DE69727589T2

DE69727589T2 - Mutanten des KERATINOCYTEN-WACHSTUMSFAKTOR-2 (KGF-2 ODER FIBROBLASTENWACHSTUMSFAKTOR-12,FGF-12)

Info

Publication number: DE69727589T2
Application number: DE69727589T
Authority: DE
Inventors: Roxanne Duan; M. Steven RUBEN; Pablo Jimenez; A. Mark RAMPY; Donna Mendrick; Jun Zhang; Jian Ni; A. Paul MOORE; A. Timothy COLEMAN; Reiner L. Gentz
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: EP0950100A1; AU3977097A; DK0950100T3; DE69727589D1; ATE259420T1; WO1998006844A1; CN1234071A; AU739773B2; JP2000517174A; KR20000029986A; ES2212121T3; NZ333725A; EP0950100B1; CA2263143A1; PT950100E

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die von derartigen Polynucleotiden codiert werden, die Verwendung derartiger Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung derartiger Polynucleotide und Polypeptide. Genauer gesagt, sind die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Mutanten des Keratinocyten-Wachstumsfaktors, manchmal nachstehend als „KGF-2" bezeichnet und auch früher als Fibroblasten-Wachstumsfaktor-12 (FGF-12) bekannt. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung derartiger Polypeptide. Diese Erfindung betrifft ferner die therapeutische Verwendung von KGF-2-Mutanten zur Förderung oder Beschleunigung der Wundheilung. Diese Erfindung betrifft neue Mutantenformen von KGF-2, die erhöhte Aktivität, erhöhte Stabilität, höheren Ertrag oder bessere Löslichkeit zeigen. Zusätzlich betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Reinigung der KGF-2-Mutanten.
Hintergrund der Erfindung
Die Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren entstammt der großen Familie der Wachstumsfaktoren, die am Wachstum und der Regeneration von weichem Gewebe beteiligt ist. Derzeit schließt sie mehrere Mitglieder ein, die einen variierenden Homologiegrad auf Proteinebene teilen und die mit einer Ausnahme ein ähnlich breites mitogenes Spektrum aufzuweisen scheinen, d. h. sie fördern die Proliferation einer Reihe von Zellen mesodermalen und neuroektodermalen Ursprungs und/oder fördern die Angiogenese.
Das Expressionsmuster verschiedener Mitglieder der Familie ist sehr unterschiedlich, und reicht von äußerst begrenzter Expression einiger Entwicklungsstadien bis zu einer ziem lich ubiquitären Expression in einer Reihe von Geweben und Organen. Alle Mitglieder scheinen Heparin und Heparinsulfatprotoglycane und Glycosaminoglycane zu binden und sich stark in der extrazellulären Matrix zu konzentrieren. KGF wurde ursprünglich als Mitglied der FGF-Familie durch Sequenzhomologie oder Reinigung und Clonierung des Faktors identifiziert. Der Keratinocyten-Wachstumsfaktor (KGF) wurde als Mitogen für eine gezüchtete Maus-Keratinocytenlinie isoliert (Rubin, J. S. et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 86: 802–806 (1989)). Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern der FGF-Familie übt er wenig Aktivität auf Mesenchym-abstammende Zellen aus, aber er stimuliert das Wachstum von Epithelzellen. Das Gen des Keratinocyten-Wachstumsfaktors codiert ein Polypeptid mit 194 Aminosäuren (Finch, P. W. et al., Science 245: 752–755 (1989)). Die N-terminalen 64 Aminosäuren sind einzigartig, aber der Rest des Proteins besitzt etwa 30% Homologie zu bFGF. KGF ist das unterschiedlichste Mitglied der FGF-Famile. Das Molekül besitzt eine hydrophobe Signalsequenz und wird effizient sekretiert. Posttranslationale Modifikationen schließen die Spaltung der Signalsequenz und die N-verbundene Glycosylierung an einer Stelle ein, was zu einem Protein mit 28 kDa führt. Der Keratinocyten-Wachstumsfaktor wird von Fibroblasten produziert, die von der Haut und der fötalen Lunge stammen (Rubin et al. (1989)). Man fand heraus, dass die Keratinocyten-Wachstumsfaktor-mRNA in den Nieren, im Darm und Ileum von Erwachsenen, jedoch nicht im Gehirn oder in der Lunge exprimiert wird (Finch, P. W. et al. Science 245: 752–755 (1989)). KGF zeigt konservierte Bereiche innerhalb der FGF-Proteinfamilie. KGF bindet mit hoher Affinität an den FGF-2-Rezeptor.
Eine gehemmte Wundheilung ist eine wesentliche Quelle der Morbidität und kann zu solchen Komplikationen wie Deshiszenz, anastomotischen Zusammenbruch und nicht heilenden Wunden führen. Beim normalen Individuum erfolgt die Wundheilung ohne Komplikationen. Dagegen ist die beeinträchtigte Wundheilung mit verschiedenen Erkrankungen wie Diabetes, Infektionen, Immunsuppression, Adipositas und Mangelernährung assoziiert (Cruse, P. J und Foord, R., Arch. Surg. 107: 206 (1973); Schrock T. R. et al., Ann. Surg. 177: 513 (1973); Poole, G. U., Jr., Surgery. 97: 631 (1985); Irvin, G. L. et al., Am. Surg. 51: 418 (1985)).
Wundheilung ist das Ergebnis komplexer Interaktionen und biologischer Prozesse. Bei der normalen Wundheilung wurden drei Phasen beschrieben: akute inflammatorische Phase, Synthese der extrazellulären Matrix sowie Collagensynthese und Remodellierung (Peacock, E. E., Jr., Wound Repair, 2. Ausgabe, WB Saunders, Philadelphia (1984)). Der Vorgang bein haltet die Interaktion der Keratinocyten, Fibroblasten und inflammatorischen Zellen an der Wundstelle.
Die Geweberegeneration scheint von spezifischen Peptidfaktoren gesteuert zu werden, die die Migration und Proliferation der am Reparaturvorgang beteiligten Zellen regulieren (Barrett, T. B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6772–6774 (1985); Collins, T. et al., Nature 316: 748–750 (1985)). Somit können Wachstumsfaktoren vielversprechende Therapeutika bei der Behandlung von Wunden, Verbrennungen und anderen Hautstörungen sein (Rifkin, D. B. und Moscatelli, J. Cell. Biol. 109: 1–6 (1989); Sporn, M. B. et al., J. Cell. Biol. 105: 1039–1045 (1987); Pierce, G. F. et al., J. Cell. Biochem. 45; 319–326 (1991)). Die Sequenz des Heilungsprozesses wird während einer akuten inflammatorischen Phase mit der Ablagerung von provisorischem Gewebe initiiert. Darauf folgt die Reepithelialisierung, Collagensynthese und Ablagerung, Fibroblastenvermehrung und Neovaskularisation, von denen alle letztendlich die Remodellierungsphase definieren (Clark, R. A. F., J. Am. Acad. Dermatol. 13: 701 (1985)). Diese Ereignisse werden von Wachstumsfaktoren und Cytokinen beeinflusst, die von inflammatorischen Zellen oder von den an den Wundrändern lokalisierten Zellen sekretiert werden (Assoian, R. K. et al., Nature (Load.) 309: 804 (1984); Nemeth, G. G. et al., „Growth Factors and Their Role in Wound and Fracture Healing, „ Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing in Biological and Clinical Implications, New York (1988), S. 1–17).
Mehrere Polypeptidurchstumsfaktoren, einschließlich des Keratinocyten-Wachstumsfaktors (KGF) (Antioniades, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 565 (1991)), dem Thrombocyten-Wachstumsfaktors (PDGF) (Antioniades, H. el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 565 (1991); Staiano-Coico, L. et al., Jour. Exp. Med 178: 865–878 (1993)), dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) (Golden, M. A. et al., J Clin. Invest. 87: 406 (1991)), des sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktors (aFGF) (Mellin, T. N. et al., J Invest. Dermatol. 104: 850–855 (1995)), des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Whitby, D. J. und Ferguson, W. J., Dev. Biol. 147: 207 (1991)), des transformierenden Wachstumsfaktors a (TGF-α) (Gartner, M. H. et al., Surg. Forum 42: 643 (1991); Todd, R. et al., Am. J. Pathol. 138; 1307 (1991)), des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) (Wong, D. T. W. et al., Am. J. Pathol. 143: 622 (1987)), des Neu-Differentzierungsfaktors (rNDF) (Danilenko, D. M. et al., J Clin. Invest, 95; 842–851 (1995)), des insulinartigen Wachstumsfaktors I (IGF-1) und des insulinartigen Wachstumsfaktors Π (IGF-Π) (Cromack, D. T. et al., J. Surg. Res. 42: 622 (1987)) wurden identifiziert, an der Wundheilung beteiligt zu sein.
Es wurde berichtet, dass rKGF-1 in der Haut die epidermalen Keratinocyten, die Keratinocyten in den Haarfollikeln und den Talgdrüsen stimuliert (Pierce, G. F. et al., J. Exp. Med. 179: 831–840 (1994)).
Zusammenfassung der Erfindung
Hier werden Nucleinsäuremoleküle aufgeführt, die ein Polynucleotid umfassen, das den Keratinocyten-Wachstumsfaktor (KGF-2) codiert, der die in 1 [SEQ ID NR: 2] dargestellte Aminosäuresequenz besitzt, oder die Aminosäuresequenz, die von dem in einem bakteriellen Wirt als ATCC-Hinterlegungsnummer 75977 am 16. Dezember 1994 hinterlegten cDNA-Clou codiert wird. Die durch Sequenzieren des hinterlegten KGF-2-Clons bestimmte Nucleotidsequenz, die in 1 [SEQ ID NR: 1] dargestellt ist, enthält einen offenen Leserahmen, der ein Polypeptid mit 208 Aminosäureresten, einschließlich eines Initiationscodons bei den Positionen 1–3 mit einer vorhergesagten Leader-Sequenz von etwa 35 oder 36 Aminosäureresten und einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 23,4 kDa codiert. Die Aminosäuresequenz des reifen KGF-2 ist in 1 dargestellt; Aminosäurereste etwa 36 oder 37 bis 208 [SEQ ID NR: 2].
Das Polypeptid, das von derartigen Nucleinsäuren codiert wird, wurde vermutlich als Mitglied der FGF-Familie identifiziert. Genauer gesagt, wurde das Polypeptid vermutlich als KGF-2 aufgrund der Aminosäuresequenzhomologie mit anderen Mitgliedern der FGF-Familie identifiziert.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neuartige Mutanten der KGF-2-Polypeptide bereitgestellt, die biologisch aktiv und diagnostisch oder therapeutisch nützlich sind.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind menschlichen Ursprungs.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuremoleküle, die menschliche KGF-2 Mutanten codieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs und genomische DNA bereitgestellt, die biologisch aktiv sind und diagnostisch oder therapeutisch nützlich sind.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Polypeptids durch rekombinante Verfahren unter Verwendung rekombinanter Vektoren wie Clonierungs- und Expressionsplasmide bereitgestellt, die als Rea genzien in dem rekombinanten Verfahren der Proteine der KGF-2-Mutanten nützlich sind sowie rekombinante prokaryontische und/oder eukaryontische Wirtszellen, die die menschlichen Nucleinsäuresequenzen der KGF-2-Mutanten umfassen.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung eines derartigen Polypeptids oder eines derartigen Polynucleotids bereitgestellt, das ein derartiges Polypeptid für therapeutische Zwecke codiert, beispielsweise, um die Proliferation der Epithelzellen und basalen Keratinocyten für Wundheilungszwecke zu stimulieren und um die Haarfollikelproduktion und die Heilung von Hautwunden zu stimulieren. KGF-2 kann klinisch bei der Stimulation der Wundheilung, einschließlich Operationswunden, Schnittwunden, tiefe Wunden, die eine Schädigung der Dermis und Epidermis beinhalten, Wunden des Augengewebes, Wunden des Dentalgewebes, Wunden der Mundhöhle, diabetische Geschwüre, Hautgeschwüre, Cubitusgeschwüre, arterielle Geschwüre, Venenstaugeschwüre, Verbrennungen, die auf Hitzeexposition oder Chemikalien zurückzuführen sind, und anderen abnormen Zustände der Wundheilung wie Urämie, Mangelernährung, Vitaminmangel und Komplikationen, die mit einer systemischen Behandlung mit Steroiden, Strahlentherapie und antineoplastischen Medikamenten und Antimetaboliten assoziiert sind, nützlich sein. KGF-2 kann verwendet werden, um den Wiederaufbau der Haut nach Hautverlust zu fördern.
KGF-2 kann verwendet werden, um die Haftung von Hauttransplantaten an ein Wundbett zu erhöhen und die Reepithelialisierung aus dem Wundbett zu stimulieren. Folgende sind Transplantatarten, bei denen KGF-2 verwendet werden könnte, um die Haftung von Hauttransplantaten an ein Wundbett zu erhöhen: Autotransplantate, künstliche Haut, Allotransplantate, autodermale Transplantate, autoepidermale Transplantate, avaculäre Transplantate, Blair-Brown-Transplantate, Knochentransplantat, brephoplastische Transplantate, Cutistransplantat, verzögertes Transplantat, Hauttransplantat, Epidermistransplantat, Fascia-Transplantat, Vollhauttransplantat, heterologes Transplantat, Xenotransplantat, homologes Transplantat, hyperplastisches Transplantat, lamelläres Transplantat, Maschentransplantat, Schleimhauttransplantat, Ollier-Thiersch-Transplantat, Omentum-Plastik, Streifenplastik, Stiel-Transplantat, Spalthauttransplantat, dickes Spalthaut-Transplantat. KGF-2 kann verwendet werden, um die Hautfestigkeit zu fördern und das Erscheinungsbild gealterter Haut zu verbessern.
Man glaubt, dass KGF-2 auch Änderungen bei der Hepatocytenproliferation und der Epithelzellenproliferation in der Lunge, Brust, Pankreas, Magen, Dünndarm und Dickdarm hervorruft. KGF-2 kann die Proliferation von Epithelzellen wie Sebocyten, Haarfollikel, Hepatocyten, Typ-II-Pneumocyten, Mucin-produzierenden Gobletzellen und anderen Epithelzellen und ihre in Haut, Lunge, Leber und dem Gastrointestinaltrakt enthaltenen Vorläufer fördern. KGF-2 kann die Proliferation von Endothelzellen, Keratinocyten und basalen Keratinocyten fördern.
KGF-2 kann auch verwendet werden, um die Nebenwirkungen der Toxizität auf den Darm zu reduzieren, die auf Strahlung, Chemotherapiebehandlungen und Virusinfektionen zurückzuführen sind. KGF-2 kann auch eine kryoprotektive Wirkung auf die Dünndarmschleimhaut haben. KGF-2 kann auch die Heilung von Mucositis (Mundgeschwüren) fördern, die auf Chemotherapie und Virusinfektionen zurückzuführen sind.
KGF-2 kann ferner zur vollständigen Regenerierung der Haut bei Voll- und Teilhautdefekten, einschließlich Verbrennungen (d. h. die Repopulation von Haarfollikeln, Schweißdrüsen und Talgdrüsen) und der Behandlung anderer Hautdefekte wie Psoriasis verwendet werden. KGF-2 kann verwendet werden, um Epidermolysis bullosa, einen Defekt bei der Haftung der Epidermis an die darunter liegende Dermis, zu behandeln, die zu häufigen, offenen und schmerzhaften Blasen führt, indem die Reepithelialisierung dieser Läsionen beschleunigt wird. KGF-2 kann auch verwendet werden, um Magen- und Zwölffinderdarmgeschwüre zu behandeln und die schnellere Heilung durch Narbenbildung der Schleimhaut und Regeneration der Drüsenschleimhaut und Zwölffingerdarmschleimhaut zu unterstützen. Entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sind Krankheiten, die zur Zerstörung der Schleimhautoberfläche des Dünndarms bzw. des Dickdarms führen. Somit könnte KGF-2 verwendet werden, um die Erzeugung einer neuen Schleimhautoberfläche zu fördern, um die schnellere Heilung zu unterstützen und um das Fortschreiten der entzündlichen Darmerkrankungen zu verhindern. Man erwartet, dass die KGF-2-Behandlung einen wesentlichen Effekt auf die Schleimhautproduktion im Gastrointestinaltrakt hat und verwendet werden könnte, um die Darmschleimhaut vor verletzenden Substanzen zu schützen, die aufgenommen werden oder auf einen chirurgischen Eingriff folgen. KGF-2 kann verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit der Unterexpression von KGF-2 assoziiert sind.
Außerdem kann KGF-2 verwendet werden, um Lungenschäden aufgrund verschiedener pathologischer Zustände zu verhindern und zu heilen. Ein Wachstumsfaktor wie KGF-2, der die Proliferation und Differenzierung stimulieren und die Reparatur der Alveolen und des Bronchienepithels fördern könnte, kann verwendet werden, um akute oder chronische Lungenschäden zu verhindern oder zu behandeln. Beispielsweise könnte ein Emphysem, das zu einem progressiven Alveolenverlust und Verletzungen beim Einatmen führt, d. h. die auf das Einatmen von Rauch und Verbrennungen zurückzuführen sind, was die Nekrose des Bronchienepithels und Alveolen verursacht, effektiv mit KGF-2 behandelt werden. KGF-2 kann auch verwendet werden, um bei Frühgeburten die Proliferation und Differenzierung von Typ-II-Pneumonocyten zu stimulieren, die helfen können, Krankheiten wie hyaline Membranerkrankungen wie das Atemnotsyndrom des Neugeborenen und bronchopulmonäre Displasie zu behandeln oder zu verhindern.
KGF-2 könnte die Proliferation und Differenzierung von Hepatocyten stimulieren und könnte somit verwendet werden, um Lebererkrankungen und Pathologien wie fulminantes, durch Zirrhose verursachtes, Leberversagen, durch virale Hepatitis und toxische Substanzen (d. h. Acetaminophen, Tetrachlorkohlenstoff und andere aus dem Fachgebiet bekannte Toxine) verursachte Leberschäden zu lindern oder zu behandeln.
Zusätzlich könnte KGF-2 auch verwendet werden, um den Ausbruch von Diabetes mellitus zu behandeln oder zu verhindern. Bei Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes Typ I und Typ II, bei dem noch etwas Funktion der Inselzellen übrig bleibt, könnte KGF-2 verwendet werden, um die Funktion der Inselzellen zu erhalten, um die permanente Manifestation der Krankheit zu lindern, zu verzögern oder zu verhindern. KGF-2 könnte auch als Hilfsmittel bei der Transplantation von Inselzellen verwendet werden, um die Inselzellfunktion zu verbessern oder zu fördern.
Ferner werden hier mimetische Peptide von KGF-2 beschrieben, die als therapeutische Peptide verwendet werden können. Mimetische KGF-2-Peptide sind kurze Peptide, die die biologische Aktivität des KGF-2-Proteins nachahmen, indem sie an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie aktivieren. Mimetische KGF-2-Peptide können auch an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie hemmen.
Außerdem können Antagonisten gegen derartige Polypeptide verwendet werden, um die Wirkung derartiger Polypeptide zu hemmen, beispielsweise, um die Narbenbildung während des Wundheilungsprozesses zu reduzieren und die Tumorproliferation, diabetische Retinopathie, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis und Tumorwachstum zu verhindern und/oder zu behandeln. KGF-2-Antagonisten können auch verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit der Überexpression von KGF-2 assoziiert sind.
Diagnostische Tests können zum Nachweis von Krankheiten oder der Anfälligkeit für Krankheiten verwendet werden, die mit Mutationen in der KGF-2-Nucleinsäuresequenz oder Überexpression der Polypeptide zusammenhängen, die von derartigen Sequenzen codiert werden. Derartige Polypeptide oder Polynucleotide, die derartige Polypeptide codieren, können für in vitro-Zwecke verwendet werden, die mit wissenschaftlicher Forschung, DNA-Synthese und der Herstellung von DNA-Vektoren zusammenhängen.
Somit stellt ein erfindungsgemäßer Aspekt eine Mutante des KGF-2-Polypeptids bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer N-terminalen Deletionsmutante von KGF-2, wobei die Mutante aus der Aminosäuresequenz Ala (63) bis Ser (208) der SEQ ID NR: 2 oder aus der Aminosäuresequenz Ala (63) bis Ser (208) des Proteins besteht, das durch die in dem Plasmid ATCC 75977 enthaltene cDNA codiert ist, und wobei die Mutante ein N-terminales Methionin enthält;
(b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 90%, 95%, 97% oder 99% mit der Aminosäuresequenz der KGF-2 Mutante nach (a) identisch ist;
(c) einem Polypeptid nach (a), wobei das Polypeptid mindestens eine Aminosäuresubstitution hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu und Lys(183)Glu.

Die erfindungsgemäße Mutante kann ein Polynucleotid sein, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem vorstehenden Polynucleotid nach (a) hybridisiert. Dieses hybridisierende Polynucleotid hybridisiert nicht unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die nur aus A-Resten oder nur aus T-Resten besteht.
Das Polynucleotid kann die Aminosäuresequenz eines Epitop-tragenden Anteils eines KGF-2 codieren, der eine vorstehende Aminosäuresequenz nach (a), (b) oder (c) besitzt.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neuartige Varianten der KGF-2-Mutanten beschrieben. Diese können durch Deletion oder Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren der KGF-2-Mutanten hergestellt werden. Natürliche Mutationen werden als allele Variation bezeichnet.
Allele Variationen können still sein (keine Änderung beim codierten Polypeptid) oder sie können die Aminosäuresequenz verändert haben. Man kann Protein-Engineering-Verfahren einsetzen, um zu versuchen, die Merkmale des nativen KGF-2 zu verbessern oder zu ändern. Man kann aus dem Fachgebiet bekannte rekombinante DNA-Technologie verwenden, um neuartige Polypeptide zu erzeugen. Muteine und Deletionsmutationen können z. B. eine erhöhte Aktivität oder erhöhte Stabilität zeigen. Zusätzlich könnten sie für einen größeren Ertrag gereinigt werden und sie könnten zumindest unter bestimmten Reinigungs- und Lagerbedingungen bessere Löslichkeit zeigen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten für den Fachmann aufgrund der hier beschriebenen Ausführungen offensichtlich sein.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die folgenden Zeichnungen veranschaulichen die erfindungsgemäßen Ausführungsformen und sollen nicht den Umfang der Erfindung, wie durch die Patentansprüche umfasst, begrenzen.
Die 1A–1C stellen die cDNA und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung dar. Die ersten 35 oder 36 Aminosäurereste sind die vermeintliche Leadersequenz (unterstrichen). Für die Aminosäuren werden die Standardabkürzungen mit einem Buchstaben verwendet. Ungenauigkeiten beim Sequenzieren sind ein weitverbreitetes Problem beim Versuch, Polynucleotidsequenzen zu bestimmen. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines automatischen 373-DNA-Sequenziergeräts (Applied Biosystems, Inc.). Es wird ein Sequenziergenauigkeit von mehr als 97% Genauigkeit vorhergesagt. [SEQ ID NR: 1]
Die 2A–2D sind eine Darstellung eines Aminosäuresequenzvergleichs des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit anderen Fibroblasten-Wachstumsfaktoren. [SEQ ID NR: 13–22]
Die 3A–3D zeigen die Gesamtlänge der mRNA und die Aminosäuresequenz für das KGF-2-Gen. [SEQ ID NR: 23 und 24]
Die 4A–4E zeigen eine Analyse der KGF-2-Aminosäuresequenz. Alpha-, Beta-, „Turn"- und „Coil"-Bereiche; Hydrophilie und Hydrophobizität; Amphipathische Bereiche; flexible Bereiche; Antigen-Index und Oberflächenwahrscheinlichkeit werden dargestellt. In der „Antigenindex-Jameson-Wolf"-Graphik entsprechen die Aminosäurereste 41-109 aus 1 den dargestellten hoch antigenen Bereichen des KGF-2-Proteins. Hydrophobe Bereiche (Hopp-Woods-Plot) liegen unter der medianen Linie (negative Werte), während man die hydrophilen Bereiche (Kyte-Doolittle-Plot) über der medianen Linie (positive Werte, z. B. Aminosäurereste 41-109) findet. Der Plot erstreckt sich über den gesamten ORF mit 208 Aminosäuren.
5 zeigt die Beurteilung von KGF-2 bezüglich des Wundverschlusses bei diabetischen Mäusen. Die Wunden wurden unmittelbar nach der Verletzung und täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag 8 gemessen. Der prozentuale Wundverschluss wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: [Fläche an Tag 1 ]-[Fläche an Tag 8]/[Fläche an Tag 1]. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
6 zeigt die Beurteilung von KGF-2 bezüglich des Wundverschlusses bei nicht diabetischen Mäusen. Die Wunden wurden unmittelbar nach der Verletzung und täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag 8 gemessen. Der prozentuale Wundverschluss wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: [Fläche an Tag 1 ]-[Fläche an Tag 8]/[Fläche an Tag 1]. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
7 zeigt den Zeitverlauf beim Wundverschluss bei diabetischen Mäusen. Die Wundflächen wurden unmittelbar nach der Verletzung und täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag 8 gemessen. Die Werte sind als Gesamtfläche (mm²) dargestellt. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
8 zeigt den Zeitverlauf beim Wundverschluss bei nicht diabetischen Mäusen. Die Wundbereiche wurden unmittelbar nach der Verletzung und täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag 8 gemessen. Die Werte sind als Gesamtfläche (mm²) dargestellt. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
9 zeigt eine histopathologische Beurteilung von KGF-2 bei diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
10 zeigt eine histopathologische Beurteilung von KGF-2 bei nicht diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
11 zeigt die Wirkung des Keratinocyten-Wachstums bei diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
12 zeigt die Wirkung des Keratinocyten-Wachstums bei nicht diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
13 zeigt die Wirkung der Hautproliferation bei diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
14 zeigt die Wirkung der Hautproliferation bei nicht diabetischen Mäusen. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
15 zeigt die DNA-Sequenz und das vom pQE60-Cys37-Konstrukt exprimierte Protein. Das exprimierte KGF-2-Protein enthält die Sequenz von Cystein an Position 37 bis Serin an Position 208 mit einem 6X(His)-Tag, der an den N-Terminus des Proteins gebunden ist.
16 zeigt die Wirkung von Methylprednisolon auf die Wundheilung bei Ratten. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 5) wurde am Tag der Verletzung 5 mg Methylprednisolon injiziert. Den Tieren wurden mit einer Stanze Hautwunden (8 mm) beigebracht, und sie wurden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit Pufferlösung oder KGF-2-Lösung in 50 μl Pufferlösung behandelt. Die Wunden wurden täglich an den Tagen 1–5 und an Tag 8 mit einem kalibrierten Jameson-Tastzirkel ausgemessen. Die Werte sind die an Tag 8 durchgeführten Messungen. (Mittelwert +/– SEM)
17 zeigt die Wirkung von KGF-2 auf den Wundverschluss. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Stanze Hautwunden (8 mm) beigebracht, und sie erhielten am Tag der Verletzung 5 mg Methylprednisolon. Die Tiere wurden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag der Verletzung, mit Pufferlösung oder KGF-2-Lösung in 50 μl Pufferlösung behandelt. Die Messungen erfolgten täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag B. Der Wundverschluss wurde mittels folgender Formel berechnet: [Fläche an Tag 8]-[Fläche an Tag 1]/[Fläche an Tag 1]. Es wurde ermittelt, dass die Fläche an Tag 1 64 mm² betrug – die Fläche, die von der Hautstanze erzeugt wurde. Die statisti sche Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
18 zeigt den Zeitverlauf der Wundheilung im Glucokortikoid-gehemmten Wundheilungsmodell. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Stanze Hautwunden (8 mm) an Tag 1 beigebracht, und sie wurden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit einer Pufferlösung oder KGF-2-Lösung in 50 μl behandelt. Die Tiere erhielten am Tag der Verletzung 5 mg Methylprednisolon. Die Wunden wurden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag der Verletzung, und an Tag 8 mit einem kalibrierten Jameson-Tastzirkel ausgemessen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM, n = 5).
19(A) zeigt die Wirkung von KGF-2 auf die Wundfläche im Ratten-Wundheilungsmodell ohne Methylprednisolon an Tag 5 nach der Verletzung. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Stanze Hautwunden (8 mm) an Tag 1 beigebracht, und sie wurden täglich entweder mit einer Pufferlösung oder mit KGF-2-Lösung in einer 50 μl-Lösung am Tag der Verletzung und danach an 5 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt. Die Wunden wurden täglich unter Verwendung eines kalibrierten Jämeson-Tastzirkels ausgemessen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM). (B) Die Beurteilung von PDGF-BB und KGF-2 in männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 6). Allen Ratten wurden 8 mm große Wunden am Rücken beigebracht und sie erhielten Methylprednisolon (MP) (17 mg/kg), um die Wundheilung zu hemmen. Die Wunden wurden täglich mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen von PDGF-BB und KGF-2 behandelt. Die Wunden wurden an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 unter Verwendung eines kalibrierten Jameson-Tastzirkels ausgemessen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM). *Im Vergleich mit Puffer. **PDGF-BB 1 μg gg. KGF-2/E3 1 μg.
20 zeigt die Wirkung von KGF-2 auf den Wunderabstand im Glucocortikoid-gehemmten Wundheilungsmodell. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Stanze Hautwunden (8 mm) beigebracht, und sie erhielten am Tag der Verletzung 17 mg/kg Methylprednisolon. Die Tiere wurden täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen und an Tag 8 mit einer Pufferlösung oder mit KGF-2-Lösung in 50 μl Pufferlösung behandelt. Der Wunderabstand wurde unter dem Lichtmikroskop mit einem kalibrierten Mikrometer gemes sen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM).
21(A) zeigt die Stimulation der normalen primären epidermalen Keratinocytenproliferation durch KGF-2. (B) zeigt die Stimulation der normalen primären epidermalen Keratinocytenproliferation durch KGF-2Δ33. (C) zeigt die Stimulation der normalen primären epidermalen Keratinocytenproliferation durch KGF-2Δ28. Menschliche normale primäre epidermale Keratinocyten wurden drei Tage mit verschiedenen Konzentrationen KGF-2, KGF-2Δ33 oder KOF-2Δ28 inkubiert. Bei allen drei Experimenten wurde 16 Std. alamarBlue zugegeben und die Intensität der roten Farbe, die durch die Zellen aus alamarBlue umgewandelt wurde, wurde mittels der Differenz zwischen O.D. 570 nm und O.D. 600 nm gemessen. Für jedes KGF-2 Protein wurde eine Positivkontrolle mit Keratinocyten-Komplett-Wachstumsmedium (KGM) und eine Negativkontrolle mit Keratinocyten-Basalmedium (KBM) auf derselben Testplatte eingeschlossen.
22(A) zeigt die Stimulation des Thymidineinbaus durch KGF-2 und FGF7 in mit FGFR1b und FGFR2 transfizierten Baf3-Zellen. Die Wirkungen von KGF-2 (rechte Graphik) und FGF7 (linke Graphik) auf die Proliferation von mit FGFRiiib (unausgefüllter Kreis) oder FGFR2iiib/KGFR (ausgefüllter Kreis) transfizierten Baf3-Zellen wurden untersucht. Die Y-Achse stellt die Menge des [3H]-Thymidineinbaus (cpm) in die DNA der Baf3-Zellen dar. Die X-Achse stellt die Endkonzentration von KGF-2 oder FGF7 dar, die dem Gewebekulturmedium zugegeben wurden. (B) zeigt die Stimulation des Thymidineinbaus durch KGF-2Δ33 in mit FGFR2iiib transfizierten Baf3-Zellen.
(C) zeigt die Stimulation des Thymidineinbaus durch KGF-2 (weißer Balken), KGF-2Δ33 (schwarzer Balken) und KGF-2Δ28 (grauer Balken) in mit FGFR2iiib transfizierten Baf3-Zellen.
23 zeigt die DNA- und Proteinsequenz für das E.coli-optimierte KGF-2 mit der gesamten Länge.
Die 24A und B zeigen die DNA- und Proteinsequenzen für das E.coli-optimierte reife KGF-2.
25 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 36 bis 208 von KGF-2 umfasst.
26 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 63 bis 208 von KGF-2 umfasst.
27 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 77 bis 208 von KGF-2 umfasst.
28 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 93 bis 208 von KGF-2 umfasst.
29 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 104 bis 208 von KGF-2 umfasst.
30 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 123 bis 208 von KGF-2 umfasst.
31 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 138 bis 208 von KGF-2 umfasst.
32 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 36 bis 153 von KGF-2 umfasst.
33 zeigt die DNA- und die davon codierte Proteinsequenz für das KGF-2-Deletionskonstrukt, das die Aminosäuren 63 bis 153 von KGF-2 umfasst.
34 zeigt die DNA-Sequenz für das Konstrukt der KGF-2-Cystein-37-bis-Serin-Mutante.
35 zeigt die DNA-Sequenz für das Konstrukt der KGF-2-Cystein-37/Cystein-106-bis-Serin- Mutante.
36 zeigt die Beurteilung der Effekte von KGF-2Δ33 auf die Wundheilung bei männlichen SD-Ratten (n = 5). Den Tieren wurden 6 mm große Wunden am Rücken beigebracht, und sie wurden mit verschiedenen Pufferkonzentrationen oder KGF-2Δ33 an 4 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt. Die Wunden wurden unter Verwendung eines kalibrierten Jameson-Tastzirkels ausgemessen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SEM). * Im Vergleich mit Puffer
37 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Wundheilung bei normalen Ratten. Männlichen SD-Ratten, 250–300 g, (n = 5) wurden 6 mm große Vollhautwunden durch am Rücken beigebracht. Die Wunden wurden mit einem Tastzirkel ausgemessen und 4 Tage, beginnend am Tag des chirurgischen Eingriffs mit, verschiedenen KGF-2Δ33-Konzentrationen und Puffer behandelt. Am letzten Tag wurden die Wunden geerntet. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests. *Wert wird mit der „Keine Behandlung"-Kontrolle verglichen. t Wert wird mit Pufferkontrolle verglichen.
38 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Bruchfestigkeit bei Schnittwunden. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 10) wurden an Tag 1 2,5 cm große Vollhautschnittwunden beigebracht, und sie wurden nach der Verletzung mit einer Anwendung von entweder Puffer oder KGF-2 (Delta 33) (1, 4 und 10 μg) intraincisional behandelt. Die Tiere wurden an Tag 5 getötet und 0,5 cm große Proben der Wunde wurden für die routinemäßige Histologie und Bruchfestigkeitsanalyse herausgeschnitten. Der biomechanische Test erfolgte unter Verwendung eines Instron-Hauttensiometers, wobei eine Kraft über die Wunde hinweg aufgewandt wurde. Die Bruchfestigkeit wurde als die größte Kraft definiert, die von jeder Wunde vor dem Reißen ausgehalten wurde. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
39 zeigt die Wirkung von KGF-2 (Delta 33) auf die Epidermisdicke in Schnittwunden. Männlichen erwachsenen SD-Ratten (n = 10) wurden an Tag 1 2,5 cm-Vollhautschnittwunden beigebracht, und sie wurden nach der Verletzung mit einer Anwendung von entweder Puffer oder KGF-2 (Delta 33) (1, 4 und 10 μg) intraincisional behandelt. Die Tiere wurden an Tag 5 getötet und 0,5 cm große Proben der Wunde wurden für die routinemäßige Histologie und Bruchfestigkeitsanalyse herausgeschnitten. Die Epidermisdicke wurde ermittelt, indem man den Mittelwert aus 6 Messungen nahm, die um die Wundstelle herum durchgeführt wurden. Die Messungen wurden von einem blinden Beobachter auf Masson-Trichrom-gefärbten Abschnitten unter dem Lichtmikroskop unter Verwendung eines kalibrierten Linsenmikrometers durchgeführt. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
40 zeigt die Wirkung von KGF-2 (Delta 33) auf die Epidermisdicke nach einer einzigen intradermalen Injektion. Männliche erwachsene SD-Ratten (n = 18) erhielten 6 intradermale Injektionen entweder mit Puffer oder mit KGF-2 in einer Konzentration von 1 und 4 μg in 50 μl an Tag 0. Die Tiere wurden 24 und 48 Stunden nach der Injektion getötet. Die Epidermisdicke wurde aus der granulären Schicht bis zum unteren Ende der Basalschicht gemessen. Es wurden etwa 20 Messungen entlang der Injektionsstelle durchgeführt und die mittlere Dicke quantifiziert. Die Messungen wurden unter Verwendung eines kalibrierten Linsenmikrometers auf Masson-Trichrom-gefärbten Abschnitten unter dem Lichtmikroskop bestimmt. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
41 zeigt die Wirkung von KGF-2 (Delta 33) auf die BrdU-Punktebewertung. Männliche erwachsene SD-Ratten (n = 18) erhielten 6 intradermale Injektionen entweder mit Placebo oder mit KGF-2 in einer Konzentration von 1 und 4 μg in 50 μl an Tag 0. Die Tiere wurden 24 und 48 Stunden nach der Injektion getötet. Den Tieren wurde zwei Stunden bevor sie getötet wurden 5-2'-Bromdesoxyuridin (100 mg/kg ip) injiziert. Die Punkteverteilung erfolgte durch einen blinden Beobachter unter dem Lichtmikroskop unter Verwendung des folgenden Punktesystems: 0–3 keine bis minimal BrdU-markierte Zellen; 4–6 leichte Markierung; 7–10 stark markierte Zellen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
42 zeigt die anti-inflammatorische Wirkung von KGF-2 auf ein PAF-induziertes Pfotenödem.
43 zeigt die anti-inflammatorische Wirkung von KGF-2Δ33 auf ein PAF-induziertes Ödem der Pfote bei Lewis-Ratten.
44 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf das Überleben von Ganzkörper-bestrahlten Balb/c-Mäusen. Männliche Balb/c-Mäuse (n = 5), 22,1 g, wurden mit 519 RADS bestrahlt. Die Tiere wurden 2 Tage vor der Bestrahlung und danach täglich 7 Tage mit Puffer oder KGF-2 (1 & 5 mg/kg, s. q.) behandelt.
45 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf das Körpergewicht der bestrahlten Mäuse. Männlichen Balb/c-Mäusen (n = 5) mit einem Gewicht von 22,1 g wurde 2 Tage vor der Bestrahlung mit 519 Rad/min entweder Puffer oder KGF-2Δ33 (1,5 mg/kg) injiziert. Die Tiere wurden täglich gewogen und nach der Bestrahlung wurde ihnen die Injektion 7 Tage eine Injektion verabreicht.
46 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Überlebensrate von Ganzkörperbestrahlten Balb/c-Mäusen. Männliche Balb/c-Mäuse (n = 7), 22,1 g, wurden mit 519 RADS bestrahlt. Die Tiere wurden 2 Tage vor der Bestrahlung und danach täglich 7 Tage mit Puffer oder KGF-2 (1 und 5 mg/kg, s. q.) behandelt.
47 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Wundheilung in einem Glucocortikoid-gehemmten Rattenmodell.
48 zeigt die Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Zellproliferation, wie sie unter Verwendung der BrdU-Markierung bestimmt wurde.
49 zeigt die Wirkung von KGF-2-Δ33 auf den an anastomotischen Operationsstellen im Rattendarm lokalisierten Collagengehalt.
Detaillierte Beschreibung
In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) offenbart, die das Polypeptid codiert, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NR: 2) besitzt, oder das das Polypeptid codiert, das von der cDNA des am 16. Dezember 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, als ATCC-Hinterlegungsnummer 75977 hinterlegten Clons codiert wird.
Nucleinsäuremoleküle
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle hier durch Sequenzierung eines DNA-Moleküls bestimmten Nucleotidsequenzen unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenziergeräts (wie das Model 373 von Applied Biosystems, Inc.) bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die von hier bestimmten DNA-Molekülen codiert werden, wurden durch Translation einer wie vorstehend bestimmten DNA-Sequenz vorhergesagt. Deshalb kann, wie aus dem Fachgebiet für jede DNA-Sequenz, die durch diesen automatisierten Ansatz bestimmt wurde, bekannt ist, jede hier bestimmte Nucleotidsequenz einige Fehler enthalten. Die mittels Automatisierung bestimmten Nucleotidsequenzen sind typischerweise mindestens etwa 90% identisch, noch typischer mindestens etwa 95% bis mindestens etwa 99,9% mit der tatsächlichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls identisch. Die tatsächliche Sequenz kann präziser durch andere Ansätze, einschließlich manuelle DNA-Sequenzierverfahren, die sehr gut aus dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden. Wie ebenfalls aus dem Fachgebiet bekannt ist, verursacht eine einzelne Insertion oder Deletion in einer ermittelten Nucleotidsequenz im Vergleich zur tatsächlichen Sequenz eine Verschiebung des Leserahmens bei der Translation der Nucleotidsequenz, so dass sich, beginnend an der Stelle einer derartigen Insertion oder Deletion, die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die von einer ermittelten Nucleotidsequenz codiert wird, vollkommen von der Aminosäuresequenz unterscheidet, die tatsächlich von dem sequenzierten DNA-Molekül codiert wird.
Wenn nicht anders angegeben, wird jede hier aufgeführte „Nucleotidsequenz" als Desoxyribonucleotidsequenz (abgekürzt A, G, C und T) dargestellt. Jedoch ist mit einer „Nucleotidsequenz" eines Nucleinsäuremoleküls oder Polynucleotids für ein DNA-Molekül oder Polynucleotid, eine Desoxyribonucleotidsequenz gemeint und für ein RNA-Molekül oder Polynucleotid, die entsprechende Ribonucleotidsequenz (A, G, C und U) gemeint, bei der jedes Thymidindesoxyribonucleotid (T) in der bestimmten Desoxyribonucleotidsequenz durch das Ribonucleotid Uridin (U) ersetzt ist. Beispielsweise soll die Bezugnahme auf ein RNA-Molekül, das die Sequenz von SEQ ID NR: 1 besitzt, die unter Verwendung der Desoxyribonucleotidabkürzungen aufgeführt ist, anzeigen, dass ein RNA-Molekül, das eine Sequenz besitzt, bei der jedes Desoxyribonucleotid A, G oder C der SEQ ID NR: 1 durch das entsprechende Ribonucleotide A, G oder C ersetzt wurde und jedes Desoxyribonucleotid T durch ein Ribonucleotid U ersetzt wurde.
Mit „isoliertem/isolierten" Nucleinsäuremolekül(en) ist ein Nucleinsäuremolekül, DNA oder RNA gemeint, das/die aus seiner/ihrer nativen Umgebung entfernt wurde(n). Beispielsweise werden rekombinante, in einem Vektor enthaltene DNA-Moleküle, als isoliert für die Zwecke der vorliegenden Erfindung betrachtet. Weitere Beispiele für isolierte DNA-Moleküle schließen rekombinante, in heterologen Wirtszellen gehaltene DNA-Moleküle oder gereinigte (teilweise oder wesentlich) DNA-Moleküle in Lösungen ein. Isolierte RNA-Moleküle schließen in vivo- oder in vitro-RNA-Transkripte der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung ein. Isolierte Nucleinsäuremoleküle nach der vorliegenden Erfindung schließen ferner solche Moleküle ein, die synthetisch hergestellt werden.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung schließen DNA-Moleküle ein, die eine Sequenz umfassen, die sich im wesentlichen von denjenigen unterscheidet, die vorstehend beschrieben wurden, die jedoch aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes noch KGF-2-Mutanten einschließen.
Natürlich ist der genetische Code im Fachgebiet gut bekannt. Deshalb wäre es für den Fachmann Routine, die vorstehend beschriebenen degenerierten Varianten zu erzeugen.
Ein Polynucleotid, das ein KGF-2-Polypeptid codiert, kann man aus einer menschlichen Prostata und einer fötalen Lunge erhalten. Ein Fragment der cDNA, die das Polypeptid codiert, wurde zuerst aus einer von einer normalen menschlichen Prostata abstammenden Genbank isoliert. Der offene Leserahmen, der das Protein mit der gesamten Länge codiert, wurde anschließend aus einer zufallsgeprimten menschlichen fötalen Lungen-cDNA-Genbank isoliert. Sie ist strukturell mit der FGF-Familie verwandt. Sie enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 208 Aminosäureresten codiert, dessen erste 35 bis 36 Aminosäurereste die vermeintliche Leader-Sequenz sind, so dass das reife Protein 173 oder 172 Aminosäuren um fasst. Das Protein zeigt den höchsten Homologiegrad zum menschlichen Keratinocyten-Wachstumsfaktor mit 45% Identität und 82% Ähnlichkeit über eine Länge von 206 Aminosäuren. Es ist auch wichtig, dass man herausfand, dass Sequenzen, die innerhalb der FGF-Familie konserviert sind, im Protein der vorliegenden Erfindung konserviert sind.
Zusätzlich zeigten Ergebnisse von ineinandergesetzter PCR von KGF-2-cDNA aus Genbanken, dass es potenzielle alternative gespleißte KGF-2-Formen gab. Insbesondere bei der Verwendung von Primern, die den N-Terminus des offenen Leserahmens von KGF-2 flankieren, wurden PCR-Produkte mit 0,2 kb und 0,4 kb aus verschiedenen cDNA-Genbanken erhalten. Eine 0,2 kb-Größe war das erwartete Produkt für KGF-2, während die 0,4 kb-Größe auf eine alternativ gespleißte KGF-2-Form zurückgeführt werden kann. Das 0,4 kb-Produkt wurde in Genbanken aus Magenkrebs, Hoden von Erwachsenen, Duodenum und Pankreas beobachtet.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA sein, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und wenn die DNA einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht codierende (Antisense-) Strang sein. Die codierende Sequenz, die den entsprechenden Teil des reifen Polypeptids codiert, kann mit der in 1 (SEQ ID NR: 1) dargestellten entsprechenden codierenden Sequenz identisch sein oder mit derjenigen des hinterlegten Clons oder sie kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, deren codierende Sequenz als Folge der Redundanz oder Degenerierung des genetischen Codes, den gleichen entsprechenden Teil des reifen Polypeptids codiert wie die DNA von 1 (SEQ ID NR: 1) oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, das die Polypeptide der KGF-2-Mutanten codiert, kann einschließen: nur die codierende Sequenz für die Polypeptidmutanten; die codierende Sequenz für die Polypeptidmutanten und zusätzliche codierende Sequenzen wie Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für die Polypeptidmutanten (und fakultativ zusätzliche codierende Sequenzen) und nicht codierende Sequenzen wie Intron- oder nicht codierende Sequenzen 5' und/oder 3' der codierende Sequenz für die Polypeptidmutanten. Zusätzlich wurde eine mRNA mit der gesamten Länge erhalten, die nicht translatierte 5'- und 3'-Bereiche des Gens enthält (3).
Dem Fachmann ist bewusst, dass aufgrund der Möglichkeiten der vorstehend diskutierten Fehler beim Sequenzieren sowie der Variabilität der Spaltungsstellen für Leader in ver schiedenen bekannten Proteinen das tatsächliche von der hinterlegten cDNA codierte KGF-2-Polypeptid etwa 208 Aminosäuren umfasst, jedoch irgendwo im Rahmen von 200–220 Aminosäuren liegen kann, und die tatsächliche Leader-Sequenz dieses Protein besitzt etwa 35 oder 36 Aminosäuren, kann aber auch im Bereich von etwa 30 bis 40 Aminosäuren liegen.
Somit umfasst der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz für das Polypeptid sowie ein Polypeptid umfasst, das zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenzen umfasst.
Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt ferner Varianten der hier vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Varianten der KGF-2-Polypeptidmutanten umfassen, die entsprechende Teile der abgeleiteten Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NR: 2) oder das von der cDNA des hinterlegten Clons codierte Polypeptid besitzen. Die Variante des Polypeptids kann eine natürlich vorkommende allele Variante des Polynucleotids sein oder eine nicht natürlich auftretende Variante des Polynucleotids.
Somit beschreibt die vorliegende Patentanmeldung Polynucleotide, die die entsprechenden Teile des vorhergesagten reifen Polypeptids codieren, wie in 1 (SEQ ID NR: 2) dargestellt, oder das gleiche vorhergesagte reife Polypeptid, das von der cDNA des hinterlegten Clons sowie von Varianten derartiger Polynucleotide codiert wird.
Derartige Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt auch Polypeptide, die mimetische KGF-2-Peptide codieren, die als therapeutische Peptide verwendet werden können. Mimetische KGF-2-Peptide sind kurze Peptide, die die biologische Aktivität des KGF-2-Proteins nachahmen, indem sie an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie aktivieren. Mimetische KGF-2-Peptide können auch an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie inaktivieren. KGF-2-Rezeptoren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf FGR2iiib und FGFR1iiib. Derartige mimetische KGF-2-Peptide werden aus Verfahren wie Phagen-Display oder kombinatorische Chemie erhalten, sind aber nicht darauf begrenzt. Beispielsweise das Verfahren, das von Wrighton et al. Science 273: 458–463 (1996) offenbart wird, um mimetische KGF-2-Peptide zu erzeugen.
Wie hier vorstehend angegeben, können die Polynucleotide eine codierende Sequenz besitzen, die eine natürlich auftretende allele Variante der codierenden, in 1 (SEQ ID NR: 1) dargestellten Sequenz oder die codierende Sequenz des hinterlegten Clons ist. Wie aus dem Fachgebiet bekannt, ist eine allele Variante eine andere Form einer Polypeptidsequenz, die eine Substitution, eine Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotide besitzen kann, die die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich ändern.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Polynucleotide ein, wobei die codierende Sequenz für die Polypeptidmutanten im selben Leserahmen mit einer Polynucleotidsequenz fusioniert werden kann, die bei der Expression und Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle unterstützen kann, beispielsweise eine Leadersequenz, die als sekretorische Sequenz zur Transportkontrolle eines Polypeptids aus der Zelle fungiert. Das Polypeptid, das eine Leadersequenz besitzt, ist ein Präprotein und die Leader-Sequenz kann von der Wirtszelle gespalten werden, um die reife Form des Polypeptids zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das das reife Protein plus zusätzliche 5 ^` Aminosäurereste ausmacht. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Sobald die Prosequenz gespalten wird, bleibt ein aktives reifes Protein übrig.
Somit kann beispielsweise das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein oder ein Protein mit einer Prosequenz oder ein Protein codieren, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz besitzt (Leader-Sequenz).
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch die codierende Sequenz im Leserahmen mit einer Markersequenz fusioniert haben, die die Reinigung des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung zulässt. Die Markersequenz kann ein Hexahistidin-Tag sein, der von einem pQE-9-Vektor geliefert wird, um die Reinigung des reifen Polypeptids, das mit einer Markersequenz fusioniert ist, im Falle eines bakteriellen Wirtes bereitzustellen, oder die Markersequenz kann beispielsweise ein Hämagglutinin (HA)-Tag bei Verwendung eines Sängerwirtes z. B. COS-7-Zellen sein. Der HA-Tag entspricht einem Epitop, das vom Influenza Hämagglutininprotein stammt (Wilson, I. et al. Cell 37: 767 (1984)).
Der Begriff „Gen" bezeichnet das DNA-Segment, das an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist; es schließt Bereiche, die dem codierenden Bereich (Leader und Trailer vorangehen und darauf folgen, sowie dazwischenliegende Sequenzen (Introns) zwischen den einzelnen codierenden Segmenten (Exons) ein.
Fragmente mit dem Gen mit der gesamten Länge der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonde für eine cDNA-Genbank verwendet werden, um die cDNA mit der gesamten Länge zu isolieren und um andere cDNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Die Sonden dieser Art be sitzen mindesten 30 Basen und können beispielsweise 50 oder mehr Basen besitzen. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Transkript mit der gesamten Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone zu identifizieren, die das vollständige Gen einschließlich regulatorischer oder Promotorbereiche, Exons und Introns enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die Isolierung des codierenden Genbereichs unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide mit einer Sequenz, die komplementär zum Gen der vorliegenden Erfindung sind, werden verwendet, um eine Genbank mit menschlicher cDNA, genomischer DNA oder cDNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Genbank die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart, wie man Nucleinsäuremoleküle isoliert oder bereitstellt, die ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz umfassen, die mindestens 90% identisch ist und besonders bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit (a) einer Nucleotidsequenz, die das KGF-2-Polypeptid mit der gesamten Länge codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz in 1 (SEQ ID NR: 2), einschließlich der vorausgesagten Leader-Sequenz umfasst; (b) einer Nucleotidsequenz, die das reife KGF-2-Polypeptid (Polypeptid mit der gesamten Länge, wobei der Leader entfernt wurde) codiert, das die Aminosäuresequenz an den Positionen bei etwa 36 oder 37 bis 208 in 1 (SEQ ID NR: 2) besitzt; (c) einer Nucleotidsequenz, die das KGF-2-Polypeptid mit der gesamten Länge codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz einschließlich des Leaders besitzt, die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75977 enthalten ist; (d) einer Nucleotidsequenz, die das reife KGF-2-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz besitzt, die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnr. 75977 enthalten ist; (e) einer Nucleotidsequenz, die irgendeines der KGF-2-Analoga oder die nachstehend beschriebenen Deletionsmutanten codiert oder (f) einer Nucleotidsequenz, die zu irgendeiner der Nucleotidsequenzen in (a), (b), (c), (d), oder (e) komplementär ist.
Mit einem Polypeptid, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die beispielsweise mindestens 95% mit einer Referenznucleotidsequenz „identisch" ist, die ein KGF-2-Polypeptid codiert, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids mit dem Referenzsystem identisch ist, außer, dass die Polynucleotidsequenz jeweils pro 100 Nucleotide der Referenznucleotidsequenz, die das KGF-2-Polypeptid codiert, bis zu fünf Punktmutationen einschließen kann. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die mindestens 95% mit einer Referenznucleotidsequenz identisch ist, können bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid ersetzt werden oder eine Anzahl von bis zu 5% der Gesamtnucleotide in der Referenzsequenz kann in die Referenzsequenz eingebaut werden. Diese Mutationen der Referenzsequenz können an den terminalen 5'- oder 3'-Positionen der Referenznucleotidsequenz oder irgendwo zwischen den terminalen Positionen auftreten, die entweder einzeln unter den Nucleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren aufeinander folgenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz verteilt sind.
In der Praxis kann unter Verwendung bekannter Computerprogramme wie das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) auf herkömmliche Weise bestimmt werden, ob irgendein bestimmtes Nucleinsäuremolekül mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit beispielsweise der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder mit der Nucleotidsequenz des hinterlegten cDNA-Clops identisch ist. Beim Bestfit-Programm werden die lokalen Homologiealgorithmen von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981) verwendet, um das beste Homologiesegment zwischen zwei Sequenzen zu finden. Bei der Verwendung von Bestfit oder irgendeinem anderen Programm zur Sequenzausrichtung, um zu bestimmen, ob eine bestimmt Sequenz beispielsweise 95% mit einer Referenzsequenz nach der vorliegenden Erfindung identisch ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass die prozentuale Identität über die gesamte Länge der Referenznucleotidsequenz berechnet wird und dass Lücken bei der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl der Nucleotide in der Referenz zugelassen werden.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart somit Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der in 1 [SEQ ID NR: 1] dargestellten Nucleinsäure oder der Nucleinsäuresequenz des hinterlegten Clons identisch sind, unabhängig davon, ob sie ein Polypeptid mit KGF-2-Aktivität codieren. Das liegt daran, dass sogar wenn ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül ein Polypeptid ohne KGF-2-Aktivität codiert, ein Fachmann noch wüsste, wie er das Nucleinsäuremolekül verwenden soll, beispielsweise als Hybridisierungssonde oder als Polymerasekettenreaktions (PCR)-Primer. Die Verwendung dieser Nucleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid ohne KGF-2-Aktivität codieren, schließt u. A. ein (1) die Isolierung des KGF-2-Gens oder alleler Varianten davon in einer cDNA-Genbank, (2) in-situ-Hybridisierung (z. B. „FISH") mit chromosomalen Ausstrichen in der Metaphase, um den genauen chromosomalen Ort des KGF-2-Gens bereitzustellen, wie in Verma et al., Human Chromosomes. A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) beschrieben; und die Northern-Blot-Analyse zum Nachweis der KGF-2-mRNA-Expression in spezifischen Geweben.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart insbesondere Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der in 1 [SEQ ID NR: 1] dargestellten Nucleinsäure oder der Nucleinsäuresequenz des hinterlegten Clons identisch sind, die tatsächlich ein Polypeptid mit KGF-2-Proteinaktivität codieren.
Mit „einem Polypeptid mit KGF-2-Aktivität" sind Polypeptide gemeint, die eine Aktivität zeigen, die einer Aktivität des erfindungsgemäßen Wildtyp-KGF-2-Proteins oder einer Aktivität ähnelt, die gegenüber derjenigen des Wildtyp-KGF-2-Proteins (entweder das Protein mit der gesamten Länge oder vorzugsweise das reife Protein) verstärkt ist, wie es in einem bestimmten biologischen Test gemessen wird, jedoch nicht unbedingt mit ihr identisch ist.
Tests der KGF-2-Aktivität werden beispielsweise nachstehend in den Beispielen 10 und 11 offenbart. Diese Tests können verwendet werden, um die KGF-2-Aktivität von teilweise gereinigtem oder gereinigtem rekombinantem Protein zu messen.
KGF-2 stimuliert die Proliferation der epidermalen Keratinocyten, jedoch nicht Mesenchymzellen wie Fibroblasten. Somit schließt „ein Polypeptid mit KGF-2-Proteinaktivität" Polypeptide ein, die in dem in Beispiel 10 aufgeführten Keratinocytenproliferationstest KGF-2-Aktivität zeigen, und an die Rezeptor-Isoformen 1-iiib und 2-iiib (Beispiel 11) binden. Obwohl der Aktivitätsgrad nicht mit demjenigen des KGF-2-Proteins identisch sein muss, zeigt „ein Polypeptid mit KGF-2-Proteinaktivität" vorzugsweise eine im wesentlichen ähnliche Aktivität im Vergleich zum KGF-2-Protein (d. h. das Kandidaten-Polypeptid zeigt relativ zum Referenz-KGF-2-Protein höhere Aktivität oder nicht mehr als etwa zehnfach weniger und vorzugsweise nicht mehr als zweifach weniger Aktivität).
Natürlich wird der Fachmann aufgrund der Degenerierung des genetischen Code sofort erkennen, dass eine große Anzahl der Nucleinsäuremoleküle, die eine Sequenz besitzen, die mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der Nucleinsäuresequenz des hinterlegten Clons oder der in 1 [SEQ ID NR: 1 ] dargestellten Nucleinsäure identisch ist, ein Polypeptid „mit KGF-2-Proteinaktivität" codiert. Tatsächlich ist, da die degenerierten Varianten dieser Nucleotidsequenzen alle dasselbe Polypeptid codieren, dem Fachmann klar ohne, dass er der vorstehend beschriebenen Vergleichstest durchführt. Im Fachgebiet erkennt man ferner, dass eine bemerkenswerte Anzahl derartiger Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten Varianten sind, auch ein Polypeptid mit KGF-2-Proteinaktivität codieren. Das liegt daran, dass der Fachmann sich vollkommen der Aminosäuresubstituitionen bewusst ist, die entweder weniger wahrscheinlich oder unwahrscheinlich die Proteinfunktion signifikant beeinflussen (z. B. Ersetzen einer aliphatischen Aminosäure durch eine zweite aliphatische Aininosäure).
Bei Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306–1310 (1990) werden beispielsweise Anleitungen bereitgestellt, wie man phänotypisch stille Aminosäuresubstitutionen herstellt, wobei die Autoren angeben, dass es zwei Hauptansätze zur Untersuchung der Toleranz der zu ändernden Aminosäuresequenz gibt. Das erste Verfahren beruht auf dem Evolutionsprozess, bei dem Mutationen entweder durch natürliche Selektion angenommen oder abgelehnt werden. Beim zweiten Ansatz werden gentechnische Verfahren verwendet, um einen Austausch der Aminosäuren an spezifischen Positionen eines clonierten Gens und Selektionen oder Durchmusterungen einzuführen, um Sequenzen zu identifizieren, die die Funktionalität erhalten. Wie die Autoren angeben, haben diese Studien offenbart, dass die Proteine erstaunlich tolerant gegenüber Aminosäuresubstitutionen sind. Die Autoren geben ferner an, welche Aminosäurenaustausche wahrscheinlich an einer bestimmten Proteinposition erlaubt sind. Beispielsweise erfordern die am meisten verdeckten Aminosäuren unpolare Seitenketten, während im allgemeinen wenige Merkmale von Oberflächenseitenketten konserviert sind. Andere derartige phänotypisch stille Substitutionen werden bei Bowie, J. U. et al., vorstehend und den hier zitierten Referenzen beschrieben.
Es werden ebenfalls Polynucleotide offenbart, die mit den hier vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt 96%, 97%, 98%, 99% Identität zwischen den Sequenzen vorliegen.
Zudem werden Polynucleotide offenbart, die unter stringenten Bedingungen mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung nur auftritt, wenn mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt. Die Polynucleotide, die mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren vorzugsweise Polypeptide, die entweder im wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das von den cDNAs von 1 (SEQ ID NR: 1) oder der/den hinterlegten cDNA(s) codiert wird.
Ein Beispiel „stringenter Hybridisierungsbedingungen" schließt die Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung ein, umfassend: 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Heringssperma DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C.
Alternativ kann das Polynucleotid mindestens 20 Basen, vorzugsweise 30 Basen und besonders bevorzugt mindesten 50 Basen besitzen, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren und das damit eine Identität aufweist, wie hier vorstehend beschrieben, und das die Aktivität beibehalten kann oder nicht. Beispielsweise können derartige Nucleotide als Sonden für das Polynucleotid von SEQ ID NR: 1 verwendet werden, beispielsweise zur Gewinnung des Polynucleotids oder als diagnostische Sonde oder als PCR-Primer.
Natürlich sind Polynucleotide, die mit einem größeren Anteil des Referenzpolynucleotids hybridisieren (z. B. dem hinterlegten cDNA-Clon), beispielsweise mit einem Anteil mit einer Länge von 50–750 nt oder sogar der Gesamtlänge des Referenzpolynucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Sonden nützlich, so wie die Polynucleotide, die den meisten, wenn nicht allen, Nucleotidsequenzen der hinterlegten cDNA oder der in 1 [SEQ ID NR: 1] dargestellten Nucleotidsequenz entsprechen. Mit einem Anteil eines Polynucleotids „mit einer Länge von mindestens 20 nt" sind beispielsweise 20 oder mehr aufeinander folgende Nucleotide von der Nucleotidsequenz des Referenzpolynucleotids (z. B. der hinterlegten cDNA oder der in 1 [SEQ ID NR: 1] dargestellten Nucleotidsequenz gemeint. Wie angegeben, sind derartige Anteile diagnostisch entweder als Sonde nach den herkömmlichen DNA-Hybridisierungsverfahren oder als Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) nützlich, wie beispielsweise bei Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, wobei die gesamte Offenbarung hier durch Bezugnahme einbezogen ist.
Da ein KGF-2-cDNA-Clon hinterlegt wurde und seine ermittelte Nucleotidsequenz in 1 [SEQ ID NR: 1 ] bereitgestellt wurde, wäre die Erzeugung von Polynucleotiden, die mit einem Teil des KGF-2-cDNA-Moleküls hybridisieren, für den Fachmann Routine. Beispiels weise könnte die Restriktionsendnucleasepaltung oder das Scheren des KGF-2-cDNA-Clons durch Ultraschall leicht verwendet werden, um DNA-Anteile mit verschiedenen Größen zu erzeugen, die Polynucleotide sind, die mit einem Anteil des KGF-2-cDNA-Moleküls hybridisieren. Alternativ könnten die hybridisierenden Polynucleotide der vorliegenden Erfindung synthetisch nach bekannten Verfahren erzeugt werden. Natürlich wäre ein Polynucleotid, das nur mit einer Poly-A-Sequenz (wie den terminalem 3'-Poly(A)-Schwanz der in 1 [SEQ ID NR: 1 ] dargestellten KGF-2-cDNA) oder mit einem komplementären Abschnitt von T- (oder U-) Resten nicht in ein erfindungsgemäßes Polynucleotid eingeschlossen, das verwendet wird, um mit einem Teil einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure zu hybridisieren, da ein derartiges Polynucleotid an jedes Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das einen Poly (A)-Abschnitt oder ein Komplement davon enthält (z. B. praktisch jeder doppelsträngige cDNA-Clon).
Es werden isolierte Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die Polypeptide codieren, die die folgenden Aminosäurereste in 1 (SEQ ID NR: 2) umfassen, die die hier genannten Erfinder als Antigenbereiche des KGF-2-Proteins ermittelt haben:
Es gibt auch zwei zusätzliche kürzere vorhergesagte Antigenbereiche, Gln74-Arg78 und Gln170-Gln175. Die Verfahren zur Erzeugung derartiger Epitop-tragender Anteile von KGF-2 werden nachstehend detailliert beschrieben.
Die Hinterlegung(en), auf die hier Bezug genommen wird, werden nach den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke des Patentverfahrens aufrechterhalten. Diese Hinterlegungen werden nur aus praktischen Gründen für den Fachmann bereitgestellt und sind keine Zulassung, dass eine Hinterlegung nach 35 U. S. C. § 112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten sind, sowie die Aminosäuresequenz der dadurch codierten Polypeptide werden hier unter Bezugnahme einbezogen und sind im Falle eines Konflikts mit irgendeiner Sequenzbeschreibung hier kontrollierend. Es kann eine Lizenz erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen und es wird hiermit keine derartige Lizenz ausgestellt.
KGF-2-Polypeptide und Fragmente
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mutante des KGF-2-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einer N-terminalen Deletionsmutante von KGF-2, wobei die Mutante aus der Aminosäuresequenz Ala (63) – Ser (208) der SEQ ID NR: 2 oder aus der Aminosäuresequenz Ala (63) – Ser (208) des Proteins besteht, das durch die in dem Plasmid ATCC 75977 enthaltene cDNA codiert ist, und wobei die Mutante ein N-terminales Methionin enthält;
(b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90%, 95%, 97% oder 99% mit der Aminosäuresequenz der KGF-2 Mutante nach (a) identisch ist;
(c) einem Polypeptid nach (a), wobei das Polypeptid mindestens eine Aminosäuresubstitution hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu und Lys(183)Glu.

Einem Fachmann ist bewusst, dass aufgrund der vorstehend diskutierten Möglichkeiten von Fehlern beim Sequenzieren sowie der Variabilität der Spaltungsstellen für Leader in verschiedenen bekannten Proteinen das tatsächliche von der hinterlegten cDNA codierte KGF-2-Polypeptid etwa 208 Aminosäuren umfasst, jedoch auch irgendwo im Bereich von 200–220 Aminosäuren liegen kann und die tatsächliche Leader-Sequenz dieses Proteins etwa 35 oder 36 Aminosäuren beträgt, jedoch auch irgendwo im Bereich von 30 bis etwa 40 Aminosäuren liegen kann.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bei Bezugnahme auf das Polypeptid von 1 (SEQ ID NR: 2) oder das von der hinterlegten cDNA bedeuteten ein Polypeptid, das im wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie ein derartiges Polypeptid beibehält. Somit schließt ein Analogon ein Proprotein ein, das durch Spaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Polypeptid herzustellen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid.
Das Fragment, das Derivat oder das Analogon des Polypeptids von 1 (SEQ ID NR: 2) oder das von der hinterlegten cDNA kann eines sein, bei dem (i) ein oder mehrere Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) ausgetauscht werden und derartige ausgetauschte Aminosäurereste können oder können nicht durch den genetischen Code codiert werden oder bei dem (ii) ein oder mehrere Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen oder eines, bei der (iii) das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids (beispielsweise Polyethylenglycol) zu erhöhen oder eines bei der (iv) die Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert ist, wie ein Leader oder eine sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids oder einer Proproteinsequenz eingesetzt wird. Man erwartet, dass derartige Fragmente, Derivate und Analoga aufgrund der hier gemachten Ausführungen im Anwendungsbereich des Fachmanns liegen.
Die Begriffe „Peptid" und „Oligopeptid" werden als Synonyme betrachtet (wie allgemein anerkannt wird) und jeder Begriff kann, so wie der Zusammenhang es erfordert, austauschbar verwendet werden, um eine Kette von mindestens zwei Aminosäuren anzugeben, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Das Wort „Polypeptid" wird hier für Ketten verwendet, die mehr als zehn Aminosäurereste enthalten. Alle Oligopeptid- und Polypeptidformeln oder Sequenzen hier werden von links nach rechts und in die Richtung von Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben.
Im Fachgebiet wird anerkannt, dass einige Aminosäuresequenzen des KGF-2-Polypeptids ohne signifikanten Effekt auf die Struktur oder die Funktion des Proteins variiert werden können. Wenn derartige Unterschiede in der Sequenz bedacht werden, sollte man sich daran erinnern, dass es kritische Bereiche auf dem Protein gibt, die die Aktivität bestimmen. Im allgemeinen ist es möglich, Reste zu ersetzen, die die tertiäre Struktur bilden, vorausgesetzt, dass Reste, die eine ähnliche Funktion ausüben, verwendet werden. In anderen Fällen kann die Art des Restes völlig unwichtig sein, wenn die Änderung an einem unkritischen Bereich des Proteins auftritt.
Somit schließt die Erfindung ferner Variationen von Mutanten der KGF-2-Polypeptide ein, die eine wesentliche KGF-2-Polypeptid-Aktivität zeigen oder die Bereiche des KGF-2-Proteins wie die nachstehend diskutierten Proteinanteile einschließen. Derartige Mutationen schließen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungssequenzen und Typsubstitutionen ein (beispielsweise die Substitution eines hydrophilen Rests mit einem anderen, jedoch in der Regel nicht einen stark hydrophilen mit einem stark hydrophoben). Kleine Änderungen oder derartige „neutrale" Aminosäuresubstitutionen haben im allgemeinen wenig Wirkung auf die Aktivität.
Die Substitution untereinander mit den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile, die Substitution der Hydroxylreste Ser und Thr, die Substitution der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und der Austausch zwischen den aromatischen Resten Phe, Tyr wird typischerweise als konservative Substitutionen angesehen.
Wie vorstehend detailliert angegeben, kann man weitere Anleitungen darüber, welche Aminosäuresubstitutionen wahrscheinlich phänotypisch still sind (d. h. wahrscheinlich keine signifikante zerstörerische Wirkung auf eine Funktion haben) bei Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: 1306–1310 (1990) finden.
Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt mimetische Peptide von KGF-2-Mutanten, die als therapeutische Peptide verwendet werden können. Mimetische Mutanten der KGF-2-Peptide sind kurze Peptide, die die biologische Aktivität der KGF-2-Mutanten nachahmen, indem sie an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie aktivieren. Mimetische Mutanten der KGF-2-Peptide können auch an die verwandten Rezeptoren von KGF-2 binden und sie hemmen. KGF-2-Rezeptoren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf FGFR2iiib und FGFR1iiib. Derartige mimetische KGF-2-Peptide werden aus Verfahren wie Phagen-Display oder kombinatorischer Chemie erhalten, sind aber nicht darauf begrenzt. Beispielsweise kann das Verfahren, das von Wrighton et al. Science 273: 458–463 (1996) offenbart wird, verwendet werden, um mimetische Mutanten der KGF-2-Peptide zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Polynucleotide werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung liegen vorzugsweise in einer isolierten Form vor. Mit „isoliertem Polypeptid" ist ein Polypeptid gemeint, das aus seiner nativen Umgebung entfernt wurde. Somit wird ein Polypeptid, das in einer rekombinanten Wirtszelle produziert wurde und/oder enthalten ist, als isoliert für die Zwecke der vorliegenden Erfindung betrachtet. Es sind auch Polypeptide gemeint, die teilweise oder wesentlich aus einer rekombinanten Wirtszelle oder einer nativen Quelle gereinigt wurden.
Wie vorstehend beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens 90%, 95%, 97% oder 99% mit der Aminosäuresequenz einer N-terminalen KGF-2-Mutante identisch ist, wobei die Mutante aus der Aminosäuresequenz Ala (63) – Ser (208) der SEQ ID NR: 2 oder aus der Aminosäuresequenz Ala (63) – Ser (208) des Proteins besteht, das von der in dem Plasmid ATCC 75977 enthaltenen cDNA codiert wird.
Wie aus dem Fachgebiet bekannt, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden bestimmt, indem die Aminosäuresequenz und ihre konservierten Aminosäuresubstituenten eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids verglichen wird.
Mit „%-Ähnlichkeit" für zwei Polypeptide ist eine Ähnlichkeitstrefferquote gemeint, die durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden Polypeptide unter Verwendung des Bestfit-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) und der Standardeinstellungen zur Ähnlichkeitsbestimmung erzeugt wird. Beim Bestfit-Programm werden die lokalen Homologiealgorithmen von Smith und Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482–489, 1981) verwendet, um das beste Ähnlichkeitssegment zwischen zwei Segmenten zu finden.
Mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die beispielsweise mindestens 95% „identisch" mit einer Referenzaminosäuresequenz eines KGF-2-Polypeptids ist, ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Referenzsequenz identisch ist, außer, dass die Polypeptidsequenz jeweils pro 100 Aminosäuren der Referenzaminosäuresequenz bis zu fünf Änderungen der Aminosäuren eines KGF-2-Polypeptids einschließen kann. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens 95% mit einer Referenzaminosäuresequenz identisch ist, können bis zu 5% der Aminosäurereste in der Referenzsequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden oder mehrere Aminosäuren von bis zu 5% der Gesamtaminosäurereste in der Referenzsequenz können in die Referenzsequenz eingebaut werden. Diese Änderungen der Referenzsequenz kann an der amino- oder carboxyterminalen Position der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen den terminalen Positionen auftreten, die entweder einzeln zwischen den Resten in der Referenz oder in einer oder mehreren aufeinander folgenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz verteilt sind.
In der Praxis kann unter Verwendung bekannter Computerprogramme wie das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) auf herkömmliche Weise bestimmt werden, ob irgendein bestimmtes Polypeptid mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit beispielsweise der in 1 [SEQ ID NR: 2] dargestellten Amino säuresequenz oder mit der vom hinterlegten cDNA-Clons codierten Aminosäuresequenz identisch ist. Bei der Verwendung von Bestfit oder irgendeinem anderen Programm zur Ausrichtung von Sequenzen, um zu bestimmen, ob eine bestimmt Sequenz beispielsweise 95% identisch mit einer Referenzsequenz nach der vorliegenden Erfindung ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass die prozentuale Identität über die gesamte Länge der Referenzaminosäuresequenz berechnet wird und dass Lücken bei der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl der Aminosäurereste in der Referenz zugelassen werden.
Wie nachstehend detailliert beschrieben, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um polyclonale und monoclonale Antikörper zu erzeugen, die bei diagnostischen Tests zum Nachweis der KGF-2-Proteinexpression, wie nachstehend beschrieben, nützlich sind oder sie können als Agonisten und Antagonisten verwendet, die die KGF-2-Proteinfunktion erhöhen oder hemmen können. Ferner können derartige Polypeptide im Zweihybridsystem der Hefe verwendet werden, um die KGF-2-Protein-bindenden Proteine zu „fangen", die ebenfalls Kandidaten-Agonisten und Antagonisten nach der vorliegenden Erfindung sind. Das Zweihybridsystem der Hefe wird bei Fields und Song, Nature 340: 245–246 (1989) beschrieben.
Dem Fachmann ist bewusst, dass Mutanten der KGF-2-Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden können, was zu chimeren Polypeptiden führt. Diese Fusionsproteine erleichtern die Reinigung und zeigen eine erhöhte Halbwertszeit in vivo. Das wurde z. B. für chimere Proteine gezeigt, die aus den ersten beiden Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten der Säugerimmunglobuline bestehen (EPA 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die eine Disulfid-verbundene dimere Struktur aufgrund des IgG-Anteils besitzen, können auch effizienter bei der Bindung und Neutralisierung anderer Moleküle sein als monomere KGF-2-Proteine oder Proteinfragmente allein (Fountoulakis et al., J Biochem 270: 3958–3964 (1995)).
Es werden auch neuartige Varianten der KGF-2-Mutanten beschrieben. Diese können hergestellt werden, indem eine oder mehrere Aminosäuren der KGF-2-Mutanten deletiert oder ersetzt werden. Natürliche Mutationen werden als allele Variationen bezeichnet. Allele Variationen können still sein (keine Änderung im codierten Polypeptid) oder können eine geänderte Aminosäuresequenz besitzen.
Um zu versuchen die Merkmale der KGF-2-Mutante zu verbessern oder zu ändern, können Protein-Engineering-Verfahren eingesetzt werden. Man kann rekombinante, dem Fachmann bekannte DNA-Technologie verwenden, um neuartige Polypeptide zu erzeugen. Muteine und Deletionen können z. B. erhöhte Aktivität oder erhöhte Stabilität zeigen. Zusätzlich könnten sie mit einem höheren Ertrag gereinigt werden und zumindest unter bestimmten Reinigungsbedingungen und Lagerbedingungen eine bessere Löslichkeit zeigen. Nachstehend sind Beispiele von Mutationen aufgeführt, die konstruiert werden können.
Aminoterminale und carboxyterminal Deletionen
Verschiedene Mitglieder der FGF-Familie wurden unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie modifiziert. Positiv geladene Moleküle wurden sowohl im aFGF als auch bFGF ersetzt oder deletiert, die für die Heparinbindung wichtig sind. Die modifizierten Moleküle führten zu einer reduzierten Heparin-bindenden Aktivität. Demnach ist bekannt, dass die Menge an modifiziertem Molekül, das von Heparin in einem Patienten komplexiert wird, reduziert würde, wobei die Wirksamkeit erhöht würde, je mehr FGF den geeigneten Rezeptor erreichen würde. ( EP 0 298 723 ).
Natives KGF-2 ist im wässrigen Zustand relativ instabil und es erfährt einen chemischen und physikalischen Abbau, der zum Verlust von biologischer Aktivität während der Verarbeitung und Lagerung führt. Natives KGF-2 neigt auch dazu, in wässriger Lösung bei erhöhten Temperaturen zu aggregieren und es wird unter sauren Bedingungen inaktiv.
Um ein oder mehrere Merkmale des nativen KGF-2 zu verbessern oder zu ändern, können Protein-Engineering-Verfahren verwendet werden. Ron et al., J. Biol. Chem., 268(4): 2984–2988 (1993) berichtete über modifizierte KGF-2-Proteine, die eine Heparin-bindende Aktivität besaßen, auch wenn die 3, 8, oder 27 aminoterminalen Aminosäurereste fehlten. Die Deletion von 3 und 8 Aminosäuren besaß volle Aktivität. Mehr Deletionen von KGF-2 wurden in PCT/IB95/00971 beschrieben. Die Deletion von carboxyterminalen Aminosäuren kann die Proteinaktivität erhöhen. Ein Beispiel ist Interferon gamma, das bis zu zehnmal höhere Aktivität durch Deletion von zehn Aminosäureresten aus dem Carboxyterminus des Proteins zeigt (Döbeli et al., J. of Biotechnology 7: 199–216 (1988)). Somit ist ein erfindungsgemäßer Aspekt, die Polypeptidanaloga von KGF-2 und die Nucleotidsequenzen derartiger Analoga von KGF-2 und Nucleotidsequenzen bereitzustellen, die derartige Analoga codieren, die eine erhöhte Stabilität (z. B. bei Exposition gegenüber einem typischen pH-Wert, Wärmebedingungen oder anderen Lagerbedingungen) im Verhältnis zum nativen KGF-2-Polypeptid zeigen.
Die erfindungsgemäßen nativen KGF-2-Polypeptide sind nachstehend dargestellt (die Nummerierung beginnt mit der ersten Aminosäure im Protein (Met)):
Ser(46)-Ser(208)
Pro(47)-Ser(208)
Glu (48)-Ser(208)
Ala (49)-Ser(208)
Thr(50)-Ser(208)
Asn(51)-Ser(208)
Ser(52)-Ser(208)
Ser(53)-Ser(208)
Ser(54)-Ser(208)
Ser(55)-Ser(208)
Ser(56)-Ser(208)
Phe (57)-Ser(208)
Ser(59)-Ser(208)
Ser(62)-Ser(208)
Ala(63)-Ser(208)
Gly(64)-Ser(208)
Arg(65)-Ser(208)
Val(57)-Ser(208)
Ser(69)-Ser(208)
Val(77)-Ser(208)
Die Erfindung schließt die N-terminalen Deletionen Ala (63) – Ser (208) (KGF-2Δ28) und Ser (69) – Ser (208) (KGF-2Δ33) ein. Weitere bevorzugte N-terminale und C-terminale Deletionsmutanten werden in den Beispielen 13 und 16 (c) der Beschreibung beschrieben und schließen ein:
Pro (47) – Ser (208) und Val (77) – Ser (208)
In die vorliegende Erfindung sind Deletionsmutanten, ebenfalls eingeschlossen, die Aminosäuren besitzen, die sowohl am N-Terminus als auch am C-Terminus deletiert sind. Diese Kombinationen können unter Verwendung rekombinanter, dem Fachmann bekannter Verfahren gemacht werden.
In der vorliegenden Patentanmeldung werden N-terminale Deletionsmutanten beschrieben. Derartige Mutanten schließen diejenigen ein, die die in 1 (SEQ ID NR: 2) dargestellten Aminosäuresequenz zeigen, außer eine Deletion mit mindestens den ersten 38 N-terminalen Aminosäureresten (d. h. eine Deletion von mindestens Met (1) – Gln (38)), jedoch nicht mehr als die ersten 147 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 38 N-terminalen Aminosäurereste (d. h. eine Deletion von mindestens Met (1) – Gln (38)), jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 46 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 62 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion die mindestens ersten 68 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 76 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 92 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 103 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein. Alternativ schließt die Deletion mindestens die ersten 122 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) ein.
Zusätzlich zu den Bereichen der vorstehend beschriebenen N-terminalen Deletionsmutanten werden in der vorliegenden Patentanmeldung auch alle Kombinationen der vorstehend beschriebenen Bereiche beschrieben, z. B. Deletionen mit mindestens den ersten 62 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 68 N-terminalen Aminosäureresten von
1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 62 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die ersten 76 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 62 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 92 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 62 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 103 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 68 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 76 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 68 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 92 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 68 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 103 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 46 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als den ersten 62 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 46 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als den ersten 68 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den ersten 46 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als den ersten 76 N-terminalen Aminosäureresten von 1 (SEQ ID NR: 2); etc. etc. etc.
In der vorliegenden Patentanmeldung werden auch C-terminale Deletionsmutanten beschrieben. Vorzugsweise ist der N-terminale Aminosäurerest der C-terminalen Deletionsmutauten Aminosäurerest 1 (Met), 36 (Thr) oder 37 (Cys) von 1 (SEQ ID NR: 2). Derartige Mutanten schließen diejenigen ein, die die in 1 (SEQ ID NR: 2) dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, außer eine Deletion mit mindestens dem letzten C-terminalen Aminosäurerest (Ser (208)), jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste (d. h. eine Deletion der Aminosäurereste Glu (154) – Ser (208) von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens den letzten C-terminalen Aminosäurerest ein, jedoch nicht mehr als die letzen 65 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die letzten 10 C-terminalen Aminosäurereste ein, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die letzten 20 C-terminalen Aminosäurereste ein, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die letzten 30 C-terminalen Aminosäure reste ein, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die letzten 40 C-terminalen Aminosäurereste ein, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ II) NR: 2). Alternativ schließt die Deletion mindestens die letzten 50 C-terminalen Aminosäurereste ein, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2).
Zusätzlich zu dem Bereichen der vorstehend beschriebenen C-terminalen Deletionsmutanten werden in der vorliegenden Patentanmeldung auch alle Kombinationen der vorstehend beschriebenen Bereiche beschrieben, z. B. Deletionen mit mindestens dem letzten C-terminalen Aminosäurerest, jedoch nicht mehr als die letzten 10 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens dem letzten C-terminalen Aminosäurerest, jedoch nicht mehr als die letzten 20 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens dem C-terminalen Aminosäurerest, jedoch nicht mehr als die letzten 30 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens dem C-terminalen Aminosäurerest, jedoch nicht mehr als die letzten 40 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den letzten 10 C-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die letzten 20 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den letzten 10 C-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die letzten 30 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den letzten 10 C-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die letzten 40 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); Deletionen mit mindestens den letzten 20 C-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die letzten 30 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2); etc. etc. etc.
In der vorliegenden Patentanmeldung werden auch Deletionsmutanten beschrieben, bei denen Aminosäurereste sowohl aus den N-terminalen als auch aus den C-terminalen Resten deletiert wurden. Derartige Mutanten schließen alle Kombinationen von N-terminalen Deletionsmutanten und vorstehend beschriebenen C-terminalen Deletionsmutanten ein. Derartige Mutanten schließen diejenigen ein, die die in 1 (SEQ ID NR: 2) dargestellten Aminosäuresequenz umfassen, außer eine Deletion mit mindestens den ersten 46 N-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) und eine Deletion mit mindestens dem letzten C-terminalen Aminosäurerest, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2). Alternativ kann die Deletion mindestens die ersten 62, 68, 76, 92, 103 oder 122 N-terminalen Aminosäurereste, jedoch nicht mehr als die ersten 137 N-terminalen Aminosäurereste von 1 (SEQ ID NR: 2) und eine Deletion mit mindestens 10, 20, 30, 40 oder 50 C-terminalen Aminosäureresten, jedoch nicht mehr als die letzen 55 C-terminalen Aminosäurereste von 1, einschließen.
Ferner werden alle Kombinationen der vorstehend beschriebenen Bereiche beschrieben.
Substitution der Aminosäuren
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt auch die Substitution von Aminosäuren ein. Nativer reifer KGF-2 enthält 44 geladene Reste, von denen 32 eine positive Ladung tragen. Abhängig vom Ort derartiger Reste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins kann die Substitution von einem oder mehreren dieser geclusterten Reste mit Aminosäuren, die eine negative Ladung oder eine neutrale Ladung tragen, die elektrostatischen Wechselwirkungen angrenzender Reste ändern und kann nützlich sein, um eine höhere Stabilität und geringere Aggregation des Proteins zu erreichen. Die Aggregation von Proteinen kann nicht nur zu einem Aktivitätsverlust führen, sondern auch bei der Herstellung pharmazeutischer Formulierungen problematisch sein, da sie immunogen sein können (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331–340 (1967), Robbins et al., Diabetes 36: 838–845 (1987), Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307–377 (1993)). Zur Reduzierung der Ladungsabstoßung sollte jede Modifikation in der Tertiärstruktur des Proteinmoleküls auf ein Minimum in Betracht gezogen werden. Somit sind Substitutionen von geladenen Aminosäuren mit einer anderen Ladung und mit neutralen oder negativ geladenen Aminosäuren von speziellem Interesse. Das letztere führt zu Proteinen mit einer verminderten positiven Ladung, um die Merkmale von KGF-2 zu verbessern. Derartige Verbesserungen schließen erhöhte Stabilität und die geringere Aggregation des Analogons im Vergleich zum nativen KGF-2-Protein ein.
Der Austausch von Aminosäuren kann auch die Selektivität der Bindung an Zelloberflächenrezeptoren verändern Ostade et al., Nature 361: 266–268 (1993) beschrieb bestimmte TNF-alpha-Mutationen, die an nur einen der beiden bekannten Rezeptoren zur selektiven Bindung von TNF-alpha führte.
KGF-2-Moleküle können eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Additionen entweder aufgrund natürlicher Mutation oder menschlicher Manipulation einschließen. Beispiele von einigen bevorzugten Mutationen sind:
Beispielsweise ist mit der Bezeichnung Ala (49) Gln gemeint, dass das Ala an Position 49 von 1 (SEQ ID NR: 2) durch Gln ersetzt ist.

Die Änderungen sind vorzugsweise von unbedeutender Natur wie konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder die Aktivität des Proteins nicht wesentlich beeinflussen. Dem Fachmann bekannte Beispiele konservativer Aminosäuresubstitutionen sind nachstehend aufgeführt:

Aromatisch:	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
Polar:	Glutamin Asparagin
Basisch:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Asparaginsäure Glutaminsäure
Klein:	Alanin Serin Threonin Methionin Glycin

Natürlich hängt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen, die ein Fachmann durchführen würde, von vielen Faktoren ab, einschließlich denjenigen, die vorstehend beschrieben wurden. Im allgemeinen beträgt die Anzahl der Substitutionen für jedes gegebene KGF-2-Polypeptid nicht mehr als 50, 40, 30, 20, 10, 5 oder 3, abhängig von der Zielsetzung. Beispielweise werden mehrere Substitutionen, die im C-Terminus von KGF-2 zur Verbesserung der Stabilität durchgeführt werden, vorstehend und in Beispiel 22 beschrieben.
Für die Funktion wesentliche Aminosäuren in KGF-2 können durch Verfahren, die aus dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie zielgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)) identifiziert werden. Das letztere Verfahren führt einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die sich ergebenden Molekülmutanten werden dann auf biologische Aktivität wie Rezeptorbindung oder in vitro- und in vivo-Proliferationsaktivität getestet. (Vgl. z. B. Beispiele 10 und 11). Stellen, die für die Liganden-Rezeptorbindung wichtig sind, können auch durch Strukturanalyse wie Kristallisation, magnetische Kernresonanz oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden. (Vgl. beispielsweise: Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904 (1992) und de Vos et al. Science, 255: 306–312 (1992).)
Die Substitution von Serin mit Cystein kann an den Aminosäurepositionen 106 und 150 erfolgen. Eine ungerade Anzahl von Cysteinen bedeutet, dass mindestens ein Cysteinrest für intermolekulare Quervernetzungen oder Bindungen verfügbar ist, die bewirken, dass das Pro tein eine unerwünschte Tertiärstruktur annimmt. Neuartige KGF-2-Proteine, bei denen ein oder mehrere Cysteine durch Serin oder z. B. Alanin ersetzt wurden, werden im allgemeinen mit einem höheren Ertrag von löslichem, korrekt gefalteten Protein gereinigt. Obwohl es nicht erwiesen ist, glaubt man, dass der Cysteinrest an Position 106 für die Funktion wichtig ist. Der Cysteinrest ist unter all den anderen FGF-Familienmitgliedern hoch konserviert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Fusionen von KGF-2 mit anderen Proteinen oder Fragmenten davon, wie Fusionen oder Hybride mit anderen FGF-Proteinen, z. B. KGF (FGF-7), bFGF, aFGF, FGF-5, FGF-6 etc. Über ein derartiges Hybrid wurde für KGF (FGF-7) berichtet. In der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. 90/08771 wurde ein chimeres Protein hergestellt, das aus den ersten 40 Aminosäureresten von KGF und dem C-terminalen Anteil von aFGF besteht. Über das Chimär wurde berichtet, das es Keratinocyten wie KGF anvisiert, ihm jedoch die Empfindlichkeit gegenüber Heparin fehlte, ein Merkmal von aFGF, jedoch nicht von KGF. Die Fusionen mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) zeigen oft eine erhöhte Halbwertszeit in vivo. Das wurde z. B. für chimere Proteine gezeigt, die aus den ersten beiden Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids mit verschiedenen Domänen der konstanten Bereiche der schweren oder leichten Ketten der Säuger-Immunglobuline bestehen (Europäische Patentanmeldung, Publikation Nr. 394 827, Traunecker et al., Nature 331, 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die eine mit Disulfidenverbundene dimere Struktur besitzen, können auch bei der Bindung von ausschließlich monomeren Molekülen effizienter sein. (Fountoulakis et al., J. of Biochemistry, 270: 3958–3964, (1995)).
Antigene/Hydrophile Teile von KGF-2
Wie in 4A–4E gezeigt, gibt es 4 sehr hydrophile Hauptbereiche im KGF-2-Protein. Die Aminosäurereste Gly41–Asn 71, Lys91–Ser 109, Asn 135–Tyr 164 und Asn 181–Ala 199 [SEQ ID NR: 25–28]. Es gibt zwei zusätzliche kürzere vorhergesagte antigene Bereiche Gln 74–Arg 78 und Gln 170–Gln 175. Man weiß, dass die hydrophilen Teile hauptsächlich an der Außenseite (Oberfläche) von Proteinen liegen und deshalb für Antikörper verfügbar sind, die diese Bereiche erkennen. Diese Bereiche sind auch wahrscheinlich an der Bindung von KGF-2 an seine(n) Rezeptoren) beteiligt. Synthetische Peptide, die von diesen Bereichen stammen, können mit der Bindung von KGF-2 an seine(n) Rezeptoren) interferieren und des halb die Funktion des Proteins blockieren. Synthetische Peptide aus den hydrophilen Teilen des Proteins können auch agonistisch sein, d. h. die Funktion von KGF-2 nachahmen.
Chemische Modifikationen
Mutanten der KGF-Polypeptide können weiter modifiziert werden, damit sie zusätzliche chemische Einheiten zu enthalten, die normalerweise nicht Teil des Proteins sind. Diese derivatisierten Einheiten können die Löslichkeit, die biologische Halbwertszeit oder die Absorption des Proteins verbessern. Die Einheiten können auch alle wünschenswerten Nebenwirkungen des Proteins oder dergleichen reduzieren oder eliminieren. Einen Überblick über jene Einheiten kann man bei REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) finden. Polyethylenglycol (PEG) ist eine solche chemische Einheit, die zur Herstellung therapeutischer Proteine verwendet wurde. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von PEG an Proteine gegen Proteolyse schützt Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137–139 (1991). Für die Bindung bestimmter PEG-Einheiten stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Für einen Überblick vgl. Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (Holcerberg und Roberts, Herausg.) S. 367–383 (1981). In vielen veröffentlichten Patenten werden die Derivate von PEG und die Verfahren beschreiben, wie sie hergestellt werden, z. B. Ono et al. U.S.-Patent Nr. 5,342,940; Nitecki et al. U.S.-Patent Nr. 5,089,261; Delgado et al. U.S.-Patent Nr. 5,349,052. Im allgemeinen sind die PEG-Moleküle mit dem Protein über eine reaktive Gruppe verbunden, die auf dem Protein zu finden ist. Für diese Bindung sind unter anderem die Aminogruppen z. B. auf Lysinen oder dem Aminoterminus des Proteins praktisch.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die gentechnisch mit den rekombinanten Vektoren hergestellt werden und die Herstellung von Mutanten der KGF-2-Polypeptide oder Fragmenten davon durch rekombinante Verfahren.
Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung der entsprechenden Polypeptide mit der gesamten Länge durch Peptidsynthese verwendet werden; deshalb können die Fragmente als Zwischenprodukte zur Herstellung der Polypeptide mit der gesamten Länge verwendet werden. Fragmente oder Teile der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit der gesamten Länge zu synthetisieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die gentechnisch mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren hergestellt werden, und die Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide durch rekombinante Verfahren.
Die Wirtszellen werden gentechnisch (transduziert oder transformiert oder transfiziert) mit den erfindungsgemäßen Vektoren hergestellt, die beispielsweise ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, eines Viruspartikel, eines Phagen etc. vorliegen. Die gentechnisch hergestellten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die für die Aktivierung von Promotoren, die Auswahl von Transformanten oder Amplifikation der KGF-2-Gene passend modifiziert werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind diejenigen, die früher mit der für die Selektion ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden und sind für den Fachmann offensichtlich.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Verfahren verwendet werden. Somit kann das Polynucleotid in irgendeinen aus einer Reihe von Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids eingebaut werden. Derartige Vektoren schließen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40, bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus, Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA stammen, Virus-DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpocken-Virus und Pseudotollwut ein. Jedoch kann jeder andere Vektor verwendet werden, solange er replizierbar und im Wirt überlebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor durch eine Reihe von Verfahren eingebaut werden. Im allgemeinen wird die DNA in (eine) geeignete Restriktionsendunucleaseschnittstelle(n) mittels aus dem Fachgebiet bekannter Verfahren eingebaut. Man glaubt, dass derartige und andere Verfahren und sonstiges im Anwendungsbereich des Fachmanns liegen.
Die DNA im Expressionsvektor ist funktional mit geeigneten Expressionskorttrollsequenzen (Promotor) verbunden, um die cDNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele derartiger Promotoren kann man erwähnen: LTR- oder SV40-Promotor, der E. coli lac- oder trp-Promotor, der Lambda-Phagen-P_L-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Genexpression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine ribosomale Bindestelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifikationsexpression enthalten.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere Selektionsmarkergene, wie Dihydrofolatreduktase oder Neomycin-Resistenz für eukaryontische Zellkultur oder ein derartiges wie Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion transformierter Wirtszellen in E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie hier vorstehend beschrieben, sowie einen geeigneten Promotor oder Kontrollsequenz enthält, kann zur Tranformation eines geeigneten Wirts verwendet werden, damit der Wirt das Protein exprimieren kann.
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte kann man erwähnen: Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen etc. Man glaubt, dass die Auswahl eines geeigneten Wirtes aufgrund der hier gemachten Ausführungen im Anwendungsbereich des Fachmanns liegt.
Genauer gesagt, schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere Sequenzen umfasst, wie ausführlich vorstehend beschrieben. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen Virusvektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung eingebaut wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen, einschließlich beispielsweise einen Promotor, der funktional mit der Sequenz verbunden ist. Dem Fachmann sind sehr viele geeignete Vektoren bekannt, und sie sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden anhand von Beispielen bereitgestellt:
Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 Qiagen), pBS, pD1O, Phagescript, psiX174, pBluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, so lange sie im Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Promotorbereiche können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit Selektionsmarkern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders zu nennende bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den unmittelbaren frühen CMV-Promotor, HSV-Thymidinkinase, den frühen und späten SV40-Promotor, LTRs aus einem Retrovirus und Maus-Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors liegt gut im Anwendungsbereich des Fachmanns.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)) erfolgen.
Die Konstrukte in Wirtszellen können auf herkömmliche Weise verwendet werden, um das Genprodukt herzustellen, das von der rekombinanten Sequenz codiert wird. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide synthetisch durch herkömmliche Peptidsynthisiergeräte hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Es können auch zellfreie Translationssysteme verwendet werden, um derartige Proteine zu produzieren, indem RNAs verwendet werden, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme eingebracht wird.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch höhere Eukaryonten codiert, wird durch den Einbau einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Verstärkerelemente sind cis-agierende DNA-Elemente, gewöhnlich von mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele schließen das SV-40-Verstärkerelemet auf der späten Seite des Replikationsursprungs von by 100 bis 270, ein Verstärkerelement des frühen Cytomegalovirus-Promotors, das Polyoma-Verstärkerelement auf der späten Seite des Replikationsursprungs und das Adenovirus-Verstärkerelement ein.
Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung, können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut werden. Die Signale können endogen zum Polypeptid sein oder sie können heterologe Signale sein.
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form, wie ein Fusionsprotein, exprimiert werden und kann nicht nur Sekretionssignale einschließen, sondern auch zusätzliche heterologe funktionale Bereiche. Beispielsweise kann dem N-Terminus des Polypeptids ein Bereich mit zusätzlichen Aminosäuren, insbesondere geladene Aminosäuren hinzugefügt werden, um die Stabilität und Persistenz während der Reinigung oder während der anschließenden Handhabung und Lagerung in der Wirtszelle zu verbessern. Dem Polypeptid können auch Peptideinheiten hinzugefügt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Derartige Bereiche können vor der endgültigen Herstellung des Polypeptids entfernt werden. Die Zugabe von Peptideinheiten zu Polypeptiden, um die Sekretion oder Exkretion zu erzeugen, um die Stabilität zu verbessern und, um unter anderem die Reinigung zu erleichtern, sind aus Fachgebiet bekannte und routinemäßige Verfahren. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfasst einen heterologen Bereich aus Immunglobulin, der nützlich ist, um Rezeptoren zu solubilisieren. Beispielsweise offenbart EP-A-O 464 533 (Kanadisches Gegenstück 2045869) Fusionsproteine, die verschiedene Anteile der konstanten Region von Immunglobulinmolekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder einem Teil davon umfasst. In vielen Fällen ist der Fc-Anteil im Fusionsprotein ausgesprochen vorteilhaft zur Verwendung bei der Therapie und der Diagnose und führt somit beispielsweise zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften (EP-A 0232 262). Andererseits wäre es für einige Verwendungszwecke wünschenswert, wenn man den Fc-Teil deletieren könnte, nachdem das Fusionsprotein in der vorteilhaften beschriebenen Weise exprimiert, nachgewiesen und gereinigt wurde. Das ist der Fall, wenn sich der Fc-Anteil als Hindernis zur Verwendung bei der Therapie und der Diagnose erweist, beispielsweise, wenn das Fusionsprotein als Antigen für Immunisierungen verwendet werden soll. Bei der Entdeckung von Medikamenten wurden beispielsweise menschliche Proteine wie shIL5- mit Fc-Anteilen zum Zweck von Durchmusterungstests mit hohem Durchsatz fusioniert, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren. Vgl. D. Bennett et al., Journal of Mole cular Recognition, Bd. 8, 52–58 (1995) und K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, Bd. 270, No. 16, S. 9459–9471 (1995).
Im allgemeinen schließen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und Selektionsmarker, die die Transformation der Wirtszelle zulassen, z. B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP 1-Gen und einen Promotor ein, der von einem hoch exprimiertem Gen stammt, um die Transkription einer stromabwärts liegenden Struktursequenz zu lenken. Derartige Promotoren können von Operons stammen, die unter anderem glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglycerinkinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in der geeigneten Phase mit Initiations- und Terminationssequenzen der Translation und vorzugsweise einer Leader-Sequenz zusammengefügt, die die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder in das extrazelluläre Medium lenkt. Fakultativ kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids codieren, das die gewünschten Merkmale verleiht, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden durch den Einbau einer strukturellen DNA-Sequenz konstruiert, die ein gewünschtes Protein zusammen mit den geeigneten Initiations- und Terminationssignalen der Translation in der funktionalen Lesephase mit einem funktionellen Promotor codieren. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypische Selektionsmarker und einen Replikationsursprung, um die Erhaltung des Vektors sicherzustellen und, um wenn gewünscht, die Amplifikation im Wirt bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl auch andere als Mittel der Wahl verwendet werden können.
Als repräsentatives, jedoch nicht begrenzendes Beispiel, können nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien einen Selektionsmarker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, der von im Handel erhältlichen Plasmiden stammt, die genetische Elemente des sehr gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Derartige im Handel erhältliche Vektoren schließen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322-„Rückgrad"-Abschnitte sind mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Wachstum bis zu einer geeigneten Zelldichte, wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion induziert und die Zellen werden für eine zusätzlichen Zeitraum gezüchtet.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel zerstört und der sich daraus ergebende Rohextrakt für eine weitere Reinigung zurückbehalten.
Die die bei der Expression von Proteinen verwendeten mikrobiellen Zellen können durch jedes praktische Verfahren, einschließlich einem Einfrier-Auftau-Zyklus, Ultraschall, mechanische Zerstörung oder Verwendung von zelllysierenden Agentien aufgebrochen werden, wobei derartige Verfahren dem Fachmann gut bekannt sind.
Verschiedene Säugerzellkultursysteme können auch verwendet werden, um das rekombinante Protein zu exprimieren. Beispiele von Säugerexpressionssystemen schließen die von Gluzman, Cell 23: 175 (1981) beschrieben COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten und andere Zelllinien ein, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können, beispielsweise die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinen. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Verstärker und auch jede notwendige ribosomale Bindestelle, Polyadenylierungsstelle, Spender- und Empfängerstellen beim Spleißen, Transkriptionsterminationssequenzen und nicht transkribierte flankierende 5'-Sequenzen. Die DNA-Sequenzen, die von dem SV40-Spleißvorgang stammen, und die Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Das KGF-2-Polypeptid kann aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren wie Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Lektinchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Es können gegebenenfalls Schritte zur Proteinfaltung durchgeführt werden, um Konfiguration des reifen Proteins zu vollenden. Schließlich kann die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt sein oder ein Produkt aus chemisch synthetischen Verfahren oder durch rekombinante Verfah ren aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt werden (beispielsweise durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur). Abhängig vom verwendeten Wirt, der bei einem rekombinanten Verfahren verwendet wird, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert sein oder können nicht glykosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch einen Methioninrest am Anfang einschließen.
Diagnostische und therapeutische Anwendungen von KGF-2
Wie in dem nachstehenden Abschnitt verwendet, soll sich „KGF-2" auf die hier beschriebenen reifen KGF-2-Formen und Formen mit der gesamten Länge von KGF-2 und auf die hier beschriebenen KGF-2-Analoga, Derivate und Mutationen beziehen. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des KGF-2-Gens als Teil eines diagnostischen Tests zum Nachweis von Krankheiten oder der Anfälligkeit für Krankheiten, die im Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Mutationen in den KGF-2-Nucleotidsequenzen stehen.
Individuen, die Mutationen im KGF-2-Gen tragen, können auf der DNA-Ebene durch eine Reihe von Verfahren entdeckt werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können aus den Zellen eines Patienten, wie aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt zum Nachweis verwendet werden oder kann enzymatisch unter Verwendung von PCR vor der Analyse amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324: 163–166 (1986)). RNA oder cDNA kann ebenfalls für denselben Zweck verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer verwendet werden, die zu den KGF-2 codierenden Nucleinsäuren komplementär sind, um KGF-2-Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Beispielsweise können Deletionen und Insertionen durch eine Änderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA mit radiomarkierter KGF-2-RNA oder alternativ mit radiomarkierten KGF-2-Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Perfekt übereinstimmende Sequenzen können von fehlgepaarten Duplexen durch RNase-A-Spaltung oder durch Unterschiede in der Schmelztemperatur unterschiedenen werden.
Auf DNA-Sequenzunterschieden basierende genetisches Tests können durch Nachweis der Änderung bei der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne denaturierenden Agentien erreicht werden. Kleine Sequenzdeletionen und Insertionen können durch hoch auflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit verschiedenen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, bei denen die Mobilitäten von verschiedenen DNA-Fragmenten im Gel an verschiedenen Positionen nach ihrem spezifischen Schmelz- oder partiellen Schmelztemperaturen verzögert werden (vgl. z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).
Sequenzänderungen an spezifischen Orten können auch durch Nuclease-Schutz-Tests wie RNase- und S1-Schutz oder dem chemischen Spaltungsverfahren gezeigt werden (z. B. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397–4401 (1985)).
Somit kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen erreicht werden (z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)) und Southern-Blot der genomischen DNA.
Zusätzlich zur herkömmlicheren Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch die in situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch einen diagnostischen Test zum Nachweis von veränderten KGF-2-Proteinspiegeln in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben das Vorhandensein einer Krankheit oder die Anfälligkeit für eine Krankheit, beispielsweise einen Tumor nachweisen kann. Tests, die verwendet werden, um KGF-2-Proteinspiegel in einer Probe nachzuweisen, stammen von einem Wirt, der dem Fachmann gut bekannt ist, und schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse, ELISA-Tests und den „Sandwich"-Test ein. Ein ELISA-Test (Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Kapitel 6, (1991)) umfasst zuerst die Herstellung eines für KGF-2-Antigen spezifischen Antikörpers vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Reporterantikörper gegen den monoclonalen Antikörper hergestellt. An den Reporterantikörper ist ein nachweisbares Reagenz wie Radioaktivität oder Fluoreszenz oder in diesem Beispiel ein Meerrettich-Peroxidase-Enzym gebunden. Dem Wirt wird eine Probe entnommen und auf einem festen Träger z. B. einer Polystryolschale, inkubiert, die die Proteine in der Probe bindet. Alle freien Proteinbindungsstellen auf der Schale werden dann durch Inkubation mit einem unspezifischen Protein wie Rinderserumalbumin abgedeckt. Dann binden die monoclonalen Antikörper an alle auf der Polystryolschale gebundenen KGF-2-Proteine. Alle ungebundenen monoclonalen Antikörper werden mit Puffer ausgewaschen. Der an die Meerrettich-Peroxidase -gebundene Reporterantikörper wird nun in eine Schale gegeben, was zur Bindung des Reporterantikörpers an jeden an KGF-2 gebundenen monoclonalen Antikörper führt. Ungebundener Reporterantikörper wird dann ausgewaschen. Die Peroxidasesubstrate werden dann in die Schale gegeben und die Menge der sich entwickelnden Farbe in einem gegebenen Zeitraum ist ein Maß für die KGF-2-Proteinmenge, die in einem gegebenen Volumen der Patientenprobe beim Vergleich mit einer Standardkurve vorliegt.
Ein Kompetitionstest kann verwendet werden, wobei die für KGF-2 spezifischen Antikörper an einen festen Träger gebunden sind und markiertes KGF-2 und eine Probe, die vom Wirt stammt, auf den festen Träger übertragen werden und die z. B. durch flüssige Szinillationschromatographie nachgewiesene Menge der Markierung mit einer Menge von KGF-2 kann in der Probe korreliert werden.
Ein „Sandwich"-Test ähnelt einem ELISA-Test. In einem „Sandwich"-Test wird KGF-2 auf einen festen Träger übertragen und bindet an den an einen festen Träger gebundenen Antikörper. Ein zweiter Antikörper wird dann an KGF-2 gebunden. Ein dritter Antikörper, der markiert ist und für den zweiten Antikörper spezifisch ist, wird dann auf den festen Träger übertragen und bindet an den zweiten Antikörper und eine Menge kann dann quantifiziert werden.
Die Polypeptide, ihre Fragmente und andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogen verwendet werden, die damit Antikörper produzieren. Diese Antikörper können beispielsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch chimere, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsgenbank ein. Es können verschiedene aus dem Fachgebiet bekannte Verfahren zur Herstellung derartiger Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Lebewesen oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Lebewesen, vorzugsweise nicht menschlich, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper bindet dann die Polypeptide selbst. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die die ganzen nativen Polypeptide binden. Derartige Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus dem Gewebe zu isolieren, das das Polypeptid exprimiert.
Zur Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper bereitstellt, die von kontinuierlichen Zelllinienkulturen produziert werden. Beispiele schließen das Hybridomverfahren (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495–497 (1975)), das Triomverfahren, das menschliche B-Zell-Hybridomverfahren (Kozbor, et al., Immunology Today 4: 72 (1983)) und das EBV-Hybridomverfahren ein, um menschliche monoclonale Antikörper herzustellen (Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96 (1985)).
Die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschriebenen Verfahren (U.S. Patent 4,946,778) können übernommen werden, um Einzelketten-Antikörper für erfindungsgemäße immunogene Polypeptidprodukte herzustellen. Es können auch transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper für die erfindungsgemäßen immunogenen Polypeptidprodukte zu exprimieren.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation des Wachstums neuer Blutgefäße oder der Angiogenese verwendet werden. Insbesondere können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung das Keratinocyten-Zellwachstum und die Proliferation stimulieren. Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Nutzung eines derartigen Polypeptids oder Polynucleotids bereit, das ein derartiges Polypeptid zur Herstellung eines Arzneimittels für therapeutische Zwecke codiert, beispielsweise, um die Proliferation der Epithelzellen und basalen Keratinocyten für Wundheilungszwecke zu stimulieren und um die Haarfollikelproduktion und die Heilung von Hautwunden zu stimulieren.
Wie vorstehend angemerkt, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Heilung von Hautwunden durch Stimulation der Epithelzellproliferation verwendet werden.
Diese Wunden können oberflächlicher Natur sein oder können tief sein und die Schädigung der Dermis und der Epidermis der Haut beinhalten. Somit stellt die vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels bereit, das konzipiert wurde, die Wundheilung zu fördern.
Bei dem Individuum, dem KGF-2 verabreicht wird, können Wunden mit normaler Geschwindigkeit heilen oder die Heilung beeinträchtigt sein. Bei Verabreichung an ein Individuum, das keine Beeinträchtigung der Heilung hat, wird KGF-2 verabreicht, um den normalen Heilungsprozess zu beschleunigen. Bei Verabreichung an ein Individuum, das eine Beein trächtigung der Heilung hat, wird KGF-2 verabreicht, um die Heilung von Wunden zu erleichtern, die ansonsten langsam oder überhaupt nicht heilen würden. Wie nachstehend angemerkt, können viele Leiden und Erkrankungen zu einer Hemmung der Heilung führen. Diese Leiden und Erkrankungen schließen Diabetes (z. B. Diabetes mellitus Typ II), die Behandlung mit sowohl Steroiden als auch anderen pharmakologischen Agentien und die ischämische Blockade oder Verletzungen ein. Steroide, von denen gezeigt wurde, dass sie die Wundheilung hemmen, schließen Cortison, Hydrocortison, Dexamethason und Methylprednisolon ein.
Es wurde auch gezeigt, dass nicht steroide Verbindungen, z. B. Octreotidacetat, ebenfalls die Wundheilung hemmen. Waddell, B. et al., Am. Surg. 63: 446–449 (1997). Man glaubt, dass die vorliegende Erfindung die Wundheilung bei Individuuen fördert, die sich einer Behandlung mit derartigen nicht Steroiden Agentien unterziehen.
Es wurde gezeigt, dass zahlreiche von Wachstumsfaktoren die Wundheilung bei Individuen fördert, deren Heilung beeinträchtigt ist. Vgl. z. B. Steed, D. et al., J. Am. Coll. Surg. 183: 61–64 (1996); Richard, J. et al., Diabetes Care 18: 64–69 (1995); Steed, D., J. Vasc. Surg. 21: 71–78 (1995); Kelley, S. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. 194: 320–326 (1990). Diese Wachstumsfaktoren schließen den Wachstumshormon-freisetzenden Faktor, den Thrombocyten-Wachstumsfaktor und den basischen Wachstumsfaktor ein. Somit umfasst die vorliegende Verbindung auch die Verabreichung von KGF-2 in Verbindung mit einem oder mehreren zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder einem anderen Mittel, das die Wundheilung fördert. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Heilung von anastomotischen und anderen durch chirurgische Eingriffe verursachten Wunden bei Individuen bereit, bei denen Wunden sowohl mit einer normalen Geschwindigkeit heilen als auch eine Beeinträchtigung der Heilung haben. Das Arzneimittel kann für die Verabreichung einer wirksamen Menge an KGF-2 an ein Individuum vor, nach und/oder während eines anastomotischen oder anderen chirurgischen Eingriffs konzipiert werden. Anastomose ist die Verbindung zweier röhrenartiger Strukturen, so wie das beispielsweise bei der Entfernung des mittleren Darmabschnitts erfolgt und die Verbindung der verbleibenden Anteile miteinander erfolgt, um den Intestinaltrakt wieder herzustellen. Im Gegensatz zur Heilung der Haut, ist der Heilungsvorgang von anastomotischen Wunden im allgemeinen nicht sichtbar. Ferner erfolgt die Wundheilung wenigstens im Gastrointestinaltrakt schnell ohne Komplikationen; jedoch erfordern Komplikationen oft die Korrektur durch zusätzliche chirurgische Eingriffe. Thornton, F. und Barbul, A., Surg. Clin. North Am. 77: 549–573 (1997).
Wie in den Beispielen 21 und 28 gezeigt, verursacht die Behandlung mit KGF-2 eine wesentliche Verringerung der peritonealen Insuffizienz und der anastomotischen Konstriktion, die auf eine Anastomose des Darms folgt. Man glaubt, dass KGF-2 diese Ergebnisse verursacht, indem der Heilungsprozess so die Wahrscheinlichkeit von auftretenden Komplikationen verringert, die auf derartige Verfahren folgen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beschleunigung der Heilung von anastomotischen und anderen, durch chirurgische Eingriffe verursachten Wunden bei Individuen bereit, bei denen Wunden mit einer normalen Geschwindigkeit heilen oder die eine Beeinträchtigung der Heilung haben.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um ein Arzneimittel zur Stimulation der Zelldifferenzierung, beispielsweise Muskelzellen, Zellen, die das Nervengewebe ausmachen, Prostatazellen und Lungenzellen herzustellen.
KGF-2 kann bei der Stimulation der Wundheilung von Wunden klinisch nützlich sein, einschließlich Operationswunden, Schnittwunden, tiefe Wunden, die eine Schädigung der Dermis und Epidermis beinhalten, Wunden des Augengewebes, Wunden des Dentalgewebes, Wunden der Mundhöhle, diabetische Geschwüre, Hautgeschwüre, Cubitusgeschwüre, arterielle Geschwüre, Venenstaugeschwüre, Verbrennungen, die auf Hitzeexposition oder Chemikalien zurückzufahren sind, in normalen Individuen und denjenigen einschließen, die Zuständen unterliegen, die eine abnorme Wundheilung induzieren wie Urämie, Mangelernährung, Vitaminmangel, Adipositas, Infektionen, Immunsuppression und Komplikationen, die mit systemischer Behandlung mit Steroiden, Strahlentherapie und antineoplastischen Medikamenten und Antimetaboliten assoziiert sind. KGF-2 ist auch für die Förderung der Wundheilung nützlich, die mit Ischämie und ischämischer Verletzung assoziiert ist, z. B. chronischer venöser Beingeschwüre, die von einer Hemmung des Rückflusses des venösen Blutkreislaufs und/oder Insuffizienz verursacht werden.
KGF-2 kann auch verwendet werden, um den Wiederaufbau der Haut nach Hautverlust zu fördern. Zusätzlich kann KGF-2 verwendet werden, um die Zugfestigkeit der Epidermis und die Epidermisdicke zu erhöhen.
KGF-2 kann verwendet werden, um die Haftung von Hauttransplantaten an ein Wundbett zu erhöhen und die Reepithelialisierung aus dem Wundbett zu stimulieren. Folgende sind Transplantatarten, bei denen KGF-2 verwendet werden könnte, um die Anheftung an ein Wundbett zu erhöhen: Autotransplantate, künstliche Haut, Allotransplantate, autodermale Transplantate, autoepidermale Transplantate, avaculäre Transplantate, Blair-Brown-Transplantate, Knochentransplantat, brephoplastische Transplantate, Cutistransplantat, verzögertes Transplantat, Hauttransplantat, Epidermistransplantat, Fascia-Transplantat, Vollhauttransplantat, heterologes Transplantat, Xenotransplantat, homologes Transplantat, hyperplastisches Transplantat, lamelläres Transplantat, Maschentransplantat, Schleimhauttransplantat, Ollier-Thiersch-Transplantat, Omentum-Plastik, Streifenplastik, Stiel-Transplantat, Spalthauttransplantat, dickes Spalthaut-Transplantat. KGF-2 kann verwendet werden, um die Hautfestigkeit zu fördern und das Erscheinungsbild gealterter Haut zu verbessern.
Man glaubt, dass KGF-2 auch Änderungen bei der Hepatocytenproliferation und der Epithelzellproliferation in der Lunge, Brust, Pankreas, Magen, Dünndarm und Dickdarm hervorruft. KGF-2 kann die Proliferation von Epithelzellen wie Sebocyten, Haarfollikel, Hepatocyten, Typ-II-Pneumocyten, Mucin-produzierenden Gobletzellen und anderen Epithelzellen und ihre in Haut, Lunge, Leber und dem Gastrointestinaltrakt enthaltenen Vorläufer fördern. Somit könnte KGF-2 die Proliferation und Differenzierung von Hepatocyten stimulieren und könnte somit verwendet werden, um Lebererkrankungen und Pathologien wie fulminantes, durch Zirrhose verursachtes Leberversagen, durch virale Hepatitis und toxische Substanzen verursachte Leberschäden (d. h. Acetaminophen, Tetrachloridkohlenstoff und andere aus dem Fachgebiet bekannte Hepatoxine) zu lindern oder zu behandeln. KGF-2 kann auch verwendet werden, um die Leberregeneration zu stimulieren oder zu fördern.
KGF-2 kann auch verwendet werden, um die Nebenwirkungen der Toxizität auf die Eingeweide zu reduzieren, die auf die Behandlung von Virusinfektionen, Strahlentherapie, Chemotherapie oder andere Behandlungen zurückzuführen sind. KGF-2 kann auch eine cryoprotektive Wirkung auf die Dünndarmschleimhaut haben. KGF-2 kann auch prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden, um Mucositis zu verhindern oder zu mildern und um die Heilung von Mucositis (z. B. Mund-, Speiseröhren-, Darm-, rektale und anale Geschwüre) zu stimulieren, die auf Chemotherapie, andere Agentien und Virusinfektionen zurückzuführen sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung oder Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Ereignissen der Schleimhaut, einschließlich Colitis ulcerosa, Morbus Crohn und anderen Krankheiten bereit, bei denen die Schleimhaut geschädigt wird. Die vorliegende Erfindung stellt auf ähnliche Weise ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung oder Behandlung von Mucositis des Mundes (einschließlich Odynophagie, die mit Schleimhautverletzungen im Pharynx und Hypopharynx assoziiert ist), der Speiseröhre, des Magens, des Colons und rektaler Mucositis bereit, unabhängig vom Mittel oder der Modalität, die diese Schädigung verursacht.
KGF-2 kann die Proliferation von Endothelzellen, Keratinocyten und basalen Keratinocyten fördern. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein in vitro-Verfahren zur Stimulation der Proliferation derartiger Zelltypen bereit, das das Inkontaktbringen der Zellen mit einer wirksamen Menge der Mutanten des KGF-2-Polypeptids der vorliegenden Erfindung beinhaltet. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation der Proliferation von Endothelzellen, Keratinocyten oder basalen Keratinocyten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der urothelialen Heilung bereit, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge von KGF-2 an ein Individuum. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beschleunigung der Heilung oder der Behandlung einer Reihe von Pathologien bereit, die die Urothelzellen betreffen (d. h. Zellen, die den Harntrakt auskleiden). Gewebeschichten, die derartige Zellen umfassen, können durch viele Mechanismen, einschließlich Katheterisierung, Operation oder bakterielle Infektion (d. h. eine Infektion durch einen Erreger, der eine sexuell übertragbare Krankheit wie Gonorrhö verursacht) beschädigt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Gewebeheilung im weiblichen Genitaltrakt. Gewebeschäden im weiblichen Genitaltrakt können durch eine Vielzahl von Zuständen, einschließlich Candida trichmoniasis-Infektionen, Garderella-, Gonorrhea-, Chlamydien-, Mycoplasmen-Infektionen und andere sexuell übertragbare Krankheiten verursacht werden.
Wie in den Beispielen 10, 18 und 19 gezeigt, stimuliert KGF-2 die Proliferation der epidermalen Keratinocyten und erhöht die Epidermisdicke. Somit können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der vollstän digen Regenerierung der Haut bei Voll- und Teilhautdefekten, einschließlich Verbrennungen (d. h. die Repopulation von Haarfollikeln, Schweißdrüsen und Talgdrüsen) und zur Behandlung anderer Hautdefekte wie Psoriasis verwendet werden.
KGF-2 kann zur Behandlung von Epidermolysis bullosa, ein Defekt bei der Anheftung der Epidermis an die darunterliegende Dermis, verwendet werden, der zu häufigen, offenen und schmerzhaften Blasen durch die Beschleunigung der Reepithelialisierung dieser Läsionen führt. KGF-2 kann auch verwendet werden, um Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüre zu behandeln und um zu helfen, die Schleimhaut schneller zu heilen und die die Drüsenschleimhaut zu regenerieren. Entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sind Krankheiten, die zur Zerstörung der Schleimhautoberfläche des Dünndarms bzw. des Dickdarms führen. Somit könnte KGF-2 verwendet werden, um die Erzeugung einer neuen Schleimhautoberfläche zu fördern, um die schnellere Heilung zu unterstützen und um das Fortschreiten der entzündlichen Darmerkrankungen zu verhindern oder abzuschwächen. Man erwartet, dass die KGF-2-Behandlung eine signifikante Wirkung auf die Schleimhautproduktion im Gastrointestinaltrakt hat und verwendet werden könnte, um die Darmschleimhaut vor verletzenden Substanzen zu schützen, die aufgenommen werden oder auf einen chirurgischen Eingriff folgen. Wie vorstehend angemerkt, kann KGF-2 auch verwendet werden, um die Heilung der Darm- oder Colonanastomose zu fördern. KGF-2 kann ferner verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die mit der Unterexpression von KGF-2 assoziiert sind.
Außerdem kann KGF-2 verwendet werden, um Lungenschäden aufgrund verschiedener pathologischer Zustände zu verhindern und zu heilen. Als Wachstumsfaktor könnte KGF-2 die Proliferation und Differenzierung stimulieren und die Reparatur der Alveolen und des Bronchienepithels fördern, um akute oder chronische Lungenschäden zu verhindern, abzuschwächen oder zu behandeln. Beispielsweise könnte ein Emphysem, das zu einem progressiven Alveolenverlust und Verletzungen beim Einatmen führt, d. h. die auf das Einatmen von Rauch und Verbrennungen zurückzuführen sind, was die Nekrose des Bronchienepithels und Alveolen verursacht, effektiv unter Verwendung von KGF-2 behandelt werden. KGF-2 könnte auch verwendet werden, um bei Frühgeburten die Proliferation und Differenzierung von Typ-II-Pneumonocyten zu stimulieren, die helfen können, Krankheiten wie hyaline Membranerkrankungen wie das Atemnotsyndrom des Neugeborenen und bronchopulmonäre Displasie zu behandeln.
Die drei Ursachen des akuten Nierenversagens sind prärenal (z. B. Herzversagen), intrinsisch (z. B. Nephrotoxizität, die durch chemotherapeutische Agentien verursacht wird) und postrenal (z. B. die Obstruktion des Harntraktes), die zu einem Zelltod der Nierentubuli, Obstruktion des tubulären Lumens und dem Rückfluss von Filtrat in die Glomeruli führt (Über-sichtartikel von Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334: 1448–1460 (1996)). Wachstumsfaktoren wie der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I, das osteogene Protein-1, der Hepatocytenwachstumsfaktor und der epidermale Wachstumsfaktor haben das Potential für die Verbesserung der Nierenerkrankung in Tiermodellen gezeigt. Taub et al., Cytokine 5: 175–179 (1993); Vukicevic et al. J. Am. Soc. Nephrol. 7: 1867 (1996). KGF-2 kann die Proliferation und Differenzierung der Nierenzellen stimulieren und könnte somit verwendet werden, um Nierenerkrankungen und Pathologien wie akutes oder chronisches Nierenversagen und das Endstadium einer Nierenerkrankung zu lindern oder zu behandeln.
KGF-2 könnte die Proliferation und Differenzierung von Brustgewebe stimulieren und könnte deshalb verwendet werden, um die Heilung von Verletzungen des Brustgewebes aufgrund eines chirurgischen Eingriffes, Trauma oder Krebs zu fördern.
Zusätzlich könnte KGF-2 verwendet werden, um den Ausbruch von Diabetes mellitus zu behandeln oder zu vermeiden. KGF-2 könnte bei Patienten mit neu diagnostiziertem Diabetes Typ I und II, bei dem noch etwas Zellfunktion vorhanden ist, verwendet werden, um die Funktion der Inselzellen zu erhalten, so dass die dauerhafte Manifestation der Krankheit gelindert, verzögert oder vermieden wird. KGF-2 könnte auch als Hilfsmittel bei der Inselzellentransplantation verwendet werden, um die Funktion der Inselzellen zu verbessern oder zu fördern.
Ferner könnte die antiflammatorische Eigenschaft von KGF-2 für die Behandlung von akuten oder chronischen Erkrankungen nützlich sein, bei denen die Entzündung eine Schlüsselpathogenese der Erkrankung ist, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Psoriasis, Ekzem, Dermatitis und/oder Arthritis. Somit stellt die vorliegende Erfindung bei einem Individuum die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung oder Abschwächung der Entzündung und Erkrankungen bereit, die eine Entzündung beinhalten.
KGF-2 kann verwendet werden, um die Schädigung von Gehirngewebe aufgrund einer Verletzung durch Trauma, eines chirurgischen Eingriffes oder Chemikalien zu heilen oder zu lindern.
Zusätzlich könnte, da KGF-2 die Epidermisdicke erhöht, das Protein verwendet werden, um alternde Haut zu verbessern, die Faltenbildung der Haut zu reduzieren und die Narbenbildung nach einem chirurgischen Eingriff zu reduzieren. Die Narbenbildung von Wundgeweben beinhaltet oft die Hyperproliferation von Hautfibroblasten. Wie in Beispiel 10 angemerkt, wird die Fibroblastenproliferation nicht von KGF-2 stimuliert. Deshalb scheint KGF-2 für epidermale Keratinocyten mitogenspezifisch zu sein und induziert die Wundheilung mit minimaler Narbenbildung. Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Heilung von Wunden mit minimaler Narbenbildung bereit. KGF-2 kann vor, während und/oder nach dem Prozess, der die Wunde erzeugt (z. B. kosmetische Operation, zufälliges oder absichtliches Gewebetrauma, verursacht durch einen scharfen Gegenstand), verabreicht werden.
Wie vorstehend angemerkt, stimuliert KGF-2 auch die Proliferation von Keratinocyten und Haarfollikeln und kann deshalb verwendet werden, um das Haarwachstum bei schütter werdendem Haar und bei Haartransplantationspatienten zu fördern. Somit stellt die vorliegende Erfindung ferner die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Produktion von Haarfollikeln bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zum Schutz eines Individuums vor ionisierender Strahlung, Chemotherapie oder Behandlung mit antiviralen Agentien bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Gewebeschäden bereit, die auf die Exposition mit ionisierender Strahlung, chemotherapeutischen Agentien oder antiviralen Agentien zurückzuführen sind. Ein Individuum kann einer ionisierenden Strahlung aus einer Vielzahl von Gründen, einschließlich therapeutischer Zwecke (z. B. für die Behandlung von hyperproliferativen Störungen), als Folge einer zufälligen Freisetzung eines radioaktiven Isotops in die Umgebung oder während nicht invasiver medizinischer diagnostischer Verfahren (z. B. Röntgenstrahlen) ausgesetzt sein. Ferner ist eine wesentliche Anzahl von Personen radioaktivem Radon an ihren Arbeitsplätzen und Zuhause ausgesetzt. Diese ständige Langzeitexposition in der Umwelt wurde verwendet, um eine Einschätzung der Lebenserwartung zu erstellen. Johnson, W. und Kearfott, K., Health Phys. 73: 312–319 (1997). Wie in Beispiel 23 gezeigt, erhöhen die Proteine der vorliegenden Erfindung das Überleben von Tieren, die Strahlung ausgesetzt sind. Somit kann KGF-2 verwendet werden, um die Überlebensraten von Individuen zu erhöhen, die an strahleninduzierten Verletzungen leiden, um Individuen vor sublethalen Strahlungsdosen zu schützen und das therapeutische Verhältnis der Bestrahlung bei der Behandlung von Erkrankungen wie hyperproliferative Störungen zu erhöhen.
KGF-2 kann auch verwendet werden, um Individuen vor Strahlungsdosen, Chemotherapeutika oder antiviralen Agentien zu schützen, die normalerweise nicht toleriert werden würden. Bei dieser Verwendungsweise, oder wie anderweitig hier beschrieben, kann KGF-2 vor, nach und/oder während der Strahlentherapie/Exposition, Chemotherapie oder Behandlung mit antiviralen Agentien verabreicht werden. Hohe Strahlungsdosen und Chemotherapeutika können insbesondere bei der Behandlung eines Individuums nützlich sein, das ein fortgeschrittenes Stadium eines Leidens wie eine hyperproliferative Störung aufweist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermeidung oder Behandlung von Erkrankungen wie strahleninduzierte und gastrointestinale Verletzungen, Mucositis, Darmfibrose, Proktitis, strahleninduzierte Lungenfibrose, strahleninduzierte Pneumonitis, strahleninduzierte Pleuraretraktion, strahleninduziertes hämopoetisches Syndrom, strahleninduzierte Myelotoxizität bereit.
KGF-2 kann alleine oder in Verbindung mit einem oder mehreren zusätzlichen Agentien verwendet werden, die einen Schutz vor Strahlung oder anderen Agentien verleihen. Es wurde gezeigt, dass eine Anzahl von Cytokinen (z. B. IL-1, TNF, IL-6, IL-12) einen derartigen Schutz verleihen. Ygl. z. B., Neta, R. et al., J. Exp. Med. 173: 1177 (1991). Zusätzlich wurde gezeigt, dass IL-11 die Schleimhautzellen des Dünndarms nach kombinierter Strahlung und Chemotherapie, Du, X. X. et al., Blood 83: 33 (1994) sowie strahleninduzierter Verletzung des Thoraxes schützt. Redlich, C. A. et al., J. Immun. 157: 1705–1710 (1996). Man hat auch gezeigt, dass mehrere Wachstumsfaktoren einen Schutz vor Strahlenexposition verleihen, z. B. der Fibroblasten-Wachstumsfaktor und der transformierende Wachstumsfaktor beta-3. Ding, I. et al., Acta Oncol. 36: 337–340 (1997); Potten, C. et al., Br. J. Cancer 75: 1454–1459 (1997).
Wie hier verwendet, ist mit „Individuum" ein Tier, vorzugsweise ein Säuger (wie Menschenaffen, Kühe, Pferde, Schweine, Eber, Schafe, Nagetiere, Ziegen, Hunde, Katzen, Hühner, Affen, Kaninchen, Frettchen, Wale und Delfine) und besonders bevorzugt ein Mensch gemeint.
Die Signalsequenz von KGF-2, die die Aminosäuren 1 bis 35 oder 36 codiert, kann verwendet werden, um sekretierte Proteine im allgemeinen durch Hybridisierung und/oder computergestützten Suchalgorithmen zu identifizieren.
Die Nucleotidsequenz von KGF-2 könnte verwendet werden, um 5'-Sequenzen durch Hybridisierung zu isolieren. Plasmide, die das KGF-2-Gen unter der Kontrolle seiner nativen Promotor-/Verstärkersequenzen umfassen, könnten dann in in-vitro-Studien verwendet werden, die auf die Identifizierung von endogenen zellulären und viralen Transaktivatoren des KGF-2-Gens abzielen.
Das KGF-2-Protein kann auch als Positivkontrolle bei Experimenten verwendet werden, die so konzipiert sind, dass Peptidomimetika identifiziert werden, die auf den KGF-2-Rezeptor wirken.
Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt ein Verfahren zur Nutzung derartiger Polypeptide oder Polynucleotide, die derartige Polypeptide für in vitro-Zwecke codieren, die mit wissenschaftlicher Forschung, DNA-Synthese, Herstellung von DNA-Vektoren zusammenhängen sowie für Bereitstellungszwecke von Diagnostika und Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten beim Menschen.
Fragmente des KGF-2-Gens mit der gesamten Länge können als Hybridisierungssonde für eine cDNA-Genbank verwendet werden, um KGF-2-Gene mit der gesamten Länge zu isolieren und um andere Gene zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit diesen Genen oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieser An besitzen mindestens 20 Basen. Vorzugsweise besitzen die Sonden jedoch mindestens 30 Basen und besitzen im allgemeinen nicht mehr als 50 Basen, auch wenn sie eine größere Anzahl von Basen besitzen können. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon zu identifizieren, der einem Transkript mit der gesamten Länge und einem genomischen Clon oder Clonen entspricht, die das vollständige KGF-2-Gen, einschließlich regulatorischer und Promotorbereiche, Exons und Introns enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die Isolierung des codierenden Bereichs des KGF-2-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Markierte Oligonucleotide, die eine Sequenz besitzen, die zu derjenigen des Gens der vorliegenden Erfindung komplementär sind, werden verwendet, um eine Genbank mit menschlicher cDNA, genomischer DNA oder cDNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Genbank die Sonde hybridisiert.
Die vorliegende Patentanmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Identifizierung des Rezeptors für das KGF-2-Peptid. Das Gen, das den Rezeptor codiert, kann durch zahlreiche aus dem Fachgebiet bekannte Verfahren identifiziert werden, beispielsweise Liganden-Panning und FACS-Sortieren (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Kapitel 5 (1991)). Vorzugsweise wird die Expressionsclonierung verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf die Polypeptide reagiert, und eine cDNA-Genbank, die aus dieser RNA erzeugt wurde, wird in Pools aufgeteilt und verwendet, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die nicht auf die Polypeptide reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden den markierten Polypeptiden ausgesetzt. Die Polypeptide können durch eine Reihe von Mitteln, einschließlich Jodierung oder Einschluss der Erkennungsstelle für eine zielspezifische Proteinkinase markiert werden. Nach der Fixierung und Inkubation werden die Objektträger einer autoradiographischen Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert und Unterpools hergestellt und unter Verwendung eines itinerativen Subpooling-Verfahrens und eines erneuten Durchmusterungsvorganges erneut transfiziert, wobei man schließlich einen Einzelclon gewinnt, der den vermeintlichen Rezeptor codiert.
Als alternativen Ansatz zur Rezeptoridentifizierung können die Polypeptide mittels Photoaffinität mit Zellmembran- oder Extraktpräperationen verbunden werden, die das Rezeptormolekül exprimieren. Quervernetztes Material wird durch PAGE-Analyse aufgelöst und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der markierte Komplex, der die Rezeptoren der Polypeptide enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und einer Proteinmikrosequenzierung unterzogen werden. Die aus der Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz würde verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotidsonden zu konstruieren, um eine cDNA-Genbank zur Identifizierung der Gene zu durchmustern, die die vermeintlichen Rezeptoren codieren.
Diese Patentanmeldung beschreibt außerdem ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen, um diejenigen zu identifizieren, die die Wirkung von KGF-2 beinträchtigen oder die Funktion von KGF-2 blockieren. Ein Beispiel eines derartigen Tests umfasst die Kombination einer Säuger-Keratinocytenzelle, der zu durchmusternden Verbindung und ³[H]-Tymidin unter Zellkulturbedingungen, bei denen die Keratinocytenzelle normalerweise proliferiert. Man kann in Abwesenheit der zu durchmusternden Verbindung einen Kontrolltest durchführen und mit der Menge der Keratinocyten-Proliferation in Gegenwart der zu bestim menden Verbindung vergleichen, wenn die Verbindung die Proliferation der Keratinocyten stimuliert.
Um nach Antagonisten zu durchmustern, kann derselbe Test in Gegenwart von KGF-2 hergestellt werden und die Fähigkeit der Verbindung, die Keratinocytenproliferation zu verhindern, wird gemessen und es wird eine Bestimmung der Antagonistenfähigkeit durchgeführt. Die Menge der Kerationocytenzell-Proliferation wird durch Flüssigkeitsszintillations-Chromatographie gemessen, die den Einbau von ³[H]-Tymidin misst.
In einem anderen Verfahren würde man eine Säugerzellen- oder eine Membranpräparation, die den KGF-2-Rezeptor exprimieren, mit markiertem KGF-2 in Gegenwart der Verbindung inkubieren. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu verstärken oder zu blockieren könnte dann gemessen werden. Alternativ würde man die Reaktion eines bekannten zweiten Botenstoffes messen, die auf die Wechselwirkung von KGF-2 folgt, und der Rezeptor würde in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung gemessen und verglichen werden. Derartige zweite Botenstoffsysteme schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf cAMP Guanylatcyclase, Innenkanäle oder Phosphoinositidhydrolyse.
Beispiele potenzieller KGF-2-Antagonisten schließen einen Antikörper oder in einigen Fällen ein Oligonucleotid ein, das an das Polypeptid bindet. Alternativ kann ein potenzieller KGF-2-Antagonist eine Mutantenform von KGF-2 sein, die an KGF-2-Rezeptoren bindet, jedoch wird kein zweiter Botenstoff gewonnen, und deshalb wird die Wirkung von KGF-2 wirksam blockiert.
Ein weiterer potenzieller KGF-2-Antagonist ist ein Antisense-Konstrukt, das unter Verwendung der Antisense-Technologie hergestellt wird. Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Dreifachhelixbildung oder Antisense-DNA oder RNA zu kontrollieren, dessen beide Verfahren auf die Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der codierende 5'-Anteil der Polynucleotidsequenz, der das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu konstruieren. Es wird ein DNA-Oligonucleotid konstruiert, das komplementär zu einem Bereich des Gens sein soll, der an der Transkription beteiligt ist (Dreifachhelix – vgl. Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988) und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)), und dabei wird die Transkription und die Herstellung von KGF-2 verhindert. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der cDNA in vivo und blockiert die Transla tion des cDNA-Moleküls in das KGF-2-Polypeptid (Antisense – Okano, J., Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch in Zellen eingebracht werden, so dass die Antisense-RNA oder DNA in vivo exprimiert werden kann, um die KGF-2-Produktion zu hemmen.
Potenzielle KGF-2-Antagonisten schließen kleine Moleküle ein, die an die Bindungsstelle des KGF-2-Rezeptors binden und sie besetzen, um dabei den Rezeptor für KGF-2 unzugänglich machen, so dass die normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele kleiner Moleküle schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf kleine Peptide oder peptidartige Moleküle.
Die KGF-2-Antagonisten können verwendet werden, um die Induktion des Wachstums neuer Blutgefäße oder die Angiogenese in Tumoren zu verhindern. Die Angiogenese, die von KGF-2 stimuliert wird, trägt ebenfalls zu mehreren Pathologien bei, einschließlich diabetischer Retinopathie und Hemmung des Wachstums von pathologischem Geweben wie bei der rheumatoiden Arthritis, die auch von den Antagonisten der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
KGF-2-Antagonisten können auch verwendet werden, um Glomerulonephritis zu behandeln, die durch die deutliche Proliferation von glomerulären Epithelzellen charakterisiert wird, die eine zelluläre Masse bilden, die den Bowman'schen Raum ausfüllen.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um die Überproduktion des Narbengewebes bei Keloidbildung nach einem chirurgischen Eingriff, Fibrose nach einem Myocardinfakt oder fibrotische Läsionen, die mit Lungenfibrose assoziiert sind, und Restenose zu hemmen. KGF-2-Antagonisten können auch verwendet werden, um andere durch KGF-2 stimulierte, proliferative Erkrankungen einschließlich Krebs und Karposi-Sarkom zu behandeln.
KGF-2-Antagonisten können auch verwendet werden, um Keratitis zu behandeln, die eine chronische Infiltration der tiefen Schichten der Cornea mit uvealer Entzündung ist, die durch eine Proliferation der Epithelzellen charakterisiert ist.
Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie z. B. nachstehend beschrieben, verwendet werden. Die hier beschriebenen Polypeptide, Agonisten und Antagonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden, um ein Arzneimittel zu umfassen. Derartige Zusammensetzung umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids, Agonisten oder Antagonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Ein derartiger Träger schließt, ist aber nicht begrenzt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte der Verabreichungsart angepasst sein.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Verpackung oder einen Kit bereit, die/der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren Bestandteilen des erfindungsgemäßen Arzneimittels gefüllt sind. Derartige Behältern kann ein Beipackzettel in der von einer Behörde vorgeschriebenen Form beiliegen, der die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf der Arzneimittel oder der biologischen Produkte regelt, wobei der Beipackzettel die Genehmigung durch die Behörde, die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf für die Verabreichung am Menschen wiederspiegelt. Zusätzlich können die Polypeptide, Agonisten und Antagonisten der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen Therapeutika verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Excipienten verabreicht werden. Es klar, dass die tägliche Dosis der Arzneimittel der vorliegenden Erfindung bei Verabreichung an einen menschlichen Patienten von dem anwesenden Arzt im Rahmen einer vernünftigen medizinischen Beurteilung entschieden wird. Das spezifische, therapeutisch wirksame Dosierungsniveau für jeden bestimmten Patienten hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Art und dem Grad der Reaktion, der erreicht werden soll; der verwendeten spezifischen Verbindung eines anderen Mittels, wenn es eines gibt; Alter, Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht und Ernährung des Patienten; Verabreichungszeitraum, Verabreichungsweg und Ausscheidungsrate der Zusammensetzung; Behandlungsdauer; Medikamente (wie Chemotherapeutika), die in Kombination oder zusammen mit der spezifischen Zusammensetzung verwendet werden und ähnliche Faktoren, die im medizinischen Fachgebiet gut bekannt sind. Geeignete, aus dem Fachgebiet bekannte Formulierungen kann man bei Remington's Pharmaceutical Sciences (neueste Ausgabe), Mack Publishing Company, Easton, PA finden. Die in der Therapie zu verwendenden Zusammensetzungen, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen, werden auf eine Weise formuliert und dosiert, die mit der guten medizinischen Praxis vereinbar ist, wobei der klinische Zustand des einzelnen Patienten (insbesondere die Nebenwirkungen der Behandlung mit KGF-2 alleine), der Ort, an den die KGF-2-Zusammensetzung gelangt, das Verabreichungsverfahren, der Verabreichungszeitplan und andere dem Arzt bekannte Faktoren in Betracht gezogen werden. Die „wirksame Menge" von KGF-2 für die Zwecke hier (einschließlich einer KGF-2-wirksamen Menge) wird durch derartige Überlegungen bestimmt.
Die Arzneimittel können auf eine bequeme Weise wie durch orale, topische, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intraartikuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege verabreicht werden. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die für die Behandlung und/oder Prophylaxe der spezifischen Indikation wirksam ist. In den meisten Fällen liegt die Dosierung im Bereich von 1 μg/kg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht täglich, wobei die Verabreichungswege, Symptome etcberücksichtigt werden. In dem spezifischen Fall des topischen Verabreichungswegs werden die Dosierungen vorzugsweise von etwa 0,01 μg bis 9 mg pro cm² verabreicht.
Als allgemeiner Vorschlag liegt die pharmazeutisch wirksame KGF-2-Gesamtmenge, die parenteral besonders pro bevorzugter Dosierung verabreicht wird, im Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis etwa 100 mg/kg/Tag des Körpergewichtes des Patienten, obwohl dies, wie vorstehend angemerkt, dem therapeutischen Ermessen unterliegt. Wenn KGF-2 kontinuierlich verabreicht wird, wird er typischerweise mit einer Dosisrate von etwa 1 μg/kg/Stunde bis etwa 50 μg/kg/Stunde entweder mittels 1–4 Injektion pro Tag oder durch ständige subkutane Infusionen beispielsweise unter Verwendung einer Minipumpe verabreicht. Eine intravenöse Lösung im Beutel oder eine Lösung in der Flasche kann ebenfalls verwendet werden.
Der KGF-2-Behandlungsverlauf, um das fibrinolytische System zu beeinflussen, erscheint optimal, wenn er länger als ein bestimmtes Minimum an Tagen fortgesetzt wird; 7 Tage im Fall von Mäusen. Die Länge der benötigten Behandlung, um Änderungen zu beobachten, und das Intervall, das auf die Behandlungen, für Reaktionen folgt, die auftreten sollen, scheinen abhängig vom gewünschten Effekt zu variieren.
KGF-2 wird auch von Selbstfreisetzungssystemen geeignet verabreicht. Geeignete Beispiele der Selbstfreisetzungszusammensetzungen schließen semipermeable Polymermatizes in Form von geformten Artikeln z. B. Filmen oder Mikrokapseln ein. Selbstfreisetzungs-Matrizes schließen Polyactide (U.S. Pat. Nr. 3,773,919, EP 58,481 ), Copolymere der L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers 22: 547–556 (1983)), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167–277 (1981) und R. Langer, Chem. Tech. 12: 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ) ein. Selbst freisetzende KGF-2-Zusammenset zungen schließen auch in Liposomen eingeschlossenen KGF-2 ein. Liposomen, die KGF-2 enthalten, werden durch per se bekannte Verfahren hergestellt: DE 3,218,121 ; Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030–4034 (1980); EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ; EP 142,641 , Japanische Patentanmeldung 83-118008; U.S. Pat. Nr. 4,485,045 und 4,544,545 und EP 102,324 . Normalerweise sind Liposomen von der kleinen (etwa 200–800 Angström) unilamellaren An, bei der der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei die gewählte Proportion für die optimale KGF-2-Therapie eingestellt wird.
Für die parenterale Verabreichung wird in einer Ausführungsform KGF-2 im allgemeinen durch Mischen des gewünschten Reinheitsgrades in einer injizierbaren Form als Einheitsdosis (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger gemischt, d. h. einen, der für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise schließt die Formulierung vorzugsweise keine oxidierenden Agentien und andere Bestandteile ein, von denen bekannt ist, dass sie schädlich für Polypeptide sind.
Im allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, indem das KGF-2 einheitlich und nahe mit flüssigen oder fein verteilten festen Trägern oder beiden in Kontakt gebracht wird. Dann wird das Produkt gegebenenfalls in die gewünschte Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, besonders bevorzugt eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch ist. Beispiele derartiger Trägervehikel schließen Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung ein. Nicht wässrige Vehikel wie fixierte Öle und Ethyloleat sowie Liposomen sind hier ebenfalls nützlich. Geeignete Formulierungen kann man in Remingtons Pharmaceutical Sciences (neueste Ausgabe), Mack Publishing Company, Easton, PA finden.
Der Träger enthält geeigneterweise kleinere Mengen an Zusatzstoffen wie Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen. Derartige Materialien sind für die Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und schließen Puffer wie Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren und ihre Salze, Antioxidantien wie Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa zehn Reste), z. B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenstoffe einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Gegenionen wie Natrium und/oder nicht ionische grenzflächenaktive Mittel wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG ein.
KGF-2 wird typischerweise in solchen Vehikeln bei einer Konzentration von etwa 0,01 μg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 0,01 μg/ml bis 10 mg/ml bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 8 formuliert. Es ist klar, dass die Verwendung von bestimmten der vorstehenden Excipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von KGF-2-Salzen führt.
KGF-2, der für die therapeutische Verabreichung verwendet werden soll, muss steril sein. Die Sterilität wird leicht durch Sterilfiltrationsmembranen erreicht (z. B. 0,2 Micron-Membranen). Therapeutische KGF-2-Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter gegeben, der eine sterile Zugangsöffnung besitzt, beispielsweise eine intravenöse Lösung im Beutel oder in einer Phiole mit einem Verschluss, der von einer hypodermischen Injektionsnadel durchstochen werden kann.
KGF-2 wird normalerweise in Einheits- oder Mehrfachdosierungsbehältern, beispielsweise in versiegelten Ampullen oder Phiolen, als wässrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution gelagert. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Phiolen mit 5 ml sterilfiltrierter 1%-iger (Gew./Vol.) wässriger KGF-2-Lösung gefüllt und das sich ergebende Gemisch wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstitution von lyophilisiertem KGF-2 unter Verwendung von bakteriostatischem Wasser für Injektionen hergestellt.
Die Dosierung muss auch auf eine patientenspezifische Weise eingestellt werden, um eine zuvor bestimmte Konzentration einer KGF-2-Aktivität, wie beispielsweise durch das RIA-Verfahren bestimmt, im Blut bereitzustellen. Somit kann die Patientendosierung eingestellt werden, um reguläre, durchgehende Blutspiegel, wie durch RIA gemessen, in der Größenordnung von 50 bis 1000 ng/ml, vorzugsweise 150 bis 500 ng/ml zu erreichen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können oral, rektal, parenteral, intracisternal, intradermal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (durch Pulver, Salben, Gele, Creams, Tropfen oder transdermale Pflaster), bucal oder als Mund- oder Nasenspray verabreicht werden. Mit „pharmazeutisch verträglichem Träger" ist ein nicht toxischer fester, halbfester oder flüssiger Füllstoff, Verdünnungsmittel, Kapselmaterial oder ein Formulierungshilfsmittel jeder Art gemeint. Der Begriff „parenteral", wie hier verwendet, bezieht sich auf Verabreichungsweisen, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane und intra zellulläre Injektion und Infusion einschließen. Die KGF-2-Polypeptide, Agonisten und Antagonisten, die Polypeptide sind, können auch durch Expression derartiger Polypeptide in vivo verwendet werden, was häufig als „Gentherapie" bezeichnet wird.
Somit können beispielsweise Zellen aus einem Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das ein Polypeptid ex vivo codiert, gentechnisch hergestellt werden, wobei die gentechnisch hergestellten Zellen einem Patienten bereitgestellt werden, damit er mit dem Polypeptid behandelt wird. Derartige Verfahren sind aus dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können Zellen mittels aus dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren unter Verwendung eines RNA-enthaltenden Retroviruspartikels, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, gentechnisch hergestellt werden.
Auf ähnliche Weise können die Zellen in vivo gentechnisch zur Expression eines Polypeptids in vivo beispielsweise durch aus dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Wie aus dem Fachgebiet bekannt, kann eine Produzentenzelle zur Herstellung eines RNA-enthaltenden Retroviruspartikels, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten zur gentechnischen Herstellung von Zellen ex vivo und Expression des Polypeptids in vivo verabreicht werden. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch derartige Verfahren sollten für den Fachmann aufgrund der Ausführungen der vorliegenden Erfindung offensichtlich sein. Beispielsweise kann das Expressionsvehikel zur gentechnischen Herstellung von Zellen ein anderes als ein Retrovirus sein, beispielsweise ein Adenovirus, der verwendet werden kann, um Zellen gentechnisch in vivo nach Kombination mit einem geeigneten Transportvehikel herzustellen. Beispiele anderer Transportvehikel schließen ein auf HSV-basierendes Vektorsystem, Adenoassoziierte Virusvektoren und inerte Vehikel beispielsweise Dextran-beschichtete Ferritpartikel ein.
Retroviren, von denen die hier vorstehend erwähnten Plasmidvektoren abstammen können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf das Moloney-Maus-Leukämie-Virus, Milznekrosevirus, Retroviren wie das Rous-Sarkom-Virus, Harvey-Sarkom-Virus, Vogel-Leukämie-Virus, Gibbon-Leukämie-Virus, menschliches Immunschwäche-Virus, Adenovirus, myoproliferatives Sarkomvirus und Mammatumor-Virus. In einer Ausführungsform stammt der retrovirale Plasmidvektor vom Moloney-Maus-Leukämie-Virus ab.
Der Vektor schließt einen oder mehrere Promotoren ein. Geeignete Vektoren, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die retroviralen LTRs, die SV40-Promotoren und den bei Miller et al., Biotechniques Bd. 7 Nr. 9: 980–990 (1989) beschriebenen menschlichen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor oder jeden anderen Promotor (z. B. zelluläre Promotoren wie zelluläre eukaryontische Promotoren einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf die Histon-, Pol III- und β-Aktin-Promotoren). Andere Viruspromotoren, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Adenovirus-Promotoren, Tymidinkinase (TK)-Promotoren und B19-Parvovirus-Promotoren. Die Auswahl eines geeigneten Promotors ist für den Fachmann aufgrund der hier enthaltenen Ausführungen offensichtlich.
Die Nucleotidsequenz, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, ist unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Adenovirus-Promotoren wie den späten Hauptpromotor des Adenovirus oder heterologe Promotoren wie den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, den Respiratory-sycytial-Virus (RSV)-Promotor; induzierbare Promotoren wie den MMT-Promotor, den Metallothioninpromotor; Hitzeschockpromotoren; den Albuminpromotor; den ApoAI-Promotor; menschliche Globin-Promotoren; Virusthymidinkinase-Promotoren wie den Herpes-Simplex-Tymidinkinase-Promotor; retrovirale LTRs (einschließlich die modifizierten hier vorstehend beschriebenen LTRs); den β-Aktin-Promotor und menschliche Wachstumshormonpromotoren. Der Promotor kann auch der native Promotor sein, der die Gene kontrolliert, die das Polypeptid codieren.
Der retrovirale Plasmidvektor wird verwendet, um Verpackungszelllinien zur Erzeugung von Produzentenzelllinien zu transduzieren. Beispiele von Verpackungszelllinien, die transfiziert werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die PE501-, PA317-, Ψ-2-; Ψ-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, ΨCRE-, ΨCRIP-, GP + E-86, GP + envAm12-und DAN-Zellinien, wie bei Miller, Human Gene Therapy 1 : 5–14 (1990) beschrieben, was hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingebracht wurde. Der Vektor kann die Verpackungszelllinien mittels jeden aus dem Fachgebiet bekannten Mittels transduzieren. Derartige Mittel schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Elektropoaration, die Verwendung von Liposomen und CaPO₄-Präzipitation. In einer Ausführungsform kann der Plasmidvektor in ein Liposom verkapselt werden oder an ein Lipid gekoppelt werden und dann einem Wirt verabreicht werden.
Die Produzentenzelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Viruspartikel, die die Nucleinsäuresequenz(en) einschließen, die die Polypeptide codieren. Derartige retrovirale Partikel werden dann verwendet, um eukaryontische Zellen entweder in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen exprimieren dann die Nucleinsäuresequenz(en), die das Polypeptid codieren. Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf embryonale Stammzellen, embryonale Karzinomzellen sowie hämatopoetische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und Bronchienepithelzellen.
Chromosomentests
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sequenzen sind auch für die Identifizierung von Chromosomen wertvoll. Die Sequenz wird spezifisch anvisiert und kann mit einer bestimmten Stelle auf einem einzelnen menschlichen Chromosom hybridisieren. Außerdem gibt es einen derzeitigen Bedarf, bestimmte Stellen auf den Chromosomen zu identifizieren. Es stehen derzeit wenige chromosomenmarkierende Reagenzien zur Markierung chromosomaler Orte zur Verfügung, die auf tatsächlichen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphismen) basieren. Die Karierung von DNAs auf Chromosomen nach der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation solcher Sequenzen mit Genen, die mit Krankheiten assoziiert sind.
Kurz gesagt, können Sequenzen auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15–25 bp) aus der cDNA hergestellt werden. Die Computeranalyse des nicht translatierten 3'-Bereichs wird verwendet, um schnell Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umspannen, wodurch der Amplifikationsvorgang verkompliziert wird. Diese Primer werden dann zur PCR-Durchmusterung der somatischen Zellhybride verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur diejenigen Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Die PCR-Kartierung somatischer Zellhybride ist ein schnelles Verfahren zur Zuordnung einer bestimmten DNA zu einem bestimmten Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotidprimern kann eine Sublokalisierung mit Fragmentfeldern aus spezifischen Chromosomen oder Pools großer genomischer Clone auf analoge An erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die einfach verwendet werden können, um das Chromosom zu kartieren, schließen in situ-Hybridisierung, vorheriges Durch mustern mit markierten durchflusscytometrisch sortierten Chromosomen und Vorselektion durch Hybridisierung ein, um chromosomenspezifische cDNA-Genbanken zu konstruieren.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eines c-DNA-Clons mit einem Chromosomenausstrich in der Metaphase kann verwendet werden, um einen präzisen chromosomalen Ort in einem Schritt bereitzustellen. Dieses Verfahren kann mit einer DNA verwendet werden, die nur 50 oder 60 Basen umfasst. Für einen Übersichtsartikel dieses Verfahrens vgl. Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz auf einem präzisen Chromosomenort kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartierungsdaten korreliert werden. Derartige Daten findet man beispielsweise bei V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (erhältlich online über die Medizinische Welch-Bibliothek der John Hopkins University). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf demselben Chromosomenbereich kartiert wurden, werden dann über Verwandtschaftsanalyse (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Dann ist es notwendig, die Unterschiede in der cDNA oder der Genomsequenz zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in allen oder manchen der betroffenen Individuen, aber nicht bei irgendeinem normalen Individuum beobachtet wird, dann ist die Mutation wahrscheinlich die Krankheitsursache.
Mit der derzeitigen Auflösung der physikalischen Kartierungs- und genetischen Kartierungsverfahren könnte eine cDNA, die präzise auf einem chromosomalen Bereich lokalisiert ist, der mit der Krankheit assoziiert ist, eines von zwischen 50 und 500 potenziellen verursachenden Genen sein. (Das setzt eine Auflösung der Kartierung von 1 Megabase und einem Gen pro 20 kb voraus).
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; jedoch soll klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen, wenn nicht anders spezifiziert, sind pro Gewicht.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte häufig auftretende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
„Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorhergehen oder folgen. Die hier verwendeten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich auf einer uneingeschränkten Basis erhältlich oder können aus zur Verfügung stehenden Plasmiden nach den veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind äquivalente Plasmide zu den beschriebenen aus dem Fachgebiet bekannt und sind für den Fachmann offensichtlich.
Die „Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Anforderungen werden so verwendet, wie es dem Fachmann bekannt wäre. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Für den Zweck der DNA-Fragment-Isolierung zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für besondere Restriktionsenzyme werden vom Hersteller spezifiziert. Die Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C werden üblicherweise verwendet, aber können nach den Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Spaltung wird der Restriktionsansatz direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung von 8 Prozent Polyacrylamid, beschrieben von Goeddel, D., et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Derartige synthetische Oligonucleotide besitzen kein 5'-Phosphat und ligieren somit nicht mit einem anderen Oligonucleotid ohne Zugabe von Phosphat mit ATP in Gegenwart einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotide ligiert mit einem Fragment, das nicht phosphorylisiert wurde.
„Ligierung" bezieht sich auf den Vorgang der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., vorstehend, S. 146). Wenn nicht anderweitig bereitgestellt, kann die Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg ungefähr äquimolarer Mengen von zu ligierenden DNA-Fragmenten erfolgen.
Eine Zelle wurde durch exogene DNA „transformiert", wenn derartige exogene DNA in die Zellmembran eingeführt wurde. Die exogene DNA kann oder kann nicht intergrierte (covalent gebundene) interchromosomale DNA sein, die das Genom der Zelle ausmacht. Bei Prokaryonten und Hefe kann die exogene DNA beispielsweise auf einem episomalen Element wie einem Plasmid gehalten werden. Was eukaryontische Zellen anbelangt, ist eine stabil transformierte oder transfizierte Zelle eine, bei der die exogene DNA in das Chromosom integriert wurde, so dass sie von Tochterzellen durch Chromosomenreplikation vererbt wurde. Diese Fähigkeit wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zellen gezeigt, Zelllinien oder Clone zu etablieren, die eine Population von Tochterzellen umfassen, die die exogene DNA enthalten. Ein Beispiel der Transformation wird bei Graham, F. & Van der Eb, A., Virology 52: 456–457 (1973) dargestellt.
„Transduktion" oder „transduziert" bezieht sich auf einen Vorgang, bei dem die Zellen Fremd-DNA aufnehmen und diese Fremd-DNA in ihr Chromosom integrieren. Die Transduktion kann beispielsweise durch Transfektion erfolgen, die sich auf verschiedene Verfahren bezieht, bei der die Zellen DNA aufnehmen oder Infektion, bei der Viren verwendet werden, um DNA in Zellen zu übertragen.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von KGF-2
Die DNA-Sequenz, die KGF-2, ATCC # 75977, codiert, wird zuerst unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzenden der prozessierten KGF-2-cDNA (einschließlich der Signalpeptidsequenz) entsprechen. Der 5'-Oligonucleotidprimer besitzt die Sequenz 5'CCCCACATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGCC3' (SEQ ID Nr. 3), enthält eine Afl III-Restriktionsenzyrrischnittstelle, einschließlich und gefolgt von 30 Nucleotiden der KGF-2-codierenden Sequenz, beginnend vom angenommenen Initiationscodon. Die 3'-Sequenz 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3' (SEQ m Nr. 4) enthält Komplementärsequenzen zur HindIII-Schnittstelle und auf sie folgen 26 Nucleotide von KGF-2. Die Restriktionsenzymschnittstellen sind mit den Restriktionsenzynischnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-60 (Qiagen, Inc. Chatsworths, CA) kompatibel. pQE-60 codiert eine Antibiotikaresistenz (AMp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotoroperator (P/O), eine ribosomale Bindestelle (RBS), einen 6-His-Tag und Restriktionsenzymschnittstellen. pQE-60 wird dann mit NcoI und HindIII gespalten.
Die amplifizierten Sequenzen werden in pQE-60 ligiert und werden im Leserahmen eingebaut. Das Ligierungsgemisch wird dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) mittels des bei Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) beschriebenen Verfahrens zu transformieren. M15/rep4 enthält multiple Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch die Kanmycinresitenz (Kan^r verleiht. Die Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert und Ampicillin/Kanmycin-resistente Kolonien werden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wird isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Die Clone, die die gewünschten Konstrukte enthalten, werden über Nacht (Ü/N) in Flüssigkultur in sowohl mit Amp (100 μg/ml) und Kan (25 μg/ml) ergänztem LB-Medium gezüchtet. Die Ü/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 anzuimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte 600 (O. D.⁶⁰⁰) zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. Dann wird IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalaktopyranosid") bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, indem der P/O geräumt wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen werden zusätzliche 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird in der chaotropen Substanz Guanidin HCl (6 Molar) solubilisiert. Nach der Klärung wird solubilisiertes KGF-2 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Heparin-Affinitätssäule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung der Proteine zulassen (Hochuli, E., et al., J. Chromatography 411: 177–184 (1984)). KGF-2 (75% rein) wird von der Säule durch Hochsalzpuffer eluiert.
Beispiel 2
Bakterielle Expression und Reinigung einer verkürzten Version von KGF-2
Die DNA-Sequenz, die KGF-2, ATCC # 75977, codiert, wird zuerst unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen der verkürzten Version des KGF-2-Polypeptids entsprechen. Die verkürzte Version umfasst das Polypeptid minus der 36 Aminosäuresignalsequenz, wobei ein Methionin- und Alaninrest genau vor dem Cysteinrest hinzugefügt werden, der die Aminosäure 37 der Proteins mit der gesamten Länge umfasst. Der 5'-Oligonucleotidprimer besitzt die Sequenz 5'CATGCCATGGCGTGCCAAGCCCTTGGTCAGGACATG3' (SEQ ID Nr. 5), enthält eine NcoI-Restriktionsenzymschnittstelle, einschließlich und gefolgt von 24 Nucleotiden der KGF-2 codierenden Sequenz einschließt und darauf folgt. Die 3'-Sequenz 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3' (SEQ ID Nr. 6) enthält Komplementärsequenzen zur HindIII-Schnittstelle und auf sie folgen 26 Nucleotide des KGF-2-Gens. Die Restriktionsenzymschnittstellen sind mit den Restriktionsenzymschnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-60 (Qiagen, Inc. Chatsworths, CA) kompatibel. pQE-60 codiert eine Antibiotikaresistenz (AMp^r), einen bakteriellen Replikationsursprung (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotoroperator (P/O), eine ribosomale Bindestelle (RBS), einen 6-His-Tag und Restriktionsenzymschnittstellen. pQE-60 wird dann mit NcoI und Hind-III gespalten. Die amplifizierten Sequenzen werden in pQE-60 ligiert und werden im Leserahmen eingebaut. Das Ligierungsgemisch wird dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) mittels des bei Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) beschriebenen Verfahrens zu transformieren. M15/rep4 enthält multiple Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch die Kanmycinresistenz (Kan^r verleiht. Die Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert und Ampicillin/Kanmycin-resistente Kolonien werden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wird isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Die Clone, die die gewünschten Konstrukte enthalten, werden über Nacht (Ü/N) in Flüssigkultur in sowohl mit Amp (100 μg/ml) und Kan (25 μg/ml) ergänztem LB-Medium gezüchtet. Die Ü/N-Ku1tur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 anzuimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte 600 (O.D.⁶⁰⁰) zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. Dann wird IPTG („Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid") bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, indem der P/O geräumt wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen werden zusätzliche 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wird in der chaotropen Substanz Guanidin HCl (6 Molar) solubilisiert. Nach der Klärung wird solubilisiertes KGF-2 aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Heparin-Affinitätssäule unter Bedingungen gereinigt, die eine feste Bindung der Proteine zulassen (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177–184 (1984)). Das KGF-2-Protein wird von der Säule durch Hochsalzpuffer eluiert.
Beispiel 3
Clonierung und Expression von KGF-2 unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems
Die DNA-Sequenz, die das KGF-2-Protein mit der gesamten Länge, ATCC # 75977, codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen:
Der 5'-Primer besitzt die Sequenz 5'GCGGGATCCGCCATCATGTGGAAATGG-ATACTCAC3' (SEQ ID Nr. 7) und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymschnittstelle (fettgedruckt), gefolgt von 6 Nucleotiden, die einem effizienten Signal zur Initiation der Translation in eukaryontischen Zellen ähnelt (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947–950 (1987)) und genau dahinter die ersten 17 Nucleotide des KGF-2-Gens (das Initiationscodon zur Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz 5'GCGCGGTACCACAAACGTTGCC-TTCCT3'(SEQ ID Nr. 8) und enthält die Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease Asp718 und 19 Nucleotide, die zur nicht translatierten 3'-Sequenz des KGF-2-Gens komplementär sind. Die amplifizierten Sequenzen werden aus einem 1%-igen Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Qiagen, Inc., Chatsworths, CA isoliert. Das Fragment wird dann mit den Endonucleasen BamHI und Asp718 gespalten und dann wiederum auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifikation des pVL941-Vektors, nachstehend diskutiert) wird zur Expression des KGF-2-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für eine Übersicht vgl.: Summers, M. D. & Smith, G. E., A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987)). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrinpromotor des Autographa californica Kernpolyeder Virus (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsschnittstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und Asp718. Die Polyadenylierungsstelle des Simian-Virus (SV) 40 wird für eine effiziente Polyadenylierung verwendet. Zur leichten Selektion der rekombinanten Viren wird das Beta-Galaktosidase Gen aus E. coli in derselben Orientierung wie der Polyhedrinpromotor eingebaut, gefolgt von dem Polyade nylierungssignal des Polyhedringens. Die Polyhedrinsequenzen werden auf beiden Seiten von Virussequenzen zur zellvermittelten homologen Rekombination der cotransfizierten Virus-Wildtyp-DNA flankiert. Viele andere Baculovirusvektoren wie pAc373, pVL941 und pAc1M1 könnten anstatt pRG1 verwendet werden (Luckow, V. A. & Summers, M. D, Virology, 170: 31–39).
Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und Asp718 gespalten. Die DNA wird dann aus einem 1%-igen Agarosegel unter Verwendung des im Handel erhältlichen Kits (Qiagen, Inc., Chatsworths, CA) isoliert. Diese Vektor DNA wird als V2 bezeichnet.
Das Fragment F2 und das Plasmid V2 wird mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli-HB101-Zellen werden dann transformiert und die Bakterien identifiziert, die das Plasmid (pBacKGF-2) mit dem KGF-2-Gen enthielten, indem eine PCR mit beiden Clonierungsoligonucleotiden verwendet wurde. Die Sequenz der clonierten Fragments wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg Plasmid pBacKGF-2 werden zusammen mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGold^TM Baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens transfiziert (Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987)).
1 μg BaculoGold^TM Virus-DNA und 5 μg Plasmid pBacKGF-2 werden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte gemischt, die 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD) enthält. Anschließend werden 10 μl Lipofektin plus 90 μl Grace-Medium zugegeben, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Transfektionsgemisch tropfenweise den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) zugegeben, die in einer 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum angesetzt werden. Die Platte wird hin- und hergeschwenkt, um die neu hinzugefügte Lösung zu mischen. Die Platte wird dann 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium, ergänzt mit 10%-igem fötalem Kälberserum wird zugegeben. Die Platte wird in einen Inkubator zurückgegeben und die Züchtung bei 27°C vier Tage fortgesetzt.
Nach vier Tagen wird der Überstand gesammelt und ein Plaquetest wird auf ähnliche Weise durchgeführt, wie bei Summers und Smith (vorstehend) beschrieben. Als Modifikation wird ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) verwendet, das eine einfache Isolierung der blaugefärbten Plaques zulässt. (Eine detaillierte Beschreibung eines „Plaquetests" findet man auch im Benutzerleitfaden für Insektenzellkultur und Baculovirologie, vertrieben von Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seiten 9–10).
Vier Tage nach der Reihenverdünnung werden die Viren den Zellen zugegeben und blau gefärbte Plaques werden mit der Spitze einer Eppendorfpipette aufgenommen. Der Agar, der die rekombinanten Viren enthält, wird dann in einem Eppendorfröhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthält. Der Agar wird durch kurze Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das rekombinante Baculovirus enthält, wird verwendet, um die in 35 mm-Schalen angesetzten Sf9-Zellen zu infizieren. Vier Tage später werden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C gelagert.
Sf9-Zellen werden in mit 10% hitzeinaktiviertem FBS ergänztem Grace-Medium gezüchtet. Die Zellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus V-KGF-2 mit einer Multiplizität der Infektion (MOI von 2 infiziert. Sechs Stunden später wird das Medium entfernt und durch SF900-II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies, Inc. Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später werden 5 uCi ³⁵S-Methionin und 5 uCi ^3SS-Cystein zugegeben. Die Zellen werden 16 Stunden weiter inkubiert, bevor sie mittels Zentrifugation geerntet werden und die markierten Proteine werden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 4
Die meisten der für die vorübergehende Expression der KGF-2-Protein-Gensequenz in Säugerzellen verwendeten Vektoren sollten den SV40-Replikationsursprung tragen. Das lässt die Replikation des Vektors mit hohen Kopiezahlen in Zellen zu (z. B. COS-Zellen), die das T-Antigen exprimieren, das für die Initiation der viralen DNA-Synthese erforderlich ist. Jede andere Säugerzelllinie kann ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
Ein typischer Säuger-Expressionsvektor enthält das Promotorelement, das die Initiation der mRNA-Transkription vermittelt, die Protein-codierende Sequenz und Signale, die für die Termination der Transkription und Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind. Zusätzliche Elemente schließen Verstärkerelemente, Kozak-Sequenzen und dazwischenliegenden Sequenzen ein, die von Spender- und Empfängerstellen für das Spleißen von RNA flankiert werden. Hoch effiziente Transkription kann mit den frühen und späten Promotoren aus SV40, den langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTRs) aus Retroviren, z. B. RSV, HTLVI, HIVI und dem frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) erreicht werden. Jedoch können zelluläre Signale ebenfalls verwendet werden (z. B. menschlicher Aktinpromotor). Geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung schließen beispielsweise Vektoren wie pSVL und pMSG (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) und pBC12MI (ATCC 67109) ein. Säugerwirtszellen, die verwendet werden könnten, schließen menschliche Hela-, 283-, H9- und Jurkat-Zellen, Maus-NIH3T3- und C127-Zellen, Cos 1-, Cos 7- und CV1-, Zellen der Meerkatze, Wachtel-QC1-3-Zellen, Maus-L-Zellen und chinesische Hamster-Ovarienzellen ein.
Alternativ kann das Gen in stabilen Zelllinien exprimiert werden, die in ein Chromosom integriertes Gen enthalten. Die gemeinsame Transfektion mit einem Selektionsmarker wie dhfr, gpt, Neomycin, Hygromycin lässt die Identifizierung und Isolierung der transfizierten Zellen zu.
Das transfizierte Gen kann auch amplifiziert werden, um große Mengen des codierten Proteins zu exprimieren. DHFR (Dihydrofolatreduktase) ist ein nützlicher Marker, um Zelllinien zu entwickeln, die mehrere hundert oder sogar mehrere tausend Kopien des Gens von Interesse tragen. Ein anderer nützlicher Selektionsmarker ist die Enzyrriglutaminsynthase (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277–279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169– 175 (1992)). Unter Verwendung dieser Marker werden die Säugerzellen in Selektionsmedium gezüchtet und die Zellen mit der größten Resistenz werden ausgewählt. Diese Zelllinien enthalten das/die amplifizierte(n), in ein Chromosom integrierte(n) Gen(e). Chinesische Hamster-Ovarienzellen werden häufig für die Produktion von Proteinen verwendet.
Die Expressionsvektoren pC1 und pC4 enthalten den starken Promotor (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438–447 (März, 1985)) plus ein Fragment des CMV-Verstärkerelements (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Mehrfachclonierungsstellen z. B. mit den Restriktionsenzymschnittstellen BamHI, XbaI und Asp718 erleichtern die Clonierung des Gens von Interesse. Die Vektoren enthalten zusätzlich das 3'-Intron, das Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Ratten-Präproinsulingens.
A. Expression von rekombinantem KGF-2 in COS-Zellen
Das Expressionsplasmid KGF-2-HA stammte von einem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillin-Resistenzgen, 3) E. coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einem Polylinkerbereich, einem SV40-Intron und einer Polyadylierungsstelle. Der HA-Tag entspricht einem Epitop, das vom Influenza-Hämagglutininprotein stammt, wie zuvor beschrieben (Wilson, I., et al. Cell 37: 767, (1984)). Das Anbringen des HA-Tags am Zielprotein lässt einen leichten Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper zu, der das HA-Epitop erkennt. Ein DNA-Fragment, das den gesamten KGF-2-Vorläufer-HA-Tag codiert, wird im Leserahmen mit dem HA-Tag fusioniert, so dass die rekombinante Proteinexpression vom CMV-Promotor gelenkt wird.
Die Strategie zur Plasmidkonstruktion wird wie folgt beschrieben:
Die DNA-Sequenz, die KGF-2, ATCC # 75977, codiert, wird mittels PCR unter Verwendung zweier Primer konstruiert: Der 5'-Primer 5'TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTGACAC3' (SEQ ID Nr. 9) enthält eine BamHI-Schnittstelle, gefolgt von 22 Nucleotiden der KGF-2- codierenden Sequenz, beginnend vom Initiationscodon; die 3'-Sequenz 5'TAAGCACTCGAGTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3' (SEQ ID Nr. 10) enthält Komplementärsequenzen zu einer XhoI-Schnittstelle, einem HA-Tag und die letzten 26 Nucleotide der KGF-2-codierenden Sequenz (das Stoppcodon nicht eingeschlossen). Deshalb enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Schnittstelle, eine KGF-2 codierende Sequenz, gefolgt von einer XhoI-Schnittstelle, einen HA-Tag, der im Leserahmen fusioniert ist und ein Translationsstoppcodon neben dem HA-Tag. Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor, pcDNA-3'HA, werden mit dem BamHI- und XhoI-Restriktionsenzym gespalten und ligiert, was zu pcDNA-3'HA-KGF-2 führt. Das Ligierungsgemisch wird im E. coli-Stamm XL1-Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) transformiert. Die transformierte Kultur wird auf Ampicillin-Mediumplatten plattiert und resistente Kolonien werden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus Transformanten isoliert und durch PCR und Restriktionsanlyse auf das Vorhandensein des richtigen Fragments untersucht. Zur Expression des rekombinanten KGF-2 wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor mittels des DEAE-DEXTRAN-Verfahrens transfiziert (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Die Expression des KGF-2-HA-Proteins wurde durch Radiomarkierung und das Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen (Harlow, E. & Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen wurden 8 Stunden mit ³⁵S-Cystein zwei Tage nach der Infektion markiert. Die Kulturmedien wurden dann gesammelt, und die Zellen wurden mit Detergenz (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) lysiert (Wilson, I., et al., vorstehend 37: 767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch das Kulturmedium wurden mit HA-spezifischem monoclonalen Antikörper präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden auf 15% SDS-PAGE-Gelen analysiert.
B: Expression und Reinigung des menschlichen KGF-2-Proteins unter Verwendung des CHO-Expressionssystems
Der Vektor pC1 wird für die Expression des KGF-2-Proteins verwendet. Das Plasmid pC1 ist ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr [ATCC Hinterlegungsnr. 37146]. Beide Plasmide enthalten das Maus-DHFR-Gen unter der Kontrolle des frühen Promotors von SV40. Chinesische Hamster-Ovarienzellen oder andere Zellen, denen Dihydrofolataktivität fehlt, die mit diesen Plasmiden transfiziert werden, können ausgewählt werden, indem die Zellen in einem Selektionsmedium (Alpha minus MEM, Life Techologies), ergänzt mit dem Chemotherapeutikum Methotrexat, gezüchtet werden. Die Amplifikation der DHFR-Gene in Zellen, die gegenüber Methotrexat (MTX) resistent sind, wurde gut dokumentiert (vgl. z. B. Alt, F. W., Kellems, R. M., Bertino, J. R. und Schimke, R. T., 1978, J. Biol. Chem. 253: 1357–1370, Hamlin, J. L. und Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107–143, Page, M. J. und Sydenham, M. A. 1991, Biotechnology Bd. 9: 64–68). Die Zellen, die in ansteigenden MTX-Konzentrationen gezüchtet werden, entwickeln eine Resistenz gegenüber dem Medikament, indem sie das Zielenzym DHFR als Folge der Amplifikation des DHFR-Gen überproduzieren. Wenn ein zweites Gen an das DHFR-Gen gebunden ist, wird es gewöhnlich gemeinsam amplifiziert und überexprimiert. Es ist Stand der Technik, Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1.000 Kopien der Gene tragen. Folglich enthalten die Zelllinien bei Methotrexatentzug das amplifizierte, in das/die Chromosomen) integrierte Gen.
Plasmid pC1 enthält zur Expression des Gens von Interesse einen starken Promotor der langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (Cullen, et al., Molecular and Cellular Biology, März, 1985: 438–4470) plus ein Fragment, das aus dem Ver stärkerelement des unmittelbaren frühen Gens des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) isoliert wurde (Boshart et al., Cell 41: 521–530, 1985). Stromabwärts des Promotors befinden sich die folgenden einzelnen Restriktionsenzymschnittstellen, die die Integration der Gene zulassen: BamHI, PvuII und NruI. Hinter diesen Clonierungsstellen enthält das Plasmid in allen drei Leserahmen Translationsstoppcodons, gefolgt von dem 3'-Intron und der Polyadenylierungsstelle des Ratten-Präproinsulingens. Es können auch andere effiziente Promotoren für die Expression verwendet werden z. B. der menschliche β-Actin-Promotor, die frühen oder späten Promotoren von SV40 oder die langen terminalen Wiederholungssequenzen aus anderen Retroviren, z. B. HIV und HTLVI. Für die Polyadenylierung der mRNA können auch andere Signale, z. B. aus den menschlichen Wachstumshormon- oder Globingenen verwendet werden.
Stabile Zelllinien, die ein Gen von Interesse in das Chromosom integriert haben, können auch bei der gemeinsamen Transfektion mit einem Selektionsmarker wie gpt, G418 oder Hygromycin ausgewählt werden. Es ist von Vorteil, zuerst mehr als einem Selektionsmarker z. B. G418 plus Methotrexat zu verwenden.
Das Plasmid pC1 wird mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann unter Verwendung von Kälberdarm Phosphatase mit aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren dephosphoryliert. Der Vektor wird dann aus einem 1%-igen Agarosegel isoliert.
Die DNA-Sequenz, die KGF-2, ATCC Nr. 75977, codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens entsprechen.
Der 5'-Oligonucleotidprimer besitzt die Sequenz 5'TAACGAGGATCCGCCATCATGTGGAAATGGATACTACAC3' (SEQ ID Nr. 9), die die unterstrichene BamHI-Schnittstelle enthält, gefolgt von 21 Basen von KGF-2-Sequenz von 1 (SEQ ID NR: 1). Das 5'-Ende des amplifizierten Fragments, das das menschliche KGF-2 codiert, stellt, eingebaut in einen Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, ein effizientes Signalpeptid bereit. Ein effizientes Signal zur Initiation der Translation in eukaryontischen Zellen, wie bei Kozak, M., J. Mol. Biol., 196: 947–950 (1987) beschrieben, ist geeignet im Vektoranteil des Konstrukts lokalisiert.
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz 5'TAAGCAGGATCCTGAGTGTACCACCATTGGAAGAAATG3' (SEQ ID Nr. 10), die die BamHI-Schnittstelle enthält, gefolgt von Nucleotiden, die zu den letzten 26 Nucleotiden der in 1 (SEQ ID NR: 1) dargestellten KGF-2-codierenden Sequenz komplementär sind, wobei das Stoppcodon nicht eingeschlossen ist.
Die amplifizierten Fragmente werden aus einem 1%-igen Agarosegel, wie vorstehend beschrieben, isoliert und dann mit der Endonuclease BamHI gespalten und dann wiederum auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt.
Das isolierte Fragment und der dephosphorylierte Vektor werden dann mit T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli-HB101-Zellen werden dann transformiert und die Bakterien identifiziert, die das Plasmid pC1 enthielten. Die Sequenz und Orientierung des eingebauten Gens wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Transfektion von CHO-DHFR-Zellen
Chinesische Hamster-Ovarienzellen, denen ein aktives DHFR-Enzym fehlt, werden zur Transfektion verwendet. 5 μg des Expressionsplasmids C1 werden zusammen mit 0,5 μg Plasmid pSVneo unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens (Felgner et al., vorstehend) transfiziert. Das Plasmid pSVneo enthält einen dominanten Selektionsmarker, das Gen neo von Tn5, das ein Enzym codiert, das die Resistenz gegenüber einer Antibiotikagruppe einschließlich G418 verleiht. Die Zellen werden in mit 1 mg/ml G418 ergänztem Alpha-minus-MEM angesetzt. Nach 2 Tagen werden die Zellen mit Trypsin versetzt und auf Hybridom-Clonierungsplatten (Greiner, Deutschland) angesetzt und 10–14 Tage gezüchtet. Nach diesem Zeitraum werden Einzelclone mit Trypsin versetzt und unter Verwendung von verschiedenen Methotrexatkonzentrationen (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) in Petrischalen mit 6 Vertiefungen angesetzt. Die Clone, die bei den höchsten Methotrexatkonzentrationen wachsen, werden dann in neue Schalen mit 6 Vertiefungen überführt, die noch höhere Methotrexatkonzentrationen (500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM) enthalten. Dasselbe Verfahren wird wiederholt, bis die Clone bei einer Konzentration von 100 μM wachsen.
Die Expression des gewünschten Genprodukts wird durch Western-Blot-Analyse und SDS-PAGE analysiert.
Beispiel 5
Transkription und Translation von rekombinantem KGF-2 in vitro
Ein PCR-Produkt stammt von der clonierten cDNA in dem pA2-Vektor ab, der für die Expression der Insektenzellen von KGF-2 verwendet wurde.
Die für diese PCR verwendeten Primer waren: 5'ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGCCATGTGGAAATGGATACTGACACATTGTGTGCC3' (SEQ ID Nr. 11) und 5'CCCAAGCTTCCACAAACGTTGCCTTCCTCTATGAG3'(SEQ ID Nr. 12).
Der erste Primer enthält die Sequenz eines T3-Promotors 5' zum ATG-Initiationscodon. Der zweite Primer ist zum 3'-Ende des offenen Leserahmens von KGF-2 komplementär und codiert das reverse Komplement eines Stoppcodons.
Das sich ergebende PCR-Produkt wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Qiagen gereinigt. 0,5 μg dieser DNA wird als Matrize für eine in-vitro-Transkriptions-Translationreaktion verwendet. Die Reaktion wird mit einem im Handel erhältlichen Kit von Promega unter dem Namen TNT durchgeführt. Der Test wird wie bei der Anleitung für den Kit unter Verwendung von radioaktiv markiertem Methionin als Substrat durchgeführt, ausgenommen, dass nur die Hälfte der angegebenen Volumina der Reagenzien verwendet werden und dass man die Reaktion bei 33°C 1,5 Stunden weiterlaufen lässt.
5 μl der Reaktion werden elektrophoretisch auf einem denaturierenden 10 bis 15%-igen Polyacrylamidgel getrennt. Das Gel wird 30 Minuten in einem Gemisch von Wasser : Methanol : Essigsäure bei jeweils 6 : 3 : 1 Volumina fixiert. Das Gel wird dann unter Hitze und Vakuum getrocknet und dann 16 Stunden auf einem Röntgenfilm exponiert. Der Film wird entwickelt, wobei er das Vorhandensein einer radioaktiven Proteinbande zeigt, die der Größe des konzeptionell translatierten KGF-2 entspricht, was sehr nahe legt, dass die clonierte cDNA für KGF-2 einen offenen Leserahmen enthält, der ein Protein der erwarteten Größe codiert.
Beispiel 6
Expression über Gentherapie
Von einem Probanden werden durch Hautbiopsie Fibroblasten erhalten. Das sich ergebende Gewebe wird in ein Gewebekulturmedium gegeben und in kleine Teile geteilt. Kleine Gewebestücke werden auf eine feuchte Oberfläche eines Gewebekulturkolbens gegeben, etwa zehn Stücke in jeden Kolben. Der Kolben wird umgedreht, fest verschlossen und bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird der Kolben umgedreht und die Gewebestücke bleiben am Kolbenboden kleben und frisches Medium (z. B. Ham-F12-Medium mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin) wird zugegeben. Dies wird dann etwa eine Woche bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird frisches Medium zugegeben und dann alle paar Tage gewechselt. Nach zwei zusätzlichen Wochen in Kultur ergibt sich eine Fibroblasten-Einzelschicht. Die Einzelschicht wird mit Trypsin versetzt und in größere Kolben abgemessen.
pMV-7 (Kirschmeier, P. T. et al., DNA, 7: 219–25 (1988)), flankiert von den langen terminalen Wiederholungssequenzen des Moloney-Maus-Sarkom-Virus, wird mit EcoRI und HindIII gespalten und anschließend mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt. Der lineare Vektor wird auf Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glassperlen gereinigt.
Die cDNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert, die den 5'- bzw. 3'-Sequenzenden entsprechen. Der 5'-Primer enthält eine EcoRI-Schnittstelle, und der 3'-Primer schließt ferner eine HindIII-Schnittstelle ein. Gleiche Mengen des linearen Rückgrads des Moloney-Maus-Sarkom-Virus und das amplifizierte EcoRI- und HindIII-Fragmente werden in Gegenwart von T4-DNA-Ligase zusammengegeben. Das sich ergebende Gemisch wird unter Bedingungen gehalten, die für die Ligierung der beiden Fragmente geeignet sind. Das Ligierungsgemisch wird verwendet, um die Bakterien HB101 zu transformieren, die dann auf Agar-enthaltendes Kanamycin zum Zweck der Bestätigung, dass das Gen von Interesse richtig eingebaut wurde, ausplattiert.
Die amphotropischen pA317- oder GP + am12-Verpackungszellen werden in Zellkultur bis zur konfluenten Dichte in Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) mit 10% Kälberserum (CS), Penicillin und Streptomycin gezüchtet. Der MSV-Vektor, der das Gen enthält, wird dann den Medien zugegeben und die Verpackungszellen werden mit dem Vektor transduziert. Die Verpackungszellen produzieren jetzt infektiöse Viruspartikel, die das Gen enthalten (die Verpackungszellen werden nun als Produzentenzellen bezeichnet).
Den Produzentenzellen wird frisches Medium zugegeben und anschließend wird das Medium von einer 10 cm-Platte mit konfluenten Produzentenzellen geerntet. Das verbrauchte Medium, das die infektiösen Viruspartikel enthält, wird durch einen Millipore-Filter filtriert, um zerstörte Produzentenzellen zu entfernen, und dieses Medium wird dann verwendet, um Fibroblastenzellen zu infizieren. Das Medium wird von einer subkonfluenten Fibroblastenplatte entfernt und schnell mit dem Medium aus den Produzentenzellen ersetzt. Dieses Medium wird entfernt und mit frischem Medium ersetzt. Wenn der Virustiter hoch ist, dann sind tatsächlich alle Fibroblasten infiziert und es ist keine Selektion erforderlich. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen Selektionsmarker wie neo oder his besitzt.
Die gentechnisch hergestellten Fibroblasten werden dann entweder allein oder nachdem sie bis zur Konfluenz auf Cytodex-3-Mikroträgerkügelchen gezüchtet wurden, in den Wirt injiziert. Die Fibroblasten produzieren nun das Proteinprodukt.
Beispiel 7
KGF-2 stimulierte Wundheilung im diabetischen Mausmodell
Um zu zeigen, dass der Keratinocyten-Wachstumfaktor-2 (KGF-2) auch den Heilungsprozess beschleunigen würde, wurde das Wundheilungsmodell der genetisch diabetischen Maus verwendet. Das Vollhaut-Wundheilungsmodell in der db+/db+-Maus ist ein gut charakterisiertes, klinisch relevantes und reproduzierbares Modell der gehemmten Wundheilung. Die Heilung der diabetischen Wunde hängt von der Erzeugung von Granulationsgewebe und der Reepthelialisierung und nicht so sehr von der Kontraktion ab (Gartner, M. H. et al., J. Surg. Res. 52: 389(1992); Greenhalgh D. G. et al., Am. J. Pathol.: 136: 1235 (1990)).
Die diabetischen Tiere besitzen viele der charakteristischen Merkmale, die bei Diabetes mellitus Typ II beobachtet werden. Homozygote (db+/db+)-Mäuse sind im Vergleich zu ihren normalen, heterozygoten (db+/+m)-Wurfgeschwister adipösen. Diabetische (db+/db+)-Mausmutanten besitzen eine einzelne autosomale rezessive Mutation auf Chromosom 4 (db+). (Coleman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 283–293 (1982)). Die Tiere zeigen Polyphagie, Polydipsie und Polyurie. Diabetische (db+/db+)-Mausmutanten besitzen einen erhöhten Blutzucker, erhöhte oder normale Insulinspiegel und eine unterdrückte zellvermittelte Immunität (Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 51 (1): 1–7 (1983); Leitner et al., Am. J. of Pathol. 114: 46–55 (1985)). Bei diesen Tieren wurden periphere Neuropathie, Myocardkomplikationen und mikrovaskuläre Läsionen, Verdickung der Basalmembran und glomeruläre Filtrationsabnormalitäten beschrieben (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2): 221–232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1): 60–67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4): 460–473 (1979); Coleman, D. L., Diabetes 31 (Suppl): 1–6 (1982)). Diese homozygoten diabetischen Mäuse entwickeln analog zum menschlichen Diabetes Typ II gegenüber Insulin resistente Hyperglykämie (Mandel et al., J. Immunol. 120: 1375–1377 (1978)).
Die bei diesen Tieren beobachteten Merkmale legen nahe, dass die bei diesem Modell beobachtete Heilung der Heilung beim menschlichen Diabetes ähneln kann (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136: 1235–1246 (1990)). Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass KGF-2 eine starke stimulatorische Wirkung auf die Heilung von Vollhautwunden bei diabetischen und nicht diabetischen heterozygoten Wurfgeschwistern besitzt. Es wurden deutliche Wirkungen auf die Reepithelialisierung und auf einen Anstieg bei den Collagenfibrillen, dem Granulationsgewebe innerhalb der Dermis bei KGF-2 behandelten Tieren beobachtet. Die exogene Anwendung von Wachstumsfaktoren kann die Bildung von Granulationsgewebe durch Ziehen von inflammatorischen Zellen in die Wunde beschleunigen.
Tiere
In dieser Studie wurden genetisch diabetische weibliche C57BL/KsJ (db+/db+)-Mäuse und ihre nicht diabetischen (db+/+m) heterozygoten Wurfgeschwister verwendet (Jackson Laboratories). Die Tiere wurden im Alter von 6 Wochen gekauft und waren zu Beginn der Studie 8 Wochen alt. Die Tiere wurden einzeln gehalten und erhielten Futter und Wasser ad libitum. Alle Manipulationen erfolgten unter Verwendung aseptischer Verfahren. Die Experimente wurden nach den Vorschriften und Richtlinien von Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee und den Richtlinien für die Sorgfalt und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
KGF-2
Der für die Wundheilungsstudien verwendete rekombinante menschliche KGF-2 wurde überexprimiert und aus pQE60-Cys37, einem E. coli-Expressionsvektorsystem (pQE-9, Qiagen) gereinigt. Das aus diesem Konstrukt exprimierte Protein ist das KGF-2 aus Cystein an Position 37 bis Serin an Position 208 mit einem 6X(His)-Tag, der an den N-Terminus des Proteins (SEQ ID NR: 29–30) (15) gebunden ist. Fraktionen, die mehr als 95% reines rekombinantes Material enthielten, wurden für das Experiment verwendet. Der Keratinocyten-Wachstumsfaktor-2 wurde in einem Vehikel formuliert, das 100 mM Tris, 8,0 und 600 mM NaCl enthielt. Die Endkonzentrationen betrugen 80 μg/ml und 8 μg/ml Stammlösung. Die Verdünnungen wurden aus der Stammlösung unter Verwendung desselben Vehikels durchgeführt.
Durch chirurgischen Eingriff erzeugte Verletzung
Die Vorschrift zur Erzeugung von Verletzungen erfolgte nach früher berichteten Verfahren (Tsuboi., R. und Rifkin, D. B., J. Exp. Med. 172: 245–251 (1990)). Kurz gesagt, wurden die Tiere am Tag der Verletzung mit einer intraperitonealen Avertininjektion (0,01 mg/ml), 2,2,2-Tribromethanol und 2-Methyl-2-butanol, aufgelöst in deionisiertem Wasser, betäubt. Der Rückenbereich des Tieres wurde rasiert und die Haut mit 70%-iger Ethanollösung und Jod gewaschen. Die chirurgische Eingriffsfläche wurde vor der Verletzung mit steriler Gaze getrocknet. Dann wurde eine 8 mm-Vollhautwunde unter Verwendung einer Keyes-Gewebestanze erzeugt. Unmittelbar nach der Verletzung wurde die umgebende Haut sanft gestreckt, damit keine Wundexpansion erfolgt. Die Wunden wurden für die Dauer des Experiments offengelassen. Die Anwendung der Behandlung erfolgte 5 aufeinanderfolgende Tage topisch, beginnend am Tag der Verletzung. Vor der Behandlung wurden die Wunden sanft mit steriler Salzlösung und Gazeschwämmen gereinigt.
Die Wunden wurden visuell untersucht und in einem festen Abstand am Tag des chirurgischen Eingriffs und danach in zwei Tagesintervallen photographiert. Der Wundverschluss wurde durch tägliche Messung an den Tagen 1–5 und an Tag 8 bestimmt. Die Wunden wurden horizontal und vertikal unter Verwendung eines Jameson-Tastzirkels gemessen. Die Wunden wurden als verheilt betrachtet, wenn das Granulationsgewebe nicht länger sichtbar war und die Wunde von einem kontinuierlichem Epithel bedeckt war.
KGF-2 wurde unter Verwendung von zwei unterschiedlichen KGF-2-Dosen verabreicht, eine 8 Tage bei 4 μg pro Wunde pro Tag und die zweite 8 Tage bei 40 μg pro Wunde pro Tag in 50 μl Vehikel. Die Vehikel-Kontrollgruppen erhielten 50 μl Vehikellösung.
Die Tiere wurden an Tag 8 mit einer intraperitonealen Natriumpentobarbitalinjektion (300 mg/kg) getötet. Die Wunden und die umgebende Haut wurden für die Histologie und die Immunhistochemie geerntet. Gewebeproben wurden zur weiteren Verarbeitung in 10% neutral gepuffertem Formalin in Gewebecassetten zwischen Biopsieschwämmchen gegeben.
Versuchskonzept
Drei Gruppen von jeweils 10 Tieren (5 diabetische und 5 nicht diabetische Kontrollen) wurden ausgewertet: 1) Vehikel-Placobokontrolle, 2) KGF-2 4 μg/Tag und 3) KGF-2 40 μg/Tag. Diese Studie wurde wie folgt konzipiert:
Messung der Wundfläche und des Wundverschlusses
Der Wundverschluss wurde analysiert, indem der Bereich in der vertikalen und horizontalen Achse gemessen wurde und die Gesamtquadratfläche der Wunde erhalten wurde. Die Kontraktion wurde dann geschätzt, indem die Unterschiede zwischen der Anfangswundfläche (Tag 0) und derjenigen nach der Behandlung (Tag 8) ermittelt wurden. Die Wundfläche an Tag 1 betrug 64 mm² – die entsprechende Größe der Hautstanze. Die Berechnungen wurden unter Verwendung der folgenden Formel durchgeführt:
[Offene Fläche an Tag 8]–[Offene Fläche an Tag 1]/[Offene Fläche an Tag 1].
Histologie
Proben wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und in Parffin eingebettete Blocks wurden senkrecht zur Wundoberfläche (5 μm) in Abschnitte unterteilt und unter Verwendung eines Reichert-Jung Mikrotoms geschnitten. Die Routine-Hämatoxylin-Eosin (H & E)-Färbung erfolgte auf Querschnitten zweigeteilter Wunden. Die histologische Untersuchung der Wunden wurde verwendet, um zu beurteilen, ob der Heilungsprozess und das morphologische Erscheinungsbild der reparierten Haut durch Behandlung mit KGF-2 geändert wurde. Diese Beurteilung schloss die Bestätigung des Vorhandenseins von Zellakkumulierung, inflammatorischer Zellen, Kapillaren, Fibroblasten, Reepithelialisierung und die Epidermisreife ein (Greenhalgh, D. G. et al., Am. J. Pathol. 136: 1235 (1990)) (Tabelle 1). Ein kalibriertes Linsenmikrometer wurde von einem blinden Beobachter verwendet.
Immunhistochemie
Reepithelialisierung
Gewebeabschnitte wurde immunhistochemisch mit einem polyclonalen anti-humanen Kaninchen-Keratinantikörper unter Verwendung eines ABC-Elite-Nachweissystems gefärbt. Die menschliche Haut wurde als positive Gewebekontrolle verwendet, während nicht-immunes IgG als Negativkontrolle verwendet wurde. Das Keratinocytenwachstum wurde durch Beurteilung des Reepithelialisierungsausmaßes der Wunde unter Verwendung eines kalibrierten Linsenmikrometers beurteilt.
Zellproliferationsmarker
Das proliferierende Zellkernantigen/Cyclin (PCNA) in Hautproben wurde unter Verwendung des anti-PCNA-Antikörpers (1 : 50) mit einem ABC-Elite-Nachweissystem gezeigt. Dickdarmkrebs des Menschen diente als positive Gewebekontrolle und menschliches Gehirngewebe wurde als negative Gewebekontrolle verwendet. Jede Probe schloss einen Abschnitt ein, wobei der primären Antikörper weggelassen wurde und durch nicht immunen Maus-IgG ersetzt wurde. Die Bewertung dieser Abschnitte basierte auf dem Proliferationsausmaß auf einer Skala von 0–8, wobei der untere Bereich der Skala geringe Proliferation und der obere Bereich starke Proliferation wiederspiegelte.
Statistische Analyse
Die experimentelle Daten wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests analysiert. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Die Daten wurden als Mittelwert +/– SEM ausgedrückt.
Ergebnisse
Wirkung von KGF-2 auf den Wundverschluss
Diabetische Mäuse zeigten im Vergleich zu heterozygoten normalen Mäusen eine beeinträchtigte Heilung. Die Dosis von 4 μg KGF-2 pro Stelle schien die maximale Reaktion bei diabetischen und nicht-diabetischen Tieren zu erzeugen (5, 6). Diese Ergebnisse waren im Vergleich zu den Puffer-Kontrollgruppen statistisch signifikant (p = 0,002 und p < 0,0001). Die Behandlung mit KGF-2 führte zu einem endgültigen durchschnittlichen Wundverschluss von 60,6% in der Gruppe, die 4 μg/Tag erhielt und 34,5% in der 40 μg/Tag-Gruppe. Die Wunden in der Puffer-Kontrollgruppe wiesen nur 3,8% Wundverschluss an Tag 8 auf. Wiederholte Messungen der Wunden an den Tagen 2–5 nach der Verletzung und an Tag 8, die an den db+/db+-Mäusen durchgeführt wurden, die mit KGF-2 behandelt wurden, zeigten eine signifikante Verbesserung in der Gesamtwundfläche (mm²) an Tag 3 nach der Verletzung im Vergleich zur Puffer-Kontrollgruppe. Diese Verbesserung hielt an und am Ende des Experiments wurden statistisch signifikante Ergebnisse beobachtet (7). Tiere in den db/+m-Gruppen, die KGF-2 erhielten, zeigten ebenfalls eine höhere Reduzierung der Wundfläche im Vergleich zu den Puffer-Kontrollgruppen bei wiederholten Messungen (8). Diese Ergebnisse bestätigten eine höhere Wundverschlussrate bei den KGF-2 behandelten Tieren.
Auswirkung von KGF-2 auf die histologische Bewertung
Die histopathologische Bewertung von KGF-2 im diabetischen (db+/db+)-Modell an Tag 8 zeigte eine statistisch signifikante Verbesserung (p < 0,0001) bei der Bewertung der Wunde im Vergleich zur Pufferkontrolle. Die pharmakologischen Effekte, die sowohl bei den 4 μg- als auch den 40 μg-Dosen von KGF-2 beobachtet wurden, unterschieden sich nicht signifikant voneinander. Die Pufferkontrollgruppe zeigte eine minimale Zellakkumulation ohne Granulationsgewebe oder Epithelmigration während die 4 μg- und 40 μg-Dosen von KGF-2 (p < 0,0001 bzw. p = 0,06) eine Epithelbedeckung der Wunde, Granulationsgewebebildung und Fibroblasten und Collagenablagerung zeigten (9).
Die histopathologische Beurteilung der Hautwunden erfolgte auf Hämatoxylin-Eosingefärbten Proben. Die Punktebewertungskriterien schlossen eine Skala von 1–12 ein, wobei eine Punktebewertung von eins die minimale Zellakkumulation mit wenig bis keiner Granulation repräsentierte und eine Punktebewertung von 12 das übermäßige Vorhandensein von Fibroblasten, Collagenablagerung und neues Epithel, das die Wunden bedeckte, repräsentierte (Tabelle 1).
Die Beurteilung der nicht diabetischen Wurfgeschwister nach beiden KGF-2-Dosen zeigte für alle ausgewerteten Messungen keine signifikante Aktivität im Vergleich zur Puffer-Kontrollgruppe (10). Die Puffer-Kontrollgruppe zeigte unreifes Granulationsgewebe, inflammatorische Zellen und Kapillaren. Die mittlere Punktebewertung war höher als bei der diabetischen Gruppe, was die beeinträchtigte Wundheilung bei den diabetischen (db+/db+)-Mäusen zeigte.
Auswirkung von KGF-2 auf die Reepithelialisierung
Die Cytokeratin-Immunfärbung wurde verwendet, um das Ausmaß der Reepithelialisierung zu bestimmen. Die Punkteverteilung erfolgte basierend auf dem Grad des Wundverschlusses auf einer Skala von 0 (kein Wundverschluss) bis 8 (vollständiger Wundverschluss). Bei den Gruppen, die 4 μg/Tag erhielten, gab es im Vergleich zur Puffer-Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Verbesserung p < 0,0001 (11). In dieser Gruppe wurden Keratinocyten beobachtet, die sich in der neu gebildeten Epidermis lokalisierten, die die Wunde bedeckte. Beide KGF-2-Dosen zeigten auch in verschiedenen Stadien mitotische Figuren. Die Beurteilung der nicht diabetischen Gruppen bei beiden Dosen von KGF-2 verbesserte auch signifikant die Beurteilung der Reepithelialisierung (p = 0,006 bzw. 0,01) (12).
Auswirkung von KGF-2 auf die Zellproliferation
Die proliferierende Zellkern-Antigen-Färbung zeigte sowohl bei den 4 μg- als auch bei den 40 μg-Gruppen eine signifikante Proliferation (13). Die nicht diabetische Gruppe zeigte ähnliche Ergebnisse, da beide Gruppen, die beide Dosen von KGF-2 erhielten, eine höhere signifikante Punktezahl im Vergleich zur Puffer-Kontrollgruppe zeigten (14). Die Epidermisproliferation wurde insbesondere auf der Basalschicht der Epidermis beobachtet. Zusätzlich wurden dicht gepackte PCNA-markierte Zellen in der Dermis, insbesondere in den Haarfollikeln, beobachtet.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse zeigen, dass KGF-2 das Wachstum der primären epidermalen Keratinocyten spezifisch stimuliert. Zusätzlich zeigen diese Experimente, dass topisch angewendetes rekombinantes menschliches KGF-2 die Heilungsrate von Vollhautschnittwunden bei diabetischen Mäusen merklich beschleunigt. Die histologische Beurteilung zeigt, dass KGF-2 die Keratinocytenproliferation mit der Epidermisverdickung induziert. Diese Proliferation ist in der Basalschicht der Epidermis lokalisiert, wie durch das proliferierende Zellkern-Antigen (PCNA) gezeigt wird. Auf Dermisebene bauten die Collagenablagerungen, die Fibroblastenproliferation und die Neovaskularisation die normale Architektur der Haut wieder auf.
Die hohe Dichte der PCNA-markierten Zellen bei KGF2-behandelten Tieren im Gegensatz zur Puffer-Kontrollgruppe, die weniger PCNA-markierte Zellen besaß, zeigt die Stimula tion der Keratinocyten auf der dermal-epidermalen Ebene, Fibroblasten und Haarfollikel. In diesem Experiment wurde Verbesserung des Heilungsprozesses durch KGF-2 stetig beobachtet. Dieser Effekt war bei den ausgewerteten Parametern (prozentuale Reepithelialisierung und Wundverschluss) statistisch signifikant. Die PCNA-markierten Keratinocyten wurden im wesentlichen hauptsächlich an der unteren Basalebene der Epidermis beobachtet. Die Dermis zeigte normalisiertes Gewebe mit Fibroblasten, Collagen und Granulationsgewebe.
Die bei den nicht diabetischen Tieren beobachtete Aktivität zeigt, basierend auf täglichen Messungen, dass KGF-2 eine signifikante pharmakologische Reaktion beim prozentualen Wundverschluss an Tag 8 sowie während des Experimentverlaufs aufwies. Obwohl die histopathologische Beurteilung sich nicht wesentlich im Vergleich zur Pufferkontrolle unterschied zeigten das Keratinocytenwachstum und die PCNA-Punktebewertung signifikante Effekte.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass KGF-2 eine signifikante Aktivität sowohl bei den gehemmten als auch den normalen Schnittwundenmodellen bei Verwendung des db+/db+-Mausmodells zeigt und deshalb bei der Behandlung von Wunden einschließlich Operationswunden, diabetischen Geschwüren, Venenstaugeschwüren, Verbrennungen und anderen Hauterkrankungen nützlich sein kann.
Experiment 8
KGF-2-vermittelte Wundheilung im steroidgehemmten Rattenmodell
Die Hemmung der Wundheilung durch Steroide wurde gut in verschiedenen in vitro- und in vivo-Systemen gezeigt. (Wahl, S. M. Glucocorticoids and Wound healing. In Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280–302 (1989); Wahl, S. M. et al., J. Immunol 115: 476–481 (1975); Werb, Z. et al., J. Exp. Med. 147: 1684–1694 (1978)). Glucocorticoide verzögern die Wundheilung durch Hemmung der Angiogenese, wobei die Gefäßpermeabilität (Ebert, R. H., et al., An. Intern. Med. 37: 701–705 (1952)), die Fibroblastenproliferation und die Collagensynthese herabgesetzt wird (Beck, L. S. et al., Growth Factors. 5: 295–304 (1991); Haynes, B. F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703–797 (1978)) und eine vorübergehende Reduzierung der zirkulierenden Monocyten erzeugt wird (Haynes, B. F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703–797 (1978); Wahl, S. M. Glucocorticoids and wound healing. In Anti-inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. Academic Press. New York. S. 280–302 (1989)). Die systemische Verabreichung von Steroiden bei beeinträchtigter Wundheilung ist ein gut etabliertes Phänomen bei Ratten (Beck, L. S. et al., Growth Factors 5: 295304 (1991); Haynes, B. F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703–797 (1978); Wahl, S. M. Glucocorticoids and Wound healing. In Anti-Inflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. Academic Press. New York. S. 280–302 (1989); Pierce, G. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 2229–2233 (1989)).
Um zu zeigen, dass KGF-2 den Heilungsprozess beschleunigen würde, wurden die Wirkungen von multiplen topischen Anwendungen von KGF-2 bei Vollhautschnittwunden bei Ratten beurteilt, bei denen die Heilung durch die systemische Anwendung von Methyprednisolon gehemmt ist. In-vitro-Studien zeigten, dass KGF-2 das Wachstum der primären epidermalen Keratinocyten spezifisch stimuliert. Dieses Beispiel zeigt, dass das topisch angewandte rekombinante menschliche KGF-2 die Heilungsrate von Vollhautschnittwunden bei Ratten beschleunigt, indem die Wundlücke mit einem kalibrierten Jameson-Tastzirkel und durch Histomorphometrie und Immunhistochemie gemessen wird. Die histologische Beurteilung zeigt, dass KGF-2 die Reepithelialisierung und folglich die Wundreparatur beschleunigt.
Tiere
In diesem Beispiel wurden junge ausgewachsene Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g (Charles River Laboratories) verwendet. Die Tiere wurden im Alter von 8 Wochen gekauft und waren zu Beginn der Studie 9 Wochen alt. Die Heilungsreaktion der Ratten wurde durch die systemische Verabreichung von Methylprednisolon (17 mg/kg/Ratte intramuskulär) zum Zeitpunkt der Verletzung gehemmt. Die Tiere wurden einzeln gehalten und erhielten Futter und Wasser ad libitum. Alle Manipulationen erfolgten unter Verwendung aseptischer Verfahren. Diese Studie wurde nach den Vorschriften und Richtlinien von Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care und Use Committee und den Richtlinien für die Sorgfalt und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
KGF-2
Rekombinantes menschliches KGF-2 wurde überexprimiert und aus pQE60-Cys37, einem E. coli-Expressionsvektorsystem (pQE-9, Qiagen), gereinigt. Das aus diesem Konstrukt exprimierte Protein ist das KGF-2 von Cystein an Position 37 bis Serin an Position 208 mit einem 6X(His)-Tag, der an den N-Terminus des Proteins (SEQ ID NR: 29–30) (15) gebunden ist. Für das Experiment wurden Fraktionen verwendet, die mehr als 95% reines rekombinantes Material enthielten. KGF-2 wurde in einem Vehikel formuliert, das 1X PBS enthielt. Die Endkonzentrationen betrugen 20 μg/ml und 80 μg/ml Stammlösung. Die Verdünnungen wurden aus der Stammlösung unter Verwendung desselben Vehikels hergestellt.
KGF-2Δ28 wurde überexprimiert und aus einem E. coli-Expressionsvektorsystem gereinigt. Für das Experiment wurden Fraktionen verwendet, die mehr als 95% reines rekombinantes Material enthielten. KGF-2 wurde in einem Vehikel formuliert, das 1X PBS enthielt. Die Endkonzentrationen betrugen 20 μg/ml und 80 μg/ml Stammlösung. Die Verdünnungen wurden aus der Stammlösung unter Verwendung desselben Vehikels hergestellt.
Durch chirurgischen Eingriff erzeugte Verletzung
Die Vorschrift zur Erzeugung von Verletzungen wurde nach dem vorstehenden Beispiel 7 befolgt. Am Tag der Verletzung die Tiere mit einer intramuskulären Ketamininjektion (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) betäubt. Der Rückenbereich des Tieres wurde rasiert und die Haut mit 70%-iger Ethanol- und Jodlösung gewaschen. Die chirurgische Eingriffsfläche wurde mit steriler Gaze vor der Verletzung getrocknet. Dann wurde unter Verwendung einer Keyes-Gewebestanze eine 8 mm Vollhautwunde erzeugt. Die Wunden wurden für die Dauer des Experiments offengelassen. Die Anwendung der Testmaterialen erfolgte einmal am Tag topisch an 7 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag der Verletzung und nach der Verabreichung von Methypredniloson. Vor der Behandlung wurden die Wunden sanft mit steriler Salzlösung und Gazeschwämmen gereinigt.
Die Wunden wurden visuell untersucht und in einem konstanten Abstand am Tag der Verletzung und am Ende der Behandlung photographiert. Der Wundverschluss wurde durch tägliche Messung an den Tagen 1–5 und an Tag 8 bestimmt. Die Wunden wurden horizontal und vertikal unter Verwendung eines Jameson-Tastzirkels gemessen. Die Wunden wurden als verheilt betrachtet, wenn das Granulationsgewebe nicht länger sichtbar war und die Wunde von einem kontinuierlichen Epithel bedeckt war.
Eine Dosis-Antwort wurde 5 Tage unter Verwendung von zwei unterschiedlichen KGF-2-Dosierungen, eine bei 1 μg pro Wunde pro Tag und die zweite bei 4 μg pro Wunde pro Tag, in 50 μl Vehikel durchgeführt. Die Vehikel-Kontrollgruppen erhielten 50 μl 1X PBS.
Die Tiere wurden an Tag 8 mit einer intraperitonealen Natriumpentobarbitalinjektion (300 mg/kg) getötet. Die Wunden und die umgebende Haut wurden dann für die Histologie und die Immunhistochemie geerntet. Gewebeproben wurden zur weiteren Verarbeitung in 10% neutral gepuffertes Formalin in Gewebecassetten zwischen Biopsieschwämmchen gegeben.
Versuchskonzept
Vier Gruppen von jeweils 10 Tieren (5 mit Methylprednisolon und 5 ohne Glucocorticoid) wurden ausgewertet: 1) Unbehandelte Gruppe, 2) Vehikel-Placobokontrolle, 3) KGF-2 1 μg/Tag und 4) KGF-2 4 μg/Tag. Diese Studie wurde wie folgt konzipiert:
Messung der Wundfläche und des Wundverschlusses
Der Wundverschluss wurde analysiert, indem der Bereich in der vertikalen und horizontalen Achse gemessen wurde und die Gesamtquadratfläche der Wunde erhalten wurde. Die Kontraktion wurde dann geschätzt, indem die Unterschiede zwischen der Anfangswundfläche (Tag 0) und derjenigen nach der Behandlung (Tag 8) ermittelt wurden. Die Wundfläche an Tag 1 betrug 64 mm² – die entsprechende Größe der Hautstanze. Die Berechnungen wurden unter Verwendung der folgenden Formel durchgeführt:
[Offene Fläche an Tag 8]–[Offene Fläche an Tag 1]/[Offene Fläche an Tag 1].
Histologie
Proben wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und in Parffin eingebettete Blocks wurden senkrecht zur Wundoberfläche (5 μm) in Abschnitte eingeteilt und unter Verwendung eines Olympus-Mikrotoms geschnitten. Die Routine-Hämatoxylin-Eosin (H & E)-Färbung erfolgte auf den Querschnitten zweigeteilter Wunden. Die histologische Untersuchung der Wunden erlaubte uns zu beurteilen, ob der Heilungsprozess und das morphologische Erscheinungsbild der reparierten Haut durch Behandlung mit KGF-2 verbessert wurde. Von einem blinden Beobachter wurde ein kalibriertes Linsenmikrometer verwendet, um den Abstand der Wundlücke zu bestimmen.
Statistische Analyse
Die experimentellen Daten wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests analysiert. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant betrachtet. Die Daten wurden als Mittelwert +/– SEM ausgedrückt.
Ergebnisse
Ein Vergleich des Wundverschlusses der unbehandelten Kontrollgruppen mit und ohne Methylprednisolon zeigt, dass die Methylprednisolon behandelten Ratten eine signifikante Hemmung der Wundheilung 8 Tage nach der Verletzung im Vergleich zu normalen Ratten aufwiesen. Die Gesamtwundfläche betrug 58,4 mm² bei der Methylprednisolon-injizierten Gruppe und 22,4 mm² bei der Gruppe, die kein Glucocorticoid erhielt (16).
Auswirkungen von KGF-2 auf den Wundverschluss
Die systemische Verabreichung von Methylpredinsolon bei Ratten zum Zeitpunkt der Verletzung verzögerte den Wundverschluss (p = 0,002) normaler Ratten. Die Messungen des Wundverschlusses der Methypredniloson-gehemmten Gruppen am Ende des Experiments an Tag 8 zeigten, dass der Wundverschluss mit KGF-2 (1 μg p = 0,002 & 4 μg p = 0,005) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe statistisch signifikant größer war (16). Der prozentuale Wundverschluss betrug 60,2% bei der Gruppe, die 1 μg KGF-2 (p = 0,002) erhielt, und 73% bei der Gruppe, die 4 μg KGF-2 (p = 0,0008) erhielt. Dagegen betrug der Wundverschluss der unbehandelten Gruppe 12,5% und derjenige der Vehikel-Placebogruppe betrug 28,6% ( 17).
Die Längsanalyse des Wundverschlusses bei den Glucocorticoid-Gruppen von Tag 1 bis Tag 8 zeigt bei beiden KGF-2-Dosierungen in den behandelten Gruppen eine signifikante Reduzierung der Wundgröße von Tag 3 bis 8 nach der Verletzung (18).
Die Ergebnisse zeigen, dass die mit 4 μg KGF-2 behandelte Gruppe einen statistisch signifikanten (p = 0,05) beschleunigten Wundverschluss im Vergleich zur unbehandelten Gruppe aufwies (19A). Obwohl es schwierig ist, die Fähigkeit eines Proteins oder anderer Verbindungen zu beurteilen, die Wundheilung in einem normalen Tier zu beschleunigen (aufgrund der schnellen Erholung), konnte trotzdem gezeigt werden, dass KGF-2 die Wundheilung in diesem Modell beschleunigt.
Histopathologische Beurteilung von KGF-2-behandelten Wunden
Die Histomorphometrie der Wundlücke zeigte eine Reduzierung im Wundabstand der KGF-2-behandelten Gruppe. Die für die unbehandelte Gruppe beobachtete Wundlücke betrug S336μ während die mit 1 μg KGF-2 behandelte Gruppe eine Reduzierung der Wundlücke bis 2972μ aufwies und die Gruppe, die mit 4 μg KGF-2 (p = 0,04) behandelt wurde, wies eine Reduzierung der Lücke bis zu 3086μ auf. (20)
Auswirkungen von KGF-2Δ28 bei der Wundheilung
Die Bewertung von KGF-2Δ28 und PDGF-BB bei der Wundheilung beim Methylprednisolon-gehemmten Rattenmodell wurde ebenfalls untersucht. Das Experiment wurde genauso wie vorstehend beim KGF-2-Protein durchgeführt, außer, dass das KGF-2Δ28-Protein keinen His-Tag besaß und die Wundheilung an den Tagen 2, 4, 6, 8 und 10 gemessen wurde. Das Puffervehikel für die Proteine war für alles außer der „E2"-Präparation des KGF-2 mit der gesamten Länge 40 mM NaOAc und 150 mM NaCl, pH 6,5. Das Puffervehikel für die „E2"-KGF-2- Präparation war 20 mM NaOAc und 400 mM NaCl, pH 6,4.
Die in 19B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass KGF-2Δ28 einen statistisch signifikant beschleunigten Wundverschluss im Vergleich zur unbehandelten Gruppe aufweist und die Wirkungen von Methylprednisolon auf die Wundheilung umkehrte.
Schlussfolgerungen
Dieses Beispiel zeigt, dass KGF-2 die Wirkungen von Methylprednisolon auf die Wundheilung umkehrte. Die exogene Anwendung von Wachstumsfaktoren kann die Granulationsgewebebildung beschleunigen, indem inflammatorische Zellen in die Wunde gezogen werden. Eine ähnliche Aktivität wurde ebenfalls bei Tieren beobachtet, die kein Methylprednisolon erhielten, was zeigte, dass basierend auf täglichen Messungen KGF-2 eine signifikante pharmakologische Reaktion beim prozentualen Wundverschluss an Tag 5 aufwies. Es wurde gezeigt, dass das Glucocorticoid-gehemmte Wundheilungsmodell bei Ratten ein geeignetes und reproduzierbares Modell zur Messung der Wirksamkeit von KGF-2 und anderen Verbindungen auf dem Gebiet der Wundheilung ist.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass KGF-2 sowohl im Glucocorticoid-gehemmten als auch in normalen Schnittwundenmodellen eine signifikante Aktivität zeigt. Deshalb kann KGF-2 bei der Stimulation der Wundheilung einschließlich Operationswunden, diabetischen Geschwüren, Venenstaugeschwüren, Verbrennungen und andere abnorme Wundheilungszustände wie Urämie, Mangelernährung, Vitaminmangel und systemische Behandlung mit Steroiden und antineoplastischen Medikamenten klinisch nützlich sein.
Beispiel 9
Verteilung der KGF-2-mRNA-Expression im Gewebe
Die Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um den Expressionsgrad des Gens, das das KGF-2-Protein in menschlichen Geweben codiert, unter Verwendung von Verfahren zu untersuchen, die unter anderem von Sambrook et. al., vorstehend zitiert, beschrieben werden. Eine Sonde, die dem gesamten offenen Leserahmen von KGF-2 der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NR: 1) entspricht, wurde durch PCR erhalten und wurde mit ³²P unter Verwendung des rediprime^TM-DNA-Markierungssystems (Amersham Life Science) nach den Anweisungen des Herstellers markiert. Nach der Markierung wurde die Sonde unter Verwendung einer CHROMA SPIN-100^TM-Säule (Clontech Laboratories, Inc.) nach der Vorschriftsnummer PT1200-1 des Herstellers gereinigt. Die gereinigte Sonde wurde dann verwendet, um verschiedene menschliche Gewebe für die Expression des KGF-2-codierenden Gens zu untersuchen.
Mehrfache Gewebe-Northern (MTN)-Blots, die Poly-A-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben (H) oder menschlichen Immunsystemgeweben (IM) enthielten, wurden aus Clontech erhalten und wurden mit einer markierten Sonde unter Verwendung der Express-Hyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech) nach der Vorschriftsnummer PT1190-1 des Herstellers untersucht. Nach der Hybridisierung und dem Waschen wurden die Blots befestigt und auf einem Film bei –70°C über Nacht exponiert und die Filme nach Standarduerfahren entwickelt.
In den meisten menschlichen Geweben wurde eine Haupt-mRNA-Spezies von etwa 4,2 kb beobachtet. Die KGF-2-mRNA war relativ häufig im Herz, Pankreas, in der Plazenta und im Eierstock vorhanden. Eine kleinere mRNA-Spezies von etwa 5,2 kb wurde ebenfalls ubiquitär beobachtet. Die Identität dieser 5,2 kb-mRNA-Spezies war nicht klar. Es ist möglich, dass das 5,2 kb-Transkript eine alternativ gespleißte Form von KGF-2 oder ein drittes Mitglied der KGF-Familie codiert. Die KGF-2-cDNA war 4,1 kb, was mit der Größe der mRNA von 4,2 kb übereinstimmt.
Beispiel 10
Keratinocyten-Proliferationstests
Hautkeratinocyten sind Zellen in der Epidermis der Haut. Das Wachstum und die Verbreitung der Keratinocyten in der Haut ist ein wichtiger Vorgang bei der Wundheilung. Ein Keratinocyten-Proliferationstest ist deshalb ein wertvoller Indikator der Proteinaktivitäten bei der Stimulation des Keratinocytenwachstums und folglich der Wundheilung.
Es ist jedoch schwierig, Keratinocyten in vitro zu züchten. Es existieren wenige Keratinocytezelllinien. Diese Zelllinie besitzen verschiedene zelluläre und genetische Defekte. Um Komplikationen dieses Tests durch zelluläre Defekte wie den Verlust von Hauptwachstumsfaktorenrezeptoren oder die Abhängigkeit von Hauptwachstumsfaktoren für das Wachstum zu vermeiden, werden primäre Hautkeratinocyten für diesen Test ausgewählt. Diese primären Keratinocyten erhält man von Clonetics, Inc. (San Diego, CA).
Keratinocytenproliferationstest mit alamarBlue
alamarBlue ist eine verwendbare blaue Farbe, die bei Zugabe zum Kulturmedium von den Mitochondrien verstoffwechselt wird. Die Farbe schlägt dann in Gewebekulturüberständen auf rot um. Die Mengen an roter Farbe können direkt durch Ablesen des Unterschieds in der optischen Dichte zwischen 570 nm und 600 nm quantifiziert werden. Dieses Ablesen spiegelt die zellulären Aktivitäten und die Zellzahl wider.
Normale primäre Hautkeratinocyten (CC-0255, NHEK-Neo vereinigt) werden von Clonetics, Inc gekauft. Diese Zellen sind Passage 2. Die Keratinocyten werden in Keratinocyten-Komplett-Wachstumsmedium (CC-3001, KGM; Cloneties, Inc.) gezüchtet, bis sie 80% Konfluenz erreichen. Die Zellen werden nach der Spezifikation des Herstellers mit Trypsin versetzt. Kurz gesagt, werden die Zellen zweimal mit ausgewogener Hank-Salzlösung gewaschen. Den Zellen werden etwa 3–5 min 2–3 ml Trypsin bei Raumtemperatur zugegeben. Es wurde eine Trypsin neutralisierende Lösung zugegeben und die Zellen wurden gesammelt. Die Zellen werden 5 min bei Raumtemperatur bei 600 × g zentrifugiert und in neue Kolben bei 3.000 Zellen pro Quadratzentimenter unter Verwendung von vorgewärmtem Medium plattiert.
Für den Proliferationstest 1.000–2.000 Keratinocytes pro Vertiefung der Corning-Platten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen in Komplettmedium außer die äußersten Reihen ausplattieren. Die äußeren Vertiefungen mit 200 μl sterilem Wasser auffüllen. Das hilft, die Temperatur- und Feuchtigkeitsschwankungen der Vertiefungen auf ein Minimum zu halten. Die Zellen bei 37°C über Nacht mit 5% CO₂ züchten. Zellen zweimal mit Keratinocyten-Basalmedium (CC-3101, KBM, Clonetics, Inc.) waschen und jeder Vertiefung 100 μl KBM zugeben. 24 Stunden inkubieren. Wachstumsfaktoren in KBM in Reihenverdünnung verdünnen und jeder Vertiefung 100 μl zugeben. KGM als Positivkontrolle und KBM als Negativkontrolle verwenden. Für jeden Konzentrationspunkt werden sechs Vertiefungen verwendet. Zwei bis drei Tage inkubieren. Am Ende der Inkubation die Zellen einmal mit KBM waschen und 100 μl KBM mit im Medium vorgemischtes 10 Vol.-% alamarBlue zugeben. 6 bis 16 Stunden inkubieren, bis die Farbe des Mediums bei der KGM-Positivkontrolle rot wird. O.D. 570 nm minus O.D. 600 nm messen, indem die Platten direkt in das Plattenlesegerät gesetzt werden.
Ergebnisse
Stimulation der Keratinocytenproliferation durch KGF-2
Um zu zeigen, dass KGF-2 (d. h. beginnend bei Aminosäure Cys37, wie in den Beispielen 7 und 8 vorstehend beschrieben) und die N-terminalen Deletionsmutanten KGF-2Δ33 und KGF-2Δ28 bei der Stimulation des epidermalen Keratinocytenwachstums aktiv waren, wurden normale primäre menschliche epidermale Keratinocyten mit dem E. coli exprimierten und gereinigten KGF-2-Protein (Chargennummer E3)(SEQ ID NR: 2), KGF-2Δ33 (Chargennummer E 1) und KGF-2Δ28 (Chargennummer E2) inkubiert. Das KGF-2-Protein stimulierte das Wachstum der epidermalen Keratinocyten mit einem EC50 von etwa 5 ng/ml, der demjenigen von FGF7/KGF-1 (21A) entspricht. Dagegen stimulierten andere FGF's wie FGF-1 und FGF-2 das Wachstum der primären Keratinocyten nicht. Der EC50 für KGF-2Δ33 betrug 0,2 ng/ml und derjenige für KGF-2Δ28 2 ng/ml (Vgl. 21B und C). Somit schien KGF-2 bei der Stimulation der Proliferation der primären epidermalen Keratinocyten genauso wirksam wie FGF7/KGF zu sein. Jedoch ist KGF-2Δ33 bei der Stimulation der Proliferation der Keratinocyten wirksamer als der in den Beispielen 7 und 8 vorstehend beschriebene „Cys (37)" KGF-2 und KGF-2Δ28.
Die Vernarbung von Wundgewebe geht einher mit der Hyperproliferation von Hautfibroblasten. Um zu bestimmen, ob die stimulatorischen Effekte von KGF-2 für Keratinocyten spezifisch waren, jedoch nicht für Fibroblasten, wurden Maus-Balb.c.3T3-Fibroblasten und menschliche Fibroblasten der Lunge getestet. Keine der Fibroblastenarten reagierte auf KGF-2 in den Proliferationstests. Deshalb schien KGF-2 ein Mitogen zu sein, das für epidermale Keratinocyten, aber nicht für Mesenchymzellen wie Fibroblasten spezifisch ist. Das legte nahe, dass die Wahrscheinlichkeit gering war, dass KGF-2 die Vernarbung der Wundgewebe verursacht.
Beispiel 11
A. Mitogene Effekte von KGF-2 auf mit spezifischen FGF-Rezeptoren transfizierte Zellen
Um zu bestimmen, welche FGF-Rezeptorisoform(en) die proliferierenden KGF-2-Effekte vermitteln/vermittelt, wurden die Auswirkungen von KGF-2 auf Zellen, die die spezifi schen FGF-Rezeptorisoformen exprimieren, nach dem von Santos-Ocampo et al., J. Biol. Chem. 271: 1726–1731 (1996) beschriebenen Verfahren getestet. Es war bekannt, dass FGF7/KGF die Mitogenese von Epithelzellen induziert, indem es an die FGFR2iiib-Form bindet und sowie spezifisch aktiviert (Miki et al. Science 251: 72–75 (1991)). Deshalb wurden die proliferativen Effekte von KGF-2 in Mitogense-Tests unter Verwendung von Zellen getestet, die eine der folgenden FGF-Rezeptorisoformen exprimierten: FGFR1iiib, FGFR2iiib, FGFR3iiib und FGFR4.
Mitogenese-Test von FGF-Rezeptoren exprimierenden Zellen
Der Thymidin-Einbau von BaF3-Zellen, die spezifische FGF-Rezeptoren exprimieren, erfolgte wie bei Santos-Ocampo et al., J. Biol. Chem. 271: 1726–1731 (1996) beschrieben. Kurz gesagt, wurden die BaF3-Zellen, die spezifische FGF-Rezeptoren exprimieren, in Dulbeco's modifiziertem Eagle-Medium, 10% neonatalem Rinderserum und L-Glutamin gewaschen und resuspendiert. Es wurden etwa 22.500 Zellen pro Vertiefung in eine Testplatte mit 96 Vertiefungen in Medium plattiert, das 2 μg/ml Heparin enthielt. Die Testreagenzien wurden jeder Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 200 μl pro Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden 2 Tage bei 37°C inkubiert. Jeder Vertiefung wurde dann 1 uCi ³H-Thymidin in einem Volumen von 50 μl zugegeben. Die Zellen wurden nach 4–5 Stunden durch Filtration durch Glasfaserpapier geerntet. Das eingebaute ³H-Thymidin wurde auf einem Wallac-Beta-Plattenscintillationszähler gezählt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigten, dass das KGF-2-Protein (Thr(36)–Ser(208) von 1 )(SEQ ID NR: 2), mit einem N-terminalen hinzugefügten Met) die Proliferation der Baf3-Zellen, die den KGF-Rezeptor, FGFR2iiib-Isoform, exprimieren, stark stimulierten, wie durch den Einbau von H³-Thymidin gezeigt (22A). Im wesentlichen wurde ein leichter stimulatorischer Effekt von KGF-2 auf die Proliferation von Baf3-Zellen beobachtet, die das FGFR1iiib-Isoform exprimieren. KGF-2 hatte keine Wirkung auf Zellen, die die FGFR3iiib oder die FGFR4-Formen des Rezeptors exprimieren.
FGF7/KGF stimulierte die Proliferation von Zellen, die den KGF-Rezeptor exprimieren. Der Unterschied zwischen KGF-2 und FGF7/KGF war faszinierend. In Kontrollexperimenten stimulierte aFGF seine Rezeptoren, FGFR1iiib und iiic und bFGF stimulierten seinen Rezep tor FGFR2iiic. Somit legten diese Ergebnisse nahe, dass KGF-2 an die FGFR2iiib-Isoform bindet und die Mitogenese stimuliert. Im Gegensatz zu FGF7/KGF bindet KGF-2 auch die FGFR1iiib-Isoform und stimuliert die Mitogenese.
B. Mitogene Effekte von KGF-2Δ33 auf Zellen, die mit spezifischen FGF Rezeptoren transfiziert wurden
Wie vorstehend gezeigt, binden sowohl FGFs oder KGF-1 als auch -2 an den FGF2iiib-Rezeptor (FGFR2iiib) und aktivieren ihn. Die proliferativen Effekte von KGF-2Δ33 bei Mitogenese-Tests wurden unter Verwendung von Zellen getestet, die eine der folgenden FGF-Rezeptortsoformen exprimiertem: FGFR2iiib oder FGFR2iiic (die 2iiic Rezeptor-transfizierten Zellen sind als Negativkontrolle eingeschlossen).
Die Experimente wurden wie vorstehend in Teil A dieses Beispiels durchgeführt. Kurz gesagt, wurden BaF3-Zellen in RPMI, enthaltend 10% Kälberserum (BCS – nicht fötales Serum), 10% conditioniertes Medium aus WEHI3-Zellen (gezüchtet in RPMI, enthaltend 5% BCS), 50 nM β-Mercaptoethanol, L-Glu (2% einer 100X Stammlösung) und Pen/Strep (1% einer 100X Stammlösung) gezüchtet.
Für den Test wurden BaF3-Zellen zweimal in RPMI-Medium, enthaltend 10% BCS und 1 μg/ml Heparin, gespült. Die BaF3-Zellen (22.000/Vertiefung) wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen in 150 μl RPMI-Medium, enthaltend 10% BCS und 1 μg/ml Heparin, plattiert. Saurer FGF, basischer FGF, KGF-1 (HG15400) oder KGF-2-Proteins (HG03400, 03401, 03410 oder 03411) wurden bei Konzentrationen von etwa 0 bis 10 nM zugegeben. Die Zellen wurden 48 Stunden in einem Endvolumen von 200 μl bei 37°C inkubiert. Alle Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Jeder Vertiefung wurde 4 Stunden bei 37°C mit Tritium versetztes Thymidin (0,5 μCi) zugegeben, und die Zellen wurden durch Filtration über einen Glasfaserfilter geerntet. Die Gesamtmenge der eingebauten Radioaktivität wurde dann durch flüssige Szintilationszählung bestimmt. Die folgenden Positivkontrollen wurden verwendet: basischer FGF und saurer FGF für FGFR2iiic-Zellen; saurer FGF und KGF-1 für FGFR2iiib-Zellen. Die folgenden Negativkontrollen wurden verwendet: Basalmedium (RPMI-Medium, enthaltend 10% BCS und 1 μg/ml Heparin).
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigten, dass KGF-2 (Thr(36)–Ser(208) mit einem N-terminalen hinzugefügten Met), KGF-2Δ33 und KGF-2Δ28-Proteine die Proliferation der BaF3-Zellen, die den KGF-Rezeptor, FGFR2iiib-Isoform, exprimieren, stark stimulierten, wie durch Einbau von ³H-Thymidin gezeigt(22A–C). Die KGF-2-Proteine hatten keine Wirkung auf Zellen, die die FGFR2iiic-Formen des Rezeptors exprimieren. Diese Ergebnisse legten nahe, dass KGF-2-Proteine an die FGFR2iiib-Isoform binden und die Mitogenese stimulieren. Außerdem scheint es, dass KGF-2Δ33 die Proliferation der BaF3-Zellen besser als KGF-2 (Thr(36)– Ser(208)) stimulieren konnte.
Beispiel 12
A. Konstruktion von E. coli-optimiertem KGF-2 mit der gesamten Länge
Um den Expressionsgrad von KGF-2 mit der gesamten Länge in einem E. coli-Expressionssystem zu erhöhen, wurden die Codons des aminoterminalen Genanteils für häufig verwendete E. coli-Codons optimiert. Für die Synthese des optimieren KGF-2-Bereichs wurde eine Reihe von sechs Oligonucleotiden synthetisiert: Nummer 1–6 (Sequenzen nachstehend aufgeführt). Diese sich überlappenden Oligos wurden in einer PCR-Reaktion für sieben Runden bei den folgenden Bedingungen verwendet:
Es wurde eine zweite PCR-Reaktion angesetzt, wobei 1 μl der ersten PCR-Reaktion mit dem synthetischen KGF-2-Primer 6 als 3'-Primer und dem synthetischen KGF-2-BamHI als 5'-Primer unter Verwendung derselben Bedingungen für 25 Zyklen verwendet wurde, wie vorstehend beschrieben. Das durch diese Endreaktion produzierte Produkt wurde mit AvaII und BamHI gespalten. Das KGF-2-Konstrukt von Beispiel 1 wurde mit AvaII und HindIII gespalten und das Fragment wurde isoliert. Diese beiden Fragmente wurden in den mit BamHI und HindIII gespaltenen pQE-9 in einer Ligierung mit drei Fragmenten cloniert.
Die für die Konstruktion des optimierten KGF-2 1/208 verwendeten Primer:
Der sich ergebende Clon ist in 23 (SEQ ID NR: 38 und 39) dargestellt.
B. Konstruktion von E. coli-optimiertem reifem KGF-2
Um die Expressionsspiegel von KGF-2 in einem E. coli-Expressionssystem weiter zu erhöhen, wurden die Codons des aminoterminalen Genanteils für häufig verwendete E. coli- Codons optimiert. Zur Übereinstimmung mit der reifen Form von KGF-1 wurde eine verkürzte Form von KGF-2, beginnend bei Threonin 36, konstruiert. Als Matrize wurde synthetischer E. coli-KGF-2 aus Beispiel 12 A in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von BspHI-5'-KGF-2 als 5'-Primer (Sequenz nachstehend angeführt) und HindIII-3'-KGF-2 als 3'-Primer (Sequenz nachstehend angeführt) verwendet. Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von Standardbedingungen, wie vorstehend in Beispiel 12A für 25 Zyklen angegeben. Das sich ergebende Produkt wurde mit BspHI und HindIII gespalten und in den mit NcoI und HindIII gespaltenen E. coli-Expressionsvektor pQE60 cloniert.
Der sich ergebende Clon ist in 24A (SEQ ID NR: 42 und 43) dargestellt.
C. Konstruktion eines alternativen E. coli-optimierten reifen KGF-2
Um die Expressionsspiegel der reifen Form von KGF-2 in einem E. coli-Expressionssystem weiter zu erhöhen, wurden die Codons von 53 Aminosäuren am aminoterminalen Anteil des E. coli-optimierten Gens in alternative, häufig verwendete E. coli-Codons geändert. Für die Synthese des optimieren KGF-2-Bereichs wurde eine Reihe von sechs Oligonucleotiden synthetisiert: Nummern 18062, 18061, 18058, 18064, 18059 und 18063 (Sequenzen nachstehend aufgeführt). Diese sich überlappenden Oligos wurden in einer PCR-Reaktion für sieben Runden bei den folgenden Bedingungen verwendet:
Nach sieben Syntheserunden wurden diesem gesamten Bereich 5'-Primer dieser Region, 18169, und ein 3'-Primer, 18060, zu einer PCR-Reaktion hinzugefügt, die 1 μl von der An fangsreaktion der sechs Oligonucleotide enthielt. Dieses Produkt wurde 30 Runden unter Verwendung der folgenden Bedingungen amplifiziert:
Es wurde eine zweite PCR-Reaktion angesetzt, um den 3'-Bereich des Gens unter Verwendung der Primer 18066 und 18065 unter denselben Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, für 25 Runden zu amplifizieren. Die sich ergebenden Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt. Die das Produkt enthaltenden Gelstücke wurden in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5 verdünnt. Ein μl eines jeden verdünnten Stücks wurde in einer zusätzlichen PCR-Reaktion unter Verwendung des Primers 18169 als 5'-Primer und des Primer 18065 als 3'-Primer verwendet. Das Produkt wurde für 25 Zyklen unter Verwendung derselben Bedingungen wie vorstehend amplifiziert. Das von dieser Endreaktion produzierte Produkt wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und in pQE60 cloniert, der ebenfalls mit EcoRI und HindIII gespalten wurde (nun pQE6).
Sequenzen der synthetischen 5'-Primer
Die Sequenz des synthetischen KGF-2-Gens und dessen entsprechende Aminosäure ist in 24B (SEQ ID NR: 54 und 55) dargestellt.
Beispiel 13
Konstruktion der KGF-2-Deletionsmutanten
Die Deletionsmutanten wurden aus dem 5'-Terminus und dem 3'-Terminus des KGF-2-Gensunter Verwendung des optimierten KGF-2-Konstrukts aus Beispiel 12 A als Matrize konstruiert. Die Deletionen wurden basierend auf Genbereichen ausgewählt, die die Expression in E. coli negativ beeinflussen könnten. Für die 5'-Deletion wurden die nachstehend aufgeführten Primer als 5'-Primer verwendet. Diese Primer enthalten die angegebene Restriktionsschnittstelle und ein ATG, um das Initiatormethionin zu codieren. Der KGF-2 (FGF-12)-208-Aminosäure-3'-HindIII-Primer wurde als 3'-Primer verwendet. Die PCR-Amplifikation für 25 Runden erfolgte unter Verwendung von Standardbedingungen, wie in Beispiel 12 aufgeführt. Die Produkte für die KGF-2 36aa/208aa-Deletionsmutanten wurden mit BspHI für die 5'-Schnittstelle und mit HindIII für die 3'-Schnittstelle gespalten und in pQE60 cloniert, das mit BspHI und HindIII gespalten wurde. Alle anderen Produkte wurden mit NcoI für das 5'-Restriktionsenzym und mit HindIII für die 3'-Schnittstelle gespalten und in den pQE60 cloniert, der mit NcoI und HindIII gespalten wurde. Für KGF-2 (FGF-12) wurde 36aa/153aa und 128aa-3'-HindIII wurde als 3'-Primer mit FGF-12-36aa/208aa als 5'-Primer verwendet. Für FGF-12-62aa/153aa wurde 128aa-3'-HindIII als 3'-Primer mit FGF-12-62aa/208aa als 5'-Primer verwendet. Die Nomenklatur der sich ergebenden Clone gibt die erste und letzte Aminosäure des Polypeptids an, das sich aus der Deletion ergibt. Beispielsweise gibt KGF-2– 36aa/153aa an, dass die erste Aminosäure der Deletionsmutante die Aminosäure 36 ist und die letzte Aminosäure ist Aminosäure 153 von KGF-2. Ferner besitzt, wie in den 25-33 angegeben, jede Mutante ein daran hinzugefügtes N-terminales Met.
Sequenzen der Deletionsprimer:
Die Sequenzen für die sich daraus ergebenden Deletionsmutanten werden in den 25-33 [SEQ m NR: 65–82] aufgeführt.
Beispiel 14
Konstruktion der KGF-2-Cysteinmutanten
Die Konstruktion der C-37-Mutationsprimer 5457-5'-BspHI und 5258-173aaa-3' HindIII wurde verwendet, um die KGF-2 (FGF-12)-Matrize aus Beispiel 12 A zu amplifizieren. Der Primer 5457-5'BspHI ändert Cystein 37 in ein Serin. Die Amplifikation erfolgte für 25 Zyklen unter Verwendung der Standardbedingungen, die vorstehend in Beispiel 12 A umrissen wurden. Das sich ergebende Produkt wurde mit BspHI und HindIII gespalten und in den mit BspHI und HindIII gespaltenen E. coli-Expressionsvektor pQE60 cloniert. (34) [SEQ ID NR: 83].
Für die Mutation von Cystein 106 in Serin wurden zwei PCR-Reaktionen zur zielgerichteten Oligonucleotidmutagenese dieses Cysteins angesetzt. In einer Reaktion wurde 5453-BspHI als 5'-Primer verwendet, und 5455 wurde als 3'-Primer in der Reaktion verwendet. In einer zweiten Reaktion wurde 5456 als 5'-Primer und 5258 HindIII als der 3'-Primer verwendet. Die Reaktionen wurden 25 Runden unter Standardbedingungen amplifiziert, wie in Beispiel 12 aufgeführt. Ein Mikroliter aus jeder dieser PCR-Reaktionen wurde als Matrize in einer nachfolgenden Reaktion unter Verwendung von 5453 BspHI als 5'-Primer und 5258 HindIII als 3'-Primer verwendet. Die Amplifikation für 25 Runden erfolgte unter Standardbedingungen, wie in Beispiel 12 aufgeführt. Das sich ergebende Produkt wurde mit BspHI und HindIII gespalten und in den mit NcoI und HindIII gespaltenen E. coli-Expressionsvektor pQE60 cloniert.
Es waren zwei PCR-Reaktionen erforderlich, um die C-37/C-106-Mutante herzustellen. Die Primer 5457-BspH1 und 5455 wurden verwendet, um den 5'-Bereich der Mutante zu erzeugen, die Cystein 37 bis zur Serinsubstitution enthielt, und Primer 5456 und 5258-HindIII wurden verwendet, um den 3'-Bereich der Mutante zu erzeugen, die Cystein 106 bis zur Serinsubstitution enthielt. In der zweiten Reaktion wurde der 5457-BspHI-Primer als 5'-Primer verwendet und 5258-HindIII als 3'-Primer verwendet, um die C-37/C-106-Mutante zu erzeugen, wobei 1 μl aus jeder der Anfangsreaktionen zusammen als Matrize verwendet wurden. Dieses PCR-Produkt wurde mit BspHI und HindIII gespalten und in den mit NcoI und HindIII gespaltenen pQE60 cloniert. Der sich ergebende Clon ist in 35 (SEQ ID NR: 84) dargestellt.
Sequenzen der Cysteinmutantenprimer:
Beispiel 15
Herstellung und Reinigung von KGF-2 (FGF-12)
Die DNA-Sequenz, die das in Beispiel 12 B beschriebene optimierte reife Protein codiert (d. h. die Aminosäuren T36 bis 5208 von KGF-2), wurde in das Plasmid pQE-9 (Qiagen) cloniert. E. coli (M15/rep4;Qiagen) wurden bis zur stationären Phase über Nacht bei 37°C in LB gezüchtet, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin. Diese Kultur wurde verwendet, um frisches LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin bei einer Verdünnung von 1 : 50 anzuimpfen. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einer O.D.₅₉₅ von 0,7 gezüchtet, und durch Zugabe von Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Nach 3–4 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in einem Puffer resuspendiert, der 60 mM NaPO₄ und 360 mM NaCl in einem Verhältnis von 5 Volumina Puffer: 1 Volumen Zellpaste enthielt.
Nach der Zertrümmerung in einem Mautin-Gaulin-Homogenisator wurde der Extrakt auf einen pH-Wert von 8,0 durch Zugabe von NaOH eingestellt und durch Zentrifugation geklärt. Der geklärte lösliche Extrakt wurde auf eine Poros-HS-50-Säule aufgetragen (2,0 × 10,0 cm; PerSeptive Biosystems, Inc.) und die gebundenen Proteine wurden schrittweise mit 50 mM NaPO₄ pH 8,0, enthaltend 0,5 M, 1,0 M und 1,5 M NaCl, eluiert. KGF-2 eluierte in der 1,5 M-Salzfraktion, die dann fünffach mit 50 mM NaPO₄ pH 6,5 bis zu einer Endkonzentration von 300 mM verdünnt wurde. Diese KGF-2 enthaltende Fraktion wurde dann nacheinander über eine Poros-HQ-20-Säule (2,0 × 7,0 cm; PerSeptive Biosystems, Inc.) aufgetragen und dann an eine Poros CM-20-Säule (2,0 × 9,0 cm; PerSeptive Biosystems, Inc.) gebunden. KGF-2 (FGF-12) enthaltende Fraktionen, die bei etwa 500 mM bis etwa 750 mM NaCl eluierten, wurden vereinigt, verdünnt und wiederum auf eine CM-20-Säule zur Konzentration aufgetragen. Schließlich wurde das Protein auf einer Gelfiltrationssäule (S-75; Pharmacia) in 40 nM NaOAC pH6,5; 150 mM NaCl (Charge E-5) aufgetragen. Alternativ ließ man die Gelfiltrationssäule in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, Charge E-4) laufen. KGF-2 enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und die Proteinkonzentration wurde durch den Bio-Rad-Protein-Test bestimmt. Mittels SDS-PAGE beurteilte man die Proteine als > 90% rein. Schließlich fand man heraus, das die durch den Limulus-Amöbocyten-Lysattest (Cape Cod Associates) bestimmten Endotoxinspiegel ≤ 1 Eu/mg betrugen. Die auf diese Weise hergestellten Proteine konnten Heparin binden, was ein Kennzeichen der Mitglieder FGF-Familie ist.
Beispiel 16
A. Konstruktion der N-terminalen Deletionsmutante KGF-2Δ33
Um den Expressionsgrad von KGF-2 in E. coli zu erhöhen und um die Löslichkeits- und Stabilitätseigenschaften von E. coli exprimiertem KGF-2 zu erhöhen, wurde eine Deletionsvariante KGF-2Δ33 (KGF-2 aa 69-208) erzeugt, bei der die ersten 68 Aminosäuren des vorprozessierten KGF-2 entfernt wurden. Der Grund zur Erzeugung dieser Deletionsvariante basierte auf den folgenden Beobachtungen. Erstens enthält reifes KGF-2 (KGF-2-aa 69-208) eine ungerade Anzahl (drei) an Cysteinresten, die zu einer Aggregation aufgrund von intramolekularen Disulfidbrückenbildung führen kann. Die KGF-Δ33-Deletionsvariante enthält nur zwei Cysteinreste, die das Potential für die intramolekulare Disulfidbrückenbildung und nachfolgende Aggregation verringern. Eine Verringerung der Aggregation sollte zu einer Erhöhung im Ertrag des aktiven KGF-2-Proteins führen. Zweitens wurde bei der KGF-Δ33-Deletionsvariante ein Poly-Serin-Abschnitt entfernt, der im KGF-1 nicht vorhanden ist und der für die Aktivität nicht wichtig zu sein scheint, aber die Expression des Proteins in E. coli behindern kann. Somit kann die Entfernung des Poly-Serin-Abschnitts die Expressionsspiegel des aktiven KGF-2-Proteins erhöhen. Drittens führt die Expression von KGF-Δ33 in E. coli zu einer natürlichen Spaltung von KGF-2 zwischen den Resten 68 und 69. Somit nimmt man an, dass KGF-Δ33 effizient prozessiert wird und in E. coli stabil ist.
Konstruktion von KGF-Δ33 in pQE6
Um eine Polymerasekettenreaktion gelenkte Amplifikation und Subclonierung von KGF-2Δ33 in den E. coli Expressionsvektor, pQE6, zuzulassen, wurden zwei Oligonucleotidprimer (5952 und 19138) komplementär zum gewünschten Bereich von KGF-2 mit der folgenden Basensequenz synthetisiert.
Im Falle des N-terminalen Primers (5952) wurde eine AflIII-Restriktionsschnittstelle eingebaut, während im Falle des C-terminalen Primers (19138) eine HindIII-Restriktionsschnittstelle eingebaut wurde. Der Primer 5952 enthält auch eine ATG-Sequenz neben und im Leserahmen mit dem KGF-2-codierenden Bereich, um die Translation des clonierten Fragments in E. coli zuzulassen, während der Primer 19138 zwei Stoppcodons (vorzugsweise in E. coli verwendet) neben und im Leserahmen mit dem KGF-2-codierenden Bereich enthält, der die richtige Translationstermination in E. coli sicherstellt.
Die Polymerasekettenreaktion erfolgte, indem dem Fachmann gut bekannte Standardbedingungen und die Nucleotidsequenz für das reife KGF-2 (aa 36-208) (konstruiert in Beispiel 12C) als Matrize verwendet wurden. Das sich ergebende Amplikon wurde einer Restriktionsspaltung mit AflIII und HindIII unterzogen und in den mit NcoI/HindIII gespaltenen Proteinexpressionsvektor pQE6 subcloniert.
Konstruktion von KGF-2Δ33 in pHE1
Um die Polymerasekettenreaktion gelenkte Amplifikation und Subclonierung von KGF-2Δ33 in den E. coli Expressionsvektor, pHE1, zuzulassen, wurden zwei Oligonucleotidprimer (6153 und 6150) komplementär zum gewünschten Bereich von KGF-2 mit der folgenden Basensequenz synthetisiert.
Im Falle des N-terminalen Primers (6153) wurde eine NdeI-Restriktionsschnittstelle eingebaut, während im Falle des C-terminalen Primers (6150) eine Asp718-Restriktionsschnittstelle eingebaut wurde. Der Primer 6153 enthält auch eine ATG-Sequenz neben und im Leserahmen mit dem KGF-2 codierenden Bereich, um die Translation des clonierten Fragments in E. coli zuzulassen, während der Primer 6150 zwei Stoppcodons (vorzugsweise in E. coli verwendet) neben und im Leserahmen mit dem KGF-2-codierenden Bereich enthält, der die richtige Translationstermination in E. coli sicherstellt.
Die Polymerasekettenreaktion erfolgte, indem dem Fachmann gut bekannte Standardbedingungen und die Nucleotidsequenz für das reife KGF-2 (aa 36-208) (konstruiert in Beispiel 12C) als Matrize verwendet wurden. Das sich ergebende Amplikon wurde einer Restriktionsspaltung mit NdeI und Asp718 unterzogen und in den mit NdeI/Asp718 gespaltenen Proteinexpressionsvektor pHE1 subcloniert.
Nucleotidsequenz von KGF2 Δ33
Aminosäuresequenz von KGF 1533:
B. Konstruktion eines optimierten KGF-2Δ33
Um den Expressionsgrad von KGF-2Δ33 in E. coli zu erhöhen, wurden die Codons des vollständigen Gens optimiert, damit sie mit denjenigen übereinstimmen, die am häufigsten in E. coli verwendet werden. Da die Matrize, die zur Erzeugung von KGF-2Δ33 verwendet wurde, innerhalb des N-terminalen Bereiches Codon-optimiert wurde, war für die C-terminalen Aminosäuren (84–208) eine Optimierung erforderlich.
Zuerst wurden die Aminosäuren 172–208 Codon-optimiert, um KGF-2Δ33(s172–208) zu erzeugen. Dies wurde durch eine Strategie mit sich überlappender PCR erreicht. Die Oligonucleotide PM07 und PM08 (entsprechen den Aminosäuren 172–208) wurden vereinigt und zusammen angelagert, indem sie auf 70°C erhitzt wurden und man sie auf 37°C abkühlen ließ. Die angelagerten Oligonucleotide wurden dann als Matrize für eine Standard PCR-Reaktion verwendet, die von den Primern PM09 und PM10 gelenkt wurde. In einer getrennten PCR-Reaktion, die dem Fachmann gut bekannte Standardbedingungen folgte und unter Verwendung von KGF-2Δ33 als Matrize wurden die Oligonucleotide PM05 (das mit der PstI-Schnittstelle innerhalb des codierenden Bereiches von KGF-2 überlappt) und PM11 verwendet, um den KGF-2-Bereich zu amplifizieren, der den Aminosäuren 84–172 entspricht. In einer dritten PCR-Reaktion wurden das Produkt der ersten PCR-Reaktion (entspricht den Codon optimierten Aminosäuren 172–208) und dem Produkt der zweiten PCR-Reaktion (entspricht den nicht optimierten Aminosäuren 84–172) vereinigt und als Matrize für eine Standard PCR-Reaktion verwendet, die von den Primern PM05 und PM10 gelenkt wurde. Das sich ergebende Amplikon wurde mit PstI/HindIII gespalten und in den mit PstI/HindIII gespaltenen pQE6KGF2Δ33 subcloniert, wobei der entsprechende nicht optimierte Bereich effektiv ersetzt wurde und pQE6KGF2Δ33(s172–208) erzeugt wurde.
Um die Codon-Optimierung von KGF-2 zu vervollständigen, wurde ein synthetisches Gencodon unter Verwendung von sich überlappenden Oligonucleotiden erzeugt, das für den KGF-2-Bereich optimiert wurde, der den Aminosäuren 84–172 entspricht. Zuerst wurden vier Oligonucleotide (PM31, PM32, PM33 und PM34) vereinigt, und sieben Zyklen der folgenden PCR wurden durchgeführt: 94°C, 30 sec, 46,5°C, 30 sec und 72°C, 30 sec.
Eine zweite PCR-Reaktion, die von den Primern PM35 und PM36 gelenkt wurde, wurde dann unter Befolgung von Standardverfahren durchgeführt, wobei 1 μl der ersten PCR-Reaktion als Matrize verwendet wurden. Das sich ergebende optimierte Genfragment wurde dann mit PstI/SalI gespalten und in den mit PstI/SalI gespaltenen pQE6KGF2Δ33s (s172–208) subcloniert, um ein vollständig optimiertes KGF-2-codierendes Gen, pQE6KGF2Δ33s, zu erzeugen.
Um einen alternativen E. coli-Proteinexpressionsvektor zu erzeugen, wurde KGF2Δ33s mittels PCR unter Verwendung der Primer PM102 und PM130 auf pQE6KGF2Δ33s amplifiziert. Das sich ergebende Amplikon wurde mit NdeI und EcoRV gespalten und in den mit NdeI und Asp718 gespaltenen (mit stumpfen Enden versehenen) pHE1-Expressionsvektor subcloniert, um pHE1Δ33s zu erzeugen.
Die bei der Konstruktion des Codon-pptimierten KGF2Δ33s verwendeten Oligonucleotidsequenzen:
Aminosäuresequenz von KGF2Δ33(s172–208):
C. Konstruktion der N-terminalen Deletionsmutante KGF-2Δ4
Um den Expressionsgrad von KGF-2 in E. coli zu erhöhen und die Löslichkeits- und Stabilitätseigenschaften von E. coli-exprimiertem KGF-2 zu erhöhen, wurde eine Deletionsvariante KGF-2Δ4 (Äminosäuren 39–208) erzeugt, bei der die ersten 38 Aminosäuren, einschließlich des Cysteins an Position 37, des vorprozessierten KGF-2 entfernt wurden. Da das sich ergebende KGF-2-Deletionsmolekül eine gerade Anzahl von Cysteinen enthält, sollten Probleme aufgrund von Aggregation verringert werden, die durch intramolekulare Disulfidbrückenbildung verursacht werden, was zu einem erhöhten Expressionsgrad des aktiven Proteins führt.
Um eine Polymerasekettenreaktions gelenkte Amplifikation und Subclonierung von KGF-2Δ4 in den E. coli-Proteinexpressionsvektor, pQE6, zuzulassen, wurden zwei Oligonucleotidprimer (PM61 und 19138) mit der folgenden Basensequenz synthetisiert.
Im Falle des N-terminalen Primers (PM61) wurde eine NcoI-Restriktionsschnittstelle eingebaut, während im Falle des C-terminalen Primers (19138) eine HindIII-Restriktionsschnittstelle eingebaut wurde. PM61 enthält auch eine ATG-Sequenz neben und im Leserahmen mit dem KGF-2-codierenden Bereich, um die Translation des clonierten Fragments in E. coli zuzulassen, während 19138 ein Stoppcodon (vorzugsweise in E. coli verwendet) neben und im Leserahmen mit dem KGF-2 codierenden Bereich enthält, der die richtige Translationstermination in E. coli sicherstellt.
Die Polymerasekettenreaktion erfolgte, indem dem Fachmann gut bekannte Standardbedingungen und die Nucleotidsequenz für das reife KGF-2 (aa 36-208) (konstruiert in Beispiel 12C) als Matrize verwendet wurden. Das sich ergebende Amplikon wurde einer Restriktionsspaltung mit NcoI und HindIII unterzogen und in den mit NcoI/HindIII gespaltenen Proteinexpressionsvektor pQE6 subcloniert.
Nacleotidsequenz von KGF2Δ4:
Aminosäuresequenz von KGF2Δ4:
Beispiel 17
KGF-2Δ33-stimulierte Wundheilung bei normalen Ratten
Um zu zeigen, dass KGF-2Δ33 den Wundheilungsprozess beschleunigen würde, wurde die Wundheilung von Schnittwunden unter Verwendung des folgenden Modells untersucht. Spague-Dawley-Ratten (n = 5) wurde mit einer Keyes-Hautstanze eine 6 mm-Schnittwunde am Rücken beigebracht. Die Wunden werden offen gelassen und 4 Tage, beginnend am Tag der Verletzung, topisch mit verschiedenen KGF-2Δ33-Konzentrationen (in 40 mM NaOAc und 150 mM NaCl, pH 6,5 Puffer) und Puffer (40 mM NaOAc and 150 mM NaCl, pH 6,5) behandelt. Die Wunden werden täglich unter Verwendung eines kalibrierten Jameson-Tastzirkels gemessen. Die Wundgröße wird in Quadratmillimetern ausgedrückt. Am letzten Tag wurden die Wunden gemessen und für die weitere Analyse geerntet. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines urgepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE). Die Bewertungsparameter schließen den prozentualen Wundverschluss, die histologischen Punktebewertung (1–3 minimale Zellakkumulation, keine Granulation; 4–6 unreife Granulation, inflammatorischen Zellen, Kapillare; 7–9 Granulationsgewebe, Zellen, Fibroblasten, neues Epithel; 10–12 reife Dermis mit Fibroblasten, Collagen, Epithel), Reepithelialisierung und Immunhistochemie ein.
Am dritten Tag nach der Verletzung zeigte die Behandlung mit KGF-2Δ33 eine Abnahme der Wundgröße (30,4 mm² bei 4 μg, p = 0,006, 33,6 mm² bei 1 μg, p = 0,0007) im Vergleich zur Pufferkontrolle von 38,9 mm². An Tag 4 nach der Verletzung zeigte die Behandlung mit KGF-2Δ33 eine Abnahme der Wundgröße (27,2 mm² bei 0,1 μg p = 0,02, 27,9 mm² bei 0,4 μg p = 0,04) im Vergleich zur Pufferkontrolle von 33,8 mm². An Tag 5 nach der Verletzung zeigte die Behandlung mit KGF-2Δ33 eine Abnahme der Wundgröße (18,1 mm² bei 0,4 μg p = 0,02) im Vergleich zur Pufferkontrolle von 25,1 mm². Vgl. 36.
Nach der Ernte der Wunden an Tag 5 wurden zusätzliche Parameter ausgewertet. KGF-2Δ33 zeigte eine Zunahme beim prozentualen Wundverschluss bei 0,4 μg (71,2%, p = 0,02) im Vergleich zur Pufferkontrolle 60,2%. Die Verabreichung von KGF-2Δ33 führt auch zu einer Verbesserung der histologischen Punktbewertung bei 1 μg und 4 μg (8,4 bei 1 μg p = 0,005, 8,5 bei 4 μg p = 0,04) relativ zur Pufferkontrolle von 6,4. Die Reepithelialisierung wurde auch bei 1 und 4 μg KGF-2Δ33 (1389 um bei 1 μg p = 0,007, 1220 um bei 4 μg p = 0,02) relativ zur Pufferkontrolle von 923 um verbessert. Vgl. 37.
Diese Studie zeigt, dass die tägliche Behandlung mit KGF-2Δ33 die Wundheilungsrate bei normalen Tieren beschleunigt, wie durch die Abnahme der Nettowundfläche gezeigt. Zusätzlich zeigt die histologische Bewertung der Wundenproben und die Beurteilung der Reepithelialisierung, dass KGF-2Δ33 die Heilungsrate in diesem normalen Rattenmodell verbessert.
Beispiel 18
Auswirkungen von KGF-2Δ33 auf die Zugfestigkeit und Epidermisdicke bei normalen Ratten
Um zu zeigen, dass KGF-2Δ33 die Zugfestigkeit und die Epidermisdicke von Wunden erhöht, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Auf dem Rücken von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (n = 8 oder 9) wird eine 2,5 cm-Mittellinien-Vollhautschnittwunde erzeugt. Der Hautschnitt wird unter Verwendung von 3 Metallklammern im gleichem Abstand geschlossen. Der Puffer (40 mM NaOAc und 150 mM NaCl, pH 6,5) oder KGF-2Δ33 (in 40 mM NaOAc und 150 mM NaCl, pH 6,5 Puffer) wurden zum Zeitpunkt der Verletzung topisch auf die Wunde aufgetragen. Vier Wundstreifen mit einer Breite von 0,5 cm werden am Tag 5 herausgeschnitten. Die Proben werden für die Studie der Bruchfestigkeit unter Verwendung eines Instron^TM-Hauttensiometers, die Hydroxyprolinbestimmung und histopathologische Beurteilung verwendet. Die Bruchfestigkeit wurde als die größte Kraft definiert, die von jeder Wunde vor dem Reißen ausgehalten wurde. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
Bei einem Schnittwundenmodell der Rattenhaut zeigte das topisch aufgetragene KGF-2Δ33 einen statistisch signifikanten Anstieg bei der Bruchfestigkeit, Zugfestigkeit und der Eperdermisdicke als Folge einer einzelnen intraincisionalen Anwendung nach der Verletzung. In einer Studie war die Bruchfestigkeit von KGF-2-behandelten Wunden bei 1, 4 und 10 μg im Vergleich zu den Pufferkontrollen (107,3 g bei 1 μg p = 0,0006, 126,4 g bei 4 μg p < 0,0001, 123,8 g bei 10 μg p < 0,0001) signifikant höher. Vgl. 38.
Die Epidermisdicke wurde unter dem Lichtmikroskop auf Masson-Trichom-Abschnitten bestimmt. KGF-2Δ33 behandelte Wunden zeigten im Gegensatz zur Pufferkontrolle von 54,8 u eine erhöhte Epidermisverdickung (60,5 μ bei 1 μg, 66,51 μ bei 4 μg p = 0,01, 59,6 μ bei 10 μg). Vgl. 39.
Diese Studie zeigt, dass eine einzelne intraincisionale Anwendung von KGF-2 den Wundheilungsprozess verbessert und beschleunigt, was durch einen Anstieg bei der Bruchfestigkeit und der Epidermisdicke von incisionalen Wunden charakterisiert ist.
Beispiel 19
Auswirkungen von KGF-2Δ33 auf normale Rattenhaut
Um die Auswirkung von KGF-2Δ33 auf normale Rattenhaut nach einer intradermalen Injektion zu bestimmen, wurde folgendes Experiment durchgeführt.
Männliche erwachsene SD-Ratten (n = 3) erhielten sechs intradermale Injektionen entweder mit Placebo oder KGF-2Δ33 (in 40 mM NaOAc und 150 mM NaCl, pH 6,5 Puffer) in einer Konzentration von 1 und 4 μg in 50 μl an Tag 0. Den Tieren wurde 5–2'-Bromdesoxyuridin (BrdU)(100 mg/kg i. p.) zwei Stunden vor der Tötung nach 24 und 48 Stunden injiziert. Die Epidermisdicke wurde von der granulären Schicht bis zum Boden der Basalschicht gemessen. Entlang der Injektionsstelle wurden etwa 20 Messungen durchgeführt und die mittlere Dicke quantifiziert. Die Messungen wurden unter Verwendung eines kalibrierten Mikrometers auf Masson-Trichom-gefärbten Abschnitten unter dem Lichtmikroskop bestimmt. Die BrdU-Punktebewertung erfolgte unter dem Lichtmikroskop durch zwei blinde Beobachter unter Verwendung des folgenden Punktebewertungssystems: 0–3 keine bis minimal markierte Zellen; 4–6 leichte Markierung; 7–10 stark markierte Zellen. Die Tiere wurden 24 und 48 Stunden nach der Injektion getötet. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests (Mittelwert +/– SE).
Mit KGF-2Δ33 behandelte Haut zeigte nach 24 Stunden eine erhöhte epidermale Verdickung (32,2 μ bei 1 μg p < 0,001, 35,4 μ bei 4 μg p < 0,0001) im Gegensatz zur Pufferkontrolle von 27,1 μ. Nach 48 Stunden zeigte mit KGF-2Δ33 behandelte Haut eine erhöhte epidermale Verdickung (34,0 μ bei 1 μg p = 0,0003, 42,4 μ bei 4 μg p < 0,0001) im Gegensatz zur Pufferkontrolle von 27,8 μ. Vgl. 40. Mit KGF-2Δ33 behandelte Haut zeigte auch eine erhöhte BrdU-Immunfärbung nach 48 Stunden (4,73 bei 1 μg p = 0,07, 6,85 bei 4 μg p < 0,0001) im Gegensatz zur Pufferkontrolle von 3,33. Vgl. 41.
Diese Studien zeigen, dass eine intradermale Injektion von KGF-2 die epidermale Verdickung erhöht und beschleunigt. Somit gäbe es bei KGF-2 Anwendungen zur Vermeidung oder Linderung von Falten, Verbesserung der Hautalterung und Verringerung der Narbenbildung oder Verbesserung der Heilung von kosmetischen Operationen. Zusätzlich kann KGF-2 prophylaktisch verwendet werden, um orale Mucosistis (Mundgeschwüre), Darmentzündungen als Reaktion auf Chemotherapie oder andere Agentien zu verhindern oder zu reduzieren.
Beispiel 20
Anti-inflammatorischer Effekt von KGF-2 beim PAF-induzierten Pfotenödem
Um den anti-inflammatorischen Effekt von KGF-2 zu zeigen, wurde das folgende Experiment unter Verwendung des PAF-induzieren Pfotenödem-Modells durchgeführt.
Gruppen mit vier Lewis-Ratten (190–210 g) wurde subkutan in die Sohle der rechten hinteren Pfote 120 μl Lösung, die 2,5 nM PAF enthielt, zusammen mit folgenden Reagenzien injiziert: 125 μg Ckb-10(B5), 24 μg LPS, 73 μg KGF-2 (Thr (36) – Ser (208) von 1 (SEQ ID NR: 2) mit einem N-terminalen Met) oder kein Protein. Der linken hinteren Pfote wurde dieselbe Menge Puffer verabreicht, um sie als Parallelkontrolle zu verwenden. Das Pfotenvolumen wurde unmittelbar vor oder 30 und 90 Minuten nach der PAF-Injektion unter Verwendung eines Plethysmographie-Systems quantifiziert. Die prozentuale (%) Änderung des Pfotenvolumens wurde berechnet.
Testreagenzien im Experiment Nr. 1 und Nr. 2
Wie in 42 gezeigt, führten, wie erwartet, die nur mit PAF injizierten rechten hinteren Pfoten zu einem signifikanten Anstieg beim Pfotenvolumen (75 oder 100% für Experiment Nr. 1 bzw. Nr. 2) 0,5 Stunden nach der Injektion; während die linken hinteren Pfoten, die Puffer erhielten, oder die rechten hinteren Pfoten, die nur LPS oder SEB erhielten, wenig Anzeichen eines Ödems zeigten (Daten nicht gezeigt). Jedoch gab es, wenn KGF-2 zusammen mit PAF lokal verabreicht wurde, eine wesentliche Verringerung (25 bzw. 50% für Experiment Nr. 1 bzw. Nr. 2) beim Pfotenvolumen im Vergleich zu Pfoten, die nur mit PAF provoziert wurden. Die Verringerung der Pfotenödeme wurde nicht bei Tieren beobachtet, die PAF zusammen mit Ckb-10 (ein anderes Protein), LPS oder SEB (zwei inflammatorische Mediatoren) erhielten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der anti-inflammatorische Effekt von KGF-2 spezifisch ist und nicht aufgrund einer unspezifischen Art des Proteins erfolgt.
Auswirkungen von KGF-2Δ33 auf das PAF-induzierte Pfotenödem bei Ratten
Indem die vorstehend beschriebenen Experimente mit KGF-2Δ33 befolgt wurden, um die biologischen Aktivitäten zur Stimulation der Keratinocytenproliferation in vitro und dessen in-vivo-Effekt auf die Wundheilung zu bestätigen, wurde KGF-2Δ33 ferner beim PAF-induzierten Pfotenödem bei Ratten beurteilt. Gruppen mit vier Lewis-Ratten (190–210 mg) wurde subkutan in die Sohle der rechten hinteren Pfote 120 μl Lösung, die 2,5 nM PAF enthielt, zusammen mit 210 μg KGF-2Δ33 oder Albumin injiziert. Den linken hinteren Pfoten wurde dieselbe Menge Puffer, Albumin oder KGF-2Δ33 verabreicht, um sie als Paralellkontrolle zu verwenden. Das Pfotenvolumen wurde in verschiedenen Intervallen nach der PAF-Injektion unter Verwendung eines Plethysmographie-Systems quantifiziert. Die prozentuale (%) Änderung des Pfotenvolumens wurde berechnet.
Wie in 43 dargestellt, zeigten, wie erwartet, die nur mit PAF und Albumin injizierten rechten hinteren Pfoten einen signifikanten Anstieg (75%) beim Pfotenvolumen 0,5 Stunden nach der Injektion; während die linken hinteren Pfoten, die Puffer, Albumin oder nur KGF-2Δ33 erhielten, wenig Anzeichen eines Ödems zeigten. Jedoch gab es, wenn KGF-2Δ33 zusammen mit PAF lokal verabreicht wurde, eine wesentliche Verringerung (durchschnittlich 20%) beim Pfotenvolumen im Vergleich mit Pfoten, die während des gesamten Experiments, das innnerhalb von 4 Stunden beendet wurde, nur mit PAF provoziert wurden. Diese Ergebnisse bestätigen die anti-inflammatorische Eigenschaft von KGF-2Δ33.
Testreagenzien
Somit ist KGF-2Δ33 zur Behandlung von akuten oder chronischen Erkrankungen nützlich, bei denen die Entzündung eine Schlüsselpathogenese der Krankheiten einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Psoriasis, Ekzeme, Dermatitis und/oder Arthritis ist.
Beispiel 21
Auswirkungen von KGF-2Δ33 auf das End-zu-End-Darm-Anastomos- Rattenmodell
Dieses Beispiel zeigt, dass KGF-2Δ33 die Rate der Darmreparatur in einem Darm- oder Colon-Anastomose-Modell bei Wistar oder Sprague-Dawley-Ratten erhöht.
Die Verwendung der Ratte bei experimenteller Anastomose ist ein gut charakterisiertes, relevantes und reproduzierbares Modell der Wundheilung nach einem chirurgischen Eingriff. Dieses Modell kann auch erweitert werden, um die Auswirkungen der chronischen Steroidbehandlung oder die Effekte verschiedener chemotherapeutischer Therapieschemata auf die Qualität und Rate der Wundheilung nach einem chirurgischen Eingriff im Colon oder Dünndarm auszuweiten (Mastboom W. J. B. et al. Br. J. Surg. 78: 54–56 (1991), Salm R. et al. J Surg. Oncol. 47: 5–11, (1991), Weiber S. et al. Eur. Surg. Res. 26: 173–178 (1994)). Die Heilung von Anastomose ähnelt der Wundheilung irgendwo sonst im Körper. Die frühen Phasen der Heilung werden durch akute Entzündung, gefolgt von Fibroblastenproliferation und Collagensynthese charakterisiert. Collagen wird allmählich modelliert und die Wunde wird gefestigt, sobald das neue Collagen synthetisiert wird. (Koruda M. J. und Rolandelli, R. H. J. Surg. Res. 48: 504–515 (1990). Die meisten postoperativen Komplikationen wie Anastomoseinsuffizienz treten während der ersten paar Tage nach dem chirurgischen Eingriff auf – eine Zeitspanne, während der die Stärke des Colons hauptsächlich durch die Fähigkeit des Wundrandes, Suturen zu halten, gesichert wird. Es wurde berichtet, dass die Kapazität des GI-Trakts, Nähte zu halten, um 80% während der ersten postoperativen Tage abnimmt. (Hogstrom H und Haglund U. Acta Chir Scand 151: 533–535 (1985), Jonsson K, et al. Am J. Surg. 145: 800–803 (1983)).
Männliche erwachsene SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Kombination von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) intramuskulär narkotisiert. Die Bauchhöhle wurde mit einem 4 cm langen Mittellinienschnitt geöffnet. Ein 1 cm breites Segment des linken Colons wurde 3 cm proximal zur peritonealen Reflektion reseziert, wobei die Randgefäße erhalten wurden. Eine Einzelschicht End-zu-End Anastomose wurde mit 8–10 unterbrochenen 5–0 invertierten Vicryl-Suturen durchgeführt, um die intestinale Kontinuität wiederherzustellen. Die Anastomose wurde dann topisch über eine Spritze entweder mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei Konzentrationen von 1 und 4 μg behandelt. Die Schnittwunde wurde mit 0–3 durchgehender Seidensutur für die Muskelschicht und mit Operationsklammern für die Haut geschlossen. Die Behandlungen erfolgten dann danach täglich und bestanden aus Puffer oder KGF-2Δ33 und 1 und 5 mg/kg sc. Am Tag des chirurgischen Eingriffs und täglich danach wurde gewogen. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Behandlung (Tag 5) getötet. Die Tiere wurden narkotisiert und erhielten Bariumklistiere und wurden in einem konstanten Abstand geröngt. Die radiologische Analyse nach der intracolonalen Verabreichung durch 2 blinde Beobachter zeigte, dass die KGF-2Δ33-behandelte Gruppen 1) einen verringerten Austritt von Barium an der Stelle des chirurgischen Eingriffs aufwiesen, 2) ein geringerer Einschnürungsgrad an der Stelle des chirurgischen Eingriffs und 3) eine Erhöhung fäkaler Pellets distal zur chirurgischen Eingriffsstelle aufwiesen.
Colon-Anastomose Radiologische Analyse
Beispiel 22
Konstruktion der carboxyterminalen Mutationen in KGF-2
Der Carboxyterminus von KGF-2 ist hoch geladen. Die Dichte dieser geladenen Reste kann die Stabilität und folglich die Löslichkeit des Proteins beeinflussen. Um Muteine zu produzieren, die das Protein in Lösung stabilisieren könnten, wurden eine Reihe von Mutationen in diesem Genbereich durchgeführt.
Um die Punktmutationen 194 R/E, 194 R/Q, 191 K/E, 191 K/Q, 188 R/E, 188 R/Q zu erzeugen, wurde der 5952-KGFΔ33-5'-AflIII-5'-Primer mit den angegeben 3'-Primern, die die geeigneten Punktmutationen für KGF-2 enthalten, in PCR-Reaktionen unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannter Standardbedingungen mit KGF2Δ33 als Matrize verwendet. Die sich ergebenden Produkte wurden mit AflIII und HindIII gespalten und in den mit NcoI und HindIII gespaltenen E. coli-Expressionsvektor, pQE60, cloniert.
KGF2Δ33,194 R/E-Konstruktions
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2Δ33,194 R/E Nucleotidsequenz:
KGF2Δ33,194 R/E Aminosäuresequenz:
KGF2Δ33,194 R/Q Konstruktion:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2 Δ33,194 R/Q Nucleotidsequenz:
KGF2 Δ33,194 R/Q Aminosäuresequenz:
KGF2Δ33,191 K/E Konstruktion:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2Δ33,19l K/E Nucleotidsequenz:
KGF2Δ33,191 K/E Aminosäuresequenz:
KGF2 Δ33,191 K/Q Konstruktion:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2 Δ33,191 K/Q Nueleatidsequenz:
KGF2 Δ33,191 K/Q Aminasäuresequenz:
KGF2Δ33, 188R/E Konstruktion:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGPF2Δ33, 188R/E Nucleotidsequenz:
KGF233, 188R/E Aminosäuresequenz:
KTF2Δ33, 188 R/Q Konstruktion:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2Δ33, 188 R/Q Nucleotidsequenz:
KGF2Δ33, 188 R/Q Aminosäuresequenz:
KGF2Δ33, 183K/E- Konstruktion
Für die Mutation 183K/E wurden zwei PCR-Reaktionen für die zielgerichtete Oligonucleotidmutagenese für dieses Lysin angesetzt. In einer Reaktion wurde 5952-KGFΔ33-5'-AflIII als 5'-Primer verwendet und KGF-2-183aa-K-bis-E-Antisense wurde als 3'-Primer in der Reaktion verwendet. In einer zweiten Reaktion wurde KGF-2-183aa-K-bis-E-Antisense als 5 '-Primer verwendet und KGF2-3'HindII-TAA-Stop wurde als 3 '-Primer verwendet. KGF2Δ33 wurde als Matrize für diese Reaktionen verwendet. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Standardbedingungen amplifiziert. Ein Mikroliter jeder dieser PCR-Reaktionen wurde als Matrize in einer nachfolgenden Reaktion unter Verwendung von 5453-BsphI als 5'-Primer und 5258-HindIII als 3'-Primer verwendet. Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung dem Fachmann gut bekannter Standardbedingungen. Das sich ergebende Produkt wurde mit AflIII und HindIII gespalten und in den mit NcoI und HindIII gespaltenen E. coli-Expressionsvektor, pQE60, cloniert.
Die folgenden Primer wurden verwendet:
KGF2 Δ33, 183K/E Nucleotidsequenz
KGF2 Δ33, 183K/E Aminosäuresequenz
Beispiel 23
Wirkung von KGF-2 auf das Überleben nach einer Gesamtkörperbestrahlung bei Balb/c-Mäusen
Ionisierende Strahlung wird häufig verwendet, um viele Malignitäten, einschließlich Lungen- und Brustkrebs, Lymphome und Beckentumoren zu behandeln (Ward, W. F. et al., CRC Handbook of Animal Models of Pulmonary Disease, CRC Press, S. 165–195 (1989)). Jedoch begrenzt die strahleninduzierte Verletzung (Lunge, Darm etc.) die Intesität und den Erfolg der Strahlentherapie (Morgan, G. W. et al., Int. J. Radfiat. Oncol. Biol. Phys. 31: 361 (1995)). Die Magenschleimhaut besitzt einen schnellen Zellzyklus und ist besonders senstiv gegenüber cytotoxischen Agentien (Potten, C. S., et al., In: Cytotoxic Insult to Tissue, Churchill Livingstone, S. 105–152 (1983)). Einige Manifestationen der Strahlenschäden des Darms schließen akute Proktitis, Darmfibrose, Striktur oder Fistelbildung ein (Anseline, D. F. et al., Ann. Surg. 194: 716–724 (1981)). Eine Behandlung, die die normalen Strukturen vor der Strahlung schützt, ohne die Sensitivität des Tumors gegenüber Strahlung zu ändern, wäre beim Management dieser Erkrankungen nützlich. Ungeachtet der bestrahlten Fläche ist die Strahlendosis durch die Strahlensensitivität des normalen Gewebes begrenzt. Komplikationen nach einer Ganzkörper- oder Teilkörperbestrahlung schließen Pneumonitis, Fibrose, gastrointestinale Verletzungen und Knochenmarkserkrankungen ein.
Mehrere Cytikine einschließlich IL-1, TNF, IL-6, IL-12 haben eine Schutzwirkung gegenüber Strahlen nach einer GKB gezeigt (Neta, R. et al., J. Exp. Med. 173: 1177 (1991)). Man hat gezeigt, dass IL-11 die Zellen der Dünndarmschleimhaut nach kombinierter Strahlungs- und Chemotherapie (Du, X. X. et al., Blood 83: 33 (1994)) und strahleninduzierter Verletzung des Thorax schützt (Redlich, C. A. et al., The Journal of lmmunology 157: 1705–1710 (1996)).
Tiere
Alle Experimente wurden unter Verwendung von BALB/c-Mäusen durchgeführt. Die Tiere wurden im Alter von 6 Wochen gekauft und waren zu Beginn der Studie 7 Wochen alt. Alle Manipulationen erfolgten unter Verwendung aseptischer Verfahren. Diese Studie wurde nach den von Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee aufgeführten Richtlinien durchgeführt, das die Experimentiervorschrift überprüfte und genehmigte.
KGF-2
Das Protein besteht aus einem menschlichen Protein mit 141 Aminosäuren, das als KGF-2Δ33 bezeichnet wird. Dieses Protein ist eine verkürzte Isoform von KGF-2, der die ersten 33 aminoterminalen Reste des reifen Proteins fehlen. Das Gen, das dieses Protein codiert, wurde in einen E. coli-Expressionsvektor cloniert. Für das Experiment wurden Fraktionen verwendet, die mehr als 95% reines rekombinantes Material enthielten. KGF-2 wurde in einem Vehikel formuliert, das 40 mM Na Acetat + 150 mM NaCl, pH 6,5 enthielt. Verdünnungen wurden aus einer Stammlösung unter Verwendung desselben Vehikels hergestellt.
Ganzkörperbestrahlung und Versuchskonzept
Mäuse wurden mit 519 RADS (5,19 Gy) unter Verwendung eines 68-Mark-I-Shepherd-Cäsium-Bestrahlungsgeräts bestrahlt. KGF-2Δ33 wurde täglich subkutan, beginnend 2 Tage vor der Bestrahlung und weiterhin 7 Tage nach der Bestrahlung verabreicht. Alle Mäuse wurden täglich gewogen. Die Mäusegruppen wurden randomisiert, damit sie eine von drei Behandlungen erhalten: Die Ganzkörperbestrahlung (GKB) plus Puffer, GKB plus KGF-2Δ33 (1 mg/kg sq), GKB plus KGF-2Δ33 (5 mg/kg sq). Es wurden zwei unabhängige Experimente durchgeführt.
Ergebnisse
Zwei Studien wurden unter Verwendung bestrahlter Tiere durchgeführt. In der ersten Studie wurden die Tiere mit 519 RADS (5,19 Gy) bestrahlt. Die Tiere wurden zwei Tage vor der Bestrahlung und danach täglich 7 Tage mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei 1 & 5 mg/kg, s. q. behandelt. An Tag 25 nach der Gesamtkörperbestrahlung überlebten 1/5 der Tiere in der Puffergruppe. Dagegen bestanden die KGF-2-behandelten Gruppen aus 5/5 Tiere a 1 mg/kg und 4/5 à 5 mg/kg (44).
Zusätzlich zeigten KGF-2 behandelte Tiere eine 0,9%-ige und 5,3%-ige Gewichtszunahme an Tag 20 nach der GKB. Dagegen wies die Puffer-behandelte Gruppe einen 4,2%-igen Gewichtsverlust an Tag 20 auf. Die normalen, unbestrahlten Kontrolltiere im passenden Alter zeigten eine 6,7%-ige Gewichtszunahme im selben Zeitraum (45).
Die Tiere in der zweiten Studie wurden ebenfalls mit 519 RADS (5,19 Gy) bestrahlt. Diese Tiere wurden zwei Tage vor der Bestrahlung und danach täglich 7 Tage mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei 1 & 5 mg/kg, s. q. behandelt. An Tag 15 nach der Gesamtkörperbestrahlung waren alle Tiere in der Puffergruppe tot. Mit KGF-2 bei 1 mg/kg ergab sich eine 30%-ige Überlebensrate und bei 5 mg/kg eine 60%-ige Überlebensrate. An Tag 25 nach der GKB zeigte die 1 mg/kg-Gruppe eine 20%-ige Überlebensrate und die 5 mg/kg eine 50%-ige Überlebensrate (46).
Schlussfolgerungen
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass KGF-2 eine schützende Wirkung nach einer GKB besitzt. Die Fähigkeit von KGF-2 die Überlebensrate von Tieren zu erhöhen, die einer GKB unterzogen wurden, legt nahe, dass es bei strahlungsinduzierten Verletzungen auch nützlich wäre und dass bei der Behandlung von Malignitäten das therapeutische Verhältnis der Bestrahlung erhöht wird.
Beispiel 24
Bewertung von KGF-2 im TPA-Modell der Hautentzündung bei Mäusen
Um zu zeigen, dass KGF-2 die Progression von Kontaktdermatitis abschwächen würde, wird ein Tetradecanoylphorbolacetat (TPA-) induziertes kutanes Entzündungsmodell verwendet. Die Verwendung von weiblichen BALB/c- und männlichen Swiss-Webster-Mäusen bei der experimentellen Hautentzündung sind gut charakterisierte, relevante und reproduzierbare Modelle der Kontaktdermatitis. Man hat gezeigt, dass diese Mäusestämme eine inflammatorische Langzeitreaktion nach der topischen Anwendung von TPA entwickeln, die lokale Hämodynamik, Gefäßpermeabilität und lokale Leukocytenwanderung umfasst, und diese pathologi schen Veränderungen ähneln denjenigen der menschlichen Dermatitis (Rao et al., 1993 Inflammation 17(6): 723; Rao et al. 1994, J. Kipid Mediators Cell Signalling 10: 213).
Die Mäusegruppen erhalten intraperitoneal, subkutan oder intravenös entweder Vehikel oder KGF-2 60 min nach der topischen Anwendung von TPA (4 μg/Ohr), wobei 10 μl jeweils an der inneren und äußeren Oberfläche des Ohres als Lösung in Aceton (200 μg/ml) angewandt wird. Die Kontrollgruppe erhält 20 μl Aceton als topische Anwendung. Vier Stunden nach der TPA-Anwendung wurde die Zunahme der Ohrendicke gemessen und die Ohren werden für die Histologie abgeschnitten. Um die Gefäßpermeabilität als Reaktion auf TPA zu bestimmen, wird den Mäusen intravenös über die Schwanzvene Evans-Blau (300 mg/kg) zu ausgewählten Zeitpunkten nach der topischen Anwendung von TPA injiziert, und die Mäuse werden 15 min danach getötet. Die Ohren werden abgeschnitten und entfernt und dann in Dimethylformamid extrahiert und zentrifugiert. Die Absorptionswerte werden spektrometrisch bei 590 nm gemessen.
Beispiel 25
Auswirkung von KGF-2Δ33 auf die Wundheilung
Die biologischen Wirkungen von KGF-2Δ33 in der Haut wurden basierend auf den anfänglichen in vitro-Daten untersucht, die die Kapazität von KGF-2 zeigen, die primären menschlichen Keratinocyten sowie Maus-pro-B-BaF3-Zellen zu stimulieren, die mit dem FGFR-Isoform 2iiib transfiziert wurden. Es wurden erste Experimente durchgeführt, um die biologischen Wirkungen von KGF-2Δ33 nach der intradermalen Verabreichung zu zeigen. Nach den intradermalen Studien wurde KGF-2Δ33 in einer Reihe von Wundheilungsmodellen (einschließlich Vollhautwunden mittels einer Biopsiestanze und Schnittwunden) untersucht, um dessen Potential als Wundheilungsmittel zu bestimmen.
Wirkung von KGF-2Δ33 in einem Glucocoricoid-gehemmten Rattenmodell der Wundheilung
Gehemmte Wundheilung ist ein wichtiges klinisches Problem, das mit einer Reihe von pathologischen Zuständen wie Diabetes assoziiert ist und eine Komplikation der systemischen Verabreichung von Steroiden oder Antimetaboliten ist. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit systemischen Glucocorticoiden die Wundheilung bei Menschen und in Tiermodellen der Gewebereparatur beeinträchtigt. Nach der Glucocorticoidverabreichung wurde eine Abnahme der zirkulierenden Monocytenspiegel und eine Hemmung der Procollagensynthese beobachtet. Die Entzündungsphase der Heilung und die Matrixsynthese sind deshalb wichtige Faktoren, die am komplexen Prozess der Gewebereparatur beteiligt sind. In der vorliegenden Studie wurden die Wirkungen mehrfacher topischer Anwendungen von KGF-2 bei Vollhautschnittwunden bei Ratten beurteilt, bei denen die Heilung durch die systemische Verabreichung von Methyprednisolon beeinträchtigt wurde.
Sprague-Dawley-Ratten (n = 5/Behandlungsgruppe) wurden 8 mm große Wunden am Rücken beigebracht und sie erhielten Methylprednisolon (17 mg/kg, i. m.), um die Heilung zu hemmen. Die Wunden wurden täglich topisch mit Puffer oder KGF-2 bei einer Dosierung von 0,1, 0,5 und 1,5 μg in einem Volumen von 50 μl behandelt. Die Wunden wurden an den Tagen 2, 4, 6 und 8 unter Verwendung eines kalibrierten Jameson-Tastzirkels ausgemessen. An Tag 6 (Daten nicht gezeigt) und Tag 8 (47) zeigten die KGF-2-behandelten Gruppen eine statistisch signifikante Verringerung des Wundverschlusses im Vergleich zur Pufferkontrolle.
Wirkung von KGF-2Δ33 auf die Wundheilung in einem diabetischen Mausmodell
Genetisch homozygoten diabetischen weiblichen (db+/db+)-Mäusen, 6 Wochen alt (n = 6), mit einem Gewicht von 30–35 g wurden am Rücken Vollhautwunden mit einer 6 mm-Biopsiestanze beigebracht. Die Wunden wurden offen gelassen und täglich mit Placebo oder KGF-2 bei 0,1, 0,5 und 1,5 μg behandelt. Der Wundverschluss wurde unter Verwendung eines Jameson-Tastzirkels ermittelt. Die Tiere wurden an Tag 10 getötet, und die Wunden wurden für die Histologie geerntet.
KGF-2 zeigte eine signifikante Verbesserung beim prozentualen Wundverschluss bei 0,1 μg (p = 0,02) im Vergleich Placebo oder der unbehandelten Gruppe. Die Verabreichung von KGF-2 führte auch zu einer Verbesserung der histologischen Punktebewertung bei 0,1 μg (p = 0,03) im Vergleich zu Placebo oder der unbehandelten Gruppe (p = 0,01) und 1,5 μg (p = 0,05) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe.
Schlussfolgerungen
Basierend auf den vorstehend dargestellten Ergebnissen zeigt KGF-2 signifikante Aktivität bei gehemmten Bedingungen wie der Glucocorticoid-Verabreichung und Diabetes. Deshalb kann KGF-2 bei der Stimulation der Wundheilung nach einem chirurgischen Eingriff, chronischen Geschwüren bei Patienten mit Diabetes oder schlechter Durchblutung (z. B. Veneninsuffizienz und Venengeschwüre), Verbrennungen und anderen abnormen Wundheilungszuständen wie Urämie, Mangelernährung, Vitaminmangel und systematische Behandlung mit Steroiden und antineoplastischen Medikamenten klinisch nützlich sein.
Beispiel 26
Wirkungen von KGF-2Δ33 auf die Mundschleimhaut
Cytotoxische Agentien, die klinisch verwendet werden, haben die unglückliche Wirkung, an manchen Orten wie der Mundschleimhaut die Proliferation des normalen Epithels zu hemmen, was zu lebensbedrohlichen Störungen der Schleimhautbarriere führt. Wir haben Studien durchgeführt, um die Wirksamkeit von KGF-2 in diesem klinischen Bereich zu untersuchen. Die Daten unterstützen eine therapeutische Wirkung von KGF-2 in den Mucositis-Modellen.
Wirkungen von KGF-2Δ33 auf die Hamster-Mundschleimhaut
Wir versuchten zu bestimmen, ob KGF-2 die Proliferation des normalen Schleimhautepithels induziert. Die Wirkung von KGF-2 in der Mundschleimhaut wurde bei syrischen Goldhamstern beurteilt. Die Wangentasche des Hamsters wurde täglich mit Puffer oder KGF-2Δ33 (bei 0,1, 1 und 10 μg/Wange) behandelt, der topisch auf die betäubten Hamsterbacken in einem Volumen von 100 μl pro Wange aufgetragen wurde. Die Verbindung hatte mit der Wange mindestens 60 Sekunden Kontakt und wurde daraufhin geschluckt. Nach siebentägiger Behandlung wurde den Tieren BrdU injiziert und sie wurden wie vorstehend beschrieben getötet. Die proliferierenden Zellen wurden unter Verwendung eines anti-BrdU-Antikörpers markiert. 48 zeigt, dass es einen signifikanten Anstieg bei der BrdU-Markierung (Zellproliferation) gab, wenn die Tiere mit 1 μg und 10 μg KGF-2Δ33 (im Vergleich zur Pufferbehandlung) behandelt wurden.
Die topische Behandlung mit KGF-2 induzierte die Proliferation normaler Schleimhautepithelzellen. Basierend auf diesen Ergebnissen kann KGF-2 bei der Vermeidung von Mundschleimhautentzündung klinisch nützlich sein, die durch chemotherapeutische Agentien (oder anderen Therapieschemata im Bezug auf toxische Arzneimittel), Strahlentherapie oder irgendeinem kombinierten chemotherapeutischen Strahlungstherapieschema verursacht wurde. Zusätzlich kann KGF-2 als Therapeutikum nützlich sein, indem es die Schwere der Mundschleimhautschädigung als Folge toxischer Agentien (Chemotherapie) oder Radiotherapie verringert.
Beispiel 27
Die Auswirkung von KGF-2Δ33 auf die ischämische Wundheilung bei Ratten
Das Ziel der Experimente, die in diesem Beispiel präsentiert werden, bestand darin, die Wirksamkeit von KGF-2 bei der Wundheilung unter Verwendnug eines ischämischen Wundheilungsmodells zu ermitteln.
Die Blutzufuhr von lokal begrenzter Haut wurde teilweise durch Herstellung eines zufälligen einzelnen myokutanen Vollhaut-Pediculuslappens (3 × 4 cm) unterbrochen. An der lokalen Hautstelle wurde eine Vollhautwunde erzeugt, die aus dem myokutanen Lappen besteht. 60 erwachsene Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet und zufällig in Behandlungs-KGF-2Δ33- und Placebo-Gruppen für diese Studie (5 Tiere/Gruppe/Zeitpunkt) eingeteilt. Die Wunden wurden jeweils an Tag 1, 3, 5, 7, 10 und nach der Verletzung geerntet.
Die Bruchfestigkeit der Wunde zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen KGF-2 und den Puffer-behandelten Gruppen zu frühen Zeitpunkten bis Tag 10 und 15 nach der Verletzung.
Die Ergebnisse zeigen, dass KGF-2 die Bruchfestigkeit bei ischämischen Wunden 10 Tage nach der Verletzung signifikant verbesserte. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass Ischämie den Heilungsvorgang bei beiden Gruppen im Vergleich zu den zuvor erhaltenen Daten verzögert, die bei den Studien der normalen Wundheilung erhalten wurden.
Dieses myokutane Lappen-Modell stellt Daten und Informationen in einer ischämischen Situation bereit, die auf einen Venenrückfluss zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass KGF-2 bei der Behandlung von chronischen Venenbeingeschwüren verwendet werden könnte, die durch eine Einschränkung des Venenrückflusses und/oder Insuffizienzverursacht wird.
Beispiel 28
Beurteilung von KGF-2 bei der Heilung von Darm Anastomose bei Ratten
Die Ergebnisse des vorliegenden Experiments zeigen, dass KGF-2Δ33 die Rate der Darmreparatur in einem Darm- oder Colon-Anastomose-Modell bei Wistar oder Sprague-Dawley-Ratten erhöht. Zusätzlich kann dieses Modell verwendet werden, um zu zeigen, dass KGF-2 und seine Isoformen die Fähigkeit, der Gastroinstinal- oder Darmwand Nähte zu binden, erhöhen.
Die Verwendung der Ratte bei experimenteller Anastomose ist ein gut charkterisiertes, relevantes und reproduzierbares Modell der Wundheilung nach einem chirurgischen Eingriff. Dieses Modell kann auch erweitert werden, um die Auswirkungen der chronischen Steroidbehandlung oder die Effekte verschiedener chemotherapeutischer Therapieschemata auf die Qualität und Rate der Wundheilung nach einem chirurgischen Eingriff im Colon oder Dünndarm auszuweiten (Mastboom W. J. B. et al. Br. J. Surg. 78: 54–56 (1991), Salm R. et al. J Surg. Oncol. 47: 5–11, (1991), Weiber S. et al. Eur. Surg. Res. 26: 173–178 (1994)). Die Heilung von Anastomose ähnelt der Wundheilung irgendwo sonst im Körper. Die frühen Phasen der Heilung werden durch akute Entzündung, gefolgt von Fibroblastenproliferation und Collagensynthese charakterisiert. Collagen wird allmählich modelliert und die Wunde wird gefestigt, sobald das neue Collagen synthetisiert wird. (Koruda M. J. und Rolandelli, R. H. J. Surg. Res. 48: 504–515 (1990). Die meisten postoperativen Komplikationen wie Anastomoseinsuffizienz treten während der ersten paar Tage nach dem chirurgischen Eingriff auf – eine Zeitspanne, während der die Stärke des Colons hauptsächlich durch die Fähigkeit des Wundrandes, Suturen zu halten, gesichert wird. Es wurde berichtet, dass die Kapazität des GI-Trakts, Nähte zu halten, um 80% während der ersten postoperativen Tage abnimmt.
(Hogstrom H und Haglund U. Acta Chir Scand 151: 533–535 (1985), Jonsson K, et al. Am J. Surg. 145: 800–803 (1983)).
Die Ratten wurden mit einer Kombination von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) intramuskulär narkotisiert. Die Bauchhöhle wurde mit einem 4 cm langen Mittellinienschnitt geöffnet. Ein 1 cm breites Segment des linken Colons wurde 3 cm proximal zur peritonealen Reflektion reseziert, wobei die Randgefäße erhalten wurden. Eine Einzelschicht End-zu-End Anastomose wurde mit 8–10 unterbrochenen 5–0 invertierten Vicryl-Suturen durchgeführt, um die intestinale Kontinuität wiederherzustellen. Die Schnittwunde wurde mit 0–3 durchgehender Seidensutur für die Muskelschicht und mit Operationsklammern für die Haut geschlossen. Jedes Tier erhielt eine tägliche klinische Bewertung, bestehend aus dem individuellen Körpergewicht, Körpertemperatur und Nahrungsmuster.
Die KGF-2Δ33- und Placebobehandlung wurden täglich sk, topisch, ip, im, intragastrisch oder intracoloal unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff durchgeführt und wurden danach bis zum Tag der Tötung, Tag 7, fortgesetzt. Es gab eine unbehandelte Kontrolle, eine Placebogruppe und KGF-2Δ33-Gruppen. Zwei Stunden vor der Tötung wurde den Tieren 100 mg/kg BrdU i. p. injiziert. Die Tiere wurden 24 nach der letzten Behandlung (Tag 5) getötet. Ein Mittellinienschnitt wurde auf der anterioren Bauchwand durchgeführt und ein 1 cm langes Colonsegment, einschließlich der Anstomose wurde entfernt. Es wurde ein drittes Segment an der Stelle des chirurgischen Eingriffs für die Gesamtkollagenanalyse entnommen.
In einer Reihe von zwei Experimenten wurden erwachsene männliche SD-Ratten (n = 6) betäubt und erhielten eine Einzelschicht-End-zu-End Anastomose des distalen Darms mit 8– 10 unterbrochenen invertierten 6–0 Prolen-Suturen. Die anastomostische Stelle wurden dann topisch mit einer Spritze entweder mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei Konzentrationen von 1 und 4 μg behandelt. Die Tiere wurden dann täglich entweder mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei Konzentrationen von 1 mg/kg oder 5 mg/kg ip. behandelt. Die Tiere wurden an Tag 5 getötet und das Colon herausgeschnitten und in flüssigem Stickstoff schockgefroren, liophilisiert und einer Collagenbestimmungen unterzogen. Die Collagenkonzentration wird als μg Collagen/mg Trockengewicht Gewebe ausgedrückt. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests. Mittelwert +/– SEM. An Tag 5 wurden die Ratten narkotisiert und erhielten ein Barium-Klistier, gefolgt von eine radiologische Analyse. Die radiologische Beurteilung des Barium-Klistiers der linken End-zu-End Colon-Anatomose aus zwei Experimenten zeigte eine konsistente Reduzierung bei der peritonealen Insuffizienz bei KGF-2-be handelten Tieren bei 1 und 5 mg/kg. Diese Daten sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Zusätzlich wurde die Bruchfestigkeit an der Stelle des chirurgischen Eingriffs unter Verwendung eines Tensitometers untersucht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den KGF-2Δ33- und Puffergruppen beobachtet. Wie in 49 gezeigt, wurden signifikante Anstiege beim Collagengehalt an der Stelle des chirurgischen Eingriffs sowohl bei 1 mg/kg KGF-2Δ33 (p = 0,02) als auch bei 5 mg/kg (p = 0,004) relativ zu den Pufferkontrollen gezeigt.
Tabelle Colon-Anastomose Radialogische Analyse
Männliche erwachsene SD-Ratten (n = 5) wurden mit einer Kombination von Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) intramuskulär narkotisiert. Die Bauchhöhle wurde mit einem 4 cm langen Mittellinienschnitt geöffnet. Ein 1 cm breites Segment des linken Colons wurde 3 cm proximal zur peritonealen Reflektion reseziert, wobei die Randgefäße erhalten wurden. Eine Einzelschicht End-zu-End Anastomose wurde mit 8–10 unterbrochenen 5– 0 invertierten Vicryl-Suturen durchgeführt, um die intestinale Kontinuität wiederherzustellen. Die Anastomose wurde dann topisch über eine Spritze entweder mit Puffer oder KGF-2Δ33 bei Konzentrationen von 1 und 4 μg behandelt. Die Schnittwunde wurde mit 0–3 durchgehender Seidensutur für die Muskelschicht und mit Operationsklammern für die Haut geschlossen. Die Behandlungen erfolgten dann danach täglich und bestanden aus Puffer oder KGF-2Δ33 und 1 und 5 mg/kg sc. Am Tag des chirurgischen Eingriffs und täglich danach wurde gewogen. Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Behandlung (Tag 5) getötet. Die Tiere wurden narkotisiert und erhielten Bartumklistiere und wurden in einem konstanten Abstand geröngt. Die Anastomose wurde dann für die histopathologische und biomechanische Analyse herausgeschnitten.
Beispiel 29
Bewertung KGF-2 in einem Modell der Darmentzündung
KGF-2 ist ein Protein, das die Keratinocytnproliferation in vitro induziert und in einer Reihe von Wundheilungsmodellen in vivo aktiv ist. Der Zweck dieser Studie bestand darin, zu bestimmen, ob KGF-2 in einem Modell der Maus-Colitis wirksam ist, die durch ad libitum Exposition gegenüber Natriumdextransulfat im Trinkwasser induziert wurde.
6 bis 8 Wochen alte weibliche Swiss-Webster-Mäuse (20–25 g, Charles River, Raleigh, NC) wurden in einem Modell der Darmentzündung verwendet, die mit einer 4%-igen Natriumdextransulfat-Lösung induziert wurde (DSS, 36.000–44.000 MW, American International Chemistry, Natick, MA), das eine Woche ad libitum verabreicht wurde. KGF-2 wurde mittels täglicher parenteraler Verabreichung (n = 10) gegeben. Drei Parameter wurden verwendet, um die Wirksamkeit zu bestimmen: 1) Klinische Punktebewertung, basierend auf der Bewertung des Stuhls; 2) histologische Punktebewertung, basierend auf der Bewertung des Colons und 3) Gewichtsänderung. Die klinische Punktebewertung bestand aus zwei Teilen, wobei insgesamt eine maximale Punktzahl von vier erreicht wird. Die Stuhlbeschaffenheit wurde bewertet als: 0 = fest; 1 = locker; 2 = Diarrhö. Blut im Stuhl wurde auch auf einer Skala von 0 bis 2 mit 0 = kein Blut; 1 = okkultes Blut und 2 = starke rektale Blutung bewertet. Eine mittlere Punktebewertung über 3 zeigte eine mögliche Lethalität und eine Erkrankung an, die über ihr behandelbares Stadium fortgeschritten war. Die klinische Punktebewertung erfolgte an Tag 0, 4, 5, 6 und 7. Um eine histologische Punktebewertung zu erhalten, wurden Stücke des aufsteigenden, transversen und absteigenden Colons mittels Verblindung, basierend aucf einer Punktebewertung der Entzündung (0–3) und einer cryptischen Punktebewertung (0–4) ausgewertet. Das Körpergewicht wurde täglich gemessen. Die Daten werden als Mittewert + SEM ausgedrückt. Ein ungepaarter t-Test nach Student wurde verwendet, um signifikante Unterschiede im Vergleich zur Krankheitskontrolle zu bestimmen (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Wenn DSS-behandelten Mäusen eine tägliche intraperitoneale (IP) KGF-2-Injektion bei einer Dosis von 1, 5 oder 10 mg/kg 7 Tage verabreicht wurde, reduzierte KGF-2 die klinische Punktebewertung signifikant um 28, 38 bzw. 50 Prozent. Die histologische Bewertung glich nahezu der dosisabhängigen Hemmung der klinischen Punktebewertung, wobei die 1, 5 und 10 mg/kg-Dosis die histologische Punktebewertung um signifikante 26, 48 und 51 Prozent reduzierte. KGF-2 reduzierte auch signifikant den mit DSS-induzierter Colitis assoziierten Gewichtsverlust.
In einer zweiten Studie wurde ein Vergleich der relativen Wirksamkeit von KGF-2Δ33 (10 mg/kg) bei täglicher IP- oder subkutaner Gabe (SC) durchgeführt. Am Ende des Experiments an Tag 7 wiesen die IP-injizierten Tiere eine signifikante 34%-ige Reduzierung in der klinischen Punktebewertung auf, während KGF-2 injizierte SC zu einer signifikanten 46%-igen Reduzierung führten. Basierend auf der Messung der klinischen Punktebewertung und dem Körpergewicht ist die SC-Verabreichung von KGF-2 mindestens so wirksam wie die IP-Verabreichung.
Es ist klar, dass die Erfindung anders umgesetzt werden kann als im Besonderen in der vorstehenden Beschreibung und den Beispielen beschrieben.
Es sind zahlreiche Modifikationen und Variationen im Lichte der vorstehenden Ausführungen möglich und deshalb kann im Rahmen der im Anhang befindlichen Patentansprüche die Erfindung anders umgesetzt werden, als im Besonderen beschrieben.

Claims

Mutante des KGF-2-Polypeptids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer N-terminalen Deletionsmutante von KGF-2, wobei die Mutante aus der Aminosäuresequenz Ala (63) bis Ser (208) in 1 oder aus der Aminosäuresequenz Ala (63) bis Ser (208) des Proteins, das durch die in dem Plasmid ATCC 75977 enthaltene cDNA codiert ist, besteht, und wobei die Mutante ein N-terminales Methionin enthält; (b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90%, 95%, 97% oder 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz der KGF-2 Mutante nach (a); (c) einem Polypeptid nach (a), wobei das Polypeptid mindestens einen Aminosäureaustausch hat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg(194)Glu, Arg(194)Gln, Lys(191)Glu, Lys(191)Gln, Arg(188)Glu und Lys(183)Glu.
Polypeptid nach Anspruch 1, das nicht glykosyliert ist.
Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2.
Fusionsprotein nach Anspruch 3, in dem das Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit einer Markersequenz verknüpft ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 4, wobei die Markersequenz ausgewählt ist aus einem Hexahistidin-Tag oder einem Hämagglutinin-Tag.
Polynucleotid, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 6, das für die Expression in E. coli optimiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, umfassend das Einfügen des Polynucleotids nach Anspruch 6 oder 7 in einen Vektor.
Vektor, enthaltend das Polynucleotid nach Anspruch 6 oder 7 oder hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 8.
Vektor nach Anspruch 9, in dem das Polynucleotid funktionell mit Expressionsregulationssequenzen verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen ermöglichen.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend das Einbringen des Vektors nach Anspruch 9 oder 10 in eine Wirtszelle.
Rekombinante Wirtszelle, die (a) das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 exprimiert; (b) mit dem Polynucleotid nach Anspruch 6 oder 7 modifiziert ist; (c) mit dem Vektor nach Anspruch 9 oder 10 modifiziert ist; oder (d) nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, die eine bakterielle, Hefe-, Pflanzen-, Insekten-, oder Säugerzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine E. coli-, SF9-, COS- oder CHO-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung einer Mutante des KGF-2-Polypeptids, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14 und Gewinnung des Polypeptids, das durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.
Polypeptid, erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 15.
Arzneimittel, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16, das Polynucleotid nach Anspruch 6 oder 7 oder den Vektor nach Anspruch 9 oder 10, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten.
In-vitro-Verfahren zur Stimulierung des Wachstums oder der Proliferation von epithelialen Zellen, umfassend das Inkontaktbringen der Zellen mit einer wirksamen Menge des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des Wachstums oder der Proliferation epithelialer Zellen in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die epithelialen Zellen Keratinozyten oder Basalkeratinozyten sind.
Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die epithelialen Zellen aus Lunge, Brust, Pankreas, Magen, Dünndarm oder Dickdarm stammen.
Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die epithelialen Zellen Sebozyten, Haarfollikel, Hepatozyten, Type-II-Pneumozyten, oder Mucin-produzierende Gobletzellen oder andere epitheliale Zellen und ihre in Haut, Lunge, Leber und dem Gastrointestinaltrakt enthaltenen Vorläufer sind.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Verbesserung des Erscheinungsbildes von Falten oder gealterter Haut, Verbesserung der Hautstraffung, Förderung der epidermalen Verdickung oder Verminderung von Narbenbildung.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung der Heilung nach kosmetischen Operationen.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Wundheilung in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Wunde ausgewählt ist aus chirurgischen Wunden, Schnittwunden, tiefen Wunden, einschließend die Schädigung der Dermis und Epidermis, Wunden des Augengewebes, Wunden des Dentalgewebes, Wunden der Mundhöhle, Geschwüre, und Verbrennungen.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei das Geschwür ein diabetisches Geschwür, Hautgeschwür, Ellbogengeschwür, arterielles Geschwür, oder Venenstaugeschwür ist.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Wunden, die durch einen chirurgischen Eingriff am Dickdarm oder Gastrointestinaltrakt an einem Individuum verursacht worden sind.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei das Verfahren Anastomose ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei das Individuum eine Beeinträchtigung der Wundheilung hat.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Beeinträchtigung durch Diabetes, ischämische Blockade oder Verletzung, nicht-steroide Zusammensetzungen, Urämie, Mangelernährung, Vitaminmangel, Adipositas, Infektion, Immunsuppression, Strahlentherapie, oder Chemotherapie verursacht ist, oder eine Komplikation ist, die mit systemischer Behandlung mit Steroiden zusammenhängt.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung von Mukositis.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Mukositis ausgewählt ist aus oral, ösophageal, gastrisch, intestinal, zum Dickdarm gehörend, rektal oder anal.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei die Krankheit Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn ist.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verminderung von Entzündungen.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Entzündung mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziiert ist ausgewählt aus Psoriasis oder Arthritis.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Entzündung mit einer Krankheit oder einem Zustand assoziiert ist ausgewählt aus Ekzem oder Dermatitis.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der urothelialen Heilung oder zur Förderung des Gewebewachstums oder Heilung im weiblichen Genitaltrakt.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung des Haarwachstums.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Gewebe, das Bestrahlung ausgesetzt ist, oder zum Schutz von Gewebe, welches Bestrahlung ausgesetzt sein wird.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Arzneimittel so konzipiert ist, dass es bei Verabreichung eine Erhöhung der Bestrahlungsdosis ermöglicht, die zur Behandlung einer malignen Erkrankung in dem Individuum verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 42, wobei das Arzneimittel so konzipiert ist, dass es bei Verabreichung einen durch Strahlung induzierten Zustand ausgewählt aus oraler Verletzung, gastrointestinaler Verletzung, Mukositis, intestinaler Fibrose, Proktitis, pulmonarer Fibrose, Pneumonitis, pleuraler Retraktion, hämatopoetischem Syndrom oder Myelotoxizität behandelt.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Lungenkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 44, wobei die Lungenkrankheit akute oder chronische Lungenschädigung ist.
Verwendung nach Anspruch 44, wobei die Lungenkrankheit Emphysem, Inhalationsverletzungen, hyaline Membrankrankheit, Atemnotsyndrom des Früh- und Neugeborenen oder bronchopulmonäre Dysplasie ist.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels für Leberkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die Leberkrankheit fulminantes Leberversagen verursacht durch Zirrhose ist.
Verwendung nach Anspruch 47, wobei die Leberkrankheit Leberschädigung verursacht durch virale Hepatitis oder toxische Substanzen ist.
Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 16 zur Herstellung eines Arzneimittels für Diabetes.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 50, wobei das Arzneimittel zur therapeutischen Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 50, wobei das Arzneimittel zur prophylaktischen Verabreichung ist.