JP2003500456A - 角質細胞増殖因子−２製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、角質細胞増殖因子−２（ＫＧＦ−２）およびその誘導体の液体および凍結乾燥形態に関する。本発明はさらに、治療目的の使用、たとえば、創傷の治癒を促進するためのＫＧＦ−２の製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、角質細胞増殖因子−２（ＫＧＦ−２）およびその誘導体の液体およ
び凍結乾燥調合物に関する。本発明はさらに、柔組織の増殖および再生を必要と
する適応症において治療用途に用いることのできるＫＧＦ−２調合物、とりわけ
局所および注射調合物に関する。

【０００２】 （背景技術） 繊維芽細胞増殖因子ファミリーは、柔組織の増殖および再生に関与する増殖因
子の大きなファミリーとして登場してきた。このファミリーは、現在のところ、
幾つかの成員を含み、これらはタンパク質レベルで種々の程度の相同性を示し、
また一つの例外を除いて類似の広いマイトジェンスペクトルを有する、すなわち
、中胚葉および神経外胚葉起源の種々の細胞の増殖を促進し、および／または血
管形成を促進する。

【０００３】 ＫＧＦはもともと、配列ホモロジーまたは因子精製およびクローニングにより
ＦＧＦファミリーの一員として同定された。角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）は、培
養したマウスの角質細胞株からマイトジェンとして単離された（Rubin, J. S.ら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 802-806 (1989)）。ＦＧＦファミリーの他
の成員と異なり、間充織由来の細胞に対する活性はほとんど有しないが、上皮細
胞の増殖を刺激する。角質細胞増殖因子は皮膚および胎児の肺に由来する繊維芽
細胞により産生される（Rubinら(1989)）。角質細胞増殖因子のｍＲＮＡは、成
人の腎臓、結腸および腸骨では発現されるが、脳または肺では発現されないこと
がわかっている（Finch, P. W.ら、Science 245: 752-755 (1989)）。ＫＧＦは
、ＦＧＦタンパク質ファミリー内で保存された領域を呈示する。ＫＧＦはＦＧＦ
−２レセプターと高親和性で結合する。

【０００４】 創傷治癒が損なわれることは、重要な罹患源であって、被裂、吻合の破損（an
astomotic breakdown）および治癒しない創傷などの合併症を起こす結果となる
。通常の個体では、創傷治癒は併発症を伴うことなく達成される。対照的に、治
癒の障害は、糖尿病、感染、免疫抑制、肥満および栄養不良などの幾つかの状態
と関係している（Cruse, P. J.およびFoord, R., Arch. Surg. 107: 206 (1973)
; Schrock, T. R.ら、Ann. Surg. 177: 513 (1973); Poole, G. U., Jr., Surge
ry 97: 631 (1985); Irvin, G. L.ら、Am. Surg. 51: 418 (1985)）。 創傷の修復は複雑な相互作用および生物学的プロセスの結果である。通常の創
傷治癒では３つの相が記載されている：急性の炎症相、細胞外マトリックスおよ
びコラーゲン合成、および再建（remodeling）である（Peacock, E. E., Jr., W
ound Repair, 第２版、WB Saunders、フィラデルフィア(1984)）。このプロセス
は、創傷部位での角質細胞、繊維芽細胞および炎症細胞の相互作用が関与してい
る。

【０００５】 （発明の開示） （発明が解決しようとする技術的課題） 柔組織の増殖および再生を促進および亢進することができるポリペプチドを、
（１）長期の貯蔵期間にわたって安定であり、（２）該ポリペプチドの薬理活性
または有効性を増大させ、および／または（３）治療計画において該ポリペプチ
ドの適用または投与を容易にする医薬組成物に調合することが望ましい。

【０００６】 （その解決方法） 本発明は、ＫＧＦ−２およびその欠失変異体または点変異体または置換変異体
（以下、「ＫＧＦ−２ポリペプチド」という）の液体および凍結乾燥調合物に関
する。本発明はさらに、たとえば、創傷治癒において、または粘液球症（mucocy
tis）または炎症性腸疾患の治療において、柔組織の増殖または再生を促進また
は亢進するためのＫＧＦ−２ポリペプチドのかかる調合物の使用に関する。本発
明の好ましい調合物は、ＫＧＦ−２の新規な変異体を用い、一つの態様において
本明細書においてＫＧＦ２−Δ３３と称する欠失変異体を用いる。該調合物に用
いる併用成分は、（１）ＫＧＦ−２ポリペプチドに貯蔵安定性を付与し、（２）
該治療組成物の柔組織治癒活性をさらに促進し、および／または（３）特定の治
療目的のための適用および投与を容易にしながら、活性形のＫＧＦ−２ポリペプ
チドを提供する。

【０００７】 本発明の第一の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドおよびｐＨ約５.０〜約８.０
で緩衝能を有する緩衝液を含む調合物に関する。有用な緩衝液としては、リン酸
緩衝液、酢酸緩衝液、アコニット酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、
炭酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられるが、クエン酸緩衝液が好ましい。 本発明の第二の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、凍結乾燥バルク剤（bulkin
g agent）およびｐＨ約５.０〜約８.０で緩衝能を有する緩衝液を含む調合物に
関する。有用な緩衝液としては、リン酸緩衝液、アコニット酸緩衝液、コハク酸
緩衝液、リンゴ酸緩衝液、炭酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられるが、ク
エン酸緩衝液が好ましい。

【０００８】 本発明の第三の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、およびＫＧＦ−２ポリペプ
チドを安定化しうるチオール含有化合物、好ましくはモノチオグリセロールを含
む調合物に関する。この調合物は、好ましくはｐＨ約５.０〜約８.０で緩衝能を
有する緩衝液を含む。この調合物はまた、１またはそれ以上の抗酸化剤および／
または１またはそれ以上の金属キレート化剤を含んでいてよい。 本発明の第四の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、緩衝液、およびある所定の
温度で調合物をゲル化させる高分子量化合物を含む調合物に関する。好ましい高
分子量化合物は、PluronicまたはPoloxamerポリオキシエチレン−ポリオキシプ
ロピレンブロックコポリマーである。該ポリペプチドに安定性を付与するため、
モノチオグリセロールなどのチオール含有化合物を調合物に含ませることができ
る。

【０００９】 本発明の第五の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、緩衝液、および増粘剤を含
む調合物に関する。増粘剤は、調合物の粘度を増大させるために用いる。好まし
い増粘剤は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロ
ース（ＨＥＣ）、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ナトロ
ソル（Natrosol）およびカルボマー（Carbomers）である。

【００１０】 さらに、本発明の調合物はまた、金属キレート化剤、抗酸化剤またはチオール
含有化合物、たとえば、アスコルビン酸エステル、モノチオグリセロール、シス
テイン、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、硫酸ナトリウム、重
亜硫酸ナトリウムおよびメタ亜硫酸ナトリウム（sodium metasulfite）、および
保存剤、たとえば、ｍ−クレゾール、フェノール、クロロブタン、クロロブタノ
ール、ベンジルアルコール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンを含んでい
てよい。抗菌保存剤はＫＧＦ−２調合物の安定性を低減させる。驚くべきことに
、メチルパラベンとプロピルパラベンとの組み合せが、ＫＧＦ−２調合物に使用
するのに適していることがわかった。本発明の調合物はまた、バイアルの上部空
間に窒素ブランケットオーバーレイ（nitrogen blanket overlay）を有していて
よい。さらに、本発明の調合物は、ヘリウム、アルゴンまたは窒素を用いて調合
物緩衝液を除去すること（purging the formulation buffer）を含む。

【００１１】 ＫＧＦ−２は表皮角質細胞の増殖は刺激するが、繊維芽細胞などの間充織細胞
の増殖は刺激しない。従って、「ＫＧＦ−２タンパク質様活性を有するポリペプ
チド」とは、下記の角質細胞増殖アッセイにおいてＫＧＦ−２活性を示し、ＦＧ
Ｆレセプターイソ型1-iiibおよび2-iiibに結合するポリペプチドを含む。 本発明は、ＫＧＦ−２ポリペプチドの医薬調合物および動物医薬調合物に関す
る。本明細書においてＫＧＦ−２ポリペプチドは、図１（配列番号：２）のポリ
ペプチドまたは寄託してあるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを参照し
て定義され、図１（配列番号：２）のポリペプチドまたは寄託してあるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドの断片、誘導体およびアナログであって本質的
に親ポリペプチドと同じ生物学的機能を保持しているものを包含する。本発明に
用いるポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポ
リペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。

【００１２】 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、４.５またはそれ以下のｐＨ、または約８を超え
るｐＨでは不十分な活性および安定性しか示さないことがわかっている。本発明
者らは、ＫＧＦ−２ポリペプチドが酸化し、沈殿することを見出した。これらポ
リペプチドは、治療目的のために調合物にしようとすると難題を提示する。物理
化学的特性および生物学的活性を維持するため、ＫＧＦ−２ポリペプチドは、抗
酸化剤、たとえば酸素捕捉化合物、および／またはタンパク質安定化剤、たとえ
ばチオール含有化合物、および／または金属キレート化剤、たとえばＥＤＴＡと
ともに調合することができる。本明細書において安定化とは、所定の期間にわた
ってＫＧＦ−２ポリペプチドの物理化学的特性および実質的な生物学的活性の両
者を維持することをいう。 本発明による調合物は、ゲル、増粘溶液、溶液および凍結乾燥形態を含む。調
合物はまた本明細書において「医薬組成物」または「組成物」とも称する。

【００１３】注射用調合物 液体調合物 本発明の第一の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、およびｐＨ約５.０〜８.０
、さらに好ましくはｐＨ５.５〜６.５、最も好ましくはｐＨ６.２で緩衝能を有
する緩衝液を含む液体調合物に関する。有用な緩衝液としては、リン酸、酢酸、
アコニット酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、コハク酸および炭酸に由来す
る緩衝液が挙げられる。典型的に用いられるのは、上記酸の一つのアルカリまた
はアルカリ土類塩である。さらに好ましくは、緩衝液は酢酸塩またはクエン酸塩
、最も好ましくはクエン酸塩であろう。たとえば、調合物は、緩衝量のクエン酸
またはその薬理学的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ３３と水中で混合することに
より生成する組成物を包含する。調合物はまた、緩衝量の酢酸またはその薬理学
的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ３３と水中で混合することにより生成する組成
物を包含する。好ましい緩衝液濃度は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭである。最も好ま
しくは、酢酸緩衝液は約２０ｍＭの濃度を有し、クエン酸緩衝液は約１０ｍＭ〜
約２０ｍＭであろう。

【００１４】 調合物はまた、ＮａＣｌ、グリシン、ショ糖またはマンニトールまたはそれら
の組み合せを等張化剤（tonicifier）として約０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、好ましく
は１０〜約１５０ｍＭ、最も好ましくは約１２５ｍＭの濃度にて、および金属キ
レート化剤、たとえばＥＤＴＡを約０ｍＭ〜約１０ｍＭ、最も好ましくは約１ｍ
Ｍの濃度にて含んでいてよい。さらに、本発明の液体調合物はまた、（ａ）安定
化量の抗酸化剤、たとえばアスコルビン酸および／または（ｂ）タンパク質安定
化量のチオール化合物、たとえばモノチオグリセロール（ＭＴＧ）の１またはそ
れ以上を含んでいてよい。理論に縛られることを意図するものではないが、ＭＴ
Ｇなどのチオール化合物はＫＧＦ−ポリペプチドに存在する遊離のスルフヒドリ
ル基を保護する働きをすると考えられる。液体調合物の貯蔵条件は、一般に約２
℃〜約８℃である。あるいは、貯蔵条件は−２０℃またはそれ以下である。最も
好ましくは貯蔵条件は約−２０℃である。ＫＧＦ−２液体調合物を凍結状態で維
持することは該ポリペプチドに対して酸化量を制限し、このことが安定なポリペ
プチド調合物という結果をもたらす。

【００１５】 好ましくは、液体調合物は、 （１）治療学的有効量のＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）ｐＨ約５.０〜約８.０で緩衝能を有する緩衝液の有効量； （３）薬理学的に許容しうる希釈剤；および （４）任意に下記成分の１またはそれ以上： （ａ）等張化剤としてのＮａＣｌ、グリシン、ショ糖またはマンニトールまた
はそれらの組み合せ、 （ｂ）キレート化剤、 （ｃ）安定化量の抗酸化剤、および （ｄ）安定化量のタンパク質安定化剤 を含む。 ＫＧＦ−２ポリペプチドは溶液中に保持するのが好ましい。

【００１６】 本発明の組成物は、上記成分を好ましくは本明細書に記載した濃度および比率
にて混合することにより製造する。 液体調合物に用いることのできる抗酸化剤としては、重硫酸ナトリウム、シス
テイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、およびブチル化
ヒドロキシアニソールが挙げられる。さらに、液体調合物に用いることのできる
安定化剤はまた、システイン、メチオニンおよびチオグリセロールなどのチオー
ル類を含む。使用できるキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）、またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）が挙げられ、ＥＤＴＡ
が好ましい。 抗酸化剤またはチオール類を含む本発明の調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチド
の安定性を増大させることができる。このことは、一層長期の貯蔵寿命を有する
医薬製品とすることを可能とする。

【００１７】 さらに、本発明の調合物は、１またはそれ以上の保存剤、たとえば、ベンジル
アルコールを好ましくは約０.５％〜約１.５％の濃度、最も好ましくは約０.９
％の濃度にて、クロロブタノールを好ましくは約０.０１％〜約１％の濃度、最
も好ましくは約０.５％の濃度にて、メチルパラベンを好ましくは約０.１〜約０
.２％の濃度、最も好ましくは約０.１８％の濃度にて、プロピルパラベンを好ま
しくは約０.０１％〜約０.０５％の濃度、最も好ましくは約０.０２％の濃度に
て、ｍ−クレゾールを好ましくは約０.１〜約１％の濃度、最も好ましくは約０.
３％の濃度にて、および／またはフェノールを好ましくは約０.１％〜約１％の
濃度、最も好ましくは約０.５％の濃度で含んでいてよい。特に好ましいのはメ
チルパラベンとプロピルパラベンとを一緒に用いることであり、メチルパラベン
を約０.１〜約０.２％の濃度で、プロピルパラベンを約０.１０％〜約０.０５％
の濃度で用いる。最も好ましいのはメチルパラベンとプロピルパラベンとの組み
合せであり、メチルパラベンを０.１８％の濃度で、プロピルパラベンを０.０２
％の濃度で用いる。

【００１８】 さらに好ましい液体調合物は、 （１）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに好ましくは約０.０５〜約
３０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに一層好ましくは約０.１〜約２０ｍｇ／ｍｌ(ｗ
／ｖ)、もっと一層好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、最も好ましくは約０.
２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度範囲でｐ
Ｈ約５.０〜約８.０にて緩衝能を有する緩衝液；および （３）組成物を所定の容量とする、薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水
を含む。

【００１９】 本発明の調合物に有用な緩衝液としては、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸および炭酸に由来する緩衝液が挙げられ
る。典型的に用いられるのは、上記酸の一つのアルカリまたはアルカリ土類塩で
ある。酢酸およびクエン酸緩衝液、たとえば、酢酸または薬理学的に許容しうる
その塩、またはクエン酸または薬理学的に許容しうるその塩が好ましい。溶液調
合物の好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ約５.０〜約８.０、好ましくはｐＨ５.５〜６.
５、最も好ましくはｐＨ６.２である。酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウ
ムが好ましい緩衝液であり、クエン酸ナトリウムが最も好ましい。

【００２０】 上記溶液にはまた、 （４）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらに好ましくは約１ｍＭの濃度範囲のキレ
ート化剤、たとえばＥＤＴＡ； （５）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭ、さらに好ましくは約１２５ｍＭの濃度範
囲のＮａＣｌ、グリシン、ショ糖またはマンニトールまたはそれらの組み合せな
どの等張化剤 を加えるのが好ましい。

【００２１】 場合により、液体調合物はまた、以下よりなる群から選ばれた化合物をタンパ
ク質安定化量で含んでいてよい： （ａ）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、 （ｂ）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、または （ｃ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール。

【００２２】 本発明のこの側面の好ましい態様は、 （１）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)、さらに好ましくは約０.１〜約２
０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０.２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度のＫＧＦ−２ポリ
ペプチド； （２）１０ｍＭのクエン酸ナトリウムまたは２０ｍＭの酢酸ナトリウム； （３）１２５ｍＭのＮａＣｌ； （４）１ｍＭのＥＤＴＡ；および （５）希釈剤としての水 を混合することにより生成する組成物を包含する。

【００２３】 さらに好ましくは、溶液調合物は、 （１）約０.２〜４ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）２０ｍＭの酢酸ナトリウム； （３）１２５ｍＭのＮａＣｌ； （４）１ｍＭのＥＤＴＡ；および （５）希釈剤としての水 を混合することにより生成する組成物を包含し、その際、該溶液はｐＨ約６.２
であり、約−２０℃で貯蔵する。

【００２４】 最も好ましくは、溶液調合物は、 （１）約１.０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５〜５.５；および （３）０.０１％のポリソルベート８０ を混合することにより生成する組成物を包含する。 該溶液はまた、約７％のショ糖かまたは２％のグリシンと０.５％のショ糖と
の組み合せのいずれかを含むのが好ましい。

【００２５】 別の態様として、溶液調合物は、 （１）約１.０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５〜５.５； （３）１ｍＭのＥＤＴＡ；および （４）０.０１％のポリソルベート８０ を混合することにより生成する組成物を包含する。 該溶液はまた、約７％のショ糖かまたは２％のグリシンと０.５％のショ糖と
の組み合せのいずれかをも含むのが好ましい。

【００２６】 本発明者らは、ＫＧＦ−２ポリペプチドが容易に酸化し、溶液から凝集および
沈降することを見出した。ＫＧＦ−２の酸化は生物学的活性を破壊するものでは
ないが、生成物の酸化の程度を制限することは一層安定な生成物に導く。本発明
者らは、液体調合物があまりにも低いｐＨにあるとＫＧＦ−２ポリペプチドはそ
の生物学的活性を失うことを観察した。さらに、溶液のｐＨがＫＧＦ−２のｐＩ
に近づくにつれて該タンパク質は溶液から沈降するであろう。それゆえ、本発明
者らは、液体調合物はｐＨ約６.０〜約７.０の範囲に維持すべきであり、約６.
２のｐＨがＫＧＦ−２ポリペプチドを安定化するうえで最適であると決定した。
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、クエン酸緩衝液がとりわけＫＧＦ−２
ポリペプチドを安定化させると決定した。

【００２７】 ｐＨ約６.０〜６.２を有するクエン酸緩衝液の使用はＫＧＦ−２ポリペプチド
の凝集が低減し安定性の増大した液体調合物をもたらすが、該液体ポリペプチド
調合物は依然としてＫＧＦ−２ポリペプチドの酸化および沈降を受ける。それゆ
え、本発明者らは、以下に記載する凍結乾燥した調合物を開発した。

【００２８】凍結乾燥調合物 本発明の第二の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチド、およびｐＨ約５.０〜約８.
０、さらに好ましくはｐＨ５.５〜６.５、最も好ましくはｐＨ６.２で緩衝能を
有する緩衝液を含むＫＧＦ−２ポリペプチドの凍結乾燥調合物に関する。有用な
緩衝液としては、リン酸、アコニット酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、コ
ハク酸および炭酸に由来する緩衝液が挙げられる。典型的に用いられるのは、上
記酸の一つのアルカリまたはアルカリ土類塩である。さらに好ましくは、緩衝液
はリン酸またはクエン酸、最も好ましくはクエン酸であろう。たとえば、調合物
は、緩衝量のクエン酸またはその薬理学的に許容しうる塩をＫＧＦ−２Δ３３と
水中で混合することにより生成する組成物を包含する。好ましい緩衝液濃度は、
約５ｍＭ〜約５０ｍＭであり、より好ましくは約１０ｍＭである。最も好ましく
は、クエン酸緩衝液を約１０ｍＭの濃度で加える。また、調合物は、等張化剤と
してのＮａＣｌを約０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度に
て、および金属キレート化剤、たとえばＥＤＴＡを約０ｍＭ〜約１０ｍＭ、最も
好ましくは約１ｍＭの濃度にて含んでいてよい。

【００２９】 さらに、バルク剤／低温保護剤（cryoprotectants）、たとえば、ショ糖、グ
リシン、マンニトール、トレハロースまたは他の薬理学的に許容しうるバルク剤
が調合物中に含まれる。使用するバルク剤の量は、溶液が等張となるような範囲
であり、約２％〜約１０％ｗ／ｖの範囲である。好ましい濃度は以下のとおりで
ある：５％マンニトール、７％ショ糖、８％トレハロース、または２％グリシン
＋０.５％ショ糖。さらに好ましくは、ショ糖またはショ糖／グリシン混合物を
用いる。さらに、本発明の凍結乾燥調合物はまた、（ａ）安定化量の抗酸化剤、
たとえばアスコルビン酸または（ｂ）安定化量のチオール化合物、たとえばモノ
チオグリセロールの１またはそれ以上を含んでいてよい。凍結乾燥調合物の貯蔵
条件は、一般に約２℃〜約２５℃である。さらに好ましくは、貯蔵条件は約２℃
またはそれ以下〜約８℃である。

【００３０】 ＫＧＦ−２ポリペプチドは、最初の溶液中で約０.０２ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍ
ｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて凍結乾燥する。 最初の凍結乾燥溶液は、（ＫＧＦ−２ポリペプチドに加えて） （１）約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲の有効量のクエン酸または薬理学的に許
容しうるその塩、好ましくはクエン酸ナトリウム、 （２）約０ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ、 （３）約０ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡ、 （４）約２％ｗ／ｖ〜約１５％ｗ／ｖの濃度のショ糖、マンニトール、グリシン
またはトレハロースの１またはそれ以上またはそれらの混合物、および （５）水 を含むのが好ましい。凍結乾燥緩衝液の好ましいｐＨ範囲は、約５.５〜約８.０
、好ましくはｐＨ約６.２である。 さらに好ましくは、凍結乾燥緩衝液は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０
ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、ｐＨ６.２、および７
％ショ糖を含む。

【００３１】 凍結乾燥ＫＧＦ−２ポリペプチド調合物は、約２９０ｍＯｓｍの等張条件を維
持するように滅菌水中で再構成する。ＫＧＦ−２ポリペプチドの再構成は、（ａ
）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｂ）約０.０１％〜約
２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｃ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのメチオニン
または（ｄ）それらの混合物を含む安定化量の抗酸化剤を任意に含む滅菌水中で
行うことができる。

【００３２】 本発明は、安定なＫＧＦ−２ポリペプチド調合物を生成する凍結乾燥サイクル
を包含する。凍結乾燥サイクルは、最初の乾燥相の際にＫＧＦ−２ポリペプチド
生成物をその崩壊温度以下に保持するように設計する。さらに、水分含量を５％
未満、より好ましくは２％未満となるようにする。そのようなプロトコールは、
特定のタンパク質について個々に決定しなければならない。本発明によるＫＧＦ
−２ショ糖含有凍結乾燥調合物のための凍結乾燥サイクルの一例は以下のように
決定された：

【００３３】

【００３４】 本発明によるＫＧＦ−２凍結乾燥調合物のための凍結乾燥サイクルの他の例は
以下のように決定された：

【００３５】 本発明の凍結乾燥調合物は、予期しないほどに増大した安定性を提供する。実
際、本発明の凍結乾燥ＫＧＦ−２調合物は、４５℃までの温度にて少なくとも９
ヶ月間、生物学的に安定である（図４）。逆相ＨＰＬＣは、本発明の凍結乾燥Ｋ
ＧＦ−２調合物が４５℃またはそれ以下、７５％の相対湿度で８ヶ月までその物
理化学的特性を保持したことを示した。このような高温度でこのように長期にわ
たって安定であることはタンパク質にとって極めて異例のことである。

【００３６】増粘調合物およびゲル調合物 本発明の第三の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドの増粘調合物およびゲル調合
物に関する。（１）増粘剤： 増粘剤を上記液体調合物に加えて、得られる調合物の粘度を増大させることが
できる。粘度の増加した調合物は、制御した放出、創傷の形状への付着または流
出の防止が重要である局所適用には有益である。そのような増粘調合物は、創傷
の治癒などの局所的な使用、皮膚疾患を治療するため、またはＫＧＦ−２医薬組
成物の局所適用によって治療し得る他の使用のために用いる。

【００３７】 増粘剤は、粘度を約５０〜約１０,０００センチポイズ（ｃｐｓ）、さらに好
ましくは約５０〜約１,０００ｃｐｓ、および最も好ましくは約２００〜約３０
０ｃｐｓに上げることができなければならない。粘度は回転紡錘粘度計を用いて
測定する。増粘剤の最も好ましい濃度は、０〜５％（ｗ／ｗ）である。増粘した
溶液は、常に液体の状態であろう。

【００３８】 適当な増粘剤の例としては、これに限られるものではないが、水溶性のエーテ
ル化セルロースおよびカルボマー（アリルスクロースかまたはペンタエリトリト
ールのアリルエーテルで架橋されたアクリル酸の高分子量ポリマー）が挙げられ
る。エーテル化セルロースの例は当該技術分野でよく知られており（ＵＳＰに列
挙されている）、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびア
ルキルヒドロキシアルキルセルロース、たとえば、メチルセルロース、ヒドロキ
シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースなどが挙げられる。別の態様において、局所ゲルまたは切開（inci
sional）ゲルは、分子量が約５０,０００〜約７００,０００のセルロース誘導体
を約０〜約２０重量％含んでいてよい。好ましい態様において、セルロース誘導
体は約２重量％〜約８重量％で含まれ、約８０,０００〜約２４０,０００の範囲
の分子量を有する。好ましいセルロース誘導体はヒドロキシプロピルメチルセル
ロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシエ
チルセルロースである。

【００３９】 増粘剤を上記で詳記した注射用調合物に加える場合には、最適の安定性のため
に塩および緩衝剤を加えるかまたは調合物から除去してよい。たとえば、クエン
酸塩の濃度を増大させてよい。クエン酸塩の好ましい濃度は、たとえば、約１０
ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸塩、さらに好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの
クエン酸塩、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのクエン酸塩である。さら
に、凍結乾燥調合物においてショ糖の量を約０％〜約５％ショ糖の範囲まで減ら
してよい。 増粘剤は本発明の液体調合物に直接加え、ついで凍結乾燥してよい。別のやり
方として、その中に増粘剤を溶解した適当な希釈剤、最も好ましくは水を加える
ことにより、本発明による凍結乾燥調合物を再構成してよい。そのような増粘剤
調合物は、スプレーにより投与できるであろう。

【００４０】 本発明による好ましい増粘ＫＧＦ−２ポリペプチド溶液の一例は、 （１）局所的有効量のＫＧＦポリペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３； （２）約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液； （３）約０.０１〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ； （４）約０.７５〜約１.２７ｍＭ、好ましくは約１ｍＭのＥＤＴＡ； （５）約０.１％〜約７％のショ糖または約２.０％のグリシンと約０.５％のシ
ョ糖との組み合せ； （６）約０.７５〜約１.５％（ｗ／ｗ）のカルボキシメチルセルロースまたは約
０.５〜約１.５％のヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは約０.２５〜約
０.７５％のヒドロキシエチルセルロースまたは約０〜１％のカルボマーまたは
これらの組み合わせ を混合することにより生成した生成物を包含する。 そのような調合物のｐＨは、最も好ましくはｐＨ６.２である。

【００４１】（２）ゲル化剤： 本発明の他の側面は、ＫＧＦ−２ポリペプチドのゲル調合物に関する。ゲル化
剤を本発明の注射用調合物に加え、室温では液体のままであるが皮膚の表面（約
３７℃）に適用したときに固化する調合物を提供することができる。そのような
調合物は、制御した放出、創傷の形状への付着または流出の防止が重要である局
所適用には有用である。そのようなゲル調合物は、創傷の治癒などの局所的な使
用、皮膚疾患を治療するため、またはＫＧＦ−２医薬組成物の局所適用によって
治療し得る他の使用のために用いる。

【００４２】 本発明によるＫＧＦ−２ポリペプチドのゲル調合物は、 （１）局所的有効量のＫＧＦポリペプチド； （２）緩衝液； （３）薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水；および （４）ゲル形成高分子量化合物 を含む。

【００４３】 本発明のゲル調合物の粘度は、室温で約１〜約１０,０００ｃｐｓ、最も好ま
しくは室温で約２０〜約１００ｃｐｓの範囲であってよい。粘度は回転紡錘粘度
計を用いて測定する。 本発明に用いることのできるゲル形成高分子量化合物は、典型的に、粘性の水
溶液を生成しうる水溶性ポリマー、または粘性の溶液を生成することができ皮膚
との接触によりゲル化しうる非水溶性で水膨潤性のポリマー（たとえば、コラー
ゲン）である。

【００４４】 有用なゲル形成高分子量化合物は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポ
リオキシプロピレンコポリマー、多糖、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）
、アクリルアミドポリマー、およびその誘導体および／またはその塩から選ばれ
てよい。創傷の治癒に用いる医薬ゲル調合物を製造するのに用いることのできる
他の化合物は、米国特許第５,４２７,７７８号（その全体を参照のため本明細書
中に引用する）に見出すことができる。

【００４５】 有用なビニルポリマー（または置換ポリエチレン）としては、ポリアクリル酸
、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールが挙げ
られる。有用な多糖としては、セルロース誘導体、グリコサミノグリカン、寒天
、ペクチン、アルギン酸、デキストラン、デンプン（α−アミロースまたはアミ
ロペクチン）、およびキトサンが挙げられる。有用なグリコサミノグリカンとし
ては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン−４−硫酸、ヘパラン硫
酸およびヘパリンが挙げられる。グリコサミノグリカンは、創傷治癒を促進する
ため、他のゲル形成ポリマー、たとえば、コラーゲン、ゼラチンまたはフィブロ
ネクチンとともに用いる。アクリルアミドポリマーは、ポリアクリルアミドまた
はポリメタクリルアミドであってよい。

【００４６】 好ましい高分子量ゲル形成化合物は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンブロックコポリマー、とりわけ取引においてPLURONIC(BASF)またはPOLAXAME
RS(BASF)として表示されるブロックコポリマーである。 一つの態様において、本発明のゲルは、平均分子量が約５００〜５０,０００
のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１０〜約
６０重量％含んでいてよい。さらに好ましい態様において、本発明のゲルは、１
,０００〜１５,０００の範囲の分子量のブロックコポリマーを約１４〜約１８重
量％含んでいてよい。本発明の好ましいブロックコポリマーは、Pluronic F108
およびPluronic F127である。

【００４７】 ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（Pluronicま
たはPoloxamer）は局所用ドラッグデリバリーシステムに使用するのに大きな可
能性を持っている。なぜなら、それは逆の熱的ゲル化の挙動を示し、良好な薬物
放出特性を有し、さらに毒性も低いからである。ゲルは溶液を温めると形成され
る。それゆえ、このゲルは室温では低粘性の水溶液であるが、哺乳動物の体に接
触し体温により温められると溶液がゲル化するにつれ粘度は上昇する。Pluronic
ゲルは、たとえば創傷や局所投与が望まれるその他の部位へのＫＧＦ−２ポリペ
プチドの徐放に用いることができる。ＫＧＦ−２ポリペプチドは液体状態でPlur
onicと混合し、創傷に適用することができる。ゲル化が起こることにより該ポリ
ペプチドが創傷に放出される速度が有効に低減され、それによって該ポリペプチ
ドと創傷部位との間の長期にわたる接触が可能となる。そのようなゲル調合物を
使用する利益としては、創傷に水分を保持すること、および創傷や該化合物を適
用できる他の部位に形状的にフィッティングする医薬化合物とすることができる
ことが挙げられる。

【００４８】 本発明によるＫＧＦ−２ポリペプチドのための好ましいゲル調合物は、クエン
酸緩衝液およびPluronicを含む。該調合物は、所定量のクエン酸または薬理学的
に許容しうるその塩を含んでいてよい。 本発明によるゲル調合物はまた、キレート化剤、安定化量の抗酸化剤またはチ
オール類をも含んでいてよい。ゲル調合物は、Pluronicなどの高分子量化合物、
または水溶性のエーテル化セルロースなどを、ゲル化を引き起こす量にて含んで
いるであろう。本発明によるゲル調合物において、ＫＧＦ−２ポリペプチドは約
０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれるのが好ましい。

【００４９】 好ましくは、ゲル調合物は、 （１）０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの最終計算濃度のＫＧＦ−２ポリ
ペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド； （２）有効量の緩衝液； （３）約１０〜約６０重量％、さらに好ましくは約１４〜約１８重量％の、平均
分子量が約５００〜５０,０００のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
ブロックコポリマー；および （４）薬理学的に許容しうる希釈剤、好ましくは水 を混合することにより製造する。

【００５０】 他の好ましいゲル調合物は、 （１）薬理学的活性量のＫＧＦ−２ポリペプチド； （２）約１０ｍＭ〜約５００ｍＭのクエン酸ナトリウム； （３）約０.０１ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌ； （４）約１ｍＭのＥＤＴＡ； （５）約０.１％〜約７％のショ糖または約２.０％のグリシンおよび約０.５％
のショ糖； （６）約１４％〜約１８％のPluronic F127；および （７）水 を含み、その際、該調合物はｐＨ約６.２にある。

【００５１】 最も好ましくは、ゲル調合物は、 （１）約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０.２ｍｇ／ｍｌの範囲
の濃度のＫＧＦ−２ポリペプチド、好ましくはＫＧＦ−２Δ３３； （２）約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲のクエン酸ナトリウム； （３）約１０％〜約２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１５〜約２５、最も好まし
くは約１６％のPluronic 127またはPoloxamer 407； （４）約６.７％〜約７.３％のショ糖、好ましくは約７％のショ糖または約２.
０％のグリシンおよび約０.５％のショ糖；および （５）所定量とする水 を含む。

【００５２】 ゲル調合物はさらに、下記の１またはそれ以上を任意に含んでいてよい： （６）約０.１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のＥＤＴＡ、 （７）約０.０１ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ。 ゲル調合物の好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ約５.０〜約８.０、好ましくはｐＨ６.
２であり、得られるゲル調合物は等張でなければならない。

【００５３】（３）他の安定化剤： 本発明の上記調合物はすべて、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオール含有化
合物および他の一般的な安定化剤から利益を受ける。そのような安定化剤の例と
しては、これらに限られるものではないが、以下のものが挙げられる： （ａ）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、 （ｂ）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、 （ｃ）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、 （ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、 （ｅ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、 （ｆ）０.００３％〜約０.０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、 （ｇ）０.００１％〜約０.０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、 （ｈ）好ましくは約０.５％〜約２.５％、最も好ましくは約１.７％の濃度のア
ルギニン、 （ｉ）ヘパリンまたはヘパリンアナログ（負に荷電したもの）、 （ｊ）好ましくは約０.５％〜約０.０５％の濃度のデキストラン硫酸、 （ｋ）シクロデキストリンまたは硫酸化シクロデキストリン、 （ｌ）アニオンまたはポリアニオン種（ヘパリンアナログ）、 （ｍ）好ましくは１０％の濃度のリジン、 （ｎ）好ましくは約２〜約１０％の濃度のヒドロキシプロピル−β−シクロデキ
ストリン、 （ｏ）好ましくは約０.１％〜約１０％、最も好ましくは約１％の濃度の硫酸化
β−シクロデキストリン、または （ｌ）以上の組み合わせ。

【００５４】ＫＧＦ−２ポリペプチドの投与 本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド調合物には、医薬組成物において有用である
ことが知られている適当な製剤学的希釈剤を用いてよい。そのような希釈剤とし
ては、これらに限られるものではないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース
、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。調合
物は投与方法に適合したものでなければならない。好ましくは、医薬組成物は、
本発明に従って上記のように調合されるであろう。水が好ましい希釈剤である。

【００５５】 ＫＧＦ−２活性を有するポリペプチドは、１またはそれ以上の薬理学的に許容
しうる賦形剤とともに医薬組成物として投与することができる。ヒト患者に投与
する場合には、本発明の医薬組成物の１日の全使用量は、担当医により妥当な医
学的判断に基づいて決定されるであろう。ある特定の患者に対して有効な特定の
治療学的有効量は、達成されるべき応答のタイプおよび程度；他の薬剤の使用の
有無を含む特定の組成；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事
；投与時間、投与経路、および該組成物の排泄速度；処置の期間；特定の組成物
と組み合わせてまたは同時に使用する薬剤（化学療法剤など）；および医学分野
でよく知られた同様の因子を含む種々の因子に依存するであろう。当該技術分野
で知られた適当な調合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences（最新版）
、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、ペンシルベニアに記載されて
いる。従って、本発明の目的のためのＫＧＦ−２の「有効量」は、以上のことを
考慮して決定される。

【００５６】 本発明の医薬組成物は、経口、直腸経由、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、関
節内、皮下、鼻内、吸入、眼内または皮内経路などの都合のよい仕方で投与して
よい。非経口および局所送達が好ましい投与経路である。本明細書において「非
経口」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および
注入を含む投与法をいう。

【００５７】 本発明の医薬組成物は、特定の適応症の治療および／または予防に有効な量に
て投与する。たいていの場合、ＫＧＦ−２の投与量は、投与経路や徴候等を考慮
に入れて１日当たり約１μｇ／ｋｇ体重〜約３０μｇ／ｋｇ体重である。しかし
ながら、投与量は０.００１μｇ／ｋｇもの低投与量であってよい。たとえば、
局所投与の特定の場合では、１ｃｍ^２当たり約０.０１μｇ〜９ｍｇの投与量を
投与するのが好ましい。鼻内および眼内投与の場合は、約０.００１μｇ／ｍｇ
〜約１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約０.０５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ
の投与量を投与するのが好ましい。

【００５８】 一般的な問題として、非経口的に投与するＫＧＦ−２ポリペプチドの薬理学的
に有効な全量は、患者の体重当たり約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の
範囲であろうが、上記のようにこの範囲は治療における裁量に委ねられるであろ
う。連続的に投与する場合には、ＫＧＦ−２ポリペプチドは一般に、１日当たり
１〜４回の注射かまたはたとえばミニポンプを用いた連続的な皮下注入のいずれ
かにより、約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の投与速度にて投与する
。静脈内バッグ溶液またはボトル溶液を用いることもできる。 線溶系に影響を及ぼすＫＧＦ−２ポリペプチド処置のコースは、所定の最小日
数以上（マウスの場合は７日）続けるならば最適であると思われる。変化を観察
するのに要する処置期間の長さおよび応答を生じるための処置後の間隔は、所望
の効果に依存して変わると思われる。

【００５９】 非経口投与の場合は、一つの態様において、ＫＧＦ−２ポリペプチドを所望の
純度にて単位注射剤型（液剤、懸濁剤、または乳濁剤）中に、薬理学的に許容し
うる担体、すなわち使用した投与量および濃度において受容者に非毒性であり調
合物の他の配合成分と両立しうるものと混合することにより調合する。たとえば
、調合物は、酸化剤やポリペプチドにとって有害であることが知られている他の
化合物を含まないのが好ましい。

【００６０】 一般に、調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチドを液体担体または細分した固体担
体または両者と均一かつ完全に接触させることにより調製する。ついで、必要な
ら生成物を所望の調合物に成形する。好ましくは担体は非経口担体であり、さら
に好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。そのような担体ビヒクルの例と
しては、水、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非
水性のビヒクル、たとえば、固定油やオレイン酸エチルなどもリポソームと同様
に有用である。当該技術分野で知られた適当な調合物は、Remington's Pharmace
utical Sciences（最新版）、マックパブリッシングカンパニー、イーストン、
ペンシルベニアに見出すことができる。

【００６１】 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、動物およびヒトにおいて涙腺の障害、疾患お
よび病理を治療するために液剤、滴剤、または増粘液剤、ゲル剤として眼に投与
することができる。 ＫＧＦ−２ポリペプチドはまた、動物およびヒトにおいて鼻粘膜および副鼻腔
上皮の疾患、傷害および病理を治療するために滴剤としてまたはスプレーの形態
で鼻粘膜に鼻内投与することができる。

【００６２】 一般に、調合物は、ＫＧＦ−２ポリペプチドを液体担体または細分した固体担
体または両者と均一かつ完全に接触させることにより調製する。ついで、必要な
ら生成物を所望の調合物に成形する。好ましくは担体は非経口担体であり、さら
に好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。そのような担体ビヒクルの例と
しては、水、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非
水性のビヒクル、たとえば、固定油やオレイン酸エチルなどもリポソームと同様
に用いることができる。当該技術分野で知られた適当な調合物は、Remington's
Pharmaceutical Sciences（最新版）、マックパブリッシングカンパニー、イー
ストン、ペンシルベニアに見出すことができる。

【００６３】 担体はまた、等張性および化学的安定性を高める物質などの適当な添加剤を少
量含んでいてよい。そのような物質は、使用した投与量および濃度において受容
者に非毒性であり、緩衝液、たとえば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、お
よび他の有機酸またはその塩；抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸；低分子量
（約１０残基未満）ポリペプチド、たとえば、ポリアルギニンまたはトリペプチ
ド；タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン
；親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえば、グ
リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン；単糖、二糖、およ
びセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストラン
を含む他の炭水化物；キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、たと
えば、マンニトールまたはソルビトール；対イオン、たとえば、ナトリウム；お
よび／または非イオン性界面活性剤、たとえば、ポリソルベート、ポリオキサマ
ー、またはＰＥＧを含む。

【００６４】 ＫＧＦ−２は、典型的に、そのようなビヒクル中で約０.０１μｇ／ｍｌ〜５
０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０.０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度にて、約
５〜約８のｐＨ、好ましくは約６〜約７、最も好ましくはｐＨ約６.２で調合さ
れる。上記賦形剤、担体、または安定化剤のいずれかの使用の結果、ＫＧＦ−２
塩が生成されるであろうことは理解されるであろう。 治療目的の投与に使用するＫＧＦ−２は滅菌してよい。滅菌は滅菌濾過膜（た
とえば、０.２ミクロン膜）で濾過することにより容易に行うことができる。治
療用ＫＧＦ−２組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、たとえば、静脈内
溶液バッグまたは皮下注射針を通すことのできる栓を有するバイアル中に入れて
よい。

【００６５】 ＫＧＦ−２は、通常、単回または多回投与容器、たとえば、密封したアンプル
またはバイアル中に水溶液または再構成用の凍結乾燥調合物として貯蔵されるで
あろう。凍結乾燥調合物の例として、３ｍｌ容バイアルに１ｍｌの滅菌濾過した
１％（ｗ／ｖ）ＫＧＦ−２水溶液を充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注
入溶液は、凍結乾燥したＫＧＦ−２を注射用水（Water-for-Injection）（１種
またはそれ以上の抗酸化剤を含んでいてよい）を用いて再構成することにより調
製する。 投薬は、たとえばＲＩＡ法によって決定されるように、前以て決定した血中濃
度のＫＧＦ−２活性が達成されるように患者に特異的な仕方で取り決めることが
できる。それゆえ、患者の投薬は、ＲＩＡにより測定されるように５０〜１００
０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１５０〜５００ｎｇ／ｍｌの次数で常に血中レベルが
達成されるように調節してよい。

【００６６】 ＫＧＦ−２はまた、徐放系により適切に投与される。徐放組成物の適当な例と
しては、成型製品、たとえばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過
性ポリマーマトリックスが挙げられる。徐放マトリックスは、ポリラクチド（米
国特許第３,７７３,９１９号、ＥＰ５８,４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガン
マ−エチル−Ｌ−グルタメート（U. Sidmanら、Biopolymers 22: 547-556 (1983
)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langerら、J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（R. Langerら、上掲）またはポリＤ−(
−)−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３,９８８）を含む。徐放ＫＧＦ−２組成物
はまた、リポソームに捕獲したＫＧＦ−２を含む。ＫＧＦ−２を含有するリポソ
ームは、自体公知の方法：ＤＥ３,２１８,１２１；Epsteinら、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985)；Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77
: 4030-4034 (1980)；ＥＰ５２,３２２；ＥＰ３６,６７６：ＥＰ８８,０４６；
ＥＰ１４３,９４９；ＥＰ１４２,６４１；日本特許出願第８３−１１８００８号
；米国特許第４,４８５,０４５号および同第４,５４４,５４５号；およびＥＰ１
０２,３２４により調製される。通常、リポソームは小さな（約２００〜８００
オングストローム）単層のものであって、脂質含量は約３０モルパーセントコレ
ステロール以上であるが、選択した比率は最適のＫＧＦ−２療法のために調節す
る。

【００６７】 本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分の１またはそれ以上を充填した１ま
たはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットをも提供する。そのような容
器には、医薬製品または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府
部局により指令された形態の通知であって、ヒトの投与のための製造、使用また
は販売の該部局による許可を反映するものを添付することができる。さらに、本
発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、他の治療用化合物と
ともに用いることができる。

【００６８】 本発明者らが本発明の調合法に従って調製したＫＧＦ−２ポリペプチドの生物
学的活性および安定性を調べたところ、驚くべきことに、モノチオグリセロール
の使用がＫＧＦ−２ポリペプチドを安定化させ、創傷の治癒に際してＫＧＦ−２
ポリペプチドに対して強化剤として振舞うことが見出された。モノチオグリセロ
ールの強化作用のための最適の濃度範囲は、０.１％〜２％ｗ／ｖであった。

【００６９】ＫＧＦ−２ポリペプチド ＫＧＦ−２は上皮細胞および表皮の角質細胞の増殖は刺激するが、繊維芽細胞
などの間充織細胞の増殖は刺激しない。それゆえ、「ＫＧＦ−２タンパク質様活
性を有するポリペプチド」には、以下および米国特許出願第０８／９１０,８７
５号に示す角質細胞増殖アッセイにおいてＫＧＦ−２活性を示し、ＦＧＦレセプ
ターのイソ型である1-iiibおよび2-iiibに結合しうるポリペプチドが含まれる。
活性の程度はＫＧＦ−２タンパク質と同一である必要はないが、「ＫＧＦ−２タ
ンパク質様活性を有するポリペプチド」はＫＧＦ−２タンパク質と比べて実質的
に同様の活性を示すのが好ましい（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ＫＧＦ
−２タンパク質よりも高い活性を示すか、または参照ＫＧＦ−２タンパク質の活
性の約１／１０以上、好ましくは約１／２以上の活性を示す）。

【００７０】 本発明の調合物に使用するＫＧＦ−２ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを有
していても有していなくてもよいが、好ましくは該ポリペプチドはＮ末端メチオ
ニンを欠失しているであろう。 ＫＧＦ−２ｃＤＮＡクローンは、１９９４年１２月１６日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、特許寄託、１０８０１ユニバーシティー・ブー
ルバール、マナサス、バージニア２０１１０−２２０９にＡＴＣＣ受託番号７５
９７７として寄託してある。さらに、発現ベクターｐＨＥ４−５中に挿入したＫ
ＧＦ−２Δ３３をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣに１９９８年１月９日にＡＴ
ＣＣ受託番号２０９５７５として寄託してある。

【００７１】 図１（配列番号：２）に示すポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドに言及するときの「断片」、「誘導体」および「アナログ
」なる語は、該ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持した
ポリペプチドを意味する。それゆえ、アナログには、プロタンパク質部分の開裂
により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成するプロタンパク質が含まれ
る。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合
成ポリペプチドであってよいが、組換えポリペプチドが好ましい。

【００７２】 図１（配列番号：２）に示すポリペプチドまたは寄託したｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドの断片、誘導体またはアナログは、（i）１またはそれ以
上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミ
ノ酸残基）により置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝子コードにより
コードされているかまたはコードされていないものであるもの、または（ii）１
またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるもの、または（iii）
成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を長くする化合物（たとえば、ポ
リエチレングリコール）などの他の化合物に融合しているものであるもの、また
は（iv）成熟ポリペプチドに、リーダー配列や分泌配列や該成熟ポリペプチドま
たはプロタンパク質配列の精製に用いる配列などの別のアミノ酸が融合している
ものであるものであってよい。そのような断片、誘導体およびアナログは、本明
細書の教示から当業者の範囲内であると思われる。

【００７３】 「ペプチド」および「オリゴペプチド」なる語は（一般に認識されているよう
に）同義であり、ペプチド結合により連結された少なくとも２つのアミノ酸から
なる鎖を示すものとして、文脈に応じて相互に入れ替えて用いることができる。
「ポリペプチド」なる語は、本明細書において１０を超えるアミノ酸残基を含む
鎖に対して用いる。本明細書においてオリゴペプチドおよびポリペプチドの式お
よび配列はすべて、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載す
る。

【００７４】 ＫＧＦ−２ポリペプチドの幾つかのアミノ酸配列は、該タンパク質の構造およ
び機能に有意の影響を及ぼすことなく変化させ得ることが当該技術分野で認識さ
れるであろう。そのような配列の差異を想定すると、該タンパク質上に活性を決
定する重要な領域が存在するであろうことを銘記すべきである。一般に、同様の
機能を果たす残基を用いることを条件として、三次元構造を形成する残基は置換
可能である。他の例において、変化が該タンパク質中の重要でない領域に起こる
場合には残基の種類は全く重要でない。

【００７５】 本発明のポリペプチドは単離形態にあるのが好ましい。「単離したポリペプチ
ド」とは、天然環境から取り出したポリペプチドを意図する。それゆえ、組換え
宿主細胞内で産生されおよび／または含まれるポリペプチドは、本発明の目的の
ためには単離されたと考えられる。組換え宿主細胞または天然源から部分的また
は実質的に精製したポリペプチドも意図される。

【００７６】 本発明の医薬調合物は、配列番号：２のＫＧＦ−２ポリペプチド（とりわけ、
成熟ポリペプチド）およびその欠失変異体、並びに配列番号：２のポリペプチド
およびその欠失変異体に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％の類似性（さらに好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するポリペプチドを含み、また、その
ようなポリペプチドの部分をも含み、ポリペプチドのそのような部分（以下に記
載するような欠失変異体など）は一般に少なくとも３０アミノ酸、さらに好まし
くは少なくとも５０アミノ酸を含む。

【００７７】 当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は
、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびそれを保存的にアミノ酸置換した配
列を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。 ２つのポリペプチドの「類似％」とは、Bestfitプログラム（Wisconsin Seque
nce Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group、ユニ
バーシティー・リサーチ・パーク、５７５サイエンス・ドライブ、マジソン、ウ
イスコンシン５３７１１）および類似性を決定するための不履行セッティング（
default settings）を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較すること
により得られる類似性のスコアを意図する。Bestfitは、２つの配列間の最大の
類似性のセグメントを見出すため、SmithおよびWatermanのローカルホモロジー
アルゴリズム（local homology algorithm)(Advances in Applied Mathematics
2: 482-489, 1981）を採用している。

【００７８】 たとえば、ＫＧＦ−２ポリペプチドの参照配列に対して少なくとも９５％の「
同一性」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ＫＧＦ−２ポリペプチドの
参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５アミノ酸までの変化を該ポリペプ
チド配列が含む他は、該ポリペプチドのアミノ酸配列が該参照配列と同一である
ことを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の
同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、該参照配列中の５％ま
でのアミノ酸残基を欠失または他のアミノ酸で置換してよく、または該参照配列
中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を該参照配列中に挿入してよい。
参照配列中のこれら変更は、参照配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置
にて、またはこれら末端位置の間のいずれかの部位で、参照配列の残基中に個々
ばらばらにかまたは参照配列内の１またはそれ以上の連続したグループ中に散在
して生じてよい。

【００７９】 実際問題としては、特定のポリペプチドがたとえば図１（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列または寄託したｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配
列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の
同一性を有するか否かの決定は、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Anal
ysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group、ユニバーシテ
ィー・リサーチ・パーク、５７５サイエンス・ドライブ、マジソン、ウイスコン
シン５３７１１）などの公知のコンピュータープログラムを用いて常法通り行え
る。特定の配列が本発明による参照配列に対してたとえば９５％の同一性を有す
るか否かを決定するためにBestfitや他の配列アラインメントプログラムを用い
る場合には、パラメーターのセッティングはもちろん、同一性のパーセントの計
算が参照アミノ酸配列の全長にわたって行われ、参照配列中のアミノ酸残基の全
数の５％までのホモロジーギャップが可能となるようにして行う。

【００８０】 本発明のタンパク質は、天然に存在するものであるか、組換えにより製造した
ものであってよく、または当該技術分野で知られた方法を用いて化学的に合成す
ることができる（たとえば、Creighton, 1983, Proteins: Structures and Mole
cular Principles, W. H. Freeman & Co., ニューヨークおよびHunkapiller, M.
ら、Nature 310: 105-111 (1984)を参照）。たとえば、本発明のＫＧＦ−２ポリ
ペプチドの断片に対応するペプチドはペプチド合成機を用いて合成できる。さら
に、所望であれば、非古典的なアミノ酸または化学的なアミノ酸アナログをＫＧ
Ｆ−２ポリペプチド配列中に置換または付加として挿入することができる。

【００８１】 非古典的なアミノ酸としては、これらに限られるものではないが、一般的なア
ミノ酸のＤ−異性体、２,４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ
酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン
酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノル
ロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシ
トルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニル
グリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザ
イナー（designer）アミノ酸、たとえばβ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミ
ノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般にアミノ酸アナログが挙げられる。さ
らに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であってよい。

【００８２】 天然に存在しない変異体は当該技術分野で知られた突然変異誘発法を用いて製
造でき、該方法としては、これらに限られるものではないが、オリゴヌクレオチ
ド媒体突然変異誘発法、アラニンスキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発法、部位特
異的突然変異誘発法（たとえば、Carterら, Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986)
；およびZollerら、Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1982)を参照）、カセット突然
変異誘発法（たとえば、Wellsら、Gene 34: 315 (1985)を参照）、制限選択突然
変異誘発法（たとえば、Wellsら、Philos. Trans. R. Soc. London Ser A 317:
415 (1986)を参照）が挙げられる。

【００８３】 本発明はさらに、翻訳の際にまたは翻訳後に、たとえば糖付加、アセチル化、
リン酸化、アミド化、公知の保護基による誘導体化、タンパク質加水分解的開裂
、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などにより識別しうるように修飾し
たＫＧＦ−２ポリペプチドを包含する。多数の化学的修飾のいずれも、臭化シア
ン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ_４に
よる特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン
の存在下での代謝的合成などを含む（これらに限られるものでない）公知の方法
により行うことができる。

【００８４】 本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾としては、たとえば、Ｎ−結合
またはＯ−結合した炭水化物鎖、Ｎ−末端またはＣ−末端のプロセシング、アミ
ノ酸骨格への化学的残基の付加、Ｎ−結合またはＯ−結合した炭水化物鎖の化学
的修飾、および原核宿主細胞発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の付加
または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまた、酵素標識、蛍光標識、同位体標
識またはアフィニティー標識などの検出しうる標識で修飾してタンパク質の検出
および単離を可能とすることができる。

【００８５】 本発明によってさらに提供されるのは、ポリペプチドの増大した溶解性、安定
性および循環時間、または低減した免疫原性（米国特許第４,１７９,３３７号を
参照）などの付加的な利点を提供するＫＧＦ−２の化学的に修飾した誘導体であ
る。誘導体化のための化学的残基は、水溶性ポリマー、たとえばポリエチレング
リコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシ
メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどから選択できる。
ポリペプチドの修飾は、分子内のランダムな位置、または分子内の前以て決定し
た位置で行うことができ、１、２またはそれ以上の化学的残基の結合を含む。

【００８６】 ポリマーはいかなる分子量であってもよく、分枝していても分枝していなくて
もよい。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取扱いおよび製造
を容易にするため約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（「約」なる語は、ポリエチレン
グリコールの調製物において幾つかの分子は言及した分子量以上であり、別の分
子は該分子量未満であることを示す）の間である。所望の治療プロフィル（たと
えば、所望の徐放期間、生物学的な活性がある場合はその作用、取扱いの容易さ
、抗原性の程度または欠失、治療用タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の知られた作用）に依存して他のサイズを用いることができ
る。

【００８７】 たとえば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５０
０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００
、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、
９０００、９５００、１０,０００、１０,５００、１１,０００、１１,５００、
１２,０００、１２,５００、１３,０００、１３,５００、１４,０００、１４,５
００、１５,０００、１５,５００、１６,０００、１６,５００、１７,０００、
１７,５００、１８,０００、１８,５００、１９,０００、１９,５００、２０,０
００、２５,０００、３０,０００、３５,０００、４０,０００、５０,０００、
５５,０００、６０,０００、６５,０００、７０,０００、７５,０００、８０,０
００、８５,０００、９０,０００、９５,０００、または１００,０００ｋＤａの
分子量を有していてよい。

【００８８】 上記に記載したように、ポリエチレングリコールは分枝した構造を有していて
よい。分枝したポリエチレングリコールは、たとえば米国特許第５,６４３,５７
５号；Morpurgoら、Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 59-72 (1996); Vorobjev
ら、Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750 (1999)；およびCalicetiら、Bioc
onjug. Chem. 10: 638-646 (1999)（これらの各開示を参照のため本明細書に引
用する）に記載されている。

【００８９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的残基）のタンパク質への結合
は、該タンパク質の機能性ドメインまたは抗原性ドメインに及ぼす影響を考慮し
て行わなければならない。たとえば、ＥＰ０４０１３８４（参照のため本明細書
に引用する）（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）に記載されているものな
どの当業者に利用できる多くの結合方法が存在し、Malikら、Exp. Hematol. 20:
1028-1035 (1992)（トレシルクロライドを用いたＧＭ−ＣＳＦのペギル化（peg
ylation）を報告）をも参照のこと。たとえば、ポリエチレングリコールは遊離
のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性の基を介してアミノ酸残基により
共有結合させることができる。反応性の基とは、活性化したポリエチレングリコ
ール分子を結合させる基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては
、リジン残基およびＮ−末端アミノ酸残基が挙げられる；遊離のカルボキシル基
を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および
Ｃ−末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレング
リコール分子を結合させるための反応性の基として用いることができる。治療目
的のために好ましいのは、アミノ基での結合、たとえばＮ−末端またはリジン基
での結合である。

【００９０】 上記で示唆しように、ポリエチレングリコールは多くのアミノ酸残基のいずれ
かに結合させることによりタンパク質に結合させることができる。たとえば、ポ
リエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸
またはシステイン残基への共有結合によりタンパク質に結合させることができる
。１またはそれ以上の反応化学を用い、ポリエチレングリコールをタンパク質の
特定のアミノ酸残基（たとえば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸またはシステイン）またはタンパク質のアミノ酸残基のうちの１を超える
種類のもの（たとえば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
システインおよびそれらの組み合せ）に結合させることができる。

【００９１】 Ｎ−末端で化学的に修飾したタンパク質が特に望まれることがあるかもしれな
い。本発明の組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いると、様々なポ
リエチレングリコール分子（分子量、分枝の有無など）から、反応混合物中での
タンパク質（またはペプチド）に対するポリエチレングリコール分子の比率、行
うべきペギル化反応の種類、および選択したＮ−末端ペギル化タンパク質を得る
方法を選択することができる。Ｎ−末端ペギル化調製物を得る（すなわち、他の
モノペギル化されたものから必要に応じてこの調製物を分離する）方法は、ペギ
ル化したタンパク質分子の集団からＮ−末端がペギル化されたものを精製するこ
とによるものであってよい。Ｎ−末端修飾にて化学的に修飾した選択的なタンパ
ク質は、特定のタンパク質の誘導体化において利用できる異なる種類の（リジン
対Ｎ−末端）一次アミノ基の異なる反応性を利用する還元的アルキル化によって
達成できる。適当な反応条件下、Ｎ−末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘
導体化がカルボニル基含有ポリマーを用いて達成できる。

【００９２】 上記に記載したように、本発明のタンパク質のペギル化は多くの手段により達
成できる。たとえば、ポリエチレングリコールを該タンパク質に直接または介入
リンカーにより結合できる。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させる
ためのリンカーを用いない系が、Delgadoら、Crit. Rev. Thera. Drug Carrier
Sys. 9: 249-304 (1992); Francisら、Intern. J. of Hematol. 68: 1-18 (1998
); 米国特許第４,００２,５３１号；米国特許第５,３４９,０５２号；ＷＯ９５
／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各開示を参照のため本明
細書に引用する）に記載されている。

【００９３】 ポリエチレングリコールを介入リンカーなしでタンパク質のアミノ酸残基に直
接結合させるための一つの系ではトレシル化したＭＰＥＧを用い、該ＭＰＥＧは
トレシルクロライド（ＣｌＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３）を用いてモノメトキシポリエチ
レングリコール（ＭＰＥＧ）を修飾することにより製造する。タンパク質をトレ
シル化ＭＰＥＧと反応させるとポリエチレングリコールは該タンパク質のアミン
基に直接結合する。それゆえ、本発明は、本発明のタンパク質を２,２,２−トリ
フルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させる
ことにより製造したタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを包含
する。

【００９４】 ポリエチレングリコールはまた、多くの種々の介入リンカーを用いてタンパク
質に結合させることができる。たとえば、米国特許第５,６１２,４６０号（その
全開示を参照のため本明細書に引用する）はポリエチレングリコールをタンパク
質に連結するためのウレタンリンカーを開示している。ポリエチレングリコール
がタンパク質にリンカーによって結合したタンパク質−ポリエチレングリコール
コンジュゲートはまた、タンパク質をＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート
、１,１’−カルボニルジイミダゾールで活性化したＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２,４
,５−トリクロロフェニルカーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカー
ボネート、および種々のＭＰＥＧ−コハク酸誘導体などなどの化合物と反応させ
ることによって製造できる。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させる
ための多くのさらなるポリエチレングリコール誘導体および反応化学がＷＯ９８
／３２４６６（その全体を参照のため本明細書に引用する）に記載されている。
本明細書に記載した反応化学を用いて製造したペギル化タンパク質生成物は本発
明の範囲に包含される。

【００９５】 本発明の各タンパク質に結合するポリエチレングリコール残基の数（すなわち
、置換の程度）もまた様々であってよい。たとえば、本発明のペギル化タンパク
質は、平均して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７
、２０、またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に結合してよい。同様に
、置換の平均程度は、１−３、２−４、３−５、４−６、５−７、６−８、７−
９、８−１０、９−１１、１０−１２、１１−１３、１２−１４、１３−１５、
１４−１６、１５−１７、１６−１８、１７−１９、または１８−２０のポリエ
チレングリコール残基／タンパク質分子の範囲であってよい。置換の程度を決定
する方法は、たとえばDelgadoら、Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9: 24
9-304 (1992)で検討されている。

【００９６】ＫＧＦ−２欠失変異体 天然のＫＧＦ−２は水性状態において相対的に不安定であり、処理および貯蔵
の間に化学的および物理的な分解を受けて生物学的活性の喪失という結果となる
。天然のＫＧＦ−２はまた、水溶液中では上昇温度で凝集しやすく、酸性条件下
では不活化される。

【００９７】 特に好ましいＫＧＦ−２ポリペプチドは、以下に示す欠失変異体である（番号
付けはタンパク質の第一のアミノ酸（Ｍｅｔ）から開始）： Ｔｈｒ（残基３６）−−Ｓｅｒ（残基２０８） Ｃｙｓ（３７）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｇｌｎ（３８）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｌａ（３９）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｌｅｕ（４０）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｇｌｙ（４１）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｇｌｎ（４２）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｓｐ（４３）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｍｅｔ（４４）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｖａｌ（４５）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（４６）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｇｌｕ（４８）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｌａ（４９）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｔｈｒ（５０）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｓｎ（５１）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５２）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５３）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５４）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５５）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５６）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｐｈｅ（５７）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（５９）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（６２）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｇｌｙ（６４）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｒｇ（６５）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｖａｌ（６７）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｓｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８） Ｖａｌ（７７）−−Ｓｅｒ（２０８） Ａｒｇ（８０）−−Ｓｅｒ（２０８）

【００９８】 Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｈｉｓ（２０７） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｖａｌ（２０６） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｖａｌ（２０５） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｍｅｔ（２０４） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｐｒｏ（２０３） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｅｕ（２０２） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｐｈｅ（２０１） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｈｉｓ（２００） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｌａ（１９９） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｓｅｒ（１９８） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｔｈｒ（１９７） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｓｎ（１９６） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１９５） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１９４） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１９３） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｔｈｒ（１９２） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１９１） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１８８） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ａｒｇ（１８７） Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−−Ｌｙｓ（１８３）

【００９９】 好ましい態様としては、Ｎ末端欠失Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ（２０８）（Ｋ
ＧＦ−２Δ２８）およびＳｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８）（ＫＧＦ−２Δ３
３）が挙げられる。他の好ましいＮ末端およびＣ末端欠失変異体としては、Ａｌ
ａ（３９）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖａ
ｌ（７７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｕ（９３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌ
ｕ（１０４）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖａｌ（１２３）−−Ｓｅｒ（２０８）；
およびＧｌｙ（１３８）−−Ｓｅｒ（２０８）が挙げられる。他の好ましいＣ末
端欠失変異体としては、Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）またはＣｙｓ（３７）−
−Ｌｙｓ（１５３）が挙げられる。

【０１００】 さらに本発明に含まれるのは、Ｎ末端とＣ末端の両方でアミノ酸が欠失した欠
失変異体である。そのような変異体には、上記Ｎ末端欠失変異体とＣ末端欠失変
異体とのあらゆる組み合わせが含まれ、たとえば、Ａｌａ（３９）−−Ｈｉｓ（
２００）；Ｍｅｔ（４４）−−Ａｒｇ（１９３）、Ａｌａ（６３）−−Ｌｙｓ（
１５３）、Ｓｅｒ（６９）−−Ｌｙｓ（１５３）等が挙げられる。そのような組
み合わせは、当業者に知られた組換え法を用いて調製できる。

【０１０１】 それゆえ、本発明の医薬調合物に使用するのに好ましいＫＧＦポリペプチドは
、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の３８個のＮ末端アミノ酸残基を
欠失しているが（すなわち、少なくともＭｅｔ（１）−Ｇｌｎ（３８）の欠失）
最初の１４７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していない他は図１（配列番号
：２）に示すアミノ酸配列を含むものを含む、Ｎ−末端欠失変異体を包含する。
別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも
最初の３８個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが（すなわち、少なくともＭ
ｅｔ（１）−Ｇｌｎ（３８）の欠失）最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基まで
は欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発
明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端ア
ミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失し
ていないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合
物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残
基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失していない
であろう欠失を有する変異体を含む。

【０１０２】 別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくと
も最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端
アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態
様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の
７６個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸
残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様におい
て、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の９２個の
Ｎ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基まで
は欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発
明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の１０３個のＮ末端
アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失
していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調
合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の１２２個のＮ末端アミノ
酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸残基までは欠失してい
ないであろう欠失を有する変異体を含む。

【０１０３】 上記Ｎ末端欠失変異体の範囲を有するＫＧＦ−２変異体を含む調合物に加えて
、本発明はまた、上記範囲のすべての組み合わせ、たとえば、図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の６８個のＮ
末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初
の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個のＮ末端アミノ酸残基を超えな
い欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸
残基だが最初の９２個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１０３個の
Ｎ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最
初の６８個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個のＮ末端アミノ酸残基を超え
ない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の６８個のＮ末端アミノ
酸残基だが最初の９２個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号
：２）に示す少なくとも最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１０３個
のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも
最初の４６個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の６２個のＮ末端アミノ酸残基を超
えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端アミ
ノ酸残基だが最初の６８個のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番
号：２）に示す少なくとも最初の４６個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の７６個
のＮ末端アミノ酸残基を超えない欠失；等を有する調合物に関する。

【０１０４】 他の態様において、Ｃ末端欠失変異体を含む調合物が本発明により提供される
。好ましくは、該Ｃ末端欠失変異体のＮ末端アミノ酸残基は、図１（配列番号：
２）のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）、３６（Ｔｈｒ）または３７（Ｃｙｓ）である
。そのような変異体を含む調合物としては、図１（配列番号：２）に示す少なく
とも最後のＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ（２０８））を欠失しているが最後の５
５個のＣ末端アミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基Ｇｌｕ（１５４）−Ｓｅｒ
（２０８）の欠失）までは欠失していない他は図１（配列番号：２）に示すアミ
ノ酸配列を含むものを包含する。別の態様において、本発明の調合物は、図１（
配列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最
後の６５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変
異体を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示
す少なくとも１０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末
端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。

【０１０５】 別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくと
も２０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸
残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様におい
て、本発明の調合物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも３０個のＣ末端
アミノ酸残基を欠失しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失し
ていないであろう欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合
物は、図１（配列番号：２）に示す少なくとも４０個のＣ末端アミノ酸残基を欠
失しているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう
欠失を有する変異体を含む。別の態様において、本発明の調合物は、図１（配列
番号：２）に示す少なくとも５０個のＣ末端アミノ酸残基を欠失しているが最後
の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していないであろう欠失を有する変異
体を含む。

【０１０６】 上記Ｃ末端欠失変異体の範囲を有するＫＧＦ−２変異体を含む調合物に加えて
、本発明はまた、上記範囲のすべての組み合わせ、たとえば、図１（配列番号：
２）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基だが最後の１０個のＣ末端アミ
ノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ末端
アミノ酸残基だが最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配
列番号：２）に示す少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基だが最後の３０個のＣ
末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後
のＣ末端アミノ酸残基だが最後の４０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；
図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の１０個のＣ末端アミノ酸残基だが
最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示
す少なくとも最後の１０個のＣ末端アミノ酸残基だが最後の３０個のＣ末端アミ
ノ酸残基を超えない欠失；図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の１０個
のＣ末端アミノ酸残基だが最後の４０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；
図１（配列番号：２）に示す少なくとも最後の２０個のＣ末端アミノ酸残基だが
最後の３０個のＣ末端アミノ酸残基を超えない欠失；等を有する調合物に関する
。

【０１０７】 さらに他の態様において、ＫＧＦ−２ポリペプチドは、Ｎ末端残基およびＣ末
端残基の両方でアミノ酸が欠失した欠失変異体であってよい。そのような変異体
は、上記Ｎ末端欠失変異体とＣ末端欠失変異体とのすべての組み合わせを包含す
る。そのような変異体としては、図１（配列番号：２）に示す少なくとも最初の
４６個のＮ末端アミノ酸残基を欠失しているが最初の１３７個のＮ末端アミノ酸
残基までは欠失しておらず、かつ少なくとも最後のＣ末端アミノ酸残基を欠失し
ているが最後の５５個のＣ末端アミノ酸残基までは欠失していない他は図１（配
列番号：２）に示すアミノ酸配列を含むものを包含する。別の態様において、欠
失は、図１（配列番号：２）の少なくとも最初の６２個、６８個、７６個、９２
個、１０３個または１２２個のＮ末端アミノ酸残基だが最初の１３７個のＮ末端
アミノ酸残基を超えない欠失および図１の少なくとも最後の１０個、２０個、３
０個、４０個、または５０個のＣ末端アミノ酸残基だが最後の５５個のＣ末端ア
ミノ酸残基を超えない欠失を含んでいてよい。さらに、上記範囲の全ての組み合
せが包含される。

【０１０８】ＫＧＦ−２置換変異体 有用なＫＧＦ−２ポリペプチドにはアミノ酸置換を有するものが含まれる。天
然の成熟ＫＧＦ−２は４４個の荷電残基を含み、そのうち３２個は正の荷電を有
している。そのような残基のタンパク質の三次元構造中での位置に依存して、こ
れらクラスター（塊）を作った残基の１またはそれ以上を負の荷電または中性の
荷電を有するアミノ酸で置換することは隣接する残基との静電的相互作用を変化
させ、タンパク質の安定性の増大および凝集の低減を達成するのに有用である。
タンパク質の凝集は活性の喪失をきたすのみならず、医薬調合物を調製する際に
問題となる。なぜなら、そのような凝集は免疫原性であり得るからである（Pinc
kardら、Clin. Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967), Robbinsら、Diabetes 36: 8
38-845 (1987), Clelandら、Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10
: 307-377 (1993)）。いかなる修飾であろうと、タンパク質分子の三次元構造内
での電荷の反発を最小にすることを考慮しなければならない。それゆえ、特に興
味のもたれるのは、荷電アミノ酸を他の荷電アミノ酸および中性または負に荷電
したアミノ酸と置換することである。後者の置換では正の荷電の減少したタンパ
ク質となり、ＫＧＦ−２の特性が改善される。そのような改善には、天然のＫＧ
Ｆ−２タンパク質と比較してアナログの安定性が高くなり凝集が低減することが
含まれる。 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性をも変化させ得
る。Ostadeら、Nature 361: 266-268 (1993)は、２つの知られたＴＮＦレセプタ
ーの一方のみへのＴＮＦアルファの結合となるある種のＴＮＦアルファ変異体を
記載している。

【０１０９】 ＫＧＦ−２分子は、天然の変異かまたはヒトによる操作のいずれかにより、１
またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含んでいてよい。幾つかの
好ましい変異体の例としては：Ａｌａ（４９）Ｇｌｎ、Ａｓｎ（５１）Ａｌａ、
Ｓｅｒ（５４）Ｖａｌ、Ａｌａ（６３）Ｐｒｏ、Ｇｌｙ（６４）Ｇｌｕ、Ｖａｌ
（６７）Ｔｈｒ、Ｔｒｐ（７９）Ｖａｌ、Ａｒｇ（８０）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（８７
）Ａｒｇ、Ｔｙｒ（８８）Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（８９）Ｔｙｒ、Ｌｙｓ（９１）Ａｒ
ｇ、Ｓｅｒ（９９）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（１０２）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１０３（Ｇｌｕ）
、Ｇｌｕ（１０４）Ｍｅｔ、Ａｓｎ（１０５）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ（１０７）Ａｓｎ
、Ｓｅｒ（１０９）Ａｓｎ、Ｌｅｕ（１１１）Ｍｅｔ、Ｔｈｒ（１１４）Ａｒｇ
、Ｇｌｕ（１１７）Ａｌａ、Ｖａｌ（１２０）Ｉｌｅ、Ｖａｌ（１２３）Ｉｌｅ
、Ａｌａ（１２５）Ｇｌｙ、Ｉｌｅ（１２６）Ｖａｌ、Ａｓｎ（１２７）Ｇｌｕ
、Ａｓｎ（１２７）Ｇｌｎ、Ｔｙｒ（１３０）Ｐｈｅ、Ｍｅｔ（１３４）Ｔｈｒ
、Ｌｙｓ（１３６）Ｇｌｕ、Ｌｙｓ（１３７）Ｇｌｕ、Ｇｌｙ（１４２）Ａｌａ
、Ｓｅｒ（１４３）Ｌｙｓ、Ｐｈｅ（１４６）Ｓｅｒ、Ａｓｎ（１４８）Ｇｌｕ
、Ｌｙｓ（１５１）Ａｓｎ、Ｌｅｕ（１５２）Ｐｈｅ、Ｇｌｕ（１５４）Ｇｌｙ
、Ｇｌｕ（１５４）Ａｓｐ、Ａｒｇ（１５５）Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（１５７）Ｌｅｕ
、Ｇｌｙ（１６０）Ｈｉｓ、Ｐｈｅ（１６７）Ａｌａ、Ａｓｎ（１６８）Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ（１７０）Ｔｈｒ、Ａｒｇ（１７４）Ｇｌｙ、Ｔｙｒ（１７７）Ｐｈｅ
、Ｇｌｙ（１８２）Ｇｌｎ、Ａｌａ（１８５）Ｖａｌ、Ａｌａ（１８５）Ｌｅｕ
、Ａｌａ（１８５）Ｉｌｅ、Ａｒｇ（１８７）Ｇｌｎ（１９０）Ｌｙｓ、Ｌｙｓ
（１９５）Ｇｌｕ、Ｔｈｒ（１９７）Ｌｙｓ、Ｓｅｒ（１９８）Ｔｈｒ、Ａｒｇ
（１９４）Ｇｌｕ、Ａｒｇ（１９４）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ（１９１）Ｇｌｕ、Ｌｙｓ
（１９１）Ｇｌｎ、Ａｒｇ（１８８）Ｇｌｕ、Ａｒｇ（１８８）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ
（１８３）Ｇｌｕが挙げられる。

【０１１０】 上記表示において、たとえば、Ａｌａ（４９）Ｇｌｎは、図１（配列番号：２
）の位置４９のＡｌａがＧｌｎで置換されていることを意味する。 変化は、タンパク質の折り畳みや活性に有意の影響を及ぼさない保存的なアミ
ノ酸置換などのように最小の性質のものであるのが好ましい。当業者に知られた
保存的なアミノ酸置換の例は以下に挙げるとおりである： 芳香族アミノ酸：フェニルアラニン トリプトファン チロシン 疎水性アミノ酸：ロイシン イソロイシン バリン 極性アミノ酸： グルタミン アスパラギン 塩基性アミノ酸：アルギニン リジン ヒスチジン 酸性アミノ酸： アスパラギン酸 グルタミン酸 小さなアミノ酸：アラニン セリン トレオニン メチオニン グリシン

【０１１１】 もちろん、当業者が行うことのできるアミノ酸置換の数は、上記のものを含む
多くの因子に依存する。一般的にいって、所定のＫＧＦ−２ポリペプチドの置換
数は、目的に依存して５０、４０、３０、２０、１０、５、または３を超えない
であろう。たとえば、安定性を改善するため、所定数の置換をＫＧＦ−２のＣ末
端で行うことができる。

【０１１２】 ＫＧＦ−２中のアミノ酸で機能にとって本質的なものの同定は、部位特異的突
然変異誘発やアラニンスキャニング突然変異誘発などの当該技術分野でよく知ら
れた方法により行うことができる（CunninghamおよびWells, Science 244: 1081
-1085 (1989)）。後者の方法は、分子中の各残基に単一のアラニン変異を導入す
るものである。ついで、得られた変異体分子をレセプター結合性やインビトロお
よびインビボ増殖活性などの生物学的活性について試験する。（たとえば、実施
例１を参照）。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気
共鳴または光親和性標識などの構造分析によっても決定できる（たとえば、Smit
hら、J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992);およびde Vosら、Science, 255: 306
-312 (1992)を参照）。

【０１１３】 他の有用なＫＧＦポリペプチドは、アミノ酸位置３７および１０６および１５
０のシステインの代わりにセリンの置換を有するポリペプチドを含む。奇数のシ
ステインは、少なくとも一つのシステイン残基がタンパク質の所望でない三次元
構造をとることを引き起こし得る分子間架橋または結合に利用されることを意味
する。１またはそれ以上のシステインがセリンまたはたとえばアラニンによって
置換された新規なＫＧＦ−２タンパク質は、一般に可溶性で正しく折り畳まれた
タンパク質として高収率で精製される。理論に拘泥されることを意図するもので
はないが、位置１０６のシステイン残基が機能にとって重要であると思われる。
このシステイン残基は他のすべてのＦＧＦファミリーの成員のなかでも高度に保
存されている。

【０１１４】 さらなるＫＧＦ−２ポリペプチドが、１９９５年２月１４日に出願したＰＣＴ
／ＵＳ９５／０１７９０、１９９５年６月５日に出願した米国特許出願第０８／
４６１,１９５号、１９９６年８月１３日に出願した同第０８／６９６,１３５号
、１９９６年８月１３日に出願した同第６０／０２３,８５２号、１９９７年２
月２８日に出願した同第６０／０３９,０４５号、１９９７年５月２３日に出願
した同第０８／８６２,４３２号、１９９７年８月１３日に出願した同第６０／
０５５,５６１号、１９９７年８月１３日に出願した同第０８／９１０,８７５号
、１９９８年２月１３日に出願した同第０９／０２３,０８２号、１９９９年７
月１日に出願した同第０９／３４５,３７３号、１９９９年７月２日に出願した
同第６０／１４２,３４３号、１９９９年７月１４日に出願した同第６０／１４
３,６４８号、１９９９年７月１５日に出願した同第６０／１４４,０２４号、１
９９９年８月１２日に出願した同第６０／１４８,６２８号、１９９９年９月２
４日に出願した同第６０／１４９,９３５号、１９９９年１１月３日に出願した
同第６０／１６３,３７５号、１９９９年１２月２２日に出願した同第６０／１
７１,６７７号、および２０００年４月１９日に出願した同第６０／１９８,３２
２号に記載されている。

【０１１５】ＫＧＦ−２ポリペプチド組成物の治療学的使用 本発明のポリペプチドは、角質細胞の成長および増殖を刺激する。従って、本
発明の組成物は、創傷の治癒を目的として上皮細胞の増殖および基底角質細胞を
刺激するため、および毛髪の毛包産生の刺激および真皮創傷の治癒のために用い
ることができる。これら創傷は表面的な性質のものであってよいが、深部のもの
で皮膚の真皮および上皮の損傷が関わるものであってもよい。 ＫＧＦ−２は多くの疾患および状態を治療するのに有用である。たとえば、Ｋ
ＧＦ−２は、種々の創傷治癒モデルにおいてインビトロおよびインビボで活性で
ある。１９９７年８月１３日に出願された米国特許出願第０８／９１０,８７５
号および１９９８年２月１３日に出願された同第０９／０２３,０８２号を参照
。

【０１１６】 ＫＧＦ−２を投与する個体は、通常の速度で創傷を治癒するかまたは治癒が損
なわれていてよい。治癒が損なわれていない個体に投与する場合には、ＫＧＦ−
２は通常の治癒プロセスを促進するために投与する。治癒が損なわれた個体に投
与する場合には、ＫＧＦ−２は、さもなければゆっくりとしか治癒しないかまた
は全く治癒しない創傷の治癒を容易にするために投与する。多くの苦痛や状態が
治癒力を損なう結果となりうる。これら苦痛および状態としては、糖尿病（たと
えば、II型糖尿病）、ステロイド剤および非ステロイド剤の両者での治療、およ
び虚血性の遮断阻害または傷害が挙げられる。

【０１１７】 多くの増殖因子が治癒の損なわれた個体において創傷治癒を促進することが示
されている。これら増殖因子としては、成長ホルモン放出因子、血小板由来増殖
因子、および塩基性繊維芽細胞増殖因子が挙げられる。それゆえ、本発明は、１
またはそれ以上のさらなる増殖因子または創傷治癒を促進する他の薬剤とともに
ＫＧＦ−２組成物を投与することをも包含する。 本発明の組成物はまた、通常の速度で治癒する個体および治癒の損なわれた個
体の両者において外科的手順により引き起こされた吻合その他の創傷の治癒をも
促進する。 本発明の組成物はまた、細胞、たとえば、筋肉細胞、神経組織を構成する細胞
、前立腺細胞、および肺細胞の分化を刺激するために用いることができる。

【０１１８】 本発明の組成物は、通常の個体および異常な創傷治癒を誘発する状態、たとえ
ば、尿毒症、栄養不良、ビタミン不足、肥満、感染、免疫抑制、およびステロイ
ド剤、放射線療法、および抗新生物剤および代謝拮抗物質による全身的治療に付
随する合併症にさらされた個体において、外科的創傷、切開創傷、真皮および上
皮の損傷を含む深部の創傷、眼組織の創傷、歯科組織の創傷、口腔創傷、糖尿病
性潰瘍、真皮の潰瘍、肘の潰瘍、動脈の潰瘍、静脈欝血性潰瘍、および熱または
冷の極端な温度への暴露、または化学物質への暴露の結果としての火傷を含む創
傷の創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用である。本発明の組成物はまた、虚血
および虚血傷害に付随する障害、たとえば、静脈循環系復帰および／または不足
の傷害によって引き起こされる慢性の静脈足潰瘍（venous leg ulcers）の治癒
の促進のため；真皮の喪失後の真皮の再確立の促進のため；表皮の引っ張り強さ
および表皮の厚さを増加させるため；および皮膚移植片の創傷床への付着の増大
および創傷床からの再上皮形成の刺激のためにも有用である。

【０１１９】 ＫＧＦ−２ポリペプチドの他の治療的用途としては、これに限られるものでは
ないが、火傷および皮膚欠損、たとえば乾癬や表皮水泡症などを治療する目的で
上皮細胞増殖および基底角質細胞を刺激することが挙げられる。ＫＧＦ−２は、
皮膚移植片の創傷床への付着を増大させるため、および該創傷床からの再上皮形
成を刺激するために用いることができる。ＫＧＦ−２はまた、放射線照射、化学
療法およびウイルス感染の結果生じる消化管毒性の副作用を低減するために用い
ることもできる。ＫＧＦ−２は、肝臓、肺、腎臓、乳房、膵臓、胃、小腸、およ
び大腸の疾患および状態を治療するのに用いることができる。ＫＧＦ−２は、炎
症性腸疾患、糖尿病、血小板減少症、低フィブリノーゲン血症、低アルブミン血
症、低グロブリン血症（hypoglobulinemia）、出血性膀胱炎、口内乾燥症、乾性
角結膜炎の治療に用いることができる。ＫＧＦ−２は、唾液腺、涙腺の上皮細胞
を刺激するため、および副鼻腔の再上皮形成および鼻粘膜の増殖を刺激するため
に用いることができる。 本発明の組成物により治療しうる他の多くの適応症は、米国特許出願第０８／
９１０,８７５号および同第０９／０２３,０８２号（参照のため本明細書に引用
する）に記載してある。

【０１２０】 本発明は、ＫＧＦ−２およびその欠失変異体の新規な液体および凍結乾燥調合
物に関する。本発明はさらに、ＫＧＦ−２の調合物の治療目的の使用に関する。
本発明の調合物は活性なＫＧＦ−２ポリペプチドに優れた安定性を付与し、幾つ
かの場合には該ポリペプチドの創傷治癒活性を強化し劇的に増大させる。 本明細書において「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物（ヒトニザル（ap
es）、ウシ、ウマ、ブタ、イノシシ、ヒツジ、齧歯類、ヤギ、イヌ、ネコ、ニワ
トリ、サル、ウサギ、ケナガイタチ（ferrets）、クジラ、およびイルカなど）
を意味し、さらに好ましくはヒトを意味する。

【０１２１】 本発明の調合物に用いるＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン
を有していても有していなくてもよいが、該ポリペプチドはＮ末端メチオニンを
欠いているのが好ましい。本発明のＫＧＦ−２ポリペプチド調合物の安定性は、
以下に記載する増殖アッセイにより決定される。 ＫＧＦ−２の他の治療的用途は、１９９８年２月１３日に出願した米国特許出
願第６０／０７４,５８５号、１９９８年１２月３０日に出願した同第６０／１
１４,４８４号、および１９９９年２月１２日に出願した同第０９／２４８,９９
８号（その全体を参照のため本明細書に引用する）に記載されている。

【０１２２】角質細胞増殖アッセイ 皮膚角質細胞は、皮膚の表皮に存在する細胞である。皮膚内での角質細胞の増
殖および拡張は創傷治癒の重要なプロセスである。それゆえ、角質細胞の増殖ア
ッセイは、角質細胞の増殖、従って創傷治癒を刺激するうえでのタンパク質活性
の価値ある指標である。 しかしながら、角質細胞をインビトロで増殖させるのは困難である。角質細胞
株はわずかしか存在しない。これら細胞株は、種々の細胞性および遺伝性の欠陥
を有する。細胞性の欠陥、たとえば基本的な増殖因子レセプターの喪失や基本的
な増殖因子の増殖への依存により本アッセイが錯綜することを避けるため、一次
皮膚角質細胞を本アッセイのために選択する。これら一次角質細胞はClonetics,
Inc.（サンジエゴ、カリフォルニア）から入手する。

【０１２３】 ＫＧＦ−２ポリペプチドの生物学的活性は、繊維芽細胞増殖因子2iiibレセプ
ター（ＦＧＦＲ2iiib）をトランスフェクションしてあるマウスＢａｆ３ ２ｂ細
胞を用いた細胞増殖アッセイにより決定することができる。細胞の増殖は、以下
に記載するように細胞を該タンパク質に暴露した後に［メチル−^３Ｈ］−チミジ
ンの導入により測定する。アッセイは、各ウエルに約２２,０００個のＢａｆ３
２ｂ細胞を入れた９６ウエル組織培養クラスタープレート中で行う。細胞を種々
の濃度のＫＧＦ−２ポリペプチドに３回ずつ曝し、ＣＯ_２インキュベーター中で
３７℃にて４８時間インキュベートする。ついで、標識チミジンを含む適当な量
の細胞培地を各ウエルに加え、インキュベーションをさらに５時間続ける。つい
で、細胞をセルハーベスターを用いて９６ウエルフォーマットにてガラス繊維フ
ィルターマット上に回収する。フィルターマットを乾燥させ、各試料に導入され
た放射能をフラット−ベッド液体シンチレーションカウンターを用いてカウント
する。このようなアッセイ条件下において、ＫＧＦ−２に暴露された細胞は、プ
ラセボ緩衝液の適当な希釈液かまたは単にリン酸緩衝食塩水のいずれかで処理し
た対照細胞と比較して増大した放射能の導入を示す。

【０１２４】 他の有用な角質細胞増殖アッセイは、Alamar Blueを用いるものである。Alama
r Blueは、培地に添加したときにミトコンドリアによって代謝される成育可能な
青色染料である。ついで、この染料は組織培養上澄み液中で赤変する。赤色染料
の量は、５７０ｎｍと６００ｎｍとの間の光学密度の差異を読み取ることにより
直接定量できる。この読み取りは、細胞の活性および細胞数を反映する。

【０１２５】 正常な一次皮膚角質細胞（ＣＣ−０２５５、ＮＨＥＫ−Ｎｅｏプールしたもの
）をClonetics, Inc.から購入する。これら細胞は継代２である。角質細胞を８
０％のコンフルエンシーに達するまで完全角質細胞増殖培地（ＣＣ−３００１、
ＫＧＭ；Clonetics, Inc.）中で増殖させる。細胞を製造業者の指示に従ってト
リプシン処理する。簡単に説明すると、細胞をハンクスの平衡塩類溶液で２回洗
浄する。２〜３ｍｌのトリプシンを細胞に室温にて約３〜５分間加える。トリプ
シン中和溶液を加え、細胞を回収する。細胞を６００×ｇにて室温で５分間回転
させ、前以て温めた培地を用いて１ｃｍ^２当たり３,０００細胞にて新たなフラ
スコにプレーティングする。

【０１２６】 増殖アッセイのため、最外列を除いて完全培地中のコーニング平底９６ウエル
プレートの各ウエル当たり１,０００〜２,０００個の角質細胞をプレーティング
する。外側のウエルには２００μｌの滅菌水を満たす。このことにより、ウエル
の温度および湿度の変動を最小限に保持することができる。細胞を３７℃にて一
夜、５％ＣＯ_２を用いて増殖させる。細胞を角質細胞基本培地（ＣＣ−３１０１
、ＫＢＭ、Clonetics, Inc.）で２回洗浄し、１００μｌのＫＢＭを各ウエルに
加える。２４時間インキュベートする。増殖因子をＫＢＭで系列希釈により希釈
し、１００μｌを各ウエルに加える。ＫＧＭを正の対照として、ＫＢＭを負の対
照として用いる。各濃度の時点について６つのウエルを用いる。２〜３日インキ
ュベートする。インキュベーションの終了時点で細胞をＫＢＭで１回洗浄し、１
０％ｖ／ｖのalamar Blueを培地中で前以て混合したＫＢＭの１００μｌを加え
る。ＫＧＭの正の対照で培地の赤変が始まるまで６〜１６時間インキュベートす
る。プレートをプレートリーダーに直接置くことにより、Ｏ.Ｄ.５７０ｎｍマイ
ナスＯ.Ｄ.６００ｎｍを測定する。

【０１２７】ＫＧＦ−２欠失変異体の構築 本発明の組成物に使用するのに有用な欠失変異体は以下のプロトコールにより
構築することができる。 欠失変異体の構築を、最適化ＫＧＦ−２構築物を鋳型として用いてＫＧＦ−２
遺伝子の５'末端および３'末端から行った。欠失は、大腸菌での発現にマイナス
に影響するかもしれない遺伝子の領域に基づいて選択した。５'欠失に関しては
、以下に列挙したプライマーを５'プライマーとして用いた。これらプライマー
は、示した制限部位および開始メチオニンをコードするＡＴＧを含んでいる。Ｋ
ＧＦ−２（ＦＧＦ−１２）２０８アミノ酸３'ＨｉｎｄIIIプライマーを３'プラ
イマーとして用いた。２５サイクルのＰＣＲ増幅を標準条件を用いて行った。Ｋ
ＧＦ−２ ３６アミノ酸／２０８アミノ酸欠失変異体の生成物を５'部位について
はＢｓｐＨＩ制限し、３'部位についてはＨｉｎｄIII制限し、ＢｓｐＨＩおよび
ＨｉｎｄIIIで消化したｐＱＥ６０中にクローニングした。他のすべての生成物
は、５'制限酵素についてはＮｃｏＩで制限し、３'部位についてはＨｉｎｄIII
制限し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIで消化したｐＱＥ６０中にクローニングし
た。

【０１２８】 ＫＧＦ−２（ＦＧＦ−１２）３６アミノ酸／１５３アミノ酸および１２８アミ
ノ酸については、３'ＨｉｎｄIIIを３'プライマーとして用い、ＦＧＦ−１２ ３
６アミノ酸／２０８アミノ酸を５'プライマーとして用いた。ＦＧＦ−１２ ６２
アミノ酸／１５３アミノ酸、１２８アミノ酸については、３'ＨｉｎｄIIIを３'
プライマーとして用い、ＦＧＦ−１２ ６２アミノ酸／２０８アミノ酸を５'プラ
イマーとして用いた。得られたクローンの命名は、欠失の結果得られるポリペプ
チドの最初と最後のアミノ酸を示している。たとえば、ＫＧＦ−２ ３６アミノ
酸／１５３アミノ酸は、該欠失変異体の最初のアミノ酸がＫＧＦ−２のアミノ酸
３６であり、最後のアミノ酸がアミノ酸１５３であることを示している。これら
ＫＧＦ−２欠失変異体の構築もまた、米国特許出願第０８／９１０,８７５号お
よび同第０９／０２３,０８２号（参照のため本明細書中に引用する）に記載し
てある。さらに、以下に示すように、各変異体はＮ末端のメチオニンが付加して
いる。しかしながら、本発明による調合物に用いるＫＧＦ−２欠失ポリペプチド
はＮ末端メチオニンを有していても有していなくてもよく、該ポリペプチドはＮ
末端メチオニンを欠いているのが好ましいであろう。

【０１２９】 欠失プライマーの配列：ＦＧＦ１２ ３６アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＢｓｐｈＩ ＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＴ
ＣＡＧＧＡＣ（配列番号：３）ＦＧＦ１２ ６３アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＴＴＣＧ（配
列番号：４）ＦＧＦ１２ ７７アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧ（
配列番号：５）ＦＧＦ１２ ９３アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴ
Ｃ（配列番号：６）ＦＧＦ１２ １０４アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＧＡＧＣ（
配列番号：７）ＦＧＦ１２ １２３アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡ
ＡＣ（配列番号：８）ＦＧＦ１２ １３８アミノ酸／２０８アミノ酸： ５'ＮｃｏＩ ＧＧＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡ
ＡＡＧ（配列番号：９）ＦＧＦ１２ ３'ＨｉｎｄIII： （上記すべての欠失クローンに使用） ＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧＡＡ
Ｇ（配列番号：１０）ＦＧＦ１２ ３６アミノ酸／１５３アミノ酸： ５'ＢｓｐｈＩ（上記） ３'ＨｉｎｄIII ＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＡＣＡ
ＧＴＣＡＴＴＧＴ（配列番号：１１）ＦＧＦ１２ ６３アミノ酸／１５３アミノ酸： ５'ＮｃｏＩおよび３'ＨｉｎｄIII上記。

【０１３０】Ｎ末端欠失変異体ＫＧＦ−２Δ３３の構築 ｐＱＥ６中でのＫＧＦ−２Δ３３の構築 複製連鎖反応指向増幅および大腸菌タンパク質発現ベクターｐＱＥ６中へのＫ
ＧＦ−２Δ３３のサブクローニングを行うため、ＫＧＦ２の所望の領域に相補的
な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（５９５２および１９１３８）を以下の
塩基配列にて合成した。 プライマー５９５２：５'ＧＣＧＧＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＧＴＧ３'（配列番号：１２） プライマー１９１３８：５'ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣ
ＡＣＣＡＴ３'（配列番号：１３）

【０１３１】 Ｎ末端プライマー（５９５２）の場合はＡｆｌIII制限部位を導入し、一方、
Ｃ末端プライマー（１９１３８）の場合はＨｉｎｄIII制限部位を導入した。プ
ライマー５９５２はまたＡＴＧ配列をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレ
ームにて含むことによってクローニング断片の大腸菌での翻訳を可能とし、一方
、プライマー１９１３８は２つの停止コドン（大腸菌で優先的に用いられるもの
）をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレームにて含むことによって大腸菌
での正しい翻訳停止を確実にする。 複製連鎖反応は、当業者によく知られた標準的条件および鋳型として成熟ＫＧ
Ｆ−２（アミノ酸３６〜２０８）のヌクレオチド配列を用いて行った。得られた
アンプリコン（amplicon）をＡｆｌIIIおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＮｃｏＩ／
ＨｉｎｄIII消化したｐＱＥ６タンパク質発現ベクター中にサブクローニングし
た。

【０１３２】ｐＨＥ１中でのＫＧＦ−２Δ３３の構築 複製連鎖反応指向増幅および大腸菌発現ベクターｐＨＥ１中へのＫＧＦ−２Δ
３３のサブクローニングを行うため、ＫＧＦ２の所望の領域に相補的な２つのオ
リゴヌクレオチドプライマー（６１５３および６１５０）を以下の塩基配列にて
合成した。 プライマー６１５３：５'ＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡ
ＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧ３'（配列番号：１４） プライマー６１５０：５'ＣＣＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＡＴＧＡＧＴＧＴ
ＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧ３'（配列番号：１５）

【０１３３】 Ｎ末端プライマー（６１５３）の場合はＮｄｅＩ制限部位を導入し、一方、Ｃ
末端プライマー（６１５０）の場合はＡｓｐ７１８制限部位を導入した。プライ
マー６１５３はまたＡＴＧ配列をＫＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレーム
にて含むことによってクローニング断片の大腸菌での翻訳を可能とし、一方、プ
ライマー６１５０は２つの停止コドン（大腸菌で優先的に用いられるもの）をＫ
ＧＦ２コード領域に隣接しかつインフレームにて含むことによって大腸菌での正
しい翻訳停止を確実にする。 複製連鎖反応は、当業者によく知られた標準的条件および鋳型として成熟ＫＧ
Ｆ−２（アミノ酸３６〜２０８）のヌクレオチド配列を用いて行った。得られた
アンプリコンをＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、ＮｄｅＩ／Ａｓｐ７１８
消化したｐＨＥ１タンパク質発現ベクター中にサブクローニングした。

【０１３４】ＫＧＦ−２Δ３３のヌクレオチド配列 ＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
ＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ
ＡＴＣＧＡＡＡＡ ＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧ
ＣＣＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＡＡＴ
ＣＧＧＡＧＴＴＧ ＴＴＧＣＣＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴＴＡＧ
ＣＣＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡ Ａ
ＧＡＡＴＴＴＡＡＣ ＡＡＴＧＡＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴ
ＡＡＴＧＧＧＡＧ ＧＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＣＣ
ＡＡＧＧ ＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＣＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴ
ＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＴＣＡＴＡＡ（配列番号：
１６）

【０１３５】ＫＧＦ−２Δ３３のアミノ酸配列 ＭＳＹＮＨＬＱＧＤＶＲＷＲＫＬＦＳＦＴＫＹＦＬＫＩＥＫＮＧＫＶＳＧＴＫＫ
ＥＮＣＰＹＳＩＬＥＩＴＳＶＥＩＧＶＶＡＶＫＡＩＮＳＮＹＹＬＡＭＮＫＫＧＫ
ＬＹＧＳＫＥＦＮＮＤＣＫＬＫＥＲＩＥＥＮＧＹＮＴＹＡＳＦＮＷＱＨＮＧＲＱ
ＭＹＶＡＬＮＧＫＧＡＰＲＲＧＱＫＴＲＲＫＮＴＳＡＨＦＬＰＭＶＶＨＳ（配列
番号：１７）

【０１３６】Ｂ．最適化ＫＧＦ−２Δ３３ポリヌクレオチド配列の構築 大腸菌中でのＫＧＦ−２Δ３３の発現レベルを増加させるため、全遺伝子のコ
ドンを大腸菌で最もしばしば用いられているものに適合させるべく最適化した。
ＫＧＦ２Δ３３を生成するのに利用した鋳型はＮ末端領域内でコドン最適化して
あったので、Ｃ末端アミノ酸（８４〜２０８）を最適化する必要があった。

【０１３７】 まず、アミノ酸１７２〜２０８をコドン最適化してＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２
−２０８）を生成した。このことは、重複ＰＣＲ戦略により達成した。オリゴヌ
クレオチドＰＭ０７およびＰＭ０８（アミノ酸１７２〜２０８に対応）を混合し
、７０℃に加熱しついで３７℃に冷却することにより一緒にアニールした。つい
で、アニールしたオリゴヌクレオチドを標準ＰＣＲ反応（プライマーＰＭ０９お
よびＰＭ１０により指令される）に鋳型として用いた。当業者によく知られた標
準的な条件に従いかつ鋳型としてＫＧＦ２Δ３３を用いた別のＰＣＲ反応におい
て、オリゴヌクレオチドＰＭ０５（ＫＧＦ２のコード領域内のＰｓｔＩ部位と重
複している）およびＰＭ１１を用いてアミノ酸８４〜１７２に対応するＫＧＦ２
の領域を増幅させた。

【０１３８】 第三のＰＣＲ反応において、第一のＰＣＲ反応の生成物（コドン最適化したア
ミノ酸１７２〜２０８に対応）と第二のＰＣＲ反応の生成物（コドンを最適化し
ていないアミノ酸８４〜１７２に対応）とを混合し、オリゴヌクレオチドＰＭ０
５およびＰＭ１０により指令された標準ＰＣＲ反応の鋳型として用いた。得られ
たアンプリコンをＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII消化
したｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３中にサブクローニングして対応のコドン最適化して
いない領域を置換し、ｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２−２０８）を生成した
。

【０１３９】 ＫＧＦ２のコドン最適化を完成させるため、アミノ酸８４〜１７２に対応する
ＫＧＦ２の領域についてコドン最適化した合成遺伝子を重複オリゴヌクレオチド
を利用して作成した。４つのオリゴヌクレオチド（ＰＭ３１、ＰＭ３２、ＰＭ３
３およびＰＭ３４）を混合し、以下のＰＣＲを７サイクル行った：９４℃、３０
秒；４６.５℃、３０秒；および７２℃、３０秒。

【０１４０】 ついで、プライマーＰＭ３５およびＰＭ３６により指令された第二のＰＣＲ反
応を、１μｌの第一のＰＣＲ反応物を鋳型として用いて標準手順により行った。
ついで、得られたコドン最適化した遺伝子断片をＰｓｔＩ／ＳａｌＩで消化し、
ＰｓｔＩ／ＳａｌＩ消化したｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３（ｓ１７２−２０８）中に
サブクローニングして完全に最適化されたＫＧＦ２コード遺伝子であるｐＱＥ６
ＫＧＦ２Δ３３ｓを生成した。 別の大腸菌タンパク質発現ベクターを生成するため、ｐＱＥ６ＫＧＦ２Δ３３
ｓ上でプライマーＰＭ１０２およびＰＭ１３０を用いてＫＧＦ２Δ３３ｓをＰＣ
Ｒ増幅させた。得られたアンプリコンをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、Ｎ
ｄｅＩおよびＡｓｐ７１８（平滑末端化）で消化しておいたｐＨＥ１発現ベクタ
ー中にサブクローニングしてｐＨＥ１Δ３３ｓを生成した。

【０１４１】 コドン最適化したＫＧＦ−２Δ３３ｓの構築に用いたオリゴヌクレオチド配列
：ＰＭ０５ ：ＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号：１８）ＰＭ０７ ：ＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧ
ＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣ
ＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ（配列番号：１９）ＰＭ０８ ：ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＧ
ＣＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＴＴＴ
ＣＴＧＡＣＣＡＣＧ（配列番号：２０）ＰＭ０９ ：ＧＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴ（配列番号：２１
）ＰＭ１０ ：ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号：２２）ＰＭ１１ ：ＧＣＣＡＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴ（配列番号：２３
）ＰＭ３１ ：ＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴ
ＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧ（配列番号：２４）

【０１４２】ＰＭ３２ ：ＡＧＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＡＣＧ
ＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴＡＣＧＧＧＣＡＧＴＴＴＴＣＴ
ＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣ（配列番号：２５）ＰＭ３３ ：ＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＣＣＡ
ＡＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＴ
ＡＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣ（配列番号：２６）ＰＭ３４ ：ＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣ
ＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＴＡＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＡＴＡＣＧＴＴＣＴＴＴ
ＣＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＣＧＴＴＧＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＣ（配列
番号：２７）ＰＭ３５ ：ＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧ（配列番号：
２８）ＰＭ３６ ：ＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ（配列番号
：２９）ＰＭ１０２ ：ＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣ
ＴＧＣＡＧＧ（配列番号：３０）ＰＭ１３０ ：ＣＧＣＧＣＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣ
ＡＴＴＧ（配列番号：３１）

【０１４３】ＫＧＦ−２Δ３３（ｓ１７２−２０８）のヌクレオチド配列 ： ＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＧ
ＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ
ＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＡ
ＧＡＡＡＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＴＣＣ
ＧＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣ
ＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡ
ＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＡＡＡ
ＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＣ
ＴＡＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡ
ＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＧＴ
ＣＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴ
ＣＡＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡ（配列番号：
３２）

【０１４４】ＫＧＦ−２Δ３３（ｓ１７２−２０８）のアミノ酸配列 ： ＭＳＹＮＨＬＱＧＤＶＲＷＲＫＬＦＳＦＴＫＹＦＬＫＩＥＫＮＧＫＶＳＧＴＫＫ
ＥＮＣＰＹＳＩＬＥＩＴＳＶＥＩＧＶＶＡＶＫＡＩＮＳＮＹＹＬＡＭＮＫＫＧＫ
ＬＹＧＳＫＥＦＮＮＤＣＫＬＫＥＲＩＥＥＮＧＹＮＴＹＡＳＦＮＷＱＨＮＧＲＱ
ＭＹＶＡＬＮＧＫＧＡＰＲＲＧＱＫＴＲＲＫＮＴＳＡＨＦＬＰＭＶＶＨＳ（配列
番号：３３）

【０１４５】実施例 実施例１ ＫＧＦ−２液体調合物 以下の成分を混合して液体ＫＧＦ−２Δ３３調合物（該調合物は液体であり、
−２０℃で貯蔵する）を生成した。 ２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、 ２０ｍＭの酢酸ナトリウム、 １２５ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 水、ｐＨ６.２。 この調合物は、２〜８℃またはそれ以下での貯蔵条件で１０ヶ月までそのイン
ビトロでの生物学的活性を保持した。１０ヶ月目の生物学的活性を図３に示す。
この調合物は、またはそれ以下での貯蔵条件で１１ヶ月までそのすべての物理化
学的特性を保持した。

【０１４６】 生物学的活性は以下の細胞増殖アッセイを用いて測定した。ＢａＦ３細胞を、
１０％ＮＢＣＳ、１０％ＷＥＨＩ細胞ならし培地、２ｍＭグルタミン、６００μ
ｇ／ｍｌのGENETICIN、１μｌのβメルカプトエタノール／５００ｍｌ増殖培地
、５０単位のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地中で常法通り増殖させ維持した（Ornitz, D., M.ら（1996）、
J. Biol. Chem. 271: 15292-15297）。細胞増殖アッセイのため、ＢａＦ３細胞
を遠心分離により回収し、基本培地（このものは増殖培地と同じ組成を有してい
るが、ＷＥＨＩならし培地は含まず、１μｇ／ｍｌのヘパリンを補足してあった
）で洗浄した。

【０１４７】 この操作の後、細胞を基本培地中に再浮遊させ、２２,０００細胞／１８０μ
ｌを９６ウエル細胞培養クラスターディッシュのウエルにプレーティングした。
別の９６ウエルプレートでＫＧＦ２の適当な希釈（必要な最終濃度よりも１０×
高い）をＰＢＳ中で行い、上記細胞に２００μｌの最終容量にて加えた。細胞プ
レートを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で３６〜４０時間インキュベー
トし、５０μｌの基本培地中の０.５μＣｉメチル−^３Ｈチミジンを各ウエルに
加えた。プレートをインキュベーター中でさらに５時間インキュベートし、Tomt
ec Harvester 96を用いてガラス繊維フィルター上で濾過することにより細胞を
回収した。導入されたチミジンをWallace βプレートシンチレーションカウンタ
ーでカウントした。

【０１４８】実施例２ ＫＧＦ−２凍結乾燥調合物 以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３凍結乾燥調合物を生成した。 １０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、 １０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 ２０ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 ７％ｗ／ｖのショ糖、 水（凍結乾燥により除かれる） ｐＨ６.２ この調合物は、４５℃またはそれ以下での貯蔵条件で９ヶ月までそのインビト
ロでの生物学的活性を保持した。９ヶ月目の生物学的活性を図４に示す。生物学
的活性の測定は実施例１に詳記した細胞増殖アッセイを用いて行った。逆相ＨＰ
ＬＣは、この調合物が、４５℃またはそれ以下の温度および７５％の相対湿度で
８ヶ月までその物理化学的特性を保持したことを示した。

【０１４９】実施例３ 増粘調合物中のＫＧＦ−２ 以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３増粘調合物を生成した。 ２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、 １０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 ２０ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 ７％ｗ／ｖのショ糖、 １.２５％のカルボキシメチルセルロース、 水 ｐＨ６.２。 この調合物は、ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドをカルボキシメチルセルロース
溶液に加えて調製する。得られた調合物の粘度は、回転紡錘粘度計により測定し
たところ約２５０ｃｐｓであった。ＫＧＦ−２ポリペプチドはカルボキシメチル
セルロースの存在下で生物学的活性を保持した。この調合物の生物学的活性を実
施例１に詳記した細胞増殖アッセイを用いてアッセイした。

【０１５０】実施例４ ゲル調合物中のＫＧＦ−２ 以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３ゲル調合物を生成した。 ２ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、 １０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 ２０ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 ７％ｗ／ｖのショ糖、 １６％のPluronic F127、 水 ｐＨ６.２ ＫＧＦ−２Δ３３をPluronic溶液に約２℃〜約８℃にて加える。得られた溶液
の粘度は２０℃で約５０ｃｐｓであり、約３７℃で固化した。ＫＧＦ−２は、実
施例１に詳記した細胞増殖アッセイによって測定されるようにPluronic F127の
存在下で生物学的活性を保持した。

【０１５１】実施例５ モノチオグリセロールによるＫＧＦの活性化 ＫＧＦ−２Δ３３タンパク質ストック調合物（０.１〜２.０ｍｇ／ｍｌ）をモ
ノチオグリセロール（ＭＴＧ）とともにまたはＭＴＧなしで調製した。 これらタンパク質調合物をｐＨ７.２の１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で
希釈して細胞増殖アッセイに使用するのに必要な濃度を達成した。

【０１５２】細胞培養 ＢａＦ３２ｂ細胞を、１０％ＮＢＣＳ、１０％ＷＥＨＩ細胞ならし培地、２ｍ
Ｍグルタミン、６００μｇ／ｍｌのGENETICIN、１μｌのβメルカプトエタノー
ル／５００ｍｌ増殖培地、５０単位のペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で常法通り増殖させ維持した（Orni
tz, D., M.ら（1996）、J. Biol. Chem. 271: 15292-15297）。

【０１５３】細胞増殖アッセイ 細胞増殖アッセイのため、ＢａＦ３２ｂ細胞を遠心分離により回収し、基本培
地（このものは増殖培地と同じ組成を有しているが、ＷＥＨＩならし培地は含ま
ず、１μｇ／ｍｌのヘパリンを補足してあった）で洗浄した。この操作の後、細
胞を基本培地中に再浮遊させ、２２,０００細胞／１８０μｌを９６ウエル細胞
培養クラスターディッシュのウエルにプレーティングした。別の９６ウエルプレ
ートでＫＧＦ２の適当な希釈（必要な最終濃度よりも１０×高い）をＰＢＳ中で
行い、上記細胞に２００μｌの最終容量にて加えた。細胞プレートを３７℃、５
％ＣＯ_２インキュベーター中で３６〜４０時間インキュベートし、５０μｌの基
本培地中の０.５μＣｉメチル−^３Ｈチミジンを各ウエルに加えた。プレートを
インキュベーター中でさらに５時間インキュベートし、Tomtec Harvester 96を
用いてガラス繊維フィルター上で濾過することにより細胞を回収した。導入され
たチミジンをWallace βプレートシンチレーションカウンターでカウントした。

【０１５４】結果 Ａ．ＫＧＦ−２活性に及ぼすＭＴＧ濃度の効果 異なる濃度のモノチオグリセロール（ＭＴＧ）に暴露したＫＧＦ−２を用いて
細胞増殖アッセイを行った。対照の試料は賦形剤を含んでいなかった。ＭＴＧを
用いた場合、種々の濃度のＭＴＧで観察されたＫＧＦ−２活性の刺激を図５に示
す。活性の増大は使用したＭＴＧの濃度に依存して対照の１０〜１５０％であっ
た。このような細胞増殖活性の促進は、この増殖因子ファミリーの他の成員では
観察されなかった。これら観察から、ＭＴＧによるＫＧＦ−２活性の刺激は極め
て特異的であると結論付けられた。結論 モノチオグリセロールはＫＧＦ−２のインビトロでの細胞増殖活性を特異的に
刺激するものと思われる。

【０１５５】実施例６ クエン酸塩を用いたＫＧＦ−２ゲル調合物 以下の成分を混合してＫＧＦ−２調合物（該調合物は室温で液体であり、皮膚
に適用するとその後ゲル化する）を生成した。 ２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 １２５ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、 １７％のPluronic 127、ｐＨ６.０、 水。

【０１５６】実施例７ 酢酸塩を用いたＫＧＦ−２ゲル調合物 以下の成分を混合してＫＧＦ−２調合物（該調合物は皮膚に適用するとゲル化
する）を生成した。 ２０ｍＭの酢酸ナトリウム、 １２５ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 １７％のPluronic 127、ｐＨ６.０、 水。

【０１５７】実施例８ 液体ＫＧＦ−２調合物 ＫＧＦ−２Δ３３を維持する緩衝液としてのクエン酸ナトリウムの適切さを４
つの別々の調合物で３つのｐＨ：ｐＨ５.０、ｐＨ５.５およびｐＨ６.０にて評
定した。調合物 ： Ａ． ＫＧＦ−２Δ３３ １または２ｍｇ／ｍｌ ２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 １２５ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム、 水。 Ｂ． さらに１％グリセロールを含む他は「Ａ」と同じ Ｃ． さらに０.０５％メチオニンを含む他は「Ａ」と同じ Ｄ． さらに１％モノチオグリセロールを含む他は「Ａ」と同じ ＫＧＦ−２Δ３３の濃度は、上記すべての調合物において１および２ｍｇ／ｍ
ｌであった。

【０１５８】 ２．凍結乾燥調合物 ＫＧＦ−２Δ３３を３つのバルク剤：マンニトール、ショ糖およびトレハロー
スの一つの存在下で凍結乾燥した。調合物 ： Ａ． １０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ二ナトリウムおよび４％マンニトール、ｐＨ６.０ Ｂ． １０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ二ナトリウムおよび７％ショ糖、ｐＨ６.０ Ｃ． １０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ二ナトリウムおよび８％トレハロース、ｐＨ６.０ ＫＧＦ−２ポリペプチドの濃度は３ｍｇ／ｍｌおよび８ｍｇ／ｍｌであった。
評定パラメーターは、水での再構成前および後のＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ、外観であった。

【０１５９】 ３．１０ｍｇ／ｍｌ ＫＧＦ−２凍結乾燥 調合物が１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質の凍結乾燥を可能とするか否かを、再構
成後のタンパク質の安定性とともに評定した。調合物 ： １０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ
二ナトリウムおよび４％マンニトール、ｐＨ６.０ 凍結乾燥した生成物を水または１％モノチオグリセロールを含有する水で再構
成した。

【０１６０】実施例９ 増粘剤の安定性 下記調合物を上記実施例の方法に従って調製する。構成１および２は凍結乾燥
したＫＧＦ−２のみである；構成３および４は凍結乾燥ケーキの一部として増粘
剤を含む；構成５〜８は液体希釈剤の一部として増粘剤を含む。

【０１６１】実施例１０ 慢性の創傷の治療にＫＧＦ−２を使用することには、医薬の複数の局所適用が
係わることが予想される。凍結乾燥した構成は、保存剤が存在しないために適用
毎に再構成するための医薬製品の別個のバイアルが必要となる。このことは、有
意な量の医薬を浪費することになるのみならず、各投与の際に多大の労力を要す
る製品調製物という結果となる。理想的には、ＫＧＦ−２の市販の構成は多数の
適用に使用可能なＫＧＦ−２の単一のバイアルであろう。この構成の実施可能性
を検討するため、ＫＧＦ−２と保存剤との適合性を調べた。

【０１６２】 保存剤はＦＤＡによって承認された化合物のリストから選択した。選択した５
つの候補保存剤は、フィジシャンズ・デスク・レファレンス（Physicians Desk
Reference：ＰＤＲ）での汎用性および生物薬剤学での先に刊行された研究に基
づいていた。調合物および剤型は最終的に承認されていないので、エラストマー
の終止部（elastomeric closure）またはｐＨ６.２での安定性との適合性には最
初は強い強調は置かなかった。濃度は文献値並びにＦＤＡ／ＵＳＰおよびＢＰガ
イドラインに基づいて選択した。下記表は、本試験で調べた５つの候補保存剤を
示す。

【０１６３】 １．「パラベン」は本実施例では０.１８％メチルパラベンと０.０２％プロピル
パラベンとして定義される。 保存剤を利用するには２つの基準が適合する必要がある。第一に、医薬製品と
の適合性および安定性が確立されなければならない。第二に、微生物に対する有
効性が確立されなければならない（ＵＳＰ＜５１＞による）。本試験の目的は、
これら保存剤とのＫＧＦ−２の短期間の適合性を調べることであった。

【０１６４】材料および方法 調合物 全ての化学試薬はSpectrumから購入したものであり、ＵＳＰ／ＮＦグレードま
たは同等のものであった。以下の一つを含む基礎調合緩衝液中にＫＧＦ−２をダ
イアフィルトレーションした：０.９％ベンジルアルコール、０.５％クロロブタ
ノール、０.５％フェノール、０.３％ｍ−クレゾール、または０.１８％メチル
パラベン＋０.０２％プロピルパラベン（「パラベン」）。ダイアフィルトレー
ションは、Biomax 10kDメンブレンを備えたAmiconスタード・セル（stirred-cel
l）で行った。手順は全て２〜８℃で行った。各ダイアフィルトレーションにつ
いて全部で５回の緩衝液の交換を行った。ダイアフィルトレーションの際の回収
は＞９０％であった。ＫＧＦ−２を１.０ｍｇ／ｍＬに希釈し、２ｍＬ容のSchot
t Purformバイアルに充填し（１.０ｍＬ）、Diakyo D-7771血清栓およびアルミ
ニウムクリンプシールで密封した。バイアルを−８０℃、２〜８℃、および２５
℃／６０％相対湿度で貯蔵した。沈殿を有する調合物は、さらに分析する前に０
.２μｍで濾過した。

【０１６５】外観 黒と白の背景に対する前方照明蛍光を用い、視覚検査を通常の倍率で行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ １６％トリス−グリシンNovexゲルを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを非還元条件下
で行った。レーン当たり２μｇのＫＧＦ−２をローディングした。ゲルを定常電
圧（１２５Ｖ）で約２時間泳動した。染色はDaiichi銀染色キットを製造業者の
指示に従って用いて行った。生物学的活性 ＫＧＦ−２の生物学的活性は、繊維芽細胞増殖因子２iiibレセプターで安定に
トランスフェクションしておいたマウスリンパ細胞株Ｂａｆ３ ２ｂを用いて決
定する。活性は、ＫＧＦ−２への暴露後の［メチル−^３Ｈ］チミジンの取り込み
によって測定される細胞増殖に基づく。

【０１６６】ディファレンシャルスキャニングカロリメトリー（ＤＳＣ） 各調合物のＤＳＣサーモグラムをCalorimetry Science Nano DSC（モデル５１
００）で得た。スキャニングは加熱および冷却の両方向で１℃／分の割合で５℃
〜８０℃にて行った。溶融温度（Ｔｍ）を熱的転移の頂点として測定した。冷却
方向ではいずれの試料においてもシグナルは認められず、変性は不可逆的なもの
であることを示していた。

【０１６７】ＲＰ−ＨＰＬＣ（濃度、純度、酸化パーセント） ＲＰ−ＨＰＬＣを、Waters 996フォトダイオードアレイ検出器を備えたWaters 2690 Allianceシステムで行った。分離にはWaters Delta-Pak C18カラム（２.
１×１５０ｍｍ、５μｍ、３００Å）を用い、溶媒Ａ（水中の０.１％ＴＦＡ）
から溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０.０７％ＴＦＡ）への一次勾配を用いた。濃
度の決定は、既知濃度の内部標準を用い、未知の全ピーク領域を標準曲線と相関
させることにより行った。典型的な標準クロマトグラムを以下に示す。２つの主
要なピークが分離され、完全なＫＧＦ−２のピークおよび酸化形態のＫＧＦ−２
として前以て同定した。酸化パーセントは全領域のうちの領域のパーセントとし
て報告してある。パーセント純度は、完全な形態および酸化形態の合計に寄与す
る領域パーセントである。

【０１６８】結果 クロロブタノールおよびパラベンはＫＧＦ−２と２〜８℃で見込みのある適合
性を示す。ベンジルアルコール、ｍ−クレゾールおよびフェノールは、２〜８℃
で貯蔵したときにＫＧＦ−２の速やかな凝集を引き起こす。２５℃で貯蔵したと
きには、全ての調合物の１週間の貯蔵後の外観は不良である。ｍ−クレゾールお
よびフェノールの存在下で凍結乾燥／解凍条件に供したとき、ＫＧＦ−２は溶液
から沈降する。 試験した全ての保存剤は、ＫＧＦ−２の熱安定性に対してわずかな不安定化作
用を有する。溶融温度は、ＤＳＣにより測定したときに全ての保存剤の存在下で
約５℃の低下を示す。試験した保存剤のうちではパラベンが最も影響が小さい。

【０１６９】 ＫＧＦ−２の比活性は、試験したいずれの保存剤の存在によっても影響を受け
なかった。２５℃で貯蔵した調合物の全活性は６週間の貯蔵後にはＫＧＦ−２の
沈殿のために低下するが、クロロブタノール、パラベンおよびベンジルアルコー
ル調合物中の可溶性タンパク質はその比活性を保持した。 ２〜８℃での貯蔵では、ＲＰ−ＨＰＬＣでの測定によると全ての調合物は開始
濃度の１０％以内で維持される。２５℃で貯蔵した場合には、ｍ−クレゾールま
たはフェノールを含有する調合物は最も迅速な沈殿速度を示した。試験した調合
物のうちでは、パラベンまたはクロロブタノールを含有する調合物が短期間の安
定性試験でＫＧＦ−２を溶液中に最大に保持する。

【０１７０】 ベンジルアルコールは、ＫＧＦ−２の迅速な酸化を引き起こし、それに引き続
いて酸化形が継続して分解されていく。このことは、初期の高い酸化レベル（ダ
イアフィルトレーションの際に形成される）と、その後のさらなる酸化形へのゆ
っくりした転移によって示される。２〜８℃で貯蔵したとき、残りの調合物は１
ヶ月当たり約４％の匹敵しうる酸化速度を有する。２５℃で貯蔵したときは、酸
化速度は１ヶ月当たり３０〜４０％に増大する。試験した調合物のうちでは、パ
ラベンを含有する調合物が最もゆっくりした酸化速度を有する。

【０１７１】 純度は、全クロマトグラフィー領域のうちでのパーセントとしてＫＧＦ−２の
主たる形態および酸化形態の合計として決定する。ベンジルアルコールまたはフ
ェノールを含有する調合物は、最初は低純度を示し、ついで上昇し、ついで徐々
に純度は失われていく。このことは、可溶性の凝集物に対応すると思われるクロ
マトグラフィーピークの０時点での急激な増大に対応している。沈殿の形成が続
くにつれて、このピークは消失し、その後、いずれの他のピーク領域にも増大は
認められない。２５℃で貯蔵したとき、パラベンを含有する調合物が最高の純度
を保持する。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、時点０および貯蔵６週間後にベンジルアルコール含有調
合物で二量体のバンドのわずかな増大を示す。わずかなレーンのストリーキング
（streaking）および二量体レベルの増大が、２５℃で貯蔵した調合物で観察さ
れる。

【０１７２】結論 ＫＧＦ−２は、試験した条件下ではベンジルアルコール、ｍ−クレゾール、お
よびフェノールとは不適合である。これらの調合物では、凝集とそれに続く沈殿
が主たる分解経路であった。試験した保存剤のうちでは、メチル／プロピルパラ
ベンがＫＧＦ−２の短期安定性に対して最小の影響を有する。

【０１７３】実施例１１ 凍結乾燥調合物中のＫＧＦ−２ 以下の成分を混合してＫＧＦ−２Δ３３前混合調合物を生成した。 ３.３ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、 １０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 ２０ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 ２％ｗ／ｖのグリシン、 ０.５％ｗ／ｖのショ糖、 水（凍結乾燥により除かれる） ｐＨ６.２。 ついで、調合物を上記第二の凍結乾燥サイクルに従って凍結乾燥した。 この調合物は、２５℃またはそれ以下での貯蔵条件で１２ヶ月までそのインビ
トロでの生物学的活性を保持した。

【０１７４】実施例１２ ＫＧＦ−２局所調合物 以下の成分を混合して局所適用のためのＫＧＦ−２調合物を生成した。 １.０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２Δ３３、 ０.４６％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ） ７％のショ糖、 ２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、 ２０ｍＭの塩化ナトリウム、 １ｍＭのＥＤＴＡ、 ｐＨ６.２。

【０１７５】 本発明は上記および実施例に特別に記載した以外の仕方でも実施しうることは
明らかであろう。 本発明の多くの修飾および変更が上記教示に照らして可能であり、それゆえ、
添付の特許請求の範囲に含まれる。 本明細書中に引用したすべての刊行物（特許、特許出願、週間記事、研究所の
マニュアル、書籍または他の書類を含む）の全開示が参照のために引用される。

【０１７６】 ７０.１ 寄託した微生物または他の生物学的材料に関する表示 (ＰＣＴ規則１３の２） 受理官庁のみ使用 国際事務局のみ使用

【０１７７】 ７０.２ 寄託した微生物または他の生物学的材料に関する表示 (ＰＣＴ規則１３の２） 受理官庁のみ使用 国際事務局のみ使用

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＫＧＦ−２のｃＤＮＡおよびそれから導かれる対応アミノ酸配列
を示す。最初の３５または３６アミノ酸残基は、推定のリーダー配列を表す（下
線）。標準的な一文字略語をアミノ酸について用いている。シークエンシングの
不正確さは、ポリヌクレオチドの配列を決定しようとする際の一般的な問題であ
る。シークエンシングは、３７３自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosyste
ms, Inc.）を用いて行った。シークエンシングの正確さは、９７％以上正確であ
ると予測される（配列番号：１および２）。

【図２】 本発明のＫＧＦ−２ポリペプチドによる正常な一次表皮角質細胞
増殖の刺激を示す。（Ａ）はＫＧＦ−２による正常な一次表皮角質細胞増殖の刺
激を示す。（Ｂ）は、ＫＧＦ−２Δ３３による正常な一次表皮角質細胞増殖の刺
激を示す。（Ｃ）は、ＫＧＦ−２Δ２８による正常な一次表皮角質細胞増殖の刺
激を示す。

【図３】 ＫＧＦ−２Δ３３液体調合物についての１０ヶ月安定性の生物学
的活性の結果を示す。

【図４】 ＫＧＦ−２Δ３３凍結乾燥製剤についての９ヶ月安定性の生物学
的活性の結果を示す。

【図５】 ＫＧＦ−２の生物学的活性に対するモノチオグリセロールの効果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/12 Ａ６１Ｋ 47/14 47/14 47/18 47/18 47/20 47/20 47/22 47/22 47/26 47/26 47/32 47/32 47/34 47/34 47/36 47/36 47/38 47/38 47/40 47/40 47/42 47/42 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アービンド・チョプラ アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ラムズデル・コート18番 (72)発明者 パービーン・コーシャル アメリカ合衆国20906メリーランド州シル バー・スプリング、チャペル・ヒル・ロー ド1704番 (72)発明者 トーマス・スピッツネイジェル アメリカ合衆国22180バージニア州ビエナ、 ストーンウォール・ドライブ8414番 (72)発明者 エドワード・アンズワース アメリカ合衆国20895メリーランド州ケン ジントン、グレンリッジ・ストリート4414 番 (72)発明者 ファザル・カーン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ナンバー405、マホガニ ー・サークル15704番 Ｆターム(参考） 4C076 AA11 AA29 CC19 DD23D DD25Z DD26Z DD37 DD37R DD38D DD41Z DD45R DD49 DD51 DD51D DD55 DD67 DD67R EE06P EE10G EE13P EE20P EE26P EE30 EE30P EE32G EE36P EE37P EE39 EE41P EE42P EE43P EE49 FF04 FF13 FF14 FF17 FF51 4C084 AA03 BA01 BA21 DB52 MA16 MA44 ZA89 ZB21

Claims (78)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）約０.０２〜約４０ｍｇ／ｍｌ(ｗ／ｖ)の濃度範囲の
   ＫＧＦ−２ポリペプチド； （ｂ）約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度範囲でｐＨ約５.０〜約８.０の緩衝能を有す
   る緩衝液； （ｃ）組成物を所定の容量とする、薬理学的に許容しうる希釈剤；および （ｄ）ｍ−クレゾール、クロロブタノール、およびメチルパラベンとプロピルパ
   ラベンとの混合物よりなる群から選ばれた保存剤； またはその反応生成物を含む医薬組成物。
2. 【請求項２】 さらに、 （ａ）約０ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲のキレート化剤；および （ｂ）約０ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度範囲の等張化剤 を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 【請求項３】 該等張化剤が、ＮａＣｌ、グリシン、ショ糖、マンニトール
   、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項２に記載の
   医薬組成物。
4. 【請求項４】 さらに、 （１）約０.５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、 （２）約０.１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、または （３）約０.１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール の一つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが約０.０５〜約３０ｍｇ／ｍｌ(
   ｗ／ｖ)の濃度範囲で含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 【請求項６】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが約０.１〜約２０ｍｇ／ｍｌ(ｗ
   ／ｖ)の濃度範囲で含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 該ＫＧＦ−ポリペプチドが約０.２〜４ｍｇ／ｍｌの濃度範
   囲で含まれる、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドがＫＧＦ−２−Δ３３である、請
   求項１に記載の医薬組成物。
9. 【請求項９】 該希釈剤が水である、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 【請求項１０】 該キレート化剤が約１ｍＭの濃度のＥＤＴＡであり、該等
    張化剤が約１２５ｍＭの濃度で存在する、請求項２に記載の医薬組成物。
11. 【請求項１１】 該ｐＨがｐＨ約５.５〜約６.５である、請求項１に記載の
    医薬組成物。
12. 【請求項１２】 該ｐＨがｐＨ約６.０である、請求項１１に記載の医薬組
    成物。
13. 【請求項１３】 該緩衝液が、リン酸、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
    ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、炭酸、およびそのアルカリまたはアルカリ土類
    塩よりなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
14. 【請求項１４】 該緩衝液が、リン酸塩、酢酸塩またはクエン酸塩である、
    請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 【請求項１５】 該緩衝液がクエン酸塩である、請求項１３に記載の医薬組
    成物。
16. 【請求項１６】 該緩衝液が、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度範囲で含まれる
    、請求項１に記載の医薬組成物。
17. 【請求項１７】 該緩衝液が、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度範囲で含まれ
    るクエン酸塩である、請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 【請求項１８】 さらに安定化量の（ａ）抗酸化剤または（ｂ）チオール化
    合物の１またはそれ以上を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
19. 【請求項１９】 −２０℃またはそれ以下の温度で保持される、請求項１に
    記載の医薬組成物。
20. 【請求項２０】 該ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを
    有するＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、Ｎ末端メチオニンを欠いたＫＧＦ−２Δ
    ３３ポリペプチド、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求
    項１に記載の医薬組成物。
21. 【請求項２１】 さらにバルク剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
22. 【請求項２２】 該バルク剤が、ショ糖、グリシン、マンニトール、トレハ
    ロース、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求項２１に記
    載の医薬組成物。
23. 【請求項２３】 該バルク剤が、ショ糖、またはショ糖とグリシンとの混合
    物である、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 【請求項２４】 さらにバルク剤を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
25. 【請求項２５】 該バルク剤が約２％〜約１０％ｗ／ｖの濃度で含まれる、
    請求項２２に記載の医薬組成物。
26. 【請求項２６】 該バルク剤が、５％のマンニトール、７％のショ糖、８％
    のトレハロース、または２％のグリシン＋０.５％のショ糖である、請求項２２
    に記載の医薬組成物。
27. 【請求項２７】 該ｐＨがｐＨ約６.２である、請求項２１に記載の医薬組
    成物。
28. 【請求項２８】 該希釈剤が水である、請求項２１に記載の医薬組成物。
29. 【請求項２９】 該緩衝液が、リン酸、酢酸、アコニット酸、クエン酸、グ
    ルタル酸、リンゴ酸、コハク酸、炭酸、およびそのアルカリまたはアルカリ土類
    塩よりなる群から選ばれたものである、請求項２１に記載の医薬組成物。
30. 【請求項３０】 該緩衝液が、リン酸塩またはクエン酸塩である、請求項２
    ９に記載の医薬組成物。
31. 【請求項３１】 該緩衝液がクエン酸塩である、請求項３０に記載の医薬組
    成物。
32. 【請求項３２】 水の９０％以上が凍結乾燥により除かれる、請求項２８に
    記載の医薬組成物。
33. 【請求項３３】 約２９０ｍＯｓｍの等張状態を維持するのに有効な所定量
    の滅菌水で再構成する、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 【請求項３４】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドがＫＧＦ−２−Δ３３である、
    請求項２１に記載の医薬組成物。
35. 【請求項３５】 該ＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを
    有するＫＧＦ−２Δ３３ポリペプチド、Ｎ末端メチオニンを欠いたＫＧＦ−２Δ
    ３３ポリペプチド、およびその混合物よりなる群から選ばれたものである、請求
    項３４に記載の医薬組成物。
36. 【請求項３６】 該緩衝液を約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で加える、請求項
    ２１に記載の医薬組成物。
37. 【請求項３７】 該緩衝液が、約１０ｍＭの濃度のクエン酸塩である、請求
    項３６に記載の医薬組成物。
38. 【請求項３８】 さらに安定化量の（ｇ）抗酸化剤または（ｈ）チオール化
    合物の１またはそれ以上を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
39. 【請求項３９】 （ａ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロー
    ル、（ｂ）約０.０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｃ）約０.０１％〜
    約２％ｗ／ｖのメチオニンまたは（ｄ）それらの混合物を含む安定化量の抗酸化
    剤を含む滅菌水中で再構成する、請求項３２に記載の医薬組成物。
40. 【請求項４０】 粘度を約５０〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させるのに有
    効な量の増粘剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
41. 【請求項４１】 該増粘剤が粘度を約５０〜約１,０００ｃｐｓに上昇させ
    るのに有効な量で含まれる、請求項４０に記載の医薬組成物。
42. 【請求項４２】 該増粘剤が粘度を約２００〜約３００ｃｐｓに上昇させる
    のに有効な量で含まれる、請求項４１に記載の医薬組成物。
43. 【請求項４３】 該増粘剤が０〜５％（ｗ／ｗ）の濃度で含まれる、請求項
    ４０に記載の医薬組成物。
44. 【請求項４４】 該増粘剤が、水溶性のエーテル化セルロースまたはアリル
    スクロースかまたはペンタエリトリトールのアリルエーテルで架橋されたアクリ
    ル酸の高分子量ポリマーである、請求項４０に記載の医薬組成物。
45. 【請求項４５】 該エーテル化セルロースが、アルキルセルロース、ヒドロ
    キシアルキルセルロース、カルボアルキルセルロースまたはアルキルヒドロキシ
    アルキルセルロースである、請求項４４に記載の医薬組成物。
46. 【請求項４６】 該エーテル化セルロースが、メチルセルロース、ヒドロキ
    シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
    ルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースである、請求項４０に記載の
    医薬組成物。
47. 【請求項４７】 該エーテル化セルロース誘導体が、分子量が約５０,００
    ０〜約７００,０００で、約０〜約２０重量％の濃度で含まれる、請求項４６に
    記載の医薬組成物。
48. 【請求項４８】 該エーテル化セルロース誘導体が、分子量が約８０,００
    ０〜約２４０,０００で、約２重量％〜約８重量％の濃度で含まれる、請求項４
    ７に記載の医薬組成物。
49. 【請求項４９】 該緩衝液が約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度のクエン酸塩で
    ある、請求項４２に記載の医薬組成物。
50. 【請求項５０】 該緩衝液が約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度のクエン酸塩で
    ある、請求項４９に記載の医薬組成物。
51. 【請求項５１】 該バルク剤が、約０.０１％〜約５％ショ糖の濃度のショ
    糖である、請求項４９に記載の医薬組成物。
52. 【請求項５２】 該増粘剤を液体調合物に直接加え、その後に凍結乾燥する
    、請求項５１に記載の医薬組成物。
53. 【請求項５３】 増粘剤を溶解した適当な希釈剤を加えることにより該調合
    物を再構成することによって、凍結乾燥した調合物に該増粘剤を加える、請求項
    ５１に記載の医薬組成物。
54. 【請求項５４】 粘度を約５０〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させるのに有
    効な量の増粘剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
55. 【請求項５５】 室温での粘度を約０.１〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させ
    るのに有効な量のゲル化剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
56. 【請求項５６】 室温での粘度を約０.１〜約１０,０００ｃｐｓに上昇させ
    るのに有効な量のゲル化剤をさらに含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
57. 【請求項５７】 該ゲル化剤が、粘性の水溶液を生成しうる水溶性ポリマー
    、または粘性の溶液を生成することができる非水溶性で水膨潤性のポリマーであ
    る、請求項５５に記載の医薬組成物。
58. 【請求項５８】 該ゲル化剤が、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポ
    リオキシプロピレンコポリマー、多糖、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）
    、アクリルアミドポリマーまたはその塩よりなる群から選ばれた高分子量ポリマ
    ーである、請求項５７に記載の医薬組成物。
59. 【請求項５９】 該ゲル化剤が、（１）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸
    、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびその塩およびエステル
    よりなる群から選ばれたビニルポリマー、または（２）セルロース誘導体、グリ
    コサミノグリカン、寒天、ペクチン、アルギン酸、デキストラン、α−アミロー
    ス、アミロペクチン、キトサン、およびその塩およびエステルよりなる群から選
    ばれた多糖である、請求項５８に記載の医薬組成物。
60. 【請求項６０】 該ゲル化剤が、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロ
    イチン−４−硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリンおよびその塩およびエステルよりな
    る群から選ばれたグリコサミノグリカンである、請求項５８に記載の医薬組成物
    。
61. 【請求項６１】 該グリコサミノグリカンが、コラーゲン、ゼラチン、また
    はフィブロネクチンとともに含まれる、請求項６０に記載の医薬組成物。
62. 【請求項６２】 該ゲル化剤が、ポリアクリルアミドまたはポリメタクリル
    アミドよりなる群から選ばれたアクリルアミドポリマーである、請求項５８に記
    載の医薬組成物。
63. 【請求項６３】 該ゲル化剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
    ブロックコポリマーである、請求項５８に記載の医薬組成物。
64. 【請求項６４】 平均分子量が約５００〜５０,０００のポリオキシエチレ
    ン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１０〜約６０重量％含む、請
    求項６３に記載の医薬組成物。
65. 【請求項６５】 １,０００〜１５,０００の範囲の分子量のポリオキシエチ
    レン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを約１４〜約１８重量％含む、
    請求項６４に記載の医薬組成物。
66. 【請求項６６】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、約０.０１ｍｇ／ｍｌ〜約
    １０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１に記載の医薬組成物。
67. 【請求項６７】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ａｌａ（６３）−−Ｓｅｒ
    （２０８）（ＫＧＦ−２Δ２８）およびＳｅｒ（６９）−−Ｓｅｒ（２０８）（
    ＫＧＦ−２Δ３３）よりなる群から選ばれたＮ末端欠失体である、請求項１に記
    載の医薬組成物。
68. 【請求項６８】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有する
    もの、Ｎ末端メチオニンを欠くもの、またはそれらの混合物である、請求項６７
    に記載の医薬組成物。
69. 【請求項６９】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ａｌａ（３９）−−Ｓｅｒ
    （２０８）；Ｐｒｏ（４７）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｖａｌ（７７）−−Ｓｅｒ
    （２０８）；Ｇｌｕ（９３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｕ（１０４）−−Ｓｅ
    ｒ（２０８）；Ｖａｌ（１２３）−−Ｓｅｒ（２０８）；Ｇｌｙ（１３８）−−
    Ｓｅｒ（２０８）；Ｍｅｔ（１）、Ｔｈｒ（３６）；およびＣｙｓ（３７）−−
    Ｌｙｓ（１５３）よりなる群から選ばれたＮ末端またはＣ末端の欠失変異体であ
    る、請求項１に記載の医薬組成物。
70. 【請求項７０】 該ＫＧＦ−２ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニンを有する
    もの、Ｎ末端メチオニンを欠くもの、またはそれらの混合物である、請求項６９
    に記載の医薬組成物。
71. 【請求項７１】 さらに、 （ａ）リジン； （ｂ）ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；および （ｃ）硫酸化β−シクロデキストリン またはそれらの組み合せの１つを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
72. 【請求項７２】 該保存剤がメチルパラベンとプロピルパラベンとの混合物
    である、請求項１に記載の医薬組成物。
73. 【請求項７３】 ０.１８％のメチルパラベンおよび０.０２％のプロピルパ
    ラベンを含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
74. 【請求項７４】 （ａ）約１.０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２； （ｂ）２０ｍＭのクエン酸、ｐＨ５〜５.５；および （ｃ）０.０１％のポリソルベート８０ を含む医薬組成物。
75. 【請求項７５】 さらに１ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項７４に記載の医薬
    組成物。
76. 【請求項７６】 （ａ）約３.３ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２； （ｂ）１０ｍＭのクエン酸ナトリウム； （ｃ）２０ｍＭの塩化ナトリウム； （ｄ）１ｍＭのＥＤＴＡ； （ｅ）２％ｗ／ｖのグリシン； （ｆ）０.５％ｗ／ｖのショ糖； （ｇ）水；および （ｈ）ｐＨ約６.２ またはその反応生成物を含む医薬組成物。
77. 【請求項７７】 ９０％以上の水が凍結乾燥により除かれる、請求項７７に
    記載の医薬組成物。
78. 【請求項７８】 （ａ）約１.０ｍｇ／ｍｌのＫＧＦ−２； （ｂ）０.４６％のヒドロキシエチルセルロース； （ｃ）７％のショ糖； （ｄ）２０ｍＭのクエン酸ナトリウム； （ｅ）２０ｍＭの塩化ナトリウム； （ｆ）１ｍＭのＥＤＴＡ；および （ｇ）ｐＨ約６.２ またはその反応生成物を含む医薬組成物。