KR20170031229A - 서팍틴의 적용 및 화장품에서의 이의 적용 - Google Patents

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KR20170031229A
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신-메이 왕
쏸-루이 수
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샤프트 바이오테크놀로지 컴. 엘티디
젠-칸 루
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Abstract

서팍틴(surfactin)은 바설러스 서브틸리스에 의해 생성되는 생계면활성제이고 상기 서팍틴은 7개 아미노산으로 구성된 환 구조를 포함하는 천연 사이클로지방족 펩타이드이고, 상기 서팍틴이 항-노화, 항-주름, 화장품(피부 침투제), 발포제 및 유화제의 피부 침투를 증가시킴을 포함하는 다양한 기능을 갖는다.

Description

서팍틴의 적용 및 화장품에서의 이의 적용{Applications of surfactin in cosmetic products and thereof}
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 서팍틴(surfactin)의 적용, 특히 화장품에서의 서팍틴의 적용에 관한 것이다.
2. 선행 기술 분야의 기재
1. 인간 피부 구조 및 이의 노화 인자
피부는 인체에서 표면 상의 주요 기관이고 이의 두께는 위치, 연령 및 성별에 따라 다양하다. 피부의 주요 기능은 외부 환경 인자, 예를 들어, UV 광, 온도 다양성, 습도 변화 및 입자상 물질 및 바이러스 또는 세균 진입에 의한 내부 기관에 대한 손상을 예방하기 위한 1차 장벽을 제공하는 것이다. 따라서, 노화 메카니즘은 손상된 세포를 대체하기 위해 외부 인자들에 의해 피부에서 용이하게 유발될 수 있다.
(1) 세포 노화 및 유전학적 결함
노화는 세포에 이어서 조직 및 기관에 대한 효과를 나타내기 시작하고 일부 조직 및 기관의 구조적 및 기능적 악화를 유발한다. 1963년에 레오나드 헤이플릭에(Leonard Hayflick)에 의해 수행된 연구는 인간으로부터 단리된 동결된 세포가 특정 횟수 동안 계대된 후 기형을 진행하는 것으로 밝혀졌다. 상기 결과를 토대로, 인간 세포에는 세포 분열을 위한 상한치가 존재하고 세포 분열 속도 및 세포의 출현 50회 계대 후 변화하여 불규칙한 분열 및 과립- 또는 일그러진 비정상 세포 출현을 유도하고 궁극적으로 세포의 아폽토시스를 유도한다. 상기 연구는 유기체의 생활 주기가 수정 단계에서 결정되고 유기체의 생물학적 시계가 예비 결정됨을 시시사하였다. 인간에서, 세포는 약 120년인 50회까지 분열할 수 있다. 인간 세포는 DNA 복제 동안에 상실된 서열의 복제를 위한 텔로머라제를 발현하지 않기 때문에, 결과적으로 유전자는 다수의 복제 및 분열 과정 동안에 손상됨에 따라서 세포 주기 상에 제한을 생성하고 상기 제한은 유리 천정으로 불리우고, 이것은 비가역적이고 불가피한 노화 과정이다.
(2) 자외선 (UV) 광
피부 및 다른 기관은 시간 경과에 따라 노화될 것이지만 피부 노화는 일상에서 다양한 환경적 인자의 효과로 인해 다른 기관과 비교하는 경우 보다 심각하다. 다수의 노화 인자들 중에서, 자외선 (UV) 조사는 가장 영향력 있는 인자이다. UV 파장은 3 eV 내지 124 eV의 에너지를 갖는 10 내지 400 nm 범위이다. UV 광은 이의 파장에 기초하여 3개의 부류로 나누어질 수 있다: (1) 315 내지 400 nm의 파장을 갖는 장-파장 UV-A는 대기를 직접 관통하고 표면에 도달할 수 있다. 이것은 또한 피부의 진피층을 침투하고 검 버섯, 노화 및 주름을 유발할 수 있다. UV-A는 3개의 파장 중에서 가장 강한 침투 능력을 소유하고 있고; (2) 280 내지 315 nm의 파장을 갖는 중-파장 UV-B는 피부 발적, 열, 통증 및 심지어 박피 또는 화상 같은 증상을 유발한다. 그러나, UV-B는 성층권 오존에 의해 흡수되고 단지 제한된 방사선이 지구의 표면에 도달하고; (3) 100 내지 280 nm를 갖는 단-파장 UV-C는 최고 에너지이고 해롭다. 그러나, 이의 단파장은 대기에 의해 흡수되고 따라서 단지 0.1 %만이 지구의 표면에 도달할 수 있다. 더욱이, 일반 보호막 및 유리 장벽은 UV-C 광선을 효과적으로 차단시킬 수 있다. 이전의 연구는 UV-A가 인간 피부 섬유아세포에서 매트릭스 메탈로프로테이나제의 합성을 유도할 수 있고 매트릭스 메탈로프로테이나제 패밀리의 구성원은 콜라겐, 엘라스틴 및 세포내 매트릭스 중 다른 물질을 분해하고 노화를 유발함을 보고하였다. 추가로, UV-A는 세포에서 유리 라디칼의 수준을 증가시킬 수 있고 과량의 유리 라디칼은 또한 미성숙 노화 또는 심지어 아폽토시스를 유도한다.
(3) 유리 라디칼
유리 라디칼 이론은 현재 가장 수용되는 노화 이론이고 1954년에 기관 (Lincoln University School of Medicine)에서 덴함 하맘 M.D.에 의해 제안되었다. 그러나, 상기 이론은 20년 후 때까지 수용되지 않았고 현재 노화의 주요 이론 중 하나가 되었다. 덴함 하맘은 1995년에 의학 노벨상 수상자로 지명되고 수여받았다. 정상 원자는 쌍을 이루는 전자를 함유하는 반면 유리 라디칼은 쌍을 이루지 않은 전자를 갖는 산소를 함유한다. 쌍을 이루지 않은 전자는 극히 불안정하기 때문에, 유리 라디칼은 정상 원자로부터 전자를 전이시킴에 따라 세포내 매트릭스에서 변화를 유도하여 세포사를 유발한다.
생체내 영양물의 대사 또는 합성 뿐만 아니라 노화를 유도할 수 있는 유리 라디칼의 중요한 공급원은 또한 환경 오염, 자외선 광, 방사선, 흡연, 살충제 및 많은 화학 물질, 특히 환경 오염(자동차 배기가스 및 공장에 의한 SO2 배출)을 포함하고 이들 모두는 생체내 상당한 양의 유리 라디칼의 생성에 기여할 수 있다.
유리 라디칼 공격은 세포막 손상 및 DNA 손상으로 나누어질 수 있다. 인간 세포에 대해, 산소-함유 유리 라디칼은 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 과산화수소 H2O2, 하이드록실 라디칼 OH-, 등을 포함하고, 이들은 반응성 산소 종(ROS)으로 불리운다. 과량의 유리 라디칼은 세포 막에서 불포화 지방산을 용이하게 공격한다. 유리 라디칼이 세포 막에서 불포화 지방산을 공격하는 경우, 지질 퍼옥시다제가 생성되고 혈관 벽에서 LDL 콜레스테롤을 산화시키고 프로스타사이클린 신테타제의 활성을 억제하여, 죽상동맥경화증, 당뇨병, 관절염, 백내장, 노화 및 관상 동맥 질환을 유발한다. 유리 라디칼이 핵으로 깊숙이 진입하는 경우 유전자 정보를 변형시켜 암이 발생할 수 있다. 추가로, 유리 라디칼은 노화 유전자를 유도하여 노화를 촉진시킬 수 있다. 연구는 암, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 근육위축병, 피부 반점 침적, 주름 형성, 황반, 퇴행성 심장 질환, 뇌졸중, 궤양, 류마티스 관절염 및 다발성 경화증을 포함하는 노화 및 퇴행성 질환의 거의 80 % 내지 90 %가 유리 라디칼과 관련됨을 지적했다.
유리 라디칼에 대한 세포 방어 메카니즘: 세포에 의해 합성되는 다양한 항산화 효소, 예를 들어, 천연적으로 생체내에서 생성되는 슈퍼옥사이드 음이온 (2O2 - + 2H+ H2O2 + O2, 2GSH + H2O2 및 GS-SG + 2H2O)을 제거할 수 있는 효소 글루타티온 퍼옥시다제(GPx) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 및 글루타티온(GSH). 연구는 또한 장수 동물이 생체내에서 보다 높은 수준의 SOD를 함유하고 인간이 지금까지 최고 수준의 SOD를 함유하는 동물임을 시사하였다. 자연 노화, 물리적 변화 및 환경적 인자들은 모두 생체내에서 항산화제의 불충분한 생성을 유발하여 노화를 유도할 수 있다.
(4) 염증
염증은 조직이 손상되거나 감염되는 경우 생기는 반응이다. 첫 번째, 비만 세포가 조직에 도달하게 되고 하기의 물질을 방출하기 전에 내피 세포에 부착한다:
(1) 히스타민: 모세관의 침투성 및 국소 혈관확장을 증가시켜 혈장 및 대식세포와 같은 물질이 통과하도록 할 수 있고 가려움증 및 알레르기 반응을 유발할 수 있는 아미노산의 유도체.
(2) 종양 괴사 인자(TNF): 사이토킨은 표적 세포를 사멸시키고 면역계를 활성화시켜 림프구의 증식을 유도하여 병원체 증식을 방지하고 또한 대식세포가 감염 부위에 모이도록 한다.
(3) 프로스타글란딘: 모세관의 혈관확장을 유도하고 신경 말단에서 통증을 유발한다. 고름은 염증 후 생성되고, 이는 죽은 세포 및 체액으로 이루어지고 통상적으로 대식세포에 의해 분해된다.
특이적 사이토킨은 COX-1 및 COX-2를 포함하는 사이클로옥시게나제(COX)를 활성화시킨다. COX는 아라키돈산을 PGE 2 및 PGF 2α와 같은 프로스타글란딘으로 전환시킨다. 최근 연구는 COX-2가 대부분의 정상 조직에서 발견되지 않지만 다양한 암을 갖는 환자들에서 검출될 수 있음을 보여주었고, 이는 암 환자에서 COX-2의 중요성을 지적한다. 추가로, COX-2는 이의 기능이 대식세포 또는 다른 세포를 활성화시키는 유도성 효소이고 염증 조직에 존재한다.
염증 부위는 주로 안지오텐신 또는 히스타민으로 인해 열을 생성시킨다. 일부 세포는 알레르겐에 대항하여 류코트리엔을 활성화시키기 위해 이전에 인터류킨으로서 공지된 염증 사이토킨 IL-17(인터류킨-1 알파)을 방출시키고 상기 사이토킨은 또한 케모킨을 포함한다. 상기 케모킨은 숙주 세포에서 화학유인 메카니즘 및 인터페론을 개시시키고 단백질 합성을 종결시킨다. 한편, 성장 인자 및 세포독성 분자는 또한 조직의 치유를 위해 방출될 수 있다. 상기 언급된 물질의 분비는 주변 영역에 영향을 주고 세포내 매트릭스의 손실을 유발하고 노화를 유도한다.
상기 언급된 4개의 노화 인자로부터, 피부 노화 과정 동안에, 표피 및 진피에서 섬유아세포의 증식은 감소되고 이는 결과적으로 진피층의 세포내 매트릭스에서 대형 분자 및 구조적 단백질의 변화에 기여하고 피부 접힘, 피부의 여윔, 윤기 없는 피부, 감소된 피부 탄성 및 수분 수준을 유도한다. 대안적으로, UV 광은 피부 조직에서 콜라겐 및 탄성 섬유를 분해시키기 위해 세포내 프로테아제의 생성을 유도한다. 추가로, UV 광은 또한 세포에서 유리 라디칼의 수준을 증가시킬 수 있고 피부 염증으로 인해 미성숙 노화를 유도할 수 있다. 더욱이, 피부는 세포막, 구조 단백질 및 핵산과 같은 세포 구조를 파괴하여 궁극적으로 세포내 매트릭스의 상실로 인해 주름 뿐만 아니라 암 발병 및 피부 세포의 사멸을 유도하는 UV 광 노출 후 ROS를 생성시킨다.
2. 인간 항-노화 단백질
일부 연구는 와인 중 화학 물질 레스베라트롤의 자극 또는 칼로리의 제한 하에 시르투인 계열이 활성화되고 세포 주기를 연장시키는 반면 MIT에 연구소(Leonard Guarente lab)의 싱클레어(Sinclair)는 효모 중 특별한 시르투인 단백질이 2개의 특이적 방식을 사용함에 의해 노화 과정에 영향을 주고 시르투인이 세포의 유전자 활성 조절 및 DNA 절단 복구를 도와줄 수 있음을 지적했다.
한편, 싱클레어 연구소의 필립 오베르도어퍼(Philipp Oberdoerffer)는 효모 기원의 시르투인 유전자를 사용하여 포유동물 시르투인 유전자의 DNA 서열을 스크리닝하기 위해 마우스 세포의 마이크로어레이를 사용하였고 마우스를 사용한 동물 연구는 또한 효모 시르투인-형 유전자가 척추동물에도 존재함을 확인하였다. 오베르도어퍼는 포유동물에서 시르투인의 주요 기능이 유전자 발현 방식을 관리하는 것임을 보고하였다. 모든 유전자는 모든 세포에 존재하지만 단지 제한된 유전자가 특정 기간에 활성화될 필요가 있다. 잘못된 유전자가 활성화되는 경우, 세포 손상이 발생하고 손상된 세포의 아폽토시스를 유도한다.
억제된 유전자는 환경 인자로부터 비롯되는 손상으로부터 서프레스된 유전자를 보호하고 서프레스된 유전자가 폐쇄된 상태의 유지를 확실히 하고 유전자의 안정성을 보장하도록 하기 위해 시르투인에 의해 유도된 탈아세틸화를 진행한다. 시르투인은 염색질의 보존 및 수축을 도와주고 유전자 및 히스톤을 커버하고 이것이 가동되지 않도록 보장할 수 있다. DNA가 UV 광 또는 유리 라디칼에 의해 손상되는 경우, 시르투인은 손상된 부위에서 복구 메카니즘을 원조한다. 영구 손상이 유발되기 전에 시르투인은 유전자 및 단백질을 커버하여 이의 보호 기능을 발휘한다. 시르투인으로부터 보호 없이, 히스톤은 구조를 완화시키기 시작하고 서프레스된 유전자는 재활성화되고 유전자가 외부 중재에 민감해지도록 하고 손상되도록 한다.
마우스가 노화되는 경우, DNA 손상율은 증가하고 상기 유형의 손상은 제어되지 않는 유전자 발현 및 염색질의 이완을 유도한다. 상기 시점에, 시르투인은 악화된 게놈의 조절을 원조한다. 제어 상실 과정 동안에 활성화된 많은 유전자들은 노화 표면형과 직접 관련된 유전자들이다.
다른 연구는 시르투인에 의해 제어되지 않는 마우스 유전자들이 노화된 마우스에서 계속적으로 발현됨을 시사했다. 오베르도어퍼는 유전자전이된 림프종 마우스 모델을 사용하여 시르투인의 기능을 조사하였고 마우스의 평균 수명은 과잉 시르투인 유전자 복제물이 제공되거나 마우스에 시르투인 활성화인자인 레스베라트롤이 공급되는 경우 24 % 내지 46 % 연장됨을 발견하였다.
대안적으로, 레오나드 구아렌트에 의해 수행된 연구는 새로운 약물의 활용이 시간 경과에 따라 시르투인의 분포를 재배열함을 지적했고 새로운 방법은 세포를 노화로부터 보호하기 위해 나타날 것이다. 상기 특이적 메카니즘을 기준으로, DNA 손상이 노화 과정을 악화시킬 수 있지만, 상기 결과는 DNA 손상 때문인 것이 아니라, 유전자 조절 부재로부터 비롯된다. 추가로, 오베르도어퍼의 연구는 또한 상기 유전자 발현 조절 과정이 DNA의 실제 돌연변이와는 상이한 후성적인 것으로 호칭됨을 보여주었다. 상기 원리의 확인에 의해, 시르투인의 자극이 노화 과정을 역행시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
3. 경피 침투 증진제(TPE)
새로운 약물의 연구는 상당한 양의 돈 및 시간을 요구하고 따라서 약물 전달 시스템의 개발은 수년 동안 보다 많은 관심을 끌었다. 가장 통상적인 약물 투여 방법은 경구 투여, 피하 주사 및 경피 투여를 포함한다. 경구 투여는 가장 통상의 투여 방법이고 약물은 위장 점막에 의해 흡수된 후 혈류에 진입하고 국소적으로 또는 전신적으로 이의 효과를 발휘한다. 그럼에도 불구하고, 경구 투여의 단점은 생체내 느리고 불규칙적인 흡수를 포함하고 이는 치료 효과를 감소시킨다. 더욱이, 상기 약물은 혈류에 도착하기 전에 간을 통과해야만 하고 이는 약물의 치료학적 효과를 감소시킬 뿐만 아니라 간에 대한 부담을 증가시킨다. 특정 약물은 불량한 장 흡수 또는 자극으로 인해 경구로 투여될 수 없고 경구 투여의 가장 심각한 결점은 구역 및 구토와 같이 환자에서 불쾌감을 유발할 수 있는 약물의 부작용이다. 또 다른 투여 방법은 피하 모세관에 의한 흡수 및 신체로의 전달을 가능하게 하기 위해 약물을 피하 영역으로 직접 주사하는 피하 주사이다. 상기 방법의 장점은 약물이 위액 및 간에 의해 영향받지 않는다는 것이고 직접 혈관으로 진입하여 다양한 신체 부분을 통과하여 치료학적 효과를 달성할 수 있다는 점이다. 상기 피하 주사는 경구 투여와 비교하는 경우 투여율을 상당히 증가시킨다. 그러나, 장기 주사를 필요로 하는 환자의 경우, 이는 장기 주사에 의해 유발되는 통증을 견디는 것은 부담이다. 다른 투여 방법은 경피 약물 전달 시스템(TDDS)을 사용하는 것이고 상기 약물은 본 시스템에서 피부에 의해 흡수된다. 투여 후, 상기 약물은 소정의 기간에 각질층을 통과하고 혈류에 진입하기 전에 모세관에 의해 흡수되고 전신 치료요법의 목적을 달성하기 위해 이의 효과를 발휘한다(문헌참조: Saunders et al., 1999).
경피 약물 전달 시스템(TDDS)의 장점은 용이한 제조, 저비용, 일정한 전달 속도, 약물의 장기간 안정한 농도 유지, 보다 낮은 투여 횟수, 낮은 독성, 감소된 간 제1 통과 효과, 감소된 약물 대사, 약물 사용에서 덜한 개별적 차이, 증가된 생물유용성 및 저용량 투여로 성취될 수 있는 치료학적 효과를 포함한다. 추가로, TDDS는 어린이, 노인 또는 약물 흡수 문제를 갖는 환자에 사용되기에 적합하고; 용이하게 적용될 수 있고 문제가 발생하는 경우 투여를 중단하기 위해 즉시 제거할 수 있다. TDDS는 상기 언급된 장점을 갖고 상기 시스템은 많은 관심을 끌었다. 현재에, TDDS 시스템의 연구 및 개발은 국소적 방출에서 전신적 표적 기관 및 제어된 방출로 진보하였고 임상용으로 적용되어 왔다(문헌참조: Shin et al., 2005).
TDDS 시스템의 주요 장애물은 피부의 각질층이다. 각질층(SC)은 피부의 상부층이고 편평하고 긴 각질 세포로 구성되고 지방 층에 의해 둘러싸여 있다(Norlen, 2001). SC의 주요 기능은 외래 물질의 진입 및 물 손실을 차단하는 것이고 피부의 최외곽 장벽이다(문헌참조: Bouwstra et al., 2003). 1973년에, 브레드나흐 등(문헌참조: Breathnach et al)은 SC에서 세포 간 세포내 공간이 피부 장벽 기능에서 중요한 역할을 수행하는 지방으로 채워짐을 발견하였다(문헌참조: Breathnach et al., 1973). 유사하게, 다른 연구는 또한 SC에서 세포내 공간에서 지방의 유동성이 SC의 온도가 상승하고 따라서 결과적으로 피부의 경관 흡수가 증가하는 경우 증가함을 시사하였다(문헌참조: Golden et al., 1987). 양친매성 약물의 소수성 및 피부 침투성은 지방이 SC로부터 제거되는 경우 상당히 증가하지만; 지방의 제거는 친지성 약물에 대한 상당한 효과를 나타내지 않는다(문헌참조: Tsai et al., 2001).
3개의 방법은 경관 흡수의 장애물을 극복하기 위해 가용하다: 먼저, 물리적 방법은 과잉 에너지를 제공하여 피부에서 일시적 구멍을 생성시켜 약물 흡수을 촉진시키고 통상의 치료는 초음파, 이온도입법, 마이크로바늘 어레이 및 열 에너지를 포함한다. 제2 방법은 전구체의 생전환 및 대사적 억제제의 조합을 사용하여 약물의 흡수를 증가시키는 생화학적 방법이다. 제3 방법은 리포좀을 사용하여 약물을 커버하거나 침투 증진제가 첨가되는 화학적 방법이다. 리포좀은 친수성 말단이 외부로 돌출되어 있고 소수성 말단은 내부로 향해 있는 곡선의 지질 이중층으로 이루어져 있고 친수성 및 소수성 물질 둘다에 대한 케리어로서 사용될 수 있다. 오일 약물은 지질 이중층으로 통합할 수 있는 반면, 친수성 약물은 리포좀의 수성상에 커버될 수 있다. 리포좀과 세포 간의 상호작용은 4개의 메카니즘을 포함한다: 리포좀의 조성물의 일부가 세포막의 조성물로 교환되는 막 간 전달; 리포좀이 세포막에 부착되어 있는 흡착; 리포좀이 세포막과 융합되어 내용물의 세포로의 전달; 및 최종적으로, 리포좀이 세포에 의해 취득되는 세포내이입. 침투 증진제는 침투성 및 피부에 의해 흡수된 약물의 양을 촉진시킬 수 있는 물질을 언급하지만 심각한 자극 및 손상을 유발하지 않는다(문헌참조: Williams and Barry, 1991). 상기 침투 증진제는 주로 SC의 세포 간 층에서 효과를 발휘하고 이의 규칙적인 구조를 파쇄하고 유동성을 증가시키고; 더욱이, 이것은 각질에 작용하여 각질세포의 구조를 느슨하게 하고 SC에서 약물의 용해도를 증가시키고 약물의 흡수를 증진시킨다(문헌참조: Walker and Smith, 1996). 침투 증진제의 첨가는 피부 침투성을 증가시키기 위해 매우 도움이 되는 방법이다(문헌참조: Saunders et al., 1999).
계면활성제는 우수한 피부 침투 증진제이고 생필름 및 피부의 침투성 증가를 도와줄 수 있고(문헌참조: Lopez et al., 2000) 최근에 약물 침투에 광범위하게 적용되었다(문헌참조: Nokhodchi et al., 2003; Shokri et al., 2001). 2001년에, 노크호드치 등(문헌참조: Nokhodchi et. al)은 계면활성제 나트륨 라우릴 설페이트(SLS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 및 벤즈알코늄 클로라이드가 마우스에서 항-우울 약물 디아제팜의 피부 흡수를 증진시킬 수 있음을 시사하였다(문헌참조: Shokri et al., 2001). 항-우울 약물에 대해 노크호드치 등에 의해 수행된 또 다른 연구는 또한 계면활성제 나트륨 라우릴 설페이트(SLS), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 및 벤즈알코늄 클로라이드가 마우스에서 피부 흡수를 증진시킬 수 있음을 지적했다(문헌참조: Nokhodchi et al., 2003). 서팍틴은 합성 세포 막, 원핵 세포 막 및 진핵 세포 막에 대해 큰 친화성을 나타내고(문헌참조: Maget-Dana and Ptak, 1995; Sheppard et al., 1991; Tsukagoshi et al., 1970b) 서팍틴과 세포 막 간의 결합은 서팍틴이 콜레스테롤 및 인지질에 대해 큰 친화성을 갖고 이들 2개의 구조는 세포막의 주요 성분들이기 때문에 고도로 선택적이다(문헌참조: Hosono and Suzuki, 1985). 화학적으로 합성된 계면활성제와 비교하는 경우, 서팍틴은 보다 온화하고 피부에 해롭지 않다.
통상적인 방법에 의해, 약물 또는 영양 활성 물질은 단지 표피(각질층)의 장벽을 침투할 수 있고 상기 발휘된 효과는 유의적이지 않다(0.3 % 이하의 효과). 상기 문제점을 해결하기 위해, 다수의 TDDS 시스템은 영양물이 피부의 표피 및 진피층을 통과하도록 영양물 침투를 증진시킬 목적으로 개발되었고 결과적으로 영양물 전달 방법은 피부 케어 기술의 주요 연구 주제가 되었다.
인간 피부의 각질층은 두께가 단지 10 내지 25 마이크론으로 매우 얇으며 최고 얇은 SC가 6 마이크론으로서 규티클 눈꺼풀에 있지만, 상기 SC는 보다 "강인"하고 피부의 가장 중요한 보호 층이다. 통상의 화장품은 3개의 주요 경로를 통해 피부를 주로 침투한다: 1. 한선관을 통해; 2. 직접 각질층을 통과; 및 3. 모낭을 통해.
일례로서 화장품 성분 골드를 사용한 골드 아름다움(gold beauty)에 대한 현재 연구는 골드가 해독, 진정, 세정 및 주름 감소 기능을 갖고 세포 인자를 재배열하고, 생리학적 기능 및 대사를 촉진시키고, 오일/물 분비가 균형을 이루게 하고 천연수를 보유하고 외부 인자에 의해 유발되는 알레르기를 예방할 수 있음을 확인하였다. 한편, 화장품에 사용되는 통상의 성분인 나노골드는 인간 모공의 200분의 1에 인접한 크기를 갖고 따라서 나노-골드 입자를 함유하는 피부 케어 제품을 사용하는 목적은 진피에서 나노골드의 세포로의 침투를 촉진시키는 것이다.
진피층에 진입한 후, 나노골드는 유전학적 수준에서 진피 세포의 기능을 조절할 수 있고 이는 진피 세포가 SOD, 메탈로티오네인 및 EGF와 같은 일련의 활성 물질을 생성하도록 유도함을 포함한다. SOD는 하이드록실 라디칼을 제거할 수 있고 메탈로티오네인은 피질 세포가 UV 광 손상에 저항하도록 도와줄 수 있기 때문에, 나노골드 입자는 진피 세포에서 항-노화 효과를 갖는다. 다른 연구는 또한 나노골드가, 섬유아세포가 세포외 매트릭스(ECM)를 분비하고 합성하고, 피부의 견고성을 강화시키면서 세포-특이적 각질세포 성장 인자(KGF)를 상이하게 표적화하고 피부를 부드럽게 하고 빛나는 광택으로 완전한 탄성력을 나타나게 하기 위해 표피 성장 인자(EGF)를 발현하고 분비하도록 유도할 수 있음을 시사하였다.
4. 생물유화제
항-세균 펩타이드로서 사용되는 것 뿐만 아니라, 서팍틴은 또한 생물유화제로서 또 다른 중요한 역할을 수행한다. 1999년에 델레우 등(Deleu et. al)은 서팍틴이 이투이른 A 및 펜기신과 비교하는 경우 알칸의 유화에서 보다 우수한 효과를 갖지만, 이투이른 A가 크리밍-응집 억제 시험(creaming-flocculation inhibition test)에서 서팍틴보다 우수한 효과를 가짐을 발견하였고 SDS는 유화에서 최소 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 연구는 20 mg/l의 서팍틴의 첨가가 디젤의 생분해를 증가시킬 수 있음을 보여주었고 pH 값이 디젤에 대한 서팍틴의 유화 효과에 영향을 주고 서팍틴이 pH가 7.4로 조정되는 경우 디젤에 대한 최상의 생분해성 효과를 가짐을 추가로 지적했다.
5. 발포제
통상의 유화제의 유화 능력 뿐만 아니라, 서팍틴은 또한 발포 형성을 촉진시키는 능력을 갖는다(문헌참조: Razafindralambo et al., 1998). 발포 효과는 서팍틴이 가스와 액체 상 사이에 존재하여 왕성한 진탕이 계면활성제가 공기를 포집하고 공기를 함유하는 얇은 필름을 형성하도록 함을 언급한다(문헌참조: Halling, 1981). 라자핀드랄암보 등(Razafindralambo et. al)은 또한 이투이른 A와 비교하는 경우 우수한 발포 효과를 제공함을 시사하였고 이들 2개의 제제의 구조는 이들의 발포 성질에 관련되어 있는 것으로 추측된다. 서팍틴은 음이온 계면활성제에 속하고 이의 지방산 탄소쇄는 보다 짧고, 이투이른 A는 보다 긴 지방산 쇄를 갖는 비-이온 계면활성제이다(문헌참조: Razafindralambo, et al., 1998).
발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 서팍틴을 사용하는 항-노화(또는 항-주름) 화장품 조성물의 제조 방법을 제공하고; 상기 조성물은 서팍틴 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 및 보조제로 이루어지고; 여기서, 상기 서팍틴은 7개 아미노산(L-아스파르트산, L-류신, 글루탐산, L-류신, L-발린 및 2개의 D-류신)으로 이루어진 사이클로지방족 헤파펩타이드이고 상기 헤파펩타이드는 주로 이소-C14(17 % ~ 35 %)인 β-하이드록시 지방산에 연결되어 있고; 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포는 다음과 같다: (1)이소-C13 > 3 %; (2) C13 > 0.65 %; (3) 이소-C14 > 17 % ; (4) C14 < 41 %; 및 (5) 이소-C15 < 11 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 바람직한 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 > 10 %; (2) C13 > 25 %; (3) 이소-C14 > 35 %; (4) C14 < 25 %; 및 (5) 이소-C15 < 3 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 최상의 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 = 37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %; 여기서, 서팍틴의 분자량은 1022 또는 1036 Da이고; 서팍틴은 이의 이성체를 포함한다(문헌참조: ROC 특허 출원 제097137532호).
본 발명에 따라, 항-노화(항-주름) 화장품 조성물은 하기의 성분들 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다: 알콜, 에스테르, 복합 폴리사카라이드, 땅콩유, 및 비타민; 여기서, 알콜은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: C16-18 알콜, 부탄디올, 펜탄디올, 옥탄디올, 글리세린, 헥사데칸올, 스테아릴 알콜, 1-도코사놀 및 프로필렌 글리콜; 여기서, 상기 에스테르는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: OLIVEM 1000, 글리세롤 모노스테아레이트(GSM), 이소프로필 미리스테이트(IPM), 이소프로필 팔미테이트(IPP) 및 트리글리세리드; 여기서, 복합 폴리사카라이드는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 크산탄 검, 트레멜라 푸시포미스 폴리사카라이드, 텍스트란 폴리사카라이드, 및 폴륨 세나 씨드(Folium sennae seed) 폴리사카라이드; 여기서, 땅콩유는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 아르간유, 쿠쿠이 견과유, 아보카도유, 밀 배아유, 및 올리브유; 여기서, 비타민은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 F, 및 비타민 K.
본 발명에 따라, 항-노화(항-주름) 화장품 조성물은 섬유아세포 증식을 유도하고, UV 광-유도된 노화, 항-산화를 저항하고, 세르투인 1 유전자의 발현을 증진시키고, 콜라겐의 증식을 촉진시키고 매트릭스 메탈로펩티다제의 활성을 억제하기 위해 사용되고; 여기서, 매트릭스 메탈로펩티다제는 매트릭스 메탈로펩티다제 9이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서팍틴을 사용함에 의해 피부 침투를 개선시키기 위한 조성물의 제조 방법을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 서팍틴 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 및 보조제를 포함하고; 여기서, 상기 서팍틴은 β-하이드록시 지방산에 연결된 7개 아미노산 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu를 포함하는 사이클로지방족 펩타이드이고 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 > 3 %; (2) C13 > 0.65 %; (3) 이소-C14 > 17 % ; (4) C14 < 41 %; 및 (5) 이소-C15 < 11 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 바람직한 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 > 10 %; (2) C13 > 25 %; (3) 이소-C14 > 35 %; (4) C14 < 25 %; 및 (5) 이소-C15 < 3 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 최상의 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 = 37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %; 여기서, 서팍틴의 분자량은 1022 또는 1036 Da이고; 여기서, 서팍틴은 이의 이성체를 포함하고; 여기서, 증진된 피부 침투 조성물은 하기의 성분 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: 알콜, 에스테르, 복합 폴리사카라이드, 견과유, 및 비타민; 여기서, 알콜은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: C16-18 알콜, 부탄디올, 펜탄디올, 옥탄디올, 글리세린, 헥사데칸올, 스테아릴 알콜, 1-도코산올 및 프로필렌 글리콜; 여기서, 상기 에스테르는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: OLIVEM 1000, 글리세롤 모노스테아레이트(GSM), 이소프로필 미리스테이트(IPM), 이소프로필 팔미테이트(IPP) 및 트리글리세라이드; 여기서, 복합 폴리사카라이드는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 크산탄 검, 트레멜라 푸시포르미스(Tremella fuciformis) 폴리사카라이드, 덱스트란 폴리사카라이드, 및 폴륨 세나 씨드 폴리사카라이드; 여기서, 견과유는 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 아르간유, 쿠쿠이 견과유, 아보카도유, 밀 배아유, 및 올리브유; 여기서, 비타민은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 F, 및 비타민 K.
본 발명에 따라, 증진된 피부 침투 조성물은 화장품 성분이 피부로 침투하도록 촉진시키기 위해 사용되고; 여기서, 화장품 성분은 덱사메타손, 하이알루론산, 감마-폴리글루탐산 및 골드-나노입자를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서팍틴을 사용하여 유화 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 유화 조성물은 서팍틴 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 및 보조제를 포함하고; 여기서, 서팍틴은 β-하이드록시 지방산에 연결된 7개 아미노산 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu로 이루어진 사이클로지방족 헵타펩타이드 분자이고 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 > 3 %; (2)C13 > 0.65 %; (3) 이소-C14 > 17 %; (4) C14 < 41 %; 및 (5) 이소-C15 < 11 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 바람직한 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 > 10 %; (2) C13 > 25 %; (3) 이소-C14 > 35 %; (4) C14 < 25 %; 및 (5) 이소-C15 < 3 %; 여기서, 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 최상의 분포는 다음과 같다: (1) 이소-C13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 = 37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %; 여기서, 서팍틴의 분자량은 1022 또는 1036 Da이고; 여기서, 서팍틴은 이의 이성체를 포함하고; 여기서, 유화 조성물은 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: 글리세롤 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 슈크로스 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르 및 렉시틴.
본 발명에 따라, 유화 조성물은 발포력을 증가시키고, 유화를 증가시키고 부드러운 느낌을 증가시키기 위한 것이고; 여기서, 유화 조성물은 세제의 발포력을 증가시키고 상기 세제는 샴푸, 세안제, 핸드 워시 크림 및 이의 샤워 겔이고; 여기서, 유화 조성물은 화장품의 유화력을 증가시키고 상기 화장품은 바디 로션, 얼굴 크림, 세럼 및 이의 블록킹 파운데이션이고; 여기서 유화 조성물은 세제의 부드러운 느낌을 증가시키고 상기 세제는 샴푸, 세안제, 핸드 워시 크림 및 이의 샤워 겔을 포함한다.
도 1은 마우스 배아 섬유아세포(BALB/3T3 클론 A31 Mus 근육 배아 섬유아세포)에서 장기 생존 유전자 세르투인 1의 mRNA 발현에 대한 상이한 농도의 서팍틴의 효과를 보여주고; 마우스 배아 섬유아세포는 6, 12, 24, 36 및 48시간 동안 상이한 농도의 서팍틴(0, 25, 50, 75 및 100 μM)과 함께 배양하였다.
도 2는 세포 증식에 대한 레스베라트롤, 팔미토일 펜타펩타이드-3 및 서팍틴의 효과를 보여주고; 마우스 배아 섬유아세포는 48시간 동안 상이한 농도의 서팍틴(0, 25, 50, 75 및 100 μM), 레스베라트롤(0, 5, 10, 20 및 30 μM) 및 팔미토일 펜타펩타이드-3(0, 3, 5, 8 및 10 μM)과 함께 배양하였다.
도 3은 항-광노화에 대한 서팍틴의 효과; UV 조사 후 마우스 배아 섬유아세포의 생존에 대한 상이한 농도의 서팍틴의 효과를 보여주고; 세포에 5 J/cm2, 10 J/cm2 및 15 J/cm2 UV 광을 조사한 후, 25, 50, 75, 100 및 125 μM의 서팍틴을 첨가하고 24시간 동안 항온처리하고 세포 생존은 MTT 방법에 의해 측정하였다.
도 4는 마우스 배아 섬유아세포에 대한 서팍틴의 보호 항-산화 효과를 보여주고; 세포는 100, 150, 200 및 250 μM의 과산화수소로 처리함에 이어서 0, 25, 50, 75 및 100 μM의 서팍틴을 첨가하고 이어서 24시간 동안 항온처리하고 세포 생존은 MTT 방법에 의해 측정하였다.
도 5는 마우스 배아 섬유아세포에서 콜라겐 용량에 대한 서팍틴 및 팔미토일 펜타펩타이드-3의 효과를 보여주고; 여기서, 상기 콜라겐 용량은 시르콜 콜라겐 검정에 의해 측정하고; 마우스 배아 섬유아세포는 24시간 동안 상이한 농도의 서팍틴(0, 25, 50, 75 및 100 μM) 및 팔미토일 펜타펩타이드-3(0, 3, 5, 8 및 10 μM)과 함께 배양하였고; PBS; 인산 완충 식염수; a, b, ab, c, 및 d: 동일한 기호는 어떠한 통계학적 차이를 지적하지 않는다.
도 6은 매트릭스 메탈로펩티다제 9에 대한 서팍틴(SF) 및 팔미토일 펜타펩타이드-3(PPP-3)의 억제 효과를 보여주고; 매트릭스 메탈로펩티다제의 농도는 ELISA에 의해 측정하였고; 마우스 배아 섬유아세포는 상이한 농도의 PPP-3(0,3, 5, 8 및 10 μM) 및 서팍틴(0, 25, 50, 75 및 100 μM)과 함께 배양하였고; a, b, c: 동일한 기호는 어떠한 통계학적 차이를 지적하지 않는다.
도 7은 덱사메타손의 피부 흡수에 대한 서팍틴의 효과를 보여주고; 2개 그룹은 대조군 그룹에서 시험하였고, 100 μl의 PBS(pH = 7.4)는 1 cm2 멸균 면에 첨가하고 마우스의 등에 부착하기 전에 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 덱사메타손과 혼합하고; 실험 그룹에서, FITC-표지된 덱사메타손은 0, 0.2, 0.5, 1, 2 및 5 %의 서팍틴과 혼합하고; 형광 강도는 공초점 현미경을 사용하여 측정하였고; 도 7(A) 내지 (F)는 각각 0, 0.2, 0.5, 1, 2, 및 5 % 서팍틴과의 덱사메타손; SF: 서팍틴을 보여준다.
도 8은 하이알루론산(HA)의 피부 흡수에 대한 서팍틴의 효과를 보여주고; 2개의 그룹은 대조군 그룹에서 시험하였고, 100 μl의 PBS(pH = 7.4)는 1 cm2 멸균 면에 첨가하고 마우스의 등에 부착시키기 전에 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 HA와 혼합하였고; 실험 그룹에서, FITC-표지된 HA는 1시간 동안 0, 0.2, 0.5, 1, 2 및 5 %의 서팍틴과 혼합하고; 형광 강도는 공초점 현미경에 의해 측정하였고; 도 8(A) 내지 (F)는 각각 0, 0.2, 0.5, 1, 2, 및 5 %의 서팍틴과의 HA; SF: 서팍틴을 보여준다.
도 9는 폴리-γ-글루탐산(γ-GPA)의 피부 흡수에 대한 서팍틴의 효과를 보여주고; 2개의 그룹은 대조군 그룹에서 시험하였고, 100 μl의 PBS(pH = 7.4)는 1 cm2 멸균 면에 첨가하고 마우스의 등에 부착시키기 전에 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 γ-GPA와 혼합하고; 실험 그룹에서, FITC-표지된 γ-GPA는 1시간 동안 0 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 % 및 20 %의 서팍틴과 혼합하고; 형광 강도는 공초점 현미경을 사용하여 측정하였고; 도 9(A) 내지 (G)는 각각 0 %, 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 % 및 20 %의 서팍틴과의 γ-GPA; SF: 서팍틴을 보여준다.
도 10은 서팍틴이 골드 나노입자의 피부 침투를 증진시킬 수 있음을 보여주고; 골드 나노입자의 양은 형광 현미경으로 측정하였고; 녹색 형광은 골드 나노입자의 존재를 지적하고, 서팍틴과 혼합된 골드 나노입자를 사용한 실험은 보다 많은 골드 나노입자가 마우스(BALB/c)의 진피에서 발견됨을 입증하였고; 녹색 스팟은 모낭 자가형광이고; SC 표면: 각질층 표면.
도 11은 서팍틴 유화력의 분석 결과를 보여주고; 상이한 농도의 서팍틴은 다양한 pH(6.4, 7.4 및 8.4)에서 완충액 중에 용해시키고 2 ml의 용해된 서팍틴은 3ml의 디젤을 함유하는 시험 튜브에 첨가하였고 이어서 2분 동안 볼텍싱하였다. 24시간 동안 실온에서 배양 후, 유화 지수(E24)를 측정하였다.
도 12는 서팍틴의 발포력의 분석 결과를 보여주고; 조 서팍틴은 pH 7.4에서 완충 용액 중에 용해시켜 상이한 농도의 서팍틴 용액을 제조하고, 2분 동안 볼텍싱하고 이어서 1시간 동안 항온처리하였다. 발포 높이를 측정하고 발포 최대 밀도(MD)를 계산한다.
도 13은 서팍틴의 농도와 발포의 높이 사이의 관계를 보여준다.
도 14는 서팍틴의 농도와 탁도(%) 간의 관계를 보여준다.
도 15는 중합체-계면활성제 복합체로 희석시킨 후 서팍틴을 함유하는 샴푸에서의 침전물을 보여준다.
본 발명은 제한 보다는 오히려 입증 목적을 위해 제공된 하기의 양태를 참조로 보다 구체적으로 기재된다. 하기 실시예는 서팍틴을 사용하여 예시되고 상기 서팍틴은 β-하이드록시 지방산에 연결된(13 내지 15개 탄화수소 쇄에 연결된) 7개 아미노산 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu을 포함하는 사이클로지방족 헵타펩타이드 분자이고, 상기 지방산의 이소-C14는 약 37 %이다.
실시예 1 인간 피부 및 마우스 배아 섬유아세포에 대한 서팍틴의 항-노화 효과
재료 및 방법
1. 세포주
인간 피부 섬유아세포(CCD-966SK)는 BCRC로부터 No. 60153으로 구입하였다.
2. 마우스 BALB/3T3 배아(BALB/3T3 클론 A31)는 BCRC로부터 No. 60009로 구입하였다.
3. 동물
200 내지 250g의 무게를 갖는 단일-성별 BALB/cByJNarl 마우스는 기관 (National Laboratory Animal Center (Taiwan))으로부터 구입하였다. 실험 전반에 걸쳐, 상기 마우스는 12-h 광/암 사이클을 갖는, 냉난방 장치(75 %의 습도)를 갖고 온도-조정된(25 ℃) 케이지에 거주시키고 물 및 음식에 자유롭게 접근할 수 있게 한다(the Animal House of Department of Life Science, Ocean University).
4. 항-노화 유전자의 발현
(1) 인간 및 마우스 유전자의 cDNA 서열 클로닝
전체 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 인간 피부 섬유아세포 및 마우스 배아 섬유아세포로부터 추출하고, RNA 겔 전기영동에 의해 분석하고 인간 피부 섬유아세포 시르투인 1 및 시르투인 3 및 마우스 배아 섬유아세포 시르투인 1의 증폭을 위해 RT-PCT에 적용하였다. GeneBan을 사용하여 널리 공지된 시르투인의 서열을 확인하였고 GCG 프로그램을 사용하여 높은 유사성을 갖는 서열에 대해 검색하였다. 프라이머 세트는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 이어서 반응 생성물의 소분획의 1.2 % 아가로스 겔 전기영동으로 증폭된 예상된 생성물을 확인하기 위해 디자인하였다. 일단 확인되면, 나머지 생성물은 저융점 한천 겔 전기영동에 적용하였고, 상기 생성물은 겔로부터 절단하고 특정 크기의 DNA 단편은 클로닝을 위해 겔 추출에 의해 정제하였다. 정제된 DNA 단편은 컴피턴트 세포로 형질전환시키기 전에 클로닝 벡터 pGEM-T-easy 벡터(pGEM-T-easy 클로닝 키트, Promega, USA)와 연결하였다. 최종적으로, 소규모 배양 후, 클로닝 벡터는 서열 분석을 위해 추출하였고, 서열 데이터는 NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하여 비교하였다. 인간 피부 섬유아세포 시르투인 1 및 시르투인 3 및 마우스 배아 섬유아세포 시르투인 1의 일부를 상기 언급된 클로닝 과정에 의해 올바르게 클로닝하고 선택된 클론은 다시 향후 실험을 위한 고순도의 플라스미드 추출을 위해 컴피턴트 세포로 형질전환시켰다.
(2) 세포 전체 RNA의 추출
RNA는 RNase에 의해 천연 환경에서 용이하게 분해시키고 따라서 사용된 모든 도구는 실험을 수행하기 전에 오토클레이빙하고 오븐에서 건조시켜야 하고 과정 동안에 장갑 및 마스크를 착용해야 한다. 800 μL의 TRIzolTM 시약을 실험 그룹의 배양 접시에 신속하게 첨가하고 세척 제거된 세포를 멸균 튜브로 전달한다. 클로로포름을 TRIzolTM 시약의 총 용적의 5분 1의 용적으로 튜브에 첨가하고 30초 동안 왕성하게 진탕시킨다. 15분 동안 실온에서 항온처리 한 후, 4 ℃에서 15분 동안 13200 rpm에서 원심분리하고 상등액을 새로운 1.5 mL의 에펜도르프에 전달한다. RNA는 상기 상등액의 수성상에 존재한다. 상등액을 또 다른 세정된 1.5 mL의 에펜도르프에 전달하고 TRIzolTM 시약 및 고염 용액(1.2 M 염화나트륨 및 0.8 M 시트르산나트륨 시트레이트)의 2분의 1의 용적으로 이소프로판올을 첨가하고, 잘 혼합하고 30분 동안 -20 ℃에서 항온처리함에 이어서 RNA를 침전시키기 위해 4 ℃에서 15분 동안 13200 rpm에서 원심분리하고; 상등액을 주의깊게 제거하고 세척하기 위해 800 μL의 100 % 무수 에탄올을 첨가하고 100 % 에탄올로 세척하기 전에 4 ℃에서 10분 동안 13200 rpm에서 원심분리한다. 상등액을 주의깊게 제거하고 5분 동안 55 ℃에서 RNA 침전물을 건조시킨다. 15 μL의 DEPC 물에 RNA 침전물을 용해시키고 10분 동안 55 ℃에서 항온처리하고 향후 사용을 위해 -80 ℃ 동결기에 저장한다.
(3) RNA의 농도 및 순도 측정
분광측정기를 사용하여 OD260을 측정하고 RNA의 농도를 계산하고, 1 OD260 = 40 ㎍의 RNA/mL 및 40 ㎍ × 희석 인자 × A260 = ㎍/mL. RNA의 순도는 OD260/OD280의 비율을 기준으로 결정하고, 1.9 내지 2.0의 수는 고순도 RNA를 지적한다.
(4) 역전사(RT)
200 μL의 에펜도르프에 총 5 ㎍의 RNA를 위치시키고 상기 용적을 DEPC 물로 13 μL로 조정하고, 1 μL의 올리고(dT) 18, 10 mM dNTP를 첨가하고 빙상에서 항온처리한다. 4 ㎕의 5 × AMV 완충액 및 1 ㎕의 AMV(40 유니트/μL)를 첨가하고 잘 혼합한다. 60분 동안 42 ℃에서 cDNA를 합성함에 이어서 10분 동안 70 ℃에서 항온처리하여 반응을 종료시킨다.
(5) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)
Taq 폴리머라제를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 RT로부터 수득된 cDNA 주형을 증폭시킨다. 1 μL의 cDNA를 0.5 μL의 10 mM dNTP, 2.5 ㎕의 10 × PCR 완충액, 유전자 특이적 프라이머(GSP)(각각 0.5 μL), 0.25 μL의 Taq 폴리머라제와 혼합하고 멸균수를 사용하여 상기 용적을 25 μL로 조정한다. 반응 튜브를 PCR 기계(DNA 열 사이클러; Applied Biosystems 2720 열 사이클러)에 위치시키고 하기의 조건을 사용하여 증폭시킨다: 2분 동안 94 ℃ 초기 변성; 30초 동안 94 ℃ 변성; 30초 동안 64 ℃ 어닐링; 총 30 사이클 동안 1분 동안 72 ℃ 연장 및 4 ℃에서 저장. 5 내지 15 μL의 PCR 생성물을 취하고 1.5 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고, 10분 동안 EtBr로 염색시키고 10분 동안 물에서 탈염색한다. 디지탈 겔 이미지 시스템을 사용하여 이미지를 검사하고 UN-SCAN-IT 겔 - 겔 분석 소프트웨어 버젼 6.1 정량적 분석에 의해 광을 포획한다.
(6) 실시간 정량(PCR)
형광 염료 SYBR 녹색 I는 이중-나선 DNA의 그루브에 매립하고 할로겐 광에 의해 여기되는 경우 형광을 발생시킬 수 있고 이어서 이의 강도가 측정될 수 있다. SYBR 녹색 I가 이중-나선 DNA의 그루브에 매립되지 않는 경우, 이의 형광 백그라운드 값은 매우 낮고; 이것이 증폭된 표적 유전자 서열로 통합되기 시작하는 경우, 이에 따라 SYBR 녹색 I의 형광 시그날은 또한 증가한다. 비-특이적 프라이머에 결합하지 않거나 게놈 DNA의 오염 없이, PCR 과정은 (1) 증폭 생성물이 기하급수적으로 합성되는 기하급수적 단계; (2) 반응물이 불충분하고 생성물이 기하급수적으로 합성되지 않는 경우 선형 단계 및 (3) 모든 반응물이 소비되고 효과적이지 않는 경우 최종 정체기 상으로 분류될 수 있다. 따라서, 조직 기관에서 표적 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해, PCR의 기하급수적 단계 동안에 정량만이 정확한 데이터를 제공할 수 있다. 실시간 정량 PCR의 원리는 동일한 PCR 조건하에 및 상이한 주형 농도의 존재하에, 보다 높은 농도의 주형은 비교작 낮은 농도에서의 주형보다 신속하게 기하급수적 단계에 도달하고 반응의 시그날이 역치를 교차하는 사이클 수는 문자 그대로 CT(역치 사이클)로서 정의되고, CT 값은 주형 농도가 감소함에 따라 증가한다는 것이다. 상이한 농도에서의 표준물을 사용하여 실시간에서 PCR 반응의 CT 값을 정량하는 것이고 표준 곡선 및 회귀 방정식은 특이적 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하고 시험 샘플에서 유전자 발현의 절대적 수준을 외삽에 의해 계산하는 것이다. 용융 곡선이 또한 요구되는 경우, 용융 온도 40 ℃ 내지 99 ℃에서 연속적 형광 검출은 표적 유전자의 증폭 사이클 후 수행될 수 있고 용융 곡선의 분석은 프라이머 자가-상보성(프라이머-이량체)이 존재하거나 프라이머 특이성이 존재하는지의 이해를 가능하게 하고 정량적 정확도를 평가하는 것을 도와준다.
96웰 PCR 플레이트에 대해 지정된 동결기 박스에 96웰 PCR 플레이트를 위치시키고 4 ℃에서 예비 냉각시키고, 각각 10 μL의 SYBR 녹색, 4 μL의 실시간 PCR 특이적 프라이머(표 1), PCR 반응에 대한 주형으로서 2 μL의 RT 생성물을 첨가하고 96웰 PCR 플레이트 필름으로 밀봉하고 이어서 4 ℃에서 3분 동안 1500 rpm에서 원심분리하였다. 샘플은 PCR 플레이트의 바닥에 있다. 실시간 PCR 기계(Roche 광사이클러 480 실시간 PCR)에 플레이트를 위치시키고 하기의 조건을 설정한다: 5분 동안 95 ℃에서 고온 개시하고, 30초 동안 95 ℃에서 증폭시키고 총 40 사이클 동안 30초 동안 60 ℃에서 어닐링하고 형광을 연속으로 측정하여 증폭된 생성물이 모두 동일한 변성 온도에 있는지를 결정한다. 반응의 완결 후 Roche 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 실험으로부터 수득된 데이터는 SPSS 소프트웨어를 사용하여 분석하고 변동량의 원-웨이 분석 및 유의적인 차이는 두칸 다중 범위 시험(Duncan's Multiple Range Test)(p<0.05)을 기준으로 비교하였다. 수득한 데이터는 평균 ± SD로서 나타낸다.
[표 1]
실시간 PCR 특이적 프라이머
Figure pct00001
*: 역 프라이머
표 1에서 프라이머는 하기와 같이 제공된 서열 목록에서 번호를 매긴다:
마우스 RSP 16-F: 서열번호 2; 마우스 RSP 16-R: 서열번호 3; 마우스 SIT1-F: 서열번호 4; 마우스 SIT1-R: 서열번호 5; 인간-GAPDH-F: 서열번호 6; 인간-GAPDH-R: 서열번호 7; 인간-SIT1-F: 서열번호 8; 인간-SIT1-R: 서열번호 9; 인간-SIT3-F: 서열번호 10; 인간-SIT3-R: 서열번호 11; T7: 서열번호 12; SP6*: 서열번호 13; 올리고 d(T)*: 서열번호 14.
결과
서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 장기 생존 세르투인 1 유전자의 발현 및 증식을 증진시킨다
도 1로부터, 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 장기 생존 유전자 세르투인 1의 발현을 촉진시킬 수 있다. 소정의 상이한 농도의 서팍틴의 경우에, 상이한 농도는 마우스 배아 섬유아세포에서 세르투인 1 유전자의 발현에 대해 상이한 효과를 갖고; 6시간 동안 서팍틴으로 처리한 후, 50 μM 및 75 μM의 서팍틴 둘다는 마우스 배아 섬유아세포에서 세르투인 1 유전자의 발현을 증진시키고; 12시간 동안 서팍틴으로 처리한 후, 25 μM의 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 세르투인 1 유전자의 발현 증진을 보여주고; 36시간 동안 서팍틴으로 처리한 후, 50 μM 및 100 μM의 서팍틴 둘다는 마우스 배아 섬유아세포에서 세르투인 1 유전자의 발현 증진을 보여주고; 48시간 동안 서팍틴으로 처리한 후, 50 μM의 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 세르투인 1 유전자의 발현 증진을 보여주고, 이중에서, 50 μM의 서팍틴은 세르투인 1 발현의 증진에서 최상의 효과를 입증한다.
도 2는 마우스 배아 섬유아세포 증식에 대한 레스베라트롤, 팔미토일 펜타펩타이드-3 및 서팍틴의 효과를 보여주고 상기 결과는 서팍틴이 마우스 배아 섬유아세포 증식을 증진시킬 수 있음을 지적하고; 더욱이, 75 μM의 서팍틴에 이어서 50 μM의 서팍틴은 세포 증식을 유도하는데 최상의 효과를 갖는다. 추가로, 서팍틴은 레스베라트롤 및 팔미토일 펜타펩타이드-3과 비교하는 경우 세포 증식을 유도하는데 보다 우수한 효과를 갖는다.
실시예 2 서팍틴은 항- 광노화 및 항-산화 효과를 갖는다.
1. 서팍틴은 항-광노화 복구 기능을 갖는다
마우스 배아 섬유아세포의 계대배양 및 접착을 위한 4시간 동안의 항온처리 후, 세포는 UV 광 하이브리드화 박스에서 0 J/cm2, 10 J/cm2 및 15 J/cm2의 에너지 밀도로 UV-A에 의해 조사하고 이어서 25, 50, 75, 100 및 125 μM의 서팍틴을 첨가한다. 24시간 동안 항온처리한 후, 세포 생존율은 MTT 방법에 의해 측정하였다.
도 3으로부터, 서팍틴은 항-광노화 복구 기능을 갖는다. 10 J/cm2의 에너지 밀도로 UV 광에 의한 조사 후, 25, 50, 75, 100 및 125 μM의 서팍틴 모두는 세포 생존율을 증가시킬 수 있고 이중에서 75 μM의 농도는 최상의 보호를 보여준다. 더욱이, 15 J/cm2의 에너지 밀도에서 UV 광에 의한 조사 후, 25, 50, 75, 100 및 125 μM의 서팍틴 모두는 세포 생존율을 증가시킬 수 있고 이중에서 50 μM의 농도는 최상의 보호를 보여준다.
2. 서팍틴은 항-산화 복구 기능을 갖는다
마우스 배아 섬유아세포의 계대배양 및 접착을 위한 4시간 동안의 항온처리 후, 과산화수소를 사용하여 산화 공급원으로서 세포를 처리하였다. 세포는 또 다른 24시간 동안 25, 50, 75 및 100 μM의 서팍틴 첨가 전에 100, 150, 200 및 250 μM의 과산화수소로 처리하였다. 세포 생존율은 MTT 방법에 의해 측정하였다.
도 4로부터, 서팍틴은 과산화수소로 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 생존율을 증가시킬 수 있고 25, 50 및 75 μM의 서팍틴 모두는 우수한 보호 효과를 갖고 이중에서 75 μM은 가장 유의적인 보호를 보여준다.
실시예 3 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 콜라겐의 생성을 유도한다
1. 콜라겐 농도의 분석
SircolTM 가용성 콜라겐 검정 키트는 배양 배지에서 콜라겐의 총 농도를 분석하기 위해 사용하고 일반 방법은 다음과 같이 기재된다:
별도의 1.5 mL의 원심분리 튜브에서 상이한 농도의 0.1 ml의 시험 샘플 및 표준물을 위치시킨다. 1 mL의 염료 시약을 첨가하고 35분 동안 볼텍싱함에 이어서 10분 동안 12000 rpm에서 원심분리하고 상등액을 제거한다. 튜브의 측면에서 잔류수를 주의깊게 제거하여 침전물과의 접촉을 회피한다. 1 mL의 알칼리 시약은 침전물을 용해시키기 위해 첨가하고 색상이 발색된 후 0.2 mL를 96웰 플레이트에 전달하고 ELISA 판독기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 콜라겐 농도를 증가시킬 수 있다
도 5로부터, 서팍틴은 마우스 배아 섬유아세포에서 콜라겐 증식을 유도할 수있다. 대조군 그룹의 인산 완충 식염수(PBS)와 함께 배양되는 세포와 비교하는 경우, 25, 50, 75 및 100 μM의 농도에서 서팍틴 모두는 콜라겐 증식을 증가시키는데 큰 효과를 갖고 이중에서 100 μM의 농도는 최상의 결과를 보여준다. 대안적으로, 팔미토일 펜타펩타이드-3(PPP-3)이 또한 세포에서 콜라겐 함량을 증가시킬 수 있지만, 이의 효과는 서팍틴의 결과와 비교하는 경우 서팍틴 처럼 양호하지 못한 것으로 보인다.
실시예 4 서팍틴은 매트릭스 메탈로펩티다제 9의 활성을 억제한다
1. 매트릭스 메탈로펩티다제 9의 억제
마우스 배아 섬유아세포를 계대배양한 후, 시판되는 활성 항-주름 물질인, 3, 5, 및 10 μM의 팔미토일 펜타펩타이드-3을 첨가하고 25, 50, 75 및 100 μM의 서팍틴으로 항온처리된 세포와 비교하였다. Abnova MMP-9(마우스) ELISA 키트 및 ELISA 판독기는 세포에서 매트릭스 메탈로펩티다제 9의 농도의 분석을 위해 사용하였다.
2. 서팍틴은 매트릭스 메탈로펩티다제의 활성을 억제할 수 있다
도 6으로부터, 50, 75 및 100 μM의 서팍틴은 모두 매트릭스 메탈로펩티다제의 활성을 억제할 수 있고 이중에서 50 μM의 서팍틴은 최상의 억제 효과를 보여준다.
실시예 5 서팍틴은 화장품의 피부 침투를 증진시킨다
1. 실험 방법
실험 전에, 마우스의 등을 면도하였다. 6 내지 8주령의 마우스는 (Zoletil)을 사용하여 복강내 주사에 의해 마취시키고 전기 면도기로 등을 면도하기 전 동물을 납작하게 눕히고 털 제거 크림을 사용하여 나머지 털을 제거한다. 동물을 가온 광을 갖는 케이지에 위치시키고 각각의 케이지에 물을 제공한다. 2개 그룹을 실험에 포함시키고, 100 ㎕의 PBS(pH = 7.4)를 1 cm2 멸균 면에 첨가하고 마우스의 등에 부착시키기 전에 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 HA 또는 덱사메타손과 혼합하고; 실험 그룹에 대해, FITC-표지된 HA 또는 덱사메타손은 1시간 동안 0, 0.2, 0.5, 1, 2 및 5 %의 서팍틴과 혼합하였다.
1시간 처리 말기에, 마우스를 CO2 질식시켜 희생시키고, 에탄올을 사용하여 피부상에 약물 잔류물을 세정하고 등에서 피부를 절단하고 생물조직부분(CM-2000, Leica, Germany)에 대해 최적의 절단 온도 화합물(O.C.T)(SAKURA®,Japen)에 매립하였다.
2. 서팍틴은 덱사메타손의 피부 침투를 증진시킨다
도 7로부터, 서팍틴은 덱사메타손의 피부 침투를 증진시키고; 형광 강도의 관찰은 피부를 통해 침투된 덱사메타손의 양을 평가할 수 있고; 형광 강도가 높을수록, 피부의 덱사메타손 흡수를 보다 증가시키고; 도 7(B), (C), (D) 및 (E) 모두는 도 7(A) 보다 큰 형광성을 나타내고, 이는 0.2, 0.5, 1 및 2 % 서팍틴이 덱사메타손의 피부 침투를 증진시킬 수 있음을 지적한다.
3. 서팍틴은 습윤화 인자 하이알루론산(HA)의 피부 흡수를 증진시킨다
도 8을 기준으로, 서팍틴은 피부에 의한 하이알루론산(HA) 흡수를 증가시킬 수 있고; 형광 강도가 높을수록 피부의 HA 흡수를 증가시키고; 도 8(A)는 최고 형광 강도를 보여주고, 1 %의 서팍틴이 습윤화 인자 HA의 피부 흡수를 증진시키는 것에 대해 최상의 효과를 가짐을 지적한다.
4. 서팍틴은 습윤화 인자 감마-폴리글루탐산(γ-GPA)의 피부 흡수를 증진시킨다
도 9로부터, 서팍틴은 γ-GPA의 피부 흡수를 증진시킬 수 있고, 형광 강도가 높을수록 피부의 γ-GPA 흡수를 보다 증진시키고; 도 9(B), (C), (D), (E), (F) 및 (G)는 모두 대조군 그룹(A) 보다 더 형광성임을 보여주었고; 이는 1, 2, 5, 10, 15 및 20 %의 서팍틴 모두가 γ-GPA의 피부 흡수를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
5. 서팍틴은 골드-나노입자(2nm)의 경피 침투를 증진시킨다
본원 발명자는 골드 나노입자 및 서팍틴의 혼합물을 특정 기간 동안 마우스의 피부에 적용하였고 생물 조직 부분에 대해 피부를 수거하였다. 골드 나노입자는 자가-발광이기 때문에, 광학 현미경을 사용하여 피부의 상피 및 진피에서 골드 나노입자의 형광 함량을 관찰할 수 있다. 상기 결과는 통상적인 방법에 의해 수득된 피부 케어 페이스트가 이의 내부 겔-매쓰형 또는 겔-번들형 구조로 인해 피부에 의한 골드 나노입자 흡수에 도움이 되지 않음을 지적했고 따라서 골드 나노입자는 단지 상피에서 발견되었다. 한편, 12.5 ppm 서팍틴의 첨가는 골드 나노입자의 경피 흡수를 상당히 증진시킬 수 있다(도 10).
상기 결과에 따라, 본 발명의 서팍틴은 화학적으로 합성된 계면활성제를 대체할 수 있고 TDDA 시스템에 광범위하게 적용될 수 있다.
실시예 6 서팍틴의 유화력의 분석
유화력은 계면활성제의 중요한 지표 중 하나이고 본 발명은 쿠퍼 등(Cooper et al)에 의해 공개된 방법을 사용하여 디젤에서 계면활성제의 유화 지수를 측정하였다. 상이한 농도의 조 서팍틴은 pH 6.4, 7.4 및 8.4의 완충액 중에 용해시키고 2 ml의 용해된 혼합물은 3 ml의 디젤을 함유하는 시험 튜브에 첨가하고 2분 동안 볼텍싱하고 측정 전 24시간 동안 실온에서 항온처리한다. 용액의 총 높이 분에 유화상의 높이에 100 %를 곱한 비율은 시험 용액의 유화 지수를 제공한다. 오일 생성물의 유화력은 유화 지수(E24)로서 나타내고, 여기서 E24의 수학식은 다음과 같이 나타낸다:
E24(%)= (유화상의 높이/용액의 총 높이) × 100 %.
도 11로부터, pH=7.4에서 최상의 유화력을 갖고; 더욱이 pH 7.4 및 160 ㎍/ml의 농도에서, 서팍틴은 최상의 유화력을 갖는다.
실시예 7 서팍틴은 발포제로서 사용될 수 있다
1. 발포력의 분석
계면활성제는 낮은-발포 제제이고 본 발명은 조 서팍틴의 발포 성질을 조사하였다. 라자핀드랄암보 등(Razafindralambo et. al)에 의해 개발된 방법을 참조하고 상이한 농도의 조 서팍틴은 7.4의 pH를 갖는 완충액 중에 용해시켰고, 2분 동안 볼텍싱하고 이어서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서 발포의 높이를 측정하고 발포력은 액체의 총 높이를 발포의 최대 높이로 나눔에 의해 수득된 발포 최대 밀도(MD)로서 표현된다.
2. 서팍틴은 발포제로서 사용될 수 있다
서팍틴은 통상의 계면활성제의 발포력 및 유화력을 포함하는 다수의 생물학적 성질을 갖는다(문헌참조: Razafindralambo et al., 1998). 소위 발포 효과는 서팍틴이 가스와 액체 상 사이의 계면에 존재함을 언급하고 격렬한 진탕은 계면활성제가 공기를 포집하여 내부에 공기와 함께 얇은 필름을 형성하도록 한다(문헌참조: Halling, 1981). 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) TH에 의해 생성된 서팍틴이 발포능을 갖는지를 조사하였고 상기 결과는 완충액으로 150 ㎍ 초과의 서팍틴의 첨가가 MD 값을 감소시키지 않았고 최소 1.23이었고(도 12 참조), 이것은 탈이온수에 첨가된 서팍틴의 농도가 임계적 마이셀 농도(CMC)에 도달하기 때문일 수 있고 서팍틴은 마이셀을 형성하고 상기 용액 중에서는 단지 단량체를 형성한다. 도 13은 서팍틴의 농도와 발포 높이 간의 관계를 보여준다. 라자핀드랄암보 등은 서팍틴의 MD 값이 0.10 정도로 낮을 수 있고 서팍틴이 이투이른 A와 비교하는 경우 보다 우수한 발포 효과를 제공하고; 따라서, 상기 구조는 발포 성질에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 시사하였다. 서팍틴은 음이온 계면활성제에 속하고 이의 지방산 탄소쇄는 보다 짧고 이투이른 A는 보다 긴 지방산 쇄를 갖는 비-이온성 계면활성제이다(문헌참조: Razafindralambo, et al., 1998). 바이러스 서브틸리스 TH에 의해 생산된 서팍틴은 발포력을 소유하고 세제, 샴푸 및 핸드 워시 겔과 같은 개인 스킨 케어 제품을 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 8 평활화제로서의 서팍틴
서팍틴은 플러슁 동안에 양호한 부드러운 느낌을 보여주고 있지만; 낮은 농도에서, 코아세르베이트가 발생할 수 있다.
1. 서팍틴은 탁도를 감소시킬 수 있다
(1) 샴푸의 상대적 농도를 0.01-1.0으로 조정한다
상대적 농도 = 샴푸 액체(g)/(샴푸 액체(g) + 물(g))
(2) 420 ml의 용액의 투과율(%, 40 ℃에서 온도)를 측정하고(1) 탁도는 =100 - 투과율(%)로서 나타낸다.
도 14를 기준으로, 세제에 사용되는 통상의 유화제, 나트륨 라우레쓰 설페이트와 비교하는 경우, 본 발명의 서팍틴은 샴푸의 탁도를 추가로 감소시킬 수 있고 부드러운 느낌을 증가시킬 수 있다.
2. 서팍틴은 코아세르베이트를 형성한다
플러슁 동안에, 서팍틴은 우수한 부드러운 느낌을 보여주지만; 코아세르베이트는 낮은 농도에서 일어난다.
도 15로부터, 중합체-계면활성제 복합체, 즉, 코아세르베이트로 희석시킨 후, 서팍틴 함유 샴푸는 침전물을 형성하고 따라서 마찰 민감성을 감소시키고 부드러운 느낌을 증가시킨다.
본 발명의 이전의 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공되고 본 발명은 보여지는 바람직한 구현예로 제한되지 않는다. 본 발명의 취지내 임의의 변화 또는 변형은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> SAFT BIOTECHNOLOGY COM. LTD and LU, Jenn-Kan <120> Applications of surfactin in cosmetic products and thereof <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus subtilus <400> 1 Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu 1 5 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse RSP 16-F <400> 2 ctgggtatct tgactaagcc tgac <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse RSP 16-R <400> 3 agttctccac ctctttctca atcc <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse SIT1-F <400> 4 tgtggctcca tcctacct <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Mouse SIT1-R <400> 5 cattcctggg acgcttat <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-GAPDH-F <400> 6 atgaggtgca tcgccctctt t <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-GAPDH-R <400> 7 tcaggcaaaa gctttctctc g <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-SIT1-F <400> 8 ggbgactact tggacatyct ggc <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-SIT1-R <400> 9 ttgctccaca catatttrcc rc <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-SIT3-F <400> 10 ggatttggac gtgcgaccaa <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-SIT3-R <400> 11 cgtgtcagtg ctgtgtcgct <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> T7 <400> 12 taatacgact cactataggg <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> SP6* <400> 13 atttaggtga cactatagaa t <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligo d(T)* <400> 14 tttttttttt tttttttt

Claims (43)

  1. 유효 용량의 화장품 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 항-노화 치료 방법으로서, 상기 조성물은 서팍틴(surfactin), 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 서팍틴이 β-하이드록시 지방산에 연결된 헤파펩타이드 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu를 포함하는 사이클로지방족 펩타이드이고 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 3 %;
    (2) C13 > 0.65 %;
    (3) 이소-C14 > 17 %;
    (4) C14 < 41 %; 및
    (5) 이소-C15 < 11 %.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 10 %;
    (2) C13 > 25 %;
    (3) 이소-C14 > 35;
    (4) C14 < 25 %; 및
    (5) 이소-C15 < 3 %.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법: (1) 이소-C13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 = 37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 서팍틴의 분자량이 1022 또는 1036 Da인, 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 서팍틴이 이의 이성체를 포함하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 항-노화 화장품 조성물이 하기의 성분들 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법: 알콜, 에스테르, 복합 폴리사카라이드, 견과유, 및 비타민.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 알콜이 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: C16-18 알콜, 부탄디올, 펜탄디올, 옥탄디올, 글리세린, 헥사데칸올, 스테아릴 알콜, 1-도코사놀 및 프로필렌 글리콜.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 에스테르가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 방법: OLIVEM 1000, 글리세롤 모노스테아레이트(GSM), 이소프로필 미리스테이트(IPM), 이소프로필 팔미테이트(IPP) 및 트리글리세리드.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 복합 폴리사카라이드가 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 크산탄 고무, 트레멜라 푸시포르미스(Tremella fuciformis) 폴리사카라이드, 덱스트란 폴리사카라이드, 및 폴륨 세나 씨드(Folium sennae seed) 폴리사카라이드.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 견과유가 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 아르간유, 쿠쿠이 견과유, 아보카도유, 밀배야유, 및 올리브유.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 비타민이 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 F, 및 비타민 K.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 항-노화 화장품 조성물이 섬유아세포 증식, 콜라겐 생산 또는 세르투인 1 유전자 발현을 촉진시키기 위해 사용되는, 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 항-노화 화장품 조성물이 UV 광 또는 항-산화에 의해 유도되는 광노화를 예방하기 위해 사용되는, 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 항-노화 화장품 조성물이 매트릭스 메탈로펩티다제를 억제하기 위해 사용되는, 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 매트릭스 메탈로펩티다제가 매트릭스 메탈로펩티다제 9인, 방법.
  17. 서팍틴을 사용함에 의해 피부 침투를 개선하기 위한 조성물의 제조 방법으로서, 상기 조성물이 서팍틴 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 및 보조제를 포함하는, 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 서팍틴이 β-하이드록시 지방산에 연결된 헤파펩타이드 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu를 포함하는 사이클로지방족 펩타이드이고 상기 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 3 %;
    (2) C13 > 0.65 %;
    (3) 이소-C14 > 17 %;
    (4) C14 < 41 %; 및
    (5) 이소-C15 < 11 %.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 10 %;
    (2) C13 > 25 %;
    (3) 이소-C14 > 35 %;
    (4) C14 < 25 %; 및
    (5) 이소-C15 < 3 %.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법: (1) 이소-C 13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 = 37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %.
  21. 제 17항에 있어서, 상기 서팍틴의 분자량이 1022 또는 1036 Da인, 방법.
  22. 제 17항에 있어서, 상기 서팍틴이 이의 이성체를 포함하는, 방법.
  23. 제 17항에 있어서, 상기 조성물이 하기의 성분들 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법: 알콜, 에스테르, 복합 폴리사카라이드, 견과유, 및 비타민.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 알콜이 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: C16-18 알콜, 부탄디올, 펜탄디올, 옥탄디올, 글리세린, 헥사데칸올, 스테아릴 알콜, 1-도코사놀 및 프로필렌 글리콜.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 에스테르가 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: OLIVEM 1000, 글리세롤 모노스테아레이트(GSM), 이소프로필 미리스테이트(IPM), 이소프로필 팔미테이트(IPP) 및 트리글리세리드.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 복합 폴리사카라이드가 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 크산탄 고무, 트레멜라 푸시포르미스 폴리사카라이드, 덱스트란 폴리사카라이드, 및 폴륨 세나 씨드 폴리사카라이드.
  27. 제 23항에 있어서, 상기 견과유가 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 아르간유, 쿠쿠이 견과유, 아보카도유, 밀 배아유, 및 올리브유.
  28. 제 23항에 있어서, 상기 비타민이 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 방법: 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 F, 및 비타민 K.
  29. 제 17항에 있어서, 상기 조성물이 화장품 성분의 피부 침투를 촉진시키기 위해 사용되는, 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 화장품 성분이 덱사메타손인, 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 화장품 성분이 하이알루론산인, 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 상기 화장품 성분이 감마-폴리글루탐산인, 방법.
  33. 제 29항에 있어서, 상기 화장품 성분이 골드-나노입자인, 방법.
  34. 서팍틴을 사용하여 유화 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 조성물이 서팍틴 및 약제학적으로 허용되는 비히클, 부형제, 희석제 및 보조제를 포함하는, 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 서팍틴이 β-하이드록시 지방산에 연결된 헤파펩타이드 (L)Glu-(L)Leu-(D)Leu-(L)Val-(L)Asp-(D)Leu-(L)Leu를 포함하는 사이클로지방족 펩타이드이고 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 3 %;
    (2) C13 > 0.65 %;
    (3) 이소-C14 > 17 %;
    (4) C14 < 41 %; 및
    (5) 이소-C15 < 11 %.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법:
    (1) 이소-C13 > 10 %;
    (2) C13 > 25 %;
    (3) 이소-C14 > 35 %;
    (4) C14 < 25 %; 및
    (5) 이소-C15 < 3 %.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 서팍틴의 지방산 말단에서 지방산의 분포가 다음과 같은, 방법: (1) 이소-C13 = 11 %; (2) C13 = 26 %; (3) 이소-C14 =37 %; (4) C14 = 24 %; 및 (5) 이소-C15 = 2 %.
  38. 제 34항에 있어서, 상기 서팍틴의 분자량이 1022 또는 1036 Da인, 방법.
  39. 제 34항에 있어서, 상기 서팍틴이 이의 이성체를 포함하는, 방법.
  40. 제 34항에 있어서, 상기 유화 조성물이 하기 성분 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법: 글리세롤 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 슈크로스 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르 및 렉시틴.
  41. 제 34항에 있어서, 상기 유화 조성물이 발포력을 증가시키기 위한 것인, 방법.
  42. 제 34항에 있어서, 상기 유화 조성물이 유화를 증가시키기 위한 것인, 방법.
  43. 제 34항에 있어서, 상기 유화 조성물이 부드러운 느낌을 증가시키기 위한 것인, 방법.
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