DE69727691T2

DE69727691T2 - Verwendung von keratinocyten-wachstumsfaktor-2

Info

Publication number: DE69727691T2
Application number: DE69727691T
Authority: DE
Inventors: L. David LACEY; R. Thomas ULICH; M. Dimitry DANILENKO; L. Catherine FARRELL
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2017-10-16
Also published as: DK0941110T3; JP2001506586A; DE69727691D1; ATE259651T1; DE69738336T2; CA2268741A1; EP0941110A1; CA2268741C; AU725509B2; AU5080698A; JP4270580B2; WO1998016243A1; DE69738336D1; PT941110E; EP0941110B1; ES2297286T3; ES2216134T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Keratinozyten-Wachstumsfaktor-2 (KGF-2) Proteinprodukten zur Stimulation der Proliferation, des Wachstums und der Differenzierung einer Reihe von Epithelzellen.
Hintergrund der Erfindung
Der komplexe Prozess der Gewebeentstehung und Regeneration wird durch eine Reihe von Proteinfaktoren vermittelt, die manchmal als Weichgewebe-Wachstumsfaktoren bezeichnet werden. Diese Faktoren werden im Allgemeinen durch einen Zelltyp freigesetzt und wirken, um die Proliferation anderer Zelltypen zu beeinflussen (Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802–806). Es gibt auch einige Wachstumsfaktoren, die aus Zellen freigesetzt werden, die selbst die Fähigkeit haben, auf solche Wachstumsfaktoren zu reagieren. Einige Weichgewebe-Wachstumsfaktoren werden durch bestimmte Zelltypen sezerniert und beeinflussen die Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung darauf reagierender Zellen in der Entwicklung multizellulärer Organismen (Finch et al. (1989), Science, 245: 752–755). Zusätzlich zu ihren Rollen in sich entwickelnden Organismen sind einige Weichgewebe-Wachstumsfaktoren für die fortgesetzte Gesundheit und die Aufrechterhaltung reiferer Systeme von Bedeutung. Zum Beispiel gibt es in Säugetieren viele Systeme, bei denen ein schneller Zellumsatz vorkommt. Solche Systeme umfassen die Haut und den gastrointestinalen Trakt, die beide epitheliale Zellschichten aufweisen.
Eingeschlossen in diese Familie der Weichgewebe-Wachstumsfaktoren ist eine Proteinfamilie der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs).
Von der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) Familie ist bekannt, dass sie aus mindestens vierzehn Mitgliedern bestehen, nämlich FGF-1 bis FGF-10 und den homologen Faktoren FHF-1 bis FHF-4, welche eine Verwandtschaft in ihren primären Strukturen teilen: basischer Fibroblastenwachstumsfaktor bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J., 5: 2523–2528); saurer Fibroblastenwachstumsfaktor aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233: 541–545); int-2 Genprodukt, int-2 (Dickson & Peters (1987), Nature, 326: 833); hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Cell, 50: 729–737 und Yoshida et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7305–7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8: 3487–3495); FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4: 335–340); Keratinozytenwachstumsfaktor, KGF (Finch et al. (1989), Science, 24: 752–755); Hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nature, 359: 855–858); FGF-9 (Miyamoto et al. (1993), Mol. Cell. Biol., 13(7): 4251–4259); und Fibroblastenwachstumsfaktor-10, der auch als Keratinozytenwachstumsfaktor-2, KGF-2 bekannt ist (PCT Patentanmeldung WO 96/25422). Vor kurzem wurden vier homologe Faktoren (oder "FHFs") aus der menschlichen Retina durch eine Kombination zufälliger cDNA-Sequenzierung, durch Durchsuchen existierender Sequenzdatenbanken und Homologie-basierenden Polymerase-Kettenreaktionen identifiziert (Smallwood et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9850–9857). Es wurde vorgeschlagen, dass FHF-1, FHF-2, FHF-3 und FHF-4 jeweils als FGF 11, FGF-12, FGF-13 und FGF-14 gemäß der Empfehlung des Nomenklaturkomitees (Coulier et al. (1997), Journal of Molecular Evolution, 44: 43–56) bezeichnet werden sollen.
WO 96/25422 beschreibt die Klonierung, Expression und Aufreinigung von Gesamtlängen KGF-2 (einschliesslich Signalsequenz, Reste Met¹ bis Thr³⁶ von SEQ ID NO: 2) und reifes KGF-2 (ohne Signalsequenz, Reste Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2) in einem bakteriellen Expressionssystem (z. B. E. coli) und eukaryontischen Expressionssystemen (z. B., Baculovirus und COS-Zellen). Dieses Dokument lehrt des Weiteren, dass KGF-2 nützlich sein könnte, um Zellwachstum und Proliferation für neue Blutgefäße oder Angiogenese, die Verhinderung von Haarverlust, die Heilung dermaler Wunden und die Differenzierung von Muskelzellen, Nervengewebe, Prostatazellen und Lungenzellen zu stimulieren.
Obwohl KGF-2 ein Mitglied der FGF-Familie ist, sind die physikalischen und in vivo-Wirkungen innerhalb der Familienmitglieder nicht die gleichen. Zum Beispiel war es wohl bekannt, dass aFGF, bFGF und KGF auf verschiedene Weisen mit Heparin reagieren. Die mitogene Aktivität von aFGF wird in der Gegenwart von Heparin wesentlich erhöht, aber die mitogene Aktivität von bFGF in der Gegenwart von Heparin ist trotz der Tatsache, dass Heparin fest an bFGF bindet, nur minimal erhöht. Im Gegensatz dazu wird die Thymidinaufnahme durch BALB/MK-Zellen gehemmt, wenn Heparin zusammen mit KGF im Kulturmedium vorliegt (Ron et al. (1993), J. Biol. Chem., 268: 2984–2988). Zudem ist von aFGF und bFGF bekannt, dass sie an den gleichen Rezeptor binden, aber KGF hat auch verschiedene Rezeptoren auf NIH/3T3-Fibroblasten, die sich von den aFGF- und bFGF-Rezeptoren auf NIH/3T3-Fibroblasten unterscheiden, die nicht mit KGF wechselwirken (Bottaro et al. (1990), J. Biol. Chem., 265, 12767–12770). Zusätzlich unterscheidet sich KGF von aFGF und bFGF dahingehend, dass es nicht mitogen für Fibroblasten und endotheliale Zellen ist (Rubin et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 802–806).
Tatsächlich unterscheidet sich das Expressionsprofil von KGF-2 deutlich von denen anderer Mitglieder der FGF-Familie (Yamasaki et al. (1996), J. Biol. Chem., 271: 15918– 15921). KGF-2 hat vermutlich eine einzigartige physiologische Rolle, wobei seine biologische Aktivität noch nicht geklärt ist (Emoto et al. (1997), J. Biol. Chem. 272(37): 23191 –23194).
Daher bleibt in Bezug auf KGF-2 als Wachstumsfaktor noch eine Menge zu lernen, einschließlich der epithelialen Zellen in weiteren Arten von Organen und Geweben, auf die KGF-2 gerichtet werden kann und die Wirkung von KGF-2 auf solche Zellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die in vitro-Verwendung von KGF-2 Proteinprodukt(en), wie sie unten definiert werden, um eine Stimulation (einschließlich Zellprotektion, Proliferation und/oder Differenzierung) von epithelialen Zellen im Auge, Ohr, Zahnfleisch, Pankreas (exokrin und endokrin), Thymus, Schilddrüse, Harnblase, Leber und/oder gastrointestinalen Trakt einschließlich der Zellen des Mundraumes, im Drüsengewebe des Magens und Dünndarm, im Dickdarm und in anderen Zellen innerhalb der intestinalen Schleimhaut zu induzieren. Sie betrifft des Weiteren die Verwendung von KGF-2 Proteinen) zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung eines Zustandes in einem Patienten, der an einem Zustand leidet, der aus komealer Abschürfung oder kornealen Geschwüren, Zahnfleischerkrankung, Trommelfellschaden, erosiver Gastritis, Ösophagitis oder Ösophagusrückfluss oder geschwürartigen oder entzündlichen Zuständen der Harnblase ausgewählt ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
Viele Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden sich aus der Durchsicht der Figuren ergeben, worin:
1 eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) zeigt, die rekombinantes menschliches KGF-2 in Gesamtlänge kodiert. Auch gezeigt wird die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des rekombinanten menschlichen KGF-2 in Gesamtlänge. Die ersten 36 Aminosäuren (Met¹ bis Thr³⁶) zeigen die mutmassliche vLeadersequenz von KGF-2 in Gesamtlänge und die Reste Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 stellen das reife KGF-2 dar. Die Gesamtlängen- und reifen Formen werden kollektiv als "KGF-2" bezeichnet.
2 eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3) zeigt, die His rFGF10 kodiert. Auch gezeigt wird die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) von His rFGF10.
3 eine cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 5) zeigt, die hFGF10 kodiert. Auch gezeigt wird die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) von hFGF10.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein KGF-2 Proteinprodukt(e), wie es unten in mehr Details beschrieben wird, in vitro verwendet werden, um die Stimulation (einschließlich Zellprotektion, Proliferation und/oder Differenzierung) von epithelialen Zellen des Auges, des Ohrs, des Zahnfleisches, der Harnblase und der Zellen des Mundraumes stimulieren.
Diese Erfindung hat somit wesentliche Implikationen in Bezug auf das Ermöglichen der Anwendung von KGF-2 Proteinprodukt(en), die spezifisch durch die prophylaktische und therapeutische Verwendung von KGF-2 charakterisiert sind, den Beginn eines Schadens oder Mängel in diesen jeweiligen Zelltypen zu reduzieren, verzögern und/oder zu blockieren. Das Folgende ist eine Beschreibung von Krankheiten und medizinischen Zuständen, die mit KGF-2 Proteinprodukten) gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Kornea-Zellen können durch korneale Abschürfung und/oder korneale Geschwüre bedingt durch Chemikalien, Bakterien oder Viren beschädigt werden. KGF-2 Proteinprodukte) sind zur Behandlung und/oder Prävention einer komealen Degeneration nützlich. Es sind Standard in vivo-Modelle der kornealen Zellregeneration bekannt (Inatomi et al. (1994), Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4): 1318, Abstract 299; Sotozono et al. (1994), Investigative Ophthalmology and Visual Science, 35(4): 1941, Abstract 317; Wilson et al. (1994), Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4): 1319, Abstract 301; Wilson et al. (1993), The FASEB Journal, 7(3): A493, Abstract 2857; Inatomi et al. (1994), Investigative Ophthalmology & Visusal Science, 35(4): 1318; Wilson et al. (1994), Experimental Eye Research, 59(6): 665–678; und Sotozono et al. (1995), Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36(8): 1524–1529).
KGF-2 Proteinprodukte) sind zur Prävention und/oder Behandlung von Zahnfleischerkrankung nützlich. Es sind Standard in vivo-Modelle von Zahnfleischerkrankungen bekannt.
KGF-2 Proteinprodukte) sind zur Verhinderung und/oder Behandlung von geschwürartigen und/oder entzündlichen Zuständen nützlich, einschließlich Zuständen, die mit Chemotherapie (wie oben diskutiert) und/oder Infektion verwandt sind. Standard in vivo-Modelle einer Schädigung der Harnblase sind bekannt (Ford und Hess (1976), Arch. Intern. Med., 136: 616–619 und Droller et al. (1982), Urol., 20: 256–258).
KGF-2 Proteinprodukte) sind zur Prävention und/oder Behandlung von Trommelfellschäden nützlich. Standard in vivo Modelle von Mittelohr Membranpertorationen sind bekannt (Clymer et al. (1996), Laryngoscope (USA), 106(3): 280–285).
KGF-2 Protein(e)
Gemäß den Begriffen dieser Erfindung ist durch den Begriff "KGF-2 Protein(e)" das durch die Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 (reifes KGF-2) definierte Protein und Proteinvarianten davon gemeint. Der Begriff "KGF-2 Protein(e)" umfasst somit ein Protein, in welchem eine oder mehrere Aminosäurereste deletiert ("Deletionsvariante(n)"), eingefügt ("Additionsvariante(n)") und/oder in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 substituiert ("Substitionsvariante(n)") wurden und welches eine biologische Aktivität beibehält. Während sich die Beschreibungen weiter unten auf Modifikationen von reifem KGF-2 beziehen, schließt dieses zusätzliche Modifikationen davon nicht aus.
Der Begriff "biologische Aktivität", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass ein KGF-2 Proteine) einige, aber nicht notwendigerweise all die gleichen Eigenschaften von (und nicht notwenigerweise zum gleichen Grad) wie reifes KGF besitzt. Die Auswahl der jeweiligen Eigenschaften von Interesse hängen von der gewünschten Verwendung des gewünschten KGF-2 Proteins (der Proteine) ab.
Spezifische Varianten des reifen KGF-2 werden in der PCT Patentanmeldung Nr. US 97/18607 von Narhi und Osslund offenbart, die mit dieser zum gleichen Datum angemeldet wurde, die auf dem Patentanmeldungsübersendungsbrief als "Variants of Keratinocyte Growth Factor-2" betitelt wird.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden wissen, dass viele Kombinationen von Deletionen, Einfügungen und Substitutionen unter der Voraussetzung, dass das endgültige Protein biologisch aktiv ist, vorgenommen werden können. Es gibt zwei prinzipielle Variablen in der Herstellung von einer Aminosäuresequenzvariante (Aminosäuresequenzvarianten): die Lokalisierung der Mutationsstelle und die Natur der Mutation. In der Entwicklung von Varianten wird die Lokalisierung der Mutationsstelle und die Natur der Mutation von den zu modifizierenden biochemischen Eigenschaften abhängen. Mutationsstellen können einzeln oder in Serie modifiziert werden, z. B., durch (1) Deletieren des Zielaminosäurerestes, (2) Einfügen von Aminosäureresten benachbart zu der lokalisierten Stelle oder (3) erstens Substituieren mit konservativen Aminosäuremöglichkeiten und dann, abhängig von dem erreichten Ergebnis, mit einer radikaleren Auswahl.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von 40 Aminosäureresten, von ungefähr 30 Aminosäureresten, von ungefähr 20 Aminosäureresten und typischerweise von ungefähr 1 bis 10 Resten. Deletionen innerhalb der Aminosäuresequenz von reifem KGF-2 können z. B. in Regionen geringer Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der FGF-Familie gemacht werden. Deletionen innerhalb der Aminosäuresequenz von reifem KGF-2 in Regionen wesentlicher Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der FGF-Familie werden wahrscheinlich die biologische Aktivität wesentlich verändern. Die gesamtzahl an Deletionen und/oder aufeinandertolgen den Deletionen wird vorzugsweise so ausgewählt, dass die tertiäre Struktur von reifem KGF-2 in der betroffenen Domäne, z. B. die Cysteinvernetzung, erhalten bleibt.
Aminosäuresequenzadditionen können amino- und/oder carboxylterminale Fusionen im Bereich einer Länge von einem Rest bis einhundert oder mehr Resten umfassen, sowie interne Intrasequenzeinfügungen von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Interne Additionen können vorzugsweise im Bereich von ungefähr 1 bis 10 Aminosäureresten, vorzugsweise von ungefähr 1 bis 5 Aminosäureresten und am meisten bevorzugt von ungefähr 1 bis 3 Aminosäureresten liegen. Additionen innerhalb der Aminosäuresequenz von reifem KGF-2 können in Regionen von geringer Homologie mit den Sequenzen der anderen Mitglieder der FGF-Familie durchgeführt werden. Additionen innerhalb der Aminosäuresequenz von reifem KGF-2 in Regionen mit wesentlicher Homologie mit den Sequenzen der anderen Mitglieder der FGF-Familie werden eher die biologische Aktivität wesentlich modifizieren. Einfügungen oder Additionen umfassen vorzugsweise Aminosäuresequenzen, die aus den Sequenzen anderer FGF-Familienmitglieder abgeleitet sind.
Es wird vorgeschlagen, dass eine Amino-Terminus-Addition das Hinzufügen eines Methionins (z. B. als ein Artefakt der direkten Expression in einer bakteriellen rekombinanten Zellkultur) oder eines Aminosäurerestes oder die Sequenz von reifem KGF-2 umfasst. Ein weiteres Beispiel einer N-terminalen Addition umfasst die Fusion einer Signalsequenz an den N-Terminus von reifem KGF-2, um die Sezemierung des Proteins aus den rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Solche Signalsequenzen können im Allgemeinen erhalten werden aus und sind somit homolog zu der vorgesehenen Wirtszellspezies. Umfasst im Umfang dieser Erfindung ist die native Signalsequenz, z. B., die native Signalsequenz des Proteins, das durch die Aminosäuren Met¹ bis Thr³⁶ von SEQ ID NO: 2 oder einer heterologen Signalsequenz definiert wird. Eine ausgewählte heterologe Signalsequenz sollte eine solche sein, die durch die Wirtszelle erkannt und prozessiert wird (d. h., durch Signalpeptidase abgespalten wird). Für prokaryontische Wirtszellen, die die native Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, kann die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt werden, die z. B. aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase oder hitzestabile Enterotoxin II-Leadersequenzen ausgewählt wird. Zur Sezernierung aus Hefe kann die Signalsequenz z. B. aus der Gruppe der Hefe-Ivertase-, Alphafaktor- oder Säurephosphatase- Leadersequenzen ausgewählt sein. In der Säugetierzelleexpression können spezifisch die Signalsequenzen von KGF-2 in Gesamtlänge oder anderen FGF-Familienmitgliedern (z. B., KGF) geeignet sein.
Ein Beispiel einer Carboxyl-Terminus-Addition umfasst chimäre Proteine, die die Fusion von KGF-2 mit der gesamten oder einem Teil der konstanten Domäne der schweren oder leichten Kette von menschlichem Immunglobulin umfassen. Solche chimären Polypeptide sind bevorzugt, bei denen der Immunglobulinanteil alle Domänen außer der ersten Domäne der konstanten Region der schweren Kette von menschlichem Immunglobulin umfasst, wie IgG, IgA, IgM oder IgE, insbesondere IgG, z. B., IgG1 oder IgG3. Ein Fachmann wird erkennen, dass jegliche Aminosäure des Aminoglobulinanteils deletiert oder durch eine oder mehrere Aminosäuren substituiert sein kann oder eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt werden können, solange der KGF-2-Anteil weiterhin epitheliale Zellen stimuliert und der Immunglobulinanteil einen oder mehrere seiner charakteristischen Eigenschaften aufzeigt.
Eine andere Gruppe einer Variante (von Varianten) ist eine Aminosäuresubstitutionsvariante(n) der Aminosäuresequenz von reifem KGF-2. Bei dieser Variante(n) wurde mindestens ein Aminosäurerest in der Sequenz von Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2, entfernt und durch einen unterschiedlichen Rest, der an seiner Stelle eingefügt wurde, ersetzt. Substitutionsvarianten umfassen Allelvarianten, welche durch natürlich vorkommende Nukleotidsequenzänderungen in der Speziespopulation charakterisiert sind, die in einem Aminosäurewechsel resultieren können oder auch nicht. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann jegliche Information nutzen, die über die Eindungs- oder aktive Stelle des Polypeptids bekannt ist, in der Auswahl möglicher Mutationsstellen verwenden.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Aminosäureresten oder Regionen zur Mutagenese wird als "alanine scanning mutagenesis" bezeichnet, welche durch Cunningham und Wells (1989), Science, 244: 1081–1085 beschrieben wird, wobei die Offenbarung dieser hiermit durch Referenzieren aufgenommen wird. In diesem Verfahren wird ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z. B., geladene Reste wie Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt (am meisten bevorzugt ist Alanin oder Polyalanin), um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu bewirken. Solche Domänen, die eine funktionelle Sensibilität für Substitutionen aufzeigen, werden dann durch das Einführen zusätzlicher oder alternativer Reste an den Stellen der Substitution verfeinert. Somit ist die Position zur Einführung einer Aminosäuresequenzmodifikation vorbestimmt, und zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einer gegebenen Position kann ein "Alanin Scannen" oder eine zufällige Mutagenese durchgeführt werden und die Variante(n) können auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität und des Grades der Aktivität hin untersucht werden.
Die Positionen von größtem Interesse zur Substitutionsmutagenese umfassen Positionen, in denen bestimmte Reste innerhalb der Aminosäure Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 sich wesentlich von verschiedenen Spezies oder anderen FGF-Familienmitliedem in Bezug auf Seitenkettenmasse, Ladung und/oder Hydrophobizität unterscheiden. Andere Positionen von Interesse umfassen solche, in denen bestimmte Reste innerhalb der Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 identisch unter verschiedenen Spezies oder anderen FGF-Familienmitgliedern sind. Solche Positionen sind im Allgemeinen für die biologische Aktivität eines Proteins wichtig. Dementsprechend würde ein Fachmann wissen, dass diese Positionen zuerst durch Substitution in einer relativ konservativen Weise modifiziert werden sollten.
Solche konservativen Substitutionen werden in Tabelle 1 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Wenn solche Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, dann können wesentlichere Änderungen (exemplarische Substitutionen) eingeführt werden und/oder andere Additionen/Deletionen können durchgeführt werden und die resultierenden Produkte können untersucht werden.
Tabelle 1: Aminosäuresubstitutionen
Bei der Herstellung solcher Änderungen von äquivalenter Natur kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindexes in der Vermittlung einer interaktiven biologischen Funktion auf ein Protein wird im Allgemeinen auf dem Gebiet verstanden (Kyte und Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157: 105–131). Es ist bekannt, dass bestimmte Aminosäuren für andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropathischen Index oder Bewertung substituiert werden können und weiterhin eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten.
Es ist auch auf dem Gebiet bekannt, dass die Substitution ähnlicher Aminosäuren wirksam auf der Basis der Hydrophilie durchgeführt werden kann, insbesondere, wenn das biologisch funktionelle äquivalente Protein oder Peptid, das dadurch hergestellt wird, zur Verwendung in immunologischen Ausführungsformen vorgesehen ist, wie es der vorliegende Fall ist. U.S. Patent 4,554,101, dessen Offenbarung hiermit durch Referenzieren aufgenommen wird, besagt, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilie ihrer benachbarten Aminosäuren bestimmt wird, mit seiner Immunogenitätund Antigenität korreliert, d. h., mit der biologischen Eigenschaft des Proteins.
U.S. Patent 4,554,101 lehrt auch das Identifizieren und Herstellen von Epitopen aus primären Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie. Durch diese Verfahren, die in U.S. Patent 4,554,101 offenbart sind, wäre ein Fachmann in der Lage, Epitope zu identifizieren, z. B., innerhalb der Aminosäuresequenz von KGF-2. Diese Regionen werden auch als "epitope Kernregionen" bezeichnet. Verschiedene wissenschaftliche Publikationen haben sich der Voraussage der sekundären Struktur und der Identifizierung von Epitopen aus Analysen von Aminosäuresequenzen gewidmet (Chou und Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 222–245; Chou und Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 211–222; Chou und Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45– 148; Chou und Fasman (1978), Ann. Rev. Biochem., 47: 251–276 und Chou und Fasman (1979), Biophys. J., 26: 367–384). Zudem sind derzeit Computerprogramme verfügbar, die die Voraussage antigener Anteile und epitoper Kernregionen von Proteinen unterstützen. Beispiele umfassen solche Programme, die auf der Jameson-Wolf-Analyse basieren (Jameson und Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1): 181–186 und Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1): 187–191, deren Offenbarungen hiermit durch Referenzieren aufgenommen werden); das Programm PepPlot^® (Brutlag et al. (1990), CABS, 6: 237–245 und Weinberger et al. (1985), Science, 228: 740–742; und andere neuere Programme zur Voraussage einer tertiären Proteinstruktur (Fetrow und Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11: 479–483).
Im Gegensatz dazu können wesentliche Modifikationen in den funktionellen und/oder chemischen Eigenschaften der Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 durch die Auswahl von Substitutionen erreicht werden, die sich wesentlich in ihrer Wirkung auf den Erhalt der (a) Struktur des Polypeptidrückgrats in der Region der Substitution unterscheiden, zum Beispiel als eine Faltblatt- oder helikale Konformation, (b) die relative Ladung oder Hydrophobie des Proteins an der Zielstelle oder (c) die Masse der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden in Gruppen aufgeteilt, die auf gemeinsamen Eigenschaften der Seitenkette basieren:

1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
3) sauer: Asp, Glu;
4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
6) aromatische: Trp, Tyr, Phe.

Nicht-konservative Substitutionen können den Austausch eines Mitglieds eines dieser Gruppen für eine andere involvieren. Derart substituierte Reste können in Regionen der Aminosäurereste Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 eingeführt werden, die, z. B., mit Regionen anderer Familienmitglieder homolog sind oder in nicht-homologen Regionen des Proteins.
In einer spezifischen Ausführungsform wird eine Polypeptidvariante vorzugsweise im wesentlichen homolog zu den Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 sein. Der Begriff "im wesentlichen homolog", wie er hier verwendet wird, bedeutet das Aufweisen eines Grades an Homologie (d. h., Identität von Aminosäureresten) zu den Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 größer als achtzig Prozent (80%); vorzugsweise größer als neunzig Prozent (90%); mehr bevorzugt größer als fünfundneunzig Prozent (95%); und am meisten bevorzugt größer als neunundneunzig Prozent (99%). Der Prozentanteil an Homologie, wie er hier beschrieben wird, wird als der Prozentanteil der Aminosäurereste berechnet, der in der kleineren der zwei Sequenzen zu finden ist, die mit identischen Aminosäureresten in der Sequenz ausgerichtet wird, die verglichen wird, wenn vier Lücken in einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um diese Ausrichtung zu unterstützen, wie durch Dayhoff (1972) in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C. aufgeführt wird. Auch umfasst als im Wesentlichen homolog sind Varianten der Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2, die bedingt durch ihre Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen die Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 isoliert werden können, oder deren Gene, die durch Hybridisierung mit der DNA von SEQ ID NO: 1 oder mit Segmenten davon isoliert werden können.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden zu schätzen wissen, dass viele Kombinationen von Deletionen, Einfügungen und Substitutionen unter der Voraussetzung gemacht werden können, dass das fertige KGF-2 Protein biologisch aktiv ist. Ein KGF-2 Proteine) kann schnell untersucht werden, um seine physikalischen Eigenschaften zu bestimmen. Zum Beispiel kann der Grad der biologischen Aktivität (z. B., Rezeptorbindung und/oder Affinität, mitogene, zellproliferative und/oder in vivo-Aktivität) unter Verwendung einer Reihe von Assays getestet werden. Ein solcher Assay umfasst einen mitogenen Assay, um die Fähigkeit eines Proteins zu untersuchen, die DNA-Synthese zu stimulieren (Rubin et al. (1989), supra). Ein anderer solcher Assay umfasst einen Zellproliferationsassay zur Untersuchung der Fähigkeit eines Proteins, die Zellproliferation zu stimulieren (Falco et al. (1988), Oncogene, 2: 573–578).
Polypeptidderivate
Auch umfasst im Umfang der vorliegenden Erfindung sind chemisch modifizierte Derivate von KGF-2 Proteinen) bei denen das Polypeptid an ein Polymer gebunden ist, um Eigenschaften zu verändert (werden hier als "Derivate" bezeichnet). Chemisch modifizierte Derivate von KGF-2 Proteinen) können durch einen Fachmann auf dem Gebiet mit der hier gegebenen Offenbarung hergestellt werden. Konjugate können unter Verwendung glykosylierter, nicht-glykosylierter oder deglykosylierter KGF-2 Proteine) hergestellt werden. Typischerweise wird ein nicht-glycosyliertes KGF-2 Proteine) verwendet.
Geeignete chemische Bereiche zur Derivatisierung umfassen wasserlösliche Polymere. Wasserlösliche Polymere sind wünschenswert, da das Protein, an welches diese gebunden sind, nicht in einer wässrigen Umgebung, wie einer physiologischen Umgebung, ausgefällt wird. Vorzugsweise wird das Polymer pharmazeutisch verträglich zur Herstellung eines therapeutischen Produkts oder einer Zusammensetzung sein. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer basierend auf solchen Überlegungen auszuwählen und feststellen zu können, ob das Polymer-/Konjugat therapeutisch verwendet werden kannund, wenn dies der Fall ist, das therapeutische Profil bestimmen (z. B., die Dauer einer anhaltenden Freisetzung; Resistenz gegen Proteolyse, die Wirkungen, falls welche da sind, auf die Dosierung, biologischer Aktivität; die Handhabbarkeit beim Einsatz; der Grad oder Mangel an Antigenizität und andere bekannte Wirkungen eines wasserlöslichen Polymers auf ein therapeutisches Protein).
Geeignete klinisch verträgliche, wasserlösliche Polymere umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Polyethylenglykol (PEG), Polyethylenglykolpropionaldehyd, Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Monomethoxy-polyethylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydridcopolymer, Poly(β-aminsäuren) (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere), Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Polypropylenglykol-Homopolymere (PPG) und andere Polyalkylenoxide, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole (POG) (z. B., Glycerin) und andere polyoxyethylierte Polyole, polyoxyethyliertes Sorbitol oder polyoxyethylierte Glukose, colonic acid oder andere Kohlenhydratpolymere, Ficoll oder Dextran und Mischungen davon. Wie hierin verwendet, soll ein Polyethylenglykol jegliche der Formen umfassen, die verwendet wurden, um andere Protein zu derivatisieren, wie Mono-(C1-C10)alkoxy- oder Arzloxy-polyethylenglykol. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann Vorteile bedingt durch seine Stabilität in Wasser bei der Herstellung aufweisen.
Die wasserlöslichen Polymere können jeweils jegliches Molekulargewicht aufweisen und können verzweigt oder unverzweigt sein. Im Allgemeinen, je höher das Molekulargewicht oder je mehr Verzweigungen, desto höher das Polymer : Proteinverhältnis. Die wasserlöslichen Polymere haben jeweils typischerweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von zwischen ungefähr 2 kDa bis ungefähr 100 kDa (der Begriff "ungefähr" zeigt an, dass in den Zubereitungen eines wasserlöslichen Polymers einige Moleküle mehr, andere weniger als das genannte Molekulargewicht wiegen werden). Das durchschnittliche Molekulargewicht eines jeweiligen löslichen Polymers liegt vorzugsweise zwischen 5 kDa und ungefähr 40 kDa, mehr bevorzugt zwischen ungefähr 10 kDa und ungefähr 35 kDa und am meisten bevorzugt ungefähr 15 kDa und ungefähr 30 kDa.
Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Anbindung, die dem Fachmann auf dem Gebiet zur Verfügung stehen, einschließlich Acylierungsreaktionen oder Alkylierungsreaktionen (vorzugsweise, um ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein herzustellen) mit einem reaktiven wasserlöslichen Molekül. Siehe z. B. EP 0 401 384 , dessen Offenbarung hiermit durch Referenzieren aufgenommen wird; siehe auch Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20: 1028–1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4–10, puliziert durch Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK; EP 0 154 316 ; EP 0 401 384 ; WO 92/16221; WO 95/34326; "0 95/13312; WO 96/11953; PCT International Application No. US 96/19459; und die anderen Publikationen, die hier zitiert werden, die sich auf eine Pegylierung beziehen.
Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein nicht-verzweigtes Monomethoxy-polyethylenglykolaldehydmolekül mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa, das mittels reduktiver Alkylierung an den N-Terminus eines KGF-2 Proteins konjugiert ist.
Polyvalente Formen
Es können polyvalente Formen, d. h., Moleküle, die mehr als einen aktiven Bereich umfassen, hergestellt werden. In einer Ausführungsform kann das Molekül mehrere KGF-2 Proteine) umfassen. Zusätzlich kann das Molekül mindestens ein KGF-2 Proteine) besitzen und, abhängig von der gewünschten Eigenschaft der polyvalenten Form, mindestens ein anderes Molekül.
In einer Ausführungsform kann das KGF-2 Proteine) chemisch gekoppelt werden. Zum Beispiel kann das KGF-2 Proteine) chemisch an ein divalentes wasserlösliches Polymer mittels der oben beschriebenen Pegylierungstechnologie gekoppelt werden. Zusätzlich kann KGF-2 Proteine) chemisch an ein Biotin gekoppelt werden und das Bio tin/KGF-2 Protein(e), das konjugiert ist, kann dann an Avidin binden, was in tetravalenten Avidin/Biotin/KGF-2 Proteinen) resultiert. KGF-2 Proteine) kann auch kovalent an Dinitrophenol (DNP) oder Trinitrophenol (TNP) gebunden werden und in Konjugaten resultieren, die mit Anti-DNP oder Anti-TNP-IgM präzipitieren, um dekamere Konjugate zu ergeben.
In einer noch anderen Ausführungsform kann ein rekombinantes Fusionsprotein hergestellt werden, das ein KGF-2 Proteine) enthält, worin jedes rekombinante chimäre Molekül eine-KGF-2 Proteinsequenz(en), wie sie oben beschrieben wird, aufweist, substituiert durch die variablen Domänen von entweder einer oder beider der schweren oder leichten Ketten der Immunglobulinmoleküle und die alle oder einen Teil der konstanten Domänen aufweisen, aber zu mindestens eine konstante Domäne der schweren oder leichten Kette von menschlichem Immunglobulin. Zum Beispiel kann jedes solches chimäere KGF-2 Proteine)/IgG1 Fusionsprotein aus zwei chimären Genen hergestellt werden: ein KGF-2 Proteine)/menschliches kappa leichte Ketten Chimäres (KGF-2 Proteine)/Ck) und ein KGF-2 Protein/menschliches gamma-1 schwere Ketten Chimäres (KGF-2 Protein/Cg-1). Nach der Transkription und Translation der zwei chimären Gene, wie sie unten beschrieben werden, können die Genprodukte in ein einzelnes chimäres Molekül zusammengebaut werden, das ein KGF-2 Proteine) aufweist, das bivalent präsentiert wird. Zusätzliche Details, die sich auf die Herstellung solcher chimären Moleküle beziehen, werden in dem U.S. Patent Nr. 5,116,964, der PCT Veröffentlichung Nr. WO 89/09622, der PCT Veröffentlichung Nr. WO 91/16437 und EP 315 062 offenbart.
In einer noch weiteren Ausführungsform können auch rekombinante Fusionsproteine hergestellt werden, wobei jedes rekombinante chimäre Molekül mindestens ein KGF-2 Protein(e), wie es unten beschrieben wird, und mindestens einen Teil der Region 186– 401 von Osteoprotegerin (OPG) aufweist, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. 96309363.8 beschrieben wird.
Die Herstellung von KGF-2 Proteinen) wird in weiterem Details unten beschrieben. Solche Proteine können z. B. durch rekombinante Techniken oder durch in vitro chemische Synthese des gewünschten KGF-2 Proteins hergestellt werden.
Polynukleotide
Basierend auf der vorliegenden Beschreibung unter Verwendung der universellen Kodon-Tabelle kann ein Fachmann auf dem Gebiet leicht alle der Nukleinsäuresequenzen bestimmen, die eine Aminosäuresequenz eines KGF-2 Proteins kodieren.
Es können rekombinante Expressionstechniken gemäß den Beschreibungen durchgeführt werden, die unten aufgezeigt werden, um diese Polynukleotide herzustellen und die kodierten Proteine zu exprimieren. Zum Beispiel kann ein Fachmann auf dem Gebiet durch das Einfügen einer Nukleinsäuresequenz, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, in einem geeigneten Vektor leicht große Mengen der gewünschten Nukleotidsequenz herstellen. Die Sequenzen können dann verwendet werden, um Nachweissonden oder Amplifikationsprimer herzustellen. Alternativ dazu kann ein Polynukleotid, das ein KGF-2 Proteine) kodiert, in einen Expressionsvektor eingeführt werden. Durch das Einführen des Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt kann das gewünschte KGF-2 Proteine) in großen Mengen hergestellt werden.
Wie weiterhin hieri beschrieben ist, sind viele Wirt-/Vektor-Systeme zur Vermehrung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen und/oder der Herstellung von KGF-2 Proteinen) verfügbar. Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Plasmid-, virale und Insertionsvektoren sowie prokaryontische und eukaryontische Wirte. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann ein Wirt-/Vektor-System anpassen, welches in der Lage ist, heterologe DNA zu vermehren oder zu exprimieren, um die Sequenzen der vorliegenden Erfindung herzustellen oder zu exprimieren.
Des Weiteren werden die Fachleute auf dem Gebiet zu schätzen wissen, dass, in Hinblick auf die vorliegende Offenbarung, die Nukleinsäuresequenzen die Nukleinsäuren 109 bis 624 von SEQ ID NO: 1 sowie degenerierte Nukleinsäuresequenzen davon, Nukleinsäuresequenzen, die eine Variante(n) von reifem KGF-2 kodieren und solche Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche an Komplementäre der Nukleinsäuren 109 bis 624 von SEQ ID NO: 1 hybridisieren (unter Hybridisierungsbedingungen, die in dem Abschnitt der cDNA-Biobliotheksuntersuchung offenbart sind, oder äquivalente Bedingungen oder stringentere Bedingungen).
Durch die vorliegende Erfindung werden auch rekombinante DNA Konstrukte zur Verfügung gestellt, die Vektor DNA zusammen mit den DNA Sequenzen beinhalten, die KGF-2 Proteine kodieren. In jedem solchen DNA Konstrukt ist die Nukleinsäureseqüenz, die ein KGF-2 Proteine) kodiert (mit und ohne Signalpeptiden) in wirksamer Verbindung mit einer geeigneten, die Expression kontrollierenden oder regulatorischen Sequenz, die in der Lage ist, die Replikation und/oder die Expression des KGF-2 Proteins(e) in einem ausgewählten Wirt zu dirigieren.
Herstellung von Polynukleotiden
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, kann leicht durch eine Reihe von Wegen erhalten werden, einschließlich, ohne Einschränkung, chemische Synthese, cDNA- oder genomische Bibliotheksdurchmusterung, Expressionsbibliotheksdurchmusterung und/oder PCR Amplifikation von cDNA. Diese Verfahren und andere, welche zur Isolierung der Nukleinsequenzen nützlich sind, werden in Shambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; durch Ausubel et al. (1994), Eds Current Protocols Press; und durch Berger und Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, beschrieben.
Die chemische Synthese von Nukleinsäuresequenzen, die die gewünschten Proteine kodieren, kann unter Verwendung von Verfahren erreicht werden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, wie solche, die durch Engels et al. aufgeführt werden (1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716–734 und Wells et al. (1985), Gene, 34: 315. Diese Verfahren umfassen inter alia die Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonatverfahren der Nukleinsäuresequenzsynthese. lange Nukleinsäuresequenzen, z. B. solche, die länger als 100 Nukleotide sind, können in mehreren Fragmenten synthetisiert werden. Diese Fragmente können dann zusammen ligiert werden, um eine geeignete Nukleinsäuresequenz zu ergeben. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Polymer-unterstützte Synthese unter Verwendung einer Standard-Phosphoramiditchemie.
Alternativ dazu kann eine geeignete Nukleinsäuresequenz durch das Durchmustern einer geeigneten cDNA-Bibliothek erhalten werden (d. h., eine Bibliothek, die aus einer oder mehreren Gewebequellen hergestellt wurde, von denen angenommen wird, dass sie das Protein exprimieren) oder einer genomischen Bibliothek (eine Bibliothek, die aus gesamtgenomischer DNA hergestellt wurde). Die Quelle der cDNA-Bibliothek ist typischerweise ein Gewebe aus irgendeiner Spezies, von der angenommen wird, dass sie ein gewünschtes Protein in einer sinnvollen Menge exprimiert. Die Quelle der genomischen Bibliothek kann jegliches Gewebe oder Gewebe aus jeglichem Säugetier oder einer anderen Spezies sein, von dem angenommen wird, dass es ein Gen trägt, das ein KGF-2 Proteine) kodiert.
Hybridisierungsmedien können auf die Gegenwart einer DNA hin untersucht werden, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäuresonden (Oligonukleotide, cDNA oder genomische DNA-Fragmente, die einen akzeptablen Grad an Homologie zur cDNA oder dem zu klonierenden Gen aufweist), die selektiv mit cDNA(s) oder Genen) hybridisieren, die in der Bibliothek vorhanden ist. Die typischerweise für solche Durchmusterungsverfahren verwendeten Sonden kodieren eine kleine Region der DNA Sequenz aus der gleichen oder einer ähnlichen Spezies, wie die Spezies, aus der Bibliothek hergestellt wurde. Alternativ dazu können die Sonden degeneriert sein, wie hier diskutiert wurde.
Hybridisierung wird typischerweise durch das Annealen der Oligonukleotidsonde oder cDNA an die Klone unter stringenten Bedingungen durchgeführt, die nicht-spezifische Bindung verhindern, aber die Bindung solcher Klone erlauben, die einen signifikanten Grad an Homologie mit der Sonde oder dem Primen aufweisen. Typische Hybridisierungs- und Wasch-Stringenzbedingungen hängen teilweise von der Größe (d. h. Nukleotidlänge) der cDNA oder der Oligonukleotidsonde ab, und inwieweit die Sonde degeneriert ist. Die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung eines Klons wird auch bei der Herstellung des Hybridisierungsmediums berücksichtigt (z. B. ob eine cDNA- oder genomische Bibliothek durchgemustert wird.
Wenn ein DNA-Fragment (wie eine cDNA) als Sonde verwendet wird, umfassen typische Hybridisierungsbedingungen solche, die in Ausubel et al. (1994), Eds, supra, aufgeführt sind. Nach der Hybridisierung wird das Hybridisierungsmedium bei einer geeigneten Stringenz gewaschen, die abhängig von verschiedenen Faktoren wie der Sondengröße, erwartete Homologie der Sonde zum Klon, dem zu untersuchenden Hybridisierungsmedium, der Anzahl der zu untersuchenden Klone und Ähnlichem ist. Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierung in 4 × SSC bei 62– 67°C, gefolgt durch Waschen in 0,1 × SSC bei 62–67°C für ungefähr eine Stunde. Alternativ dazu sind exemplarische stringente Hybridsierungsbedingungen eine Hybridisierung in 45–55% Formamid, 4 × SSC bei 40–45°C. Auch umfasst sind DNA Sequenzen, welche an die Nukleinsäuresequenzen unter Hybridisierungsbedingungen erleichterter Stringenz hybridisieren, die in 1 aufgeführt werden und welche KGF-Protein(e) kodieren. Beispiele solcher erleichterten Stringenzhybridisierungsbedingungen sind 4 × SSC bei 45–55°C oder Hybridisierung bei 30–40% Formamid bei 40– 45°C. Siehe Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring-Harbor Laboratory, Seiten 387 bis 389.
Es gibt auch exemplarische Protokolle für stringente Waschbedingungen, bei denen Oligonukleotidsonden verwendet werden, um Hybridisierungsmediendurchzumustern. Zum Beispiel verwendet ein erstes Protokoll 6 × SSC mit 0,05 Prozent Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur zwischen ungefähr 35°C und 63°C, abhängig von der Länge der Sonde. Zum Beispiel werden Sonden mit 14 Basen bei 35–40°C, Sonden mit 17 Basen bei 45–50°C, Sonden mit 20 Basen bei 52–57°C und Sonden mit 23 Basen bei 57–63°C gewaschen. Die Temperatur kann um 2–3°C erhöht werden, wenn der Hintergrund nicht-spezifischer Bindung hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen. Eine derartige stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2% SDS.
Ein anderes Verfahren zur Gewinnung einer geeigneten Nukleinsäuresequenz ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Verfahren wird cDNA aus Poly (A)⁺ RNA oder Gesamt-RNA unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase hergestellt. Zwei Primer, typischerweise komplementär zu zwei unterschiedlichen Regionen der cDNA (Oligonukleotide), die ein KGF-2 Proteine) kodiert, werden dann zu der cDNA zusammen mit einer Polymerase, wie der Taq-Polymerase, hinzugefügt und die Polymerase amplifiziert die cDNA-Region zwischen den Primern.
Die Oligonukleotidsequenzen, die als Sonden oder Primer ausgewählt werden, sollten von adäquater Länge und ausreichend eindeutig sein, um die Menge an nichtspezifischer Bindung zu minimieren, die während der Durchmusterung oder PCR-Amplifikation vorkommen kann. Die tatsächliche Sequenz der Sonden oder Primer basiert üblicherweise auf konservierten oder hoch homologen Sequenzen oder Regionen.
Optional können die Sonden oder Primen vollständig oder teilweise degeneriert sein, d. h., sie können eine Mischung von Sonden/Primern enthalten, die alle die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, aber dazu verschiedene Kodons verwenden. Eine Alternative zur Herstellung von degenerierten Sonden ist es, ein Inosin in einige oder alle der Kodonpositionen zu platzieren, die mit der Spezies variieren können. Die Oligonukleotidsonden oder Primer können durch chemische Syntheseverfahren für DNA, wie oben beschrieben, hergestellt werden.
Vektoren
Die DNA, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, kann in Vektoren zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression eingefügt werden. Geeignete Vektoren sind kommerziell verfügbare oder der Vektor kann speziell hergestellt werden. Die Auswahl oder Herstellung eines geeigneten Vektors wird von (1), ob er zur DNA-Amplifikation oder zur DNA-Expression verwendet werden soll, (2) der Größe der in den Vektor einzufügenden DNA und (3) der mit dem Vektor zu transformierenden vorgesehenen Wirtszelle abhängen.
Die Vektoren involvieren jeweils eine Nukleinsäuresequenz, die ein gewünschtes Protein kodiert, das wirksam an eine oder mehrere der folgenden Expressionskontroll- oder regulatorischen Sequenzen gebunden ist, die in der Lage sind, die Expression eines gewünschten Proteins durch eine ausgewählte Wirtszelle zu steuern, kontrollieren oder anderweitig zu bewirken. Jeder Vektor enthält, abhängig von seiner Funktion (Amplifikation der DNA oder Expression der DNA) und seiner Kompatibilität mit der vorgesehenen Wirtszelle verschiedene Komponenten. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind aber nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, eine oder mehrere Selektions- oder Markergene, Promotoren, Verstärkerelemente, eine Transkriptionsterminierungssequenz und Ähnliche. Diese Komponenten können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden.
Beispiele geeigneter prokaryontischer Klonierungsvektoren umfassen Bakteriophagen wie Derivate von Lamda oder Plasmide aus E. coli (z. B. pBR322, col E1, pUC, den F-Faktor und Bluescript^®-Plasmidderivate (Stratagene, LaJolla, CA)). Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen viele Arten auf dem Gebiet für Wirtszellen bekannt sind, die unten beschrieben werden, können auch für diese Zwecke verwendet werden.
Signalsequenz
Die Nukleinsäure, die eine Signalsequenz kodiert, kann 5' von der Sequenz eingefügt werden, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, z. B., kann sie eine Komponente eines Vektors sein oder sie kann Teil einer Nukleinsäure sein, die ein KGF-2 Proteine) kodiert. Die Nukleinsäure, die die native Signalsequenz von KGF-2 kodiert, ist bekannt (WO 96/25422).
Replikationsursprung
Die Expressions- und Klonierungsvektoren umfassen im Allgemeinen eine Nukleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. In einem Klonierungsvektor ist diese Sequenz typischerweise eine, die den Vektor in die Lage versetzt, unabhängig von der wirtschromosomalen DNA zu replizieren und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind wohl bekannt. Solche Sequenzen sind wohl bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet und verschiedene Ursprünge (z. B., SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen wird der Replikationsursprung für Säugetierexperessionsvektoren nicht benötigt (z. B., der SV40-Ursprung wird oft nur verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Selektionsgen
Die Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise jeweils ein Selektionsgen. Dieses Gen kodiert ein "Marken"-Protein, das für das Überleben und das Wachstum der transformierten Wirtszellen notwendig ist, wenn diese in einem Selektionskulturmedium wachsen gelassen werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, werden das Selektionsgen nicht enthalten und werden daher nicht in dem Kulturmedium überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine vermitteln, z. B., Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin; (b) auxotrophe Mängel komplmentieren; oder (c) kritische Nährstoffe zur Verfügung stellen, die aus dem Kulturmedium nicht verfügbar sind.
Andere Selektionsgene können verwendet werden, um die zu exprimierenden Gene zu amplifizieren. Die Amplifikation ist ein Verfahren, bei dem Gene, für die ein größerer Bedarf zur Herstellung eines Proteins besteht, die kritisch für das Wachstum sind, in Tandem innerhalb der Chromosomen sukzessiver Generationen rekombinanter Zellen vermehrt wird. Beispiele geeigneter selektiver Marker für Säugetierzellen umfassen Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidinkinase. Die Zelltransformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, auf den nur die Transformanten besonders adaptiert sind, um bedingt durch den in dem Vektor vorhandenen Marker zu überleben. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der transformierten Zellen unter Bedingungen, bei den die Konzentration des Selektionsmittels in dem Medium nacheinander gewechselt wird, ausgeübt, wodurch eine Amplifikation von beiden, dem Selektionsgen und der DNA, die das gewünschte Protein kodiert, herbeigeführt wird. Als ein Ergebnis werden erhöhte Mengen des gewünschten Proteins aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
Zum Beispiel werden Zellen, die mit dem DHFR Selektionsgen transformiert wurden, zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat enthält, ein kompetitiver Antagonist von DHFR. Eine geeignete Wirtszelle, wenn ein Wildtyp DHFR verwendet wird, ist die chinesische Hamsterovarzelllinie, der es an DHFR-Aktivität fehlt (Urlaub und Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77 (7): 4216–4220). Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Mengen an Methotrexat ausgesetzt. Dieses führt zu der Synthese von multiplen Kopien des DHFR Gens und gleichzeitig zu Mehrtachkopien von anderer DNA, die in dem Expressionsvektor vorhanden ist, wie der DNA, die das gewünschte Protein kodiert.
Promotoren
Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise jeweils einen Promotor enthalten, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und an eine Nukleinsäuresequenz operativ gebunden ist, die das gewünschte Protein kodiert. Ein Promotor ist eine nicht-translatierte Sequenz, die stromaufwärts (5') zum Startkodon eines strukturellen Gens (im Allgemeinen innerhalb 100 bis 1000 Bp) lokalisiert ist, die die Transkription und Translation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz kontrolliert. Ein Promotor kann konventionellerweise in eine von zwei Klassen eingruppiert werden, induzierbare Promotoren und konstitutive Promotoren. Ein induzierbarer Promotor löst erhöhte Mengen an Transkription von DNA unter seiner Kontrolle als Reaktion auf eine Änderung in den Kulturbedingungen aus, wie der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder einer Änderung in der Temperatur. Eine große Anzahl von Promotoren, die durch eine Reihe potenzieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohl bekannt. Ein Promotor kann operativ an DNA, die das gewünschte Protein kodiert, durch das Entfernen des Promotors aus der Quell-DNA durch Restriktionsenzymverdau und das Einfügen der gewünschten Promotorsequenz gebunden werden. Die native KGF-2 Promotörsequenz kann verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression von DNA zu steuern, die ein gewünschtes Protein kodiert. Ein heterologer Promotor ist bevorzugt, jedoch nur, wenn er eine erhöhte Transkription und höhere Ausbeute des exprimierten Proteins im Vergleich zu dem nativen Promotor erlaubt und, wenn er kompatibel mit dem Wirtszellsystem ist, das zur Verwendung ausgewählt wurde. Zum Beispiel kann jegliche der nativen Promotorsequenzen der anderen FGF-Familienmitgliedern verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der DNA zu steuern, die das gewünschte Protein kodiert.
Zur Verwendung mit prokanontischen Wirtszellen geeignete Promotoren umfassen die Beta-Lactamase- und Lactose-PROMOTORsysteme; alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp) Promotorsystem; ein bakterielles Lumineszenz(luxR) Gensystem und Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor. Andere bekannte bakterielle Promotoren sind auch geeignet. Deren Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, womit der Fachmann auf dem Gebiet in die Lage versetzt wird, diese in die gewünschten DNA Sequenzen unter Verwendung von Linkern und Adaptoren zu ligieren, die benötigt werden, um jegliche notwendigen Restriktionsschnittstellen zur Verfügung zu stellen.
Geeignete unterstützende Sequenzen zur Verwendung mit Hefezellen sind auch auf dem Gebiet bekannt. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Säugetierwirtszellen sind wohl bekannt und umfassen solche, die aus den Genomen von Viren erhalten werden, wie dem Polyomavirus, Geflügelpestvirus, Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogelsarkomavirus, Zytomegalovirus, ein Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt Simianvirus 40 (SV40). Andere geeignete Säugetierpromoto ren umfassen heterologe Säugetierpromotoren, z. B., Hitzeschockpromotoren und den AktinPromotor.
Verstärkerelemente
Die Expressions- und Klonierungsvektoren werden typischerweise jeweils eine Verstärkersequenz enthalten, um die Transkription einer DNA Sequenz. die ein gewünschtes Protein kodiert, durch höhere Eukaryonten zu erhöhen. Verstärker sind cis-wirkende Elemente der DNA, normalerweise ungefähr 10–300 Bp in Länge, die auf den Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen.
Verstärker sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig. Sie werden 5'- und 3'- zur Transkriptionseinheit gefunden. Hefeverstärker werden vorteilhafterweise mit Hefepromotoren verwendet. Verschiedene Verstärkersequenzen, die aus Säugetiergenen verfügbar sind, sind bekannt (z. B., Globin, Elastase, Albumin, Alpha-Fetoprotein und Insulin). Zusätzlich sind virale Verstärker wie der SV40-Verstärker, der Zytomegalovirus frühe Promotorverstärker, der Polyomaverstärker und Adenovirusverstärker exemplarische verstärkende Elemente für die Aktivierung eukaryontischer Promotoren. Während ein Verstärker in einen Vektor bei einer Position 5' oder 3' zu einer DNA gespliced werden kann, die ein gewünschtes Protein kodiert, wird er typischerweise an einer Stelle 5' von dem Promotor positioniert.
Transkriptionsterminierung
Expressionsvektoren, die in eukaryontischen Zellen verwendet werden, werden jeweils typischennreise eine Sequenz enthalten, die zur Terminierung der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig ist. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den 5'- und manchmal 3'- nicht-translatierten Regionen eukaryontischer DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in dem nicht-translatierten Teil der mRNA transkribiert werden, der das gewünschte Protein kodiert.
Die Herstellung eines geeigneten Vektors, der eine oder mehrere der oben aufgelisteten Komponenten enthält (zusammen mit der gewünschten kodierenden Sequenz) wird durch Standardligierungstechniken erreicht. Isolierte Plasmide oder DNA Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und wieder in der gewünschten Reihenfolge ligiert, um den benötigten Vektor herzustellen. Um zu bestätigen, dass die korrekte Sequenz hergestellt wurde, kann die Ligationsmischung verwendet werden, um E. coli zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten können durch bekannte Techniken, wie sie oben beschrieben werden, ausgewählt werden. Größere Mengen des Vektors aus den Transformanten werden dann hergestellt, durch Restriktionsendonukleaseverdau analysiert und/oder sequenziert, um die Gegenwart des gewünschten Konstnakts zu bestätigen.
Ein Vektor, der die transiente Expression von DNA zur Verfügung stellt, die ein gewünschtes Protein in Säugetierzellen kodiert, kann auch verwendet werden. Im Allgemeinen involviert die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum große Mengen des gewünschten Proteins synthetisiert, das durch den Expressionsvektor kodiert wird. Jedes transiente Expressionssystem, das einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfasst, ermöglicht die bequeme positive Identifizierung von Proteinen, die durch klonierte DNAs kodiert werden, sowie zur schnellen Durchmusterung auf solche Proteine der gewünschten biologischen oder physiologischen Eigenschaften.
Wirtszellen
Jede einer Reihe von rekombinanten Wirtszellen, von denen jede eine Nukleinsäuresequenz zur Verwendung zur Expression eines gewünschten Proteins enthält, wird auch durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Exemplarische prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen umfassen bakterielle, Säugetier-, Pilz-, Insekten-, Hefe- oder Pflanzenzellen.
Prokaryontische Wirtszellen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt, auf Eubakterien wie gram-negative oder gram-positive Organismen (z. B. E. coli (HB101, DH5a, DH10 und MC1061); Bacilli wie B. subtilis; Pseudomonas-Spezies wie P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella typhimurium; oder Serratia marcescans. Als eine spezifische Ausführungsform kann ein KGF-2 Proteine) in E. coli exprimiert werden.
Zusätzlich zu prokaryontischen Wirtszellen können KGF-2 Proteine) in glykosylierter Form aus jeglichen einer Reihe von geeigneten Wirtszellen exprimiert werden, die aus multizellulären Organismen abgeleitet sind. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip kann jede höhere eukaryontische Zellkultur verwendet werden, egal ob die Kultur Wirbeltier oder Nichtwirbeltierzellen, einschließlich Pflanzen und Insektenzellen, involviert.
Eukaryontische Mikroorganismen, wie filamentöse Pilze und Hefe, können geeignete Wirtszellen zur Expression eines KGF-2 Proteins sein. Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe wird unter den niederen eukaryontischen Wirtsmikroorganismen am häufigsten verwendet, aber es ist auch eine Anzahl anderer Genera, Spezies und Stämme wohl bekannt und üblicherweise verfügbar.
Es können Wirbeltierzellen verwendet werden, weil die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebskultur) ein wohl bekanntes Verfahren ist. Beispiele von nützlichen Säugetierwirtszelllinien umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die Affennieren CV1 Linie, die mit SV40 (COS-7) transformiert ist, menschliche embryonale Nierenlinie (293 Zellen oder 293 Zellen, die auf Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden), Babyhamstemierenzellen und chinesische Hamsterovarzellen. Andere geeignete Säugetierzellliriien umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, HeLa, Maus L-929-Zellen, 3T3-Linien, die aus Swiss, Balb-c oder NIH-Mäusen abgeleitet sind und BHK- oder HaK-Harristerzelllinien. Als eine spezifische Ausführungsform kann ein KGF-2 Proteine) in COS-Zellen oder in Baculovirus-Zellen exprimiert werden.
Eine Wirtszelle kann mit einer gewünschten Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen transfiziert und vorzugsweise transformiert werden, die die Expression der Nukleinsäure erlauben. Die Auswahl von geeigneten Wirtszellen und Verfahren zur Transformierung, Kultivierung, Amplifikation, Durchmusterung und Produktherstellung und Aufreinigung sind auf dem Gebiet wohl bekannt. (Gething and Shambrook (1981), Nature, 293: 620–625 oder, alternativ dazu, Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750– 1759 oder U.S. Pat. Nr. 4,419,446). Zum Beispiel kann für Säugetierzellen ohne Zellwände das Kalziumphosphatfällungsverfahren verwendet werden. Elektroporation, Mikroinjektion und andere bekannte Techniken können auch verwendet werden.
Es ist auch möglich, dass ein gewünschtes Protein durch homologe Rekombination oder mit rekombinanten Produktionsverfahren unter Verwendung von Kontrollelementen hergestellt werden können, die in eine Zelle eingeführt werden, die bereits eine DNA enthält, die ein KGF-2 Proteine) enthält. Die homologe Rekombination ist eine Technik, die ursprünglich zum Zielen auf Gene entwickelt wurde, um Mutationen in transkriptionell aktiven Genen zu induzieren oder korrigieren (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. und Mol. Biol., 36: 301). Die Basistechnik wurde als ein Verfahren zur Einführung spezifischer Mutationen in spezifische Regionen des Säugetiers des Säugetiergenoms entwickelt (Thomas et al. (1986), Cell, 44: 419–428; Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51: 503–512 und Doetschman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583– 8587) oder um spezifische Mutationen innerhalb defekter Gene zu korrigieren (Doetschman et al. (1987), Nature, 330: 576–578). Beispielhafte Techniken werden im U.S. Patent Nr. 5,272,071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 und WO 94/31560 beschrieben.
Kultivierung der Wirtszellen
Das Verfahren zur Kultivierung einer jeden oder mehrerer rekombinanten Wirtszellen zur Herstellung eines gewünschten Proteins wird abhängig von vielen Faktoren und Überlegungen variieren; das optimale Herstellungsverfahren für eine gegebene Situation wird sich den Fachleuten auf dem Gebiet durch minimales Experimentieren eröffnen. Solche rekombinanten Wirtszellen werden in geeignetem Medium kultiviert und das exprimierte Protein wird dann optional wiedergewonnen, isoliert und aus dem Kulturmedium durch geeignet Mittel, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, aufgereinigt (oder aus der Zelle, wenn es intrazellulär exprimiert wird).
Genauer, jede der rekombinanten Zellen, die verwendet werden, um ein gewünschtes Protein herzustellen, kann in Medien kultiviert werden, die zur Induzierung von Promotoren, dem Auswählen rekombinanter Wirtszellen und dem Amplifizieren des Gens geeignet sind, das das gewünschte Protein kodiert. Die Medien können, falls notwendig, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferein oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salze (wie Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nukleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die normalerweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glukose und anderen Energiequellen supplementiert werden. Andere Zusätze können auch in geeigneten Konzentrationen mitumfasst werden, wie die Fachleute auf dem Gebiet zu schätzen wissen. Geeignete Kulturbedingungen wie Temperatur, pH und Ähnliche sind den Fachleuten auf dem Gebiet zur Verwendung mit den ausgewählten Wirtszellen wohl bekannt.
Das resultierende Expressionsprodukt kann dann bis nahe an die Homogenität durch auf dem Gebiet bekannten Verfahren aufgereinigt werden. Exemplarische Aufreinigungstechniken werden in den publizierten PCT Anmeldungen Nr. WO 90/08771 und WO 96/11952 gelehrt.
Verwendungen
KGF-2 Protein(e) und chemisch modifizierte Derivate davon, die eine biologische Aktivität aufweisen (kollektiv "KGF-2 Proteinprodukt(e);) können als Forschungsreagenzien und als therapeutische und diagnostische Agenzien verwendet werden. Somit kann ein KGF-2 Proteinprodukte) in in vitro- und/oder in vivo- diagnostischen Untersuchungen verwendet werden, um die Menge an KGF-2 in einer Gewebe- oder Organprobe zu quantifizieren.
Zum Beispiel kann ein KGF-2 Proteinprodukt(e) zur Identifizierung des Rezeptors für KGF-2 Protein(e) in verschiedenen Körperflüssigkeiten und Gewebeproben unter Verwendung von auf dem Gebiet wohl bekannten Techniken verwendet werden (WO 90/08771).
Diese Erfindung schlägt auch die Verwendung eines KGF-2 Proteinprodukts(e) in der Herstellung von Antikörpern vor, die gegen KGF-2 Proteinprodukt(e) hergestellt wurden, einschließlich nativem KGF-2. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann wohl bekannte, publizierte Verfahren verwenden, um monoklonale und polyklonale Antikörper oder rekombinante Antikörper zu erhalten. Solche Antikörper können dann verwendet werden, um die KGF-2 Proteinprodukte, einschließlich nativem KGF-2, aufzureinigen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung umfasst pharmazeutische Zubereitungen, die jeweils therapeutisch- oder prophylaktisch wirksame Mengen eines KGF-2 Proteinprodukts(e) enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden im Allgemeinen eine therapeutisch wirksame oder prophylaktisch wirksame Menge eines KGF-2 Proteinprodukts(e) in Mischung mit einem Träger enthalten. Der Träger umfasst vorzugsweise eine oder mehrere pharmazeutisch und physiologisch verträgliche Formulierungsmaterialien in Verbindung mit dem KGF-2 Proteinprodukt(e).
Das primäre Lösungsmittel in einem Vehikel kann entweder wässrig oder nicht-wässrig in seiner Natur sein. Zusätzlich kann der Träger andere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe zur Modifikation oder Aufrechterhaltung des pHs (z. B. Puffer wie Citrate, Phosphate und Aminosäuren wie Glycin); der Osmolarität (z. B. Mannitol und Natriumchlorid); der Viskosität; der Klarheit; der Farbe; der Sterilität; der Stabilität (z. B., Saccharose und Sorbitol); des Geruchs der Formulierung; der Geschwindigkeit der Auflösung (z. B., Lösungsvermittler und Solubilisierungsmittel wie Alkohole, Polyethylenglykole und Natriumchlorid); der Geschwindigkeit der Freisetzung; sowie Masse liefernde Agenzien für lyophilisierte Formulierungen (z. B., Mannitol und Glycin), Tenside (z. B., Polysorbat 20, Polysorbat 80, Triton und Pluronics); Antioxidationsmittel (z. B., Natriumsulfitund Natriumhydrogensulfit); Konservierungsmittel (z. B., Benzoesäure und Salizylsäure); geschmacksgebende und verdünnende Mittel; Emulgierungsmittel; suspendierende Mittel; Lösungsmittel; Füllstoffe; Verabreichungsträger; Verdünnungsmittel und/oder pharmazeutische Adjuvanzien enthalten. Andere wirksame Verabreichungsformen wie parenterale langsam freisetzende Formulierungen, inhalative Nebel, oral aktive Formulierungen oder Zäpchen sind auch möglich.
Die Zusammensetzung kann auch Feststoffzubereitungen der polymeren Verbindungen wie Massenerosionspolymere involvieren (z. B., Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) Copolymere, PLGA Polymermischungen, Block-Copolymere aus PEG und Milch- und Glykolsäure, Poly(cyanoacrylate)); Oberflächenerosionspolymere (z. B., Poly(anhydride) und Poly(orthoester)); Hydrogelester (z. B., pluronische Polyole, Po ly(vinylalkohol), Poly(vinylpynolidon), Maleinsäureanhydrid-alkylvinylether-Copolymere, Cellulose, Hyaluronsäurederivate, Alginat, Kollagen, Gelatine, Albumin und Stärken und Dextrane) und Zusammensetzungssysteme davon; oder Zubereitungen von Liposomen oder Mikrosphären. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in vivo Eliminierung der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Die optimale pharmazeutische Formulierung für ein gewünschtes Protein kann durch einen Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden, abhängig von dem Weg der Verabreichung und der gewünschten Dosierung. Beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, pages 1435–1712; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332–351; Leone-Bay et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38: 4263– 4269; Haas et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1): 93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 and WO 94/21235 offenbart.
Spezifische langsam freisetzende Zusammensetzungen sind von einer Reihe von Herstellern einschließlich Depotech Corp. (Depfoam^TM, ein multivesikuläres Liposom); Alkermes, Inc. (ProLease^TM, eine PLGA Mikrosphäre) verfügbar. So wie Hyaluronan hier gebraucht ist, schliesst es Hyaluronan, Hyaluronsäure, Salze davon (wie Natriumhyaluronat), Ester, Ether, enzymatische Derivate und vernetzte Gele von Hyaluronsäure und chemisch modifizierte Derivate von Hyaluronsäure (wie Hylan) ein. Beispielhafte Formen von Hyaluronan sind in den U.S. Patent Nr. 4,582,865, 4,605,691, 4,646,524, 4,713,448, 4, 716,154, 4, 716, 224, 4, 772,419, 4, 851, 521, 4, 957, 774, 4, 863, 907, 5,128, 326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883; den europäischen Patentanmeldungen Nr. 0 507 604 A2 and 0 718 312 A2; and WO 96/05845 offenbart. Zulieferer von Hyaluronan umfassen BioMatrix, Inc., Ridgefield, NJ; Fidia S. p. A., Abano Terme, Italy; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan; Pharmacia AB, Stockholm, Sweden; Genzyme Corporation, Cambridge, MA; Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH; Calbiochem-Novabiochem AB, Latelfingen, Switzerland; Intergen Company, Purchase, NY and Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan.
Zur Behandlung und/oder Prävention oraler Indikationen kann eine flüssige Lösung oder Suspension in einer Weise verwendet werden, die einem Mundwasser ähnelt, bei dem die Flüssigkeit im Mund herumgeschwenkt wird, so dass die Behandlung von Geschwü ren maximiert wird (U.S. Patent Nr. 5,102,870, dessen Lehre hiermit durch Referenzieren aufgenommen wird). Längerer Kontakt mit der Schleimhautoberfläche kann durch das Auswählen eines geeigneten Trägers erreicht werden, der in der Lage ist, die Schleimhaut zu beschichten. Typische Beispiele sind Pektin-enthaltende Formulierungen wie Orabase Registered^TM (Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood, MA), Sucralfate Suspensionen, Kaopectat und Magnesiamilch. Die Formulierung kann auch eine ausbreitbare Creme, Gel, Lotion oder Salbe mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen Träger sein. KGF-2 Proteinprodukte) kann auch in eine sich langsam auflösende Tablette oder Pastille, eine Kaugummibasis oder eine buccale oder langsam freisetzende Prothese, die z. B. am hinteren Backenzahn angehängt ist, eingebracht werden. Therapeutische Mittel wie Analgetika oder Anästhetika können verabreicht werden, um Schmerz zu verringern und auch Antiinfektiva, antibakterielle Substanzen, Antipilzmittel und Antiseptika können verabreicht werden, um eine sekundäre Infektion der Geschwüre zu verhindern und/oder zu behandeln.
Sobald die pharmazeutische Zusammensetzung formuliert wurde, kann sie in sterilen Gefäßen als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydriertes oder Iyophilisiertes Pulver gelagert werden. Solche Formulierungen können entweder in zur Verwendung fertiger Form gelagert werden oder in einer Form (z. B., lyophilisiert), die die Wiedefierstellung vor der Verabreichung voraussetzt.
In einer spezifischen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf Kits zur Herstellung einer Einzeldosisverabreichungseinheit gerichtet. Die Kits können jeweils beides, einen ersten Behälter mit einem getrockneten Protein und einen zweiten Behälter mit einer wässrigen Formulierung, enthalten. Kits, die vom Umfang dieser Erfindung umfasst sind, sind Einzel- oder Mehrfachkammer vorgefüllte Spritzen; beispielhafte vorgefüllte Spritzen sind (z. B., Flüssigkeitsspritzen und Lyospritzen wie Lyo-Ject^®, eine Dualkammer, vorgefüllte Lyospritze), von der Vetter GmbH, Ravensburg, Deutschland verfügbar.
Ein KGF-2 Proteinprodukte) kann in therapeutisch- oder prophylaktisch wirksamen Mengen an Organe oder Gewebe verabreicht werden, die spezifisch dahingehend charakterisiert sind, dass sie einen Schaden oder klinisch nicht ausreichende Zahl an Epithelzellen aufweisen. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass KGF-2 Protein produkt(e)formulierungen, die hierin beschrieben werden, sowohl für Veterinär- wie auch menschliche Anwendungen verwendet werden können und, dass der Begriff "Patient" nicht in einer einschränkenden Weise verwendet werden sollte.
Die Häufigkeit der Dosierung des KGF-2 Proteinprodukts(e) an einen Patienten wird von der Krankheit und dem Zustand des Patienten abhängen sowie den pharmakokinetischen Parametern des KGF-2 Proteinprodukts(e), seiner Formulierung und der Art der Verabreichung. Das KGF-2 Proteinprodukte) kann einmal verabreicht werden, täglich verabreicht werden oder mit einer ersten Bolusdosis, gefolgt von einer kontinuierlichen Dosis oder dauerhaften Freisetzung verabreicht werden. Es wird auch vorgeschlagen, dass andere Modi zur kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Dosierung durchgeführt werden können. Zum Beispiel kann die chemische Derivatisierung in verlangsamten Freisetzungsformen des Proteins resultieren, welche in einer kontinuierlichen Präsenz im Blutstrom in voraussagbaren. Mengen, basierend auf dem bestimmten Dosierungsmuster, resultieren.
Einem Patienten, der einer Stimulierung (einschließlich Zellprotektion und/oder Differenzierung) von Epithelzellen bedarf, kann eine wirksame Menge eines KGF-2 Proteinprodukts(e) verabreicht werden, um die gewünschte Reaktion in dem Patienten auszulösen. Die Dosierungsstrategie, die in einem Verfahren zur Prävention oder Behandlung eines spezifischen Zustandes involviert ist, wird im Allgemeinen durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt, welche die Wirkung der Medikamente modifizieren, z. B., das Alter, der Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Diät des Patienten, die Schwere einer Infektion, die Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Geeignete Dosierungen können durch die Verwendung etablierter Assays zur Bestimmung von Dosierungen, die in Verbindung mit geeigneten Dosisreaktionsdaten verwendet werden, etabliert werden. Typische Dosierungen werden im Bereich von 0,001 mg/kg Körpergewicht bis 500 mg/kg Körpergewicht liegen, vorzugsweise bis zu 200 mg/kg Körpergewicht, mehr bevorzugt 100 mg/kg Körpergewicht.
Die KGF-2 Proteinprodukte) können mittels topischer, enteraler oder parenteraler Verabreichung einschließlich, ohne Einschränkung, intravenös, intramuskulär, intraarteriell, intrathekal, intrakapsulär, intraorbital, intrakardial, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subkutan, subkutikulär, intraartikulär, subkapsulär, subarachnoidal, intraspinal und durch intrasternale Injektion und Infusion verabreicht werden. Das KGF-2 Proteinprodukte) kann mittels oraler Verabreichung verabreicht werden oder durch Schleimhautmembranen verabreicht werden, d. h., intranasal, sublingual, buccal oder rektal für eine systemische Verabreichung. Das KGF-2 Proteinprodukte) kann einmal verwendet werden oder wiederholt verabreicht werden, abhängig von der Krankheit und dem Zustand des Patienten. In einigen Fällen kann das KGF-2 Proteinprodukte) als Zusatzstoff für eine andere Therapie verabreicht werden und auch mit anderen pharmazeutischen Zubereitungen.
In einer anderen Ausführungsform wird auch eine Zelltherapie (z. B. Implantation von Zellen, die KGF-2 Proteine) herstellen)vorgeschlagen. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Implantieren von Zellen in Patienten umfassen, die in der Lage sind, eine biologisch aktive Form von KGF-2 Proteine) zu synthetisieren und zu sezernieren. Solche Zellen, die KGF-2 Proteine) produzieren, können Zellen sein, die normalerweise keine KGF-2 Proteine) synthetisieren, die aber modifiziert wurden, um KGF-2 Proteine) herzustellen, oder Zellen, die die Fähigkeit haben, KGF-2 Proteine) zu synthetisieren, die durch Transformation mit einem Polynukleotid verstärkt wurden, das zur Expression und Sezernierung von KGF-2 Proteinen) geeignet ist. Um eine potenzielle immunologische Reaktion in Patienten zu minimieren, denen KGF-2 Proteine) einer Fremdspezies verabreicht werden, ist es bevorzugt, dass die Zellen von der gleichen Spezies wie der Patient sind (z. B., menschlich) oder, dass die Zellen mit einem Material verkapselt sind, das eine Barriere gegen die Immunerkennung zur Verfügung stellt oder, dass Zellen in eine immunologisch gesehen vorteilhafte anatomische Position eingebracht werden, wie die Hoden, die Augen, das zentrale Nervensystem.
Menschliche oder nicht-menschliche tierische Zellen können in Patienten in biokompatiblen, semi-permeablen polymeren Umfassungen oder Membranen implantiert werden, um die Freisetzung des KGF-2 Proteins(e) zu ermöglichen, aber die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder durch andere zerstörende Faktoren aus dem umgebenden Gewebe verhindern. Alternativ dazu könnten die eigenen Zellen des Patienten, die ex vivo transformiert wurden, um KGF-2 Proteine) herzustellen, direkt in den Patienten ohne eine solche Verkapselung implantiert werden. Das Verfahren zur Membranverkapselung lebender Zellen ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und die Herstellung verkapselter Zellen und deren Implantation in Patienten kann mit be kannten Techniken durchgeführt werden (U.S. Patent Nrs. 4,892,538; 5,011,472; und 5,106,627).
In einer noch weiteren Ausführungsform wird auch eine in vivo Gentherapie in Betracht gezogen, worin eine Nukleinsäuresequenz, die ein KGF-2 Proteine) kodiert, direkt in den Patienten eingeführt wird. Ein wirksamer und lang andauernder Gentransfer in Hepatozyten ist für eine wirksame Gentherapie zur lokalen Expression des Proteins notwendig, um Lebererkrankungen zu verhindern und/oder zu behandeln und/oder zur Sezernierung des Proteins, um Erkrankungen in anderen Organen oder Geweben zu verhindern und/oder zu behandeln.
Das DNA Konstrukt kann direkt in das Gewebe des Organs, das zu behandeln ist, eingespritzt werden, wo es unter der Voraussetzung, dass die DNA operativ an einen Promotor gebunden ist, der in einem solchen Gewebe aktiv ist, in vivo aufgenommen und exprimiert werden kann. Das DNA-Konstrukt kann zusätzlich eine Vektorsequenz aus solchen Vektoren umfassen, wie dem Adenovirusvektor, einem Retrovirusvektor, Papillomavirus und/oder einem Herpesvirusvektor, um die Aufnahme in die Zellen zu unterstützen. Der physikalische Transfer kann in vivo durch lokale Injektion des gewünschten Nukleinsäurekonstrukts oder eines anderen geeigneten VFreisetzungsvektors, der das die gewünschte Nukleinsäuresequenz enthält, wie ein Liposom-vermittelter Transfer, direkte Injektion (nackte DNA), rezeptorvermittelter Transfer (Liganden-DNA-Komplex) oder Mikropartikelbombardement (Genpistole) erreicht werden. Für die in vivo Generation von Hepatozyten in der Leber kann die Verwendung des retroviralen Moloney – Vektors besonders effektiv sein (Bosch et al. (1996), Cold Spring Harbor, Gene Therapy Meeting, September 25–29, 1996; und Bosch et al. (1996), Journal of Clinical Investigation, 98(12): 2683–2687).
Die folgenden Beispiele sind mitumfasst, um die vorliegende Erfindung besser zu illustrieren.
Beispiele
Standardverfahren für viele der in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder geeignete alternative Verfahren werden in weithin anerkannten Handbüchern der Molekularbiologie zur Verfügung gestellt, wie z. B. Shambrook et al. (1989), supra und Ausubel et al. (1990), supra. Alle Chemikalien sind entweder von analytischer Qualität oder USP-Qualität.
Beispiel 1: Proteinherstellung
Das folgende Beispiel lehrt die Herstellung von His rFGF10 und hFAGF10.
A. Herstellung von DNA
pAMG21 His rFGF10:
Das Plasmid pAMG21 His rFGF10 enthält DNA, die die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. pAMG21 His rFGF10 wurde wie folgthergestellt.
Zuerst wurde das Plasmid pAMG21 dN6 rFGF10 hergestellt. Für diese Herstellung wurde eine PCR unter Verwendung von FGF10 cDNA erwachsener Ratten (Yamasaki et al. (1996), J. Biol. Chem., 271(27): 15918–15921, rFGF) in dem Vektor pGEM-T (Promega, Madison, WI), der als pGEM-T rFGF10 bezeichnet wird, als ein Template verwendet mit dem folgenden 5'-Oligonukleotidprimer (OLIGO#1), welcher eine NdeI-Stelle umfasst und einem 3'-Oligonukleotidprimer (OLIGO#2), welcher eine BamHI-Stelle umfasst:
OLIGO#1: (SEQ ID NO: 7) 5'-AAA CAA CAT ATG GTT TCT CCG GAG GCT ACC AAC TCC-3'
OLIGO#2: (SEQ ID NO: 8) 5'-AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG-3'
Das in dieser Reaktion hergestellte PCR-Produkt wurde aufgereinigt und mit den Restriktionsendenukleasen NdeI und BamHI verdaut. Das 525-Basenpaar (Bp) restriktionsverdaute PCR Produkt wurde aus einem Agarosegel aufgereinigt und mit einem aufgereinigten 6 Kilobasen (Kb) BamHI bis NdeI pAMG21 Vektor DNA Fragment ligiert. [Der Expressionsvektor pAMG21 (ATCC Zugangsnummer: 98113) enthält geeignete Restriktionsschnittstellen zum Einfügen von Genen stromabwärts eines luxPR- Promotors (siehe U.S. Patent Nr. 5,169,318 zur Beschreibung des lux-Expressionssystems).] Das resultierende kodierte rFGF10 Protein unterscheidet sich von rFGF10 durch die Deletion der ersten 6 aminoterminalen Aminosäurereste zu einem natürlich vorkommenenden Methioninrest, wobei das Protein die folgende aminoterminale (N-terminale) Aminosäuresequenz: MVSPEAT...... (angefangen bei Rest #43, 2, Yamasaki et al. (1996), supra) aufweist.
Als nächstes wurde das Plasmid pAMG21 His rFGF10 unter Verwendung eines pAMG21 His Vektorshergestellt. Der pAMG21 His Vektor unterscheidet sich von pAMG21 wie folgt: zwischen dem einleitenden Methioninkodon von pAMG21 (ATG) und der Sequenz, die diesem folgt (GTTAACG...), ist die folgende Sequenz eingefügt "AAA CAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GCT AGC", welche für "KHHHHHHHAS" kodiert. Die Addition des Kodons für Ala und Ser nach dem 7 × His-tag ergibt eine gut gut geeignete Restriktionsschnittstelle, NheI, zur Klonierung.
Das 4,7 Kb BstXI-NheI Fragment des pAMG21 His Plasmidvektors wurde dann mit dem 1,8 Kb BspEI-BstXI-Fragment von pAMG21 dN6 rFGF10 und den folgenden Oligonukleotidlinkern OLIGO#3 und OLIGO#4 (NheI bis BspEI) ligiert.
OLIGO#3: (SEQ ID NO: 9) 5'-CTA GCG ATG ACG ATG ATA AAC AGG CTC TGG GTC AGG ACA TGG TTT CT-3'
OLIGO#4: (SEQ ID NO: 10) 5'-CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GAG CCT GTT TAT CAT CGT CAT CG-3'
Das resultierende kodierte Protein unterscheidet sich von dN6 rFGF10 dadurch, dass es ein Histidin-Tag (7 × His) aufweist, gefolgt von einer Enterokinaseschnittstelle mit der (reifen) N-terminalen Sequenz in Gesamtlänge (angefangen bei Rest #37, 1, Yamasaki et al. (1996), supra). Es wurden zweiundzwanzig Aminosäuren zu dem Aminoterminus des dN6 rFGF10 wie folgt hinzugefügt: MKHHHHHHHASDDDDKQALGQD [MVSPEAT....].
Der E. coli-Wirtsstamm GM120 (ATCC Zugangsnummer: 55764) hat den lacIQ-Promotor und das lacI-Gen an einer zweiten Position in dem Wirtschromosom eines prototrophen E. coli K12-Wirt integriert. Die Transformation des GM120 E. coli-Wirts mit dieser Ligationsmischung und das Ausplattieren auf Luria-Agarplatten, die 40 μg/ml Kanamycin enthalten, ergab rekombinante bakterielle Kolonien. Ein bakterieller Klon, der das korrekte rekombinante Plasmid enthält, wurde durch PCR-Durchmusterung identifiziert. Es wurde Plasmid DNA aufgereinigt und sequenziert, um die eingefügte Sequenz zu bestätigen. Das Wachstum rekombinanter bakterieller Kulturen zur Exprimierung des Genprodukts wird unten beschrieben.
pAMG21 hFGF10:
Das Plasmid pAMG21 hFGF10 enthält DNA, die die Aminosäuresequenz, die in 3 aufgeführt ist (hFGF10), kodiert. Somit hat hFGF10 die Sequenz von Leu⁴⁰ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2, wie oben aufgeführt. pAMG21 hFGF10 wurde wie folgt hergestellt.
Das Plasmid pAMG21 dN20 hFGF10 enthält eine Deletion der DNA, die die ersten 28 Aminosäuren der reifen rFGF10 Sequenz kodiert, was in der folgenden N-terminalen Aminosäuresequenz resultiert: MSSPSSA..... (angefangen bei Rest #65, 2, Yamasaki et al. (1996), supra). pAMG21 dN20 hFGF10 wurde wie folgt khergestellt.
Das 6 Kb BamHI-NdeI pAMG21 Vektorfragment wurde an ein NdeI-BamHI dN20 hFGF10 PCR Produkt ligiert, das wie folgt generiert worden war: PCR wurde unter Verwendung von pGEM-T rFGF10 als Template durchgeführt und dem folgenden 5' Oligonukleotidprimer (OLIGO#5), welcher eine NdeI Stelle an dem 5' Ende des rFGF10 Gens eingebaut hat und die Kodons für die ersten 28 Aminosäuren deletiert und einem 3' Oligonukleotidprimer (OLIGO#6), welcher eine BamHI Stelle in das 3' Ende des rFGF10 Gens eingebaut hat:
OLIGO#5: (SEQ ID NO: 11) 5'- AAA CAA CAT ATG TCT TCT CCT TCC TCT GCA GGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC AA -3'
OLIGO#6: (SEQ ID NO: 12) 5'- AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCA TGG GG -3'
Dieses PCR Produkt wurde aufgereinigt, mit den Restriktionsendenukleasen NdeI und BamHI verdaut und wie oben beschrieben an das 6 Kb BamHI-NdeI pAMG21 Vektorfragment ligiert.
Plasmid pAMG21 rFGF10 wurde durch Ligation eines 6,5 Kb BspEI-NdeI Fragment von pAMG2 His rFGF10 mit den folgenden Oligonukleotidlinkern OLIGO #11 und OLIGO#8 (NdeI bis BspEI) hergestellt.
OLIGO#7: (SEQ ID NO: 13) 5'- TAT GCT GGG TCA GGA CAT GGT TTC T -3'
OLIGO#8: (SEQ ID NO: 14) 5'- CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GCA -3'
Das resultierende kodierte Protein unterscheidet sich von His rFGF10 durch die Deletion des 7 × Histidin-Tags und der Wiederherstellung der ursprünglichen reifen aminoterminalen Proteinsequenz (MLGQDM....).
Ein 4,8 Kb BstXI-BspEI Fragment von pAMG21 rFGF10 wurde mit dem 1,8 Kb Fragment von pAMG21 dN20 hFGF10 PstI (eingeführt)-BstXI und den folgenden OLIGO#13 und OLIGO#14 Oligonukleotidlinkern (PstI bis BspEI) ligiert, um acht Serinkodons aus der Rattensequenz zu deletieren.
OLIGO#9: (SEQ ID NO: 15) 5'- CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGC TTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA -3'
OLIGO#10: (SEQ ID NO: 16) 5'- GAG CTA GGA GAG GAG AAG CTG CTG GAG CTA GAG TTG GTA GCC T -3'
GM120 E. coli Wirtszellen wurden mit diesem pAMG21 hFGF10 Ligationsprodukt transformiert und auf Luria-Agarplatten ausplattiert, die 40 μg/ml Kanamycin enthalten, und ergaben rekombinante bakterielle Kolonien. Ein bakterieller Klon, der das korrekte rekombinante Plasmid enthält, wurde durch PCR Durchmusterung identifiziert. Plasmid- DNA wurde gereinigt und sequenziert, um die eingefügte Sequenz zu bestätigen. Das Wachstum der rekombinanten bakteriellen Kulturen zur Exprimierung des Genprodukts wird unten beschrieben.
B. Produktion in E. coli
Kulturen rekombinanter GM120 E. coli-Zellen, die das sequenzbestätigte Plasmid von Interesse enthalten (pAMG21 His rFGF10 beziehungsweise pAMG21 hFGF10) werden jeweils wachsen gelassen, um die. Expression des eingeführten Gens wie folgt zu optimieren:
Fünfhundert Milliliter Kulturflaschen, gefüllt mit Luriamedium plus Kanamycin, wurden mit Zellen angeimpft und bei 30°C für 10 bis 16 Stunden wachsen gelassen. Die gesamten 500 ml wurden zu einem 9 l bis 11 l NZ Amin-basierenden Medium in einem 15 L Fermenter hinzugefügt. Alle Ansätze wurden bei einem pH von 7 und einer gelösten Sauerstoffmenge von > 50% wachsen gelassen. Ansätze von Zellen, die pAMG21 His rFGF10 enthalten und pAMG21 hFGF10 enthalten wurden jeweils wachsen gelassen und bei 30°C induziert. Die Ansätze wurden bei einem pH von 7 und einer gelösten Sauerstoffmenge von > 50% wachsen gelassen. Wenn die optische Zelldichte 10 ± 2 erreichte, wurde ein Autoinducer zu dem Fermenter hinzugefügt und die zellen wurden für weitere 12 h wachsen gelassen. Nach 12 Stunden wurde die Brühe auf weniger als 15°C abgekühlt, der Fermenter wurde abgegossen und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellpaste wurde eingefroren.
C. Aufreinigung
His rFGF10:
His rFGF10 wurde aus der E. coli Zellpaste unter Verwendung von drei Chromatografieschritten aufgereinigt: S-Sepharose bei pH 7,5, S-Sepharose bei pH 8,5 und Chelat (Ni)-Sepharose. Achtzig Gramm der E. coli Zellpaste wurden in 10 Volumen H₂O homogenisiert, dann wurden die Zellen in einem Mikrofluidizer aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellsuspension wurde für 3 Stunden bei 15300 × g zentrifugiert. Der Überstand, der lösliches His rFGF10 enthält, wurde auf 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 7,5 angepasst, dann auf eine 300 ml S-Sepharose FF Säule aufgetragen, die in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibriert worden war. Nach dem ausgiebigen Waschen der Säule mit Äquilibrierungspuffer, um nicht gebundenes Protein zu entfernen, wurde die Säule mit einem 40-Volumen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 eluiert. Fraktionen, die zwischen 0,8 M und 1,0 M NaCl eluiert wurden, enthielten His rFGF10, welches als eine 24 kDa Bande mittels SDS-PAGE nachgewiesen wurde. Die Identität dieser Bande wurde durch N-terminale Sequenzierung bestätigt. Diese Fraktionen wurden zusammengeführt, mit H₂O verdünnt, um die NaCl Konzentration auf 0,4 M zu verringern und auf einen pH von 8,5 durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 9,2 angepasst. Diese Probe wurde auf eine 75 ml S-Sepharose HP Säule aufgetragen, die in 40 Tris-HCl, pH 8,5 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 40 mM Tris-HCl, pH 8,5 gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen, dann mit einem 40 Volumen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. Fraktionen, die zwischen 0,9 M und 1,1 M NaCl eluieren, wurden zusammengeführt. Die zusammengeführten Fraktionen wurden dann auf eine 200 ml Chelat-(Ni)-Sepharosesäule aufgetragen, die in 1 M NaCl 40 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM Imidazol äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspufter gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen, dann mit einem 20-Volumen Gradienten von 0 bis 100 mM Imidazol in 1 M NaCl, 40 ml Tris-HCl, pH 8,5 eluiert, gefolgt durch einen 20-Volumen Gradienten von 100 bis 500 mM Imidazol in dem gleichen Puffer. His rFGF10 eluierte zwischen 100–200 mM Imidazol. Fraktionen, die His rFGF10 enthalten, wurden zusammengeführt, konzentriert und gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ausgetauscht. Die Probenreinheit, die durch Silber-gefärbte oder Coomassieblau-gefärbte SDS-Gele analysiert wurde, wurde als mehr als 97% geschätzt. Die Gesamtausbeute betrug 459 mg aufgereinigtes His rFGF aus 80 g Zellpaste.
hFGF10:
hFGF10 wurde unter Verwendung von drei Chromatografieschritten aufgereinigt: S-Sepharose bei pH 7,5, Heparin-Sepharose bei pH 7,5 und Hydroxyapatit. Einhundert Gramm E. coli Zellpaste, die hFGF10 enthält, wurde homogenisiert und genau wie oben beschrieben aufgebrochen. Nach der Zentrifugation bei 15 300 × g für 3 Stunden wurde der Überstand, der lösliches hFGF10 enthält, auf 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 durch die Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 7,5 angepasst, dann auf eine 300 ml S-Sepharose FF Säule aufgetragen, die in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit Äquilibrierungspufter, um nicht gebundenes Protein zu entfernen, wurde die Säule mit einem 40-Volumen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 eluiert. Fraktionen, die zwischen 0,9 M und 1,1 M NaCl eluieren, enthielten hFGF10, welches mittels SDS-PAGE nachgewiesen wurde. Die Identität dieser Bande wurde durch N-terminale Sequenzierung bestätigt. Diese Fraktionen wurden zusammengeführt, mit 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 verdünnt, um die NaCl Konzentration auf 0,4 M zu verringern und auf eine 60 ml Heparin-Sepharosesäule aufgetragen, die in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspufter gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, dann mit einem 80-Volumen Gradienten von 0 bis 3 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. hFGF10 eluierte zwischen 1,0 und 1,35 M NaCl. Diese Fraktionen wurden zusammengeführt und gegen 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine 50 ml Hydroxyapatitsäule aufgetragen, die in 40 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibriert worden war. Nach dem Probenauftrag wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, dann mit einem 40-Volumen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert. Fraktionen, die zwischen 0,24 M und 0,44 M NaCl eluierten, enthielten hFGF10. Diese Fraktionen wurden zusammengeführt, konzentriert und gegen PBS Puffer ausgetauscht. Die Probenreinheit wurde größer als 97% durch Coomassieblau-gefärbte SDS Gele abgeschätzt. Die Ausbeute von aufgereinigtem hFGF10 betrug 90 mg aus 100 g Zellpaste.
Beispiel 2: In situ Hybridisierungsstudie
Eine in situ Hybridisierungsstudie wurde durchgeführt, um die Stellen der Expression von KGF-2 in normalen erwachsenen und embryonalen Rattengeweben zu bestimmen.
Ein Segment der Ratten KGF-2 Sequenz, einschließlich der ersten 128 Nukleotide der publizierten kodierenden Region (Genebank Zugangsnummer: D79215) plus 100 Nukleotide stromaufwärts von der Translationsinitiierungsstelle wurde aus Rattenlungen cDNA amplifiziert und in pGEM-T (Promega) kloniert. Das linearisierte Template wurde verwendet, um hochspezifische Aktivitäts ³³P markierte Riboproben zu synthetisieren.
Eine Reihe von normalen embryonalen und ausgewachsenen Rattengeweben wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und 5 um dicke Schnitte hergestellt.
Vor der in situ Hybridisierung wurden die Gewebe mit 0,2 M HCl permeabilisiert, gefolgt von Verdau mit Proteinase K und Acetylierung mit Triethanolamin und Essigsäureanhydrid. Schnitte wurden mit ³³P-markierten Riboproben über Nacht bei 55°C hybridisiert, dann einer Waschung bei hoher Stringenz in 0,1 × SSC bei 60°C unterzogen. Die Schnitte wurden in eine NTB2 Filmemulsion (Eastman Kodak, Rochester, NY) eingetaucht, bei 4°C für 2–3 Wochen belichtet, entwickelt und gegengefärbt. Die Schnitte wurden mit Dunkelfeld- und Standardbeleuchtung untersucht, um eine gleichzeitige Beurteilung der Gewebemorphologie und des Hybridisierungssignals zu ermöglichen.
Zusammenfassend produzierte die KGF-2 Sonde eine klare Verteilung des Signals in Gewebeschnitten embryonaler beziehungsweise adulter Ratten mit wenig oder ohne Hintergrundsignal. In Embryonen späterer Stadien wurde die das KGF-2 Signal hauptsächlich in Zellen mit mesenchymalen Erscheinungsbild beobachtet, wobei wenig epitheliale Expression festgestellt wurde (Tabelle 2). In den Erwachsenen wurde anders als im Embryo die KGF-2 Expression sowohl in epithelialen als auch mesenchymalen Geweben nachgewiesen (Tabelle 2).
Tabelle 2: In situ Hybridisierung
Beispiel 3: His rFGF10 stimulierte Proliferation und Differenzierung epithelialen Zellen
Achtzehn weibliche BDF1-Mäuse wurden in 6 Gruppen von jeweils 3 Mäusen aufgeteilt (1 behandelte und 1 Kontrollgruppe für jeden der 3 Zeitpunkte). Die ersten zwei Gruppen erhielten 5 mg/kg His rFGF10 oder die Pufferkontrolle IV für 1 Tag; die zweiten zwei Gruppen erhielten 5 mg/kg His rFGF10 oder die Pufferkontrolle IV täglich für 3 Tage; und die dritten zwei Gruppen erhielten 5 mg/kg His rFGF10 oder die Pufferkontrolle IV täglich für 7 Tage. Alle Mäuse wurden mit 50 mg/kg BrdU eine Stunde vor der Ernte injiziert, radiografiert und geopfert. Körper und ausgewählte Organgewichte (einschließlich aller Segmente des Dünndarms) wurden entnommen, Blut wurde zur Hämatologie und Serumuntersuchung genommen und die Organe wurden für die histologische Analyse und BrdU-Markierung geerntet.
Es wurde eine zusätzliche Studie unter Verwendung athymischer nackter Mäuse durchgeführt. In dieser Studie wurde 5 mg/kg/Tag His rFGF10 subkutan in die Flanke von fünf weiblichen Nacktmäusen für 8 Tage injiziert. Weitere fünf weibliche Nacktmäuse erhielten die Pufferkontrolle. Alle Mäuse wurden mit 50 mg/kg BrdU eine Stunde vor der Ernte injiziert und getötet. Körper und ausgewählte Organgewichte wurden genommen, Blut wurde für Hämatologie und Serumuntersuchungen genommen und die Organe wurden für eine histologische Analyse und BrdU-Markierung geerntet.
Die BrdU Immunhistochemie wurde auf 4 um dicke Schnitten von Zinkformalin fixiertem, paraffineingebetteten Gewebe durchgeführt. BrdU wurde mit einem monoklonalen Antikörper aus der Ratte (MAb) gegen BrdU (Accurate Chemical, Westbury, NY) nachgewiesen, gefolgt durch einen biotinylierten Anti-Kaninchen/Anti-Maus sekundären Cocktail (BioTek, Solutions, Inc., Santa Barbara, CA) und einem ABC tertiären Komplex, der an alkalische Phosphatase gebunden ist (BioTek). Die Farbreaktion wurde mit rotem Chromagen visualisiert (BioTek).
H&E und BrdU-gefärbte Schnitte wurden untersucht. Die wesentlichen histologischen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Zusätzlich zu den unten aufgelisteten Funden hatten Nacktmäuse, die subkutan mit His rFGF10 injiziert worden waren, eine lokalisierte epidermale und Talgdrüsenhyperplasie an der Injektionsstelle sowie eine Normalisierung der follikulären Morphologie mit Haarwurzeln, die oberhalb der epidermalen Oberfläche zu erkennen waren.
Tabelle 3: Histologiezusammenfassung nach Organsystemen
Beispiel 4: Trophische Reaktion in den Dünndärmen von normalen Mäusen
Weibliche BDF1-Mäuse wurden intraperitoneal (IP) entweder mit His rFGF10 (5 mg/kg) oder Salzlösung für drei aufeinanderfolgende Tage injiziert. Dreiundzwanzig Stunden nach der letzten Injektion wurde jede Maus getötet, die Därme wurden entfernt und mit kalter Salzlösung ausgespült, unter gleichmäßiger Belastung aufgehängt und in Duodenum Jejunum und Ileum aufgeteilt. Die Nassgewichte dieser Gewebe wurden bestimmt und als Prozent Körpergewicht ausgedrückt und ein ungepaarter t-Test wurde verwendet, um die Gewichte der jeweiligen Darmabschnitte His rFGF10 und mit Salzlösung – behandelter Ratten zu vergleichen. Es gab eine 26%-ige Erhöhung im Nassgewicht des Dünndarms.
Beispiel 5: Trophische Wirkung in Ratten mit 80% Dünndarmresektion
Für diese Studie wurden 80% des Dünndarms (5 cm distal zu dem Ligament von Treitz bis 5 cm proximal zu der ileozäkalen Klappe) chirurgisch entfernt und die Tiere erholten sich über 4 Wochen. Die Tiere wurden dann für 7 Tage entweder mit Salzlösung oder His rFGF10 bei 5 mg/kg subkutan behandelt. Die Tiere wurden geopfert und der verbleibende Darm entfernt, mit kalter Salzlösung gespült und unter einheitlicher Belastung von 10 g aufgehängt. Die Gesamtlänge wurde bestimmt und der Darm wurde wie folgt sektioniert: zuerst 1/3 Duodenum, zweitens 1/3 Jejunum und zuletzt 1/3 Ileum. Ein Teil von jedem wurde zur Histologie und biochemischen Analyse entnommen. Der für die Histologie vorgesehene Teil wurde in Paraffin eingebettet, in Querschnitte geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Es wurde eine Bildanalyse verwendet, um die Schleimhautdicke und Kryptentiefe in dem Ileum und Jejunum zu messen und diese Daten wurden verwendet, um die Villushöhe zu bestimmen, wo die Schleimhautdicke – Kryptentiefe = Villushöhe entspricht. Es gab eine signifikante (p < 0,01) Erhöhung in der Schleimhautdicke bedingt durch eine Erhöhung in der Villushöhe.
Beispiel 6: Überleben von Krypten in den Dünndärmen von bestrahlten Mäusen
Weibliche BDF1-Mäuse wurden mit 5 mg/kg/Tag His rFGF10 oder Träger für 3 Tage behandelt und anschließend mit 12 Gy aus einer Cäsiumquelle bestrahlt. Vier Tage später wurden die Mäuse mit 50 mg/kg BrdU IP eine Stunde vor Tötung injiziert. Die Därme wurden entfernt, mit kalter Salzlösung gespült, bei gleichmäßiger Belastung unter Verwendung eines 5 g Gewichts aufgehängt und in Duodenum, Jejunum und Ileum aufgeteilt. Diese Segmente wurden gewogen, in Formalin fixiert und in Paraffin zur Herstellung von Querschnitten eingebettet. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen BrdU gefärbt und gefärbte Krypten wurden unter Verwendung eines Lichtmikroskops gezählt. Positive Krypten wurden dahingehend identifiziert, dass sie drei oder mehr markierte Nuklei/Krypte haben. Die Behandlung erhöhte die Überlebensrate der Krypten um 45 %, während die Nachbehandlung genauso wirksam war.
Beispiel 7: Wirkung einer Vorbehandlung mit His rFGF10 in einem neonatalen Rattenmodell der Cytosinarabinosid (ARA-C) Chemotherpie-Induzierten Haarausfall
Fünf Nachkommen von neonatalen Ratten (ungefähr 10–15 Welpen pro Gruppe) wurden IP mit 5 mg/kg/Tag His rFGF10 oder PBS im Alter von 5, 6 und/oder 7 Tagen injiziert (experimentelle Tage –3, –2 und/oder –1). An den experimentellen Tagen 0–5 (8 –12 Tage an Alter) wurden alle Welpen IP mit 30 mg/kg Cytosinarabinosid (ARA-C) injiziert.
Die Welpen wurden mit 0–4 für ihre Behaarung und Haardichte durch drei unabhängige Beobachter bewertet, denen die Behandlungsgruppen an den experimentellen Tagen 6, 8, 11, 13 und 15 nicht bekannt waren. Die Bewertungen für Dichte und Fläche wurde für jeden Rattenwelpen täglich berechnet, die Werte wurden addiert und durchschnittliche Summen wurden für jede Behandlungsgruppe berechnet und die statistische Signifikanz bei jedem Zeitpunkt unter Verwendung des "Kruskal-Wallis nonparametric rank sums test" bestimmt.
His rFGF10 induzierte bei allen Dosierungsstrategien einen signifikanten Grad an Schutz gegen ARA-C-induzierter Haarausfall nur am Tag 8 des Experiments, obwohl ein His rFGF10-induzierter Trend zur ARA-C Protektion bei allen anderen Zeitpunkten zu beobachten war.
Beispiel 8: Chemotherapie-induziertes Mukositismodell
Mäusen (15/Gruppe), die mit 5-Fluoruracil behandelt wurden, wurde Träger allein (Salzlösung) oder His rFGF10 verabreicht.
Kontrollgruppe: An den Tagen –2 bis 0 wurde einer Gruppe von Mäusen täglich Salzlösung an den Tagen –2 bis 0 verabreicht und intraperitoneal mit 5-Fluorouracil (5-FU, 60 mg/kg/Tag) an den Tagen 1 bis 4 injiziert.
His rFGF10 Vorbehandlung: An den Tagen –2 bis 0 wurde eine Gruppe von Mäusen subkutan mit His rFGF10 (5 mg/kg) injiziert. An Tagen 1 bis 4 wurden die Mäuse intraperitoneal mit 5-Fluorouracil (5-FU), 60 mg/kg/Tag) injiziert.
Die Wirkungen auf die Körpergewichte und das Überleben der verschiedenen Gruppen wurden analysiert. Die Körpergewichte wurden täglich von Tag 0 bis zum Ende am Tag 30 ermittelt. Die Mäuse wurden visuell zweimal/Tag auf Zeichen von Morbidität für 30 Tage untersucht und sterbende Tiere wurden getötet. Die prozentuale Änderung des Körpergewichts am Tag 6, dem Tiefpunkt, wird in Tabelle 4 aufgezeigt.
Tabelle 4: Wirkungen von His rFGF10 auf das Körpergewicht
Vorbehandlung mit His rFGF10 zeigte auch eine Erhöhung der Überlebensrate.
Beispiel 9: Bestrahlungsmortalitätsmodell
Vorbehandlung mit rekombinantem menschlichen KGF-2 (mit der Sequenz von Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 und hergestellt gemäß der Lehren von WO 96/25422, rhuKGF-2), entweder kombiniert mit G-CSF oder Salz post-BMT erhöhte die Überlebensrate signifikant, wenn mit G-CSF alleine oder mit Salzkontrollen verglichen wird. Die Anzahl der proliferierenden Krypten des Dünndarms waren 4 Tage nach 12 Gy in rhuKGF-2 vorbehandelten Mäusen erhöht und die BMT-Prozedur änderte das Ausmaß dieser rhuKGF-2-induzierten Reaktion nicht. Zudem änderte rhuKGF-2 nicht die hämapoetischen Erholungskinetiken von BMT-behandelten Mäusen nach nicht lethalen (9 Gy) TBI. rhuKGF-2-Vorbehandlungen verhinderten die Mortalität in lethal bestrahlten (12 Gy)-Mäusen, die mit peripheren Blutvorläuferzellen (1 × 10⁷ PBPCs) transplantiert worden waren, wenn sie allein oder in Kombination mit G-CSF (100 μg/kg/Tag, SC, Tage 1 bis 10) verwendet wurden. Ähnlich zu den BMT-Experimenten, überlebten keine Kontroll PBPC-transplantierten Mäuse und allein mit G-CSF behandelte Mäuse wiesen eine Verbesserung auf. rhuKGF-2 Vorbehandlungen änderten auch nicht die Kinetiken der hämapoetischen Erholung nach PBPC Transplantation in der Anwesenheit oder Abwesenheit von G-CSF nach nicht lethalen (8,5 Gy) TBI. Wenn rhuKGF-2 sowohl vor wie auch nach lethalen Bestrahlung und PBPCs gegeben wurde, behinderte es weder eine verbesserte Überlebensrate, die in Mäusen zu sehen war, die mit rhuKGF-2 Vorbehandlungen allein behandelt wurden, noch änderte es die Kinetiken der hämapoetischen Rekonstitution nach nicht lethaler Bestrahlung.
Beispiel 10: Strahlungsinduziertes Mukositismodell
Mukositis wird in Mäusen mit 12 Gy Gesamtkörperbestrahlung induziert. Mäuse wurden täglich mit 5 mg/kg/Tag an rekombinantem menschlichen KGF-2 (im Allgemeinen gemäß der Lehren von WO 96/25422 hergestellt, rhuKGF-2) behandelt, angefangen an dem Tag vor der Bestrahlung und bis zu Tag drei nach der Bestrahlung. Vier Tage nach der Bestrahlung wurden die Mäuse getötetund die Anzahl proliferierender Krypten (die BrdU-positive Zellen enthalten) wurden gezählt.
rhuKGF-2 Behandlung erhöht die Zahl der proliferierenden Krypten in dem Duodenum, proximalen und distalen Jejunum des Dünndarms relativ zu nicht-rhuKGF-2 behandelten Tieren. rhuKGF-2 ist auch in der Lage den Körpergewichtsverlust in bestrahlten Mäusen zu verringem.
Beispiel 11: Adriamycin-induziertes Mukositismodell
Mukositis wird in Mäusen mit einer einzigen intraperitonealen Dosis an Adrtamycin bei 24 mg/kg induziert. Die Mäuse werden täglich mit 1 mg/kg/Tag rhuKGF-2 behandelt, angefangen an dem Tag vor der Bestrahlung und bis drei Tage nach der Bestrahlung. Vier Tage nach der Bestrahlung wurden die Mäuse getötet und die Zahl der proliferierenden Krypten (die BrdU-positive Zellen enthalten) wurde gezählt.
rhuKGF-2 Behandlung erhöht die Anzahl der proliferierenden Krypten in dem Duodenum, Jejunum und Ileum relativ zu nicht-rhuKGF-2 behandelten Tieren.
Beispiel 12: Kolitismodell
In zwei Gruppen von jeweils 10 Tieren wird Kolitis durch Koloninstillation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure in Ethanol bei einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht induziert. Um zu bestimmen, ob rhuKGF-2 durch einen schützenden Mechanismus wirkt, wird eine Gruppe von Ratten (Gruppe A) mit rhuKGF-2 vorbehandelt oder mit Träger bei 24 Stunden, 1 Stunde vor der Induktion der Kolitis bei einer Dosis von 5 mg/kg (i. p.) vorbehandelt, und die Tiere werden 8 Stunden nach der Verletzung getötet. Um mögliche Heilungswirkungen zu beurteilen, wird rhuKGF-2 oder Träger (gleiche Dosierung, i. p.) in eine zweite Gruppe (Gruppe B) 24 Stunden nach der Induktion der Kolitis injiziert und die Behandlung wird täglich für 1 Woche weitergeführt. Der Gewebeschaden wird mikroskopisch untersucht und als Prozentanteil an Geschwüren oder Erosionen ausgedrückt.
Tiere, die mit rhuKGF-2 nach der Induktion der Kolitis (Gruppe B) behandelt wurden, zeigen signifikant weniger Geschwüre im Vergleich zur Kontrollgruppe (Gruppe A). In Tieren, die vor der Induktion der Kolitis behandelt wurden, gibt es Erosionen, aber durch die kurze Untersuchungszeit von 8 Stunden keine Geschwüre. Die Erosionen unterscheiden sich nicht signifikant von denen, die in der Kontrollgruppe zu beobachten sind (Gruppe A).
Beispiel 13: Dextransulfat-induziertes Kolitismodell
Studie 1: Ratten werden mit 4% und 6% DSS in Wasser für 1 Woche gefüttert. Am Ende der zweiten Woche werden die distalen 4 cm des Darms entnommen. Acht Schnitte in 0,5 cm Intervallen werden präpariert und mit H & E gefärbt. Der Prozentanteil von jedem Darmabschnitt mit Nekrose (Zerstörung der glandulären Struktur) wird in einer zufälligen und kodierten Weise untersucht.
Studie 2: Ratten werden IP Träger oder rhuKGF-2 (1 mg/kg/Tag) injiziert und entweder mit Wasser oder 4% Dextransulfatnatrium für 14 Tage gefüttert. Die Darmschnitte werden mit PAS gefärbt.
Dextransulfatnatrium scheint eine dosisabhängige Erhöhung der Darmschleimhautnekrose zu induzieren. rhuKGF, das bei 1 mg/kg/Tag für 14 Tage verabreicht wurde, erhöht die Darmmucinproduktion in der Kontrollgruppe sowie in den Dextransulfatnatrium-behandelten Ratten.
Beispiel 14: Rattenzirrhosemodell
Männliche Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 150 und 175 gm wiegen, wurden verwendet. Die Tiere werden Phenobarbital (0,35 mg/ml) in ihrem Trinkwasser für die Dauer der Studie ausgesetzt. Die Tiere wurde wöchentlich mit CCl₄ in Maisöl als Träger be handelt, während sie unter leichter Isofluoranzanästhesie waren. Die anfängliche Dosis CCl₄ beträgt 40 μl pro Ratte. Die Dosis wird wöchentlich angepasst, zu- bzw. abnehmend in 40 μl Schritten, basierend auf der Gewichtszunahme. Zehn Kontrolltiere werden Phenobarbital in ihrem Trinken ausgesetzt und wöchentlich mit Maisölträger behandelt. Die Lebertunktion wird durch Messung der Bromosulfophthylein (BSP) Clearance, Serumtransaminasespiegel und Serumalbuminspiegeln untersucht. Nach dem Töten der Tiere wird die Leber entfernt, gewogen und zur Bestimmung der Hydroxyprolinmengen als Indikator der Kollagenablagerung und Fibrose weiter aufgearbeitet.
Die Tiere werden für das oben genannte Zirrhoseinduktionsprotokoll für 11 Wochen aufbewahrt. In der elften Woche werden Tiere zufällig in Kontroll- und rhuKGF-2 Behandlungsgruppen aufgeteilt. rhuKGF-2 wird einmal pro Tag durch subkutane Injektion bei einer Dosis von 1 mg/kg für insgesamt 15 Tage gegeben. Nach 15 Tagen der rhuKGF-2 Behandlung werden die Tiere getötet.
Ratten, in denen die Zirrhose mit CCl₄ induziert wurde, zeigen eine Erhöhung in der Serum BSP-Konzentration, was die eingeschränkte Leberentgiftung dieses Mittels reflektiert. Ratten, die mit rhuKGF-2 behandelt wurden, haben eine geringere BSP Serummenge als nicht behandelte Tiere, was eine verbesserte Lebertunktion nahe legt. Ratten, in denen mit CCl₄ eine Zirrhose induziert wurde, zeigen eine Erhöhung in SGPT, welche durch rhuKGF-2 Behandlung umgekehrt wird. rhuKGF-2 Behandlung ist in der Lage, Serumalbumin zu erhöhen. rhuKGF-2 Behandlung resultiert in einem erhöhten Leber-zu-Körpergewichts-Verhältnis, was ein kompensatorisches Leberwachstum reflektiert.
Beispiel 15: Hepatektomiemodell
Ratten, die einer 70%-igen teilweisen Hepatektomie ausgesetzt wurden, erreichen ihre ursprüngliche Lebermasse schneller, wenn sie mit 1 mg/kg/d rhuKGF-2 behandelt werden, im Vergleich zu nicht behandelten Tieren.
Beispiel 16: Akute Hepatotoxizitätsmodelle
In akuten Hepatotoxizitätsmodellen, bewirkt rhuKGF-2 Behandlung (1 mg/kg entweder vor oder bei 3 h nach dem toxischen Agens) Erhöhungen in Serumtransaminasespiegel in Ratten mit akutem hepatischen Versagen, das entweder durch Kohlenstofftetrachlorid, Acetaminophen oder Galaktosamin induziert ist. Vorbehandlung mit rhuKGF-2 verhindert auch eine Verringerung in den Clearance Funktionen der Lebemach Acetaminophen, wie durch Sulfobromophthalein(BSP) Clearance gemessen wird.
Beispiel 17: In vivo retroviral vermitteltes Gentransfermodell
Mäusen wird rhuKGF-2 (1–5 mg/kg) intravenös verabreicht. 48 Stunden nach intravenöser Injektion von rhuKGF-2 erhöht sich die murine Hepazytenproliferation im Vergleich zu nicht stimulierten Lebem und gelangt wieder zu normalen proliferativen Mengen. Es werden keine Knötchen oder mikroskopische Abnormalitäten entweder akut oder nach 5 Monaten beobachtet.
Wenn der rhuKGF-2 Behandlung eine intravenöse Injektion von hohem Titer E. coli LacZ, die retrovirale Moloney Vektoren (1 × 108 cfu/ml) exprimieren, folgt, erhöht sich die β-Galaktosidaseexpression mit dem Prozentanteil der Hepatozyten, die transduziert wurden. Mehrere Monate danach verbleibt ein Teil der transduzierten Hepatozyten X-gal-positiv.
Beispiel 18: In vivo Diabetesmodell
Männliche Ratten, die zu Studienbeginn 200 bis 260 Gramm wiegen, werden in diesem Modell verwendet (WO 96/11950). Diabetes wird durch eine einzelne intravenöse Injektion von Streptozotocin bei 50 mg Streptozotocin in Natriumcitratpuffer pro kg Körpergewicht induziert. Nicht diabetische Kontrollratten erhalten eine einzelne intravenöse Injektion von Natriumcitratpuffer für Kontrollzwecke. rhuKGF-2 wird täglich als subkutane Injektion verabreicht. Die rhuKGF-2 Dosis beträgt abhängig von dem Experiment 3 oder 5 mg/kg/Tag.
In dem ersten Experiment wird die rhuKGF-2 Therapie zwei Tage vor dem Induzieren der Diabetes begonnen und wird nach der Induktion der Diabetes für eine Gesamtzahl von acht Injektionen weitergeführt. Die diabetischen Ratten, die mit rhuKGF-2 vor der Diabetesinduktion behandelt wurden und diejenigen, bei denen rhuKGF nach der Injektion weitergeführt wird, zeigen Symptome, die eine mildere Form von Diabetes anzeigen. Somit verhindert die rhuKGF-2 Therapie entweder teilweise die Induktion der Krankheit oder heilt insulinproduzierende Inselzellen nach Streptozotocin-induzierter Beta-Zellzerstörung.
In dem zweiten und dritten Experiment wird die subkutan verabreichte rhuKGF-2 Therapie einen Tag nach der Induktion von Diabetes mit Streptozotocin begonnen. In der zweiten Studie ist die Wasseraufnahme und Harnabgabe signifikant geringer als in den rhuKGF-2 behandelten diabetischen Ratten im Vergleich zu diabetischen Ratten an Tag 9, ebenfalls eine Abmilderung des Krankheitszustands anzeigend. In der dritten Studie ist die rhuKGF-2 Therapie in der Lage, den Gesamtanteil an Insulin und C-Peptid im Pankreas von diabetischen Ratten zu erhöhen, wenn mit diabetischen Ratten verglichen wird, die mit Natriumchloridlösung behandelt wurden.
In dem vierten Experiment wird eine 7 Tage dauernde rhuKGF-2 Therapie 7 Tage nach Streptozotocinbehandlung begonnen und die Tiere werden dann für weitere 12 Wochen verfolgt. In allen Experimenten, außer dem vierten Experiment werden BlutGlukosemengen, HarnGlukosemengen und Urinvolumen als Endpunkte für die Analyse verwendet. Zusätzlich werden die Wasseraufnahme, Harn C-Peptidmengen oder gesamtpankreatisches Insulin und C-Peptidgehalt in einigen Experimenten gemessen. In dem vierten Experiment ist der einzig untersuchte Endpunkt die Blutglukose.
Da eine große Fraktion an Insulin aus der Zirkulation durch die Leber entfernt wird, reflektiert die Messung peripherer Insulinkonzentrationen eher posthepatische Metabolismusvorgänge als die Insulinsezernierung des Pankreas. Daher werden oft Messungen des C-Peptids durchgeführt und als peripherer Marken der Insulinsezernierung verwendet. C-Peptid wird durch die Prozessierung von Pro-Insulin in Insulin hergestellt. Insulin und C-Peptid werden aus den Betazellen in äquimolaren Mengen sezerniert und nur ein kleiner Teil des C-Peptids wird durch die Leber extrahiert.
STZ-behandelte Tiere aus beiden Gruppen, die rhuKGF-2 erhalten, haben signifikante Verringerungen in der Blutglukose während der rhuKGF-2 Dosierungsperiode.
Sequenzauflistung

Claims

Ein in vitro-Verfahren zur Stimulierung der Produktion von Epithelzellen, die aus Zellen innerhalb des Auges, des Ohrs, des Zahnfleisches und der Harnblase ausgewählt sind, das das Inkontaktbringen solcher Zellen mit einer wirksamen Menge von KGF-2 Proteinen) umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin besagtes) KGF-2 Proteine) eine Aminosäuresequenz aufweist (aufweisen), die die Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ der SEQ ID NO: 2 oder eine Variantensequenz davon umfasst, wobei besagte Variante Deletionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Additionen umfasst und die biologische Aktivität des reifen KGF-2 Proteins beibehält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin besagte Variantensequenz eine Aminosäuresequenz umfasst, die mehr als achtzig Prozent (80%), neunzig Prozent (90%), fünfundneunzig Prozent (95%) oder neunundneunzig Prozent (99%) homolog zu den Aminosäuren Cys³⁷ bis Cer²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 ist und wobei besagte Variante Deletionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Additionen umfasst und die biologische Aktivität des reifen KGF-2 Proteins beibehält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin besagtes) KGF-2 Proteine) mit der ganzen oder einem Teil der konstanten Domäne der schweren oder leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins fusioniert ist (sind).
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin besagtes) KGF-2 Proteine) durch Bindung desselben an ein Polymer chemisch modifiziert ist (sind).
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, worin besagtes) KGF-2 Proteine) durch Konjugation mit einem wasserlöslichen Polymer chemisch modifiziert ist (sind).
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin besagtes) KGF-2 Proteine) vor der Verabreichung aus einem dehydrierten oder lyophilisierten Pulver rekonstituiert wird (werden).
Eine Verwendung einer wirksamen Menge von KGF-2 Proteinen) zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung eines Zustandes in einem Patienten, der an einem Zustand leidet, der aus kornealer Abschürfung oder kornealen Geschwüren, Zahnfleischerkrankung, Trommelfellschaden oder Geschwüren oder entzündlichen Zuständen der Harnblase ausgewählt ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin besagtes) KGF-2 Proteine) eine Aminosäuresequenz aufweist (aufweisen), die die Aminosäuren Cys³⁷ bis Ser²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 oder eine Variantensequenz davon umfasst, worin besagte Variante Deletionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Additionen umfasst und die biologische Aktivität des reifen KGF-2 Proteins beibehält.
Die Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei besagte Variantensequenz eine Aminosäuresequenz umfasst, die mehr als achtzig Prozent (80%), neunzig Prozent (90%), fünfundneunzig Prozent (95%) oder neunundneunzig Prozent (99%) homolog zu den Aminosäuren Cys³⁷ bis Cer²⁰⁸ von SEQ ID NO: 2 ist und wobei besagte Variante Deletionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Additionen umfasst und die biologische Aktivität des reifen KGF-2 Proteins beibehält.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin besagtes) KGF-2 Proteine) an die gesamte oder einen Teil der konstanten Domäne der schweren oder leichten Kette eines menschlichen Immunglobulins fusioniert ist (sind).
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, worin besagtes) KGF-2 Proteine) durch die Bindung desselben an ein Polymer chemisch modifiziert ist (sind).
Die Verwendung gemäß Anspruch 12, worin besagtes) KGF-2 Proteine) durch Konjugation mit einem wasserlöslichen Polymer chemisch modifiziert ist (sind).
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13, worin besagtes) KGF-2 Proteine) vor der Verabreichung aus einem dehydrierten oder lyophilisierten Pulver rekonstituiert wird (werden).
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14, worin besagtes) KGF-2 Proteine) topisch, enteral oder parenteral verabreicht wird (werden).