다. 본 발명에서의 에스테르의 하이드로카르빌 라디칼은 거기에 공유 결합된 다른 양립가능한 작용기, 예컨대 아미드 및 알콕시 모이어티(예를 들어, 에톡시 또는 에테르 결합 등)를 포함하거나 가질 수 있다.
다른 적합한 오일은 아미드를 포함한다. 아미드는 25℃에서 액체이고 물 중에서 불용성이면서 아미드 작용기를 갖는 화합물을 포함한다. 적합한 아미드는 N-아세틸-N-부틸아미노프로피오네이트, 아이소프로필 N-라우로일사르코시네이트 및 Ν,Ν,-다이에틸톨루아미드를 포함한다. 다른 적합한 아미드가 미국 특허 제6,872,401호에 개시되어 있다. 다른 적합한 오일은 에테르를 포함한다. 적합한 에테르는 다가 알코올의 포화 및 불포화 지방 에테르, 및 그의 알콕실화 유도체를 포함한다. 예시적인 에테르는 폴리프로필렌 글리콜의 C4-20 알킬 에테르, 및 다이-Cs-3o 알킬 에테르를 포함한다. 이들 재료의 적합한 예에는 PPG-14 부틸 에테르, PPG-15 스테아릴 에테르, 다이옥틸 에테르, 도데실 옥틸 에테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 유화제를 포함할 수 있다. 유화제는, 본 조성물이 에멀젼의 형태인 경우에 또는 불혼화성 재료가 배합되어 있는 경우에 특히 적합하다. 국소 치료 및/또는 미용 조성물은 약 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 또는 1% 내지 약 20%, 10%, 5%, 3%, 2%, 또는 1%의 유화제를 포함할 수 있다. 유화제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 유화제의 비제한적인 예가 미국 특허 제3,755,560호, 미국 특허 제4,421,769호, 및 문헌[McCutcheon's, Emulsifiers and Detergents, 2010 Annual Ed., published by M. C. Publishing Co.]에 개시되어 있다.
다른 적합한 유화제가 문헌[Personal Care Product Council's International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, Thirteenth Edition, 2006, under the functional category of "Surfactants - Emulsifying Agents"]에 추가로 기재되어 있다. 선형 또는 분지형 실리콘 유화제가 또한 사용될 수 있다. 특히 유용한 폴리에테르 개질된 실리콘은 Shin Etsu로부터의 KF-6011, KF-6012, KF-6013, KF-6015, KF-6015, KF-6017, KF-6043. KF-6028, 및 F-6038을 포함한다. Shin Etsu로부터의 KF-6100, KF-6104, 및 KF-6105를 비롯한 폴리글리세롤화 선형 또는 분지형 실록산 유화제가 또한 특히 유용하다.
유화제는 또한 유화성 실리콘 탄성중합체를 포함한다. 적합한 실리콘 탄성중합체는 분말 형태일 수 있거나, 휘발성 또는 비휘발성 실리콘과 같은 용매, 또는 파라핀계 탄화수소 또는 에스테르와 같은 실리콘 상용성 비히클 중에 분산 또는 가용화될 수 있다. 적합한 유화성 실리콘 탄성중합체는 적어도 하나의 폴리알킬 에테르 또는 폴리글리세롤화된 단위를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물의 점도를 증가시키거나, 상기 조성물을 농후하게 하거나, 고화하거나, 상기 조성물에 고체 또는 결정질 구조를 제공하기 위해 구조화제(structuring agent)가 사용될 수 있다. 구조화제는 전형적으로 용해성, 분산성, 또는 상 상용성(phase compatibility)에 기초하여 분류된다. 수성 또는 물 구조화제의 예에는 중합체 작용제, 천연 또는 합성 검, 다당류 등이 포함된다. 일 태양에서, 국소 치료 및/또는 미용 조성물은 조성물의 중량 기준으로 약 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 5% 내지 약 25%, 20%, 10%), 7%, 5%, 4%, 또는 2%의 하나 이상의 구조화제를 포함할 수 있다.
다당류 및 검이 적합한 수성상 증점제일 수 있다. 중합체 구조화제의 적합한 부류에는 카르복실산 중합체, 폴리아크릴아미드 중합체, 설폰화 중합체, 고분자량 폴리알킬글리콜 또는 폴리글리세린, 이들의 공중합체, 이들의 소수성으로 개질된 유도체, 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 실리콘 검이 다른 오일상(oil phase) 구조화제이다. 다른 유형의 오일상 구조화제는 실리콘 왁스를 포함한다. 실리콘 왁스는 알킬 실리콘 왁스로 지칭될 수 있고, 이는 실온에서 반고체 또는 고체이다. 다른 오일상 구조화제는 하나 이상의 천연 또는 합성 왁스, 예컨대 동물성, 식물성, 또는 광물성 왁스일 수 있다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 겔화제를 포함할 수 있다. 용어 "겔화제"는 액체 용액, 에멀젼, 및 현탁액을 증점화하고 안정화하는 데 사용되는 재료를 지칭한다. 이는 내부 구조를 형성하는 콜로이드 혼합물로서 액체상 중에 용해되어, 생성된 겔에 고체 물질의 외관을 제공하며, 그러면서 액체로 주로 구성된다. 겔화제는 증점제와 매우 유사하다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있다. "계면활성제" 또는 "표면-활성제"는 물 또는 수용액 중에 용해될 때 표면 장력을 감소시키는 유기 화합물을 지칭한다. 에멀젼에서, 계면활성제는 친수성 부분 및 친유성 부분을 함유할 것이며, 이에 의해 계면활성제는 불혼화성 상들 사이의 표면의 표면 장력을 감소시키도록 기능한다. 기능상, 계면활성제는 유화제, 습윤제, 클렌징제, 거품 촉진제(foam booster), 및 가용화제를 포함한다.
계면활성제는 중간 분자량 내지 고분자량(예컨대, 약 100 내지 300,000 달톤)의 임의의 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성(예를 들어, 베타인(예를 들어, 코카미도프로필 베타인), 세제 및 아미노산을 포함하지만 이로 한정되지 않음) 화합물로서, 이에 대하여 그 분자의 상당한 부분은 친수성이고 상당한 부분은 친유성이다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 조성물 및 국소 조성물을 제조하는 본 기술분야에서 알려진 것과 같은 종래의 방법으로 일반적으로 제조될 수 있다. 그러한 방법은 전형적으로, 가열, 냉각, 진공 적용 등을 행하거나 행하지 않고서, 하나 이상의 단계에서 성분들을 비교적 균일한 상태로 혼합하는 것을 포함한다. 전형적으로, 에멀젼은 먼저 수성상 재료들을 지방상(fatty phase) 재료들과 별개로 혼합하고, 이어서 적절한 경우 2개의 상을 배합하여 원하는 연속상(continuous phase)을 생성함으로써 제조된다.
본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 바람직하게는 활성 물질의 안정성(물리적 안정성, 화학적 안정성, 광안정성 등) 및/또는 전달을 최적화하도록 제조된다. 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은 치료 기간 동안 본 조성물의 충분한 양을 저장하는 크기로 된 패키지 내에 제공될 수 있다.
일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물은, 예를 들어 용액, 겔, 크림, 로션, 연고, 에멀젼, 현탁액, 페이스트, 에어로졸, 에어로졸 폼, 에어로졸 분말, 로션, 도찰제, 연고, 팅크제, 고약, 습포제, 스프레이, 건조 분말, 또는 이들의 조합으로 제조 및/또는 투여될 수 있다.
용어 "용액"은 용질(예를 들어, 치료제 또는 미용제)이 액체 용매 중에 용해된, 화학 평형에 있는 시스템을 지칭한다.
용어 "겔" 또는 "젤리"는 안정-상태(steady-state)에 있을 때 유동을 나타내지 않는 실질적으로 묽은 가교결합된 시스템으로 구성된 고체의 젤리-유사 물질을 지칭한다. 중량 기준으로, 겔은 주로 액체이지만, 여전히 이것은 액체 내에서 3차원 가교결합된 네트워크로 인해 고체처럼 거동한다.
용어 "크림"은 직장 또는 질의 피부 또는 점막과 같은 피부 또는 점막에 적용하기 위한 국소 제제를 지칭한다. 크림은 오일과 물의 혼합물인 반고체 에멀젼이다. 이는 2가지 유형으로 세분된다: 연속 수성상 중에 분산된 오일의 소적으로 구성된 수중유(OAV) 크림, 및 연속 오일상 중에 분산된 물의 소적으로 구성된 유중수(W/O) 크림.
용어 "에멀젼"은 둘 이상의 불혼화성(블렌딩 불가능한) 액체들의 혼합물을 지칭한다. 하나의 액체(분산상)가 다른 하나의 액체(연속상) 중에 분산된다. 에멀젼은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다.
용어 "현탁액"은 미세 입자들이 유체 중에 현탁되고 이들이 부력에 의해 지탱되는 혼합물; 이뿐만 아니라, 미세 입자들이 유체보다 더 조밀하고 부력에 의해 지탱되지 않는 혼합물도 지칭한다.
용어 "페이스트"는 지방 베이스, 물, 및 적어도, 분말이 내부에 현탁된 고체 물질로 이루어진 형태를 지칭한다.
용어 "에어로졸"은 가스 중의 미세 고체 입자들 또는 액적들의 현탁액을 지칭한다.
용어 "에어로졸 폼"은 액체 또는 고체 중에 많은 가스 버블을 포획함으로써 형성되는 물질을 지칭한다.
용어 "에어로졸 분말"은 고체 입자의 에어로졸 미스트를 생성하는 일종의 분배 시스템을 지칭한다.
용어 "도찰제"는 피부에 대한 적용을 위한 약물첨가된 국소 제제를 지칭한다. 이러한 유형의 제제는 또한 밤(balm) 또는 도포제(embrocation)로 불린다. 도찰제는 로션과 유사한 점도를 갖는다. 도찰제는 일반적으로 연고 또는 크림보다 상당히 더 적은 점성을 나타낸다.
용어 "로션"은 저점도 내지 중간 점도 국소 제제를 지칭한다.
용어 "연고"는 다양한 신체 표면, 예컨대 눈(안연고), 질, 항문, 및 코의 피부 및 점막 상에 국소적으로 사용되는 점성의 균질한 반고체 제제를 지칭한다.
용어 "팅크제"는 비휘발성 물질의 알코올성 추출물 또는 용액을 지칭한다. 팅크제이기 위해서, 알코올성 추출물은 에탄올 백분율이 적어도 40 내지 60%여야 한다.
용어 "고약"은 머리 또는 다른 신체 표면을 진정시키는 데 사용되는 의약 연고를 지칭한다.
용어 "습포제"는 아프거나, 염증이 생겼거나, 통증이 있는 신체 부분을 치료하기 위해 피부 위로 클로스(cloth) 상에 펴발라진, 종종 가열되고 약물첨가된, 연질 습성 연약(soft moist mass)을 지칭한다.
용어 "스프레이"는 액적 및 혼입된 주위 가스의 집합을 지칭한다.
일부 구체적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 미용 또는 치료 조성물은 봉입체 내의 미용제 및/또는 치료제가 IL-10, KGF, EGF, VEGF, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 봉입체를 포함한다.
V. 경피 전달 시스템 및 기구
본 발명은 또한 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템을 제공한다. 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템이 또한 제공된다. 경피 전달 시스템은, 예를 들어 패치, 정량식 스프레이(spray metered), 스프레이 현탁액, 면봉, 스펀지, 스틱, 샴푸 현탁액, 정량식 에어로졸(aerosol metered), 또는 에어로졸 스프레이일 수 있다.
용어 "패치", "경피 패치", 또는 "피부 패치"는 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 또는 미용 조성물의 특정 용량을 피부에 또는 피부를 통해 전달하기 위해 피부 상에 배치되는 접착 패치를 지칭한다. 패치는 연장된 기간에 걸쳐 대상체에게 치료 또는 미용 조성물의 제어된 방출을 제공할 수 있다.
용어 "정량식 스프레이"는 액적 및 혼입된 주위 가스의 쇼트 버스트(short burst)를 공급함으로써 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 또는 미용 조성물의 특정량을 전달하는 것을 돕는 장치를 지칭한다.
용어 "스프레이 현탁액"은 주위 가스 내에 혼입된 매우 작은 액적 중의 활성제의 현탁액으로서 표면(예컨대, 피부) 상에 분무될 수 있도록 한 액체 중의 활성제(예를 들어, 미용제 또는 치료제)의 현탁액을 지칭한다.
용어 "면봉"은 거즈 또는 면과 같은 작은 재료 조각을 지칭하는 것으로, 이는 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 또는 미용 조성물을 적용하는 데 사용된다.
용어 "스펀지"는 목욕, 청소, 및 다른 목적에 사용되는 것과 흡수성이 유사한, 흡수 물질, 다공성 플라스틱, 고무, 셀룰로스, 또는 다른 재료를 지칭한다.
용어 "스틱" 및 "립스틱"은 차단 표면을 제공하고 수분을 가두는 밀랍 또는 석유 젤리로부터 통상 제조되는 "스틱-형상" 재료를 지칭한다. 차단 재료는 수분 손실을 방지하고 입술의 편안함을 유지하며, 그러면서 향미제, 착색제, 선스크린 및 다양한 작용제가 추가의 특정 이득을 제공할 수 있다.
용어 "샴푸"는 모발 및 두피를 세척하는 데 사용되는 비누 또는 세제의 다양한 액체 또는 크림 제제 중 임의의 것을 지칭한다. 용해 또는 분산된 활성제, 예를 들어 치료제 또는 미용제를 함유하는 샴푸가 상기 작용제의 경피 전달에 사용될 수 있다.
용어 "샴푸 현탁액"은 세척 동안 활성제(예를 들어, 미용제 또는 치료제)의 경피 전달을 위한 샴푸 중에 현탁된 상기 작용제를 함유하는 샴푸를 지칭한다.
용어 "정량식 에어로졸"은 에어로졸화된 의약의 쇼트 버스트를 공급함으로써 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물의 특정량을 전달하는 것을 돕는 장치를 지칭한다.
용어 "에어로졸 스프레이"는 액체 입자의 에어로졸 미스트를 생성하는 일종의 분배 시스템을 지칭한다.
본 발명은 또한 어플리케이터에 결합된 용기 및 경피 전달 시스템을 포함하는 장치 또는 기구를 제공한다. 따라서, 일부 태양에서, 경피 전달 조성물(예를 들어, 본 명세서에 개시된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)은 적용을 촉진시키는 장치 내로 포함된다.
장치는 일반적으로 어플리케이터에 결합된 용기를 포함하며, 여기서 본 발명의 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)은 용기 내에 포함된다. 예를 들어, 일부 장치는 혼합물의 기화를 조장함으로써 전달을 촉진시킨다. 이들 기구는 분무기(예를 들어, 펌프-구동 분무기)와 같은 어플리케이터에 결합된 용기 내에 포함된 본 발명의 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)을 갖는다. 이들 태양은 또한 포함된 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)을 용기 밖으로 배출시키기 위한 추진제를 포함할 수 있다. 더 집중된 적용이 가능하도록 다른 기구가 설계될 수 있다. 본 발명의 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)의 집중된 적용을 촉진시키는 장치는 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)을 담는 용기에 결합된 롤-온(roll-on) 또는 면봉-유사 어플리케이터를 가질 수 있다.
일부 구체적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 경피 전달 시스템은 미용 또는 치료 조성물을 포함하는 봉입체를 포함하며, 봉입체 내의 미용제 및/또는 치료제는 IL-10, KGF, EGF, VEGF, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진다.
VI. 질병 및 질환 그리고 치료 방법
본 출원에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구는 피부 장애를 치료하기 위하여 치료 응용(예방 응용을 포함함), 및 미용 응용에 사용될 수 있다. 게다가, 일부 태양에서, 본 출원에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구는 피부 질병 이외의 질병을 치료하기 위해 치료적으로(예방적으로를 포함함) 사용될 수 있다. 일부 태양에서, 본 출원에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구는 피부 표면으로부터 멀리 있는 위치에 혈류를 통해 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
용어 "피부 질환," "피부 장애" 및 "피부 질병"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 봉입체 형태의 미용제 또는 치료제의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 생리학적 상태(예를 들어, 병리학적 상태)를 지칭하는 것으로 본 명세서에 사용된다. 이 용어는, 예를 들어, 감염, 염증, 일광 손상, 또는 자연 노화와 관련되거나 그에 의해 야기된 피부 질환, 장애, 또는 질병을 포함한다. 본 출원에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구를 사용하여 치료될 수 있는 피부 질환 및 장애의 상세한 예가 하기에 제공되어 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위하여" 또는 "경감시키는" 또는 "경감시키기 위하여"와 같은 용어는 (1) 질환 또는 장애, 예를 들어 피부 질환 또는 장애의 증상들을 치유, 감속, 완화시키고/시키거나 그의 진행을 중단시키는 조치 및 (2) 표적이 되는 질환 또는 장애, 예를 들어 피부 질환 또는 장애의 발생을 예방 및/또는 감속시키는 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 자는 질환 또는 장애를 이미 가진 자; 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 자; 및 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 자를 포함한다.
소정 태양에서, 대상체가, 예를 들어 질환 또는 장애, 예를 들어 피부 질환 또는 장애의 전체적, 부분적, 또는 일시적 개선을 나타낸다면, 대상체는 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료된다". 예를 들어, '치료' 또는 '치료하는'은 크기 및 두께 그리고 과각질화의 감소; 감소된 통증; 감소된 가려움; 실제의 치료 영역은 아니지만 그에 인접한 곳의 감소된 염증(국소 적용의 구역으로부터 먼 곳에서의 발적 및 종창); 병변의 개수의 감소; 새로운 병변의 발생의 감소, 치료된 영역 밖에 있는 병변의 해소("필드 효과"), 및 관해 속도의 감소 - 이는, 예를 들어 증가된 면역 감시에 기인함 - 를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
예를 들어, 봉입체 형태의 치료제 또는 미용제에 의한 국소 치료 후에의, 질환, 예를 들어 피부 질환 또는 장애의 개선을 지칭하기 위해 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "개선하다"는 피부 질환 또는 장애의 상태를 측정하거나 정량하는 파라미터(예를 들어, 피부 노화에서의 주름살의 존재 또는 부재 및/또는 깊이 또는 길이)의 임의의 통계학적으로 유의한 개선을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 그러한 파라미터의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 개선을 포함한다. '개선하다'라는 용어는 또한 치료되지 않은 질환 또는 장애와 대비하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 또는 적어도 약 180배 또는 그 이상의 개선을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다" 및 "예방하는"은 질병 또는 장애, 예를 들어 피부 질환 또는 장애의 재발, 확산, 또는 개시의 예방을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구는 완전한 예방으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 일부 태양에서, 예를 들어 피부 질환 또는 장애로서의 질병 또는 장애의 개시가 지연되거나, 또는 그의 중증도가 감소된다.
많은 태양은 (예를 들어, 통증 또는 피부 장애를 피하기 위한) 예방적 조치로서 또는 피부 장애로 이미 괴로워하거나 통증으로 고생하고 있는 대상체를 치료하기 위한 치료적 조치로서 대상체를 치료하기에 적합하다. 일반적으로, 약제품 또는 화장품 내로 포함될 수 있는 대부분의 약물, 화학물질, 및 미용제가 본 발명의 경피 전달 조성물로 제형화될 수 있다.
하기의 본 발명의 태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 당업자는 본 명세서에 개시된 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)의 광범위한 응용성 및 다른 전달제(예를 들어, 다른 치료제 및/또는 미용제)의 경피 전달 조성물 내로의 포함이 간단하다는 것을 용이하게 이해할 수 있다.
일부 태양에서, 용어 피부 장애는 대상체의 피부 건강에 영향을 주는 질병 또는 질환을 지칭한다. 일부 태양에서, 용어 피부 장애는 또한 점막에 영향을 주는 질병 또는 장애를 포함한다. 일부 태양에서, 피부 장애는, 예를 들어 여드름(심상성 여드름, 낭포성 여드름 등을 포함함), 욕창, 발진, 건조 피부, 박피, 피부염, 일광화상, 흉터, 과각화증, 육아종, 피부 궤양, 무좀, 아구창, 옹종, 칸디다증, 세균성 질염, 질증, 연조직염, 단순 포진, 건성 비강진, 피부염(아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 유아 지방관(cradle cap), 화폐상 피부염, 입주위 피부염, 및 포진성 피부염을 포함하지만 이로 한정되지 않음), 습진, 홍색음선, 단독, 다형 홍반, 부스럼, 농가진, 감염(세균성, 바이러스성, 및 진균성 감염을 포함하지만 이로 한정되지 않음), 소수포성 대수 포진, 셀룰라이트, 피부 노화, 피부 주름살, 과다색소침착, 각화증, 피부 흠, 건성 비강진, 사마귀, 광손상 피부, 만성 피부증, 피부염, 건조감, 비늘증 등이다.
예를 들어, 일 실시 형태에서, 염증, 통증, 또는 인간 질병, 예컨대 암, 관절염, 및 알츠하이머병의 치료 또는 예방의 방법은 본 명세서에 기재된 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물)을 사용하는 단계를 포함한다. 한 가지 접근에 의하면, 통증 또는 염증을 감소시키는 데 효과적인 전달제(예를 들어, 봉입체 형태의 치료제)를 포함하는 경피 전달 조성물이 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 통증 또는 염증의 감소가 모니터링된다. 본 명세서에 기재된 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물)은 바람직하게는 염증의 영역 또는 통증 또는 특정 질환과 관련된 영역에서 피부에 적용되고, 염증 또는 통증을 감소시키거나 질병의 진행을 억제하기에 충분한 시간 동안 치료가 계속된다.
다른 방법에서, 주름살을 감소시키고 피부 팽팽함 및 유연성을 증가시키기 위한("피부 톤을 회복하는"으로 총체적으로 지칭됨) 접근이 제공된다. 따라서, 경피 전달 조성물(예를 들어, 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제 및/또는 미용제를 포함하는 치료 조성물 또는 미용 조성물)이 제공되고 치료를 필요로 하는 대상체의 피부와 접촉된다.
추가적으로, 주름살을 감소시키고, 검버섯을 제거하고, 피부 팽팽함 및 유연성을 증가시키는 방법이 제공된다. 이러한 접근에 의하면, 본 명세서에 개시된 봉입체 형태의 치료제 및/또는 미용제를 포함하는 경피 전달 조성물이 필요로 하는 대상체에게 제공되며, 대상체는 경피 전달 조성물과 접촉되고, 원하는 피부 톤을 회복하기에(예를 들어, 주름살 또는 검버섯을 감소시키거나, 또는 피부 미백, 팽팽함 및 유연성을 회복하기에) 충분한 시간 동안 치료가 계속된다.
본 출원에 개시된 방법, 조성물, 전달 시스템, 및 기구를 사용하여 치료될 수 있는 일부 피부 질환 및 장애의 구체적인 정의가 하기에 제공되어 있다.
용어 "옹종"은 종기(boil)보다 더 큰 농양을 지칭하는 것으로, 통상 피부 상으로 농(pus)을 배출하는 하나 이상의 구멍을 갖는다. 이는 통상 세균성 감염, 가장 일반적으로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 야기된다. 용어 "연조직염"은 피부의 진피 층 및 피하 층의 심각한 염증을 갖는 결합 조직의 미만성 감염을 지칭한다. 연조직염은 피부에 침입하는 세균의 유형에 의해, 통상 피부에서의 상처구멍(cut), 박리 또는 파손에 의해 야기된다. A군 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 스타필로코쿠스는 이들 세균 중 가장 일반적이다. 용어 "피부염"은 피부의 임의의 염증(예를 들어, 발진 등)을 지칭한다. 용어 "백선증"은 기생 진균(피부사상균)에 의해 야기되는 피부의 진균증 감염의 일군을 지칭한다.
용어 "농창"은 농가진의 변형을 지칭하는 것으로, 조직의 더 깊은 수준에서 제시된다. 이는 통상 스타필로코쿠스와 관련된다. 용어 "습진성 피부염", 또는 일반적으로 불리는 이른바 "습진"은 피부의 상부 층에 영향을 주는 알러지성 질환의 유형이다. 이 질환은 발적, 가려움, 건조감 및 피부 부종을 갖는 지속적이고 재발되는 피부 발진을 특징으로 한다. 용어 "단독"은 진피의 급성 스트렙토코쿠스 세균성 감염을 지칭하는 것으로, 염증을 초래하고 특징적으로는 아래에 놓인 지방 조직 내로 확대된다.
용어 "다형 홍반"은 알려지지 않은 병인의 피부 질환을 지칭하는 것으로, 이는 가능하게는, 선행 감염(antecedent infection) 또는 약물 노출 후에 통상 일어나는, 피부 및 구강 점막의 표층 미소혈관계에서의 면역 복합체의 침적에 의해 매개될 것이다. 경미한 형태는, 대칭으로 배열되고 사지 상에서 시작되는, 경미하게 가렵고 분홍색을 띤 적색 얼룩(mildly itchy, pink-red blotch)으로 통상 제시된다. 이는 종종 고전적인 "표적 병변(target lesion)" 외관을 띠는데, 옅은 중심부 둘레에 분홍색을 띤 적색 고리를 갖는다. 용어 "홍색음선"은 분홍색 반점(pink patch)을 초래할 수 있고, 이러한 분홍색 반점은 갈색 비늘(brown scale)로 변할 수 있는 피부 질병을 지칭한다. 이는 세균 코리네박테리움 미누티시뭄(Corynebacterium minutissimum)에 의해 야기된다. 용어 "홍색피부증"("박탈성 피부염", "박탈피부염" 및 "레드 맨 증후군(Red man syndrome)"으로도 알려짐)은 거의 전체 피부 표면에 영향을 주는 홍반 및 낙설(scaling)을 갖는 염증성 피부 질병을 지칭한다.
용어 "모낭염"은 하나 이상의 모낭의 염증을 지칭한다. 이 질환은 피부 상의 어디에서든 일어날 수 있다. 용어 "부스럼"(또는 "종기")은 모낭의 감염에 의해 야기된 피부 질병을 지칭하는 것으로, 농 및 죽은 조직의 국재화된 축적으로 이어진다. 용어 "농가진"은 표층 세균성 피부 감염을 지칭한다. 이는 주로 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해, 그리고 때로는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)에 의해 야기된다.
신생아 천포창(Pemphigus neonatorum) 또는 리터병(Ritter's disease)으로도 알려진 용어 "포도상구균성 열상 피부 증후군(staphylococcal scalded skin syndrome)"은 스타필로코쿠스 아우레우스에 의해 야기되는 피부과적 질환을 지칭한다. 용어 "질편모충증"은 질염의 일반적인 원인이 되는 감염을 지칭한다. 이는 단세포 원생 기생충 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)에 의해 야기된다. 용어 "질증"(예를 들어, 세균성 질증)은 질 감염(질염)을 지칭한다. 이는 천연 발생 세균총의 불균형 또는 효모(칸디다증) 또는 트리코모나스 바기날리스(질편모충증)의 존재에 의해 야기된다. 용어 "소수포성 대수 포진"은 세균, 바이러스, 전신 질환, 또는 일광 또는 열 노출에 의해 야기되는 수포성 질병을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피부 노화"는 유전자의 발현 또는 억제, 환경적 인자(예를 들어, 일광 노출, UVA 및/또는 UVB 노출, 흡연), 내인성 인자(예를 들어, 내인성 자유 라디칼 생성 또는 세포성 노화) 또는 잔주름 및/또는 주름살, 건조 피부, 염증이 발생된 피부, 거친 피부, 누르스름한 피부(sallow skin), 모세혈관확장증, 처진 피부, 확대된 모공, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 생성하는 전술된 것들 사이의 상호작용으로부터 기인되는 인간 피부 조직 질환을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성 노화 피부 질환"은 피부의 연령 노화(chronological aging)로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래되는 피부 노화 질환을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "광노화 피부 질환"은 일광 및/또는 자외광(예를 들어, UVR, UVA, UVB, 및/또는 UVC)에 대한 노출로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래되는 피부 노화 질환을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피부 암"은 악성 및 전악성 피부 암을 지칭하기 위해 사용된다. 그렇기 때문에, 용어 "피부 암"은 흑색종 및 비흑색종 피부 암, 광선 각화증, 기저 세포 암종, 상피내 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma-in-situ) 또는 보웬병(Bowen's disease), 상피내 흑색종(melanoma in-situ), 및 다른 절제불능 암종을 포함한다. 용어 "피부 암"은 피부의 원발성 및 속발성 암 둘 모두를 지칭한다. 이에 관하여, 이 용어는 원발성 피부 암 또는 피부로 전이되는 다른 암에 의해 야기되는 전이성 병변을 포함한다. 또한, 이 용어는 다음의 비제한적인 예를 포함한다: 피부 T-세포 림프종, 유방외 파제트병(extramammary Paget' s disease), 악성 흑자, 피부 흑색종 전이, 및 피부 리슈만편모충증.
일부 구체적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 질병 및/또는 질환은 IL-10, KGF, EGF, VEGF, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 그로 본질적으로 이루어진 봉입체의 경피 투여에 의해 치료될 수 있다. 일부 구체적인 태양에서, IL-10, KGF, EGF, VEGF, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진 봉입체는 미용 목적으로 경피 투여될 수 있다.
VII. 봉입체 생성 및 정제
봉입체 형태의 치료제 및 미용제가 과도한 실험 없이 당업계에 알려진 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다.
일부 태양에서, 봉입체 형성은 봉입체-유도 폴리펩타이드에 대한 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질의 유전자 융합(또는 화학적 접합)에 의해 촉진될 수 있다. 일부 태양에서, 봉입체-유도 폴리펩타이드는 바이러스성 단백질이다. 특정 태양에서, 바이러스성 단백질은 캡시드 단백질이다. 일부 태양에서, 봉입체-유도 폴리펩타이드는 구제역 바이러스(FMDV)의 VP1 오량체-형성 캡시드 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 IB-유도 단백질이 당업계에 알려져 있다. 따라서, 발현을 위해 선택된 사실상 임의의 치료용 또는 미용용 단백질이 봉입체로서 침적되도록 안내되고, 이후에 본 명세서에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 구체적인 태양에서, 본 명세서에 개시된 봉입체는 IL-10, KGF, EGF, VEGF, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
인간 유전자 작제물의 20 내지 40%만큼이나 많은 비율이 정상 세포 배양 조건 하에서 E. 콜라이(E. coli) 내에서 봉입체로서 발현될 수 있다(문헌[Stevens (2000) Structure Fold. Des. 8:R177-185]). 게다가, IB 형성은 더 높은 유도 온도, pH 제어 없는 상태의 세포 배양법, 오스몰 농도 변화, 유도 모달리티(induction modality), 프로모터의 선택, 세포 밀도, 배양 배지, 또는-일반적으로-시스템의 전체 발현 속도에 영향을 주는 임의의 인자와 같은 다수의 인자들에 의해 촉발될 수 있다.
본 발명의 봉입체는 IB를 생성할 수 있는 적합한 발현 시스템 내에서 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산의 서열을 도입하는 단계 및 상기 IB의 생성에 적합한 조건 하에서 그것을 배양하는 단계를 일반적으로 포함하는 종래의 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세균"은 진정세균 및 고세균을 포함한다. 소정 태양에서, 그람-양성 및 그람-음성 세균을 포함한 진정세균이 본 명세서에 기재된 방법에 사용된다. 일 태양에서, 그람-음성 세균, 예를 들어 장내세균과(Enterobacteriaceae)가 사용된다. 장내세균과에 속하는 세균의 예에는 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 시겔라(Shigella)가 포함된다.
일 태양에서, E. 콜라이가 사용된다. MC4100, DnaK, 및 BL21이 일부 태양에서 사용되는 적합한 E. 콜라이 균주이다. 다른 적합한 E. 콜라이 균주는 E. 콜라이 LG1522(ATCC 번호: BAA-1907™), E. 콜라이AMC 198(ATCC 번호: CRM-11229™), E. 콜라이 크룩스(Crooks)(ATCC 번호: CRM-8739™), DH5α, BL26, HB101, JM107, D21, JM103, AB 1157, 및 일반적으로, 예일대학 CGSC(Yale University Coli Genetic Stock Center) 또는 다른 저장소에서 입수가능한 균주들 중 임의의 것을 포함한다(문헌[Maloy & Hughes (2007) Methods Enzymol. 421:3-8]).
일부 태양에서, 그람-양성 세균, 예를 들어 유산균목(Lactobacillales)이 사용된다. 유산균목에 속하는 세균의 예에는 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 오에노코쿠스(Oenococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 및 스트렙토코쿠스가 포함된다(예를 들어, 문헌[Ljungh & Wadstrom (2009) "Lactobacillus Molecular Biology: From Genomics to Probiotics," Horizon Scientific Press, ISBN 1904455417]; 문헌[Charalampopoulos & Rastall (2009) "Prebiotics and Probiotics Science and Technology," Springer ISBN 0387790578] 참조). 일부 구체적인 태양에서, 세균은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 균주이다. 일부 태양에서, 락토코쿠스 락티스 균주는 프로테아제 결핍이다. 일부 태양에서, 락토코쿠스 락티스균주는 L. 락티스 NZ900 HtraA- ClpP-이다.
이들 예는 제한적이라기보다는 예시적이다. 상기 언급된 세균 중 임의의 것의 돌연변이 세포가 또한 사용될 수 있다. 물론, 세균의 세포 내에서의 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적절한 세균을 선택하는 것이 필요하다. 예를 들어, 잘 알려진 플라스미드, 예컨대 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410 또는 다른 구매가능한 벡터가 레플리콘을 공급하기 위해 사용될 때, E. 콜라이, 세라티아(Serratia), 또는 살모넬라(Salmonella) 종이 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 일부 태양에서, 진균, 예를 들어 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluveromyces marxianus), 및 피키아 페르멘탄스(Pichia fermentans)가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포", "세포주", "균주" 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환가능하게 사용되고, 모든 그러한 지칭들은 자손을 포함한다. 따라서, 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산이 "세포" 또는 "세포주" 내에 도입될 때, 이 용어는 초대 대상 세포(primary subject cell) 및 전달 횟수에 관계없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 의도적인 또는 우발적인 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량이 정확하게 동일할 수 없음이 이해되어야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
미생물 및 세포주 내에의 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 서열의 도입은 종래의 방법에 의해 수행된다. 간략하게 말하면, 숙주 세포 게놈에 대해 자율 복제 및 단백질 발현이 가능한 발현 벡터가 숙주 세포 내로 도입된다. 적절한 발현 벡터의 작제물이 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y.)]; 문헌[Ausubel et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology" (New York: Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)]; 및 문헌[Baneyx (1999) Current Opinion in Biotechnology 10:411-421]을 참조한다.
적절한 원핵 세포 - 세균을 포함함 -, 및 발현 벡터가, 예를 들어 ATCC(American Type Culture Collection, 미국 매사추세츠주 록빌 소재)를 통해 구매가능하다. 원핵 세포, 및 특히 세균 세포 배양물의 대규모 성장을 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 이들 방법이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 일부 태양에서, pTVP1GFP(Apr), pReceiver-MO2, 및 pReceiver-B01 벡터(Genecopoeia, 미국 매사추세츠주 록빌 소재)가 사용될 수 있다.
예를 들어, 원핵 숙주 세포가 관심있는 재조합 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염되고, 경우에 따라 프로모터를 유도하거나, 형질전환체(transformant)를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 변형된 종래의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산은, 관심있는 폴리펩타이드(들)를 인코딩하기만 한다면, 임의의 공급원으로부터의 RNA, cDNA, 또는 게놈 DNA일 수 있다. 미생물 숙주 내에서의 폴리펩타이드 및 단백질(이들의 변이체를 포함함)의 발현에 적절한 핵산을 선택하기 위한 방법이 잘 알려져 있다. 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, Hsp70을 인코딩하는 DNA가, 예를 들어 Hsp70을 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써, 단리되고 서열분석될 수 있다. 유사하게, IL-10, EGF, KGF, VEGF, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 DNA가, 예를 들어 IL-10, EGF, KGF, 또는 VEGF를 인코딩하는 유전자 각각에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브들을 사용함으로써, 단리되고 서열분석될 수 있다.
치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 프로모터의 제어 하에서 미생물 내에서의 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터가 이러한 목적을 위해 이용가능하며, 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입하고자 하는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환시키고자 하는 특정 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각각의 벡터는, 그것이 양립가능한 특정 숙주 세포에 따라 다양한 성분들을 함유한다. 특정 유형의 숙주에 따라, 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 함유하지만 이로 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
일부 구체적인 태양에서, 핵산은 IL-10, EGF, KFG, VEGF(이들의 단편, 변이체, 및 유도체, 예컨대 융합 단백질, 또는 이종 모이어티를 포함하는 작제물을 포함함) 또는 이들의 조합을 인코딩한다. 일부 구체적인 태양에서, 봉입체 내의 치료용 또는 미용용 단백질은 단일 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 다른 태양에서, 봉입체 내의 치료용 또는 미용용 단백질은 다수의 핵산에 의해 인코딩될 수 있다(예를 들어, 단백질은 수 개의 하위단위를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 상이한 핵산에 의해 인코딩될 수 있고, 상이한 핵산 각각은 동일한 벡터 내에 또는 상이한 벡터들 내에 삽입될 수 있다). 일부 태양에서, 본 명세서에 개시된 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화되어 있다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유래된, 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 미생물 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열도 통상 보유한다.
(i) 신호 서열: 치료용 및 미용용 단백질은 직접 재조합으로 생성될 뿐만 아니라 이종 폴리펩타이드를 갖는 융합 폴리펩타이드로서도 재조합으로 생성될 수 있는데, 이때 이종 폴리펩타이드는 전형적으로 성숙 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특정 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 가공되는(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 이종 폴리펩타이드 신호 서열을 인식 및 가공하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 1 pp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열에 의해 치환될 수 있다.
(ii) 복제 기점 성분: 발현 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 그러한 서열은 다양한 미생물에 대해 당업계에 잘 알려져 있다.
(iii) 선택 유전자 성분: 발현 벡터는 일반적으로 선택가능 마커라고도 지칭되는 선택 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 선택적 배양 배지 중에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지 중에서 생존하지 못을 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대해 내성을 부여하거나, (b) 유전자 마커(들)의 존재에 의해 야기된 것들 이외의 영양요구성 결핍을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양소, 예를 들어 간균강(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 인코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선택 계획(selection scheme)의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 이용한다. 이러한 경우에, 관심있는 핵산으로 성공적으로 형질전환된 세포들은 약물 내성을 부여하는 폴리펩타이드를 생성하고, 이에 따라 선택 계획을 생존시킨다. 그러한 우성 선택(dominant selection)의 예는 약물 네오마이신(문헌[Southern & Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341]), 마이코페놀산(문헌[Mulligan & Berg (1980) Science 209:1422-27]) 또는 하이그로마이신(문헌[Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:410-413])을 사용한다. 상기 주어진 3개의 예는 적절한 약물 G418 또는 네오마이신(게네티신), xgpt(마이코페놀산), 또는 하이그로마이신 각각에 내성을 전달하기 위하여 진핵생물 제어 하에서 세균 유전자를 사용한다.
(iv) 프로모터 성분: 관심있는 재조합 치료용 또는 미용용 단백질을 생성하기 위한 발현 벡터는, 숙주 유기체에 의해 인식되고 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 적합한 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(문헌[Chang et al. (1978) Nature 275:617-624]; 문헌[Goeddel et al. (1979) Nature 281:544-48]), 아라비노스 프로모터 시스템(문헌[Guzman et al. (1992) J. Bacteriol. 174: 7716-7728]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(문헌[Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057-74], 및 유럽 특허 EP 36776호) 및 혼성 프로모터, 예컨대 tac 프로모터(문헌[De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25])를 포함한다. 일 태양에서, 재조합 유전자는 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 유도성 trc(trp-lac) 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다(문헌[Egon et al. (1983) Gene 25:167-178]). 그러나, 다른 알려진 세균 프로모터들이 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있으며, 그럼으로써 임의의 필요한 제한 부위를 공급하기 위해 링커 또는 어댑터를 사용하여 숙련된 작업자가 그들을 관심있는 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되게 할 수 있다(문헌[Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269-81]). 또한, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 상기]; 및 문헌[Ausubel et al, 상기]을 참조한다.
세균계에 사용하기 위한 프로모터는 또한 일반적으로 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno)(S.D.) 서열을 함유한다. 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 세균 공급원 DNA로부터 제거되고 원하는 DNA를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다.
(v) 벡터의 작제 및 분석: 상기 열거된 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 연결 기법을 사용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편이 필요한 플라스미드를 생성하는 데 요구되는 형태로 절단되고, 조정되고, 재연결된다. 작제된 플라스미드에서의 올바른 서열을 확인하기 위한 분석을 위하여, 성공적인 형질전환체가 항생제 내성에 의해 선택된다. 형질전환체로부터의 플라스미드가 문헌[Sanger et al. (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467)] 또는 문헌[Messing et al. (Messing et al. (1981) 핵산s Res. 9:309-21)]의 방법에 의해, 또는 문헌[Maxam & Gilbert (Maxam & Gilbert (1980) Methods in Enzymology 65:499-560)]의 방법에 의해 제조되고/되거나, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석되고/되거나, 서열분석된다. 또한, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 상기]; 및 문헌[Ausubel et al, 상기]을 참조한다.
이어서, 관심있는 재조합 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, 이는 전술된 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 적절한 경우에 다양한 프로모터를 유도하도록 변형된 종래의 영양 배지 중에서 배양함으로써 달성된다.
(vi) 숙주 세포의 배양: 상기에 논의된 바와 같이, 적합한 세포가 당업계에 잘 알려져 있다. 봉입체의 형태로 또는 주변세포질 공간 또는 세포내 공간 내에서 재조합 치료용 또는 미용용 단백질을 풍부하게 발현하는 숙주 세포가 전형적으로 사용된다. 치료용 단백질을 생성하기 위해 사용되는 원핵 세포는 당업계에 알려져 있고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지 중에서 성장되는데, 이러한 배지에는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y.) (2001)]에 전반적으로 기재된 배지가 포함된다. 세균에 적합한 배지는 루리아-베르타니(Luria-Bertani)(LB) 브로스(broth), AP5 배지, 영양 브로스, 나이트하르트 최소 배지(Neidhardt's minimal medium), 및 C.R.A.P. 최소 또는 완전 배지 - 이들에는 필요한 영양 보충제가 첨가됨 - 를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 소정 태양에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 가능하게 하기 위하여, 발현 벡터의 작제에 기초하여 선택된 선택제(selection agent)를 함유한다. 예를 들어, 암피실린이 암피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장용 배지에 첨가된다. 탄소, 질소, 및 무기 인산염 공급원 이외의 임의의 필요한 보충제가 또한 단독으로 도입되거나 또는 다른 보충제 또는 배지와의 혼합물, 예컨대 복합 질소 공급원으로서 도입되어 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택적으로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 다이티오에리트리톨, 및 다이티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양될 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이 성장의 경우, 온도는, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 39℃, 또는 약 25℃ 내지 약 37℃의 범위이거나, 또는 약 30℃이다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 유도가 발생되게 하기 위하여, 전형적으로 세포는 고 세포 밀도 과정을 사용하여, 예를 들어 약 200의 A550의 소정의 광학 밀도가 달성될 때까지 배양될 수 있는데, 이 지점에서 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 유도하도록 (예를 들어, 유도인자(inducer)의 첨가, 배지 성분의 고갈 등에 의해) 점 유도(point induction)가 개시된다.
임의의 필요한 보충제가 또한, 단독으로 도입되거나 또는 다른 보충제 또는 배지와의 혼합물, 예컨대 복합 질소 공급원으로서 도입되어, 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배지의 pH는, 주로 숙주 유기체에 따라, 약 5 내지 9의 임의의 pH일 수 있다. E. 콜라이의 경우, 최적 pH는, 예를 들어 약 6.8 내지 약 7.4, 또는 약 7.0이다.
IB는 다수의 기술 표준 기법들 중 임의의 것에 의해 치료용 또는 미용용 단백질을 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 불용성 재조합 치료용 또는 미용용 단백질은 대부분의 숙주 단백질을 가용화하기에, 그러나 대상인 치료용 또는 미용용 단백질은 실질적으로 불용성인 적합한 이온 강도의 완충액에 세포를 노출시킴으로써, 또는 주변세포질 공간 또는 세포내 공간으로부터 봉입체를 방출시키도록 하기 위해 세포를 파괴하여 그것이, 예를 들어 원심분리에 의해 회수될 수 있게 함으로써 적합한 단리 완충액 중에서 단리된다. 이러한 기법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,511,503호에 기재되어 있다. Kleid et al.은 균질화 및 이에 이어지는 원심분리에 의한 IB의 정제를 개시한다(문헌[Kleid et al. (1984) Soc. Industr. Microbiol. 23:217-235]). 또한, 예를 들어 문헌[Fischer et al. (1993) Biotechnology and Bioengineering 41:3-13]을 참조한다.
미국 특허 제5,410,026호는 IB로부터 단백질을 회수하기 위한 전형적인 방법을 기재하고 있으며, 다음과 같이 요약되어 있다. 원핵 세포는 적합한 완충액 중에 현탁된다. 전형적으로, 완충액은 완충에 적합한 pH 5 내지 9, 또는 약 6 내지 8의 완충제 및 염으로 이루어진다. NaCl을 비롯한 임의의 적합한 염이 완충 용액 중에서 충분한 이온 강도를 유지하기에 유용하다. 전형적으로, 약 0.01 내지 2 M, 또는 0.1 내지 0.2 M의 이온 강도가 사용된다. 세포는, 이 완충액 중에 현탁되어 있는 동안에, 예를 들어 기계적 방법, 예컨대 균질기(만톤-가울린 프레스(Manton-Gaulin press), 마이크로플루이다이저(Microfluidizer), 또는 니로-소아비(Niro-Soavi)), 프렌치 프레스(French press), 비드 밀(bead mill), 또는 초음파 파쇄기(프로브 또는 배스(bath))와 같은 일반적으로 이용되는 기법을 사용하여, 또는 화학적 또는 효소적 방법에 의해 파괴되거나 용해된다.
세포 파괴의 화학적 또는 효소적 방법의 예에는, 라이소자임을 사용하여 세균벽을 용해시키는 것을 수반하는 스페로플라스팅(spheroplasting)(문헌[Neu & Heppel (1964) Biochem. Biophys. Res. Comm. 17:215-19]), 및 고등장성의 용액으로 그리고 저등장성의 냉수 세척으로 생존 세포를 처리하여 폴리펩타이드를 방출시키는 것을 수반하는 삼투압 충격(osmotic shock)이 포함된다(문헌[Neu & Heppel (1965) J. Biol. Chem. 240:3685-3692]). 초음파가 분석 규모 부피의 발효 브로스 중에 함유된 세균의 파괴에 일반적으로 사용된다. 더 큰 규모로, 고압 균질화가 전형적으로 사용된다.
세포가 파괴된 후에, 현탁액은 불용성 단백질의 실질적으로 전부를 펠릿화하기에 충분한 시간 동안 표준 원심분리기 내에서 전형적으로 저속으로, 일반적으로 약 500 내지 25,000×g로 원심분리되며, 예를 들어 일 태양에서 약 15,000×g가 사용된다. 그러한 시간은 원심분리되는 부피뿐만 아니라 원심분리기 설계에 따라 간단히 결정될 수 있다. 전형적으로, 약 10분 내지 0.5시간이 IB를 펠릿화하기에 충분하다. 일 태양에서, 현탁액은 15분 동안 15,000×g로 원심분리된다. 생성된 펠릿은 IB의 실질적으로 전부를 함유한다.
세포 파괴 과정이 완전하지 않다면, 펠릿은 또한 온전한 세포 또는 파손된 세포 단편을 함유할 수 있다. 세포 파괴의 완전성은 소량의 동일한 완충 용액 중에 펠릿을 재현탁시키고 위상차 현미경으로 현탁액을 검사함으로써 검정될 수 있다. 파손된 세포 단편 또는 전세포(whole cell)의 존재는, 그러한 단편 또는 세포 및 다른 오염물을 제거하기 위해 추가의 초음파처리 또는 다른 파괴 수단이 필요하다는 것을 나타낸다. 그러한 추가의 파괴 후에, 필요하다면, 현탁액은 다시 원심분리되고, 펠릿은 회수되고, 재현탁되고, 재검사될 수 있다. 이러한 과정은 시각적 검사에 의해 펠릿화된 물질 내에의 파손된 세포 단편의 부재가 밝혀질 때까지 또는 추가의 처리가 생성된 펠릿의 크기를 감소시키지 못할 때까지 반복될 수 있다.
치료제 또는 미용제를 함유하는 봉입체의 재조합 생성을 위한 전술된 과정은 IB가 세포내 공간에 있든 주변세포질 공간 내에 있든 사용될 수 있다. 일 태양에서, IB를 생성 및 단리하기 위한 본 명세서에 제공된 조건에 의해 VP1의 아미노 말단에 융합된 GFP를 함유하는 IB 및 Hsp70 샤페론을 함유하는 IB가 생성된다. 그러나, 이러한 과정 및 절차는 대체로 미소한 변형을 갖는 재조합 단백질에 적용가능하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 동일한 과정, 방법, 및 조건은 일반적으로 미용적 및/또는 치료적으로 유효한 폴리펩타이드를 포함하는 IB의 생성, 단리, 및 특성화(예를 들어, 생물물리학 및/또는 약리학적)에 적용될 수 있으며, 여기서 폴리펩타이드(들)는 IL-10 및/또는 EGF 및/또는 KGF 및/또는 VEGF 및/또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어진다.
소정 태양에서, 이러한 과정 및 절차는 치료용 또는 미용용 단백질을 함유하는 IB를 제조하거나 또는 그를 산업적 규모로 생성 및 정제하는 데 적용가능하다.
IB 내의 불용성 치료용 또는 미용용 단백질이 IB를 가용화 또는 희석시키고 단백질을 재접힘(refolding)되게 함으로써 생물학적으로 활성인 형태로 회수될 수 있음은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Burgess (2009) Methods in Enzymology 463:259-282]; 문헌[Cabrita & Bottomley (2004) Biotechnology Annual Review 10:31-50] 참조). 이어서, 이들 가용화 및 재접힘된 단백질은 치료 또는 미용 용도를 위해 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 치료용 및 미용용 단백질의 국소 투여의 방법은 관심있는 치료용 또는 미용용 단백질이 IB 형태로 투여되고, IB가 피부를 침투한다는 점에서 당업계에 알려진 방법과 상이하다. 따라서, 가용성이고 생리학적으로 활성인 단백질을 얻기 위한 고가의 시간 소모적인 가용화 및 재접힘 단계가 필요하지 않다.
치료용 또는 미용용 펩타이드의 합성은, 예를 들어 고체상 펩타이드 합성 방법의 변형(문헌[Stewart J. M. and Young J. D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.]; 문헌[Bodanzsky M. and Bodanzsky A. (1984) The practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York]; 문헌[Lloyd-Williams et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC, Boca Raton (Fla., USA)]), 용액 합성, 고체상 합성 및 용액 합성 방법 또는 효소적 방법의 조합(문헌[Kullmann W (1980) J. Biol. Chem. 255, 8234-8238])과 같은 당업계에 알려진 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 이들 펩타이드는 원하는 서열을 생성하려는 목적으로 유전자 조작에 의해 변형되거나 변형되지 않은 세균 균주의 발효에 의해 얻어질 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 예컨대 교재, 학술지 기사, 진뱅크(Genbank) 또는 다른 서열 데이터베이스 등록물, 간행된 출원 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 지시된 것처럼 그와 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1
GFP 봉입체는 모델 표피 샘플 내로 깊이 침투할 수 있다
1. 목적:
본 연구의 목적은 봉입체 샘플이 표피를 침투할 잠재성을 평가하는 것이었다. 대체로 가용성인 단백질로부터의 봉입체를, 단백질을 봉입체-유도 펩타이드에 융합함으로써 생성하였다. 피부 치료제 및 미용제의 개발을 위한 인간 피부의 대리물로서 당업계에 널리 사용되는 재구성된 인간 표피(Reconstituted Human Epidermis)(RHE) 모델 시스템인 Straticell® RHE-EPI/001을 사용하여 봉입체 침투를 평가하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 평가된 생성물 : 3개의 샘플을 평가하였다: (1) M0037 GFP로 지정된, 가용성 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하는 양성 대조군 샘플(50 μl의 Tris 완충액 중 50 ㎍); (2) M0037 CI로 지정된, GFP 세균 봉입체를 포함하는 샘플(펠릿 형태로 50 ㎍); 및 (3) M0037 CTRL로 지정된, 음성 대조군(배양 배지).
2.2 사용된 재료 : 재구성된 인간 표피(RHE/EPI/001) 삽입물; Straticell에 의해 제공된, 성장 배양 배지 및 유지 배양 배지; 인산염 완충 식염수(PBS); 메스, 극저온 바이알 그리퍼(cryogenic vial gripper), 샘플을 조작하기 위한 용기; 아이소펜탄(2-메틸부탄); 드라이 아이스/액체 질소; 최적 절단 온도(Optimum Cutting Temperature)(OCT) 화합물; 크라이오 몰드(cryo mold), 표준 크기; 젤라틴 처리된 샘플 홀더 및 커버 슬립; 형광 현미경법용 봉입제(mounting medium).
2.3 장비 : 세포 배양을 위한 일반적 장비(CO2 인큐베이터, 층류 캐비닛, 현미경, 원심분리기), Leica CM3050S 크라이오스태트(cryostat), Olympus DP70 디지털 이미지 캡처 시스템에 결합된 Olympus BX62 자동 형광 현미경, Leica 입체 형광 현미경.
2.4 방법
2.4.1 재구성된 피부 및 생성물 적용 : RHE/EPI 삽입물을 Straticell®에 의해 제공된 사용설명서에 따라 엄격히 처리하였다. 주위 37℃, 5% CO2 및 습도에서, 37℃에서의 24시간의 안정화 기간 후에, 다음과 같이 샘플 생성물을 적용하였다:
Figure pct00007
M0037 GFP: 50 μL의 Tris 완충액 + 25 μL의 유지 배지 중 50 ㎍의 GFP.
Figure pct00008
M0037 CI: 50 ㎍의 CI + 75 μL의 유지 배지.
Figure pct00009
M0037 CTRL: 75 μl의 유지 배지.
모든 생성물을 적용한 후에, 샘플을 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후에, 샘플을 동결을 위하여 처리하였다.
2.4.2 봉입(mounting) 및 동결
24시간 인큐베이션 기간 후에, 그리고 동결시키기 위한 샘플 처리 전에, 형광 현미경법을 사용하여 샘플을 시각적으로 평가하였다(도 1). 그 시점에서, 순간-동결(snap-freezing) 방법(초고속 동결(ultrafast freezing))을 사용하여 샘플을 처리하여 최대 완전성을 보장하고 샘플 손실의 가능성을 감소시켰다. 수행된 순간-동결 프로토콜이 하기에 상세히 기재되어 있다.
샘플의 제조 및 동결을 위한 순간-동결 절차를 다음과 같이 적용하였다. 액체 질소 또는 드라이 아이스 중에 용기를 부유시킴으로써 아이소펜탄을 냉각시켰다. 비드를 형성하고 그 용액이 농밀하고 탁하게 보였을 때 아이소펜탄은 충분히 차가운 상태인 것으로 여겨졌다. OCT의 얇은 층을 미리 라벨링 및/또는 확인된 크라이오 몰드 위로 놓았다. 인큐베이션 용액을 재구성된 피부 삽입물로부터 빼냈다. 이어서, 메스를 사용하여 삽입물로부터 막을 제거하고, 재구성된 피부 샘플을 4℃에서 PBS가 담긴 페트리 디쉬 상에 놓았다. OCT 배지 내에 도입되기 직전에, 샘플 각각을 한 장의 여과지 상에서 (표피 상에의 어떠한 가능한 종이 침적물도 조심스럽게 피하면서) 가볍게 건조시켰다. 2개의 사본 샘플을 제공하기 위하여 각각의 삽입물을 2개로 나누었다. 재구성된 피부 샘플을 크라이오 몰드 상의 OCT 층 상에 위치시켰는데, 이때 상이한 피부 층들이 몰드의 기저 상에 있도록 그것을 배향시켰다(즉, 표피를 에지들 중 하나를 향해 배향시켰다). 크라이오스태트를 사용하여 최적의 조직학적 절단물을 얻기 위해 크라이오 몰드 상에 올바르게 조직을 위치시키는 것이 중요하였다. 놓아둔 조직 단편을 OCT로 덮었다. 메스 또는 피펫의 선단을 사용하여 조직을 정교하게 위치시키고 기포의 형성을 방지하였다. 한 쌍의 핀셋을 사용하여 예비냉각된 아이소펜탄 중에 크라이오 몰드를 놓았다. 일단 샘플을 동결시키면, 남아 있는 샘플을 처리하면서, 크라이오 몰드를 드라이 아이스 중에 유지하였다. 샘플을 -80℃에서 동결기 내에 저장하였다. 수송을 위하여, 액체 질소 또는 드라이 아이스를 사용하였다.
2.4.3 슬라이스의 제조 및 봉입
일단 샘플을 동결시키면, LEICA CM3050 S 크라이오스태트를 사용하여 20 μm 두께 슬라이스를 얻었다. 슬라이스를 젤라틴 처리된 샘플 홀더 상에 놓았다. 이후에, 형광 검출용 봉입제(Fluoromount)를 사용하여 샘플을 반영구적으로 봉입하였다. 샘플을 광으로부터 멀리 하여 4℃에서 저장하였다.
2.4.4 관찰 및 이미지 캡처
20X 플랜 아포크로매틱 렌즈를 사용하여 이미지 캡처 디지털 시스템(Olympus DP70)에 결합된 자동 현미경(Olympus BX61)을 사용하여 관찰을 수행하였다. 이미지 명칭들을 작성하였으며, 이때 이들 명칭은 캡처 수(상관 수), 배율, 및 일부 경우에는 노출 시간을 표시하였다. 형광 이미지에 더하여, 투과광 이미지를 각각의 샘플에 대해 캡처하여 형광 신호의 위치를 찾아내는 것을 용이하게 하였다.
형광 이미지의 캡처를 자동 모드를 사용하는 것 대신에 수동 모드로 수행하였으며, 이때 노출 시간은 3 내지 4초로 조정하였다. 이로써, 샘플들 사이의 형광 세기가 비교가능하였다. 가용성 GFP 또는 대조군 샘플 이미지들 중 일부에서, 그리고 항상 그것을 이미지의 명칭 내에 표시하면서, 노출을 최대 30초로 증가시켰다.
3. 장기간 샘플 저장
실험을 결론내린 후에, 샘플을 -80℃에서 장기간 저장하였다(최대 2년).
4. 결과
4.1. 3개의 샘플에 대한 형광 비교
도 2에서의 패널 A, B, 및 C는 3개의 샘플, 즉 대조군(CTRL), 가용성 GFP(GFP), 및 GFP 봉입체(CI)의 상대 형광 세기를 보여준다. 배율은 각각의 경우에 20X였다. 노출 시간은 대조군 및 가용성 GFP 샘플의 경우에는 4초이고, 봉입체 샘플의 경우에는 2.5초였다. 노출 시간은 샘플 각각에 대해 동일하였기 때문에, 이미지에서 보여준 형광 세기의 차이는 실제 세기의 차이에 상응한다. 도 2에서의 패널 D, E, 및 F는 패널 A, B, 및 C에서의 샘플에 상응하는 투과 현미경 이미지를 각각 나타낸다. 투과 이미지 각각은 인공 표피 모델을 성장시키기 위해 사용된 막(문자 "m"으로 표기됨)의 위치 및 각질층, 즉 표피의 최외층("SC"로 표시됨)의 위치를 나타내었다.
4.2. M0037-CI 샘플(봉입체)
도 3 및 도 4는 M0037-CI 샘플, 즉 봉입체 형태의 GFP로부터 얻어진 형광 이미지의 몇몇 예를 제공한다. 대부분의 관찰에서, 형광은 각질층(SC) 내에 또는 표피의 외부 층 내에 위치된 형광 응집체 내에서 위치가 확인되었다. 추가의 염색 또는 표지화를 수행하지 않았기 때문에, 봉입체가 각질층 내에 위치되었는지 또는 이것이 표피 내에 더 깊이 침투하였는지를 결정하기가 어려웠다. 이러한 침투 수준은 염료(H&E, Col7 등) 및 공초점 현미경법을 통한 관찰의 조합을 사용하여 결정될 것이다. 몇몇 M0037-CI 샘플에서는, 일부 SC 단편이 떼어져 나가기 시작하였다(예를 들어, 도 3 및 도 4 참조). 따라서, 그러한 경우에, 봉입체가 거의 SC 내에 있는지 또는 그것이 표피 내에 깊게 침투하였는지를 결정하기가 어려웠다.
슬라이스들 중 일부에서는, 표지화가 표피 내 깊은 곳에서 관찰되었다. 슬라이스들은 두께가 20 μm였기 때문에, 종래의 현미경법은 시야(field)의 완전히 투명한 뷰(view)를 제공하지 않았다. 도 5는 상이한 초점 평면들에서 촬영된 동일한 시야의 3개의 이미지의 최대 세기에 상응하는 재구성을 나타낸다.
4.3 M0037-GFP 샘플(가용성 GFP)
도 6(패널 A 및 B)은 M0037-GFP 샘플로부터의 형광 이미지를 나타낸다. 대부분의 관찰에서, 형광은 M0037-CI 샘플(봉입체)에 대해 관찰된 것보다 훨씬 더 낮았으며, 동일한 조건에서 이미지를 캡처하는 경우, 형광은 거의 검출 불가능하였다. 그러나, 약간의 형광 신호가 존재하였으며, 이미지 캡처 시간을 30초로 연장하였을 때, 일부 응집체가 관찰될 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 형광 신호의 분포는 GFP 봉입체와 함께 인큐베이션된 샘플에서 관찰된 신호보다 유의하게 더 균질하였다. 일부 샘플에서는, 4초의 노출 시간으로 더 높은 형광 세기가 검출되었지만 희미하였다(결과는 도시되지 않음).
4.4. M0037-CTRL 샘플(대조군)
도 7은 대조군 샘플 M0037-CTRL에 상응하는 형광 이미지를 나타낸다. 모든 관찰에서, 검출된 형광은 M00037-CI(GFP 봉입체) 또는 M0037-GFP(가용성 GFP) 샘플에서보다 훨씬 더 낮았으며, 이는 실제적으로 존재하지 않았다. 30초의 노출 시간까지 획득이 이루어지게 하고, 다이어프램을 최대로 열어서, 약간의 희미한 형광을 검출할 수 있었는데, 이는 자가형광 또는 백그라운드 형광인 것으로 여겨질 것이며, 그 이유는 전체 샘플에 걸쳐 균질하게 분포되었기 때문이다.
4.5 공초점 현미경법을 사용하여 얻어진 이미지
Leica SP2 공초점 현미경을 사용하여 얻어진 일련의 광학적 단면(형광 이미지) 및/또는 위상차 이미지의 경우에 동일한 시야에서 투과광 모듈을 사용하여 얻어진 이미지를 사용하여 3차원 재구성(최대 투영(Max projection))을 수행하였다. 전술된 방법에 따라 얻어진 20 μm 단면들을 사용하여 이미지를 획득하였다.
도 8(20x 배율, 두 이미지 시리즈 모두에 대해 동일한 캡처 조건)에 나타낸 바와 같이, 샘플 M0037-CI(봉입체)(패널 A) 및 M00037-GFP(가용성 GFP)(패널 B)로부터의 신호의 형광 세기에 있어서 그리고 또한 그의 형상 및 분포에 있어서 명백한 차이가 있었다.
도 9에서의 일례에 나타낸 바와 같이, 대부분의 관찰에서, M0037-CI 샘플로부터의 형광 신호가 각질층(SC) 내에, 표피의 최외층 내에, 그리고 많은 경우에 또한 표피의 중간 및 깊은 영역 내에 위치된 형광 응집체인 것으로 검출되었다. 대조적으로, 도 10에 제시된 일례에 나타낸 바와 같이, 대부분의 관찰에서, M0037-GFP 샘플의 형광은 오로지 각질층 영역 내에서만 분산되고 위치되었다.
이러한 관찰은 미립자상의 비가용화된 형태의 봉입체가 표피를 침투할 수 있음을 명백히 나타내었다. 더욱이, 온전한 봉입체의 침투는 표층이 아니었으며, 봉입체는 표피 내의 중간 위치에서 그리고 심지어는 깊은 위치에서도 검출되었다.
실시예 2
GFP 봉입체의 생성 및 특성화
일반적으로, 본 출원에서의 개시내용에 따른 미용제 및/또는 치료제로서 사용되는 봉입체는 본 실시예에 개시된 방법 또는 당업계에 알려진 방법에 따라 생성되고 특성화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제13/142,295호(미국 특허 출원 공개 US 2011-0268773호로서 공개됨), 및 미국 특허 출원 제13/319,772호(미국 특허 출원 공개 제2012-0148529호로서 공개됨)뿐만 아니라 그러한 2개의 미국 특허 출원에 인용된 모든 참고문헌을 참조하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
봉입체의 생성 : 에스케리키아 콜라이 MC4100 균주(단백질 접힘 및 분해에 관하여 WT, araD139 Δ(argF-lac) U169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR) 내에서 그리고 그의 유도된 균주, JGT20(주요 샤페론 DnaK가 결핍됨, dnak756 thr::Tn10) - 이하, DnaK 균주 - 내에서 봉입체(IB)를 생성하였다. 이들 균주를 아미노 말단에서 구제역 바이러스(FMDV)의 오량체-형성 캡시드 단백질인 VP1에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는, 발현 벡터 pTVP1GFP(ApR)(문헌[Garcia-
Figure pct00010
. (2005) Microb. Cell. Fact. 4:27])로 형질전환시켰다(문헌[Gonzalez-Montalban et al. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355:637-642]). 고도로 소수성인 이러한 바이러스성 단백질은 봉입체로서의 융합 단백질의 침적을 안내한다(문헌[Doglia et al. (2008) Biotechnol. J. 3:193-201]). 유사한 작제물, VP1LAC는 이미 기재된 베타-갈락토시다제 융합을 인코딩한다(문헌[Garcia-
Figure pct00011
. (2005) Microb. Cell. Fact. 4: 27]). 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 유도성-trc 프로모터의 제어 하에서 재조합 유전자를 발현하였다. 세균을 100 ㎍/ml의 암피실린으로 보충된 루리아 베르타니(LB) 풍부 배지(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 스페인 28760 마드리드 소재) 중에서 배양하고, 1 mM IPTG를 첨가함으로써 재조합 유전자 발현을 유도하였다. IPTG를 첨가한 지 1시간 후에 봉입체가 검출가능하다.
봉입체의 정제 : 200 ml의 세균 배양물의 샘플을 5분 동안 5.000 g로 4℃에서 원심분리하고, 50 ml의 용해 완충액(50 mM TrisHCl pH 8.1, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. 0.5초 주기 하에서 진폭의 40%에서 25 내지 40분 동안 Braun LabsonicU 프로브 초음파처리기(Braun Biotech International)를 사용하여 아이스 재킷부착(Ice jacketed) 샘플을 초음파처리하였다. 일단 초음파처리되면, 28 μl의 100 mM 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 및 23 μl의 라이소자임을 샘플에 첨가하였으며, 이어서 이를 45분 동안 교반 하에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 40 μl의 Nonidet P40(NP-40)을 첨가하였으며, 혼합물을 교반 하에서 4℃에서 1시간 동안 유지한다. 교반 하에서 37℃에서 45분 동안 120 μl의 1 mg/ml DNase 및 120 μl의 1 M Mg2SO4를 사용하여 DNA를 회수하였다. 마지막으로, 샘플을 15분 동안 15000 g로 4℃에서 원심분리하고, 순수한 봉입체를 함유하는 펠릿을 0.5% Triton X-100을 함유하는 용해 완충액으로 세척하고, 분석 시까지 ―20℃에서 저장하였다.
세균 및 봉입체의 현미경적 분석 : 488 nm에서 여기 후에 Leica TSC SP2 AOBS 공초점 형광 현미경(Leica Microsystems Heidelberg GmbH, 독일 맨하임 소재)을 사용함으로써 샘플을 분석하였으며, 플랜 아포크로매트 대물렌즈(줌 8; 1,024 × 1,024 픽셀수)(63× (NA 1.4 오일(oil))를 사용하여 500 내지 600 nm의 방출 파장에서 이미지를 기록하였다. 형광 봉입체를 생성하는 세균 세포의 분석을 위하여, IPTG 유도 후 1, 2 또는 3시간째에 취해진 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서 0.2% 포름알데하이드로 고정시키고 그들의 사용 시까지 4℃에서 저장하였다. 단리된 봉입체를 20 ml의 PBS 중에 재현탁시켰다.
안정성 분석 : 5시간 동안 DnaK-세포 내에서 얻어진 IB를 40 mg/l의 겐타마이신, 100 U/ml의 페니실린 및 10 ㎍/ml의 스트렙토마이신의 존재 하에서 10 g/l의 소혈청 알부민(BSA) 및 60 g/l의 수크로스를 갖는 PBS 중에 희석시키고, 분취물을 상이한 온도(37℃, 25℃, 또는 4℃)에서 인큐베이션하였다. 상이한 시간에, 형광 결정 시까지 샘플을 ―80℃에서 동결시켰다.
450 nm의 여기 파장을 사용하고 510 nm에서 형광 방출을 검출함으로써, Cary Eclipse 형광 분광광도계(Variant, Inc., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)에서 형광을 분석하였다. 결과는 ―80℃에서 유지되고 완전히 안정한 대조군 샘플과 대비하여 남아 있는 활성 또는 형광의 백분율로서 기재하였다. 다른 샘플 세트를 Telstar(Terrassa, 스페인 소재)로부터의 Cryodos-80 동결건조기 내에서 동결건조시키고 분석 시까지 4℃ 또는 25℃에서 저장하였다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경법 : 2 μM, 5 μM 및 10 μM의 상이한 농도로 VP1GFP 봉입체를 첨가하기 24시간 전에, HeLa(자궁경부암 세포주; ATCC: CCL-2™) 및 NIH3T3(섬유아세포 세포주; ATCC: CRL-1658™) 세포 배양물을, 유리 플레이트(MatTek Corporation, 미국 매사추세츠주 애쉬랜드 소재) 상에 70%의 밀도로 시딩하였다. 봉입체를 첨가한 지 4시간 후에, 플랜 아포크로매트 렌즈(63×, N.A. 1.4 오일)를 사용하여 스펙트럼 공초점 Leica TCS SP5 AOBS(Leica Microsystems, 독일 맨하임 소재)를 사용하여 살아있는 세포를 검사하였다. 핵 및 세포막 표지화를 위하여, 5 ㎍/ml의 Hoechst 33342 및 5 ㎍/ml의 CellMask(둘 모두 미국 오레곤주 유진 소재의 Molecular Probes, Inc.로부터 입수됨)와 함께 이들 각각에 대해 실온에서 5분 동안 세포를 인큐베이션하고, 공초점 검출 전에 2회 세척하였다. 핵을 405 nm 다이오드 레이저 빔으로 여기시키고, 414 내지 461 nm(청색 채널)에서 검출하였으며; 633 nm 헬륨 네온 레이저의 광으로 여기시킴으로써 세포막을 검출하고 형광을 656 내지 789 nm(근적외 채널)에서 검출하였으며; 마지막으로, 아르곤 레이저 488-nm 라인을 VP1GFP 봉입체를 이미징하는 데 사용하였다(녹색 채널, 방출 = 500 내지 537 nm).
실시예 3
Hsp70 봉입체의 생성 및 특성화
일부 경우에, 봉입체는 미용 목적 및 치료 목적 둘 모두에 사용될 수 있다. 샤페론, 예컨대 Hsp70 또는 Hsp38이 이러한 부류의 단백질에 속한다. 인간 Hsp70 샤페론은 세포 아폽토시스의 강력한 억제제인데(문헌[Gamido et al. (2003) Cell Cycle 2: 579-584]), 이는 치료적 가치가 있는 다른 활성들 중에서도 무엇보다 각별한 활성이다(문헌[Calderwood et al. (2005) Eur. J. Immunol. 35: 2518-2527]). 피부는 다수의 스트레스 인자 요인(stressor agent)에 대해 신체를 보호하는 첫 번째 장벽이다. 세포 스트레스 반응은 Hsp 발현 유도를 포함하는데, Hsp 발현 유도는 연령에 따라 감소되어 환경적 공격으로부터 세포 보호를 저하시키는 것으로 보고되어 있다. 피부에서 Hsp70 수준을 증가시킴으로써, 피부가 더운 스트레스 조건 및 추운 스트레스 조건 하에 있을 때 예방적 미용제로서 사용되거나, UVB-유도된 세포사에 대한 광보호로서 사용되거나, 탈수에 대한 세포 보호에 사용되거나, 또는 다수의 스트레스 인자에 의해 야기된 손상을 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Matsuda et al. (2010) J. Biol. Chem. 285: 5848-5858]; 문헌[Jonak et al (2006) Int. J. Cosmet. Sci. 28: 233-41]; 문헌[Laplante et al. (1998) J. Histochem. Cytochem. 46: 1291-301]; 문헌[Maytin (1992) J. Biol. Chem. 267: 23189-96]; 문헌[Bivik et al. (2007) Carcinogenesis 28: 537-44]; 문헌[Fargnoli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 846-50]; 문헌[Garmyn et al. (2001) J. Invest. Dermatol. 117: 1290-5]을 참조한다.
봉입체의 생성 : 적절하게 변형된 실시예 2에 기재된 것과 같은 프로토콜에 따라, N-말단에 융합된 히스티딘-6 정제 태그를 갖는 인간 Hsp70 단백질(호모 사피엔스(Homo sapiens) 열충격 70 kD 단백질 1B, HSPA1B, NCBI 레퍼런스 번호: NM005346; 진뱅크 GI:167466172)을 발현하는, N-His 태그, T7 프로모터, 및 암피실린 내성 유전자를 함유하는 pReceiver-B01 시판 발현 벡터(OmicsLink™ ORF Expression Ready Clone 카탈로그 번호 EX-R0068-B1, GeneCopoeia, 미국 매사추세츠주 록빌 소재)로 형질전환된 E. 콜라이 BL21(DE3)의 균주에서 봉입체를 생성한다. 세균 세포를 100 ㎍/ml의 암피실린으로 보충된 LB 풍부 배지 중에서 배양하고, 1 mM IPTG를 첨가함으로써 재조합 유전자 발현을 유도한다. 봉입체는 IPTG 첨가 후 1시간째에 검출가능하다. Hsp70의 응집에 의해 형성된 봉입체는 실시예 2에 기재된 것과 같은 절차에 따라 정제된다.
아폽토시스 검정 : 예를 들어 Annexin V-FITC57(예를 들어, Annexin V-FITC 아폽토시스 검출 시트(Apoptosis Detection Kit)(Roche))에 의한 형광 검정을 사용하여, 세포 아폽토시스를 결정한다. 재구성된 표피 샘플을 Hsp70 봉입체의 부재 또는 존재 하에서 스트레스 인자 요인(예를 들어, 화학 제품) 또는 아폽토시스를 야기하는 것으로 알려진 스트레스 환경 조건(예를 들어, 추위, 열, UV 방사선, 탈수) 하에 둔다. 표피 샘플을 스트레스 인자 요인 또는 스트레스 환경 조건을 적용하기 이전에, 동시에, 또는 이후에 Hsp70 봉입체로 처리할 수 있다. 대조군으로서, 피부 세포에 대한 봉입체의 추정상의 유해한 영향을 검출하기 위한 목적으로, 동일한 양의 봉입체를 스트레스 인자 요인 또는 스트레스 환경 조건의 부재 하에서 표피 샘플에 첨가한다. 일정 기간 인큐베이션 후에, 제조업체에 의해 권장된 바대로, Annexin V-FITC 및 프로피듐 요오다이드로 피부 세포를 염색하고, 형광 세기 수준을 검출한다.
결과 : Hsp70 봉입체와 함께 행한 표피 샘플의 인큐베이션은, 비-가용화된 봉입체 내에 함유된 인간 Hsp70이 봉입체 형태로 국소 투여될 때 그의 천연 생물학적 활성을 수행할 수 있는지를, 그리고 봉입체가 세포사에 이르는 아폽토시스 사건을 유의하게 억제할 수 있는지를 보여줄 것이다. 그 결과는, 아폽토시스-유도 조건에 노출되고, 그 이전에, 동시에, 또는 이후에 Hsp70 봉입체로 처리된 피부 세포가 그의 생존력을 유지할 수 있는지를 보여줄 것이다. 더욱이, 이러한 관찰은 불용성 봉입체 형태로 생성된 단백질이 국소 투여될 수 있는지, 이들 단백질이 국소 투여 후에 생물학적으로 활성인지, 그리고 국소 투여 후에 생물학적 활성이 치료적 효과를 갖는지를 보여준다. 또한, 그 결과는 봉입체가 국소 투여될 때 치료적 가치를 갖는 나노입자인지, 그리고 게다가 이것이 기계적으로 그리고 기능적으로 안정하고, 완전히 생체적합성인지를 보여준다.
실시예 4
카탈라제 봉입체
반응성 산소종(ROS), 예컨대 초과산화물 음이온, 하이드록실 라디칼, 일중항 산소, 및 과산화수소는 구조적 및 기능적(효소) 단백질, 지질막, 조직 다당류, 및 유전 물질(DNA)에 대해 다수의 유해한 영향을 야기한다. 피부에서, 이들 손상에 대해 보호하는 것으로 추정되는 분자는 초과산화물 불균등화 효소(SOD), 글루타티온 퍼옥시다제(GPO), 및 카탈라제와 같은 특정 효소를 포함한다. 외인성 공급원으로부터 이용가능한 효소, 예컨대 카탈라제 및 SOD는 미용 제형 내에서 안정화하기가 통상 용이하지 않다.
미용 용도를 위한 외인성 SOD의 적용은, 예를 들어 문헌[Miyachi et al. (1987) J. Invest. Dermatol. 89:111-112]; 및, 문헌[Filipe et al. (1997) Exp. Dermatol. 6:116-121]에 기재되어 왔다. 열- 및 UV-안정성 미용제로서의 호열성 미생물로부터 얻어진 유사한 효소의 사용이 또한 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Mas-Chamberlin et al. (2002) Cosmet. Toil 117:22-30]; 문헌[Lintner et al. (2002) IFSCC Magazine 5:195-200] 참조). 또한, US4129644호(초과산화물 불균등화 효소를 함유하는 미용 조성물로 피부 및 모발을 보호하는 것을 개시함), US5145644호(과산화수소 파괴 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법을 개시함), 또는 EP1004289A2호(카탈라제를 포함하는 미용 및 피부 보호 조성물을 개시함)를 참조한다.
최근에, 카탈라제가 또한 미용 업계에 사용되기 시작하였다. 몇몇 마스크 트리트먼트(mask treatment)는 표피의 상부 층에서의 세포 산화를 증가시키려는 의도로 이 효소를 안면 상에서 과산화수소와 결합시킨다. 저수준의 카탈라제가 또한 인간 모발의 백모 과정(graying process)에서 역할을 하는데, 이는 신체에 의해 자연적으로 생성된 과산화수소가, 카탈라제 수준이 감소될 때, 모발을 탈색시키기 때문이다. 따라서, 카탈라제는, 예를 들어 모발을 백모하기 위한 미용 트리트먼트 내로 포함될 수 있다.
카탈라제 봉입체의 생성 : 4℃에서 5분 동안 5.000 g로 원심분리함으로써 20 ml의 배양물 샘플을 수확하고, 용해 완충액(50 mM TrisHCl pH 8.1, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA) 중에 재현탁시키고, ―80℃에서 동결시켰다. 해동 후에, 100 μl, 100 mM의 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)(또는 다른 프로테아제 억제제) 및 400 μl의 50 mg/mL 라이소자임을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 0.5% Triton X-100을 함유하는 100 μl의 동일한 용해 완충액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 초음파처리 또는 다른 파괴 방법, 예컨대 고압 균질화를 사용하여 샘플을 파괴하였다. 그 후에, 5 μl의 Nonidet P40(NP-40)을 첨가하고, 샘플을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 37℃에서 45분 동안 15 μl의 1 mg/ml DNase 및 15 μl의 1 M MgSO4를 사용하여 DNA를 회수하였다. 마지막으로, 샘플을 4℃에서 15분 동안 15000xg로 원심분리하고, 순수한 카탈라제 봉입체를 함유하는 펠릿을 0.5% Triton X-100을 함유하는 1 ml의 용해 완충액으로 1회 세척하였다. 4℃에서 15분 동안 15000xg로의 최종 원심분리 후에, 분석 시까지 ―80℃에서 펠릿을 저장하였다. 모든 인큐베이션은 교반 하에서 행하였다. 이 프로토콜에 사용된 부피 및 인큐베이션 시간은, 더 많은 양의 샘플을 사용할 때에는 규모를 상승시켰다.
봉입체 형태의 카탈라제가 약리학적으로 활성인지를 결정하기 위한 예비 실험에서, 카탈라제 봉입체를 시험관내 뉴런 모델 시스템에 투여하였다. 카탈라제 봉입체는 모델 시스템 내에서 효소적으로 활성이고 신경보호 효과를 갖는 것으로 확인되었다(결과는 나타내지 않음).
결과 : 카탈라제 봉입체와 함께 행한 표피 샘플의 인큐베이션은, 비-가용화된 봉입체 내에 함유된 카탈라제가 봉입체 형태로 국소 투여될 때 그의 천연 생물학적 활성을 수행할 수 있는지를, 그리고 봉입체가 반응성 산소종(ROS)에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 유의하게 보호할 수 있는지를 보여줄 것이다. 그 결과는, 반응성 산소종에 노출되고, 그 이전에, 동시에, 또는 이후에 카탈라제 봉입체로 처리된 피부 세포가 그의 생존력을 유지할 수 있는지를 보여줄 것이다.
실시예 5
인터류킨-10(IL-10) 봉입체
인간 사이토카인 합성 억제 인자(CSIF)로도 알려진 인터류킨-10(IL-10 또는 IL10)은 항염증 사이토카인이다. IL-10의 한 가지 역할은 계속 진행 중인 염증 과정에 의한 괴사의 위험을 감소시킴으로써 피부에 대한 심각한 손상을 방지하는 것일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Grimbaldeston et al. (2007) Nature Immnology 8:1095-1104(비만 세포-유래 인터류킨-10이, 예를 들어 포이즌 아이비(poison ivy) 또는 포이즌 오크(poison oak)에 따른 접촉 피부염에서, 그리고 자외선 B에 의한 만성 자극에서 피부 병상을 제한하는 것을 개시함)]을 참조한다. 따라서, 피부 염증을 감소시키기 위해 IL-10이 국소 조성물 내에 포함될 수 있다.
봉입체의 생성 : 4℃에서 5분 동안 5.000xg로 원심분리함으로써 20 ml의 배양물 샘플을 수확하고, 용해 완충액(50 mM TrisHCl pH 8.1, 100 mM NaCl 및 1 mM EDTA) 중에 재현탁시키고, ―80℃에서 동결시킨다. 해동 후에, 100 μl, 100 mM의 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)(또는 다른 프로테아제 억제제) 및 400 μl의 50 mg/mL 라이소자임을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 0.5% Triton X-100을 함유하는 100 μl의 동일한 용해 완충액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 초음파처리 또는 다른 파괴 방법, 예컨대 고압 균질화를 사용하여 샘플을 파괴한다. 그 후에, 5 μl의 Nonidet P40(NP-40)을 첨가하고, 샘플을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 37℃에서 45분 동안 15 μl의 1 mg/ml DNase 및 15 μl의 1 M MgSO4를 사용하여 DNA를 회수한다. 마지막으로, 샘플을 4℃에서 15분 동안 15000xg로 원심분리하고, 순수한 IL-10 봉입체를 함유하는 펠릿을 0.5% Triton X-100을 함유하는 1 ml의 용해 완충액으로 1회 세척한다. 4℃에서 15분 동안 15000xg로의 최종 원심분리 후에, 분석 시까지 ―80℃에서 펠릿을 저장한다. 모든 인큐베이션은 교반 하에서 행한다. 이 프로토콜에 사용된 부피 및 인큐베이션 시간은, 더 많은 양의 샘플을 사용할 때에는 규모를 상승시킨다.
결과 :IL-10 봉입체와 함께 행한 표피 샘플의 인큐베이션은, 비-가용화된 봉입체 내에 함유된 IL-10이 봉입체 형태로 국소 투여될 때 그의 천연 생물학적 활성을 수행할 수 있는지를, 그리고 계속 진행 중인 염증 과정에 의한 괴사의 위험을 감소시킴으로써 봉입체가 피부에 대한 심각한 손상을 유의하게 예방할 수 있는지, 피부 병상을 제한할 수 있는지, 또는 피부 염증을 감소시킬 수 있는지를 보여줄 것이다. 그 결과는, 염증-유발 자극에 노출되고, 그 이전에, 동시에, 또는 이후에 IL-10 봉입체로 처리된 피부 세포가 그의 생존력을 유지할 수 있는지를 보여줄 것이다.
실시예 6
건선 치료를 위한 인터류킨-10(IL-10) 봉입체의 사용
특히 환자에 대한 피하 투여를 통한 임상 시험에서의 건선의 치료에 IL-10이 사용되어 왔다. 그러나, 단백질의 생성, 필요한 양, 및 그의 만성 투여와 관련된 고비용을 고려해볼 때, 건선 치료를 위한 IL-10의 사용은 경제적으로 실용적이지 않다. IL-10의 국소 투여는 IL-10에 의한 치료의 비용을 유의하게 감소시킬 것이다.
건선을 치료하기 위해 IL-10 봉입체를 사용하는 것의 실행가능성을 시험하기 위하여, 건선을 갖는 인간 피부의 배양된 생검(외식편(explant))을 포함하는 생체외(ex vivo) 모델 시스템에 IL-10 봉입체를 사용하였다. 이러한 모델 시스템은 배양 상태로 수 일 동안 인간 피부의 조직학적 특성, 세포 특성 및 유전적 특성을 유지할 수 있다. 따라서, 이 모델 시스템은 피부 질병 또는 질환, 예컨대 건선 및 아토피성 피부염에 대한 상이한 자극/억제제의 영향을 평가하는 데 사용될 수 있다. 게다가, 이러한 기법은 시험된 작용제의 약리학적 활성을 평가하기 위하여 정량적 RT-PCR과 조합될 수 있다.
건선 피부 및 건강한 피부를 사용한 유전자 발현 연구는 건선 병변에서 과발현된 유전자의 확인 및 검증을 가능하게 하여 그의 수준을 치료제의 임상 효능과 상관시킬 수 있게 하였다. IL-10의 작용 기전과 관련되고/되거나 건선 병상과 관련된 유전자의 확인은 생체외에서 건선 병변에 적용된 IL-10 봉입체의 활성의 평가를 가능하게 하였다. 환자로부터 생검을 얻었으며, 각각의 생검에서 10개의 유전자의 발현 수준을 RT-PCT를 통해 결정하였다.
IL-10 봉입체를 환자로부터의 건선 외식편에 적용하였다. 각각의 외식편을 4개의 부분으로 다시 나누고, 이들을 4개의 상이한 검정을 수행하는 데 각각 사용하였다. (i) 각각의 시험이 상이한 농도의 IL-10 봉입체를 피부 샘플에 국소 적용하는, 2개의 시험, (ii) GFP 봉입체(GFP-VP1)가 피부 샘플에 적용된 대조군 시험, 및 (iii) 음성 대조군(봉입체를 함유하지 않음).
IL-10 봉입체로 처리된 건선 외식편에서는, 염증의 유의한 감소가 관찰되었다(IFN-감마, IL-8, K16, TNF-알파, 및 IL-17A의 감소된 수준이 관찰됨). GFP 봉입체로 처리된 외식편에서는, 대조군 샘플과 대비하여 염증의 약간의 증가가 관찰되었다(표 3 참조).
[표 3]
Figure pct00012
이들 결과는 (염증을 감소시키기 위해) 치료적으로 사용되거나, 또는 (염증의 시각적 효과, 예컨대 발적 및/또는 종창을 감소시키기 위해) 미용제로서 사용될 수 있는 작용제인, 봉입체 형태의 IL-10의 투여가 생체외 인간 건선 모델 시스템에서 염증을 감소시킬 수 있음을 보여주었다.
대조군/플라세보로서 사용된 GFP-VP1 봉입체가 약간의 염증 효과를 야기하였다는 관찰은 E. 콜라이-생성 봉입체의 사용이 약간의 면역원성 효과를 가질 수 있음을 시사하였다. 따라서, GRAS로서 인식되는 유기체인 프로바이오틱 세균 균주를 사용한 대안적인 봉입체 생성 시스템을 개발하였다(결과는 나타내지 않음).
실시예 7
EGF, KGF 및 VEGF 봉입체
요약 : EGF, VEGF 및 KGF를 인코딩하는 유전자를 2개의 P170 벡터(Bioneer A/S, 덴마크 호르숄름 소재) 내로 클로닝하였다. 클로닝된 작제물의 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 3개의 상이한 L. 락티스 균주를 형질전환시켜, 총 18개의 상이한 균주를 생성하였다. KGF, EGF, 또는 VEGF를 발현하는 균주에 대해 플라스크 발현 실험을 수행하였다. 신속-제조(fast-prep) 용해물을 제조하여, 가용성 및 불용성 분획을 생성하였다. 가용성 또는 불용성 분획을 사용하여 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 (고 카피수 플라스미드 및 clpP 균주 둘 모두에서) 주로 불용성 분획에서 KGF의 발현을 보여주었다. VEGF 발현은 가용성 및 불용성 분획 둘 모두에서 검출되었지만, 각각의 분획에는 상이한 밴드 패턴이 있었다.
E. 콜라이에서의 발현 플라스미드의 작제 : 인간 EGF(55개 아미노산 길이), KGF(165개 아미노산 길이) 및 VEGF(208개 아미노산 길이)를 인코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 합성하였다. E. 콜라이에서의 유전자 클로닝을 위해 2개의 발현 벡터를 사용하였다: (i) pAMJ398, 세포내 생성을 위한 배지-카피수 플라스미드(MCM), 및 (ii) pAMJ328, 세포내 생성을 위한 고 카피수 플라스미드(HCN). pAMJ328의 NcoI 및 SalI 제한 부위를 통해, 그리고 pAMJ398의 BspHI 및 SAlI 제한 부위를 통해 발현 벡터 내로 유전자를 클로닝하였다. 발현 플라스미드를 E. 콜라이 DH10B에서 확립하였다(Research Master Cell Banks/rMCB를 -80℃에서 저장하였다): UP1406: pAMJ328::EGF; UP1407: pAMJ328::VEGF; UP1408: pAMJ328::KGF; UP1409: pAMJ398::EGF; UP1410: pAMJ398::VEGF; 및, UP1411: pAMJ398::KGF.
락토코쿠스 락티스 균주의 형질전환 : 플라스미드 DNA를 E. 콜라이 균주로부터 정제하였다. 플라스미드 DNA를 제한 효소 매핑, 클로닝 결합부의 DNA 서열분석, 및 MG1363(Bioneer A/S, 덴마크 호르숄름 소재)에 기초한 3개의 L. 락티스 균주, wt, htrA-, clpP-의 형질전환에 사용하였다. 모든 플라스미드 작제는 제한 효소 매핑 및 DNA 서열분석에 의해 확인되고 검증되었다. M17G5-erm 중에서 성장시킨 후에, rMCB를 글리세롤 중에서 확립하였다(-80℃에서 저장하였다).
[표 4]
Figure pct00013
L. 락티스 플라스크 실험 : 18개의 발생된 L. 락티스 균주(표 4)를 1% 글루코스 및 1 ㎍/mL 에리트로마이신으로 보충된 풍부 배지(1.5xM17) 중에서 하룻밤 성장시켰다. 하룻밤 성장시킨 후에 pH 및 OD600을 측정하여, P170 프로모터의 유도가 일어났음을 보장하였다. 예상된 바와 같이, pH는 약 5.0 내지 5.5이고, OD600은 약 4 내지 5였다. 하룻밤 배양물 10 ml를 수확하고, 세포 펠릿을 -20℃에서 저장하였다. 세포 펠릿을 1 ml PSB 중에서 세척하고, 세포 물질을 2개의 튜브 내에 나누어서 넣었는데, 이때 각각의 튜브에는 500 μl 세포 물질(~ 5 ml 배양물)이 담겨 있었다. 하나의 펠릿은 신속-제조를 위해 사용하고, 다른 하나는 -20℃에서 저장하였다. 신속-제조를 위한 변형된 프로토콜을 사용하여 가용성 및 불용성 분획을 제조하였다. 가용성 분획 및 불용성 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석한 후, 쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯 분석을 행하였다(도 12 및 도 13 참조).
L. 락티스 플라스크 실험( VEGF ): VEGF를 갖는 발현 벡터를 함유하는 L. 락티스 세포를 에리트로마이신을 갖는 1.5xM17G10 배지 중에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 10 μL의 가용성 세포내 분획 및 10 μL의 불용성 세포내 분획을 SDS-겔 12% Tris-글리신 상에 로딩하고(loaded), 쿠마시 염색하고(도 12a), 웨스턴 블로팅하였다(도 12b).
VEGF의 분자량에 상응하는 명백한 단백질이 쿠마시 염색에 의해서는 가용성 또는 불용성 어느 것에서도 관찰되지 않았다(도 12a). 그러나, (블롯의 좌측에 화살표로 표시된 레인 2 내지 7의 모든 균주에서) 가용성 분획에서 웨스턴 블로팅에 의해 명백한 신호가 관찰되었다(도 12b). MW는 약 40 내지 42 kDa였는데, 이는 예측된 밴드 크기(23 KDa)보다 더 높았다. 이러한 MW를 갖는 VEGF 밴드의 존재는 또한, 인간 세포주에서의 VEGF의 발현을 분석하였을 때에 대한 Abcam(VEGF 항체 공급업체)으로부터의 생성물 데이터시트에 기재되어 있다. 대부분의 균주(블롯의 우측에 화살표로 표시된 레인 8 내지 13)에서 불용성 분획에서 약 50 KDa 및 100 kDa 초과의 밴드를 검출하였는데, 이는 VEGF가 봉입체 내에 존재함을 나타낸다.
L. 락티스 플라스크 실험( KGF ) : KGF를 갖는 발현 벡터를 함유하는 L. 락티스 세포를 에리트로마이신을 갖는 1.5xM17G10 배지 중에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 10 μL의 가용성 세포내 분획 및 10 μL의 불용성 세포내 분획을 SDS-겔 12% Tris-글리신 상에 로딩하고, 쿠마시 염색하고(도 13a), 웨스턴 블로팅하였다(도 13b).
KGF의 분자량에 상응하는 명백한 단백질이 쿠마시 염색에 의해서는 가용성 또는 불용성 어느 것에서도 관찰되지 않았다(도 13a). 그러나, clpP 균주에서 가용성 분획에서 웨스턴 블로팅에 의해 명백한 신호가 관찰되었다(레인 6 및 7에서의 이중 밴드, 블롯의 우측에 있는 화살표)(도 13b). MW는 약 22 kDa였는데, 이는 KGF에 대해 예측된 밴드 크기(18 KDa)에 가깝다. 동일한 밴드 패턴이 불용성 분획에서 관찰되었다. 가장 강력한 밴드 패턴은 고 카피수(HCN) 플라스미드(레인 12, 균주 UP1437)를 함유하는 clpP 균주에서 관찰되었는데, 이는 KGF가 봉입체 내에 존재함을 나타낸다.
L. 락티스 플라스크 실험( EGF ) : EGF를 갖는 발현 벡터를 함유하는 L. 락티스 세포를 에리트로마이신을 갖는 1.5xM17G10 배지 중에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 10 μL의 가용성 세포내 분획 및 10 μL의 불용성 세포내 분획을 SDS-겔 12% Tris-글리신 상에 로딩하고, 쿠마시 염색하고, 웨스턴 블로팅한다. 이들 실험은 개시된 균주 내에서 발현된 EGF가 봉입체 내에 존재하는지를 보여줄 것이다.
EGF 및/또는 KGF 및 VEGF 봉입체(또는 다른 단백질 또는 비-단백질 치료제, 부형제 등을 또한 포함하는 조성물)와 함께 행한 표피 샘플의 인큐베이션은 비-가용화된 봉입체 내에 함유된 단독으로의 또는 조합된 상태의 이들 성장 인자가 봉입체 형태로 국소 투여될 때(즉, 피부 또는 다른 상피 조직에 투여될 때) 그들의 천연 생물학적 활성을 수행할 수 있는지를, 그리고 봉입체가 (예를 들어, 노화 또는 환경적 인자에 대한 노출로 인한) 내인성 및/또는 외인성 피부 손상 또는 병리학적 질환(예를 들어, 피부 질병 또는 질환)을 유의하게 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는지를 보여줄 것이다. 따라서, 실험 데이터는 이들 봉입체가 미용제 및/또는 치료제로서 효과적으로 기능하는 능력을 나타낼 것이다. 결과는 또한 피부-손상 질환에 노출되고 그 이전에, 동시에, 또는 이후에 EGF 및/또는 KGF 및 VEGF 봉입체를 포함하는 조성물로 처리된 피부 세포(예를 들어, 인공 모델 시스템, 생체외 모델, 또는 대상체의 피부에서)가 그의 생존력을 유지할 수 있는지를 보여줄 것이다.
상세한 설명 부분 - 그러나 발명의 내용 및 요약서 부분은 아님 - 은 청구범위를 해석하기 위해 사용하고자 한다는 것이 이해되어야 한다. 발명의 내용 및 요약서 부분은 본 발명자(들)에 의해 고려되는 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 그러나 전부는 아닌 예시적인 실시 형태를 기술할 수 있으며, 이에 따라, 본 발명 및 첨부된 청구범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.
본 발명은 지정된 기능 및 그의 관계의 구현을 예시하는 기능적인 구성 요소를 이용하여 전술하였다. 이들 기능적 구성 요소의 경계는 설명의 편의상 본 명세서에서 임의대로 규정하였다. 지정된 기능 및 그의 관계가 적절히 수행되는 한 대안적인 경계가 규정될 수 있다.
구체적 실시 형태의 전술된 설명은 다른 사람이 당업계의 기술 내에서 지식을 적용함으로써, 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않고서, 과도한 실험 없이, 그러한 구체적 실시 형태를 다양한 적용에 대해 용이하게 수정 및/또는 변형시킬 수 있도록 본 발명의 전반적 성질을 완전히 보여줄 것이다. 따라서, 그러한 변형 및 수정은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시 형태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에서의 표현 또는 용어는, 본 명세서의 용어 또는 표현이 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 하도록, 제한이 아니라 설명이 목적임이 이해되어야 한다.
본 발명의 범위 및 범주는 전술된 예시적인 실시 형태들 중 임의의 것에 의해 제한되어야 하는 것이 아니라 단지 하기의 청구범위 및 그의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.

Claims (51)

  1. 피부 장벽을 가로질러 미용제(cosmetic agent)를 전달하는 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물(cosmetic composition)을 적용하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 미용제는 봉입체 형태로 상기 피부 장벽을 가로지르는, 방법.
  2. 피부 장벽을 가로질러 치료제(therapeutic agent)를 전달하는 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물(therapeutic composition)을 적용하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 치료제는 봉입체 형태로 상기 피부 장벽을 가로지르는, 방법.
  3. 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제, 및 피부학적으로 허용되는 담체를 포함하는 미용제 조성물의 미용적 유효량을 국소 적용하여 상기 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 피부 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 피부 질환을 치료하기 위한 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치료 조성물 또는 치료제의 치료적 유효량을 국소 적용하여 상기 대상체의 피부 질환을 개선하도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 미용제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 상기 미용제의 침투는 가용성 형태의 동일한 미용제의 침투와 대비하여 증가되는, 방법.
  6. 치료제에 의한 피부의 침투를 향상시키는 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 적용하는 단계를 포함하며, 상기 치료제의 침투는 가용성 형태의 동일한 치료제의 침투와 대비하여 증가되는, 방법.
  7. 조직 재생을 자극하는 방법으로서,
    대상체의 피부에 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 상기 조직에 도달하고 그의 재생을 자극하는, 방법.
  8. 진핵 세포 증식을 자극하는 방법으로서,
    대상체의 피부에 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 적용하는 단계를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투하여 진핵 세포 증식을 자극하는, 방법.
  9. 경피 전달 시스템의 제조 방법으로서,
    (i) 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제 또는 치료제를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 봉입체를 담체와 혼합함으로써 상기 경피 전달 시스템을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 불용성인, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 가용화되지 않는, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 부분 가용화되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 미립자 형태인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 미립자 형태는 약 20 내지 약 1500 nm의 입자 크기를 갖는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 미립자 형태는 약 100 nm 내지 약 500 nm의 입자 크기를 갖는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미립자 형태는 약 150 nm 내지 약 300 nm의 입자 크기를 갖는, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미립자 형태는 수화된 비정질 형태인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 표적 세포에 의해 내재화되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포는 표피 세포인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포는 비-표피 세포인, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포는 뉴런인, 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포는 근육 세포인, 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 표적 세포는 지방세포인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 봉입체는 적어도 하나의 피부 층을 침투할 수 있는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 봉입체는 각질층(cornified layer(stratum corneum)), 반투명층(투명층)(translucent layer(stratum lucidum)), 과립층(granular layer(stratum granulosum)), 유극층(spinous layer(stratum spinosum)) 또는 기저층(basal/germinal layer(stratum basale/germinativum))을 침투할 수 있는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미용제 또는 치료제는 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 전구약물인, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 천연 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 또는 화학적으로 합성된 폴리펩타이드인, 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 융합 단백질인, 방법.
  31. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 단백질 접합체인, 방법.
  32. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 키메라(chimeric) 폴리펩타이드인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩타이드는 세균, 효모, 곤충 세포, 및 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 내에서 발현되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 봉입체-유도(inclusion-body inducing) 폴리펩타이드에 유전자 융합되거나 또는 접합되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 봉입체-유도 폴리펩타이드는 바이러스성 단백질인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 바이러스성 단백질은 캡시드 단백질인, 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 봉입체-유도 폴리펩타이드는 구제역 바이러스(FMDV)의 VP1 오량체-형성 캡시드 단백질 또는 그의 단편을 포함하는, 방법.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 단백질 정제 태그 또는 시각화 태그에 접합되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 단백질 정제 태그는 His6-태그인, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 시각화 태그는 형광 태그인, 방법.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 에리트로포이에틴(EPO), 코르티코트로핀-방출 호르몬(CRH), 성장 호르몬-방출 호르몬(GHRH), 고나도트로핀-방출 호르몬(GnRH), 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 프로락틴-방출 호르몬(PRH), 멜라노트로핀-방출 호르몬(MRH), 프로락틴-억제 호르몬(PIH), 소마토스타틴, 부신피질자극 호르몬(ACTH), 소마토트로핀 또는 성장 호르몬(GH), 황체형성 호르몬(LH), 여포-자극 호르몬(FSH), 티로트로핀(TSH 또는 갑상선-자극 호르몬), 프로락틴, 옥시토신, 항이뇨 호르몬(ADH 또는 바소프레신), 멜라토닌, 뮐러관 억제 인자(
    Figure pct00014
    ), 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 가스트린, 콜레시스토키닌(CCK), 세크레틴, I형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I), II형 인슐린-유사 성장 인자(IGF-II), 심방 나트륨이뇨 펩타이드(ANP), 인간 융모성 고나도트로핀(hCG), 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩타이드(PP), 렙틴, 신경펩타이드 Y, 레닌, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 인자 VIII, 인자 IX, 조직 인자, 인자 VII, 인자 X, 트롬빈, 인자 V, 인자 XI, 인자 XIII, 인터류킨 1(IL-1), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 8(IL-8), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨 12(IL-12), 인터류킨 16(IL-16), 인터페론 알파, 베타, 감마, 신경 성장 인자(NGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-베타), 골 형성 단백질(BMP), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 아교세포 성장 인자, 각질세포 성장 인자(KGF), 내피 성장 인자, 알파-1 항트립신, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 사이클로스포린, 피브리노겐, 락토페린, 조직-유형 플라스미노겐 활성제(tPA), 키모트립신, 이뮤노글로빈, 히루딘, 초과산화물 불균등화 효소(superoxide dismutase), 이미글루세라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase)(DHFR), 카탈라제, 또는 샤페론으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 IL-10 및/또는 EGF 및/또는 KGF 및/또는 VEGF, 및/또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 또는 그로 본질적으로 이루어지는, 방법.
  43. 제3항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선, 셀룰라이트, 심상성 여드름, 낭포성 여드름, 피부 노화, 피부 주름살, 과다색소침착, 각화증, 피부 흠(skin blemish), 건성 비강진, 사마귀, 광손상 피부, 만성 피부증, 피부염, 건조감, 비늘증, 바이러스성 감염, 진균성 감염, 및 세균성 피부 감염으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제4항에 있어서, 상기 피부 질환은 건선, 여드름, 무좀, 아구창, 옹종, 칸디다증, 세균성 질염, 질증, 연조직염, 단순 포진, 건성 비강진, 피부염, 습진, 홍색음선, 단독(erysipelas), 다형 홍반, 부스럼(furuncle), 농가진, 및 감염으로부터 선택되는, 방법.
  45. 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하는 미용 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템.
  46. 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하는 치료 조성물을 포함하는 경피 전달 시스템.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 전달 시스템은 패치, 스프레이, 면봉, 스펀지, 스틱, 또는 샴푸인, 경피 전달 시스템.
  48. 어플리케이터에 결합된 용기 및 상기 용기 내에 포함된 제45항 또는 제46항에 따른 경피 전달 시스템을 포함하는 기구.
  49. 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 미용제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있는, 국소 미용 조성물.
  50. 단리된 봉입체 형태의 적어도 하나의 치료제를 포함하며, 상기 봉입체는 피부 장벽을 침투할 수 있는, 국소 치료 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 겔, 크림, 로션, 연고, 에멀젼, 현탁액, 에어로졸, 에어로졸 폼, 도찰제, 팅크제, 고약(salve), 습포제(poultice), 건조 분말, 또는 이들의 조합인, 국소 조성물.
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