KR20200011499A - 멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 치료를 위한 보툴리눔 신경독소 - Google Patents

멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 치료를 위한 보툴리눔 신경독소 Download PDF

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비르지트 피.에스. 재키
시자즈 지. 말릭
조앤 왕
이 리우
에이미 브리도-안데르센
랜스 이. 스튜어드
리잉 큐. 레
에드워드 씨. 시아
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Abstract

피부의 과다멜라닌 관련 질병, 예컨대, 과다색소침착을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 BoNT/DC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

Description

멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 치료를 위한 보툴리눔 신경독소
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 31일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 62/512,792의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본원에 기술된 주제는 클로스트리듐 독소, 예컨대, 보툴리눔 신경독소, 및 특히, 보툴리눔 신경독소 BoNT/DC 모자이크를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 피부의 멜라닌 관련 질병, 특히, 과다멜라닌 관련 질병, 예컨대, 과다색소침착을 치료하는 방법에 관한 것이다.
멜라닌세포는, 멜라닌 색소를 제조하고, 그를 또 다른 유형의 피부 세포인 주변 각질세포로 분포시키는, 피부에 존재하는 분화된 세포이다. 피부색, 모발 색상 및 눈의 홍채색은 주로 멜라닌의 존재 또는 부재에 의해 결정된다. 멜라닌 생산을 비롯한, 멜라닌세포 대사 (즉, 모발 색상 및 피부색)는 적어도 부분적으로는, 호르몬 및 UV 노출에 대한 반응으로 주로 각질세포에 의해 방출되는 다양한 물질에 의해 조절된다.
멜라닌 관련 질병으로도 지칭되는 피부 및 모발 색소 장애로는 기미, 피부 손상 후 색소 손실, 백반증, 주근깨, 검은 점 (지방종성 검은 점(lipomasmole) (반) 및 비정형 검은 점 (이형성 반) 포함), 피부섬유종, 유피낭종, 켈로이드, 각질극 세포종, 화농성 육아종, 지루성 각화증, 광선 각화증, 연성 섬유종, 흑색종 및 일광 흑색점을 포함한다.
특정 단백질, 예컨대, SNAP (가용성 NSF 부착 단백질) 수용체 (SNARE) 단백질 (신탁신(Syntaxin)-3 (Stx-3), 시냅토솜-연관 단백질 23 (SNAP-23), 및 소포체 연관 막 단백질 (VAMP, 시냅토브레빈으로도 또한 명명) 포함)은 멜라닌세포에서 멜라닌 함량에 영향을 줄 수 있다 (Yatsu et al., J Invest Dermatol, 133(9), 2237-2246, 2013). 소포체 연관 막 단백질, 예컨대, VAMP-2의 절단, 결합, 및/또는 격리가 멜라닌세포 세포내 소포체의 이동을 파괴시킬 수 있고, 멜라노솜 (분화된 색소 함유 소포체)에서의 멜라닌생성 (색소 형성) 및/또는 소포체, 예를 들어, 멜라닌 함유 멜라노솜의 방출 또는 전달을 파괴시킬 수 있다. VAMP-2는 멜라닌세포에서 발현되고, 아마도 멜라노솜 및 SNAP-23과 연관되어 있을 수 있다 ([Scott and Zhao, J Invest Dermatol, 116(2), 296-304, 2001]; [Van Den Bossche et al., Traffic, 7(7), 769-778 2006]; [Wade et al., J. Biol. Chem., 276(23), 19820-19827, 2001]).
검은 반점의 반(patch)을 포함하며 비정상적으로 균일하지 않은 피부색을 띠는 것인 과다색소침착은, 보편적으로는 "노화에 따른 반점" 또는 "검버섯"으로도 알려져 있는 기미 및 일광 흑색점을 비롯한 여러 피부 장애와 연관이 있다. 과다색소침착 치료는 (1) 국부 미백제, 예컨대, 4% 히드로퀴논 (HQ), 트리-루마(Tri-Luma) (히드로퀴논, 트레티노인 및 플루오시놀론의 조합), 레티노이드 (예컨대, 트레니노이드, 아다팔렌 및 트라자로텐) 처방; (2) 색소를 제거 또는 파괴하는 의료 시술, 예컨대, 화학적 박피술, 레이저 요법; 및 (3) 일반 의약품 약물 및 화장품, 예컨대, 2% HQ 및 각종 허브 추출물을 포함한다. 현행 과다색소침착 치료는 피부 자극 및 염증을 비롯한 여러 부작용을 갖고 있으며, 염증은 염증 후 과다색소침착을 유도할 수 있으며, 추가의 과다색소침착의 동인이 된다.
멜라닌 관련 질병, 및 더욱 특히, 과다멜라닌 관련 질병 치료를 위한 작용제 및 방법이 요구되고 있다. 본 조성물 및 방법은 이러한 요구를 충족시키기 위한 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 보툴리눔 신경독소 (BoNT) 모자이크, 예컨대, BoNT/DC 모자이크를 제공 또는 투여하는 단계를 포함하는, 멜라닌 관련 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 멜라닌 관련 질병은 멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 또는 질환이다. 한 실시양태에서, 멜라닌세포 과다활성는 과다색소침착 및/또는 비정상적인 색소침착을 일으킨다. 다른 실시양태에서, 질병은 예를 들어, 기미, 일광 흑색점 (일광 흑자), 반, 또는 흑색종이다.
일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소 모자이크를 포함하는 액체 또는 고체 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소 모자이크는 BoNT/DC 모자이크이다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 조성물이고, 주사를 통해 투여된다. 실시양태에서, 주사는 근육내, 피내, 진피내 또는 피하 주사이다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 액체 조성물 또는 고체 조성물이고, 경피적으로 또는 국부적으로 투여된다.
한 측면에서, 보툴리눔 신경독소 (BoNT)를 제공 또는 투여하는 단계를 포함하는, VAMP-2를 절단하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소는 BoNT 모자이크이다. 한 실시양태에서, BoNT는 BoNT/DC 모자이크이다.
도 1a는 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC, 또는 결합 도메인 부분이 없는 BoNT/D의 변이체인 LHn/D 처리 이후의 마우스 멜라닌세포 세포 중 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH; 상단 밴드, 로딩 대조군) 및 소포체 연관 막 단백질 (VAMP-2, 하단 밴드)의 웨스턴 블롯을 보여주는 것이고;
도 1b는 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군), BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/DC, 또는 결합 도메인 부분이 없는 BoNT/D의 변이체인 LHn/D 처리 이후의 마우스 멜라닌세포 세포에서의, GAPDH의 양으로 정규화되고, 도 1a에 제시된 웨스턴 블롯 밴드 강도에 기초하여 비처리 대조군 대비의 상대적인 비율(%)로 제시된 VAMP-2의 양을 보여주는 그래프이고;
도 2a는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/DC 처리 이후의 마우스 멜라닌세포 세포 중 멜라닌 수준 (5 x 105개의 세포당 ㎍/mL로 표시)을 보여주는 막대 그래프이고;
도 2b는 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군), BoNT/A, BoNT/D, 또는 BoNT/DC 처리 이후의 마우스 멜라닌세포 세포 중 멜라닌 함량 (106개의 세포당 ㎍/mL로 표시)을 보여주는 막대 그래프이고;
도 3은 2% 코지산을 이용한 국부 처리 (양성 대조군), 또는 5 nM 및 10 nM의 BoNT/DC, 5 nM 및 10 nM의 LHn/D, 또는 BoNT/A (10 nM)를 이용한 처리 이후 14일째 인간 피부 등가 모델에서의 멜라닌 함량 (조직 샘플당 ㎍으로 표시)을 보여주는 막대 그래프이고;
도 4는 격일로 적용된 0.3% 코지산의 국부 처리 (양성 대조군, 가로 스트라이프로 필링된 막대), 또는 0일째 천연 BoNT/DC (파선으로 필링된 막대) 또는 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군, 오픈 막대)로 진피내 주사를 맞은 후 6일째의 인간 피부 외식편으로서, 여기서, 샘플은 UV에 노출되지 않았거나, 또는 UV에 노출되었던 것인 인간 피부 외식편의, 마손 폰타나(Masson's Fontana) 염색을 사용한 조직학적 방법에 기초하여 멜라닌에 대해 양성으로 염색된 기저층 중 멜라닌 양 (기저층 면적에 대한 상대적 비율(%)로서 측정)을 보여주는 막대 그래프이다.
I. 정의
본원에서 사용된 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미하는 것으로, 이는 부분적으로는 값이 측정 또는 결정된 방법 (즉, 측정 시스템의 한계)에 의존하게 될 것이다. 예를 들어, "약"이란, 관련 기술분야에서의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에서 특정 값이 기술되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약"이라는 용어는 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미한다.
"투여" 또는 "투여하는"이라는 것은 대상체에게 제약 조성물을 제공하는 (즉, 투여하는) 단계, 또는 대안적으로, 대상체가 제약 조성물을 받는 단계를 의미한다. 본원에 개시된 제약 조성물은 다양한 방법으로 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 근육내, 진피내, 피하 투여, 경막내 투여, 복강내 투여, 국부 (경피적), 주입, 및 이식 (예를 들어, 저속 방출용 장치, 예컨대, 중합체 임플란트 또는 미니삼투 펌프의 것) 모두 적절한 투여 경로일 수 있다.
"경감시키는"이란, 병태 또는 장애의 증상 발생 감소를 의미한다. 따라서, 경감시키는이라는 것은 일부 감소, 유의적인 감소, 거의 전체에 가까운 감소, 및 전체 감소를 포함한다.
"보툴리눔 독소" 및 "보툴리눔 신경독소" (BoNT)는 상호교환적으로 사용된다. 이는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생산된 신경독소 뿐만 아니라, 비-클로스트리듐 종에 의해 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소 (또는 그의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본원에서 사용된 "보툴리눔 독소"라는 어구는 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F, G 및 X (Stenmark, 비공개된 데이터), 및 그의 서브타입 및 그의 임의의 다른 유형의 서브타입, 및 DC, CD ([Moriishi et al. 1996], [Webb et al., 2007], [Nakamura et al. 2010], [Peng et al. 2012], [Rossetto et al. 2014], [Berntsson et al. 2013]) 및 FA (또한 H로도 공지, 문헌 [Yao et al. 2017])를 비롯한, 모자이크, 또는 각 경우에서, 상기 중 임의의 것의 임의의 재조작된 단백질, 유사체, 유도체, 동족체, 부분, 하위 부분, 변이체, 또는 버전을 포함한다. 본원에서 사용된 "보툴리눔 독소"는 또한 "변형된 보툴리눔 독소"도 포함한다. 추가로, 본원에서 사용되는 "보툴리눔 독소"는 또한 보툴리눔 독소 복합체 (예를 들어, 300, 550 (BoNT/DC, 문헌 [Moura et al. 2011]), 600 및 900 kDa 복합체 뿐만 아니라, 복합체 단백질과 비연관되어 있는 보툴리눔 독소 (150 kDa)의 신경독성 성분도 포함한다. 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F, G 및 모자이크, 예컨대, DC는 각각 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 및 BoNT/DC로 언급될 수 있다.
"클로스트리듐 독소"란, 클로스트리듐 독소가 세포를 중독시키게 하는 세포 기전으로서, 클로스트리듐 독소의 저 또는 고친화성 클로스트리듐 독소 수용체에의 결합, 독소/수용체 복합체의 내재화, 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위, 및 클로스트리듐 독소 기질의 효소적 변형을 포함하는 것인 전반적인 세포 기전을 수행할 수 있는 클로스트리듐 독소 균주에 의해 생산된 임의의 독소를 지칭한다. 클로스트리듐 독소의 비제한적인 예로는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/DC 모자이크, 테타누스(Tetanus) 독소 (TeNT), 바라티이(Baratii) 독소 (BaNT), 및 부티리쿰(Butyricum) 독소 (BuNT)와 같은 보툴리눔 독소를 포함한다. 신경독소가 아닌, BoNT/C2 세포독소 및 BoNT/C3 세포독소는 "클로스트리듐 독소"라는 용어로부터 배제된다. 본원에 개시된 클로스트리듐 독소는 제한 없이, 자연적으로 발생된 클로스트리듐 독소 변이체, 예컨대, 예로서, 클로스트리듐 독소 이소폼 및 클로스트리듐 독소 서브타입; 비-자연적으로 발생된 클로스트리듐 독소 변이체, 예컨대, 예로서, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 클로스트리듐 독소 키메라 변이체 및 그의 클로스트리듐 독소 단편, 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 본원에 개시된 클로스트리듐 독소는 또한 클로스트리듐 독소 복합체 뿐만 아니라, 복합체 단백질과 비연관되어 있는 클로스트리듐 독소의 신경독성 성분을 포함한다. 본원에서 사용된 "클로스트리듐 독소 복합체"라는 용어는 클로스트리듐 독소 및 비-독소 연관 단백질 (NAP)을 포함하는 복합체, 예컨대, 예로서, 보툴리눔 독소 복합체, 테타누스 독소 복합체, 바라티이 독소 복합체, 및 부티리쿰 독소 복합체를 지칭한다. 클로스트리듐 독소 복합체의 비제한적인 예로는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해 생산된 것, 예컨대, 예로서, 900 kDa BoNT/A 복합체, 500 kDa BoNT/A 복합체, 300 kDa BoNT/A 복합체, 500 kDa BoNT/B 복합체, 500 kDa BoNT/C1 복합체, 500 kDa BoNT/D 복합체, 300 kDa BoNT/D 복합체, 300 kDa BoNT/E 복합체, 300 kDa BoNT/F 복합체, 550 kDa BoNT/DC 복합체, 및 300 kDa BoNT/DC 복합체를 포함한다.
"클로스트리듐 독소 활성 성분"은 대상체 또는 환자에게로의 투여시, 또는 그 이후에 효과를 발휘하는 클로스트리듐 독소 중 임의의 부분을 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 "클로스트리듐 독소 활성 성분"이라는 용어는 대략 150 kDa 클로스트리듐 독소 및 총칭하여 비-독소 연관 단백질 (NAP)로 불리는 다른 단백질을 포함하는 클로스트리듐 독소 복합체, 대략 150 kDa 클로스트리듐 독소 단독, 또는 변형된 클로스트리듐 독소, 예컨대, 예로서, 재표적화된 클로스트리듐 독소를 포함한다.
생물학적 활성 성분에 적용되는 "유효량"이란, 일반적으로 대상체에서 원하는 변화를 일으키는 데 충분한, 성분의 양을 의미한다. 예를 들어, 원하는 효과가 멜라닌 관련 장애와 연관된 증상의 감소인 경우, 성분의 유효량은 유의적인 독성을 초래하지 않으면서, 증상을 적어도 실질적으로 감소시키는 양이다.
클로스트리듐 독소 조성물에 첨가되는 부형제, 또는 부형제들의 특정 조합을 참조로 하여 사용될 때, "유효량"은 원하는 안정성 및/또는 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 활성 성분의 조성물을 달성하는 데 필요한 각 부형제의 양을 지칭한다. 본 실시양태의 다른 측면에서, 치료 유효 농도의 클로스트리듐 독소 활성 성분은 자양물과 연관된 증상, 예컨대, 예를 들어, 멜라닌 관련 질병을 예컨대, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90% 또는 최대 100%만큼 감소시킨다.
"중쇄" 또는 "HC"란, 보툴리눔 신경독소의 중쇄를 의미한다. 그의 분자량은 약 100 kDa이고, 이는 또한 H 쇄로도 지칭될 수 있다.
HC는 대략적으로 중쇄의 카르복실 단부 세그먼트에 등가인, 보툴리눔 신경독소의 중쇄로부터 유래된 단편 (약 50 kDa), 또는 무손상 중쇄 중 상기 단편에 상응하는 일부분을 의미한다. 고친화성, 표적 세포, 예컨대, 예를 들어, 멜라닌세포에의 시냅스전 결합에 관여하는 천연, 또는 야생형 보툴리눔 신경독소의 일부분을 함유하는 것으로 간주된다.
HN은 대략적으로 중쇄의 아미노 단부 세그먼트에 등가인, 보툴리눔 신경독소의 중쇄로부터 유래된 단편 (약 50 kDa), 또는 무손상 중쇄 중 상기 단편에 상응하는 일부분을 의미한다. 경쇄의 세포내 엔도솜 막을 통과한 전위에 관여하는 천연, 또는 야생형 보툴리눔 신경독소의 일부분을 함유하는 것으로 간주된다.
"경쇄" 또는 "LC"란, 클로스트리듐 신경독소의 경쇄를 의미한다. 그의 분자량은 약 50 kDa이고, 이는 또한 L 쇄, L로서, 또는 보툴리눔 신경독소의 단백질분해 도메인 (아미노산 서열)으로서 지칭될 수 있다.
LC-HN/LHN이란, 경쇄 및 전위 도메인으로 구성된 BoNT (약 100 kDa)의 단편을 의미한다. 유사하게, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 모자이크 DC의 LC-HN은 각각 LC-HN/A, LC-HN/B, LC-HN/C, LC-HN/D, LC-HN/E, LC-HN/F, LC-HN/G, 및 LC-HN/DC를 지칭할 수 있다.
LHN 또는 L-HN은 HN 도메인에 커플링된, L 쇄, 또는 그의 기능성 단편을 포함하는, 클로스트리듐 신경독소로부터 유래된 단편을 의미한다. 이는 HC 도메인을 제거 또는 변형시키기 위해, 단백질분해에 의해 무손상 클로스트리듐 신경독소로부터 수득될 수 있다. 유사하게, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, 모자이크 DC의 LHN은 각각 LHN /A, LHN /B, LHN /C, LHN /D, LHN /E, LHN /F, LHN /G, 및 LHN /DC로 지칭될 수 있다.
"국소 투여"는 예컨대, 예를 들어, 근육내 또는 피내 또는 피하 주사, 또는 국부 투여를 통해 제약의 생물학적 효과가 요구되는 부위인, 동물의 신체 상의 또는 그 내부의 부위에 또는 그 주변부에 제약을 직접 투여하는 것을 의미한다. 국소 투여는 예컨대, 정맥내 또는 경구 투여와 같은 전신 경로의 투여를 배제한다. 국부 투여는 제약 작용제가 환자의 피부에 적용되는 국소 투여의 한 유형이다.
"변형된 보툴리눔 독소"란, 그의 아미노산 중 적어도 하나가 천연 보툴리눔 독소와 비교하여, 결실, 변형, 또는 치환되어 있는 것인 보툴리눔 독소를 의미한다. 변형된 보툴리눔 독소는 재조합적으로 제조된 신경독소, 또는 재조합적으로 제조된 신경독소의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형된 보툴리눔 독소는 천연 보툴리눔 독소의 적어도 하나의 생물학적 활성, 예컨대, 보툴리눔 독소 수용체에 결합할 수 있는 능력, 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제시킬 수 있는 능력을 유지한다. 변형된 보툴리눔 독소의 한 예로는 한 보툴리눔 독소 혈청형 (예컨대, 혈청형 A)으로부터의 경쇄를 갖고, 다른 보툴리눔 독소 혈청형 (예컨대, 혈청형 B)으로부터의 중쇄를 갖는 보툴리눔 독소가 있다. 변형된 보툴리눔 독소의 또 다른 예로는 신경전달물질, 예컨대, 물질 P에 커플링된 보툴리눔 독소가 있다.
"돌연변이"란, 자연적으로 발생된 단백질 또는 핵산 서열의 구조적 변형을 의미한다. 예를 들어, 핵산 돌연변이의 경우, 돌연변이는 DNA 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 단백질 서열 돌연변이의 경우, 돌연변이는 단백질 서열 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환일 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산을 포함하는 단백질 서열은 또 다른 아미노산, 예를 들어, 아미노산 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 리신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신 또는 임의의 다른 자연적으로 또는 비-자연적으로 발생된 아미노산 또는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 대신으로 치환될 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는, 전사되고, 생성된 mRNA가 번역되었을 때, 돌연변이화된 단백질 서열을 생성하는 DNA 서열에 대한 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질 서열에 대한 돌연변이는 또한 원하는 단백질 서열에 대한 원하는 돌연변이를 함유하는 펩티드를 서열을 융합시킴으로써 생성될 수 있다.
"환자"란, 의료, 미용 또는 수의학적 관리를 받는 인간 또는 비-인간 대상체를 의미한다. 따라서, 본원에 개시된 조성물은 임의의 동물, 예컨대, 예를 들어, 포유동물 등을 치료하는 데 사용될 수 있다.
"제약 조성물"이란, 활성 제약 성분, 예컨대, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 활성 성분, 예컨대, 보툴리눔 독소, 및 적어도 하나의 추가 성분, 예컨대, 예를 들어, 안정제 또는 부형제 등을 포함하는 조성물을 의미한다. 그러므로, 제약 조성물은 대상체, 예컨대, 인간 환자에게 진단적, 치료적, 또는 미용적으로 투여하는 데 적합한 제제이다. 제약 조성물은 예를 들어, 동결건조 또는 진공 건조된 상태, 동결건조 또는 진공 건조된 제약 조성물의 재구성 후에 형성된 용액, 또는 재구성이 필요없는 용액 또는 고체로서의 제약 조성물일 수 있다.
"약리적으로 허용되는 부형제"는 "약리적 부형제" 또는 "부형제"와의 동의어로서, 포유동물에게 투여되었을 때, 실질적으로 장기간의 또는 영구적인 유해한 영향을 주지 않는 임의의 부형제를 지칭하며, 화합물, 예컨대, 예로서, 안정화제, 벌크화제, 동결보호제, 동결건조보호제, 첨가제, 비히클, 담체, 희석제 또는 보조제를 포함한다. 부형제는 일반적으로 활성 성분과 혼합되거나, 또는 활성 성분을 희석 또는 봉입할 수 있도록 허용되고, 고체, 반고체, 또는 액체 작용딜 수 있다. 클로스트리듐 독소 활성 성분을 포함하는 제약 조성물은 활성 성분의 제약상 허용되는 조성물로의 프로세싱을 촉진시키는 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다는 것 또한 구상된다. 임의의 약리적으로 허용되는 부형제는 그가 클로스트리듐 독소 활성 성분과 비화합성을 띠지 않는 한, 제약상 허용되는 조성물에 그를 사용하는 것도 고려된다. 약리적으로 허용되는 부형제의 비제한적인 예는 예컨대, 문헌 [Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999)]; [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000)]; [Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001)]; 및 [Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)] (상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
제약 조성물의 구성 성분은 단일 조성물 (즉, 임의로 요구되는 재구성용 유체를 제외한, 모든 구성 성분이 제약 조성물을 화합하는 초기 시점에 존재하는 것인 조성물)에, 또는 예를 들면, 예를 들어 제약 조성물을 화합하는 초기 시점에는 존재하지 않은 성분을 함유할 수 있는, 재구성 비히클로 재구성되는 진공 건조된 조성물과 같은 2성분 시스템으로서 포함될 수 있다. 2성분 시스템은 장기간의 저장 보관 동안 2성분 시스템의 제1 성분과 충분한 화합성을 띠지 않는 성분을 도입할 수 있다는 이점을 비롯한 수개의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 재구성 비히클은 사용 기간 동안, 예를 들어, 1주일의 냉장 보관 동안 미생물의 성장으로부터 충분히 보호하지만, 보존제가 독소를 분해할 수도 있는 2년의 냉동고 보관 기간 동안에는 존재하지 않는 보존제를 포함할 수 있다. 장기간 동안 보툴리눔 독소, 또는 다른 성분과 화합성을 띠지 않을 수 있는 다른 성분이 이러한 방식으로 도입될 수 있고; 즉, 대략 사용 시점에 제2 비히클에 (예컨대, 재구성 비히클에) 첨가될 수 있다. 제약 조성물은 또한 보존제, 예컨대, 벤질 알콜, 베조산, 페놀, 파라벤 및 소르브산을 포함할 수 있다. 제약 조성물은 예를 들어, 부형제, 예컨대, 계면활성제; 분산화제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 활택제; 보존제; 생리적으로 분해가능한 조성물, 예컨대, 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 오일성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤화제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 항산화제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체 또는 소수성 물질 및 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 다른 성분을 포함할 수 있다.
"장성 작용제"란, 등장성을 제공하기 위해 제제에 포함되는 저분자량 부형제를 의미한다. 이당류, 예컨대, 트레할로스 또는 수크로스, 폴리알콜, 예컨대, 소르비톨 또는 만닛톨, 단당류, 예컨대, 글루코스, 및 염, 예컨대, 염화나트륨이 장성 작용제로서의 역할을 할 수 있다.
"다당류"란, 2개 초과의 당류 분자 단량체로 이루어진 중합체를 의미한다. 단량체는 동일하거나, 또는 상이할 수 있다.
"안정화제," "안정화 작용제" 또는 "안정제"란, 비안정화된 조성물과 비교하여 제약 조성물의 효력이 증가되도록 클로스트리듐 독소 활성 성분을 안정화시키는 작용을 하는 물질을 의미한다.
"안정제"는 부형제를 포함할 수 있고, 단백질 및 비-단백질 분자를 포함할 수 있다.
"치료 제제"란, 장애 또는 질환, 예컨대, 예를 들어, 멜라닌 관련 질병과 연관된 장애 또는 질환을 치료하고, 그를 통해 경감시키는 데 사용될 수 있는 제제를 의미한다.
"국부 투여"는 전신 투여를 배제시킨다. 다시 말해, 및 종래의 경피적 치료 방법과 달리, 보툴리눔 독소의 국부 투여를 통해서는 상당량의 신경독소가 환자의 순환계를 통과하지 않게 된다.
"치료하는"이란, 병태 또는 장애의 적어도 하나의 증상, 예컨대, 예를 들어, 과량의 멜라닌을 일시적으로 또는 영구적으로 경감시킨다는 것 (또는 그를 제거한다는 것)을 의미한다.
"VAMP"란, 시냅토브레빈 또는 소포체 연관 막 단백질을 의미하며, 이는 VAMP-1, VAMP-2, 및 VAMP-3을 포함한다.
"변이체"란, 표적 세포에 의해 인식되고, 표적 세포에 의해 내재화되고, 표적 세포에서 SNARE (가용성 NSF 부착 단백질 수용체) 단백질을 촉매적으로 절단하는, 야생형 보툴리눔 독소와 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 치환, 변형, 부가 또는 결실에 의해 변형된 클로스트리듐 신경독소, 예컨대, 야생형 보툴리눔 독소 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, 또는 모자이크 DC를 의미한다. 변이체 신경독소 성분의 예로는 하나 이상의 아미노산이 치환, 변형, 결실 및/또는 부가된 보툴리눔 독소의 변이체 경쇄를 포함할 수 있다. 상기 변이체 경쇄는 예를 들어, 신경전달물질 소포체의 방출과 같은, 엑소시토시스를 방해하는 데 있어 동일하거나, 또는 더욱 우수한 능력을 가질 수 있다. 추가로, 변이체의 생물학적 효과는 모체 화학적 엔티티와 비교하여 감소될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열이 제거된 보툴리눔 독소 A형의 변이체 경쇄는 모체 (또는 천연) 보툴리눔 독소 A형 경쇄의 것과 비교하여 더 짧은 생물학적 지속성을 가질 수 있다.
II. 치료 방법
한 측면에서, 환자에서 멜라닌 관련 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 환자에게 멜라닌 함량을 감소시키는 데 효과적인 용량 또는 양으로 클로스트리듐 독소, 예컨대, 보툴리눔 신경독소 (BoNT)룰 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 신경독소는 BoNT 모자이크, BoNT/DC이다. 다른 관련된 측면에서, BoNT를 포함하는 조성물을 투여함으로써 과다멜라닌 질병, 예컨대, 과다색소침착을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 실시양태에서, 조성물은 BoNT 모자이크, BoNT/DC를 포함한다.
실시예 1에서 상세하게 설명되는 제1 연구에서, 마우스 멜라닌세포 세포를 동일한 양의 천연 BoNT/A, 천연 BoNT/B, 재조합 BoNT/D, 천연 BoNT/DC, 또는 재조합 LHn/D - 결합 도메인 부분이 없는 BoNT/D의 변이체로 처리하였다. 독소로 처리한 후, 웨스턴 블롯에 의해 VAMP-2 및 GAPDH를 검출하였고, 멜라닌 함량을 측정하였다. 본 결과는 도 1a-1b에 제시되어 있다.
도 1a는 비처리군 (음성 대조군) 또는 독소 처리된 마우스 멜라닌세포 세포 중 GAPDH (상단 밴드, 로딩 대조군) 및 VAMP-2 (하단 밴드) 단백질의 웨스턴 블롯을 보여주는 것이다. 도 1b는 GAPDH의 양으로 정규화되고, (도 1a에 제시된 웨스턴 블롯 밴드 강도에 기초하여) 비처리 대조군 대비의 상대적인 비율(%)로 제시된 VAMP-2의 양을 보여주는 막대 그래프이다. BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D 또는 LHn/D가 아닌, BoNT/DC로 멜라닌세포 세포를 처리하였을 때, 그 결과로 VAMP-2가 >90% 감소되었다. 따라서, 한 측면에서, 대상체에게 일정량의 BoNT/DC를 투여함으로써 피부의 멜라닌세포 세포 중의 VAMP-2를 절단하는 방법이 고려된다. 피부의 멜라닌세포 중의 무손상 VAMP-2의 감소는 멜라닌 함량을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 대상체에게 일정량의 BoNT/DC를 투여함으로써 피부 중 또는 세포 중의 VAMP-2 수준을 감소시키고, 이로써, 피부 및/또는 멜라닌세포 중의 멜라닌 함량을 감소시키는, 피부의 멜라닌세포 세포 중의 멜라닌 함량을 감소시키는 방법이 고려된다.
또한 실시예 1에서 상세하게 설명된 연구에서, 마우스 멜라닌세포 세포를 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/DC로 처리하였다. 20시간 처리 후, 멜라닌 함량을 측정하였고, 그 결과는 도 2a에 제시되어 있다. 도 2b에 제시된 결과의 경우, 마우스 멜라닌세포 세포를 완충제 (음성 대조군), BoNT/A, BoNT/D 또는 BoNT/DC로 처리하였다. 24시간 처리 후, 세포 중 멜라닌 함량을 측정하였다. 도 2b의 막대 그래프는 완충제, BoNT/A, BoNT/D, 또는 BoNT/DC로 처리한 이후의 마우스 멜라닌세포 세포 중의 멜라닌 수준 (106개의 세포당 ㎍/mL로 표시)을 보여주는 것이다. 도 2a 및 2b의 데이터는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/D가 아닌 BoNT/DC로 멜라닌세포 세포를 처리하는 것이 멜라닌 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 또 다른 BoNT 혈청형, 예컨대, BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/D로 처리한 것과 비교하여, 또는 비처리 멜라닌세포와 비교하여, BoNT/DC로 처리하였을 때, 멜라닌 함량은 적어도 약 50% 감소되었다. 따라서, 비처리 멜라닌세포와 비교하여, 또는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/D로 처리된 멜라닌세포와 비교하여, 멜라닌세포 중 멜라닌 함량을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70% 감소시키는 양으로 BoNT/DC를 투여하는 것인, 멜라닌 관련 질병을 치료하는 방법을 고려한다.
실시예 2에서 설명되는 또 다른 연구에서, 다층의, 고도로 분화된 인간 표피 모델을 형성하기 위해 배양된, 정상적인, 인간-유래의 표피 각질세포 및 멜라닌세포에 기초한 인간 피부 조직 모델을 수득하였다. 조직 샘플을 1, 4, 8 및 12일째에 2개 농도 (5 nM 또는 10 nM)의 천연 BoNT/DC 또는 LHn/D로, 또는 10 nM의 천연 BoNT/A로 처리하고, 5, 8, 11 및 15일째에 멜라닌 함량에 대해 평가하였다. 대조군으로서, 평행으로 일부 조직 샘플을 국부 적용된 물 (비처리군 또는 음성 대조군)로, 또는 2% 코지산 (양성 대조군)으로 시험하였다. 15일째에 측정된 모델 조직 중의 멜라닌 함량을 나타내는 대표 데이터가 도 3에 제시되어 있다. BoNT/A가 아닌, BoNT/DC로 처리하였을 때, 멜라닌 수준이 상당히 감소되었다. 데이터는, 같은 농도의 BoNT/A 처리와 비교하면, 10 nM BoNT/DC로 처리하였을 때, 멜라닌 함량이 약 40% 감소되었다는 것을 나타낸다. 본 연구에서, MTT 검정법 (매트테크 코포레이션(MatTek Corp.), MTT-100)을 이용하여 처리 후 모델 조직내 세포의 생존율을 측정함으로써 BoNT/DC 처리가 세포 생존율에는 영향을 주지 않음을 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음).
또 다른 연구는 실시예 3에 기술되어 있다. 본 연구에서, 인간 피부 샘플을 10일 동안 매일 UV에 노출시키면서, 또는 그를 수행하지 않고 유지시켰다. BoNT/DC를 0일째에 진피내 주사하고, 코지산을 격일로 국부적으로 적용시켰다. 본 연구 6일째에 이식편을 조직학적 방법에 의해 평가하여 일반 형태 (마손 트리크롬) 및 멜라닌 함량 (마손 폰타나)을 평가하였다. 조직학적 방법에 기초하면 모든 용량의 BoNT/DC (2.5-10 nM)는 우수한 내성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 도 4는 마손 폰타나 염색을 사용한 조직학적 방법에 기초하여 멜라닌에 대해 양성으로 염색된, 기저층 면적에 대한 상대적 비율(%)로서 측정된, 본 연구 6일째의 조직 이식편 중 멜라닌 함량을 보여주는 것이다. 비처리 조직 이식편 (음성 대조군, 오픈 막대)과 비교하였을 때, 천연 BoNT/DC (파선으로 필링된 막대)로 처리되고, UV에 노출된 조직 이식편에서는 멜라닌 함량이 50% 감소되었다. 비처리 조직 이식편 (음성 대조군, 오픈 막대)과 비교하였을 때, 천연 BoNT/DC (파선으로 필링된 막대)로 처리되고, UV에 노출되지 않은 조직 이식편에서는 멜라닌 함량이 30% 감소되었다. 관찰되는 바와 같이, 10 nM BoNT/DC의 미백 효과는 0.3% 코지산 (양성 대조군, 가로 스트라이프로 필링된 막대)의 미백 효과와 유사하다.
상기 연구들에 기초하여, 멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 및/또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 그를 필요로 하는 환자에게, (i) 멜라닌세포에 의해 흡수되고, (ii) VAMP를 절단하거나, 그에 결합하거나, 또는 그를 격리시키는, 치료 유효량의 BoNT 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, VAMP는 VAMP-2이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 BoNT/DC 모자이크 독소이다.
"BoNT/DC" 및 "BoNT/DC 모자이크"는 BoNT/D의 경쇄 및 전위 도메인에 상동성인 경쇄, 및 BoNT/C의 결합 도메인에 상동성인 결합 도메인을 포함하는 천연 또는 재조합 독소를 의미한다.
BoNT/DC를 생산하는 균주의 예로는 예를 들어, BoNT/DC VPI 5995 (수탁: EF378947); BoNT/DC D 4947 (수탁: AB037920); BoNT/DC 사우쓰 아프리카(South Africa) (수탁: D38442); BoNT/DC 사우쓰 아프리카 (수탁: BAA07477); BoNT/DC OFD04, OFD05, OFD08, OFD09, OFD12, OFD13, OFD16, 및 OFD17 (수탁: AB461914, AB461915, AB461916, AB461917, AB461918, AB461919, AB461920, 및 AB461921); BoNT/DC It1 (세드릭 우드스트라(Cedric Woudstra) (ANSES, 프랑스(France)) (수탁: CM003329 JENO01000000); BoNT/DC DC5 (수탁: NZ_JDRY01000170)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 독소 모자이크는 비-클로스트리듐 공급원으로부터 생산된다. 비-클로스트리듐 독소 모자이크의 예로는 예를 들어, 웨이셀라 오리자에(Weissella oryzae) SG25T를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 멜라닌 관련 질병을 치료하기 위해 그를 필요로 하는 환자에게, VAMP-2를 절단하고, 이로써, 세포 중 멜라닌 함량을 저하 또는 감소시키는, 치료 유효량의 BoNT/DC 모자이크를 투여하는 단계를 포함한다.
예는 바람직한 BoNT를 예시하지만, 본 방법은 다른 BoNT, 예컨대, 다른 모자이크 BoNT, 또는 천연 독소와 비교하여 그의 아미노산 중 적어도 하나가 결실, 변형, 또는 치환된 것인 변형된 신경독소의 사용으로도 달성될 수 있다는 것, 또는 변형된 보툴리눔 신경독소는 재조합적으로 제조된 보툴리눔 신경독소 또는 그의 유도체 또는 단편일 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 특정 실시양태에서, 변형된 독소는 관심 뉴런 또는 비-뉴런 세포에 대해 변경된 세포 표적화 능력을 가진다. 이러한 변경된 능력은 보툴리눔 독소의 자연적으로 발생된 표적화 도메인을, 비-보툴리눔 독소 표적 세포에 존재하는 비-보툴리눔 독소 수용체에 대한 선택적 결합 활성을 보이는 표적화 도메인으로 치환시킴으로써 달성된다. 상기와 같은 표적화 도메인에 대한 변형을 통해 (재-표적화된) 비-보툴리눔 독소 표적 세포 상에 존재하는 비-보툴리눔 독소 수용체 (표적 수용체)에 선택적으로 결합할 수 있는 변형된 독소가 생성된다. 비-보툴리눔 독소 표적 세포에 대한 표적화 활성을 갖는 변형된 보툴리눔 독소는 비-보툴리눔 독소 표적 세포 상에 존재하는 수용체에 결합할 수 있고, 세포질 내로 전위될 수 있고, 표적 세포에 대해 그의 단백질분해 효과를 발휘할 수 있다. 본질적으로, 효소 도메인을 포함하는 보툴리눔 독소 경쇄는 적절한 표적화 도메인을 선택함으로써 세포내로 임의의 원하는 세포로 전달된다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용하기 위한 클로스트리듐 독소, 예컨대, 보툴리눔 독소는 진공 압력하에 용기 중에서 동결건조, 진공 건조된 형태로, 또는 안정적인 액제로서 보관될 수 있다. 동결건조 이전에, 보툴리눔 독소는 제약상 허용되는 부형제, 안정제 및/또는 담체, 예컨대, 예를 들어, 알부민 등과 조합될 수 있다. 허용되는 부형제 또는 안정제로는 단백질 부형제, 예컨대, 알부민 또는 젤라틴 등, 또는 폴록사머, 당류, 폴리에틸렌 글리콜 등을 비롯한, 비-단백질 부형제를 포함한다. 알부민을 함유하는 실시양태에서, 알부민은 예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 재조합 인간 알부민 등일 수 있다. 동결건조된 물질은 환자에게 투여되는 보툴리눔 독소 함유 용액 또는 조성물을 생성하기 위해 적합한 액체, 예컨대, 예를 들어, 염수, 물 등으로 재구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 클로스트리듐 유도체는 클로스트리듐 유도체를 캡슐화하는 중합체 매트릭스를 포함하는 방출 조절형 시스템으로 제공되며, 여기서, 분할된 양의 클로스트리듐 유도체가 장기간에 걸쳐 조절된 방식으로 중합체 매트릭스로부터 방출된다. 방출 조절형 신경독소 시스템은 예를 들어, 미국 특허 6,585,993; 6,585,993; 6,306,423 및 6,312,708 (상기 특허들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.
표적 조직으로의 국소 투여를 위핸 선택된 클로스트리듐 독소의 양은 예컨대, 치료되는 멜라닌 관련 질병의 중증도, 선택된 신경독소 독소의 가용성 특징 뿐만 아니라, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강과 같은 기준에 기초하여 달라질 수 있다. 예를 들어, 피부 부위의 영향을 받은 정도는 주사된 신경독소의 부피에 비례하는 것으로 간주되지만, 멜라닌 관련 질병 억제제 효과의 양은 대부분의 용량 범위에 대해 투여된 클로스트리듐 독소의 농도에 비례하는 것으로 간주된다. 적절한 투여 경로 및 투여량을 결정하는 방법은 일반적으로 각 사례별로 주치의에 의해 결정된다. 그러한 결정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 통상적인 것이다 (예를 들어, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), edited by Anthony Fauci et al., 14th edition, published by McGraw Hill] 참조).
일부 실시양태에서, 치료 유효량은 환자의 멜라닌 함량을 감소시키는 데 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 1 pg (0.001 ng) 내지 약 100 ㎍이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 0.01 ng 내지 약 10 ㎍이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 0.1 ng 내지 약 1 ㎍ (1000 ng)이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 1 ng 내지 약 500 ng이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 10 ng 내지 약 100 ng이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 0.1 ng 내지 약 10 ng이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량 범위는 약 0.01 ng 내지 약 0.1 ng이다.
일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소 모자이크 BoNT/DC는 신경독성 성분 및 비-독소 연관 단백질 (NAP)을 포함하는 독소 복합체로서 투여된다. 일부 실시양태에서, BoNT/DC 모자이크는 550 kD 복합체 또는 300 kD 복합체로서 투여된다. 대안적 실시양태에서, BoNT/DC는 신경독성 성분으로서 투여된다.
치료 유효량의 클로스트리듐 독소, 예컨대, BoNT 모자이크를 비롯한, 보툴리눔 독소는 예를 들어, 주사, 예컨대, 근육내, 피내, 진피내, 피하 주사 등, 정맥내, 경피적, 및 국부 주입에 의해 투여된다. 추가로, 예를 들어, 투여 경로는 마이크로니들 또는 프락셔널 레이저를 사용하는 진피 주사일 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여 방법을 통해 신경독소를 선택된 표적 조직으로 국소적으로 투여할 수 있다. 투여 방법은 상기 기술된 바와 같이, 신경독소를 함유하는 용액 또는 조성물을 주사하는 것을 포함하고, 신경독소를 표적 조직에 조절된 방식으로 방출하는 방출 조절형 시스템의 이식을 포함한다. 상기 방출 조절형 시스템은 반복 주사의 필요성을 감소시킨다. 조직내 보툴리눔 독소의 생물학적 활성의 확산은 용량과 함수 관계에 있는 것으로 보이며, 점진적으로 진행될 수 있다. 문헌 [Jankovic J., et al., Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994), page 150]. 예를 들어, 신경독소는, 신경독소가 멜라닌 관련 질병의 발생에 관여하는 것으로 간주되는 진피 세포에 주로 영향을 줄 수 있도록 투여될 수 있다.
본 발명에 따른, 표적 조직으로의 주사 또는 국부 적용에 의한, 보툴리눔 독소의 국소 투여는 멜라닌 관련 질병을 경감시키기 위해 환자에게 제약을 전신 투여하는 것에 대한 우수한 대안을 제공한다.
멜라닌세포 과다활성 및/또는 과량의 멜라닌과 연관된 장애 및/또는 질환으로는 예를 들어, 과다멜라닌생성, 기미와 연관된 과다색소침착, 일광 흑자 (노화에 따른 반점), 피부 상의 반, 및 흑색종을 포함한다.
일부 실시양태에서, VAMP를 절단하는 방법을 포함한다. 본 방법은 독소를 VAMP와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 독소는 클로스트리듐 독소, 예컨대, 보툴리눔 독소, 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 독소는 보툴리눔 독소 모자이크, 그의 단편 또는 변이체이다. 대안적 실시양태에서, 독소는 비-클로스트리듐 독소 모자이크, 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/D, 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 BoNT/D 경쇄 (LC/D)를 VAMP와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/DC이다. 일부 실시양태에서, VAMP는 VAMP-2 또는 VAMP-3이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 BoNT/DC 또는 BoNT/D 경쇄 (LC/D)를 VAMP-2 또는 VAMP-3과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, VAMP-2를 절단하는 방법을 포함한다. 본 방법은 보툴리눔 독소, 그의 단편 또는 변이체를 VAMP-2와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소, 그의 단편 또는 변이체는 VAMP-2를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 실질적으로 완전히 (예컨대, 100%) 절단하는 양으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소, 그의 단편 또는 변이체는 BoNT/D, BoNT/D 경쇄 (LC/D), BoNT/B, 또는 BoNT/B 경쇄 (LC/B)를 포함한다. 상기 실시양태에서, VAMP는 재조합 VAMP이거나, 또는 용해된 멜라닌세포로부터 또는 생체내 멜라닌세포로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, VAMP-2를 절단하고, 멜라닌세포 중 멜라닌 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 멜라닌세포를 보툴리눔 독소, 그의 단편 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보툴리눔 독소는 BoNT/DC 모자이크이다. 일부 실시양태에서, BoNT/DC 모자이크는 멜라닌세포 세포 중 VAMP-2를 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 실질적으로 완전히 (예컨대, 100%) 절단하는 양으로 제공된다.
III. 실시예
본 개시내용의 범주를 제한하고자 하는 의도 없이, 예시적인 실시양태를 하기 실시예에 의해 기술한다.
실시예 1
BoNT/DC에 의한 멜라닌세포 처리가 멜라닌 함량을 감소시킨다.
정상적인 마우스 멜라닌세포 (멜란-a(Melan-a)) 세포를 전면생장률이 ~80%가 될 때까지, 6-웰 플레이트 중 성장 배지에서 성장시켰다. 세포를 무혈청 배지 중에서 10 nM의 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군), 천연 BoNT/A, 천연 BoNT/B, 재조합 BoNT/D, 천연 BoNT/DC 또는 재조합 LHn/D로 이중으로 처리하였다. 세포를 24시간 동안 독소로 처리한 후, 96시간 동안 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시켰다.
96시간 동안 인큐베이션시킨 후, 항-VAMP-2 및 항-GAPDH를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 VAMP-2 및 GADPH를 검출하였다. SOLVABLE™ (퍼킨엘머(PerkinElmer)) 멜라닌 검정법을 이용하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 결과는 도 1a-1b에 제시되어 있다.
유사한 연구에서, 정상적인 마우스 멜라닌세포 (멜란-a) 세포를 전면생장률이 ~65-75%가 될 때까지, 6-웰 플레이트 중 성장 배지에서 성장시키고, 무혈청 배지 중에서 20시간 동안 10 nM의 천연 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, 또는 BoNT/DC로 삼중으로 처리한 후, 추가의 96시간 동안 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시켰다. SOLVABLE™ (퍼킨엘머) 멜라닌 검정법을 이용하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 결과는 도 2a에 제시되어 있다.
유사한 연구에서, 정상적인 마우스 멜라닌세포 (멜란-a) 세포를 전면생장률이 ~80%가 될 때까지, 6-웰 플레이트 중 성장 배지에서 성장시키고, 무혈청 배지 중에서 24시간 동안 완충제 (비처리군 또는 음성 대조군), 10 nM의 천연 BoNT/A, 재조합 BoNT/D, 또는 천연 BoNT/DC로 삼중으로 처리한 후, 추가의 96시간 동안 무혈청 배지 중에서 인큐베이션시켰다. SOLVABLE™ (퍼킨엘머) 멜라닌 검정법을 이용하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 결과는 도 2b에 제시되어 있다.
실시예 2
BoNT/DC는 인간 피부 등가 모델에서 멜라닌 함량을 감소시킨다.
인간 피부 조직 모델, MELANODERM™ (매트테크 코포레이션)을 입수하였다. 상기 모델은 다층의, 고도로 분화된 인간 표피 모델을 형성하기 위해 배양된, 정상적인, 인간-유래의 표피 각질세포 및 멜라닌세포에 기초한 것이다. 상기 조직은 1:10의 비율로 멜라닌세포 및 각질세포를 포함하는 3차원 공동 배양물이다. 1, 4, 8 및 12일째에 배지 중 기저 전달에 의해 조직 샘플을 완충제 (비처리 대조군), 5 nM 또는 10 nM 의 천연 BoNT/DC, 천연 BoNT/A, 또는 LHN/D (음성 대조군으로서)로 이중으로 처리하고, 5, 8, 11 및 15일째에 멜라닌 함량에 대해 평가하였다. 대조군으로서, 평행으로 일부 조직 샘플을 국부 적용된 물 (비처리 대조군)로, 또는 2% 코지산 (양성 대조군)으로 시험하였다.
조직 샘플을 1, 4, 8 및 12일째에 처리하고, 5, 8, 11 및 15일째에 SOLVABLE™ (퍼킨엘머) 멜라닌 검정법을 이용하여 멜라닌 함량에 대해 평가하였다. MTT 검정법 (매트테크 코포레이션, MTT-100)을 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. MTT 검정법에 기초하면, BoNT/DC 처리가 세포 생존율에는 영향을 주지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 15일째에 평가된 멜라닌 함량은 도 3에 제시되어 있다.
실시예 3
BoNT/DC는 인간 이식편 피부에서 멜라닌 함량을 감소시킨다.
45세 백인 여성으로부터의 복부 성형술로부터 입수한 인간 피부 이식편을 10일 동안 매일 (0-8일째에) UV에 노출시키면서, 또는 그를 수행하지 않고 유지시켰다. BoNT/DC를 0일째에 진피내 주사하고 (50 ㎕), 코지산을 격일로 국부적으로 적용시켰다. 본 연구 6일째에 이식편을 조직학적 방법에 의해 평가하여 일반 형태 (마손 트리크롬) 및 멜라닌 함량 (마손 폰타나)을 평가하였다.
조직학적 방법에 기초하면 모든 용량의 BoNT/DC (2.5-10 nM)는 우수한 내성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 조직 이식편 중의 멜라닌의 비율(%)이 도 4에 제시되어 있으며, 여기서, 막대는 하기와 같은 처리에 상응한다: 천연 BoNT/DC 진피내 주사 후 6일째의 조직 이식편 (파선으로 필링된 막대), 양성 대조군으로서 코지산이 국부적으로 적용된 것 (가로 스트라이프로 필링된 막대) 및 비처리군 (대조군, 오픈 막대). 10 nM BoNT/DC의 미백 효과는 0.3% 코지산의 미백 효과와 유사하다.
실시예 4
BoNT/DC에 의한 일광 흑자 치료.
포토타입 II 피부를 가진 45세 여성은 그녀 얼굴 상에 다양한 크기의 과다색소침착된 균일하지 않은 갈색 변색, 검은 반점을 보였고, 이는 일광 흑자로 진단되었다. 상기 여성은 BoNT/DC 독소 제제를 이용한 표피내 치료를 받았다. 국부 마취용 크림을 30 min 동안 피부에 도포하고, 치료 전에 완전히 제거하였다.
진공 건조된 1.5 ㎍ BoNT/DC 독소 분제를 1 mL의 멸균 0.9% 염수 중에 용해시켜 10 nM 용액을 구성하고, 30-G 니들을 이용하여 상기 여성의 얼굴 피부 반점의 진피 상층부 내로 주사하였다. 독소를 주사 부위당 50 ㎕씩 약 1 ㎠씩의 간격을 두고 주사하였다. 주사 깊이는 약 0.5 mm였다. 환자의 얼굴에 총 약 1.5 ㎍을 주사하였다.
기준선에서 및 치료 후 3주째에 평가를 수행하였다. 캔필드(Canfield) RBX 영상화 기술을 이용하여 색소침착의 정량적 평가를 수행하였다. 기준선과 비교하였을 때, 치료 후 3주째, 상기 여성의 얼굴 피부는 영상화에 기초하면 반점이 현저히 밝아진 것으로 나타났고; 상기 여성은 의사의 전반적 평가 및 대상 만족도 점수에서 심각한 전반적 색소침착에서 경미한 전반적 색소침착으로의 더 높은 점수를 받았다.
실시예 5
BoNT/DC에 의한 기미 치료
포토타입 III 피부를 가진 37세의 임신한 여성은 그녀의 볼, 코, 윗입술 및 이마에 과다색소침착된 변색, 갈색의 불규칙적인 반점성 반을 보였고, 이는 기미로 진단되었다. 상기 여성은 BoNT/DC 독소 제제를 이용한 표피내 치료를 받았다.
진공 건조된 4.5 ㎍ BoNT/DC 독소 분제를 3 mL의 멸균 0.9% 염수 중에 용해시켜 10 nM 용액을 구성하고, 멀티니들 진피용 주사기 시스템을 이용하여 상기 여성의 얼굴 피부의 표피 내로 주사하였다. 변색을 보이는 부위에 다중 주사 부위에서 독소 용액을 주사하였고, 주사 부위는 약 2 mm씩의 간격을 두고 있고, 주사 지점당 2 ㎕씩 주사되었다. 주사 깊이는 약 0.1 mm였다. 환자의 얼굴에 총 약 4.5 ㎍을 주사하였다.
기준선에서 및 치료 후 3주째에 평가를 수행하였다. 캔필드 RBX 영상화 기술을 이용하여 색소침착의 정량적 평가를 수행하였다. 기준선과 비교하였을 때, 치료 후 3주째, 상기 여성의 얼굴 피부는 유의적으로 더 적은 변색을 보였고; 상기 여성은 의사의 전반적 평가 및 대상 만족도 점수에서 심각한 전반적 색소침착에서 경미한 전반적 색소침착으로의 더 높은 점수를 받았다.
상기에서 여러 예시적인 측면 및 실시양태가 논의되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그의 특정 변형, 치환, 첨가 및 하위조합을 이해할 것이다. 그러므로, 하기 첨부되는 청구범위 및 이하 도입되는 청구범위는 그의 진실된 정신 및 범주 내에 상기의 모든 변형, 치환, 첨가 및 하위조합이 포함되어 있으며, 이에 그러한 모든 변형, 치환, 첨가 및 하위조합을 포함한다는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.

Claims (9)

  1. 멜라닌세포 과다활성 또는 과량의 멜라닌 생산과 연관된 장애 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 BoNT/DC를 투여하는 단계를 포함하는,
    멜라닌세포 과다활성 또는 과량의 멜라닌 생산과 연관된 장애를 치료하는 방법.
  2. 과다멜라닌 관련 질병을 앓는 환자의 피부에 BoNT/DC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는,
    피부의 과다멜라닌 관련 질병을 치료하는 방법.
  3. 피부의 과다색소침착 치료를 필요로 하는 환자의 피부에 BoNT/DC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는,
    피부의 과다색소침착을 치료하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장애 또는 질병이 과다멜라닌생성, 과다색소침착, 기미, 일광 흑색점, 반, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 BoNT/DC를 포함하는 액체 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 조성물이 장성 작용제 및 계면활성제 중 하나 이상의 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 진피 주사를 통해 이루어지는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 BoNT/DC를 포함하는 고체 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 국부 투여인 방법.
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