KR20210008392A

KR20210008392A - 국소 제제로부터의 생물학적 작용제의 전달 방법

Info

Publication number: KR20210008392A
Application number: KR1020207035243A
Authority: KR
Inventors: 랜스 스튜어드; 에이미 브리도-안데르센; 지에 셴; 리디아 앤드류스-존스; 시앙 호; 벳시 블룸; 광 웨이 루; 팡징 왕; 써니 쿠마르; 그레고리 니콜슨; 론 브로이드
Original assignee: 알레간 인코포레이티드
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-01-21
Also published as: AU2019264916A1; CN112312894A; RU2022103924A; MX2020012060A; WO2019217869A1; BR112020023071A2; US20190343759A1; CA3099997A1; JP2021523176A; EP3790531A1; US20230190636A1

Abstract

제제의 국소 적용에 의해 진피 또는 표재성 근육으로의 생물학적 작용제의 전달 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 본 방법은 피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치 또는 컨디셔닝하는 단계, 및 생물학적 작용제를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함한다.

Description

국소 제제로부터의 생물학적 작용제의 전달 방법

[관련 출원의 상호-참조]

본 출원은 2018년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/670,711을 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 개시내용은 국소적으로 적용된 제제로부터 진피 및/또는 표재성 근육으로의 생물학적 작용제의 전달 방법에 관한 것이다.

배경

인간 피부는 유익한 작용제의 전달을 위한 용이하게 접근가능한 표면이다. 평균 성인 신체의 피부는 대략 2 m²의 표면을 덮고, 신체를 통해 순환하는 혈액의 약 1/3을 수용한다. 피부는 형태적으로 구별되는 영역; 기저 층, 가시 층, 과립층 및 가장 위에 있는 각질층을 갖는, 가장 위에 있는 층인 표피를 함유한다. 유익한 작용제의 피부로의 국소 전달을 위해 및 유익한 작용제의 전신으로의 경피 전달을 위해, 작용제는 각질층의 장벽 특성을 극복해야 한다. 각질층은 그 위에 놓인 작용제에 대해 선택적으로 투과성이고, 오직 400 달톤 미만의 분자량을 갖는 비교적 친지성인 화합물만이 이를 통과하도록 허용한다. 각질층의 장벽 특성을 극복하는 방법은 물리적 또는 기계적 방법, 예컨대 이온영동, 피부 전기천공, 마이크로니들링, 및 화학적 방법, 예컨대 침투 증진제, 예를 들어 디메틸술폭시드(DMSO), 올레일 알콜, 프로필렌 글리콜(PG), 메틸 피롤리돈, 및 도데실아질 시클로헵탄 2-온(아존(AZONE)^®)을 포함한다. 이러한 화학적 방법은, 특히 분자가 친지성 또는 양친매성인 경우에, 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 특정 화합물의 침투를 증진시킬 수 있다. 친수성 화합물, 예컨대 단백질 및 다른 생물학적 작용제는 심지어 공지된 화학적 투과 기술을 이용하는 경우에도 효과적인 전달을 위해 피부 장벽을 극복하지 못한다. 피부를 통한 생물학적 작용제의 전달을 달성하는 방법이 요구된다.

간단한 요약

한 측면에서, 생물학적 작용제의 전달 방법이 제공된다. 상기 방법은 피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계; 및 생물학적 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 처치 및 적용하는 단계는 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달을 달성한다.

한 실시양태에서, 처치는 화학적 또는 기계적 처치, 또는 화학적 및 기계적 처치의 조합을 포함한다.

한 실시양태에서, 처치는 히알루론산을 포함하는 제제를 포함하며, 여기서 히알루론산의 일부는 결정질 형태 또는 마이크로스피큘(microspicule) 형태이다.

또 다른 실시양태에서, 처치는 피부 롤러이다. 한 실시양태에서, 피부 롤러는 각질층과 접촉하는 평평한 블레이드-형상 모서리를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 피부 롤러는 각질층과 접촉하는 끝으로 갈수록 가늘어지는 형태의 샤프트를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는다.

한 실시양태에서, 피부 영역은 피부 롤러의 단일 통과로 처치된다. 또 다른 실시양태에서, 피부 영역은 피부 롤러의 1 회 초과의 통과로 처치된다.

또 다른 실시양태에서, 처치는 테이프 스트리핑이다. 한 실시양태에서, 테이프 스트리핑은 테이프의 스트립을 적어도 2 회 적용하고 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 테이프 스트리핑은 테이프의 스트립을 2-20 회 또는 3-12 회 적용하고 제거하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, 처치 및 적용하는 단계는 동시에 수행된다.

일부 실시양태에서, 생물학적 작용제는 클로스트리디움 유도체이다. 한 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 보툴리눔 독소이다. 다른 실시양태에서, 생물학적 작용제는 약 100,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다. 대안적인 실시양태에서, 생물학적 작용제는 약 40,000 달톤 초과의 분자량을 갖는다.

또 다른 측면에서, 국부 영역에서의 상태를 생물학적 작용제로 처치하는 방법은 피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계; 및 생물학적 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함한다. 처치 및/또는 적용은 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달을 달성한다.

한 실시양태에서, 상태는 잔주름 또는 주름이다. 한 실시양태에서, 잔주름 또는 주름은 측면 안각 주름, 미간 주름, 이마 주름, 광경근 주름, 비구순 주름, 입술 주위 주름, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 상태는 피부 늘어짐이다. 또 다른 실시양태에서, 상태는 지성 피부, 피지, 또는 확장된 모공 크기이다. 또 다른 실시양태에서, 상태는 과도한 또는 감소된 색소이다. 한 실시양태에서, 상태는 과다색소침착이다.

또 다른 측면에서, 피부 품질을 개선시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계, 및 클로스트리디움 유도체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함한다. 처치 및/또는 적용은 개선된 피부 품질을 위한 클로스트리디움 유도체의 피부 전달을 달성한다.

한 실시양태에서, 처치는 화학적 용매, 예컨대 하지만 비제한적으로, 디메틸술폭시드(DMSO), 올레일 알콜, 프로필렌 글리콜(PG), 메틸 피롤리돈, 및 도데실아질 시클로헵탄 2-온(아존^®)으로의 처치를 제외한다.

도면의 간단한 설명

하기 도면은 본 방법의 실시양태의 측면 및 특징을 예시하기 위해 제시된다.

도 1a는 IgG의 침투 깊이를 가시화하기 위해 형광 표지된, IgG의 국소 적용 전에 히알루론산 제제로 처치된 인간 사체 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이고, 영상은 0 ㎛, 8 ㎛, 16 ㎛, 24 ㎛, 32 ㎛, 40 ㎛, 48 ㎛, 56 ㎛ 및 64 ㎛의 조직 깊이에서 촬영된 것이고;

도 1b는 IgG의 침투 깊이를 가시화하기 위해 형광 표지된, IgG의 국소 적용 전에 피부 처치되지 않은 인간 사체 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이고, 영상은 0 ㎛, 8 ㎛, 16 ㎛, 24 ㎛, 32 ㎛, 40 ㎛, 48 ㎛, 56 ㎛ 및 64 ㎛의 조직 깊이에서 촬영된 것이고;

도 1c는 히알루론산 제제로 처치되고 IgG로 처치되지 않은 인간 사체 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이고, 영상은 0 ㎛, 8 ㎛, 16 ㎛, 24 ㎛, 32 ㎛, 40 ㎛, 48 ㎛, 56 ㎛ 및 64 ㎛의 조직 깊이에서 촬영된 것이고;

도 2a는 IgG의 침투 깊이를 가시화하기 위해 형광 표지된, IgG의 국소 적용 전에 마이크로니들 피부 롤러로 처치된 인간 사체 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이고, 영상은 IgG 적용 1 시간 후에 및 0 ㎛에서 280 ㎛까지 10 ㎛ 별 조직 깊이에서 촬영된 것이고;

도 2b는 IgG의 침투 깊이를 가시화하기 위해 형광 표지된, IgG의 국소 적용 전에 처치되지 않은 인간 사체 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이고, 영상은 IgG 적용 1 시간 후에 및 0 ㎛에서 280 ㎛까지의 10 ㎛ 별 조직 깊이에서 촬영된 것이고;

도 3a는 BoNT/A(10 U/kg)의 근육내(IM) 또는 피내(ID) 주사 후 3-4 일에 관찰된 최대 평균 래트 발가락 외전 점수(digit abduction score)(DAS)를 나타내는 막대 그래프이고 (n= 6 래트/투여 방법);

도 3b는 0.25 mm, 0.5 mm 또는 1.0 mm의 니들 길이를 갖는 피부-롤러로 피부를 처치한 후, 여기서 롤러를 처치할 피부의 영역에 걸쳐 1 회(1X) 또는 2 회(2X) 통과시키고, 이어서 BoNT/A 조성물의 국소 적용 후의 최대 평균 래트 DAS 점수를 나타내는 막대 그래프이고;

도 3c는 0.25 mm, 0.5 mm 또는 1.0 mm의 니들 길이를 갖는 피부-롤러로 피부를 처치한 후 DAS 분석과 비교하여 래트 전경골의 신경근육 접합부에서의 SNAP25₁₉₇-양성 염색의 백분율을 나타내는 막대 그래프이고;

도 4는 0.5 mm의 니들 길이를 갖는 피부-롤러로 피부를 처치한 후, 여기서 롤러를 처치할 피부 영역에 걸쳐 2 회 통과시키고, 이어서 지시된 농도에서 BoNT/A를 포함하는 2 종의 상이한 제제의 국소 적용 후의 최대 평균 래트 DAS 점수를 나타내는 막대 그래프이고;

도 5는 MTX 및 DRS로 확인된 2 개의 상이한 피부-롤러로 피부를 처치한 후, 여기서 롤러를 피부 처치 영역에 걸쳐 2 회(2X), 3 회(3X), 4 회(4X) 또는 5 회(5X) 통과시키고, 이어서 BoNT/A의 국소 제제를 적용한 후의 최대 평균 래트 DAS 점수를 나타내는 막대 그래프이고;

도 6은 피부-롤러로 피부를 처치한 후, 이어서 150 kDa BoNT/A 또는 900 kDa BoNT/A를 포함하는 국소 제제를 적용한 후의 평균 피크 래트 DAS 점수를 나타내는 막대 그래프이고;

도 7은 위에 놓인 피부 표면에 대해 테이프 스트리핑 및 BoNT/A 국소 적용 후 래트 TA 근육의 축삭 및 일부 운동 신경 말단에서의 가벼운 SNAP25₁₉₇-양성 염색을 나타내는 면역조직화학(IHC) 염색이다. 테이프 스트리핑을 겪지 않은 근육에서는 SNAP25₁₉₇ 염색이 관찰되지 않았다.

상세한 설명

정의

하기 정의가 본원에 적용된다:

본원에서 사용된 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하는 것으로, 이는 부분적으로는 값이 측정 또는 결정된 방법(즉, 측정 시스템의 한계)에 의존하게 될 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야에서의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에서 특정 값이 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"이라는 용어는 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미한다.

"투여" 또는 "투여하다"는 대상체, 또는 대안적으로 제약 조성물을 제공받는 대상체에게 보툴리눔 독소를 제공하는(즉 투여하는) 단계를 의미한다.

"완화"는 상태 또는 상태와 연관된 증상의 발생의 감소를 의미한다. 따라서, 완화는 일부 감소, 유의적인 감소, 거의 전체에 가까운 감소, 및 전체 감소를 포함한다. 완화 효과는 클로스트리디움 유도체를 환자에게 투여한 후 1 내지 7 일 또는 때때로 그 후에 임상적으로 나타나지 않을 수 있다.

"동물 단백질 무함유"는 혈액 유래, 풀링된 혈액 및 다른 동물 유래 생성물 또는 화합물의 부재를 의미한다. "동물"은 포유동물(예컨대 인간), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물 종을 의미한다. "동물"은 미생물, 예컨대 박테리아를 배제한다. 따라서, 동물 단백질 무함유 제약 조성물은 보툴리눔 신경독소를 포함할 수 있다. 예를 들어, "동물 단백질 무함유" 제약 조성물은 혈청 유래 알부민, 젤라틴 및 다른 동물 유래 단백질, 예컨대 이뮤노글로불린이 실질적으로 없거나 또는 본질적으로 없거나 또는 완전히 없는 제약 조성물을 의미한다. 동물 단백질 무함유 제약 조성물의 예는 (활성 성분으로서의) 보툴리눔 독소 및 안정화제 또는 부형제로서의 적합한 폴리사카라이드를 포함하거나 이로 이루어진 제약 조성물이다.

"생물학적 작용제"는 생물학적 활성이고 5,000 달톤 이상의 분자량을 갖거나 또는 본원에 명시된 값의 범위의 분자량을 갖는 분자를 의도한다.

"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생산된 신경독소, 뿐만 아니라 비-클로스트리디움 종에 의해 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소 (또는 그의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 혈청형 A(BoNT/A), 보툴리눔 독소 혈청형 B(BoNT/B), 보툴리눔 독소 혈청형 C(BoNT/C), 보툴리눔 독소 혈청형 D(BoNT/D), 보툴리눔 독소 혈청형 E(BoNT/E), 보툴리눔 독소 혈청형 F(BoNT/F), 보툴리눔 독소 혈청형 G(BoNT/G), 보툴리눔 독소 혈청형 H(BoNT/H), 보툴리눔 독소 혈청형 X(BoNT/X), 및 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 하위유형 및 변이체를 포괄한다. 본원에 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 "변형된 보툴리눔 독소"를 포괄한다. 추가로, 본원에 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 보툴리눔 독소 복합체(예를 들어, 300, 600 및 900 kDa 복합체), 뿐만 아니라 복합체 단백질과 연관되지 않은 보툴리눔 독소의 신경독성 성분(150 kDa)을 포괄한다.

"클로스트리디움 유도체"는 클로스트리디움 독소의 임의의 부분을 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "클로스트리디움 유도체"는 천연 또는 재조합 신경독소, 재조합 변형된 독소, 그의 단편, 표적화된 소포성 세포외배출 조정제(TEM), 또는 그의 조합을 포괄한다.

"클로스트리디움 독소"는, 클로스트리디움 독소가 세포를 중독시키게 하는 전반적인 세포 기전을 수행할 수 있는 클로스트리디움 독소 균주에 의해 생산된 임의의 독소를 지칭하고, 클로스트리디움 독소의 저 또는 고친화성 클로스트리디움 독소 수용체에의 결합, 독소/수용체 복합체의 내재화, 클로스트리디움 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위, 및 클로스트리디움 독소 기질의 효소적 변형을 포함한다. 클로스트리디움 독소의 비제한적인 예로는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C₁, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G와 같은 보툴리눔 독소, 파상풍 독소(TeNT), 바라티이 독소(BaNT), 및 부티리쿰 독소(BuNT)를 포함한다. 신경독소가 아닌 BoNT/C₂ 세포독소 및 BoNT/C₃ 세포독소는 용어 "클로스트리디움 독소"로부터 배제된다. 본원에 개시된 클로스트리디움 독소는, 비제한적으로, 천연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대, 예를 들어, 클로스트리디움 독소 이소형 및 클로스트리디움 독소 하위유형; 비-천연 발생 클로스트리디움 독소 변이체, 예컨대, 예를 들어, 보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리디움 독소 변이체, 클로스트리디움 독소 키메라 변이체 및 그의 활성 클로스트리디움 독소 단편, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 본원에 개시된 클로스트리디움 독소는 또한 클로스트리디움 독소 복합체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "클로스트리디움 독소 복합체"는 클로스트리디움 독소 및 비-독소 연관 단백질(NAP)을 포함하는 복합체, 예컨대, 예를 들어, 보툴리눔 독소 복합체, 파상풍 독소 복합체, 바라티이 독소 복합체, 및 부티리쿰 독소 복합체를 지칭한다. 클로스트리디움 독소 복합체의 비제한적인 예는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생산된 것, 예컨대, 예를 들어, 900-kDa BoNT/A 복합체, 600-kDa BoNT/A 복합체, 300-kDa BoNT/A 복합체, 500-kDa BoNT/B 복합체, 500-kDa BoNT/C₁ 복합체, 500-kDa BoNT/D 복합체, 300-kDa BoNT/D 복합체, 300-kDa BoNT/E 복합체, 및 300-kDa BoNT/F 복합체를 포함한다.

생물학적 활성 성분에 적용되는 "유효량"은 대상체에서 원하는 변화를 유도하기에 일반적으로 충분한 성분의 양을 의미한다. 예를 들어, 원하는 효과가 결석 형성의 감소인 경우에, 성분의 유효량은 유의한 독성을 초래하지 않으면서, 방광 과다활성 및 연관 증상의 적어도 실질적인 감소를 유발하는 양이다.

용어 "무손상 피부"는 그의 천연 장벽 기능을 보유하고 각질층의 장벽 기능을 손상시킬 수 있는 방식으로 화학적 수단 또는 물리적 처치에 의해 변경되지 않은 피부를 지칭한다. 반대로, "비-무손상" 피부는 각질층의 장벽 기능을 손상시키는 방식으로 처치된 피부를 지칭한다.

"국부 투여"는, 예컨대, 예를 들어 근육내 또는 피내 또는 피하 주사 또는 국소 투여를 통해, 제약의 생물학적 효과가 요구되는, 동물 신체 상의 또는 그 내의 부위에 또는 그 부근에 제약 작용제를 투여하는 것을 의미한다. 국부 투여는 전신 경로의 투여, 예컨대 정맥내 또는 경구 투여를 배제한다. 국소 투여는 제약 작용제가 환자의 피부에 적용되는 국부 투여의 한 유형이다.

"변형된 보툴리눔 독소"는 그의 아미노산 중 적어도 하나가 천연 보툴리눔 독소와 비교하여, 결실, 변형, 또는 치환되어 있는 것인 보툴리눔 독소를 의미한다. 추가로, 변형된 보툴리눔 독소는 재조합적으로 제조된 신경독소, 또는 재조합적으로 제조된 신경독소의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소는 천연 보툴리눔 독소의 하나 이상의 생물학적 활성, 예컨대, 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력, 또는 뉴런으로부터의 신경전달물질 방출 또는 비-뉴런 세포로부터의 소포 방출을 억제하는 능력을 보유한다. 변형된 보툴리눔 독소의 한 예로는 하나의 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대, 혈청형 A)으로부터의 경쇄, 및 상이한 보툴리눔 독소 혈청형(예컨대, 혈청형 B)으로부터의 중쇄를 갖는 보툴리눔 독소가 있다. 변형된 보툴리눔 독소의 또 다른 예로는 신경전달물질, 예컨대, 물질 P에 커플링된 보툴리눔 독소가 있다.

용어 "분자량"은 분자를 구성하는 모든 원자의 원자량의 합을 지칭하고, 달톤(Da)으로 수치적으로 표현될 수 있다.

"돌연변이"는, 천연 발생 단백질 또는 핵산 서열의 구조적 변형을 의미한다. 예를 들어, 핵산 돌연변이의 경우, 돌연변이는 DNA 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 단백질 서열 돌연변이의 경우, 돌연변이는 단백질 서열 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 예를 들어, 단백질 서열을 포함하는 특정 아미노산은 또 다른 아미노산, 예를 들어 아미노산 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신 또는 임의의 다른 천연 또는 비-천연 발생 아미노산 또는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는, 전사되고, 생성된 mRNA가 번역되었을 때, 돌연변이화된 단백질 서열을 생성하는 DNA 서열에 대한 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는 또한 원하는 단백질 서열에 대한 원하는 돌연변이를 함유하는 펩티드를 서열을 융합시킴으로써 생성될 수 있다.

용어 "수동 경피 전달"은 활성제를 피부 표면 상에 배치하여 그가 피부 표면 상의 보다 높은 약물 농도와 피부 내의 보다 낮은 약물 농도 사이의 농도 구배의 함수로서 피부 내로 침투함으로써 활성제를 전달하는 것을 지칭한다.

"말초 투여"는 국부 투여와는 대조적으로, 증상을 보이는 위치로부터 떨어진 위치에 대한 투여를 의미한다.

"제약 조성물"은, 활성 제약 성분, 예컨대, 예를 들어, 클로스트리디움 독소 활성 성분, 예컨대, 보툴리눔 독소, 및 적어도 하나의 추가 성분, 예컨대, 예를 들어, 안정제 또는 부형제 등을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 제약 조성물은 대상체, 예컨대 인간 환자에 대한 진단 또는 치료 투여에 적합한 제제이다. 제약 조성물은 예를 들어, 동결건조 또는 진공 건조된 상태, 동결건조 또는 진공 건조된 제약 조성물의 재구성 후에 형성된 용액, 또는 재구성이 필요 없는 용액 또는 고체일 수 있다.

"약리적으로 허용되는 부형제"는 "약리적 부형제" 또는 "부형제"와의 동의어로서, 포유동물에게 투여되었을 때, 실질적으로 장기간의 또는 영구적인 유해한 영향을 주지 않는 임의의 부형제를 지칭하며, 화합물, 예컨대, 예를 들어, 안정화제, 벌크화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 첨가제, 비히클, 담체, 희석제 또는 보조제를 포괄한다. 부형제는 일반적으로 활성 성분과 혼합되거나, 또는 활성 성분을 희석 또는 봉입할 수 있도록 허용되고, 고체, 반고체, 또는 액체 작용제일 수 있다. 또한, 클로스트리디움 독소 활성 성분을 포함하는 제약 조성물은 활성 성분의 제약상 허용되는 조성물로의 프로세싱을 촉진시키는 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있을 것으로 구상된다. 임의의 약리적으로 허용되는 부형제가 클로스트리디움 독소 활성 성분과 비상용성이 아닌 한, 제약상 허용되는 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 약리적으로 허용되는 부형제의 비제한적 예는, 예를 들어, 문헌 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7^th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20^th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10^th ed. 2001); 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4^th edition 2003)]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 "TEM"은 "표적화된 세포외배출 조정제" 또는 "재표적화된 엔도펩티다제" 또는 "표적화된 분비 억제제(TSI)"와 동의어이다. 일반적으로, TEM은 클로스트리디움 독소 경쇄로부터의 효소적 도메인, 클로스트리디움 독소 중쇄로부터의 전위 도메인, 및 표적화 도메인을 포함한다. TEM의 표적화 도메인은 천연-발생 클로스트리디움 독소에 의해 이용되는 천연 클로스트리디움 독소 수용체 이외의 다른 수용체에 분자를 표적화하는 변경된 세포 표적화 능력을 제공한다. 이러한 재표적화된 능력은 클로스트리디움 독소의 천연-발생 결합 도메인을 비-클로스트리디움 독소 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 표적화 도메인으로 대체함으로써 달성된다. 비-클로스트리디움 독소 수용체에 결합하지만, TEM은 세포질 내로의 TEM/ 수용체 복합체의 내재화, 소포 막 및 이중쇄 분자 내의 세공의 형성, 효소적 도메인의 세포질 내로의 전위, 및 표적 세포의 SNARE 복합체의 성분에 대한 단백질 분해 효과를 발휘하는 것을 포함하는 중독 과정의 다른 모든 단계를 거친다.

본원에 사용된 "국소 적용" 또는 "국소적으로 적용하는"은 각질층이 무손상이거나 또는 파괴될 수 있는 표피 조직, 특히 외부 피부 상에 직접 놓거나 펴바르는 것을 의미한다.

본원에 사용된 "국소 전달" 또는 "국소 투여" 등은 피부로의 국부 전달을 위해 피부 내로 국소적으로 적용된 활성제의 통과를 의미한다.

본원에 사용된 "경피"는 표재성 근육으로의 국부 전달 또는 활성제의 전신 전달을 위한 피부 내로의 및/또는 이를 통한 통과를 의미한다.

"처치하는" 또는 "처치"는 적어도 하나의 증상(예컨대, 예를 들어, 고관절 및 서혜부 통증)을 일시적으로 또는 영구적으로 완화시키는 (또는 제거하는) 것을 의미한다.

"치료 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분한 양을 지칭한다.

"변이체"는 표적 세포에 의해 인식되고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 표적 세포에서 SNARE(SNAP(가용성 NSF 부착 단백질)수용체) 단백질을 촉매적으로 절단하는, 야생형 보툴리눔 독소에 비해 적어도 하나의 아미노산의 대체, 변형, 부가 또는 결실에 의해 변형된 클로스트리디움 신경독소, 예컨대 야생형 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, H, X, 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 하위유형, 하이브리드, 키메라를 의미한다.

변이체 신경독소 성분의 예는 치환, 변형, 결실 및/또는 부가된 하나 이상의 아미노산을 갖는 보툴리눔 독소의 변이체 경쇄를 포함할 수 있다. 상기 변이체 경쇄는 예를 들어, 신경전달물질 소포체의 방출과 같은, 세포외배출을 방해하는 데 있어 동일하거나, 또는 더 우수한 능력을 가질 수 있다. 추가로, 변이체의 생물학적 효과는 모체 화학적 엔티티와 비교하여 저감될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열이 제거된 보툴리눔 독소 A형의 변이체 경쇄는 모체 (또는 천연) 보툴리눔 독소 A형 경쇄의 것과 비교하여 더 짧은 생물학적 지속성을 가질 수 있다.

처치 방법

한 측면에서, 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달 방법이 제공된다. 이 방법은 피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계; 및 생물학적 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함한다. 처치 및/또는 적용은 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달을 달성한다. 일부 실시양태에서, 처치 및/또는 적용은 예를 들어, 처치된 피부 영역의 표재성 근육으로의 또는 처치된 피부 영역의 진피로의 생물학적 작용제의 전달을 달성한다. 다른 측면에서, 국부 영역에서의 상태를 처치하거나, 피부 품질을 개선시키거나, 또는 손상되거나 노화된 피부를 처치하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 작용제는 클로스트리디움 유도체이다.

실시예 1에 기재된 바와 같이, 피부 영역을 처치하고 생물학적 작용제를 적용함으로써 피부 상태를 처치하는 방법을 입증하기 위한 연구를 수행하였다. 인간 사체 피부를 히알루론산 미세결정을 함유하는 연마 스크럽으로 처치하여 각질층을 파괴하였다. 히알루론산 스크럽으로 처치한 후, 생물학적 작용제 IgG를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하였다. IgG는 150 kDa 단백질이다. 이는 피부 내로의 침투 깊이가 가시화될 수 있도록 형광-표지되었다. 비교 대조군의 경우, IgG 제제를 적용하기 전에 피부 샘플을 히알루론산 스크럽으로 처치하지 않았고, 다른 피부 샘플을 히알루론산 스크럽만으로 처치하였다(즉, IgG 제제를 적용하지 않았다). 피부 샘플을 형광이 검출될 수 없을 때까지 공초점 레이저 주사 현미경으로 증가하는 조직 깊이에서 스캐닝하였고, 영상을 촬영하였다. 결과가 도 1a-1c에 제시된다.

도 1a를 참조하면, IgG의 국소 적용 전에 히알루론산 스크럽으로 처치된 피부의 공초점 레이저 주사 현미경으로부터의 영상이 각각의 영상에서 지시된 바와 같이 다양한 조직 깊이에서 제시된다. 공초점 영상은 형광-표지된 IgG의 침투 깊이가 약 32 ㎛에 이르는 것을 보여준다. 영상은 또한 피부의 형태가 히알루론산 스크럽으로 변경되었음을 보여준다. 이는 히알루론산 스크럽으로 처치되지 않은 피부 대조군 샘플에 상응하는 도 1b의 영상을 검사함으로써 명백하다. 각질층을 파괴하기 위해 피부를 처치하는 단계 없이 피부에 생물학적 작용제를 적용하는 것은 약 8 ㎛의 IgG 침투 깊이를 달성하였다. 히알루론산 스크럽 처치를 받지 않은 대조군 샘플의 영상 (도 1b)은 또한 형광 강도가 훨씬 더 낮고 거의 보이지 않았음을 보여준다. 히알루론산 스크럽으로 처치되고 IgG로 처치되지 않은 다른 대조군 샘플과 관련하여, 영상이 도 1c에 제시된다. 히알루론산 스크럽만으로 처치된 대조군 피부 샘플에서 배경 형광이 거의 검출되지 않았다. 이들 결과는 피부 상의 각질층을 파괴하기 위해 연마 스크럽, 예컨대 히알루론산 미세결정을 함유하는 것을 사용하는 것이 표피/진피 장벽으로의 생물학적 작용제, 예컨대 150 kDa IgG의 전달을 개선시킬 수 있다는 것을 입증하고, 피부 구조를 파괴함으로써 피부에서의 큰 분자 침투가 증진될 수 있다는 것을 보여준다. 한 실시양태에서, 규정된 영역 내의 각질층을 파괴하도록 피부를 처치하고, 처치된 피부 영역에 생물학적 작용제를 포함하는 제제를 적용하는 것은 각질층을 파괴하도록 처치되지 않은 피부에 적용된 동일한 제제로부터의 생물학적 작용제의 침투 깊이보다 적어도 약 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4 배 더 큰 규정된 영역 내로의 생물학적 작용제의 침투 깊이에서의 증가를 달성한다.

또 다른 연구에서, 피부 롤러로 각질층을 파괴하도록 피부 영역을 처치하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 인간 사체 피부 샘플을 0.5 mm의 길이를 갖는 니들을 갖는 피부 롤러로 미세천공하였다. 피부 롤러로 처치한 후, 형광-표지된 IgG를 갖는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하였다. 1시간 후, 피부를 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석하고, 형광이 가시화될 수 있을 때까지 10 ㎛ 두께의 피부 층을 통해 스캐닝하였다. 대조군으로서, IgG 제제를 적용하기 전에 피부 샘플을 피부 롤러로 처치하지 않았다.

도 2a는 형광-표지된 IgG의 국소 적용 전에 마이크로니들 피부 롤러로 처치된 피부의 영상을 보여준다. 영상은 형광-표지된 IgG의 검출 한계인 220 ㎛의 생성된 마이크로채널의 깊이를 보여준다. 도 2b는 IgG의 국소 적용 전에 피부 롤러로 처치되지 않은 피부의 영상을 보여준다. 형광-표지된 IgG는 약 70 ㎛ 깊이를 초과하여 가시화될 수 없었다. 이들 결과는 물리적 처치가 없는 경우보다 피부 롤러로의 물리적 처치 후 생물학적 작용제가 인간 피부 내로 3 배 더 깊이 침투하였음을 입증하였다. 형광 마커는 피부 롤러 처치 후 대략 220 ㎛ 깊이(도 2a) 대 피부 롤러 처치 없이 대조군 피부에 대해 대략 70 ㎛ 깊이(도 2b)까지 가시적이었다. 220 ㎛ 깊이로의 전달은 피부의 진피 층으로의 전달과 동일하다. 이들 결과는 5,000 달톤, 10,000 달톤, 50,000 달톤, 75,000 달톤 또는 100,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 생물학적 작용제의 피부에서의 침투가 생물학적 작용제의 적용 전에 또는 그와 동시에 피부 구조를 파괴함으로써 증진될 수 있음을 보여준다. 한 실시양태에서, 침투 증진은 각질층을 파괴하도록 처치되지 않은 유사한 피부 영역에 적용된 동일한 제제로부터의 동일한 생물학적 작용제에 대해 수득된 것보다 적어도 약 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 배 더 크다.

실시예 3은 각질층을 파괴하여 생물학적 작용제의 전달을 허용하도록 피부를 처치하는 또 다른 연구를 기재한다. 본 연구에서, 생물학적 작용제는 보툴리눔 신경독소 유형-A(BoNT/A)였다. 무모 래트의 전경골근(TA) 근육 위에 놓인 피부를 0.25 mm, 0.50 mm 또는 1.0 mm의 니들 길이를 갖는 피부 롤러로 미세천공하였다. 통과 횟수 또는 니들 장치가 처치의 피부 영역 상에서 롤링되는 횟수는 1 회 또는 2 회(즉, 1 회 또는 2 회 통과, 도면에서 1X, 2X 등으로 표시됨)였다. 피부 롤러로 처치한 후, 150 kDa 생물학적 작용제, BoNT/A를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하였다.

BoNT/A의 피부 침투를 측정하기 위해, 래트 발가락 외전 점수(DAS)를 사용하였다. DAS는 국부 근육 약화에 대한 BoNT/A의 효능을 결정하는 데 사용되는 생리학적 검정이다 (Broide, R.S. et al., Toxicon, 71:18-24 (2013)). 간략하게, 근육내(IM) 또는 피내(ID) 주사 후, 독소는 특징적인 후지 놀람 반응을 생성하는 동물의 능력의 용량-의존성 감소를 도출하고, 이 반응의 정도를 5-점 척도로 점수화한다. 추가로, 근육 내의 운동 신경에서의 기능적 BoNT/A의 존재는 고도로 선택적인 항체를 사용하여 BoNT/A-절단된 SNAP25 기질(SNAP25₁₉₇)에 대한 면역조직화학적(IHC) 염색에 의해 검증될 수 있다 (Rheaume, C. et al., Toxins (Basel), 7 (7), 2354-2370 (2015); Cai, B.B. et al., Neuroscience, 352:155-169 (2017)).

본 연구에서, 국소 적용 후, 제1 일-제4 일 및 제7 일에 DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 관찰하고 기록하였다. 점수 척도는 실시예 3에 제시된다. TA 근육 위에 놓인 피부 내로의 BoNT/A(10 U/kg; 900 kDa)의 피내 주사를 양성 대조군으로서 사용하였다. 피내 주사는 앞서 동일한 독소 용량에서 근육내 주사와 비교되었고, 효능은 도 3a에 보인 바와 같이 단지 약간만 감소되는 것으로 밝혀졌다(각각 ~ED70 대 ~ED90).

도 3b-3c를 참조하면, 피부 롤러를 사용한 미세천공은 래트에서 일시적 근육 마비를 유도하며, 점수는 0 내지 4의 DAS 범위이다(검정에서 최대 반응) (도 3b). 0.25 mm의 길이를 갖는 니들은 국소적으로 적용된 보툴리눔 신경독소와 함께 낮은 DAS 점수(평균 <1)로 이어졌다. 0.5 mm 및 1.0 mm 니들 길이는 0.25 mm 니들 길이보다 실질적으로 더 우수한 DAS 점수(3-4)를 제공하였으며, 이는 니들 길이가 장벽 파괴의 효율 및 BoNT/A 전달의 그에 따른 효율에 영향을 미친다는 것을 입증한다. 니들 길이에 관계없이, 피부 롤러로의 2 회 통과는 단일 통과에 비해 증가된 전달을 제공하였다.

래트 DAS 검정은 일반적으로 후지 송아지 근육 중 하나, 예컨대 전경골근 근육 내로의 BoNT/A의 근육내 주사, 이어서 DAS 점수를 수반한다. 각질층을 파괴하도록 장벽 파괴를 한 래트의 TA 근육 위에 놓인 피부 조직의 처치(예를 들어, 피부 롤러)는 피부 표면으로부터 아래 놓인 근육으로의 기능적 BoNT/A의 전달을 용이하게 할 수 있다. 근육내 주사에서와 같이, BoNT/A의 이러한 국소 적용은 또한 용량-의존성, 측정가능한 DAS 반응을 초래한다.

단일 피부 롤러 컨디셔닝(처치) 및 BoNT/A 국소 처치 후 SNAP25₁₉₇-양성 신경근육 연접부(NMJ)의 정량적 분석은 도 3c에서 보인 바와 같이, 니들 길이에 의존적인 DAS 점수와 양의 상관관계를 보였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 전경골근의 단면은 1) 시냅스후 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)에 결합하는 형광-표지된 α-붕가로톡신(α-Bgt)을 사용한 총 NMJ의 존재 및 2) 재조합 모노클로날 항체를 사용한 시냅스전 운동 신경 말단(MNT) 및 운동 신경(MN) 축삭에서의 SNAP25₁₉₇의 존재에 대해 이중-표지되었다 (Rheaume, C. et al., Toxins (Basel), 7 (7), 2354-2370 (2015)). 전경골근 전반에 걸친 총α-Bgt-표지된 NMJ의 대표적인 샘플링 중 SNAP25₁₉₇-양성 NMJ의 백분율을 계산하고 기록하고, 결과를 도 3c에 나타낸다. 도 3b-3c의 데이터는 보다 긴 니들 및/또는 피부 위로 보다 많은 통과를 한 증가된 장벽 파괴가 피부에서의 BoNT/A의 국소 전달을 용이하게 한다는 것을 입증한다.

따라서, 한 실시양태에서, 진피로의 및/또는 표재성 근육으로의 생물학적 작용제의 전달 방법이 제공된다. 상기 방법은 각질층을 파괴하도록 피부를 처치하는 단계 및, 처치된 피부에 생물학적 작용제를 가진 제제를 국소적으로 적용하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 생물학적 작용제는 단독으로 및 단지 수동 수송에 의해 진피 및/또는 표재성 근육으로 전달된다. 수동 수송 또는 확산은 피부의 외부 표면과 내부 표면 사이의 약물 농도 구배에 의존한다. 확산 속도는 구배에 비례하고, 분자의 크기, 소수성, 친수성 및 다른 생리화학적 특성 뿐만 아니라 흡수 표면의 면적에 의해 조정된다. 한 실시양태에서, 생물학적 작용제는 어떠한 능동 수송도 없이 진피 및/또는 표재성 근육으로 전달된다. 능동 수송 또는 전달은, 예를 들어 생물학적 작용제의 이온화, 또는 작용제를 피부 내로 및 이를 통해 추진시키는 다른 수단에 의존한다. 능동 수송 전달 시스템은 이온영동, 초음파영동, 및 열 미세천공과 같은 방법을 포함한다.

또 다른 연구는 피부 롤러로의 장벽 파괴 후 진피 또는 표재성 근육 내로의 전달 효율에 대한 생물학적 작용제 및 제제의 용량을 평가하는 실시예 4에 기재된다. 무모 래트에서의 피부 처치 영역을, 0.50 mm 마이크로니들을 갖는 피부 롤러로 피부 영역에 2 회 통과시킴으로써 컨디셔닝하였다. 각각의 제제에 대해 2 가지 상이한 용량에서 BoNT/A를 포함하는 2 종의 제제를 처치된 피부 영역에 적용하였다. 국소 적용 후, 제1 일-제4 일, 및 제7 일에 DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 결정하였다. 도 4는 상이한 제제에 대한 최대 평균 래트 DAS 점수를 보여준다. 평균 피크 DAS 점수는 용량, 니들 길이, 및 롤러 통과의 횟수가 일정하게 유지될 때 상이한 제제가 상이한 효율로 BoNT/A를 전달할 수 있다는 것을 입증한다. 제제에 상관없이, 국소 용량을 증가시키는 것은 TA 근육으로의 BoNT/A의 보다 효율적인 전달을 용이하게 한다.

생물학적 작용제의 전달에 대한 2 개의 상이한 피부 롤러의 효과를 평가하는 또 다른 연구가 실시예 5에 기재된다. 피부 롤러는 각각 0.5 mm 니들을 가졌고, 하나의 롤러는 더 높은 니들 밀도를 가졌다 - 540 개의 니들("DRS" 롤러) 대 200 개의 니들("MTS" 롤러). 니들의 형상은 또한 평평한 블레이드형 외관을 갖는 니들을 갖는 하나의 롤러, 및 가늘어지는 원통형의 형태의 니들을 갖는 다른 롤러로 상이하였다. 무모 래트에서의 피부 처치 영역을, 피부 롤러 중 하나로, 피부 영역에 2 회, 또는 MTX 롤러로, 3 회, 4 회 및 5 회 통과시킴으로써 컨디셔닝하였다. BoNT/A를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하였다. 국소 적용 후, DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 결정하였다. 도 5는 상이한 롤러 처치에 대한 최대 평균 래트 DAS 점수를 보여준다. 데이터는 상이한 물리적 설계를 갖는 피부 롤러가 150,000 달톤(150 kDa) 초과의 분자량을 갖는 단백질 생물학적 작용제의 전달에 사용될 수 있음을 보여준다.

도 6은 본원에 기재된 방법을 사용하여 표재성 근육으로 150,000 달톤 및 900,000 달톤의 분자량을 갖는 생물학적 작용제의 전달을 입증하는 또 다른 연구의 결과를 보여준다. 래트 상의 피부 영역을 피부 롤러를 사용하여 컨디셔닝하고(실시예 6), 컨디셔닝 후, 생물학적 작용제를 포함하는 국소 제제를 적용하였다. DAS 검정을 사용하여 근육으로의 생물학적 작용제-보툴리눔 독소-의 기능적 전달을 평가하였다. 도 6의 데이터는 피부 장벽 파괴를 국소 적용과 조합함으로써, 900 kDa BoNT/A 복합체가 150 kDa BoNT/A 분자만큼 효율적으로 전달될 수 있다는 것을 입증한다. 이는 정제된 150 kDa BoNT/A와 비교하여 BoNT/A 복합체의 실질적으로 증가된 크기를 고려하면 놀라운 결과였다.

무모 래트를 사용한 또 다른 연구에서, 테이프 스트리핑으로 피부를 처리하는 것 및 진피 또는 아래 놓인 표재성 근육으로의 생물학적 작용제의 전달을 평가하였다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 피부를 테이프 스트리핑하여 각질층을 파괴하여 아래 놓인 근육으로의 기능적 BoNT/A의 전달을 용이하게 하였다. 테이프 스트리핑의 유무의 사전-처치 후에, BoNT/A를 TA 근육 위의 피부 영역에 적가 적용하였다. 국소 적용 후, 처치된 피부 및 아래 놓인 근육을 수집하고, 면역조직화학에 의한 SNAP25₁₉₇-양성 염색을 위해 가공하였고, 조직 영상을 도 7에 나타낸다. 테이프 스트리핑 및 BoNT/A 국소 적용 후, 모든 표재성 근육은 운동 신경 말단 및 축삭에서 가벼운 SNAP25₁₉₇-양성 염색을 나타내었다. NMJ의 총 샘플링 중 SNAP25₁₉₇-표지된 NMJ의 백분율은 ~20 %로 추정되었다. 위에 놓인 피부 표면으로의 테이프 스트리핑을 겪지 않은 어느 근육에서도 면역조직화학적 신호가 관찰되지 않았다. 이들 결과는 온화한 테이프 스트리핑이 진피 및 표재성 근육 층으로의 BoNT/A의 전달을 용이하게 하기에 충분하다는 것을 입증한다.

도 1-7의 데이터는 진피 및/또는 표재성 근육으로의 생물학적 작용제의 전달이 각질층을 파괴하도록 피부를 처치하거나 컨디셔닝하고 제제를 생물학적 작용제와 함께 적용함으로써 달성됨을 입증한다. 인간 피부에 대한 모델로서, 인간 사체 피부 및 무모 래트 상의 피부를 사용하여 데이터를 생성하였다. 무모 래트 피부는 전형적인 래트 피부보다 더 큰 피부 두께를 갖는다. 무모 래트에서, 다리 피부 표면부터 피부밑근육층까지는 약 1.2 mm이다. 인간에서, 인간 얼굴 피부 표면으로부터 피부 지방까지의 거리는 약 2-3 mm이다. 양성 DAS 반응의 본 연구에서의 관찰은 장벽 파괴가 무모 래트 다리 피부를 통해 TA 근육으로 ~1.2 mm 초과의 거리(이 영역에서의 래트 피부의 두께)에서 독소 전달을 용이하게 한다는 것을 입증한다. 따라서, 장벽 파괴는 피부 표면으로부터 2-3 mm인 인간 안면 근육으로의 독소 전달을 용이하게 할 수 있다. 보툴리눔 신경독소는 조직에서 확산하거나 퍼진다. 확산 및 퍼짐의 정도는 용량 및 부피를 비롯한 여러 인자에 기초한다. 본원의 데이터에 기초하여, 생물학적 작용제, 예컨대 BoNT/A는 표피로부터 아래 놓인 근육으로 아래로 0.5 cm 확산할 수 있다.

상기 언급된 것과 같이, 및 도 1-7의 데이터에 기초하여, 피부 영역을 컨디셔닝 또는 처치하고, 생물학적 작용제를 포함하는 제제를 처치 또는 컨디셔닝된 피부 영역에 국소 적용함으로써 진피 또는 표재성 근육으로 생물학적 작용제를 전달하는 방법이 고려된다. 한 측면에서, 피부 상태, 예컨대 잔주름 및/또는 주름을 처치하기 위한 방법이 고려된다. 잔주름 및/또는 주름은 측면 안각 주름(눈가의 주름), 미간 주름(눈썹 사이의 수직선), 이마 주름, 광경근 주름(목 주름), 비구순 주름("스마일 주름" 또는 "웃음 주름") 또는 입술 주위 주름(입 및 입술 주위)일 수 있다. 실시예 8은 인간 대상체가 노화로 인한 잔주름을 개선시키도록 처치되는 예를 제공한다.

다른 측면에서, 본원에 기재된 방법은 피부 품질을 개선시키기 위해 고려된다. 인간 피부의 상태 또는 품질은, 예를 들어 습도, UV-광, 화장품, 노화, 질환, 스트레스, 흡연 및 식습관을 포함한 다양한 인자에 의해 연속적으로 영향을 받으며, 이들 각각은 다양한 피부 변화를 초래할 수 있다. 노화의 특징인 변화가 피부 상에 나타나며, 이들 중 다수는 피부 구조의 변화에 의해 반영된다. 피부 노화의 일부 임상 징후는 잔주름 및 깊은 주름의 출현을 포함하고, 이들 각각은 연령에 따라 증가할 수 있다. 주름은 피부의 연대적 노화 및 일광에 대한 피부의 노출로 인한 피부의 광노화 둘 다에 의해 유발될 수 있다. 본원에서 고려되는 피부 품질을 개선시키는 방법은 천연 노화 또는 상기 언급된 다양한 인자와 연관된 피부 변화를 역전시키거나, 그의 진행을 늦추거나, 또는 예방하는 것을 포함한다. 예를 들어, 피부 품질의 개선은 일광 손상 또는 광노화와 연관된 피부 변화 - 즉, 일광 또는 다른 형태의 화학 방사선(예를 들어, 예컨대 UV 방사선 및 태닝 부스)에 대한 노출과 연관된 피부 변화의 역전, 진행의 늦춤, 또는 예방을 포함한다. 또 다른 예로서, 피부 품질을 개선시키는 것은 또한 방사선, 공기 오염, 바람, 추위, 습윤, 열, 화학물질, 연기, 담배 흡연, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 외인성 인자로 인한 피부 변화를 역전시키거나, 그의 진행을 늦추거나, 또는 예방하는 것을 포함할 수 있다. 피부 품질의 개선은 또한, 예를 들어 특정 피부 상태(예를 들어, 여드름), 감염(즉, 리슈마니아증), 또는 부상(예를 들어, 찰과상, 천공, 열상, 또는 수술 상처)으로부터 초래될 수 있는 흉터의 역전, 예방 또는 감소를 포함할 수 있다. 피부 품질의 개선은 상기 논의된 피부 변화 중 하나 이상을 저감, 감소 및/또는 최소화하는 것을 포함한다. 피부 품질의 개선은 보다 젊은 외관을 갖는 피부를 초래할 수 있다. 피부 품질의 개선은 보다 매끄럽고 수화된(즉, 덜 건조한), 심지어 색소 또는 덜 비늘 모양의 외관을 갖는 피부를 초래할 수 있다.

본원에 기재된 방법과 관련하여, 피부 품질의 개선, 국부 피부 상태의 처치, 또는 생물학적 작용제의 전달을 위해, 처치에 고려되는 피부는 안면 피부, 목, 손, 팔, 다리 또는 몸통 상의 피부, 및 다른 신체 부위의 피부를 포함할 수 있다. 처치 또는 개선될 피부 상태는, 예를 들어 주름(인간 안면 주름을 포함하나, 이에 제한되지는 않음), 피부 주름의 깊어짐, 피부의 얇아짐, 흉터 감소, 피부의 황변, 모틀링(mottling), 과다색소침착, 색소침착 및/또는 비-색소침착 검버섯의 출현, 가죽화, 탄력 상실, 리코일능력(recoilability) 상실, 콜라겐 섬유의 상실, 탄성 섬유의 비정상적 변화, 진피의 소혈관의 악화, 거미 정맥의 형성, 및 그의 조합을 포함한다.

다른 실시양태에서, 피부 품질을 개선시키는 방법은 피부 늘어짐, 지성 피부, 피지, 또는 확장된 모공 크기 중 하나 이상을 개선시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 피부의 과다색소침착을 처치함으로써 피부 품질을 개선시키는 것이다.

실시예 9-11은 피부 품질을 개선시키기 위해 본원에서 고려되는 방법을 사용하여 인간 대상체를 처치하는 예를 기재한다. 실시예 9에서, 인간 여성을 히알루론산 마이크로스피큘 스크럽의 마이크로박피술로 처치하고, 처치된 피부 영역에 대한 보툴리눔 독소의 국소 적용으로, 주름을 최소화하고 피부 늘어짐을 개선시키는 것을 비롯한 피부 품질을 개선시킨다. 실시예 10에서, 남성 인간을 피부 롤러로 처치하고, BoNT/A의 액체 제제로, 유분, 피지 및 모공 크기를 감소시킴으로써 피부 품질을 개선시켰다. 실시예 11에서, 남성 인간을 히알루론산 마이크로스피큘 스크럽의 마이크로박피술로 처치하고, 처치된 피부 영역에 대한 보툴리눔 독소의 국소 적용으로, 유분, 피지 및 모공 크기를 감소시킴으로써 피부 품질을 개선시킨다.

기재된 실시예로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 본원의 방법은 피부 영역에 대한 화학적 또는 기계적 처치 또는 화학적 및 기계적 처치의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 처치는 히알루론산을 포함하는 제제를 포함하며, 여기서 히알루론산의 일부는 결정질 형태 또는 마이크로스피큘 형태이다. 또 다른 실시양태에서, 처치는 마이크로니들링 장치, 예컨대 피부 롤러이다. 한 실시양태에서, 마이크로니들링 장치는 각질층과 접촉하는 평평한 블레이드-형상 모서리를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로니들 장치는 각질층과 접촉하는 끝으로 갈수록 가늘어지는 형태의 샤프트를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는다. 한 실시양태에서, 피부 영역은 마이크로니들링 장치의 단일 통과로 처치된다. 또 다른 실시양태에서, 피부 영역은 마이크로니들링 장치의 1 회 초과의 통과로 처치된다.

또 다른 실시양태에서, 처치는 테이프 스트리핑이다. 한 실시양태에서, 테이프 스트리핑은 테이프의 스트립을 적어도 2 회 적용하고 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 테이프 스트리핑은 테이프의 스트립을 2-20 회 또는 3-12 회 적용하고 제거하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 화학적 및/또는 기계적 처치는 순차적으로 또는 동시에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 화학적 및/또는 기계적 처치, 및 생물학적 작용제를 사용한 제제의 적용은 순차적으로 또는 동시에 수행된다.

본원에 기재된 방법을 위해 고려되는 생물학적 작용제는 10 kDa, 25 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 125 kDa, 150 kDa, 175 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 600 kDa, 700 kDa, 800 kDa, 900 kDa, 1,000 kDa, 1,500 kDa, 1,600 kDa, 2,000 kDa, 2,200 kDa, 2,500 kDa 또는 3,000 kDa 초과의 분자량을 가질 수 있다. 본원에 기재된 방법을 위해 고려되는 생물학적 작용제는 10 kDa, 25 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 125 kDa, 150 kDa, 175 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 500 kDa 초과 및 약 3,000 kDa, 2,500 kDa, 2,200 kDa, 2,000 kDa, 1,600 kDa, 1,500 kDa 또는 1,000 kDa 미만의 분자량을 가질 수 있다.

한 실시양태에서, 생물학적 작용제는 클로스트리디움 유도체, 예컨대 보툴리눔 신경독소(BoNT), 예컨대, 예를 들어, BoNT/A, BoNT/B 등이다. 이들 독소는 신경전달물질과 같은 신경분비 물질의 방출을 차단함으로써 신경계에 작용한다. BoNT의 작용은 세포 표면 상의 수용체 분자에 대한 그의 결합에 의해 개시되고, 이어서 독소-수용체 복합체는 세포내이입을 겪는다. 일단 세포 내부에 있으면, BoNT는 SNARE 단백질(가용성 N-에틸말레이미드-감수성 인자 부착 단백질 수용체)로 공지된 세포로부터의 신경전달물질 도킹 및 방출을 담당하는 세포외적 특이적 단백질을 절단한다. 그로 인한 일시적인 화학탈신경은 신경근 접합부에서의 운동 신경전달을 차단하기 위해 의학적으로 사용되어 다양한 치료 용도를 유도하였다.

일부 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 천연, 재조합 클로스트리디움 독소, 재조합 변형된 독소, 그의 단편, TEM, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 보툴리눔 독소이다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 유형 A, 유형 B, 유형 C₁, 유형 D, 유형 E, 유형 F, 유형 G, H, X, 또는 모자이크 보툴리눔 독소 및/또는 그의 하위유형, 하이브리드, 키메라, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 보툴리눔 신경독소는 재조합적으로 제조된 보툴리눔 신경독소, 예컨대 이. 콜라이에 의해 생산된 보툴리눔 독소일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 TEM이다.

일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소는 천연 독소와 비교하여 그의 아미노산 중 적어도 하나가 결실, 변형 또는 교체된 보툴리눔 신경독소인 변형된 신경독소일 수 있거나, 또는 변형된 보툴리눔 신경독소는 재조합 생산 보툴리눔 신경독소 또는 그의 유도체 또는 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 독소는 관심 뉴런 또는 비-뉴런 세포에 대해 변경된 세포 표적화 능력을 가진다. 이러한 변경된 능력은 보툴리눔 독소의 천연 발생 표적화 도메인을, 비-보툴리눔 독소 표적 세포에 존재하는 비-보툴리눔 독소 수용체에 대한 선택적 결합 활성을 보이는 표적화 도메인으로 치환시킴으로써 달성된다. 상기와 같은 표적화 도메인에 대한 변형은 비-보툴리눔 독소 표적 세포(재-표적화됨) 상에 존재하는 비-보툴리눔 독소 수용체(표적 수용체)에 선택적으로 결합할 수 있는 변형된 독소를 초래한다. 비-보툴리눔 독소 표적 세포에 대한 표적화 활성을 갖는 변형된 보툴리눔 독소는 비-보툴리눔 독소 표적 세포 상에 존재하는 수용체에 결합하고, 세포질 내로 전위되고, 표적 세포의 SNARE 복합체에 대해 그의 단백질분해 효과를 발휘할 수 있다. 본질적으로, 효소 도메인을 포함하는 보툴리눔 독소 경쇄는 적절한 표적화 도메인을 선택함으로써 임의의 원하는 세포로 세포내 전달된다.

본 방법에 따라 사용하기 위한 클로스트리디움 유도체, 예컨대, 보툴리눔 독소는 진공 압력 하에 용기 내에서 동결건조, 진공 건조된 형태로 또는 안정한 액체로서 보관될 수 있다. 동결건조 이전에, 보툴리눔 독소는 제약상 허용되는 부형제, 안정제 및/또는 담체, 예컨대, 예를 들어, 알부민 등과 조합될 수 있다. 허용되는 부형제 또는 안정제는 단백질 부형제, 예컨대, 알부민 또는 젤라틴 등, 또는 폴록사머, 당류, 폴리에틸렌 글리콜 등을 비롯한, 비-단백질 부형제를 포함한다. 알부민을 함유하는 실시양태에서, 알부민은 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 재조합 알부민 등일 수 있다. 동결건조된 물질은 환자에게 투여되기 위한 보툴리눔 독소를 함유하는 용액 또는 조성물을 생성하기 위해, 적합한 액체, 예컨대, 예를 들어, 염수, 물 등으로 재구성될 수 있다.

일부 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 클로스트리디움 유도체를 캡슐화하는 중합체 매트릭스를 포함하는 조절 방출 시스템으로 제공되며, 여기서 일정 분량의 클로스트리디움 유도체는 조절되는 방식으로 장기간에 걸쳐 중합체 매트릭스로부터 방출된다. 조절 방출 신경독소 시스템은 예를 들어 미국 특허 번호 6,585,993; 6,585,993; 6,306,423 및 6,312,708에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

대안적 실시양태에서, 클로스트리디움 유도체는 국소 투여에 적합한 연고, 겔, 크림 또는 에멀젼으로 제공된다.

본 방법에 따라 투여되는 클로스트리디움 유도체, 예를 들어 보툴리눔 독소의 치료 유효량은 독소의 효능, 및 그의 중증도를 비롯한, 치료되는 통증의 특징적인 특징, 및 크기, 체중, 연령, 및 요법에 대한 반응성을 비롯한 다른 다양한 환자 변수에 따라 달라질 수 있다. 독소의 효능은 마우스에 대한 LD₅₀ 값의 배수로서 표현되며, 독소의 1 단위(U)는 각각 체중이 약 20 g인 18 내지 20 마리 암컷 스위스-웹스터(Swiss-Webster) 마우스 군의 50 %를 죽이는 독소의 등가량인 것으로서 정의된다.

보툴리눔 독소의 치료 유효량은 특정 보툴리눔 독소의 효능에 따라 달라질 수 있는데, 이는 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 제제들이 등가의 효능 단위를 갖지 않기 때문이다. 앨러간, 인크.(Allergan, Inc.)로부터 입수가능한, 보툴리눔 독소 유형 A인, 1 단위의 보톡스(BOTOX)^®(오나보툴리눔A)는 입센 파마슈티칼스(Ipsen Pharmaceuticals)로부터 입수가능한, 또한 보툴리눔 독소 유형 A인, 대략 3 내지 5 단위의 디스포트(DYSPORT)^®(아보보툴리눔톡신A)와 동등한 효능 단위를 갖는다고 보고되었다. 엘란(Elan)으로부터 입수가능한 보툴리눔 독소 유형 B인 미오블록(Myobloc)^®은 보톡스^®에 비해 훨씬 더 낮은 효능 단위를 갖는 것으로 보고되었다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소는 복합체화 단백질이 없는 순수 독소, 예컨대 제오민(XEOMIN)^®(인코보툴리눔톡신A)일 수 있다. 1 단위의 인코보툴리눔톡신A는 1 단위의 오나보툴리눔톡신A와 대략 동등한 효능을 갖는 것으로 보고되었다. 따라서, 투여되는 독소의 양 및 그의 투여 빈도는 처치를 담당하는 의사의 재량에 따를 것이고, 특정 독소 제제에 의해 생성되는 안전성 및 효과의 문제에 상응할 것이다.

인간 치료 용도에 사용되는 투여량은 다양할 수 있다. 전형적으로, 환자에게 투여되는 클로스트리디움 유도체의 용량은 약 0.01 단위 내지 약 1,000 단위 이하일 수 있다; 예를 들어, 처치당 환자당 약 500 단위 이하, 바람직하게는 약 80 단위 내지 약 460 단위의 범위 내이지만, 보다 적은 또는 보다 많은 용량이 적절한 상황에서 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 약 1-500 단위의 보툴리눔 독소 유형 A, 예컨대 보톡스^®를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 약 1-100 단위의 보톡스^®를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, 본 방법은 약 2-50 단위의 보톡스^®를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 안면 상의 표적 부위에 국소적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여량은 처치당 약 1 단위 내지 약 100 단위의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 처치당 투여량은 2 단위, 5 단위, 10 단위, 20 단위, 30 단위, 40 단위, 50 단위, 60 단위, 70 단위, 80 단위, 90 단위, 100 단위, 110 단위, 120 단위, 130 단위, 140 단위, 150 단위, 160 단위, 170 단위, 180 단위, 190 단위 또는 200 단위의 보툴리눔 독소 유형 A, 예컨대 오나보툴리눔톡신A이다. 대안적 실시양태에서, 본 방법은 약 3-500 단위의 아보보툴리눔A를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구체적 실시양태에서, 본 방법은 약 6-250 단위의 아보보툴리눔A를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 안면 상의 표적 부위에 국소적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여량은 처치당 약 3 단위 내지 약 250U의 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 약 1-100 단위의 인코보툴리눔톡신A를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구체적 실시양태에서, 본 방법은 약 2-50 단위의 인코보툴리눔톡신A를 포함하는 조성물을 표적 부위에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 안면 상의 표적 부위에 국소적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 투여량은 처치당 약 1 단위 내지 약 100 단위의 범위의 인코보툴리눔톡신A일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신경독소가 보툴리눔 독소 유형 B인 경우, 투여량은 보툴리눔 독소 유형 A의 기능적 등가 투여량보다 대략 50 배 더 많다.

실시예

하기 비제한적 실시예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 방법의 실시양태의 범주 내의 특정한 바람직한 방법을 제공하고, 그의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

150 kDa 생물학적 작용제의 피부 침투에 대한 히알루론산 스크럽 처치의 효과

동결된 인간 사체 피부 샘플을 실온(22-25 ℃)에서 완전히 해동시키고, 물로 잠시 헹구고, 하드 보드 상의 습윤 종이 타월 상에 편평하게 놓고, 2 개의 PBS 습윤 면-팁 면봉을 사용하여 세정하고, 면봉으로 건조시켰다. 히알루론산 스크럽(MITI 시스템즈, 대한민국)을 피부에 고르게 적용하고 (~30 mg/~2x2 ㎠), 2 방울의 미네랄 오일을 첨가하여 스크럽을 습윤시켰다. 오일 및 스크럽의 혼합물을 갖는 피부를 장갑을 낀 손가락을 사용하여 30 초 동안 적당한 압력으로 마사지한 후, 2 개의 습윤 면-팁 면봉을 사용하여 닦았다.

FITC-IgG(200 ㎍/0.5 mL 용액의 100 ㎕)를 적용하여 처치된 영역(~4 ㎠)을 덮고, 장갑을 낀 손가락을 사용하여 30 초 동안 적당한 압력으로 피부를 마사지하였다. 2 개의 습윤 면-팁 면봉을 사용하여 과량의 FITC-IgG를 제거하였다. 처치된 피부 조각을 절단하고 처치된 샘플로서 유리 슬라이드 상에 배치하였다. 동일한 절차를 약간의 변형을 갖는 2 개의 대조군 샘플에 대해 반복하였다. 히알루론산 스크럽 처치를 받지 않은 대조군 샘플의 경우, 히알루론산 스크럽이 없는 미네랄 오일을 사용하여 FITC-IgG 적용 전에 피부 샘플을 마사지하였다. FITC-IgG가 없는 대조군 샘플의 경우, 히알루론산 스크럽을 피부 상에 적용하고, 이어서 100 ㎕ 포스페이트 완충 염수(PBS)를 적용하였다. 형광이 검출될 수 없을 때까지 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 증가하는 조직 깊이에서 샘플을 스캐닝하였고, 영상을 촬영하였다. 결과가 도 1a-1c에 제시된다.

실시예 2

150 kDa 생물학적 작용제의 피부 침투에 대한 피부 롤러 처치의 효과

인간 사체 피부 샘플을 실온(22-25 ℃)에서 완전히 해동시키고, 물로 잠시 헹구고, 하드 보드 상의 습윤 종이 타월 상에 편평하게 놓았다. 공급자에 의해 제공된 가이드라인에 따라 정상 압력을 사용하여 마이크로니들링 장치 더마 롤러(Derma roller)^® MN(MT5 마이크로니들 피부 롤러, 0.5 mm)으로 피부를 미세천공하였다. 마이크로니들링 장치를 수직으로 4 회, 수평으로 4 회, 이어서 동일한 면적에 걸쳐 동일한 강도로 각 방향으로 4 회 대각선으로 부드럽게 롤링하였다. 미세천공된 피부 조각을 절단하고, 100 ㎕의 FITC-IgG 용액(200 ㎍/0.5 mL)을 미세천공된 영역(적어도 1 ㎠)을 덮도록 적용하였다. 피부를 습윤 종이 타월을 갖는 암실, 폐쇄 및 가습 챔버에서 60 분 동안 방해받지 않게 방치하고, 인큐베이션 기간의 완료 후 습윤 염수 킴와이프스(Kimwipes)™를 사용하여 과량의 염료를 제거하였다. 염색된 미세천공을 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하고, 더 이상 형광이 가시화될 수 없을 때까지 10 ㎛ 두께의 피부 층을 통해 스캐닝하였다. 샘플은 FITC-IgG를 갖는 비처치 피부 및 FITC-IgG를 갖는 미세천공된 피부를 포함하였다. 결과가 도 2a-2b에 제시된다.

실시예 3

기능성 보툴리눔 독소의 피부 침투에 대한 피부 롤러 처치의 효과

무모 래트의 전경골근(TA) 위에 놓인 피부를 0.25 mm, 0.50 mm 또는 1.0 mm의 니들 길이를 갖는 마이크로니들링 장치, DRS^® 더마 롤러로 미세천공하였다. 마이크로니들 장치로의 통과 횟수 또는 니들 장치가 관심 영역 상에 롤링되는 횟수는 1 회 또는 2 회(즉, 1 회 또는 2 회 통과, 도면에서 1X, 2X 등으로 표시됨)였다. 적절한 마이크로니들링 장치로 사전처치한 후, 적절한 희석제 중 26 ng/mL의 150 kDa BoNT/A 50 ㎕를 이어서 조직 내로 러빙/마사지와 함께 관심 피부 영역에 적가 적용하였다. 국소 적용 후, 제1 일-제4 일 및 제7 일에 DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 관찰하고 기록하였다. DAS 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하고 점수화하였다 (Broide, R.S. et al., Toxicon, 71:18-24 (2013)). 간략하게, 래트를 몸통 주위로 쥐고, 공기 중으로 들어올리고, 편평한 표면으로의 드롭 또는 복귀를 시뮬레이션함으로써 DAS 반응을 유도하였다. 래트는 그의 뒷발의 발가락을 펼침으로써 충격에 대해 반사적으로 대비하고, 동물이 리클라이닝(reclining) 자세를 마주한 상태에서 DAS 반응을 즉시 점수화하였다. 이어서, 다양한 정도의 발가락 외전을 5-점 척도로 점수화하였다(0= 정상 내지 4= 발가락 외전의 최대 감소). 래트에서의 피크 DAS 반응이 일반적으로 제3 일-제4 일에 관찰된다. TA 근육 위에 놓인 피부 내로의 BoNT/A(10 U/kg; 900 kDa)의 피내(ID) 주사를 양성 대조군으로서 사용하였다. ID 주사는 이전에 동일한 독소 용량의 IM 주사와 비교되었으며, 효능은 단지 약간만 감소되는 것으로 밝혀졌다 (각각~ ED70 대~ ED90) (도 3a). 결과가 도 3b에 제시된다.

단일 피부 롤러 처치 후 SNAP25₁₉₇-양성 신경근육 접합부(NMJ)의 정량적 분석 및 BoNT/A 국소 처치를 또한 수행하였다. TA 근육의 14 ㎛ 두께 단면을 1) 시냅스후 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)에 결합하는 형광-표지된 α-붕가로톡신(α-Bgt)을 사용한 총 NMJ의 존재 및 2) 재조합 모노클로날 항체를 사용한 시냅스전 운동 신경 말단(MNT) 및 운동 신경(MN) 축삭에서의 SNAP25₁₉₇의 존재에 대해 이중-표지하였다(Rheaume, C. et al., Toxins (Basel), 7 (7), 2354-2370, (2015)). TA 근육 전반에 걸친 총α-Bgt-표지된 NMJ의 대표적인 샘플링 중 SNAP25₁₉₇-양성 NMJ의 백분율을 계산하고, 기록하고, 도 3c에 제시하였다. 더마롤러 사전-처치가 없는 국소 적용은 관찰가능한 DAS 점수 또는 IHC 염색을 제공하지 않았다(데이터는 제시되지 않음).

실시예 4

피부 롤러로의 미세천공 후 피부에서의 기능성 보툴리눔 신경독소의 피부 침투에 대한 제제의 효과

BoNT/A의 기능적 경피 전달을 위한 판독물로서 래트 DAS 모델을 사용하여, 무모 래트를 마이크로니들링 장치로 사전처치하여 피부를 통해 150 kDa BoNT/A를 전달하였다. 각 래트의 피부 처치 부위를 마이크로니들링 장치, 0.50 mm 니들을 갖는 DRS^® 더마 롤러로 롤러를 TA 근육 상에 2 회 통과시킴으로써 프라이밍하였다. BoNT/A의 2 종의 상이한 제제에 대한 지시된 용량 및 각각의 제제에 대한 2 가지 상이한 용량을 처치된 피부 영역에 적용하였다. 각각의 시험 작용제를 TA 근육 위의 피부 상에 50 ㎕ 총 부피로 적가 적용함으로써 적용하였다. 국소 적용 후, 제1 일-제4 일 및 제7 일에 DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 플롯팅하였다. DAS 검정을 수행하고, 기재된 바와 같이 점수화하였다 (Broide, R.S. et al., Toxicon, 71:18-24 (2013)). 피크 DAS 점수는 BoNT/A의 적용 3-4 일 후에 관찰되었고, 조건당 n= 5 또는 6의 래트가 평가되었다. 결과는 도 4에 제시된다.

실시예 5

전달 효율에 대한 피부 롤러의 분석

2 개의 상이한 마이크로니들링 장치를 비교(head-to-head) 평가하여, 피부를 통해 BoNT/A를 전달하는 잠재적인 차이를 평가하였다. DRS50 더마 롤러 시스템 장치(0.5-mm 니들 길이, 540 개 니들; 중국) 및 MTS MR5 롤러(0.5-mm 니들 길이, 200 개 니들; 클리니컬 레졸루션 래보러토리즈, 인크.(Clinical Resolution Laboratories, Inc.))를, 피부 영역을 DRS50 더마롤러 시스템 롤러로 2 회 또는 MTS MR5 롤러로 2-5 회 롤링함으로써 비교하였다. DRS50 롤러가 2 배 초과의 니들의 수를 갖는다는 것을 고려하여, 실험 목적은 MR5 롤러로 대등한 투과를 달성하기 위해 증가된 수의 롤링 또는 통과가 필요할 것인지를 결정하는 것이었다. 니들의 형상은 또한 2 개의 롤러 유형 사이에서 상이함을 또한 주목하여야 한다. DRS50 롤러는 평평한 블레이드형 외관을 갖는 니들을 갖고, 한편 MR5 롤러는 보다 전형적인 원통형의 가늘어지는 바늘 형태를 갖는다. 결과가 도 5에 제시된다.

실시예 6

피부 롤러로의 미세천공 후 피부에서의 기능성 보툴리눔 신경독소 복합체(900 kDa)의 효율적인 전달

BoNT/A의 기능적 경피 전달을 위한 판독물로서 래트 DAS 모델을 사용하여, 무모 래트를 더마롤러로 사전처치하여 피부를 통해 150 kDa BoNT/A(n= 3) 또는 900 kDa BoNT/A 복합체(n= 6)를 전달하였다. TA 근육 위로 MTS MR5 롤러(0.5-mm 니들 길이; 클리니컬 레졸루션 래보러토리즈, 인크.)를 사용한 5 회 통과를 국소 시험 물품의 적용 전에 수행하였다. 150 kDa BoNT/A 및 900 kDa BoNT/A 복합체 둘 다를 동일한 방식으로 제제화하고, 피부 롤러로 피부를 컨디셔닝한 후 래트에게 각 용량으로 적용하였다. 150 kDa BoNT/A를 갖는 제제는 10 ng/mL의 농도를 가졌고, 50 ㎕로 적용하여 0.5 ng의 BoNT/A를 투여하였다. 900 kDa BoNT/A를 갖는 제제는 65 ng/mL의 농도를 가졌고, 50 ㎕로 적용하여 3.25 ng의 BoNT/A를 투여하였다. 질량 기준으로 적용된 용량 차이가 주목할 만하였지만, 몰 기준으로 용량은 유사하였다. 몰식으로, 약간 더 많은 900 kDa 복합체를 투여하였다. 각각의 시험 작용제를 TA 근육 위의 피부 상에 적가 적용하고 각각의 드롭 이후 문지름으로써 50 ㎕ 총 부피로 적용하였다. 국소 적용 후, 제1 일-제4 일 및 제7 일에 DAS 판독치를 취하고, 각각의 군에 대한 최대 평균 DAS 점수를 플롯팅하였다. DAS 검정을 상기 및 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행하고 점수화하였다 (Broide, R.S. et al., Toxicon, 71:18-24 (2013)). 결과는 도 6에 제시된다.

실시예 7

기능성 보툴리눔 신경독소의 피부 침투에 대한 테이프 스트리핑의 효과

각질층을 파괴하여 피부 표면으로부터 아래 놓인 근육으로의 기능적 BoNT/A의 전달을 용이하게 하도록 테이프 스트립으로의 무모 래트의 처치를 수행하였다. 래트를 수회 테이프 스트리핑한 반면, 대조군은 테이프 스트리핑을 받지 않았다. 테이프 스트리핑의 유무의 사전-처치 후, 50 ㎕의 7000 U/mL(총 350 U)의 150 kDa BoNT/A를 TA 근육 위의 피부 영역에 적가 적용하였다. 10 U/kg 150 kDa BoNT/A의 피내 주사를 양성 대조군으로서 사용하였다. 국소 적용 후, 처치된 TA 근육을 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 면역조직화학에 의한 SNAP25₁₉₇-양성 염색을 위해 가공하였다. 결과는 도 7에 제시된다.

실시예 8

잔주름 및 늘어짐을 개선시키기 위한 피부 롤러 장벽 파괴 및 국소 BoNT의 용도

포토타입 II 피부를 갖는 45 세 여성은 잔주름 및 늘어짐을 비롯한 광-노화된 얼굴 피부의 징후를 최소화하고자 한다. 그녀는 연관된 휴식 시간으로 인해, 그녀의 피부의 품질을 개선시키기 위한 아주 적은 레이저 처치도 거절한다. 대신, 그녀는 보툴리눔 신경독소 기반 제품(예를 들어 BoNT/A)으로의 국소 처치를 요구한다. 처치 전에, 국소 마취제 크림(2.5 % 리도카인 및 2.5 % 프릴로카인)을 처치 30 분 전에 피부 상에 적용한 다음, 무균 물수건으로 완전히 제거한다.

이어서, 얼굴의 대략 20 cm² 면적(대략 5 cm 직경 원)을 0.5 mm 피부 롤러로 수직으로 1-10 회, 수평으로 1-10 회, 대각선으로 1-10 회, 및 반대 대각선으로 1-10 회 롤링함으로써 처치를 위한 프라이밍을 한다. 이어서, 액체 또는 액체 재구성된 BoNT/A 생성물 (20 cm²당 200 ㎕)을 프라이밍된 영역에 즉시 적가 적용하고 각각의 드롭 이후 마사지한다. 제공자는 최종 적가 적용 15 분 후에 얼굴을 부드럽게 세정한다.

기준일 및 처치 후 12 주에 평가를 수행한다. 기준일과 비교하여, 처치 후 12 주에, 그녀의 얼굴 피부는 보다 높은 의사의 전반적 평가 및 대상체 만족도 점수를 나타내며, 거침, 수화, 피부 탄성, 및 표피-통과 수분 손실(TEWL)의 유의한 개선이 있다.

실시예 9

잔주름 및 늘어짐을 개선시키기 위한 연마제 스크럽으로의 장벽 파괴 및 국소 적용

포토타입 II 피부를 갖는 45 세 여성은 잔주름 및 늘어짐을 비롯한 광-노화된 얼굴 피부의 징후를 최소화하고자 한다. 그녀는 연관된 휴식 시간으로 인해, 그녀의 피부의 품질을 개선시키기 위한 아주 적은 레이저 처치도 거절한다. 대신, 그녀는 보툴리눔 신경독소 기반 제품(예를 들어 BoNT/A)으로의 국소 처치를 요구한다. 처치 전에, 피부를 무균 물수건으로 세정한다.

얼굴의 대략 20 cm² 면적(대략 5 cm 직경 원)을 히알루론산 마이크로스피큘 (HA 미세결정질) 스크럽으로 마이크로박피에 의해 프라이밍한다. 100 mg의 HA 스크럽을 처치할 영역에 적용하고 장갑을 낀 손가락으로 30 초 동안 마사지한다. 임의의 나머지 스크럽을 멸균수로 습윤화된 면 면봉으로 제거한다. 이어서, 액체 BoNT/A 또는 재구성된 BoNT/A 생성물(20 cm²당 200 ㎕)을 프라이밍된 영역에 즉시 국소적으로 적가 적용하고 각각의 드롭 이후 마사지한다. 제공자는 최종 적가 적용 15분 후에 얼굴을 부드럽게 세정한다.

실시예 10

유분, 피지 및 모공 크기를 감소시키기 위한 마이크로피부 롤러에 의한 장벽 파괴에 이은 국소 BoNT/A의 용도

포토타입 III 피부를 갖는 35 세 남성은 지성 이마(지루)를 갖고, BoNT/A로의 국소 처치를 받는다.

처치 전에, 국소 마취제 크림(2.5 % 리도카인 및 2.5 % 프릴로카인)을 처치 30 분 전에 피부 상에 적용한 다음, 무균 물수건으로 완전히 제거한다. 이어서, 얼굴의 대략 20 cm² 면적(대략 5 cm 직경 원)을 0.5 mm 피부 롤러로 수직으로 1-10 회, 수평으로 1-10 회, 대각선으로 1-10 회, 및 반대 대각선으로 1-10 회 롤링함으로써 처치를 위한 프라이밍을 한다. 이어서, 액체 또는 액체 재구성된 BoNT/A 생성물(20 cm²당 200 ㎕)을 프라이밍된 영역에 즉시 적가 적용하고 각각의 드롭 이후 마사지한다. 제공자는 최종 적가 적용 15분 후에 얼굴을 부드럽게 세정한다.

기준일 및 처치 후 12 주에 평가를 수행하고, 피지의 양을 피지계를 사용하여 측정한다. 기준일과 비교하여, 처치 후 12 주에, 그의 이마는 보다 높은 의사의 전반적 평가를 나타내고, 환자는 그 결과로 그가 만족하였음을 보고하였고, 유분, 피지 및 모공 크기의 유의한 감소가 있었다. 피지 감소의 백분율(%)을 피지계에 의해 측정한다.

실시예 11

유분, 피지 및 모공 크기를 감소시키기 위한, 히알루론산 마이크로스피큘 스크럽으로의 장벽 파괴에 이은 국소 BoNT/A의 용도

처치 전에, 피부를 무균 물수건으로 세정한다. 이어서, 얼굴의 대략 20 cm² 면적(대략 5 cm 직경 원)을 히알루론산 마이크로-스피큘 (HA 미세결정질) 스크럽으로 마이크로박피에 의해 프라이밍한다. 100 mg의 스크럽을 처치할 영역에 적용하고 장갑을 낀 손가락으로 30 초 동안 마사지한다. 임의의 나머지 스크럽을 멸균수로 습윤화된 면 면봉으로 제거한다. 이어서, 액체 BoNT/A 또는 재구성된 BoNT/A 생성물 (20 cm²당 200 ㎕)을 프라이밍된 영역에 즉시 국소적으로 적가 적용하고 각각의 드롭 이후 마사지한다. 제공자는 최종 적가 적용 15 분 후에 얼굴을 부드럽게 세정한다.

본 개시내용의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 많은 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 기재된 실시양태는 단지 예시의 목적으로만 제시되고, 실시양태는 하기 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안됨을 이해하여야 한다. 따라서, 하기 청구범위는 문자 그대로 제시된 요소뿐만 아니라 실질적으로 동일한 결과를 얻기 위해 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하기 위한 모든 동등한 요소의 조합도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 상기 기재된 것들, 개념상 등가인 것들, 및 본 개시내용의 사상을 포함하는 것들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계; 및
생물학적 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함하며,
상기 처치가 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달을 달성하는 것인 생물학적 작용제의 전달 방법.
제1항에 있어서, 처치가 화학적 또는 기계적 처치를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 처치가 히알루론산을 포함하는 제제이며, 여기서 히알루론산의 일부는 결정질 형태인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 처치가 피부 롤러인 방법.
제4항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 평평한 블레이드-형상 모서리를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 끝으로 갈수록 가늘어지는 형태의 샤프트를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 단일 통과로 처치되는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 1 회 초과의 통과로 처치되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 처치가 테이프 스트리핑인 방법.
제9항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 적어도 2 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 2-20 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 3-12 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 처치 및 적용하는 단계가 동시에 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 작용제가 클로스트리디움 유도체인 방법.
제14항에 있어서, 클로스트리디움 유도체가 보툴리눔 독소인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 작용제가 약 40,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 것인 방법.
피부 영역의 각질층을 파괴하여 처치된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 처치하는 단계; 및
생물학적 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 처치된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함하며,
상기 처치가 생물학적 작용제의 국소 또는 경피 전달을 달성하는 것인 국부 영역에서의 상태를 생물학적 작용제로 처치하는 방법.
제17항에 있어서, 상태가 잔주름 또는 주름인 방법.
제18항에 있어서, 잔주름 또는 주름이 측면 안각 주름, 미간 주름, 이마 주름, 광경근 주름, 비구순 주름, 입술 주위 주름 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 상태가 피부 늘어짐인 방법.
제17항에 있어서, 상태가 지성 피부, 피지, 확장된 모공 크기, 또는 과다색소침착인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 처치가 화학적 또는 기계적 처치를 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 처치가 히알루론산을 포함하는 제제이며, 여기서 히알루론산의 일부는 결정질 형태인 방법.
제22항에 있어서, 처치가 피부 롤러인 방법.
제25항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 평평한 블레이드-형상 모서리를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제25항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 끝으로 갈수록 가늘어지는 형태의 샤프트를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 단일 통과로 처치되는 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 1 회 초과의 통과로 처치되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 처치가 테이프 스트리핑인 방법.
제29항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 적어도 2 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 2-20 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 3-12 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제17항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 처치 및 적용하는 단계가 동시에 수행되는 것인 방법.
제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 작용제가 클로스트리디움 유도체인 방법.
제14항에 있어서, 클로스트리디움 유도체가 보툴리눔 독소인 방법.
제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 작용제가 약 40,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 것인 방법.
피부 영역의 각질층을 파괴하여 컨디셔닝된 피부 영역을 규정하도록 피부 영역을 컨디셔닝하는 단계; 및
클로스트리디움 유도체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제제를 컨디셔닝된 피부 영역에 적용하는 단계를 포함하며,
상기 컨디셔닝 및 적용이 클로스트리디움 유도체의 진피 전달 및/또는 표재성 근육 전달을 달성하는 것인 피부 품질을 개선시키는 방법.
제37항에 있어서, 클로스트리디움 유도체가 보툴리눔 독소인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 클로스트리디움 유도체가 약 500,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 것인 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 컨디셔닝이 화학적 또는 기계적 처치를 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 처치가 히알루론산을 포함하는 제제이며, 여기서 히알루론산의 일부는 결정질 형태인 방법.
제40항에 있어서, 처치가 피부 롤러인 방법.
제42항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 평평한 블레이드-형상 모서리를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제42항에 있어서, 피부 롤러가 각질층과 접촉하는 끝으로 갈수록 가늘어지는 형태의 샤프트를 갖는 다수의 미세돌출부를 갖는 것인 방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 단일 통과로 컨디셔닝되는 것인 방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 영역이 피부 롤러의 1 회 초과의 통과로 컨디셔닝되는 것인 방법.
제40항에 있어서, 처치가 테이프 스트리핑인 방법.
제47항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 적어도 2 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 2-20 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 테이프 스트리핑이 테이프의 스트립을 3-12 회 적용하고 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 컨디셔닝 및 적용하는 단계가 동시에 수행되는 것인 방법.