KR20120027170A

KR20120027170A - 혈관 과민반응과 관련된 피부질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20120027170A
Application number: KR1020117025371A
Authority: KR
Inventors: 코니 엘 호; 앨리스 두; 댄 브라운
Original assignee: 레반스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Priority date: 2009-04-01
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2012-03-21
Also published as: BRPI1014922A2; EP2413947A1; WO2010114828A1; US20170136105A1; US20220347275A1; JP2012522786A; JP2017081997A; PT2413947T; MX2011010335A; JP6140445B2; CY1123249T1; EP2413947B1; ES2804328T3; DK2413947T3; KR101959234B1; CA2757449A1; EP2413947A4; US20120148562A1

Abstract

본 발명은 만성적인 또는 일시적인 홍조(flushing) 또는 얼굴붉힘(blushing), 및/또는 주사(rosacea)와 같은 혈관 과민반응(vascular hyper-reactivity)을 특징으로 하는 피부질환을 가진 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 방법은 국소 조성물을 환자 피부의 환부에 적용하는 것을 포함한다. 국소 조성물은 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 감소시키기 위한 유효량의 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin), 및 보툴리눔 독소를 피부의 미소혈관계로 효과적으로 운반하기 위한 담체(carrier)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 피부에서의 혈관 과민반응을 치료하는 안전하고, 효과적이며, 통증이 없는 및/또는 편리한 방법을 제공한다.

Description

혈관 과민반응과 관련된 피부질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SKIN CONDITIONS ASSOCIATED WITH VASCULAR HYPER-REACTIVITY}

본 출원은 참조에 의해 그 내용의 전체가 본 명세서에 포함된, 2009년 4월 1일에 출원된 미국임시특허출원 제61/165,701호에 기초한 우선권을 주장한다.

본 발명은 혈관 과민반응(vascular hyper-reactivity), 또는 과민반응성 혈관 확장(hyper-reactive vascular dilation)을 특징으로 하는 피부질환의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 주사(rosacea)와 같은 질환의 치료, 또는 주사의 예방 또는 진행을 늦추기 위한 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin) 국소 제제의 용도에 관한 것이다.

주사(Rosacea)는 얼굴에서 확장된 표재혈관(dilated superficial blood vessels)으로 진행될 수 있는 얼굴 발적(facial redness), 붉은-돔 구진(red-domed papules), 작열감 및 가려움, 및 붉은 주먹코를 특징으로 하는 만성질환이다. 주사는 1400만명 이상의 미국인들에게 영향을 미치며(National Rosacea Society, 2009), 발병이 정점에 이르는 나이의 30 내지 60세 사이이다.

주사는 적어도 네 개의 다양한 증상을 가지는 서브타입들로 분류될 수 있으며, 환자는 하나 이상의 서브타입들로 동시에 고통받을 수 있다(Wilkin et al. (2004), J Am Acad Dermatol, Vol. 50 (6): 907-12). 홍반성혈관확장성 주사는 볼, 이마, 및 코의 영구적인 홍반(즉, 발적)을 특징으로 하며, 환자는 쉽게 홍조(flush) 및 얼굴붉힘(blush)을 나타내는 경향이 있다. 전형적으로, 소혈관들은 피부 표면 가까이에서 보이며(예를 들어, 모세혈관혈관확장증), 개인은 작열감 또는 가려움을 경험할 수 있다. 구진농포성 주사는 붉은 구진(이 중 일부는 고름이 차 있다(농포))과 함께 얼굴 중심을 통과하는 몇몇 영구적인 발적의 출현 때문에 여드름과 쉽게 혼동될 수 있다. 비류성 주사는 피지선 과형성으로 인한 코의 비대인 비류와 가장 일반적으로 연관되는 서브타입이다. 비류성 주사의 증상은 또한 턱, 이마, 볼, 눈꺼풀, 및 귀에 영향을 끼칠 수 있는 두꺼워진 피부, 불규칙한 표면 소결절형성, 및 비대를 수반할 수 있다(Jansen and Plewig G (1998), Facial Plast Surg, Vol. 14 (4): 241-53). 안구 주사로 알려진 네 번째 서브타입은 주로 눈에 영향을 끼치며, 붉고, 자극된 눈, 부어오른 눈꺼풀, 재발하는 다래끼, 및 가려움과 작열감을 특징으로 한다.

주사의 증상들은 사회적으로 많은 환자들을 무력하게 만들고, 질환은 여러 해 동안 지속될 수 있으며, 치료 없이는 거의 치유되지 않는다. 치료는 일반적으로 증상의 다양한 타입 및 강도 때문에 개인적으로 맞추어진다. 항생물질, 레티노이드, 벤조일 퍼옥사이드, 및 베타 차단제를 포함하는 다양한 경구 및 국소 약물 치료제들은 처음에 질환을 통제 하에 두기 위해 처방되며, 이는 1년 내지 2년 동안 계속될 수 있다. 장기적인 치료는 주로 질환의 차도(remission)를 유지하기 위해 필요하다. 보다 더 진행된 주사 단계에서는 눈에 보이는 표재혈관을 제거하기 위한, 광범위한 발적을 감소시키기 위한, 또는 코의 미관손상을 개선하기 위한 레이저, 강한 광원, 또는 외과 치료를 필요로 할 수 있다.

현재 사용 가능한 주사 및 연관된 증상의 치료법들은 비용 효율이 높지 않으며, 실질적인 의료 위험들을 내포할 수 있다. 더욱이, 국소 치료들은 원하지 않는 전신 독성(systemic toxicity)을 피하는 이점이 있는 반면, 국소 치료들의 실효성은 예를 들어, 환부의 넓은 영역, 피부 미소혈관계의 다양한 깊이, 및 환자 피부의 개인적인 편차에 의해 제한될 수 있다.

주사에 효과적인 치료법들은 물론 주사의 진행을 예방하는 효과적인 치료법들을 포함하는 혈관 과민반응과 연관된 피부질환에 대한 보다 효과적인 치료법들이 요구된다.

본 발명은 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 치료, 경감, 또는 개선하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서 본 발명은 주사와 같은 질환을 특징으로 하는 혈관 과민반응의 치료 또는 개선에 유용하다. 더욱이 본 발명의 방법 및 조성물은 만성적 또는 일시적인 홍조 및 얼굴붉힘과 같은 증상을 완화할 수 있으며, 이들이 주사로 진행하는 것을 예방할 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 만성적인 또는 일시적인 홍조 또는 얼굴붉힘, 또는 주사와 같은 혈관 과민반응을 특징으로 하는 피부질환을 가진 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 국소 조성물을 환자 피부의 환부에 적용하는 것을 포함한다. 국소 조성물은 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 감소시키기 위한 유효량의 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin), 및 보툴리눔 독소를 피부의 미소혈관계로 효과적으로 운반하기 위한 담체(carrier)를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 보툴리눔 신경독소는 HIV-TAT 또는 역(reverse) HIV-TAT 아미노산 서열들과 같은 하나 이상의 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)(또는 단백질 수송자 도메인(transporter domains))을 가진 양전하로 하전된 펩타이드 담체(예를 들어, 폴리라이신)와 함께 제제화된다. 방법은 환부에 대한 국소 보툴리눔 독소의 단일 적용을 포함할 수 있거나, 또는 특정 실시태양에서, 반복된 적용을 포함할 수 있다.

본 발명은 유효량의 보툴리눔 독소를 피부의 환부에 조정 가능하게 적용하며, 조정 가능하게 근원적인 미소혈관계로 운반할 수 있도록 한다. 따라서 본 발명은 주사의 진행을 치료, 개선, 또는 예방하기 위하여, 및/또는 만성적 또는 일시적인 혈관 과민반응이 주사와 같은 질환으로 진행하는 것을 예방하기 위하여 안전하고, 효과적이며, 통증이 없는 피부에서의 혈관 과민반응 치료 방법을 제공한다.

두 번째 양태에서, 본 발명은 피부 혈관 과민반응의 치료를 위한 보툴리눔 신경독소를 국소적으로 투여하기 위한 조성물, 제제, 키트 및/또는 다른 부형제 또는 장치를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 보툴리눔 신경독소 및 담체를 환자의 피부 환부에 편리하고, 안전하고, 통증이 없고 및/또는 조정 가능하게 적용하도록 해주는 크림, 로션, 겔, 및 패치를 제공한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

본 발명은 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 치료, 경감, 또는 개선하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서 본 발명은 주사와 같은 질환을 특징으로 하는 혈관 과민반응의 치료 또는 개선에 유용하다. 본 발명은 국소 조성물을 환자 피부의 환부(들)에 적용하는 것을 포함한다. 국소 조성물은 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 감소시키기 위한 유효량의 보툴리눔 신경독소, 및 보툴리눔 독소를 피부의 미소혈관계로 효과적으로 운반하기 위한 담체를 포함한다.

보툴리눔 독소는 연부조직(soft tissue)에서 아세틸콜린의 효과를 중개하는 것으로 알려져 있으며(일반적으로 주입을 통해), 발한을 감소시키며, 근육 경련을 억제하는데 효과적으로 사용되고 있다. 하지만, 본 발명에 따라, 보툴리눔 독소는 피부 미소혈관계에서 혈관확장을 감소시키기 위해 국소적으로 투여되며, 피부에서 혈관 과민반응을 감소시킨다. 본 발명은 단일 증상으로 만성적 또는 일시적인 홍조 또는 얼굴붉힘을 감소시키거나 제거하며, 및/또는 주사의 진행성 질환, 예를 들어, 홍조, 구진, 및 궁극적으로 비류를 지연시키거나 또는 예방한다.

혈관수축은 혈관활성장펩타이드(VIP; vasoactive intestinal peptide), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP; calcitonin gene-related-peptide) 또는 전시냅스 소포(presynaptic vesicles)에 함유된 다른 펩타이드의 방출을 억제함으로써 매개될 수 있다. 혈관확장제 신경 펩타이드들(Vasodilator neuropeptides)은 사람 진피(dermis)의 미소혈관계에서 산화질소 형성을 증진시킴으로써 말초 순환의 혈관 긴장(vascular tone)에 관여한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 보툴리눔 신경독소는 피부 미소혈관계에서 발한신경말단(sudomotor nerve terminals)으로부터 아세틸콜린과 함께-방출되는 CGRP 및 VIP와 같은 혈관확장제 신경 펩타이드들의 방출을 차단함으로써 혈관확장을 감소시킬 수 있다. 따라서, 보툴리눔 신경독소를 이용한 혈관확장제의 방출 억제는 피부의 혈관수축 또는 혈관확장의 회피 및 홍조 및 얼굴붉힘의 회피를 유도할 수 있으며, 따라서 주사의 진행성 질환의 개선을 결과적으로 유도할 수 있다.

주사를 위한 현존하는 치료법들은 국소 및 경구 항생물질, 벤조일 퍼옥사이드, 레티노이드, 베타 차단제, 코티손 크림 및 레이저 또는 강한 펄스광(intense pulse light) 치료들을 포함한다. 이러한 모든 치료법들은 하나 이상의 단점들과 관련되어 있다. 국소 및 경구 항생물질들은 세균의 다중약물내성(bacterial multidrug resistance) 및 죽음을 초래할 수 있는 알러지 반응을 촉진시킬 수 있는 위험을 가지고 있다. 벤조일 퍼옥사이드 및 레티노이드는 피부에 자극을 줄 수 있으며, 코티손 크림은 단기 사용에 제한되며, 중지하는 경우 원래대로 되돌아가는 재발을 일으킬 수 있다. 베타 차단제는 피로 및 성기능 장애와 같은 원하지 않는 부작용들을 나타낼 수 있다. 레이저 및 강한 펄스광 치료와 관련된 위험들은 흉터형성, 타박상, 긴 회복, 높은 비용, 및 통증을 포함한다.

본 명세서에서 설명된 국소 보툴리눔 신경독소 조성물 및 관련된 치료법들은 주사에 대한 현존하는 치료법들과 관련된 단점들을 극복한다. 조성물은 넓은 영역에 걸쳐 적용될 수 있으며, 통증을 유발하지 않으며, 장기간의 경감을 제공하며, 만성 질환에서 항생물질의 남용 위험을 제거한다. 또한, 국소 제제는 주사 가능한 보툴리눔 신경독소 사용의 기술적인 어려움들의 일부를 극복한다. 예를 들어, 주사 가능한 보툴리눔 신경독소의 투여는 집도자(operator)에 의존적이며, 안면 신경 및 근육 내로 너무 깊게 주사될 수 있어 기능적인 장애 및 안면 비대칭을 초래할 수 있다. 혈관 과민반응 피부질환을 적절히 치료하는데 필요한 보툴리눔 신경독소를 얼굴, 목 및 가슴의 넓은 표면 영역에 주사하는 것은 대단히 도전적이다. 주사는 연속적이지 않으며, 따라서 동등한 적용을 위해 확산(diffusion)에 의존한다. 혈관 과민반응을 가진 환자 피부 안으로의 보툴리눔 신경독소 주입은 피부를 보다 민감하고, 붉고, 멍이 들기 쉽게 만들며, 따라서 치료받을 특정 피부질환을 자극한다. 본 발명의 조성물은 피부의 표재층(superficial layers)을 타겟으로 하기 위해 디자인되었으며, 넓은 영역에 걸쳐 균등하게 적용될 수 있는 보툴리눔 독소의 희석된 국소 형태를 제공한다.

본 발명은 따라서 주사(rosacea)를 치료 또는 개선하고, 및/또는 만성 또는 일시적 혈관 과민반응이 주사와 같은 질환으로 진행하는 것을 예방하기 위한 안전하고, 효과적이며, 통증이 없고, 및/또는 편리한 만성적 및 일시적 혈관 과민반응을 포함하는 피부에서의 혈관 과민반응 치료 방법을 제공한다.

피부 혈관 과민반응으로 특징되는 질환들

치료받을 환자는 홍조 또는 얼굴붉힘, 및 주사와 같은 제한 없는 피부 혈관 과민반응과 관련된 피부질환을 가진다.

홍조(flushing)는 얼굴, 목, 및 낮은 빈도로 상반신 및 복부의 온감각(sensation of warmth) 또는 작열감과 함께 나타나는 피부 발적의 일시적인 공격이다. 홍조를 끊임없이 지속되는 감광성 홍반(persistent erythema of photosensitivity), 급성 접촉 반응(acute contact reactions), 또는 광선탄력섬유증(solar elastosis)과 구별시키는 것은 공격의 일시적인 속성이다(Greaves (1998) Flushing and flushing syndromes , rosacea and perioral dermatitis. In: Champion RH, et al, eds. Rook/Wilkinson/Ebling textbook of dermatology, 6th ed., Vol. 3: 2099-2104).

얼굴붉힘(blushing)은 홍조와 관련되어 있으나, 일반적으로 덜 강렬하며, 얼굴 또는 볼의 발적(redness)에 한정된다. 장기간 동안의 반복된 홍조는 안면의 모세혈관혈관확장증(telangiectasias) 및 주사를 유도할 수 있다(Greaves (1998) Flushing and flushing syndromes , rosacea and perioral dermatitis. In: Champion RH, et al, eds. Rook/Wilkinson/Ebling textbook of dermatology, 6th ed., Vol. 3: 2099-2104). 주사의 초기 얼굴붉힘 및 홍조는 끊임없이 지속되는 발적, 구진, 낭포, 및 궁극적인 비류를 특징으로 하는 더 진행된 단계 또는 서브타입의 주사를 유도할 수 있다.

홍조 또는 얼굴붉힘은 사회공포증(예를 들어, 범불안 장애, 공황 장애), 알코올 중독, 갱년기 장애 및 월경 전 증후군, 당뇨병, 폐 장애 또는 질환(예를 들어, 폐기종, 만성 기관지염), 곤충 자상 알러지(insect sting allergies), 임신, 비만 세포증, 소토 증후군(Soto's Syndrome), 졸린거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 호지킨병, 패혈증, 황열, 나이아신 유도체들, 아시피목스, 급성 스트레스 장애, 부신암, 항콜린성 증후군, 출혈열, 자율신경 반사부전 증후군, 카르시노이드 증후군, 부신항진증, 충혈, 고혈당증, 고성선자극호르몬성 난소부전, 위-장췌장 신경내분비종양, 고마그네슘혈증, 갑상선 기능 항진증, 수질 갑상선암, 승모판 질환, 아편류 금단(opioid withdrawal), 신경모세포종, 나이아신 독성, 부종양 자가면역 증후군(paraneoplastic autoimmune syndromes), 뇌하수체 질환, 척수 자율신경 반사부전(spinal autonomic dysreflexia), 흉선암(thymus cancer), 및 갑상선암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 근원적인 질환 또는 질병의 결과로서 일어날 수 있다.

특정 실시태양에서, 환자는 홍반성혈관확장성 주사, 구진농포성 주사, 비류성 주사, 및/또는 안구 주사의 하나 이상과 같은 주사를 가진다(예를 들어, 주사로 진단된다). 이러한 또는 다른 실시태양에서, 환자는 하나 이상의 주사 증상을 가진다. 하나 이상의 주사 증상은 홍반(erythema), 홍조(flushing), 얼굴붉힘(blushing), 모세혈관혈관확장증(telangiectasias), 구진(papules), 농포(pustules), 비류(rhinophyma), 작열감(burning sensations), 및 가려움(itching sensations)을 포함한다. 이와 같은 하나 이상의 증상들은 본 발명에 따라 호전되거나 개선된다.

특정 실시태양에서, 환자는 주사를 가지나, 주로 비류성 주사와 함께 또는 주사 단계 이전에 발생하는 비류를 아직 가지지는 않는다. 비류는 코 끝에서 피지선의 비대에 의해 야기되는 코 위에서 느리게 성장하는 양성종양(benign tumor)이다. 이러한 실시태양에서 따라, 본 발명의 조성물 및 방법은 비류의 발달을 예방할 수 있다.

보툴리눔 독소

본 발명의 방법 및 조성물은 본 명세서에서 기술된 국소 전달을 위해 제제화된 보툴리눔 신경독소를 포함한다. 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 신경독소는 그람-양성 세균 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 제조된 신경독소이며, 사람들에게 알려진 가장 치명적인 물질 중의 하나이다. 신경독소들은 신경근 접합부(neuromuscular junction)에서 전시냅스 신경 말단(pre-synaptic nerve terminals)으로부터 아세틸콜린의 방출을 막음으로써 근육 마비를 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 신경독소는 자율신경계의 콜린성 시냅스(cholinergic synapses)에서 시냅스 전달(synaptic transmission)을 또한 억제할 수 있다.

보툴리눔 독소는 혈청학적으로 연관되었지만 별개인 8종의 신경독소들로 분류된다. 이들 중에서, 마비를 유발할 수 있는 7종이 보툴리눔 신경독소 혈청타입 A, B, C, D, E, F 및 G로 지정되었다. 이들 혈청타입의 각각은 타입-특이적 항체(type-specific antibody)에 의한 중화에 의해 구별된다. 각각의 혈청타입은 세균으로부터 분리되거나 재조합에 의해 생산될 수 있다. 독소 혈청타입 7종 모두에 대한 정제된 활성 보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은 100 kDa의 중쇄 및 50 kDa의 경쇄를 포함하여 약 150 kDa이다. 세균에 의해 방출될 때, 보툴리눔 독소는 비-독소 단백질(non-toxin proteins)과 함께 관련된 150 kDa의 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체이다. 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디아(Clostridia)에 의해 900 kDa, 500 kDa 및 300 kDa 형태로 생성된다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C는 700 kDa 또는 500 kDa 복합체로 생산될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300 kDa 및 500 kDa 복합체 두 가지 모두로 생산되는 반면, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 대략 300 kDa 복합체로서만 생성된다. 150 kDa 보툴리눔 독소와 관련된 비독성 단백질들(nontoxic proteins)은 독소가 섭취될 때 변성(denaturation)에 대한 안정성 및 소화성 산(digestive acid)에 대한 보호를 제공하는 것으로 생각된다. 반면 위에서 서술된 보툴리눔 신경독소들의 복합된 형태들은 본 명세서에서 서술된 조성물 및 방법과 관련되어 사용될 수 있으며, 본 발명의 특정 실시태양에서, 보툴리눔 독소는 정제되고(예를 들어, 부속 단백질과 관련되지 않고), 약 150 kDa의 분자량을 가진다.

보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청타입 A, B, C, D, E, F, 및 G로부터 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 보툴리눔 독소는 타입 Al, A2 및/또는 타입 A3를 포함하는 보툴리눔 독소 혈청타입 A이다. 전형적인 타입 A 생산 균주는 할 균주(Hall Strain)(타입 Al), 교토 F(Kyoto F)(타입 A2), 및 NCTC 2916(타입 Al)을 포함한다. Jacobson et al., Analysis of Neurotoxin Cluster Genes in Clostridium botulinum Strains Producing Botulinum Neurotoxin Serotype A Subtypes, Appl. Environ. Microbiol. 74(9):2778-2786 (2008) 참조. 본 발명의 방법 및 조성물의 사용에 적합한 보툴리눔 독소는 클로스트리디아(Clostridia) 세균에 의해 생산되고, 정제되거나 또는 선택적으로 재조합 또는 합성기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 독소는 재조합 펩타이드, 융합 단백질, 또는 하이브리드 신경독소일 수 있으며, 각각 다른 보툴리눔 독소 혈청타입들의 서브유닛 또는 도메인으로부터 제조된다(예를 들어, 본 명세서에서 참조로 포함된 미국특허 6,444,209 참조).

모든 7종의 보툴리눔 독소 혈청타입들(A, B, C, D, E, F, 및 G)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 메타바이올로직스(Metabiologics)(Madison, Wisconsin)사는 물론 다른 출처들로부터 상업적으로 입수 가능하다. 적어도 두 종의 보툴리눔 독소, A형 및 B형이 특정한 인간 증상의 치료를 위한 제제로서 상용으로 입수 가능하다. 예를 들어, 타입 A는 보톡스(BOTOX)？(Allergan) 및 디스포트(DYSPORT)？(Ipsen)에 포함되고, 타입 B는 마이오블록(MYOBLOC)？(Elan)에 포함된다.

보툴리눔 독소는 선택적으로 보툴리눔 독소 유도체, 예를 들어, 보툴리눔 독소 활성을 가지나 천연 또는 재조합의 원형 보툴리눔 독소에 대해 하나 이상의 화학적 변형 또는 기능적 변형을 포함하는 화합물일 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 변형된 신경독소(예를 들면, 원형의, 또는 재조합에 의해 생성된 신경독소와 비교해 하나 이상의 아미노산 결실, 변형 또는 치환을 갖는 신경독소)일 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 1 내지 약 20, 또는 1 내지 약 10, 또는 1 내지 약 5, 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입(총괄하여)을 가지는 타입 A(타입 A2 또는 타입 A3을 포함) 또는 타입 B 독소일 수 있다. 보툴리눔 독소는 필요한 보툴리눔 독소 활성을 가지는 전체 분자의 일부분일 수 있으며, 그와 같은 경우에, 그 자체로 또는 조합 또는 컨쥬게이트(conjugate) 분자, 예를 들면, 융합 단백질의 일부로서 이용될 수 있다.

일부 실시태양에서, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 혈청타입의 조합이다. 예를 들어, 본 발명은 보툴리눔 독소 혈청타입 A 및 혈청타입 B의 조합을 사용할 수 있다.

담체 분자들

본 발명에 따라, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소를 피부 미소혈관계로 효과적으로 운반하기 위해 담체와 함께 제제화된다. 본 발명은 유효량의 보툴리눔 독소를 피부의 환부(이는 넓은 영역일 수 있다)에 조정 가능하게 적용하며, 조정 가능하게 근원적인 미소혈관계로 운반할 수 있도록 한다. 본 발명에 따라, 담체는 펩타이드 담체 또는 비-펩타이드 폴리머 담체이며, 일반적으로 양전하로 하전된다.

담체는 참조로써 본 발명에 포함되는 WO 2008/082885에 기재된 HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 아미노산 서열과 같은 적어도 하나의 단백질 전달 도메인 또는 수송 도메인을 포함할 수 있다. 전형적인 수송 도메인들은 HIV-TAT 염기성 영역의 역(reverse) 서열(천연 HIV-TAT 단백질의 49-57 아미노산)에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. HIV-TAT 염기성 영역의 역 서열(RRRQRRKKR(서열번호: 1))은 이하에서 "역 HIV-TAT"로 언급된다.

따라서 전형적인 담체들은 그 전체가 참조로써 본 발명에 포함되는 WO 2009/015385에 기재된 펩타이드들을 포함한다. 예를 들어, 담체는 N- 또는 C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 모두에서 HIV-TAT 서열 또는 역 HIV-TAT 서열을 포함하는 양이온성 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 담체는 N- 또는 C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 모두에서 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(서열번호:2)와 같은 HIV-TAT 서열, 또는 Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg(서열번호:1)과 같은 역 HIV TAT 서열을 가질 수 있다.

일 실시태양에서, 담체는 HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 서열인 N-말단부, HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 서열인 C-말단부, 및 N-말단부 및 C-말단부 사이에 하나 이상의 양이온성 잔기들(예를 들어, Lys 또는 Arg)을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드는 N-말단부 및 C-말단부 사이에 5 내지 20 양이온성 잔기들(Lys과 같은), 약 12, 약 15, 또는 약 17과 같은 양이온성 잔기들을 가질 수 있다. 전형적인 담체들은 따라서 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-(Lys)n-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(서열번호:3), 또는 Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-(Lys)n-Gly-Arg- Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg(서열번호:4)를 포함하며, 여기서 n은 약 5 내지 약 20, 약 10 내지 약 20과 같다. 일 실시태양에서, 펩타이드의 N-말단부는 HIV-TAT 서열이며, 펩타이드의 C-말단부는 HIV-TAT 서열이다. 선택적으로, 또는 추가적으로, 담체는 N-말단부가 역 HIV-TAT 서열이고, C-말단부가 역 HIV-TAT 서열인 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 다음 아미노산 서열을 가질 수 있다: Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-(Lys)15-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(서열번호:5).

일반적으로, 담체는 특히 높은 Arg 및 Lys 잔기 함량을 가지는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 담체는 총괄하여 적어도 약 50%의 Arg 및 Lys 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%의 Arg 및 Lys 잔기를 포함할 수 있다. 이들 또는 다른 실시태양에서, 이와 같은 유도체들은 서열번호 3, 4 또는 5에 대하여 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하는 1 내지 5개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실(총괄적으로)을 가지는 서열번호 3, 4 또는 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 실시태양에서, 이와 같은 치환, 삽입, 또는 결실은 HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 서열 내에 위치한다.

담체는 약 15 아미노산 내지 약 100 아미노산 길이를 가진 펩타이드일 수 있다. 특정 실시태양에서, 담체는 약 25 내지 약 50, 또는 약 25 내지 약 40 아미노산 길이이다. 본 발명의 전형적인 실시태양에서, 담체 펩타이드는 약 35 아미노산 길이다. 담체의 길이를 다양하게 함으로써 보툴리눔 신경독소를 피부에서 다양한 침투 깊이에 운반하기 위해 담체의 길이는 디자인될 수 있다. 예를 들어, 보다 긴 폴리머 담체는 피부의 더 깊은 층으로 침투할 것이다.

본 발명과 관련된 용도에 적합한 다른 담체들은 보툴리눔 독소를 피부 장벽을 통과하여 진피의 원하는 깊이까지 전달하기 위한 양전하로 하전된 폴리머 담체를 포함한다. 이와 같은 담체들은 그 전체가 참조로써 본 발명에 포함되는 미국특허공개공보 2004/0220100 및 WO 2005/084410에 개시된 폴리머 담체를 포함한다. 이들 실시태양에서, 양전하로 하전된 폴리머 담체는 폴리머 백본(polymeric backbone)에 부착된 양전하로 하전된 분지 그룹들(branching groups)을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "양전하로 하전된"은 담체가 생리학적으로 적합한 상태(physiologically compatible conditions) 하에서 양전하를 가진 것을 의미한다.

일반적으로, 양전하로-하전된 폴리머 담체는 사슬에 생리학적 pH에서 양전하를 운반하는 그룹들을 가진, 또는 백본으로부터 확장하는 곁사슬에 부착된 양전하를 운반하는 그룹들을 가진 원자들의 선형사슬(linear chain)이다. 양전하로 하전된 백본 그 자체는 정의된 효소 생물학적 활성 또는 치료 생물학적 활성을 가질 필요가 없다. 선형 백본은 일부 실시태양에서 질소, 산소, 황, 규소 및 인으로부터 선택되는 헤테로원자들에 의해 중단되는 탄화수소 백본이다. 백본 사슬 원자들의 대부분은 탄소이다. 또한, 백본은 반복 유닛의 폴리머(예를 들어, 아미노산, 폴리(에틸렌옥시), 폴리(프로필렌아민), 폴리알킬렌이민 등)일 수 있지만, 선택적으로 헤테로폴리머일 수 있다. 일부 실시태양에서, 폴리머 백본은 양전하로 하전된 폴리펩타이드이다(예를 들어, 폴리라이신). 다른 실시태양에서, 양전하로 하전된 백본은 폴리프로필렌아민이며, 여기서 아민 질소 원자들의 수는 양전하를 운반하는 (테트라-치환된) 암모늄 그룹들로 나타난다.

양전하로 하전된 백본은 예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌이민인 폴리알킬렌이민과 같은 헤테로- 또는 호모-폴리머일 수 있는, 약 10,000 내지 약 2,500,000, 또는 약 100,000 내지 약 1,800,000, 또는 약 500,000 내지 약 1,400,000의 분자량을 가진 비-펩티드 폴리머(nonpeptidyl polymer)일 수 있다. 담체의 길이를 다양하게 함으로써 폴리머 담체의 길이는 보툴리눔 독소를 피부에서 다양한 침투 깊이에 운반하기 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 보다 긴 폴리머 담체들은 피부의 보다 깊은 층으로 침투할 것이다.

특정 실시태양에서, 백본은 양전하로 하전된 그룹들을 포함하는 부착된 다수의 곁사슬(side-chain) 모이어티들(moieties)을 가진다(예를 들어, 암모늄 그룹(ammonium groups), 피리디늄 그룹(pyridinium groups), 포스포늄 그룹(phosphonium groups), 설포늄 그룹(sulfonium groups), 구아니디늄 그룹(guanidinium groups), 또는 아미디늄 그룹(amidinium groups)). 곁사슬 모이어티들은 일관된 방법 또는 다양한 방법으로 백본을 따라서 간격을 둘 수 있다. 또한 곁사슬들의 길이는 유사하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 곁사슬은 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지며 상기-언급한 양전하로 하전된 그룹들 중 하나의 (백본으로부터 떨어진) 말단부(distal end)에서 종결되는 선형 또는 가지의 탄화수소 사슬일 수 있다.

담체 및 생물학적 활성제(예를 들어, 보툴리눔 독소) 사이의 결합은 일반적으로 이온결합, 수소결합, 반데르발스힘, 또는 이들의 조합에 의한 것과 같은 비-공유 결합에 의한다.

일부 실시태양에서, 양전하로 하전된 백본은 다수의 양전하로 하전된 곁사슬 그룹들(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 호모아르기닌 등)을 가진 폴리펩타이드이다. 바람직하게, 폴리펩타이드는 약 10,000 내지 약 1,500,000, 또는 약 25,000 내지 약 1,200,000, 또는 약 100,000 내지 약 1,000,000의 분자량을 가진다. 당업자는 아미노산들이 담체에 사용될 때, 곁사슬들이 부착 중심에서 D- 또는 L-형태(R 또는 S 배열)를 가질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 선택적으로, 백본은 펩토이드(peptoid)와 같은 폴리펩타이드의 유사체(analog)일 수 있다. 예를 들어, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem., Vol. 4:80 (1992); 및 Simon et al. Proc. Nat'l. Acad. ScL USA, Vol. 89:9367 (1992) 참조. 간단하게, 펩토이드는 곁사슬이 α-탄소 원자들 대신에 백본 질소 원자들에 부착되어 있는 폴리글라이신이다. 곁사슬들의 일부분은 양전하로 하전된 백본 구성을 제공하기 위해 양전하로 하전된 그룹에서 종결될 수 있다. 펩토이드의 합성은 예를 들어, 그 전체가 참조로써 본 발명에 포함된 미국특허 5,877,278에 서술되어 있다. 본 명세서에서 사용된 용어로, 펩토이드 백본 구조를 가지는 양전하로 하전된 백본들은 α-탄소 위치에서 천연 곁사슬을 가진 아미노산으로 이루어지지 않았으므로 "비-펩타이드"로 고려된다.

예를 들어, 다른 다양한 백본들이 폴리펩타이드들의 입체 또는 전자 모방체(steric or electronic mimics)를 채용하는데 사용될 수 있으며, 여기서 상기 펩타이드의 아마이드 결합은 에스터 결합, 티오아마이드(-CSNH-), 역 티오아마이드(-NHCS-), 아미노메틸렌(-NHCH₂-) 또는 역 메틸렌아미노(-CH₂NH-) 그룹들, 케토-메틸렌(-COCH₂-) 그룹들, 포스피네이트(-PO₂RCH₂-), 포스폰아미데이트 및 포스폰아미데이트 에스터(-PO₂RNH-), 역 펩타이드(-NHCO-), 트랜스-알켄(-CR=CH-), 플루오르알켄(-CF=CH-), 다이메틸렌(-CH₂CH₂-), 티오에테르(-CH₂S-), 하이드록시에틸렌(-CH(OH)CH₂-), 메틸렌옥시(-CH₂O-), 테트라졸(CN₄), 설폰아미도(-SO₂NH-), 메틸렌설폰아미도(-CHRSO₂NH-), 역 설폰아마이드(-NHSO₂-), 및 말로네이트를 가진 백본 및/또는 예를 들어, Fletcher et al. ((1998) Chem. Rev., Vol. 98:763) 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌들의 상세한 설명에서 검토된 젬-다이아미노-알킬 서브유닛(gem-diamino-alkyl subunits)과 같은 대체물로 교체된다. 상기 치환들의 많은 경우가 α-아미노산으로부터 형성된 백본과 비교하여 근사한 동입체 폴리머 백본(isosteric polymer backbones)을 형성한다.

상기에서 제공된 백본들 각각에서, 양전하로 하전된 그룹을 운반하는 곁사슬 그룹들이 추가될 수 있다. 예를 들어, 설폰아마이드-결합 백본들(-SO₂NH- 및 -NHSO₂-)은 질소 원자에 부착된 곁사슬 그룹들을 가질 수 있다. 유사하게, 하이드록시에틸렌(-CH(OH)CH₂-) 결합은 하이드록시 치환기에 부착된 곁사슬 그룹을 지닐 수 있다. 당업자는 양전하로 하전된 곁사슬 그룹을 제공하기 위해 일반적인 합성 방법을 사용하여 다른 결합 화학 반응들을 쉽게 개작할 수 있다.

일 실시태양에서, 양전하로 하전된 폴리머 담체는 (효율 그룹(efficiency group)으로도 언급되는) 분지 그룹들(branching groups)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용된, 효율 그룹 또는 분지 그룹은 조직 또는 세포막을 통해 양전하로 하전된 폴리머 담체의 전좌(translocation)를 증진시키는 효과를 가지는 임의의 작용제(agent)이다. 분지 그룹 또는 효율 그룹들의 비-제한적인 예들은 (서술된) HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 또는 이들의 단편들, 안테나페디아(Antennapedia)의 단백질 전달 도메인, 또는 이의 단편, 또는 -(gly)_n1-(arg)_n2(여기서, n1은 약 0 내지 약 20, 또는 0 내지 약 8, 또는 2 내지 약 5의 정수이며, n2는 독립적으로 약 5 내지 약 25, 또는 약 7 내지 약 17, 또는 약 7 내지 약 13의 홀수이다)를 포함한다.

다른 실시태양들은 (gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q(서열번호: 6), (gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q (서열번호: 7), 또는 (gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q (서열번호: 8)(여기서 p 및 q 는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수이다)의 구조식을 가지는 HIV-TAT 단편 또는 역 HIV-TAT 서열을 사용하며, 단편은 단편의 C-말단 또는 N-말단을 통해 백본에 부착되어 있다. HIV-TAT 단편들은 p 및 q가 각각 독립적으로 0 내지 약 8, 2 내지 약 5와 같은 정수들인 것을 포함한다.

양전하로 하전된 곁사슬 또는 분지 그룹은 활성을 보유하는 안테나페디아(Antp) 단백질 전달 도메인(PTD), 또는 이들의 단편일 수 있다. 이들은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, Console et al, J. Biol. Chem., Vol. 278:35109 (2003)로부터 알 수 있다.

양전하로 하전된 폴리머 담체는 전체 담체 중량의 백분율로 약 0.05 내지 약 45%, 또는 약 0.1 내지 약 30%와 같이, 적어도 약 0.05%의 양으로 양전하로 하전된 분지 그룹들을 포함할 수 있다. -(gly)_n1-(arg)_n2의 구조식을 가지는 양전하로 하전된 분지 그룹들의 경우 양은 약 0.1 내지 약 25%일 수 있다.

특정 실시태양에서, 담체의 백본 부분은 폴리라이신이며, (상기에서 설명된) 양전하로 하전된 분지 그룹들은 라이신 곁사슬 아미노 그룹들에 부착된다. 폴리라이신은 약 25,000 내지 약 1,200,000, 또는 약 100,000 내지 약 1,000,000과 같은 약 10,000 내지 약 1,500,000의 분자량을 가질 수 있다. 이는 예를 들어, MW > 70,000인 폴리라이신, 70,000 내지 150,000의 MW인 폴리라이신, MW 150,000 내지 300,000인 폴리라이신 및 MW > 300,000인 폴리라이신과 같은 임의의 상업적으로 입수 가능한 폴리라이신일 수 있다(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA). 적절한 폴리라이신의 선택은 조성물의 잔존 성분에 의존할 것이며, 전체적인 총 양전하(net positive charge)를 조성물에 제공하기에 충분할 것이며, 바람직하게 음전하로 하전된 성분들의 결합 길이의 1 내지 4배의 길이를 제공하기에 충분할 것이다.

다른 실시태양들에서, 담체는 비교적 짧은 폴리라이신 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 백본(선형 또는 분지일 수 있다)이며, 양전하로 하전된 분지 그룹들을 가진다. 이와 같은 담체들은 치료 조성물에서 수송 효율을 현저하게 감소시키는 백본들 및 보툴리눔 독소의 통제되지 않는 응집을 최소화하는데 유용할 수 있다. 담체가 비교적 짧은 선형 폴리라이신 또는 PEI 백본일 때, 백본은 약 75,000 보다 적은, 또는 약 30,000 보다 적은, 또는 약 25,000 보다 적은 분자량을 가질 것이다. 하지만 담체가 비교적 짧은 분지된 폴리라이신 또는 PEI 백본일 때, 백본은 약 60,000 보다 적은, 또는 약 55,000 보다 적은, 또는 약 50,000 보다 적은 분자량을 가질 것이다. 하지만 만약 여기에 기술된 분획제(partitioning agents)가 조성물에 포함되는 경우, 분지된 폴리 라이신 및 PEI 백본의 분자량은 약 75,000까지일 수 있는 반면, 선형 폴리라이신 및 PEI 백본의 분자량은 약 150,000까지 일 수 있다.

조성물 및 제제

본 발명 방법에 사용된 조성물은 바람직하게 유효량의 보툴리눔 독소를 포함한다. "유효량"은 유익한 또는 요구되는 임상 결과에 영향을 주기에 충분한 양을 의미한다(예를 들어, 피부에서 혈관 과민반응을 감소시키기에 충분한 양). 각 실시태양에서, 유효량은 보툴리눔 독소의 혈청타입, 사용된 독소의 형태(예를 들어, 복합체 또는 정제된 디-사슬(di-chains)), 및 일부 실시태양에서는 나이, 치료받을 질환(예를 들어, 홍조, 얼굴붉힘, 특정 서브타입의 주사), 치료받을 피부 영역의 크기, 및 증상의 심각성을 포함한 환자에 대한 개별적인 요인에 기초한다.

일부 실시태양에서, 유효량은 정제된 보툴리눔 신경독소(예를 들어, 혈청타입 A)의 약 0.1 ng 내지 약 2.0 ng이다. 유효량은 약 0.2 ng 내지 약 1.5 ng, 또는 약 0.5 ng 내지 약 1.0 ng의 정제된 보툴리눔 신경독소(예를 들어, 혈청타입 A 또는 보툴리눔 신경독소 타입 A 복합체)일 수 있다. 유효량은 치료가 필요한 부위의 크기에 따라 본 명세서에서 설명된 약 0.5 ml 내지 약 10 ml의 크림 또는 겔에 결합될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 대상 또는 환자(즉, 특정 치료가 필요한 인간 또는 다른 포유류)의 피부 또는 상피에 적용하기 위해 제제화된다. 일반적으로, 조성물은 보툴리눔 독소를 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 약학적으로 허용 가능한 희석액 또는 부형제와 함께 혼합함으로써 제조된다(상기에 기재됨). 담체 대 보툴리눔 독소의 중량비는 약 10:1 내지 약 1:10의 범위일 수 있다(예를 들어, 1:1). 비율은 각각 약 6:1 내지 약 1.5:1일 수 있다. 이와 같은 실시태양에서, 담체는 서열번호 3, 4, 또는 5의 펩타이드일 수 있다.

조성물은 피부학적 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 매질(medium)(즉, 이들이 적용될 조직에 적합한 담체, 부형제 또는 매질)을 포함하는 국소약(topical pharmaceutical) 또는 약용 화장품 조성물(cosmeceutical compositions)에서 전형적인 다른 성분들을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "피부학적 또는 약학적으로 허용가능한"은 이들 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 또는 일반적으로 심한 독성, 상반성(incompatibility), 불안정성, 알러지 반응 등이 없이 환자에 사용하기에 적합한 것으로 설명되는 조성물 또는 이의 성분을 의미한다. 적절하게, 본 발명의 방법의 사용에 적합한 조성물은 고려 하에 당업계, 특히 화장품 및 피부의학에서 일반적으로 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 다수의 소형 음이온, 바람직하게는 다가의 음이온, 예를 들어, 인산염, 아스파르트산염, 또는 시트르산염을 포함할 수 있다.

이들의 형태면에서, 국소 보툴리눔 독소 조성물은 조성물이 사용될 수 있는 피부 및 다른 조직에 적용하기 위한 용액, 에멀전(마이크로에멀전 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 파우더, 연고 또는 다른 일반적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물은 보툴리눔 독소 및 담체 뿐만 아니라, 이와 같은 생성물에 사용되는 항균제, 보습제, 및 수화제(hydration agents), 침투제(penetration agents), 방부제, 유화제, 천연 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 디터전트(detergent), 연화제, 항산화제, 방향제, 충전제(filler), 증점제(thickner), 왁스, 악취 흡수제, 염료, 착색제, 분말과 같은 다른 성분들 및 선택적으로, 마취제, 항-소양 첨가제(anti-itch additive), 식물 추출물, 컨디셔닝제(contitioning agent), 흑화제(darkening agent) 또는 미백제(lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모(mica), 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 자외선차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다

특정 실시태양에서, 조성물은 겔화제 및/또는 점도-변형제를 포함하다. 이 작용제들은 일반적으로 조성물의 점도를 증가시키기 위해 첨가되어, 조성물의 적용을 보다 용이하고 보다 정확하게 한다. 또한, 이 작용제들은 보툴리눔 독소의 활성 감소를 유발하는 경향이 있는 보툴리눔 독소/담체 수용액의 건조를 방지하는데 기여한다. 전형적인 작용제는 전하를 띠지 않고 보툴리눔 독소의 활성 또는 피부를 통과하는 독소-담체 복합체의 효율성을 방해하지 않는 작용제들이다. 겔화제는 예를 들면, 히드록시프로필셀룰로오스(HPC)와 같은, 특정한 셀룰로오스계 겔화제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 보툴리눔 독소/담체 복합체는 2-4% HPC를 갖는 조성물로 제제화된다. 선택적으로, 보툴리눔 독소/담체 복합체를 포함하는 용액의 점도는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하는 것에 의해 변화될 수 있다. 다른 실시태양에서, 보툴리눔 독소/담체 용액은 세타필(Cetaphil)？ 보습제와 같은 사전-혼합된 점도제(pre-mixed viscous agent)와 혼합될 수 있다.

특정 실시태양에서, 조성물은 폴록사머계 희석액을 추가로 포함한다. 폴록사머 희석액은 동결건조된 단백질을 희석시킬 수 있으며, 그 다음 적용되기에 충분한 점도까지 겔화시키며 한정된 피부 영역에서 남게 되는 혼성폴리머 계면활성제이다. 폴록사머는 약 10% 내지 20%, 예를 들어, 식염수(saline)에서 0.9%로 존재할 수 있다. 약 15%에서, 폴록사머는 온도-감응형(thermal-sensitive)이다. 즉, 조성물은 20℃ 이하의 온도에서 액체로 남아있을 것이며, 국소 적용을 위한 20-35℃의 범위에서 겔 생성물이 생성될 것이다.

보툴리눔 독소 조성물은 선택적으로 분획제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "분획제(partitioning agent)"는 보툴리눔 독소와 양전하로 하전된 폴리머 담체의 원치 않는 또는 제어되지 않는 응집을 방지하거나 또는 최소화하는 특성을 갖는 임의의 물질 또는 첨가제이다. 분획제는 예를 들면, 농축된 보툴리눔 독소 용액이 용적 제한(volume constraint) 때문에 사용되어야 하는 경우 특히 유용할 수 있다. 이와 같은 실시태양에서, 분획제는 보툴리눔 독소가 분산되어 유지될 수 있게 하여, 분획제가 없는 경우 일어났을 독소의 응집을 방지한다. 일반적으로, 분획제는 (1) 비-자극성(non-irritating)이고, (2) 보툴리눔 독소를 파괴하지 않으며, (3) 투과성의 증가를 부여하지 않고, (4) 신뢰할 수 있는 안정적인 입자 크기를 제공하고, (5) 전하를 띠지 않으며, (6) 독소와 폴리머 담체의 복합체를 방해하지 않는다.

적합한 분획제의 예는 에탄올(EtOH)이다. 예를 들어, EtOH는 조성물의 5% 미만과 같이, 조성물의 20% 미만으로 존재할 수 있다. 예로서, 용적 제한 때문에 2.5 ml가 아닌, 0.5 ml 용액에 100 U 보툴리눔 독소를 재구성하는 것이 요구되는 경우, 일반적으로 보툴리눔 독소는 바람직하지 않은 응집 및 따라서 활성 감소를 보일 것이라는 것을 안다. 그러나 분산제로서 1% EtOH을 첨가하는 것에 의해, 완전한 활성(full activity)은 이 농도로 24시간 후에도 유지된다. 또 다른예로서, 1.0 ml의 0.9% NaCl에서 재구성된 보톡스？는 완전한 활성을 가지며, 1% 및 5% EtOH + 0.9% NaCl의 0.5ml에서의 재구성은 완전한 활성을 갖는 용액을 생성한다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 보툴리눔 독소와 양전하로 하전된 담체의 복합체화(complexation)를 향상시키기 위해 올리고-다리(oligo-bridge) 또는 다가 음이온(polyanion) 다리가 보툴리눔 독소 조성물에 첨가된다. 이와 같은 다리는 보툴리눔 독소 복합체들이 조성물에 사용될 때 특히 유용하다. 복합체 단백질들의 일부는 양전하로 하전되고, 나머지는 음전하로 하전된다. 상기 독소의 성분들의 정확한 분포(distribution)는 독소의 기원(source)에 따라 상이하기 때문에, 특정한 기원으로부터의 보툴리눔 독소는 본 명세서에 기재된 양전하로 하전된 폴리머 담체들과의 복합체화에 대해 보다 낮은 경향을 가질 수 있다. 그러나 그와 같은 보툴리눔 독소 복합체들에 올리고- 또는 다가 음이온 다리를 첨가하는 것에 의해, 국소 투여의 효율성 및 효능이 현저하게 증가된다. 그와 같은 올리고-/다가 음이온 다리의 적합한 예들은 인산 나트륨(5%), PBS, 또는 (예를 들면, 분자량 3000의) 5% 폴리-L-아스파르트산염을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 보툴리눔 독소와 담체가 시간의 경과에 따라 제어된 방식으로 피부 상으로 방출될 수 있도록 캡슐화되거나 물질 내에 함유된 것인 제어-방출형(controlled-release) 또는 지속-방출형(sustained-release) 조성물의 제형일 수 있다. 보툴리눔 독소 및 담체는 시간의 경과에 따라 보툴리눔 독소의 방출을 제공하도록 선택되거나 및/또는 구성된 매트릭스(matrix), 리포좀, 소포(vesicle), 마이크로캡슐(microcapsule), 미세구(microsphere) 등에, 또는 고체 입자형 물질 내에 함유될 수 있다. 보툴리눔 독소 및 담체는 함께 (예를 들면, 동일한 캡슐 내에) 또는 별개로 (별개의 캡슐 내에) 캡슐화될 수 있다.

국소 조성물의 적용

조성물은 의사 또는 다른 의료 전문가의 지시에 의해 또는 지시 하에 본 발명의 방법에 따라 투여된다. 조성물은 단일 치료로 또는 시간의 경과에 따라 일련의 정기적인 치료로 투여될 수 있다. 치료의 효과는 약 3, 4, 5 또는 6개월 동안 지속될 것으로 기대된다. 따라서, 국소 조성물은 한번 투여되거나, 또는 반복하여 투여되거나, 또는 일상적(routinely)으로 투여될 수 있다. 치료의 빈도는 다양할 수 있지만, 예를 들어, 한달에 한번, 또는 일년에 2 내지 10번, 일년에 2 내지 5번일 수 있다. 치료는 비-자극성이고, 상태를 악화시키지 않기 때문에 필요하다면 1, 2, 3, 또는 4 또는 그 이상의 수 년간(more years) 장기 치료가 가능하다.

여기에서 서술된 본 발명의 방법에 따른 보툴리눔 독소의 국소 전달을 위해 상기에서 서술된 조성물이 위치 또는 효과가 요구되는 위치(예를 들어, 피부의 환부)에서 피부에 국소적으로 적용된다. 보툴리눔 독소/담체 수용액이 피부에 직접 적용되는 실시태양에서, 독소 활성의 감소를 야기할 수 있는 용액의 증발을 방지하기 위해 치료된 부위를 덮어 가리거나(cover)(예를 들어, Cetaphil？ 보습제를 이용하여) 또는 치료된 부위를 장벽(barrier)을 이용해 차단(예를 들어, Telfa)하는 것이 바람직하다. 그의 속성 때문에, 가장 바람직하게는 적용된 보툴리눔 독소의 양은 세심하게, 임의의 부작용 또는 바람직하지 않은 결과를 생성하지 않으면서 원하는 효과를 생성할 적용율 및 적용 빈도로 세심하게 적용되어야 한다. 따라서 예를 들면, 본 발명의 국소 조성물은 피부 표면의 cm² 당 약 1 U 내지 약 20,000 U,바람직하게는 약 1 U 내지 약 10,000 U 보툴리눔 독소의 비율로 적용되어야 한다. 이 범위 내에서 보다 높은 투여량은 바람직하게는 제어되는 방출 물질과 함께 이용될 수 있거나(예를 들어, 패치 등), 예를 들면, 또는 제거 전에 피부에 보다 짧은 체류 시간(dwell time)이 허용될 수 있다.

일부 실시태양에서, 혈관 과민반응을 특징으로 하는 피부 질환을 가진 환자를 치료 방법은 국소 보툴리눔 독소 조성물의 적용 전에 피부 표면을 준비하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 보툴리눔 독소/담체 조성물의 적용 전의 피부 표면의 준비는 용액의 효력을 증진시킬 수 있다. 예를 들면, 적용 전에 피부 상에서 표면 기름을 세정하기 위해 피부 표면상으로 계면활성제를 도입하면 놀라울 정도로 역효과를 초래하는데, 이는 계면활성제가 보툴리눔 독소의 활성을 파괴하는 것으로 보이기 때문이다. 보툴리눔 독소/담체 용액의 적용 전에, 세정에 뒤이어 피부가 수회 물로 세척되어도 이 역효과는 일어난다. 유아용 세정제(baby wipe)에서 발견되는 것과 같은 매우 순한 계면활성제도 이 현상을 유발하는 것으로 보인다. 따라서, 특정 실시태양에서, 피부는 물만을 이용하여 사전에 세정된다. 물 단독에 의한 세척은 또한 보툴리눔 독소의 경피 전달을 적절하게 개선하는 것으로 보인다.

키트 및 전달 장치

본 발명은 혈관 과민반응을 특징으로 하는 피부질환을 가진 환자를 치료하기 위한 경피 전달 장치(transdermal device)를 제공한다. 이와 같은 장치는 본 발명에서 서술된 보툴리눔 독소 및 담체를 포함한다. 이와 같은 장치는 피부 패치와 같은 구조로 간단할 수 있고, 또는 조성물의 분배 수단 및 상기 조성물의 분배를 모니터링하는 수단, 및 선택적으로 대상의 상태를 모니터링(예를 들면, 분배되는 물질에 대한 대상자의 반응을 모니터링)하는 수단을 포함하는 보다 복잡한 장치일 수 있다. 일 실시태양에서, 본 발명은 서술된 유효량의 보툴리눔 독소 및 담체를 포함하는 피부 패치를 제공한다.

전달 장치의 구축을 위해 바람직한 물질은 장치의 표면상에서 보툴리눔 독소의 분해 또는 보툴리눔 독소의 원치 않는 흡착을 통한, 보툴리눔 독소/담체 용액의 활성의 상실을 초래하지 않는 것들이다. 이와 같은 원치 않는 거동은 예를 들어, 수용액에 담긴 보툴리눔 독소/담체가 폴리프로필렌 표면을 접촉하는 경우에 관찰되나, 보툴리눔 독소/담체 용액이 폴리비닐 클로라이드(PVC) 표면을 접촉하는 경우에는 관찰되지 않는다.

일반적으로, 조성물은 장치에서 사전-제제화(pre-formulated)되거나 및/또는 사전-장착(pre-installed)되거나 또는 예를 들면, 두 성분(보툴리눔 독소 및 담체)를 별도로 수용하나, 적용 시 또는 적용 전에 그들을 조합하는 수단을 제공하는 키트를 이용하여 나중에 제조될 수 있다. "함께(in conjunction with)"는 두 성분들(보툴리눔 독소 및 담체)이 대상자에게 투여될 조성물에 조합되는 단계를 포함하는 배합(combination) 절차로 투여되거나 또는 두 성분들이 별개로, 그러나 보툴리눔 독소 유효량의 필요한 전달을 제공하기 위해 함께 작용하는 방식으로 투여된다는 것을 의미한다.

예를 들면, 담체를 포함하는 조성물이 먼저 환자의 피부에 적용되고, 뒤이어 보툴리눔 독소를 포함하는 피부 패치 또는 다른 장치가 적용된다. 보툴리눔 독소는 피부 패치 또는 다른 분배 장치에 건조 제형으로 포함될 수 있고, 반면에 양전하로 하전된 폴리머 담체는 상기 패치의 적용 전에 피부 표면에 크림 또는 로션으로 적용되어 상기 두 물질이 함께 작용하여 원하는 경피 전달이 이루어질 수 있다. 따라서 상기 두 물질(담체 및 보툴리눔 독소)이 조합되어 작용하거나 또는 인 시투(in situ)로 조성물 또는 조합을 형성하기 위해 상호작용한다.

따라서 본 발명은 또한 혈관 과민반응을 특징으로 하는 피부질환을 치료하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 유효량의 보툴리눔 독소, 담체, 및 본 발명에서 설명된 폴록사머 희석액과 같은 희석액을 포함한다. 일 실시태양에서, 피부질환은 주사(rosacea)이다. 일부 실시태양에서, 보툴리눔 독소는 키트에서 다른 성분들과는 별도로 패키징될 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소는 담체 및/또는 희석액과는 달리 동결건조되고, 분리된 바이알(vial)에서 보관될 수 있다. 다른 실시태양에서, 보툴리눔 독소는 장치(예를 들어, 피부 패치) 내에 패키징된다.

또 다른 실시태양에서, 양전하로 하전된 폴리머 담체는 환자의 피부 또는 상피로 적용하기 위해 액체, 겔, 크림 등으로 사전-제제화된다. 특정 실시태양에서, 키트는 보툴리눔 독소를 양전하로 하전된 폴리머 담체 및 희석액와 혼합하고, 국소 혼합물을 환자 피부의 환부에 적용하기 위해 추가로 기구들 및/또는 애플리케이터(applicator)를 포함할 수 있다.

다른 실시태양에서, 키트는 신경독소 치료 중에 또는 치료 이후에 치료된 부위를 유지하기 위한 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 치료 이후 과도한 보툴리눔 독소 조성물을 제거하기 위한 순한 피부 클렌저(들)(gentle skin cleanser(s)), 발적 저감 로션(redness reduction lotion), 하나 이상의 추가적인 주사의 국소 치료제, 및/또는 SPF 15 이상을 가진 자외선 차단 제품을 포함할 수 있다.

예를 들어, 재직 중(in-office) 치료들 사이에, 환자들은 후 국소 신경독소 치료 시스템(the after topical neurotoxin treatment system) 또는 치료된 부위를 유지하기 위한 키트를 제공받을 수 있다. 키트는 (환자들이 아침 및/또는 저녁에 적용할 수 있는) 순한 피부 클렌저, 순한 피부 클렌저 이후에 적용될 수 있는 국소 발적 저감 로션(예를 들어, Eucerin？ 안티-발적 시스템 또는 다른 감초(licorice)를 포함하는 로션), 및 (낮 동안 치료된 부위를 보호하기 위한) SPF 15 이상의 광범위 스펙트럼 자외선 차단제를 포함한다. 저녁에 환자는 순한 클렌저를 사용하여 다시 세정할 것이며, 예를 들어, 메트로니다졸 겔(metronidazole gel)(0.75% 내지 1.0%의 USP 범위)과 같은 하나 이상의 국소 주사 치료제의 국소 투여가 뒤따른다.

다음 예들은 본 발명의 다양한 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다.

실시예

실시예 1: 보툴리눔 신경독소의 국소 제제

전형적인 제제는: 최소화된 면역원성을 가지며, 동물 또는 인간 성분들을 포함하지 않는 정제된 150 kDa 보툴리눔 독소 타입 A; 보툴리눔 독소의 경피성 전달을 진피까지 가능하게 해주는 담체 펩타이드(R-K-K-R-R-Q-R-R-R-G-(K)₁₅-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R 서열번호:5); 및 담체를 위한 부형제 역할을 하는 폴록사머계 희석액을 포함한다.

보툴리눔 독소는 발효 배양(fermentation culture)에서 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)(혈청타입 A - Hall 균주)에 의해 생산되며, 100-kDa의 중쇄 및 50-kDa의 경쇄로 이루어진 완전히 활성인(fully active) 디-사슬(di-chain)은 배지(culture medium)로부터 정제된다. 상업적으로 이용 가능한 BOTOX？ Cosmetic(Allergan)과는 달리, 정제된 150 kDa 신경독소는 임의의 세균-유래 부속 단백질(bacterially-derived accessory proteins)과 연관되지 않거나, 또는 인간 혈청 알부민, 헤마글루티닌, 또는 다른 모아진(pooled) 인간-유래 성분들에 제제화되지 않는다.

정제된 보툴리눔 신경독소는 펩타이드 담체와 약 1:1의 중량비로 조합되고, 인산염 완충된 식염수로 200 μL까지 희석된다. 상기 결과 혼합물은 1.8 mL의 폴록사머계 희석액(예를 들어, Pluronic？ F127, NF Grade, BASF Corp.)와 조합되었다. 폴록사머 희석액은 동결건조된 단백질을 희석시킬 수 있으며, 그 다음 적용되기에 충분한 점도까지 겔화시키며 한정된 피부 영역에서 남게 되는 혼성폴리머 계면활성제이다. 약 15%에서(0.9% 식염수와 함께), 폴록사머는 온도-감응형(thermal-sensitive)이다. 즉, 조성물은 20℃ 이하의 온도에서 액체로 남아있을 것이며, 국소 적용을 위한 20-35℃의 범위에서 겔 생성물이 생성될 것이다.

실시예 2: 국소 보툴리눔 신경독소 조성물을 이용한 안면 홍조의 치료

안면 홍조의 치료를 위해, 1 나노그램의 동결건조된 보툴리눔 신경독소 타입 A를 함유한 바이알이, 펩타이드 담체 및 폴록사머계 희석액을 함유하는 액체 희석제를 포함하는 두 번째 바이알과 함께 혼합되었다(실시예 1 참조). 성분들은 환부(예를 들어, 환자의 볼 및 코 주름(nasal fold) 부위)에 국소적으로 적용되는 미끄러운 점성 겔을 형성하도록 함께 혼합되었다.

치료 2주 이내, 환자는 예를 들어, 휴식 및 운동 시에 안면 홍반에 상당한 개선이 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 치료 이후, 홍조는 전체적인 치료 부위에서 단지 약간 인지할 수 있을 뿐이었다. 작은 모세혈관혈관확장증은 국소 보툴리눔 신경독소 겔을 이용한 치료 이후 단지 약간 인식할 수 있을 뿐이었다. 또한 주사 가능한 보툴리눔 신경독소를 사용하는 경우 나타나는 이상반응으로 보고된 볼처짐(cheek droop)의 눈에 띠는 징후는 없었다. 결과들은 2 개월 이상 지속되었다.

실시예 3: 국소 보툴리눔 신경독소 조성물을 이용한 주사( rosacea )의 치료

보통의 부음(moderate swelling), 홍반 및 얼굴 중심부의 구진을 함께 포함하는 주사의 치료를 위해 1.2 나노그램의 동결건조된 보툴리눔 신경독소 타입 A가 담체 펩타이드 및 폴록사머계 희석액과 함께 혼합되었다(실시예 1). 조성물은 국소적으로 환자의 얼굴 중심의 모든 환부에 적용되었다.

치료 약 3일 후 경에, 피부질환이 빠르개 개선되었다. 국소 보툴리눔 신경독소 겔의 두 번째 적용이 이후 약 4주 동안 적용되었고, 피부의 상태는 계속하여 개선되었다. 두 번째 치료 4개월 이후, 환자는 주사 증상(확장된 혈관, 구진)이 거의 개선된 상태를 유지하였다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허, 및 특허출원은 아래 나열된 것들과 함께 그 전체가 모든 목적을 위해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

참조 문헌

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Claims

환자 피부의 환부(들)에, 피부의 미소혈관계에서 혈관확장을 감소시키기 위한 유효량의 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin), 및 보툴리눔 독소를 피부의 미소혈관계로 운반하기 위한 담체를 포함하는 국소 조성물
을 적용하는 것을 포함하는 피부 혈관 과민반응을 특징으로 하는 피부질환을 가진 환자를 치료하는 방법.
제 1 항에 있어서,
질환은 홍조(flushing) 또는 얼굴붉힘(blushing)인 것인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
환자는 주사(rosacea)를 가진 환자인 것인 방법.
제 3 항에 있어서,
주사는 홍반성혈관확장성 주사(erythematotelangiectatic rosacea), 구진농포성 주사(papulopustular rosacea), 비류성 주사(phymatous rosacea), 및/또는 안구 주사(ocular rosacea) 중 하나 이상인 것인 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
환자는 홍반(erythema), 홍조(flushing), 얼굴붉힘(blushing), 모세혈관혈관확장증(telangiectasias), 구진(papules), 농포(pustules), 비류(rhinophyma), 작열감(burning sensations), 및 가려움(itching sensations)으로부터 선택되는 하나 이상의 주사 증상을 가진 것인 방법.
제 3 항에 있어서,
환자는 주사를 가지나, 비류를 가지지는 않는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 100 kDa의 중쇄 및 50 kDa의 경쇄를 가진 정제된 보툴리눔 신경독소인 것인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 약 450 kDa 내지 약 900 kDa 범위의 분자량을 가진 정제된 보툴리눔 신경독소 복합체인 것인 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 할 균주(Hall Strain)로부터 유래한 것인 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 타입 A-생산 균주로부터인 것인 방법.
제 10 항에 있어서,
타입 A-생산 균주는 타입 A1, 타입 A2, 또는 타입 A3인 것인 방법.
제 8 항에 있어서,
복합체는 교토-F(Kyoto-F) 또는 NCTC 2916 균주의 타입 A2 또는 타입 A3 보툴리눔 신경독소 유전자 클러스터로 구성되는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 타입 A, 타입 B, 또는 타입 C인 것인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소는 클로스트리디아(Clostridia) 박테리아에 의해 생산되거나 또는 재조합에 의해 생산되는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
담체는 양전하로 하전된 펩타이드 담체 또는 양전하로 하전된 비-펩타이드 폴리머 담체인 것인 방법.
제 15 항에 있어서,
담체는 적어도 하나의 단백질 수송 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
제 16 항에 있어서,
단백질 수송 도메인은 HIV-TAT 염기성 영역(basic region) 또는 역(reverse) HIV-TAT 염기성 영역 아미노산 서열인 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
단백질 수송 도메인은 서열번호 1의 역 HIV-TAT 아미노산 서열인 것인 방법.
제 17 항에 있어서,
담체는 N- 또는 C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 모두에서 HIV-TAT 염기성 서열(서열번호 2) 또는 역 HIV-TAT 염기성 서열(서열번호 1)을 포함하는 것인 방법.
제 19 항에 있어서,
담체는 HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 염기성 서열인 N-말단부, HIV-TAT 또는 역 HIV-TAT 염기성 서열인 C-말단부, 및 N-말단부 및 C-말단부 사이에 하나 이상의 양이온성 잔기들을 포함하는 것인 방법.
제 20 항에 있어서,
양이온성 잔기들은 아르기닌 및/또는 라이신인 것인 방법.
제 20 항에 있어서,
양이온성 잔기들은 각각 라이신인 것인 방법.
제 20 항, 제 21 항, 또는 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
담체는 N-말단부 및 C-말단부 사이에 약 5 내지 약 20의 양이온성 잔기들을 가지는 것인 방법.
제 23 항에 있어서,
담체는 N-말단부 및 C-말단부 사이에 약 12, 약 15, 또는 약 17의 양이온성 잔기들을 가지는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
담체는 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-(Lys)n-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(서열번호 3), 또는 Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-(Lys)n-Gly-Arg-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg(서열번호 4)이며, 여기서 n은 약 5 내지 약 20인 것인 방법.
제 25 항에 있어서,
n은 약 10 내지 약 20인 것인 방법.
제 25 항에 있어서,
담체는 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-(Lys)15-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(서열번호 5)인 것인 방법.
제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
담체는 약 15 아미노산 내지 약 100 아미노산 길이를 가진 펩타이드인 것인 방법.
제 28 항에 있어서,
담체는 약 25 내지 약 50 아미노산 길이를 가진 펩타이드인 것인 방법.
제 28 항에 있어서,
담체는 약 25 내지 약 40 아미노산 길이를 가진 펩타이드인 것인 방법.
제 15 항에 있어서,
담체는 폴리머 백본(polymeric backbone)에 부착된 양전하로 하전된 분지 그룹들(branching groups)을 포함하는 폴리머 담체인 것인 방법.
제 31 항에 있어서,
백본은 폴리(에틸렌옥시), 폴리(프로필렌아민), 폴리(알킬렌이민)으로부터 선택되는 반복 유닛들의 폴리머인 것인 방법.
제 31 항에 있어서,
폴리머는 헤테로폴리머인 것인 방법.
제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
백본은 약 10,000 내지 약 2,500,000의 분자량을 가진 것인 방법.
제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
분지 그룹들은 암모늄 그룹(ammonium groups), 피리디늄 그룹(pyridinium groups), 포스포늄 그룹(phosphonium groups), 설포늄 그룹(sulfonium groups), 구아니디늄 그룹(guanidinium groups), 및 아미디늄 그룹(amidinium groups)으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
제 15 항에 있어서,
담체는 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 및 호모아르기닌으로부터 선택되는 아미노산을 가진 양이온성 폴리펩티드인 것인 방법.
제 36 항에 있어서,
폴리펩티드는 약 10,000 내지 약 1,500,000의 분자량을 가지는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
보툴리눔 신경독소의 유효량은 정제된 보툴리눔 신경독소 약 0.1 ng 내지 약 2.0 ng인 것인 방법.
제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 희석액을 추가로 포함하는 것인 방법.
제 39 항에 있어서,
담체 및 보툴리눔 독소는 희석액에 약 10:1 내지 약 1 : 10의 중량비 범위로 용해되는 것인 방법.
제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 용액, 에멀전, 현탁액, 크림, 로션, 또는 겔인 것인 방법.
제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 겔화제(gelling agent) 및/또는 점도 조절제(viscosity-modifying agent)를 포함하는 것인 방법.
제 42 항에 있어서,
겔화제 또는 점도 조절제는 폴록사머계 희석액(poloxamer-based diluent)인 것인 방법.
제 43 항에 있어서,
폴록사머계 희석액은 약 10 부피% 내지 20 부피%로 존재하는 것인 방법.
제 43 항에 있어서,
폴록사머계 희석액은 약 16 부피%로 존재하는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 한 번 적용되거나, 또는 일주일에 한 번, 격주에 한 번, 한달에 한 번, 또는 일년에 2 내지 10회의 섭생으로 적용되는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 피부 패치 또는 키트.
보툴리눔 신경독소, 순한 클렌저(gentle cleanser), 발적 저감 시스템(redness reduction system), SPF 15 이상의 풀 스펙트럼 자외선 차단제(full spectrum sunscreen), 및 메트로니다졸 겔(metronidazole gel)을 함유하는 키트.