MX2011010335A - Metodos y composiciones para tratar afecciones de la piel asociadas con hiperreactividad vascular. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee métodos y composiciones para tratar un paciente que tiene una afección en la piel caracterizada por hiperreactividad vascular, tal como enrojecimiento o rubor facial crónico o episódico y/o rosácea. El método comprende aplicar una composición tópica a las áreas afectadas de la piel del paciente. La composición tópica comprende una cantidad efectiva de una neurotoxina botulínica para reducir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea, y un portador para transportar de manera efectiva la toxina botulínica a la microvasculatura cutánea. De esta manera, la invención provee una forma segura, efectiva, cómoda y/o conveniente para tratar la hiperreactividad vascular de la piel.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA TRATAR AFECCIONES DE LA PIEL ASOCIADAS CON HIPERREACTIVIDAD VASCULAR REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense No. 61/165.701, presentada el 1 de abril de 2009, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO EN FORMA ELECTRÓNICA Los contenidos del archivo de texto presentado en forma electrónica con la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad: copia en formato legible por computadora del listado de secuencias (nombre del archivo: REVA 003_01WO SeqList_ST25.txt, guardado en fecha: 30 de marzo de 2010, con un tamaño de archivo de 4 kilobytes) .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al tratamiento de afecciones de la piel caracterizadas por hiperreactividad vascular o dilatación vascular hiperreactiva . En particular, la presente invención se refiere al uso de una formulación tópica de neurotoxina botulínica para tratar afecciones tales como rosácea, o para prevenir o ralentizar el avance de la rosácea .

ANTECEDENTES La rosácea es una afección crónica caracterizada por el enro ecimiento facial que puede desencadenar en vasos sanguíneos superficiales dilatados en la cara, pápulas rojas en forma de domo, sensaciones de ardor y comezón, y nariz enrojecida y bulbosa. La rosácea afecta a más de 14 millones de ciudadanos estadounidenses (National Rosácea Society, 2009), y la edad pico de su desencadenamiento oscila entre los 30 y los 60 años.

La rosácea se puede clasificar en al menos cuatro subtipos con diversos síntomas, y un paciente puede padecer de uno o más subtipos en forma concurrente (Wilkin y colaboradores (2004), J Am Acad Dermatol, Vol . 50 (6) : 907-12) . La rosácea eritemato- telangiectática se caracteriza por un eritema (es decir, enrojecimiento) permanente de las mejillas, la frente y la nariz, y el paciente tiende a sofocarse y ruborizarse con facilidad. Típicamente, se observan pequeños vasos sanguíneos cerca de la superficie de la piel (por ej . telangiectasias ) y el individuo puede experimentar sensaciones de ardor o comezón. La rosácea papulopustulosa se puede confundir fácilmente con el acné debido a la presencia de cierto enrojecimiento permanente en el rostro central, con pápulas rojas, algunas de las cuales están llenas de pus (pústulas) . La rosácea fimatosa es el subtipo más comúnmente asociado con rinofima, un agrandamiento de la nariz provocado por hiperplasia de la glándula sebácea. Los síntomas de la rosácea fimatosa pueden incluir: engrosamiento de la piel, nodularidades de superficie irregular, y engrosamiento, lo que también puede afectar el mentón, la frente, las mejillas, los párpados y las orejas (Jansen y Plewig G (1998), Facial Plast Surg, Vol . 14 (4) : 241-53) . Un cuarto subtipo, conocido como "rosácea ocular" afecta principalmente los ojos y se caracteriza por presentar ojos rojos e irritados, párpados inflamados, orzuelos recurrentes, y sensaciones de comezón y ardor.

Los síntomas de la rosácea son inhabilitantes a nivel social, para muchos pacientes, y la afección puede durar años y raramente se revierte sin tratamiento. Los tratamientos típicamente se adecúan al individuo debido al tipo y severidad diversos de los síntomas. En un principio, se prescriben varios medicamentos orales y tópicos -que incluyen antibióticos, retinoides, peróxido de benzoilo y bloqueadores beta- para llevar la afección bajo control, lo que puede demorar de uno a dos años. Con frecuencia es necesario el tratamiento a largo plazo para mantener la remisión de la afección. Las etapas más avanzadas de la rosácea pueden requerir de tratamiento con láser, fuente de luz intensa o tratamiento quirúrgico para extraer los vasos sanguíneos superficiales visibles, reducir el enrojecimiento extendido, o mejorar las desfiguraciones de la nariz.

Los tratamientos disponibles en la actualidad para la rosácea y los síntomas asociados son costosos y pueden imponer un riesgo médico significativo. Además, si bien los tratamientos tópicos tienen la ventaja de evitar la toxicidad sistémica indeseada, la efectividad de los tratamientos tópicos puede estar limitada por, a modo de ejemplo, las áreas amplias de piel afectada, las diversas profundidades de la microvasculatura de la piel, y las variaciones individuales en la piel del paciente.

Es necesario encontrar tratamientos más efectivos para las afecciones de la piel asociadas con hiperreactividad vascular, con inclusión de tratamientos efectivos para la rosácea así como también tratamientos efectivos para prevenir el avance de la rosácea.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos y composiciones para tratar, reducir o mejorar la vasodilatación en la microvasculatura cutánea. Por ende, la presente invención es útil para tratar o mejorar la hiperreactividad vascular que caracteriza afecciones tales como rosácea. Asimismo, los métodos y las composiciones de la invención pueden aliviar síntomas tales como sofoco y rubor facial crónico o episódico, y prevenir su desencadenamiento en rosácea.

En un aspecto, la presente invención provee un método para tratar un paciente que tiene una afección de la piel caracterizada por hiperreactividad vascular cutánea, tal como sofoco o rubor facial crónico o episódico, o rosácea. El método comprende aplicar una composición tópica al área o áreas afectadas de la piel del paciente. La composición tópica comprende una cantidad efectiva de neurotoxina botulínica para disminuir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea, y un portador para transportar de manera efectiva la toxina botulínica a la microvasculatura cutánea. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, la neurotoxina botulínica se formula con un portador de péptido de carga positiva (por ej . , polilisina) que tiene uno o más dominios de transducción de proteínas (o dominios transportadores) , tales como secuencias de aminoácidos de HIV-TAT o HIV-TAT reversa. El método puede implicar una única aplicación tópica de toxina botulínica a las regiones afectadas o, en ciertas formas de realización, puede implicar la aplicación repetida.

La invención permite que se apliquen de manera controlable cantidades efectivas de toxina botulínica a las regiones afectadas de la piel, y se suministren de manera controlable a la microvasculatura subyacente. De esta manera, la invención provee una manera segura, efectiva y controlable de tratar hiperreactividad vascular en la piel, así como también de tratar, mejorar o prevenir el avance de la rosácea, y/o evitar que la hiperreactividad vascular crónica o episódica se desencadene en una afección tal como rosácea.

En un segundo aspecto, la presente invención provee composiciones, formulaciones, kits, y/o otros vehículos o dispositivos para administrar neurotoxina botulínica por vía tópica, para el tratamiento de hiperreactividad vascular cutánea. Por ejemplo, la invención provee cremas, lociones, geles y parches que permiten que la neurotoxina botulínica y el portador sean aplicados de manera conveniente, segura, cómoda y/o controlabe al área o las áreas afectadas de la piel del paciente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos y composiciones para tratar, reducir o mejorar la vasodilatación en la microvasculatura cutánea. Por ende, la presente invención es útil para tratar o mejorar la hiperreactividad vascular que caracteriza afecciones tales como rosácea. La invención implica aplicar una composición tópica al área o las áreas afectadas de la piel del paciente. La composición tópica comprende una cantidad efectiva de neurotoxina botulínica para disminuir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea, y un portador para transportar de manera efectiva la toxina botulínica a la microvasculatura cutánea.

Se conoce que la toxina botulínica media los efectos de la acetilcolina en el tejido blando (generalmente, por medio de inyección) y se ha usado en forma efectiva para reducir la sudoración e inhibir el espasmo muscular. No obstante, de acuerdo con la presente invención, la toxina botulínica se administra en forma tópica para disminuir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea para, de esta manera, reducir la hiperreactividad vascular en la piel. La invención disminuye o elimina el sofoco o rubor facial crónico o episódico como afecciones aisladas y/o retarda o previene el desencadenamiento progresivo de la rosácea, por ej . , sofoco, pápulas y eventual rinofima.

La vasoconstricción puede ser mediada al inhibir la liberación del péptido vasoactivo intestinal (VIP, por sus siglas en inglés Vasoactive Intestinal Peptide) , péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP, por sus siglas en inglés Calcitonin Gene-Related-Peptide) u otros péptidos contenidos en las vesículas presinápticas . Los neuropéptidos vasodilatadores están implicados en el tono vascular de la circulación periférica al reforzar la formación de óxido nítrico en la microvasculatura de la dermis humana. Sin ajustarse a la teoría, la neurotoxina botulínica puede disminuir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea al bloquear la liberación de los neuropéptidos vasodilatadores, tales como CGRP y VIP que son co-liberados con la acetilcolina de las terminaciones nerviosas sudomotoras . Por ende, la inhibición de la liberación de los vasodilatadores con la neurotoxina botulínica puede generar vasoconstricción o impedimiento de la vasodilatación así como también impedimento del sofoco o rubor de la piel y, por ende, el posterior desarrollo de la enfermedad progresiva de la rosácea.

Los tratamientos existentes para la rosácea incluyen antibióticos tópicos u orales-, peróxido de benzoilo, retinoides, bloqueadores beta, crema con cortisona, y tratamientos con láser o luz pulsada intensa. Todos estos tratamientos se asocian con una o más desventajas. Los antibióticos orales o tópicos presentan el riesgo de promover resistencia a multidrogas bacterianas y reacciones alérgicas, lo que puede provocar la muerte. El peróxido de benzoilo y los retinoides puede ser irritantes para la piel, y las cremas de cortisona se limitan a usos de corta duración, y pueden causar una erupción como efecto rebote cuando se dejan de usar. Los bloqueadores beta pueden producir efectos colaterales indeseados, tales como fatiga y disfunción sexual. Los riesgos asociados con los tratamientos con láser y luz pulsada intensa incluyen la aparición de cicatrices y hematomas, un período de recuperación más extenso, costos superiores y dolor.

Las composiciones de neurotoxina botulínica tópicas y los tratamientos asociados según se describen en la presente superan las desventajas asociadas con los tratamientos existentes para la rosácea. Las composiciones se pueden aplicar sobre un área amplia, no causan dolor, proveen un período de alivio prolongado, y eliminan el riesgo del abuso de antibióticos en una afección crónica. Asimismo, la formulación tópica supera algunas de las dificultades técnicas de usar neurotoxina botulínica inyectable. Por ejemplo, la administración de la neurotoxina botulínica inyectable depende del operador, y se puede inyectar en forma demasiado profunda en los músculos y nervios faciales, provocando incapacidad funcional y asimetría facial. Es por demás delicado inyectar neurotoxina botulínica en una amplia área de superficie del rostro, el cuello y el mentón, necesario para tratar de manera adecuada las afecciones hiperreac ivas vasculares de la piel. Las inyecciones no son contiguas y, por ende, depeden de la difusión para la aplicación uniforme. Las inyecciones de neurotoxina botulínica en la piel de los pacientes con hiperreactividad vascular posiblemente tornen la piel más sensible, roja y amoratada, de esta manera irritando la afección particular de la piel a ser tratada. Las composiciones de la invención ofrecen una forma tópica diluida de toxina botulínica que está diseñada para focalizarse sobre las capas superficiales de la piel, y que se puede aplicar de manera uniforme sobre áreas amplias.

En consecuencia, la invención provee una manera segura, efectiva, cómoda y/o conveniente de tratar hiperreactividad vascular en la piel, con inclusión de hiperreactividad vascular crónica o episódica, a fin de tratar o mejorar la rosácea, y/o evitar que la hiperreactividad vascular crónica o episódica se desencadene en una afección tal como rosácea. Afecciones caraterizadas por hiperreactividad vascular cutánea El paciente a ser tratado tiene una afección de la piel asociada con hiperreactividad vascular cutánea, tal como, mas sin limitarse a: sofoco, rubor facial y rosácea.

El sofoco es un ataque episódico de enrojecimiento de la piel junto con una sensación de calor o ardor del rostro, el cuello y, con menos frecuencia, el tronco superior y el abdomen. Es la naturaleza transitoria de los ataques la que distingue el sofoco del eritema persistente de la fotosensibilidad, las reacciones por contacto agudas o la elastosis solar (Greaves (1998) Flushing and flushing syndromes, rosacea and perioral dermatitis. En: Champion RH, y colaboradores, eds . Rook/Wilkinson/Ebling Textbook of Dermatology, 6ta. ed., Vol . 3: 2099-2104) .

El rubor facial está relacionado con el sofoco pero típicamente es menos intenso y se limita al enro ecimiento del rostro o de las mejillas. Los sofocos repetidos en un período de tiempo prolongado pueden generar telangiectasia y rosácea del rostro (Greaves (1998) Flushing and flushing syndromes, rosacea and perioral dermatitis. En: Champion RH, y colaboradores, eds. Rook/Wilkinson/Ebling Textbook of Dermatology, 6ta ed. , Vol. 3: 2099-2104). El rubor facial y el sofoco iniciales de la rosácea pueden provocar etapas avanzadas o subtipos de rosácea caracterizada por sofoco persistente, pápulas, quistes y eventual rinofima.

El sofoco o el rubor facial pueden originarse a partir de una afección o enfermedad subyacentes que incluyen, mas no se limitan a: fobia social (por ej . trastorno de ansiedad generalizado, ataque de pánico) , alcoholismo, menopausia y síndrome premenstrual, diabetes, trastornos o enfermedades pulmonares (por ej . enfisema, bronquitis crónica) , alergias por picaduras de insectos, embarazo, mastocitosis , síndrome de Soto, síndrome de Zollinger-Ellison, síndrome de Cushing, enfermedad de Hodgkin, septicemia, fiebre amarilla, derivados de niacina, acipimox, trastorno de estrés agudo, cáncer suprarrenal, síndrome anticolinérgico, fiebre hemorrágica, síndrome de disreflexia autónoma, síndrome carcinoide, hiperadrenalismo, hiperemia, hiperglicemia , disfunción ovárica hipergonadotrópica, tumor neuroendocrino gastro-enteropancreático, hipermagnesemia, hipertiroidismo, carcinoma medular tiroideo, enfermedad de la válvula mitral, síndrome de abstinencia a opioides, neuroblastoma, toxicidad de niacina, síndromes autoinmunes paraneoplásicos , enfermedad de la glándula pituitaria, disreflexina autónoma espinal, cáncer del timo y cáncer de tiroides.

En ciertas formas de realización, el paciente tiene (por ej . , ha sido diagnosticado con) rosácea, tal como una o más entre: rosácea eritemato-telangiectática, rosácea papulopustulosa, rosácea fimatosa y/o rosácea ocular. En estas u otras formas de realización, el paciente tiene uno o más síntomas de rosácea. Dichos uno o más síntomas de rosácea incluyen eritema, sofoco, rubor facial, telangiectasias , pápulas, pústulas, rinofima, sensaciones de ardor, y sensaciones de comezón. Dichos uno o más síntomas son mejorados o aliviados de acuerdo con la invención.

En ciertas formas de realización, el paciente tiene rosácea, pero todavía no tiene rinofima, que frecuentemente aparece con la rosácea fimatosa o en etapas avanzadas de la rosácea. La rinofima es un tumor benigno de crecimiento lento sobre la nariz, causado por la hipertrofia de las glándulas sebáceas en la punta de la nariz. De acuerdo con estas formas de realización, las composiciones y los métodos de la presente invención pueden prevenir el desarrollo de rinofima. Toxina botulínica Los métodos y las composiciones de la invención comprenden neurotoxina botulínica, formulada para suministro tópico, según lo descrito en la presente. Las toxinas botulínicas o neurotoxinas botulínicas son neurotoxinas producidas por las bacterias gram-positivas Clostridium botulinum y son una de las sustancias más letales conocidas por el hombre. Es bien sabido que las neurotoxinas producen parálisis de los músculos al evitar la liberación de la acetilcolina de las terminaciones nerviosas presinápticas en la unión neuromuscular . Las neurotoxinas también pueden inhibir la transmisión sináptica en las sinapsis colinérgicas del sistema nervioso autónomo.

La toxina botulínica se clasifica en ocho neurotoxinas que están relacionadas a nivel serológico pero son distintas. Siete de estas ocho pueden causar parálisis, a saber: los serotipos A, B, C, D, E, F y G de neurotoxina botulínica. Cada uno de estos serotipos se distingue por la neutralización con anticuerpos de tipo específico. Cada serotipo se puede aislar de las bacterias o producirse en forma recombinante . El peso molecular de la molécula de proteína de toxina botulínica activa, purificada, para todos los siete serotipos de toxina es de aproximadamente 150 kDa, que incluye una cadena pesada de 100 kDa y una cadena liviana de 50 kDa. Tal como son liberadas por la bacteria, las toxinas botulínicas son complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 150 kDa junto con proteínas no tóxicas asociadas. El complejo de toxina botulínica tipo A puede ser producido por Clostridia como formas de 900 kDa, 500 kDa y 300 kDa. Los tipos de toxina botulínica B y C pueden ser producidos como un complejo de 700 kDa o 500 kDa. La toxina botulínica tipo D es producida como complejo tanto de 300 kDa como de 500 kDa, mientras que los tipos de toxina botulínica E y F son producidos como complejos sólo de aproximadamente 300 kDa. Se cree que las proteínas no tóxicas asociadas con la toxina botulínica de 150 kDa proveen estabilidad contra la desnaturalización y proveen protección contra los ácidos digestivos cuando la toxina es ingerida. Si bien las formas complejas de las neurotoxinas botulínicas descritas con anterioridad se pueden usar en conexión con las composiciones y los métodos descritos en la presente, en ciertas formas de realización de la invención, la toxina botulínica es purificada (por ej . no asociada con proteínas accesorias) y tiene un peso molecular de alrededor de 150 kDa.

La toxina botulínica se puede seleccionar entre los serotipos A, B, C, D, E, F y G de toxina botulínica. En ciertas formas de realización, la toxina botulínica es la toxina botulínica de serotipo A, que incluye los Tipos Al, A2 y/o A3. Las cepas que producen el Tipo A de ejemplo incluyen la cepa Hall (Tipo Al) , Kyoto F (Tipo A2) , y NCTC 2916 (Tipo Al) . Véase Jacobson y colaboradores, Analysis of Neurotoxin Cluster Genes in Clostridíum botulinum Strains Producing Botulinum Neurotoxin Serotype A Subtypes, Appl . Environ. Microbiol. 74 (9) : 2778-2786 (2008) . La toxina botulínica adecuada para uso en los métodos y las composiciones de la invención puede ser producida por las bacterias Clostridia y purificada o, de manera alternativa, ser producida por técnicas recombinantes o sintéticas. Por ejemplo, la toxina puede ser un péptido recombinante , una proteína de fusión, o una neurotoxina híbrida, según se prepare a partir de subunidades o dominios de diferentes serotipos de toxina botulínica (véase, por ej . , la patente estadounidense 6.444.209, que se incorpora en la presente por referencia) .

Todos los siete serotipos de toxina botulínica (A, B, C, D, E, F y G) se encuentran disponibles a nivel comercial a través de Sigma-Aldrich y de Metabiologics , Inc. (Madison, Wisconsin) , así como también a través de otras fuentes. Al menos dos tipos de toxina botulínica, los tipos A y B, se encuentran disponibles a nivel comercial en formulaciones para el tratamiento de ciertas afecciones en humanos . El tipo A, por ejemplo, está contenido en el producto BOTOX® (Allergan) y DYSPORT® (Ipsen) , y el Tipo B está contenido en el producto MYOBLOC® (Elan) .

La toxina botulínica puede ser, alternativamente, un derivado de toxina botulínica, por ej . , un compuesto que tiene la actividad de la toxina botulínica pero que contiene una o más alteraciones químicas o funcionales con relación a las toxinas botulínicas nativas, recombinantes o de origen natural. Por ejemplo, la toxina botulínica puede ser una neurotoxina modificada, por ej . , una neurotoxina que tiene al menos uno de sus aminoácidos delecionado, modificado o reemplazado, en comparación con una neurotoxina nativa o producida de manera recombinante . Por ejemplo, la toxina botulínica puede ser una toxina de Tipo A (con inclusión del tipo A2 o tipo A3 ) o de Tipo B que tiene desde 1 hasta aproximadamente 20, o desde 1 hasta aproximadamente 10, o desde 1 hasta aproximadamente 5, sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos (en forma colectiva) . La toxina botulínica puede ser una porción de toda la molécula que posee la actividad necesaria de la toxina botulínica, y en dicho caso, se puede usar per se o como parte de una molécula en combinación o conjugada, por ejemplo, una proteína de fusión.

En algunas formas de realización, la toxina botulínica es una combinación de serotipos de toxina botulínica. Por ejemplo, la invención puede emplear una combinación de serotipo A y serotipo B de toxina botulínica.

Moléculas del portador üe acuerdo con la presente invención, la toxina botulínica se formula con un portador para transportar de manera efectiva la toxina botulínica a la microvasculatura cutánea. La invención permite aplicar cantidades efectivas de toxina botulínica de manera controlable a las regiones afectadas de la piel (que pueden ser áreas amplias) , y suministrarla de manera controlable a la microvasculatura subyacente. De acuerdo con la invención, el portador es un portador peptídico o un portador polimérico no peptídico, y por lo general tiene carga positiva.

El portador puede comprender al menos un dominio de transducción o dominio de transporte de proteínas, tal como una secuencia de aminoácidos de HIV-TAT o HIV-TAT reversa, según lo descrito en el documento WO 2008/082885, que se incorpora en la presente por referencia. Los dominios de transporte de ejemplo tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia reversa de la región básica de HIV-TAT (aminoácidos 49-57 de la proteína HIV-TAT de origen natural) . La secuencia reversa de la región básica de HIV-TAT (RRRQRRKKR (SEC ID NO : 1) ) se denomina, en lo sucesivo, como "HIV-TAT reversa" .

Por ende, los portadores de ejemplo incluyen los péptidos descritos en el documento WO 2009/015385, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Por ejemplo, el portador puede ser un péptido - catiónico que comprende una secuencia de HIV-TAT o secuencia de HIV-TAT reversa en el término N o en el C, o tanto en el término N como en el término C. Por ejemplo, el portador peptídico puede tener una secuencia de HIV-TAT, tal como Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEC ID NO : 2 ) , o una secuencia de HIV-TAT reversa, tal como Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg (SEC ID NO.-l), en el término N o en el C, o tanto en el término N como en el término C.

En una forma de realización, el portador comprende una porción N-terminal que es una secuencia de HIV-TAT o secuencia de HIV-TAT reversa, una porción C-terminal que es una secuencia de HIV-TAT o secuencia de HIV-TAT reversa, y uno o más residuos catiónicos (por ej . , Lys o Arg) entre la porción N-terminal y la porción C-terminal. Por ejemplo, el péptido puede tener desde 5 hasta 20 residuos catiónicos tales como Lys entre la porción N-terminal y la porción C-terminal, tal como de alrededor de 12, alrededor de 15, o alrededor de 17 residuos catiónicos. Los portadores de ejemplo, por ende, incluyen Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly- (Lys) n-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEC ID N0:3), o Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly- (Lys) n-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg (SEC ID NO : 4 ) , donde n oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20. En una forma de realización, la porción N-terminal del péptido es una secuencia de HIV-TAT y la porción C- terminal del péptido es una secuencia de HIV-TAT. En forma alternativa o adicional, el portador puede comprender péptidos donde la porción N-terminal es una secuencia de HIV-TAT reversa y la porción C- terminal es una secuencia de HIV-TAT reversa. Por ejemplo, el péptido puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly- (Lys) 15-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEC ID NO : 5 ) .

Por lo general, el portador se caracteriza por tener un contenido particularmente alto de residuos Arg y Lys. Por ejemplo, el portador puede contener al menos aproximadamente el 50%, en forma colectiva, de residuos de aminoácidos Arg y Lys, pero puede contener al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, de residuos Arg y Lys. En estas u otras formas de realización, dichos derivados pueden 2 O tener la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3, 4 ó 5 con desde 1 a 5 sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos (en forma colectiva), que incluyen sustituciones, inserciones o deleciones de 1, 2, 3 ó 4 aminoácidos con respecto a SEC ID NO: 3, 4 ó 5. En ciertas formas de realización, dichas sustituciones, inserciones o deleciones, se ubican dentro de la secuencia de HIV-TAT o secuencia de HIV-TAT reversa.

El portador puede ser un péptido que tiene una longitud que abarca desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos. En ciertas formas de realización, el portador abarca desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50, o desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 40 aminoácidos en longitud. En una forma de realización de ejemplo de la invención, el péptido portador es de aproximadamente 35 aminoácidos en longitud. La longitud del portador se puede diseñar para llevar neurotoxina botulínica a diferentes profundidades de penetración en la piel al variar la longitud del portador. Por ejemplo, los portadores poliméricos más largos penetrarán en capas más profundas de la piel .

Otros portadores adecuados para uso en conexión con la invención incluyen un portador polimérico de carga positiva para suministrar la toxina botulínica a través de la barrera de la piel a profundidades deseadas de la dermis subyacente. Dichos portadores incluyen los portadores poliméricos revelados en la publicación de patente estadounidense No. 2004/0220100 y WO 2005/084410, las cuales incorporan por referencia en su totalidad. En estas formas de realización, el portador polimérico de carga positiva comprende grupos de ramificación de carga positiva unidos a una estructura polimérica. Tal como se usa en la presente, "de carga positiva" significa que el portador tiene una carga positiva bajo condiciones compatibles a nivel fisiológico.

Por lo general, el portador polimérico de carga positiva es una cadena lineal de átomos, ya sea con grupos en la cadena que portan una carga positiva a pH fisiológico, o bien con grupos que portan una carga positiva unida a las cadenas laterales que se extienden desde la estructura. La estructura de carga positiva en sí misma no necesita tener una actividad biológica terapéutica o enzimática definida. La estructura lineal es una estructura de hidrocarburo que, en algunas formas de realización, es interrumpida por heteroátomos seleccionados entre nitrógeno, oxígeno, azufre, silicio y fósforo. La mayoría de los átomos de la cadena de la estructura son de carbono. Además, la estructura puede ser un polímero de unidades de repetición (por ej . , aminoácidos, poli ( etilenoxi ) , poli (propilenamina) , polialquilenimina, y similar) pero, en forma alternativa, puede ser un heteropolímero . En algunas formas de realización, la estructura polimérica es un polipéptido de carga positiva (por ej . , polilisina) . En otras formas de realización, la estructura de carga positiva es una polipropilenamina en donde un número de los átomos de nitrógeno de la amina están presentes como grupos amonio (tetra-sustituidos) que portan una carga positiva.

La estructura de carga positiva puede ser un polímero no peptidilo, que puede ser un hetero u homopolímero tal como una polialquilenimina -por ejemplo, una polietilenimina o polipropilenimina- que tiene un peso molecular que oscila entre aproximadamente 10,000 y aproximadamente 2,500,000, o entre aproximadamente 100,000 y aproximadamente 1,800,000, o entre aproximadamente 500,000 y aproximadamente 1,400,000. La longitud del portador polimérico se puede diseñar para llevar neurotoxina botulínica a diferentes profundidades de penetración en la piel al variar la longitud del portador. Por ejemplo, los portadores poliméricos más largos penetrarán en capas más profundas de la piel.

En ciertas formas de realización, la estructura tiene adherida una pluralidad de fracciones de cadena lateral que incluyen grupos de carga positiva (por ej . , grupos amonio, grupos piridinio, grupos fosfonio, grupos sulfonio, grupos guanidinio o grupos amidinio) . Las fracciones de cadena lateral se pueden separar a lo largo de la estructura de manera consistente o variable. Asimismo, la longitud de las cadenas laterales puede ser similar o disímil. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las cadenas laterales pueden ser cadenas de hidrocarburo lineales o ramificadas que tienen desde uno hasta veinte átomos de carbono y terminan en el extremo distante (lejos de la estructura) en uno de los grupos de carga positiva mencionados con anterioridad.

La asociación entre el portador y el agente biológicamente activo (por ej . toxina botulínica) tiene lugar generalmente mediante interacción no covalente, tal como mediante interacciones iónicas, enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, o combinaciones de las mismas.

En algunas formas de realización, la estructura de carga positiva es un polipéptido que tiene múltiples grupos de cadenas laterales de carga positiva (por ej . , lisina, arginina, ornitina, homoarginina , y similares) .

Preferentemente, el polipéptido tiene un peso molecular que abarca desde aproximadamente 10,000 hasta aproximadamente 1,500,000, o desde aproximadamente 25,000 hasta aproximadamente 1,200,000, o desde aproximadamente 100,000 hasta aproximadamente 1,000,000. La persona versada en el arte apreciará que, cuando los aminoácidos se usan en el portador, las cadenas laterales pueden tener forma D o forma L (configuración R o S) en el centro de la unión. En forma alternativa, la estructura puede ser un análogo de un polipéptido tal como un peptoide . Véase, por ejemplo, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl . , Vol . 32:543 (1993) ; Zuckermann y colaboradores Chemtracts-Macromol . Chem., Vol. 4:80 (1992) ; y Simón y colaboradores Proc . Nat ' 1. Acad. Sci. USA, Vol. 89:9367 (1992) . Brevemente, un peptoide es una poliglicina en la cual la cadena lateral está unida a los átomos de nitrógeno de la estructura en lugar de los átomos de carbono alfa. Una porción de las cadenas laterales puede terminar en un grupo de carga positiva para proveer un componente de estructura de carga positiva. La síntesis de los peptoides se describe en, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.877.278, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Tal como se usa el término en la presente, las estructuras de carga positiva que tienen una construcción de estructura de peptoide se consideran "no peptídicas" ya que no están compuestas por aminoácidos que tienen cadenas laterales de origen natural en las ubicaciones del carbono alfa.

Una variedad de otras estructuras pueden ser utilizadas empleando, por ejemplo, miméticos estéricos o electrónicos de polipéptidos en donde los enlaces amida del péptido son reemplazados con sustitutos tales como enlaces éster, tioamidas (-CSNH-), tioamida invertida (-NHCS-) , aminometileno ( -NHCH2 - ) o los grupos metilenamino ( -CH2NH- ) invertidos, grupos ceto-metileno (-COCH2-) , fosfinato (-P02RCH2-) , fosfonamidato y éster de fosfonamidato (-P02 NH-) , péptido reverso (-NHCO-) , trans-alqueno (-CR=CH-) # f luoroalqueno (-CF=CH-), dimetileno (-CH2CH2-) , tioéter (-CH2S) , hidroxietileno ( -CH (OH) CH2- ) , metilenoxi (-CH20-) , tetrazol (CN4) , sulfonamido (-S02NH-) , metilensulfonamido (-CHRS02NH-) , sulfonamida invertida (-NHS02-) , y estructuras con malonato y/o subunidades gem-diamino-alquilo , por ejemplo, tal como lo describen Fletcher y colaboradores ((1998) Chem. Rev. , Vol . 98:763) y lo detallan las referencias citadas en ese documento. Muchas de las sustituciones mencionadas generan estructuras poliméricas aproximadamente isostéricas relativas a las estructuras formadas a partir de aminoácidos alfa .

En cada una de las estructuras provistas con anterioridad, se pueden unir grupos de cadenas laterales que portan un grupo de carga positiva. Por ejemplo, las estructuras enlazadas por sulfonamida (-S02NH- y -NHS02-) pueden tener grupos de cadenas laterales unidos a los átomos de nitrógeno. En forma similar, el enlace hidroxietileno (-CH(0H)CH2-) puede presentar un grupo de cadena lateral unido al sustituyente hidroxi . La persona versada en el arte puede adaptar con facilidad las otras químicas de enlace para proveer grupos de cadenas laterales de carga positiva usando métodos sintéticos estándares.

En una forma de realización, el portador polimérico de carga positiva es un polipéptido que tiene grupos de ramificación (que también se denominan "grupos de eficiencia") . Tal como se usa en la presente, un "grupo de eficiencia" o "grupo de ramificación" es cualquier agente que tiene el efecto de promover la translocación del portador polimérico de carga positiva a través de una membrana tisular o celular. Los ejemplos no limitativos de grupos de eficiencia o ramificación incluyen HIV-TAT o HIV-TAT reversa (según lo descrito) o sus fragmentos, el dominio de transducción de proteínas de Antennapedia, o un fragmento del mismo, o - (gly) ni- (arg) n2, en donde ni es un número entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 20, o de 0 a aproximadamente 8, o de 2 a aproximadamente 5. n2 es independientemente un número entero impar de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 13.

Otras formas de realización emplean fragmentos de HIV-TAT o secuencias de HIV-TAT reversas de fórmula (gly)P-RGRDDRRQRRR- (gly) q (SEC ID NO : 6), (gly) p-YGRKKRRQRRR- (gly) q (SEC ID NO: 7), o (gly) p-RKKRRQRRR- (gly) q (SEC ID NO: 8) en donde p y q son cada uno, independientemente, un número entero de 0 a 20 y el fragmento está unido a la estructura ya sea mediante el término C o el término N del fragmento. Los fragmentos de HIV-TAT incluyen aquellos en los cuales p y q son cada uno, independientemente, números enteros de 0 a aproximadamente 8 , tal como de 2 a aproximadamente 5.

El grupo de ramificación o cadena lateral de carga positiva puede ser el dominio de transducción de proteínas (PTD, por sus siglas en inglés Protein Transduction Domain) Antennapedia (Antp) o un fragmento del mismo que retiene la actividad. Estos son conocidos en el arte, por ejemplo, a través de Consolé y colaboradores, J. Biol . Chem. , Vol . 278 :35109 (2003) .

El portador polimérico de carga positiva puede incluir grupos de ramificación de carga positiva en una cantidad de al menos aproximadamente el 0.05%, como porcentaje del peso total del portador, tal como desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 45%, o desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 30%. Para los grupos de ramificación de carga positiva que tienen la fórmula - (gly) ni- (arg) n2 , la cantidad puede abarcar- desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 25% .

En ciertas formas de realización, la porción de la estructura del portador es una polilisina y los grupos de ramificación de carga positiva (según lo descrito con anterioridad) están unidos a los grupos amino de cadenas laterales de la lisina. La polilisina puede tener un peso molecular que oscila entre aproximadamente 10,000 y aproximadamente 1,500,000, tal como entre aproximadamente 25,000 y aproximadamente 1,200,000, o entre aproximadamente 100,000 y aproximadamente 1,000,000. Puede ser cualquiera entre las polilisinas disponibles a nivel comercial (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) tales como, por ejemplo, polilisina que tiene un PM > 70,000, polilisina que tiene un PM de 70,000 a 150,000, polilisina que tiene un PM de 150,000 a 300,000 y polilisina que tiene un PM > 300,000. La selección de una polilisina apropiada dependerá de los componentes restantes de la composición y serán suficientes para proveer una carga positiva neta total a la composición y proveer una longitud que sea preferentemente entre una y cuatro veces superior a la longitud combinada de los componentes de carga negativa.

En otras formas de realización, el portador es una estructura de polilisina o polietilenimina (PEI) relativamente corta (que puede ser lineal o ramificada) y que tiene grupos de ramificación de carga positiva. Dichos portadores pueden ser útiles para minimizar la acumulación descontrolada de las estructuras y la toxina botulínica en una composición terapéutica, lo que provoca que la eficiencia del transporte disminuya de manera drástica. Cuando el portador es una estructura de polilisina o PEI lineal relativamente corta, la estructura tendrá un peso molecular menor a aproximadamente 75,000, o menor a aproximadamente 30,000, o menor a aproximadamente 25,000. Cuando el portador es una estructura de polilisina o PEI ramificada relativamente corta, no obstante, la estructura tendrá un peso molecular menor a aproximadamente 60,000, o menor a aproximadamente 55,000, o menor a aproximadamente 50,000. Si, no obstante, se incluyen agentes de partición -como los que se describen en la presente- en la composición, el peso molecular de la polilisina ramificada y las estructuras de PEI puede llegar hasta aproximadamente 75,000, mientras que el peso molecular de las estructuras de polilisina y PEI lineales puede llegar hasta aproximadamente 150,000.

Composiciones y formulaciones Las composiciones usadas en los métodos de la invención preferentemente comprenden una cantidad efectiva de toxina botulínica. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener un resultado clínico deseado o beneficioso, por ej . una cantidad suficiente para reducir la 3 O hiperreactividad vascular en la piel. Una "cantidad efectiva" en cada forma de realización se basará en el serótipo de toxina botulínica, la forma de toxina usada (por ej . bi-cadenas complejas o purificadas), y en algunas formas de realización, los factores individuales al paciente, que incluyen edad, condición a ser tratadas (por ej . sofoco, rubor facial, subtipo particular de rosácea) , tamaño del área de piel a ser tratada, y severidad de los síntomas.

En algunas formas de realización, una "cantidad efectiva" abarca desde aproximadamente 0.1 ng hasta aproximadamente 2.0 ng de neurotoxina botulínica purificada (por ej . , serotipo A) . La cantidad efectiva puede abarcar desde aproximadamente 0.2 ng hasta aproximadamente 1.5 ng, o desde aproximadamente 0.5 ng hasta aproximadamente 1.0 ng de neurotoxina botulínica purificada (por ej . , complejo de neurotoxina botulínica Tipo A o serotipo A) . La cantidad efectiva se puede combinar en una cantidad que abarca desde aproximadamente 0.5 mi hasta aproximadamente 10 mi de crema o gel, según se describe en la presente, dependiendo del tamaño del área que necesita tratamiento.

Las composiciones para uso en los métodos de la invención están formuladas para su aplicación a la piel o epitelio de los sujetos o pacientes,- es decir, humanos u otros mamíferos que necesitan del tratamiento particular. En general, las composiciones se preparan al mezclar la toxina botulínica con el portador (según lo descrito con anterioridad) , y opcionalmente con uno o más diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. La relación del portador respecto de la toxina botulinica puede estar en el rango comprendido entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:10 en masa (por ej . , aproximadamente 1:1) . La relación puede oscilar entre aproximadamente 6:1 y aproximadamente 1.5:1, respectivamente. En dichas formas de realización, el portador puede ser el péptido de SEC ID NO: 3 , 4 ó 5.

Las composiciones pueden contener otros ingredientes típicos en las composiciones farmacéuticas o cosmecéuticas tópicas, con inclusión de un portador, vehículo o medio aceptable a nivel dermatológico o farmacéutico (es decir, un portador, vehículo o medio que es compatible con los tejidos a los cuales serán aplicados) . El término "aceptable a nivel dermatológico o farmacéutico" , tal como se usa en la presente, significa que las composiciones o los componentes de las mismas según fueron descritos son adecuados para uso en contacto con estos tejidos o para uso en pacientes en general sin toxicidad indebida, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares. Según lo apropiado, las composiciones adecuadas para uso en los métodos de la invención pueden comprender cualquier ingrediente convencionalmente usado en los campos bajo consideración, y particularmente en el ámbito cosmetológico y dermatológico. Las composiciones también pueden incluir una cantidad de un pequeño anión, preferentemente un anión polivalente, por ejemplo, fosfato, aspartato o citrato.

En términos de su forma, las composiciones tópicas de toxina botulinica pueden incluir soluciones, emulsiones (incluso microemulsiones) , suspensiones, cremas, lociones, geles, polvos, ungüentos u otras composiciones sólidas o líquidas típicas usadas para aplicación a la piel y otros tejidos donde las composiciones se pueden usar. Dic as composiciones pueden contener -además de la toxina botulinica y el portador- otros ingredientes típicamente usados en dichos productos, tales como agentes antimicrobianos, humectantes e hidratantes, agentes de penetración, conservantes, emulsionantes, aceites naturales o sintéticos, solventes, agentes tensioactivos , detergentes, emolientes, antioxidantes, fragancias, rellenos, espesantes, ceras, agentes absorbentes de olores, tinturas, agentes colorantes, polvos, y opcionalmente incluyen anestésicos, aditivos anticomezón, extractos botánicos, agentes acondicionadores, agentes de oscurecimiento o aclaramiento , brillo, humectantes, mica, minerales, polifenoles, siliconas o sus derivados, bloqueadores solares, vitaminas, y fitomedicamentos .

En ciertas formas de realización, las composiciones incluyen agentes gelificantes y/o agentes modificadores de viscosidad. Estos agentes por lo general se agregan para incrementar la viscosidad de la composición, a fin de que la aplicación de la composición sea más fácil y más precisa. Asimismo, estos agentes ayudan a evitar que la solución acuosa de toxina botulinica/portador se seque, lo que suele causar una disminución en la actividad de la toxina botulínica. Los agentes de ejemplos son aquellos que no están cargados y que no interfieren con la actividad de la toxina botulínica o la eficiencia de los complejos toxina-portador para traspasar la piel. Los agentes gelificantes pueden ser ciertos agentes gelificantes a base de celulosa, tales como hidroxipropilcelulosa (HPC) por ejemplo. En algunas formas de realización, el complejo toxina botulinica/portador se formula en una composición que tiene entre 2 y 4% de HPC. En forma alternativa, la viscosidad de una solución que contiene un complejo toxina botulinica/portador se puede alterar al agregar polietilenglicol (PEG) . En otras formas de realización, la solución de toxina botulinica/portador se combina con agentes viscosos pre-mezclados , tales como el humectante Cetaphil®.

En ciertas formas de realización, la composición además comprende un diluyente basado en poloxámero. El diluyente de poloxámero es un agente tensioactivo copolimérico capaz de diluir proteina liofilizada, y luego gelificarse a una viscosidad suficiente para aplicarse y permanecer en un área cutánea definida. El poloxámero puede estar presente en aproximadamente 10% a 20%, por ejemplo, en 0.9% de solución salina. A aproximadamente 15%, el poloxámero es termosensible . Es decir, la composición permanecerá líquida a temperatures de 20 °C o menos, formándose un producto de gel a temperaturas en el rango comprendido entre 20 y 35 °C para aplicación local.

Las composiciones de toxina botulínica pueden incluir, opcionalmente , agentes de partición. Tal como se usa en la presente, un "agente de partición" es cualquier sustancia o aditivo que tiene la propiedad de evitar o minimizar la acumulación indeseada o descontrolada de la toxina botulínica con los portadores poliméricos de carga positiva. Los agentes de partición son particularmente útiles, por ejemplo, cuando se emplea una solución de toxina botulínica concentrada debido a las restricciones de volumen. En dichas formas de realización, el agente de partición mantiene la toxina botulínica dispersa, lo que así evita la acumulación de la toxina que de lo contrario ocurriría sin el agente de partición. Por lo general, un agente de partición (1) no es irritante, (2) no destruye la toxina botul nica, (3) no confiere ningún incremento en la permeabilidad, (4) brinda tamaños de partículas confiables y estables, (5) no está cargado, y (6) no interfiere con los complejos de la toxina y el portador polimérico.

Un ejemplo de un agente de partición adecuado es el etanol (EtOH) . Por ejemplo, el EtOH puede estar presente en menos del 20% de la composición, tal como menos de aproximadamente el 5% de la composición. A modo de ejemplo, si las restricciones de volumen requieren reconstituir 100 U de toxina botulinica en 0.5 mi de solución, en vez de 2.5 mi, se observa típicamente que la toxina botulinica exhibirá acumulación indeseable y, por ende, actividad reducida. No obstante, al agregar EtOH al 1% como agente dispersante, se mantiene la actividad completa incluso después de 24 horas a esta concentración. Como otro ejemplo, Botox® a una reconstitución de 1.0 mi de NaCl al 0.9% tiene actividad completa, mientras que la reconstitución a 0.5 mi en EtOH al 1% y 5% más NaCI al 0.9% produce soluciones con actividad completa .

En ciertas formas de realización de la invención, los puentes oligo o polianión se agregan a las composiciones de toxina botulinica para mejorar la formación del complejo de la toxina con un portador de carga positiva. Dichos puentes son particularmente útiles cuando los complejos de toxina botulinica se usan en las composiciones. Algunas de las proteínas de los complejos tienen carga positiva, mientras que otras tienen carga negativa. Como la distribución exacta de los componentes de la toxina varía según la fuente de la toxina, puede ser que la toxina botulinica de ciertas fuentes tenga una propensión menor en cuanto a la formación de complejos con los portadores poliméricos de carga positiva descritos en la presente. No obstante, al agregar un puente oligo o polianión a dichos complejos de toxina botulinica, la eficiencia y la eficacia de la administración tópica se incrementa en forma drástica. Los ejemplos adecuados de dichos puentes oligo/polianión incluyen fosfato sódico (5%), PBS o poli-L-aspartato al 5% (por ej . , con un PM de 3000) .

Las composiciones de acuerdo con esta invención pueden estar en la forma de composiciones de liberación controlada o de liberación prolongada, en donde la toxina botulinica y el portador están encapsulados o en su defecto contenidos dentro de un material de tal manera que se liberan sobre la piel de manera controlada en el tiempo. La toxina botulinica y el portador pueden estar contenidos dentro de matrices, liposomas, vesículas, microcápsulas , microesferas y similares, o dentro de un material particulado sólido, todo lo cual se selecciona y/o conforma para proveer la liberación de la toxina botulínica en el tiempo. La toxina botulínica y el portador se pueden encapsular juntos (por ej . , en la misma cápsula) o por separado (en cápsulas separadas) .

Aplicación de la composición tópica Las composiciones se administran de acuerdo con los métodos de la invención mediante o bajo la dirección de un médico u otro profesional al cuidado de la salud. Las composiciones se pueden administrar en un único tratamiento o en una serie de tratamientos periódicos en el tiempo. Se espera que el efecto del tratamiento se extienda durante aproximadamente 3, 4, 5 ó 6 meses. Por ende, la composición tópica se puede administrar una vez, o se puede administrar en forma repetida o rutinaria. La frecuencia del tratamiento puede variar, pero puede ser, por ejemplo, una vez por mes, o de dos a diez veces por año, tal como de dos a cinco veces por año. Como el tratamiento no es irritante ni exacerba la afección subyacente, el tratamiento a largo plazo durante 1, 2, 3 ó 4 o más años es posible, de ser necesario.

Para el suministro tópico de la toxina botulínica de acuerdo con los métodos de la invención según se describe en la presente, una composición tal como la descrita con anterioridad se aplica en forma tópica a la piel en un lugar o lugares donde el efecto es deseado (por ej . las áreas afectadas de la piel) . En las formas de realización donde una solución acuosa de toxina botulínica/portador se aplica directamente a la piel, es preferible cubrir el área tratada (por ej . , con humectante Cetaphil®) o tapar el área tratada con una barrera (por ej . , Telfa) , a fin de evitar que la solución se seque, lo que provocaría una disminución de la actividad de la toxina. A causa de su naturaleza, más preferentemente, la cantidad de toxina botulínica aplicada, debería aplicarse con cuidado, a una tasa de aplicación y frecuencia de aplicación que produzcan el resultado deseado sin producir ningún resultado adverso ni indeseado. En consecuencia, por ejemplo, las composiciones tópicas de la invención deberían aplicarse a una tasa que abarca desde aproximadamente 1U hasta aproximadamente 20,OOOU, preferentemente desde aproximadamente 1U hasta aproximadamente ??,???? toxina botulínica por cm2 de superficie de piel. Preferentemente, se podrían emplear dosis más altas dentro de estos rangos junto con materiales de liberación controlada (por ej . parches y similares) , por ejemplo, o permitir un tiempo de permanencia más corto sobre la piel antes de su retiro.

En algunas formas de realización, el método para tratar un paciente que tiene una afección de la piel caracterizada por hiperreactividad vascular comprende, además, preparar la superficie de la piel antes de la aplicación de la composición tópica de toxina botulínica. En ciertas formas de realización, la preparacón de la superficie de la piel antes de la aplicación de la composición de toxina botulinica/portador promueve la eficacia de la solución. Por ejemplo, la introducción de agentes tensioactivos sobre la superficie de la piel con el objeto de limpiar los aceites superficiales sobre la piel antes de la aplicación puede ser contraproducente, porque los agentes tensioactivos parecen destruir la actividad de la toxina botulínica. Esto ocurre incluso si la piel es posteriormente lavada con agua varias veces antes de la aplicación de la solución de toxina botulínica/portador. Incluso los agentes tensioactivos extremadamente suaves, tales como los encontrados en las toallitas húmedas para bebés, parecen causar este fenómeno. Por consiguiente, en ciertas formas de realización, la piel se limpia previamente usando sólo agua. El lavado solamente con agua también parece mejorar el transporte transdérmico de la toxina botulínica en forma moderada.

Kits y otros dispositivos de suministro La presente invención provee dispositivos transdérmicos para tratar un paciente que tiene una afección de la piel caracterizada por hiperreactividad vascular. Dichos 4 O dispositivos contienen toxina botulínica y un portador tal como se describe en la presente. Dichos dispositivos pueden ser tan simples en su conformación como un parche para la piel, o pueden ser dispositivos más complicados que incluyen medios para dispensar y supervisar la dispensación de la composición, y opcionalmente medios para supervisar la afección del sujeto (por ej . , supervisar la reacción del sujeto a las sustancias que están siendo dispensadas) . En una forma de realización, la presente invención provee un parche para la piel que comprende una cantidad efectiva de una toxina botulínica y un portador según lo descrito.

Los materiales para la fabricación de los dispositivos de suministro pueden ser aquellos que no provocan la pérdida de la actividad de la solución de toxina botulínica/portador, ya sea a través de la degradación o de la adsorción indeseada de la toxina botulínica sobre una superficie del dispositivo. Dicho comportamiento indeseado ha sido observado, por ejemplo, cuando la toxina botulínica/portador en una solución acuosa entra en contacto con superficies de polipropileno, mas no cuando la solución de toxina botulínica/portador entra en contacto con superficies de cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés Polyvinyl Chloride) .

Por lo general, las composiciones pueden ser pre-formuladas y/o pre- instaladas en un dispositivo o pueden ser preparadas con posterioridad, por ejemplo, usando un kit que comprende los dos ingredientes (toxina botulínica y portador) por separado, pero brindando un mecanismo para combinarlos al momento o antes de la aplicación. La expresión "junto con" hace referencia a que los dos componentes (toxina botulínica y portador) se administran en un procedimiento de combinación, que puede implicar ya sea combinarlos en una composición -que se administra posteriormente al sujeto- o bien administrarlos por separado, pero de manera tal que actúen en forma conjunta para brindar el suministro requerido de una cantidad efectiva de la toxina botulínica.

Por ejemplo, una composición que contiene el portador se puede aplicar primero a la piel del paciente, y después aplicar un parche para la piel u otro dispositivo que contiene la toxina botulínica. La toxina botulínica se puede incorporar en forma seca en un parche para la piel u otro dispositivo de dispensación, mientras que el portador polimérico de carga positiva se puede aplicar a la superficie de la piel en una crema o loción antes de la aplicación del parche de manera tal que los dos actúen juntos, lo que genera el suministro transdérmico deseado. Por ende, las dos sustancias (portador y toxina botulínica) actúan en combinación o pueden interactuar para formar una composición o combinación in situ.

Por ende, la presente invención también provee un kit para tratar una afección de la piel caracterizada por hiperreactividad vascular. El kit comprende una cantidad efectiva de una toxina botulínica, un portador, y un diluyente, tal como un diluyente de poloxámero según se describe en la presente. En una forma de realización, la afección de la piel es rosácea. En algunas formas de realización, la toxina botulínica se envasa en forma separada de los otros componentes en el kit. Por ejemplo, la toxina botulínica se puede liofilizar y almacenar en un frasco separado del portador y/o diluyente. En otra forma de realización, la toxina botulínica se envasa dentro de un dispositivo, por ej . un parche para la piel.

En otra forma de realización más, el portador polimérico de carga positiva se pre-formula en un líquido, gel, crema, o similares para aplicación a la piel o el epitelio de un paciente. En ciertas formas de realización, el kit también peude comprender utensilios y/o un aplicador para mezclar la toxina botulínica con el portador polimérico de carga positiva y el diluyente, y aplicar la mezcla tópica a un área afectada de la piel del paciente.

En otras formas de realización, el kit puede comprender componentes para mantener el área tratada entre o después de los tratamientos con neurotoxina. Por ejemplo, el kit puede comprende uno o más limpiadores suaves para la piel para retirar el exceso de la composición de toxina botulínica después del tratamiento, una loción para reducir el enro ecimiento, uno o más tratamientos tópicos adicionales para rosácea, y/o productos de protección solar con un factor de protección solar de 15 o más.

Por ejemplo, entre los tratamientos domésticos, se puede brindar a los pacientes un kit o sistema post - tratamiento con neurotoxina tópica para mantener el área tratada. El kit comprende un limpiador suave para la piel (que el paciente puede aplicarse por la mañana y/o por la noche) , una loción tópica para reducir el enro ecimiento (por ejemplo, el sistema anti-enrojecimiento de Eucerin® u otras lociones que contengan regaliz) , que se puede aplicar después del limpiador suave para la piel, y un bloqueador solar de amplio espectro con factor de protección solar de 15 o más (para proteger el área tratada durante el día) . Por la noche el paciente puede lavarse nuevamente con el limpiador suave, seguido de la administración tópica de uno o más tratamientos tópicos para la rosácea, tales como, por ejemplo, metronidazol en gel (USP entre 0.75% y 1.0%) .

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar adicionalmente varios aspectos de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Formulación tópica de neurotoxina botulínica Una formulación de ejemplo comprende: una toxina botulínica tipo A purificada de 150 kDa, que es mínimamente inmunogénica y no contiene componentes animales o humanos; el péptido portador (R-K-K-R-R-Q-R-R-R-G- (K) 15-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R SEC ID NO: 5), que permite el suministro transcutáneo de la toxina botulínica a la dermis subyacente; y un diluyente a base de poloxámero, que actúa como un vehículo para el portador.

La toxina botulínica es producida por Clostridiu botulinum (serotipo A - cepa Hall) en un cultivo de fermentación, y la bi-cadena completamente activa comprendida por una cadena pesada de 100 kDa y una cadena liviana de 50 kDa es purificada a partir del medio de cultivo. A diferencia del cosmético BOTOX® disponible a nivel comercial (Allergan) , la neurotoxina de 150 kDa purificada no está asociada con ninguna proteína accesoria derivada a nivel bacteriano ni formulada en albúmina de suero humano, hemaglutinina, u otros conjuntos de componentes derivados de humanos.

La neurotoxina botulínica purificada se combina con el portador peptídico en una relación de aproximadamente 1:1 en masa, y se diluye con solución salina tamponada en fosfato a 200 yL. La mezcla resultante se combina con 1.8 mL de diluyente a base de poloxámero (por ej . , Pluronic® F127, Grado NF, BASF Corp.) . El diluyente de poloxámero es un agente tensioactivo copolimérico capaz de diluir proteína liofilizada, y luego gelificarse a una viscosidad suficiente para ser aplicado y permanecer en un área cutánea definida. Al 15% (es con 0.9% de solución salina) , el poloxámero es termosensible . Es decir, la composición permanecerá líquida a temperaturas de 20 °C o menos, formándose un producto en gel a temperaturas en el rango comprendido entre 20 y 35 °C para aplicación local.

Ej emplo 2: Tratamiento de sofoco facial con una composición tópica de neurotoxina botulínica Para el tratamiento de sofoco facial, se mezcla un frasco que contiene 1 nanogramo de neurotoxina botulínica tipo A liofilizada con un segundo frasco que contiene un diluyente líquido que comprende el portador peptídico y el diluyente a base de poloxámero (ver el Ejemplo 1) . Los componentes se mezclan juntos para formar un gel viscoso blando que se aplica en forma tópica a las áreas afectadas (por ej . , las mejillas y las áreas de los surcos nasales de un paciente) .

Se espera que dentro de las 2 semanas de tratamiento, el paciente note una mejoría significativa de, por ejemplo, el eritema facial ante el descanso y el ejercicio. Por ejemplo, después del tratamiento, el sofoco tan sólo será ligeramente perceptible en las áreas generales de tratamiento. Tan sólo se percibirán ligeramente pequeñas telangiectasias después del tratamiento con el gel tópico de neurotoxina botulínica. También se espera que no existan signos visibles de caída de mejillas, que es un evento adverso informado cuando se usa neurotoxina botulínica inyectable. Se espera que los resultados perduren durante 2 meses o más.

Ejemplo 3: Tratamiento de rosácea con una composición tópica de neurotoxina botulínica Para el tratamiento de rosácea, incluso con inflamación moderada, eritema y pápulas de la parte central del rostro, se mezclan 1.2 nanogramos de neurotoxina botulínica tipo A liofilizada con el péptido portador y el diluyente a base de poloxámero (Ejemplo 1) . La composición se aplica en forma tópica a todas las áreas afectadas del rostro central del paciente .

Se espera que en aproximadamente 3 días después del tratamiento, la afección de la piel mejore rápidamente. Entonces se puede aplicar una segunda aplicación del gel tópico de neurotoxina botulínica en aproximadamente cuatro semanas, y la afección de la piel continuará mejorando. Cuatro meses después del segundo tratamiento, se espera que el paciente permanezca casi libre de los síntomas de la rosácea (vasos sanguíneos dilatados, pápulas) .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes analizadas y citadas en la presente, que incluyen las listadas a continuación, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

REFERENCIAS (1) Jacobson MJ, Guangyun L, Rap ael B, Andreadis J, Johnson EA, Analysis of Neurotoxin Clusber Genes in Clostridium botulinum Strains Producing Botulinum Neurotoxin Serotype A Subtypes, Appl . Environ. Microbiol. 74(9) :2778-2786 (2008) . (2) Alexandroff AB, Sinclair SA, Langtry JA, Successful use of botulinum toxin type A for the treatment of neck and anterior chest wall flushing. Derm. Surg. 32(12) : 1536-1536 (2006) . (3) Bull HA, Hothersall J, Chowdhury N, Cohén J, Dowd P, Neuropeptides induce reléase of nitric oxide from human dermal microvascular endothelial cells. Journal of Invest . Dermatol. 106:655-660 (1996) . (4) Carruthers J, Carruthers A, The effect of full-face broadband light treatments alone and in combination with bilateral crow' s feet botulinum toxin type a chemodenevation . Dermagol Surg 30:355-366 (2004) . (5) Cohen-Arad A, Blitzer A, Botulinum toxin treatment for symptomatic Frey's syndrome . Otolaryngology - Head and Neck Surg 122: 237-240 (2000) . (6) Jacob CI . Dermatologic Surgery. 31(4) : 492-492 (March 2006) . (7) Kranendonk, SK, Re: Botulinum Toxin for the Treatment of Facial Flushing. Dermatologic Surgery. 31 (4) : 491-491 (March 2006) . (8) Lowe N, Campanati A, Bodokh I, Cliff S, Jaén P, Kreyden O, Naumann M, Offidani A, Vadoud J, and Haram H, The place of botulinum toxin type A in the treatment of focal · hyperhidrosis . British Journal of Dermatology 151: 1115-1122 (2004) . (9) Sato K, Kang WH, Saga K and Sato KT, Biology of sweat glands and their disorders . II Disorders of sweat gland function. J Am Acad Dermatol 20:713-726 (1989) .

Claims (48)

5 O NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES :

1. Un método para tratar un paciente que tiene una afección de la piel caracterizada por hiperreactividad vascular cutánea, dicho método CARACTERIZADO porque comprende : aplicar una composición tópica al área o las áreas afectadas de la piel del paciente, en donde la composición tópica comprende una cantidad efectiva de una neurotoxina botulínica para disminuir la vasodilatación en la microvasculatura cutánea, y un portador para transportar la toxina botulínica a la microvasculatura cutánea.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la afección es sofoco o rubor facial.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO porque el paciente tiene rosácea.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque la rosácea es una o más entre: rosácea eritemato- telangiectática, rosácea papulopustulosa, rosácea fimatosa y/o rosácea ocular.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, CARACTERIZADO porque el paciente tiene uno o más síntomas de la rosácea seleccionados entre: eritema, sofoco, rubor facial, telangiectasias , pápulas, pústulas, rinofima, sensaciones de ardor y sensaciones de comezón.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque el paciente tiene rosácea, pero no tiene rinofima .

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica es una neurotoxina botulínica purificada que tiene una cadena pesada de 100 kDa y una cadena liviana de 50 kDa.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica es un complejo de neurotoxina botulínica purificada que tiene un peso molecular que oscila entre aproximadamente 450 kDa y aproximadamente 900 kDa.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7 ó 8, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica deriva de la cepa Hall.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7 ó 8, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica es de una cepa productora de Clostridium botulinum tipo A.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque la cepa productora de Tipo A es de tipo Al, tipo A2 o tipo A3.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el complejo está organizado como grupos de genes de neurotoxina botulínica de tipo A2 o tipo A3 de cepas Kyoto-F o NCTC 2916.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica es de tipo A, tipo B o tipo C.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque la neurotoxina botulínica es producida por las bacterias Clostridia o es producida en forma recombinante .

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 , CARACTERIZADO porque el portador es un portador peptídico de carga positiva o un portador polimérico no peptídico de carga positiva.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque el portador además comprende al menos un dominio de transporte de proteínas .

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el dominio de transporte de proteínas es una secuencia de aminoácidos de región básica de HIV-TAT o de región básica de HIV-TAT reversa.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque el dominio de transporte de proteínas es la secuencia de aminoácidos de HIV-TAT reversa de SEC ID NO: 1.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque el portador comprende una secuencia básica de HIV-TAT (SEC ID NO: 2) o una secuencia básica de HIV-TAT reversa (SEC ID N0:1) en el término N o en el término C, o tanto en el término N como en el término c .

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, CARACTERIZADO porque el portador comprende una porción N-terminal que es una secuencia básica de HIV-TAT o de HIV-TAT reversa, una porción C-terminal que es una secuencia básica de HIV-TAT o de HIV-TAT ' reversa, y uno o más residuos catiónicos entre la porción N- erminal y la porción C-terminal.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque los residuos catiónicos son Arginina y/o Lisina .

22. El método de acuerdo con la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque los residuos catiónicos son, cada uno, Lisina .

23. El método de acuerdo con la reivindicación 20, 21 ó 22, CARACTERIZADO porque el portador tiene desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 residuos catiónicos entre la porción N-terminal y la porción C-terminal .

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque el portador tiene aproximadamente 12, aproximadamente 15 o aproximadamente 17 residuos catiónicos entre la porción N-terminal y la porción C-terminal.

25. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 , CARACTERIZADO porque el portador es Arg-Lys -Lys -Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly- (Lys) n-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEC ID NO : 3 ) , o Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly- (Lys)n- Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg (SEC ID NO : 4 ) , donde n oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, CARACTERIZADO porque n oscila entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, CARACTERIZADO porque el portador es Arg-Lys -Lys -Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly- (Lys) 15-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEC ID NO: 5) .

28. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, CARACTERIZADO porque el portador es un péptido que tiene una longitud que abarca desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 100 aminoácidos .

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, CARACTERIZADO porque el portador es un péptido que tiene una longitud que abarca desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 aminoácidos.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, CARACTERIZADO porque el portador es un péptido que tiene una longitud que abarca desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 40 aminoácidos.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque el portador es un portador polimérico que comprende grupos de ramificación de carga positiva unidos a una estructura polimérica.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 31, CARACTERIZADO porque la estructura es un polímero de unidades de repetición que se selecciona entre poli ( etilenoxi ) , poli (propilenamina) , poli (alquilenimina) .

33. El método de acuerdo con la reivindicación 31, CARACTERIZADO porque el polímero es un heteropolímero .

34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, CARACTERIZADO porque la estructura tiene un peso molecular que abarca desde aproximadamente 10,000 hasta aproximadamente 2,500,000.

35. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, CARACTERIZADO porque los grupos de ramificación se seleccionan independientemente entre grupos amonio, grupos piridinio, grupos fosfonio, grupos sulfonio, grupos guanidinio y grupos amidinio .

36. El método de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque el portador es un polipéptido catiónico que tiene aminoácidos seleccionados entre lisina, arginina, ornitina y homoarginina .

37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, CARACTERIZADO porque el polipéptido tiene un peso molecular que abarca desde aproximadamente 10,000 hasta aproximadamente 1, 500 , 000.

38. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, CARACTERIZADO porque la cantidad efectiva de neurotoxina botulínica abarca desde aproximadamente 0.1 ng hasta aproximadamente 2.0 ng de neurotoxina botulínica purificada.

39. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, CARACTERIZADO porque la composición además comprende un diluyente.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, CARACTERIZADO porque el portador y la toxina botulínica se disuelven en el diluyente a una relación en el rango que oscila entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:10 en masa .

41. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, CARACTERIZADO porque la composición es una solución, emulsión, suspensión, crema, loción o gel.

42. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, CARACTERIZADO porque la composición comprende un agente gelificante y/o un agente que modifica la viscosidad .

43. El método de acuerdo con la reivindicación 42, CARACTERIZADO porque el agente gelificante o el agente que modifica la viscosidad es un diluyente a base de poloxamero.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, CARACTERIZADO porque el diluyente a base de poloxámero está presente de aproximadamente 10% a 20% en volumen.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 43, CARACTERIZADO porque el diluyente a base de poloxámero está presente a aproximadamente 16% en volumen.

46. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45, CARACTERIZADO porque la composición se aplica una vez, o se aplica en un régimen de una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez por mes, o dos a diez veces por año.

47. Un parche o kit para la piel CARACTERIZADO porque es para realizar el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 46.

48. Un kit CARACTERIZADO porque contiene neurotoxina botulínica, un limpiador suave, un sistema para reducir sofoco, una pantalla solar de alto espectro con factor de protección solar de 15 o más, y metronidazol en gel.