ES2890675T3 - APC para uso en el tratamiento de cicatrices cutáneas anormales - Google Patents

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Abstract

Una proteína C activada (APC) o análogo de la misma para uso en minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica en un individuo, que comprende poner en contacto una cicatriz patológica con una cantidad terapéuticamente efectiva de APC o análogo de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN
APC para uso en el tratamiento de cicatrices cutáneas anormales
Campo de la invención
La invención se refiere a cicatrices cutáneas anormales, incluidas cicatrices hipertróficas, atróficas y queloides, y al tratamiento de las mismas.
Antecedentes de la invención
La referencia a cualquier estado de la técnica en la memoria descriptiva no es un reconocimiento o sugerencia de que este estado de la técnica forma parte del conocimiento general común en cualquier jurisdicción o que se pueda esperar razonablemente que este estado de la técnica se entienda, considere relevante y/o se combine con otras piezas de la técnica anterior por un experto en la materia.
En el adulto, la respuesta normal a la lesión es generalmente la reparación de la herida, un proceso fisiológico que da como resultado cierto grado de fibrosis, conduciendo a la formación de tejido cicatricial. Aunque quizás sea una imperfección cosmética, está ampliamente aceptado que el tejido cicatricial que surge de la reparación de heridas es de hecho una formación de tejido normal.
Histológicamente, el tejido cicatricial que surge de un proceso normal de reparación de heridas aparece como una matriz extracelular parvicelular, casi avascular, densa, compuesta predominantemente de colágeno tipo I. La distribución y el alineamiento del colágeno tipo I pueden ser diferentes a las del tejido antes de la lesión, y en particular el tejido cicatricial puede tener un alineamiento más pronunciado del colágeno tipo I en una sola dirección en comparación con el colágeno depositado en el tejido antes de la lesión. Además, puede haber un entrecruzamiento más extenso entre las fibras de colágeno en una cicatriz en comparación con el observado en el tejido antes de la lesión.
La formación de cicatrices fisiológicas se ha descrito clásicamente como la siguiente a tres fases distintas que consisten en una fase inicial en la que se forma un coágulo de fibrina, una fase intermedia en la que se lisa el coágulo de fibrina y se deposita una matriz temporal que consiste en proteoglicano, glicoproteína y colágeno tipo III abajo, y una fase final en la que la fase temporal se digiere y se sustituye por una matriz rica en colágeno tipo I. Factores locales, tales como el tipo, el tamaño y la ubicación de la herida, el suministro vascular a la herida, la presencia de infección, el movimiento local y la exposición a la radiación y la luz UV, influyen en la reparación de la herida y, por lo tanto, en la formación de cicatrices fisiológicas. Factores sistémicos que incluyen el estado del rendimiento cardiovascular, la infección, el estado metabólico y las hormonas también influyen en la formación de cicatrices fisiológicas.
En general, se acepta que una respuesta fisiológica normal a una lesión es un proceso de reparación de la herida que se completa con evidencia de depósito de colágeno tipo I aproximadamente a las 3 a 4 semanas de la lesión. Una prolongación del proceso de reparación de la herida más allá de este tiempo aumenta la probabilidad de formación de una cicatriz patológica en lugar de una cicatriz fisiológica (Momtazi et al. 2013 Wound Repair and Regeneration 21: 77-87).
Una cicatriz patológica puede denominarse un trastorno de la piel resultante de una proliferación desregulada o de la formación de tejido fibrótico. Ejemplos particulares incluyen cicatrices hipertróficas, cicatrices atróficas y cicatrices queloides. Las cicatrices patológicas son de particular preocupación porque pueden causar una desfiguración cosmética más significativa y limitaciones funcionales que incluyen dolor, prurito, intolerancia al calor, intervalo de movimiento reducido y discapacidad de por vida para las contracturas.
Si bien existen algunas diferencias claras entre las cicatrices hipertróficas, las cicatrices atróficas y las cicatrices queloides, generalmente se cree que las cicatrices patológicas surgen generalmente de la señalización anormal y la proliferación de células, especialmente fibroblastos y miofibroblastos.
Además, el equilibrio entre TGF-p1 y TGF-p3 es un regulador importante de la formación de cicatrices. El aumento o la actividad prolongada de TGF-p1 conduce a una sobreproducción y a un depósito excesivo de colágeno por los fibroblastos que a menudo resulta en cicatrices hipertróficas (Abdou et al. 2011 Am J Dermatopathol. 33: 84-91; Honardoust et al. 2012, J. Burn Care Res. 33: 218-227; Chalmers 2011 Int Wound J 8: 218-223).
Se ha encontrado una sobre-expresión de TGF-p1 y p2 en fibroblastos queloides y derivados de queloides, con una expresión de ARNm de TGF-p3 significativamente menor (Lee TY et al. Ann Plast Surg. 1999; 43: 179-84; Xia W et al. Wound Repair Regen. 2004; 12:546-56). Se ha demostrado que los anticuerpos anti-TGF-p1 y p2 pueden reducir la cicatrización de heridas en heridas de incisión en ratas (Shah, M. et al., J Cell Sci 107: 1137-57, 1994). Los oligonucleótidos de fosforotioato antisentido contra TGF-p1 y p2 se han utilizado in vivo para reducir significativamente las cicatrices posoperatorias en modelos de conejo y ratón de cirugía de glaucoma (Cordeiro MF, et al. Gene Ther. 2003; 10:59-71). La adición de TGFp1 a una herida fetal de rata que normalmente sanaría sin una cicatriz da como resultado la formación de cicatrices (Lin RY et al. Ann Surg. 1995; 222 (2): 146-154). Se ha demostrado que otros fibroblastos queloides son hipersensibles al TGF-p (Bettinger et al. 1996 Plast Reconstr Surg 98:827-833). Los embriones de ratones que son genéticamente nulos para TGFp3 se curan con una cicatriz en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje, que exhiben una curación sin cicatrices (Occleston NL et al. J Biomater Sci Polym Ed. 2008; 19(8): 1047-63). En tres estudios doble ciego controlados con placebo, el TGFp3 recombinante humano intradérmico, avotermina mejora la apariencia de cicatrices (Bush J et al. Dermatol Res Pract. 2010; 2010:690613).
Los estudios anteriores sugieren que es la expresión persistente de los receptores de TGF y/o TGF-p1 y/o la falta de TGF-p3 lo que se asocia con la prolongación de la reparación de la herida que conduce a la formación de una cicatriz patológica. Además, también se entiende que la expresión de TGF-p1 es relevante para la persistencia de cicatrices patológicas que han surgido de un proceso prolongado de reparación de heridas. Esto se deriva del hecho de que muchas de las modalidades utilizadas en la clínica hoy en día para el tratamiento de cicatrices hipertróficas fijan como objetivo el propio TGF-p1.
Se han utilizado con cierto éxito corticosteroides, metotrexato, interferón a y p y algunos inhibidores de citocinas para el tratamiento de cicatrices hipertróficas y queloides. Los corticosteroides se consideran un criterio estándar y se entiende que inhiben el crecimiento de fibroblastos y fomentan la degradación del colágeno (McCoy et al. 1980 Proc Soc Exp Biol Med 163: 216-222.). La triamcinolona es un ejemplo de un corticosteroide que inhibe la expresión de TGF-p1 e induce la apoptosis en fibroblastos (Xu et al. 2009 Chinese J. Plastic Surg 25:37-40).
La terapia con corticosteroides puede resultar en efectos secundarios no deseados de atrofia de la cicatriz, pigmentación tisular y dolor. La terapia con interferón puede provocar fiebre, dolor de cabeza, artralgia, fatiga, escalofríos y confusión (al Khawajah 1996 Int. J. Dermatol. 35: 515-517), y hay dudas sobre la eficacia general (Ledon et al. 2013 Dermatol Surg 39:1745-1757.).
Otras modalidades propuestas para el tratamiento de cicatrices patológicas son diversas con respecto a la química y el mecanismo de acción que proponen fijar como objetivo. Estos incluyen toxina botulínica A, pentoxifilina, minociclina, copolímeros de colágeno-glicosaminoglicano, TGF p3 recombinante, manosa-6-fosfato, interleucina-10, insulina y propranolol (Ledon supra).
Sigue existiendo la necesidad de minimizar la probabilidad de formación de cicatrices patológicas, en particular para minimizar la probabilidad de formación de cicatrices hipertróficas.
También existe la necesidad de tratar cicatrices patológicas como cicatrices hipertróficas.
El documento WO 2014/005183 describe métodos para usar una cantidad eficaz de proteína C activada (APC) para tratar a un individuo por un trastorno de la piel caracterizado por la presencia de queratinocitos hiperproliferativos. El documento WO 02/100445 describe un método y un medicamento para fomentar la cicatrización de heridas en un sujeto. El documento WO 01/72328 describe métodos de tratamiento de enfermedades con APC. Le et al. (PLoS One (2012) 7 (10): e48040) describe que se requiere TGFp3 para la reparación de heridas por escisión en vivo. McCollum et al. (Br. J. Surg. (2011) 98(7):925-934) describe un ensayo clínico aleatorizado de fase II de avotermina frente a placebo para la mejora de la cicatriz. Ledon et al. (Dermatol. Surg. (2013) 39(12):1745-1757) revisa el tratamiento intralesional de los queloides y las cicatrices hipertróficas.
Sumario de la invención
La invención busca abordar una o más limitaciones de la técnica anterior. En el presente documento se describe un método para inducir a una célula de la piel, tal como un fibroblasto o queratinocito, a expresar o producir TGF-p3. Se describe, además, un método para inhibir la expresión o producción de TGF-p1 por una célula de la piel.
La invención proporciona una proteína C activada (APC) o un análogo de la misma para su uso en minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica en un individuo, que comprende poner en contacto una cicatriz patológica con una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o análogo de la misma. También se describe un método para inhibir o prevenir la formación de una cicatriz patológica, especialmente una cicatriz hipertrófica. También se describe un método para minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica. Estos métodos utilizan proteína C activada (APC) o análogos de la misma que incluyen APC-3K3A para inducir la producción de TGF-p3 o para inhibir la inducción de TGF-p1, permitiendo así la inhibición de la formación de cicatrices patógenas y la minimización de la aparición de una cicatriz patológica.
Otros aspectos de la presente invención y realizaciones adicionales de los aspectos descritos en los párrafos precedentes resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción, dada a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: La producción de TGF-p1 y TGF-p3 por queratinocitos humanos tratados con APC.
Figura 2: La producción de TGF-p1 y TGF-p3 por fibroblastos humanos tratados con APC-3K3A.
Figura 3: (SEC ID No: 1): secuencia de aminoácidos de APC-3K3A.
Descripción detallada de las realizaciones
La proteína C activada (APC) es la forma activada de la proteína C (también conocida como autoprotrombina IIA y factor de coagulación sanguínea XIV) que desempeña un papel importante en la regulación de la coagulación sanguínea, la inflamación, la muerte celular y el mantenimiento de la permeabilidad de las paredes de los vasos sanguíneos en seres humanos y otros animales. APC realiza estas operaciones principalmente inactivando proteolíticamente las proteínas Factor Va y Factor Villa.
Como se describe en el presente documento, los inventores han identificado que APC y APC 3K3A tienen influencias comunes sobre la producción de células de la piel de diversas isoformas de TGF-p.
Específicamente, los inventores han demostrado que tanto APC como APC 3K3A potencian la producción de TGF-p3 en las células de la piel. Se demostró que las células que expresaron constitutivamente TGF-p3 tenían una mayor producción de TCF-p3 por contacto con APC o APC 3K3A en comparación con los controles no tratados. Es importante destacar que la producción de TGF-p1 no mejoró sustancialmente en células de la piel tratadas con APC o APC-3K3A.
Se cree que el gran aumento en la producción o expresión de TGF-p3 (hasta 6 veces con respecto a las células cutáneas tratadas con APC-3K3A en comparación con controles no tratados) es importante para minimizar la formación de cicatrices patológicas o para el tratamiento de cicatrices patológicas, independientemente de la cantidad de producción o expresión de TGF-p1.
Además, la expresión constitutiva de TGF-p1 se inhibió cuando cesó la producción de TGF-p3 de células de la piel potenciada por APC. Además, la inhibición de la expresión constitutiva de TGF-p1 en células de la piel tratadas con APC no inhibió la expresión constitutiva de TGF-p3.
A partir de las observaciones anteriores, los inventores han identificado la utilidad de APC y APC-3K3A en la mejora selectiva de la expresión constitutiva o producción de TGF-p3 por células de la piel, tales como fibroblastos, miofibroblastos, queratinocitos y células endoteliales, o una composición que incluye una o más de estas células, y la inhibición selectiva de la expresión constitutiva o la producción de TGF-p1 por las células de la piel. Sobre la base de estos hallazgos, y la importancia conocida de las isoformas de TGF-p1 y TGF-p3 en la reparación de heridas y la persistencia de cicatrices patógenas, los inventores han identificado APC y análogos de APC como APC-3K3A como potenciales modalidades para minimizar la probabilidad de formación de cicatrices patológicas y para minimizar la apariencia de cicatrices patológicas.
A. Definiciones
El término "comprender" y variaciones del término, tales como "que comprende”, "comprende" y "compuesto", no pretenden excluir otros aditivos, componentes, números enteros o pasos.
Una 'cicatriz normal' o 'cicatriz fisiológica’ es generalmente una formación de tejido que surge de un proceso normal de reparación de heridas. Histológicamente, una cicatriz normal o fisiológica puede aparecer como una matriz extracelular parvicelular densa, casi avascular, compuesta predominantemente de colágeno tipo I.
"Cicatriz patológica" se refiere generalmente a una cicatriz que surge de un procesamiento anormal de reparación de heridas, por ejemplo, un proceso de reparación de heridas que se ha ampliado o prolongado, lo que conduce a una formación tardía de la matriz temporal o final, o un fallo en la producción de cualquiera de las matrices. El proceso ampliado de reparación de heridas puede estar asociado con una inflamación significativa o prolongada. Estas cicatrices pueden distinguirse histológicamente de las cicatrices normales por la presencia de haces de colágeno hialinizados en espiral y por tener una mayor vascularización y celularidad que una cicatriz normal. Una cicatriz patológica puede ser una cicatriz que está confinada dentro de los límites del sitio de la lesión o que se extiende más allá de esos límites. Una cicatriz patológica puede causar un intervalo de movimientos reducido y una discapacidad de por vida a la contractura, desfiguración cosmética significativa y limitaciones funcionales que incluyen dolor, prurito e intolerancia al calor.
"Formación de cicatrices patológicas" se refiere generalmente a un proceso por el cual se forma una cicatriz patológica. En un proceso de este tipo, se altera al menos una de las fases normales de la reparación de la herida que normalmente conduciría a la formación de una matriz temporal o final. Un proceso de este tipo puede conducir a un retraso en el cierre de una herida por la cicatriz patológica. En este sentido, el proceso por el cual se forma la cicatriz patológica puede representar una ampliación o prolongación de un proceso normal de reparación de heridas, aunque se entiende que los mecanismos de acción que sustentan la formación de una cicatriz patológica no son los mismos que los que sustentan una cicatriz fisiológica normal en respuesta a la lesión en forma de reparación de heridas.
"Un trastorno fibroproliferativo" se refiere generalmente a un trastorno que implica la proliferación anormal de fibroblastos y fibrocitos, o un nivel anormal de actividad de fibroblastos y fibrocitos, incluido el desarrollo de un perfil de citocinas anormal por fibroblastos o fibrocitos, que conduce a la formación de tejido fibrótico excesivo.
"Una cicatriz hipertrófica" es un ejemplo de una cicatriz patológica y es una cicatriz elevada que permanece dentro de los límites de la lesión original, generalmente retrotrayéndose espontáneamente después de la lesión inicial. Estas cicatrices son duras, elevadas, rojas, pican, sensibles y están contraídas. Estas cicatrices se ven después de una lesión por quemadura y se agrandan al presionar el límite de la cicatriz. Una cicatriz hipertrófica puede contener fibroblastos que no son proliferativos y un subconjunto menor que prolifera rápidamente y demuestra una síntesis activa. Histológicamente, una cicatriz hipertrófica puede presentarse como haces de colágeno tipo III finos, bien organizados y ondulados orientados paralelos a la superficie de la epidermis con abundantes nódulos que contienen miofibroblastos y mucopolisacárido abundante, con niveles bajos de PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes)/nivel de p53/expresión de ATP. Una cicatriz hipertrófica puede surgir dentro de las 4 a 8 semanas posteriores a la lesión, entrar en una fase de crecimiento rápido hasta durante 6 meses y luego retrotraerse en unos pocos años.
Un "queloide" o una "cicatriz queloide" es una proliferación fibrosa benigna que se extiende más allá del límite de la herida inicial o el sitio de la lesión. Son cicatrices permanentes que no se retrotraen. Histológicamente, estas cicatrices pueden presentarse como haces de colágeno hipocelular de tipo I y III desorganizados, grandes y gruesos, sin nódulos o con exceso de miofibroblastos. Pueden estar poco vascularizados con vasos sanguíneos dilatados muy dispersos. Los niveles de expresión de PCNA/nivel de p53/ATP pueden ser altos.
Una "cicatriz atrófica" es una cicatriz que surge de un proceso anormal de reparación de heridas que conduce a la formación de una depresión en el tejido de la piel.
"Fibroblasto" es generalmente una célula de origen mesodérmico que produce precursores de la matriz extracelular. Estas células son esenciales para la reparación de heridas.
"Fibroblasto del lecho de la herida"es un fibroblasto que puede aislarse de un sitio de lesión o adyacente a él que se somete a una reparación normal de la herida.
"Fibroblasto queloide"es un fibroblasto que puede estar aislado o adyacente a un queloide.
"Fibroblasto de cicatriz hipertrófica"es un fibroblasto que puede estar aislado o adyacente a una cicatriz hipertrófica "Miofibroblasto" se refiere generalmente a una célula que se encuentra entre un fibroblasto y una célula de músculo liso en diferenciación. Los miofibroblastos normalmente se tiñen para el filamento intermedio vimentina, que es un marcador mesenquimatoso general y "alfa actina del músculo liso". Son positivos para otros marcadores lisos como otro tipo de filamento intermedio, desmina, positivo en algunos tejidos, pero pueden ser negativos para desmina en otros. Algunos miofibroblastos en forma estrellada también pueden ser positivos para GFAP.
"Queratinocito" se refiere generalmente a una célula epidérmica que sintetiza queratina y otras proteínas y esteroles. Estas células constituyen el 95% de la epidermis y se forman a partir de células indiferenciadas o basales en la unión dermoepidérmica. Su proteína de filamento intermedio característica es la citoqueratina. En sus diversas etapas sucesivas, la queratina forma la capa de células espinosas y la capa de células granulares, en las que las células se aplanan y mueren lentamente para formar la capa final, el estrato córneo, que se exfolia gradualmente. "Células endoteliales" se refiere generalmente a las células que forman el endotelio. El endotelio es la capa delgada de células que recubre la superficie interior de los vasos sanguíneos y linfáticos, formando una interfaz entre la sangre o la linfa circulante en la luz y el resto de la pared del vaso.
"Proteína C activada" ("APC") es una serina proteasa que tiene un peso molecular de aproximadamente 56 kD que desempeña un papel central en la anticoagulación fisiológica. El precursor inactivo, la proteína C, es una glicoproteína dependiente de la vitamina K sintetizada por el hígado y el endotelio y se encuentra en el plasma. La activación de la proteína C se produce en la superficie de las células endoteliales y se desencadena por un complejo formado entre la trombina y la trombomodulina. Se ha demostrado que otra proteína de membrana endotelial específica, el receptor de proteína C endotelial (EPCR), acelera esta reacción más de 1000 veces.
El 'análogo' en la expresión "APC o un análogo del mismo", se refiere a un "análogo de APC". Un análogo de APC es un compuesto que puede actuar a través del receptor de proteína C endotelial (EPCR) y el receptor activado por proteasa - 1 (PAR-1), o el PAR-1 y el receptor activado por proteasa -3 (PAR-3), para minimizar la apoptosis, o para aumentar la supervivencia celular en células estresadas o lesionadas. Como se describe adicionalmente en el presente documento, análogos de APC tienen una secuencia que es homóloga a la secuencia de la proteína C humana.
"Tratando" y "tratamiento" se refiere generalmente al tratamiento y cuidado de un paciente con el propósito de combatir una enfermedad, afección o trastorno, ya sea para eliminar la enfermedad, afección o trastorno, o de manera profiláctica para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección patológica o trastorno.
B. Inducción por APC de la expresión de TGF-b3
Se describe un método para inducir la expresión o producción de TGF-p3 por parte de una célula de la piel, que incluye las etapas de poner en contacto una célula de la piel con APC o APC-3K3A; induciendo así la expresión o producción de TGF-p3 por parte de la célula de la piel.
La célula de la piel puede expresar o producir de forma constitutiva TGF-p3.
La célula de la piel puede expresar o producir de forma constitutiva TGF-p1.
La célula de la piel puede ser un fibroblasto, un miofibroblasto, un queratinocito o una célula endotelial.
En los casos en los que la célula de la piel es un fibroblasto, puede consistir en un fibroblasto del lecho de la herida, un fibroblasto queloide y un fibroblasto cicatricial hipertrófico.
Típicamente, el contacto de la célula de la piel con APC o APC3K3A potencia la expresión o producción del TGF-p3 por parte de la célula de la piel; por ejemplo, aumenta la expresión o producción de TGF-p3 por parte de la célula de la piel, de modo que la expresión o producción de TGF-p3 por parte de la célula de la piel es mayor que la expresión o producción de TGF-p3 por parte de la célula de la piel no tratada.
Por lo tanto, se describe en el presente documento un método para potenciar la expresión o producción constitutiva de TGF-p3 por parte de una célula de la piel, tal como un fibroblasto, un miofibroblasto, un queratinocito o una célula endotelial, incluida la etapa de poner en contacto una célula de la piel que tiene expresión o producción constitutiva de TGF-p3 con APC o APC-3K3A, potenciando así la expresión constitutiva o la producción de TGF-p3 por parte de la célula de la piel.
Típicamente, la expresión o producción de TGF-p3 por parte de células de la piel tratadas con APC o APC-3K3A aumenta en aproximadamente un 100 a 500% en fibroblastos tratados y en aproximadamente un 5 a 50% en queratinocitos tratados, en relación con la expresión constitutiva o producción de TGF-p3 de las células de la piel. Típicamente, la expresión o producción de TGF-p3 por parte de células de la piel tratadas con APC o APC-3K3A es inducida o potenciada durante un período de al menos 3 a 4 días después del contacto inicial de la célula de la piel con APC o APC-3K3A.
Típicamente, la expresión o la producción constitutiva de TGF-p1 no se potencia por el contacto de la célula de la piel con APC o APC-3K3A.
Típicamente, APC o APC-3K3A no induce la proliferación de células de la piel.
C. Inhibición por APC de la expresión de TGF-b1
Se describe un método para inhibir la expresión o la producción constitutiva de TGF-p1 por parte de una célula de la piel, tal como un fibroblasto, un miofibroblasto, un queratinocito o una célula endotelial, que incluye la etapa de poner en contacto la célula de la piel con APC, inhibiendo así la expresión constitutiva o la producción de TGF-p1 por parte de la célula de la piel.
En los casos en los que la célula de la piel es un fibroblasto, éste puede seleccionarse del grupo que consiste en un fibroblasto del lecho de la herida, un fibroblasto queloide y un fibroblasto cicatricial hipertrófico.
Típicamente, la expresión o producción de TGF-p1 es inhibida por APC en aproximadamente un 5 a 30%, preferiblemente en aproximadamente un 10 a 25%, preferiblemente en aproximadamente un 20% con respecto a la expresión constitutiva o producción de TGF-p1 por parte de las células de la piel.
Típicamente, la expresión o producción de TGF-p1 es inhibida al menos aproximadamente de 3 a 5 días después del contacto de la célula de la piel con APC.
Típicamente, la célula de la piel expresa o produce de forma constitutiva TGF-p3.
Típicamente, la expresión o producción constitutiva de TGF-p3 no es inhibida por el contacto de la célula de laa piel con APC.
Típicamente, la APC no induce la proliferación de células de la piel.
D. Inhibición de la formación de cicatrices patológicas
También se describe un método para inhibir o prevenir la formación de una cicatriz patológica en un individuo que incluye las etapas de:
- proporcionar un individuo que tiene un sitio de lesión tisular que se somete a reparación de heridas;
- poner en contacto el sitio de la lesión tisular con APC o APC-3K3A
inhibiendo o previniendo así la formación de una cicatriz patológica en el individuo.
También se describe un método para inhibir o prevenir la prolongación de la reparación de heridas en un sitio de lesión en un individuo que incluye las etapas de:
- proporcionar un individuo que tiene un sitio de lesión tisular que se somete a reparación de heridas;
- poner en contacto el sitio de la lesión tisular con APC o APC-3K3A;
inhibiendo o previniendo así la prolongación de la reparación de la herida en el sitio de la lesión en el individuo. El individuo puede estar en riesgo de formación de una cicatriz patológica. En particular, el individuo puede tener factores de riesgo sistémicos o locales para la reparación prolongada de heridas o de otra manera para la formación de una cicatriz patológica. Factores de riesgo sistémicos incluyen infección sistémica, síndrome metabólico, diabetes o intolerancia a la glucosa, función cardiovascular alterada. El individuo puede estar genéticamente predispuesto a la formación de cicatrices queloides o hipertróficas. Factores de riesgo locales incluyen los relacionados con la lesión, incluida la naturaleza de la lesión en sí (por ejemplo, un traumatismo o quemadura), inflamación anormal, estrés físico repetido por el movimiento o exposición a radiación ultravioleta.
El método puede incluir la etapa de evaluar a un individuo para determinar si el individuo o el sitio de la lesión tiene uno o más factores de riesgo sistémicos o locales descritos anteriormente para la formación de una cicatriz patológica o para una prolongación del proceso de reparación de la herida. Típicamente, se evalúa al individuo para determinar uno o más factores de riesgo sistémicos o locales aplicables a la formación de una cicatriz hipertrófica. Con respecto a las lesiones por quemaduras, factores de riesgo particulares pueden incluir: genéticos, especialmente piel oscura, p. ej., raza indígena estadounidense/nativa de Alaska, quemaduras faciales, % más alto de TBSA, gravedad de la quemadura (Thompson CM et al, Genetic risk factors for hypertrophic scar development. J Burn Care Res. septiembre-octubre de 2013; 34(5):477-82).
Otros factores de riesgo incluyen la edad y la influencia hormonal. Aunque las cicatrices queloides y las cicatrices hipertróficas pueden desarrollarse a cualquier edad, tienden a desarrollarse más fácilmente durante y después de la pubertad. La menopausia tiende a provocar la regresión de la cicatrización y el embarazo tiende a exacerbarla. Las cicatrices de la cirugía de tiroides (cicatrices de tiroidectomía) pueden ser problemáticas debido a cambios hormonales.
Los factores genéticos y el historial previo también son relevantes. Específicamente, las cicatrices anormales tienen 15 veces más probabilidades de ocurrir en personas de piel más oscura. La formación de cicatrices queloides ocurre en zonas de alta concentración de melanocitos y rara vez se encuentra en los párpados, los genitales, las plantas de los pies y las palmas de las manos. Las personas con cabello pelirrojo y pecas también tienen un mayor riesgo de cicatrices queloides. Las personas con antecedentes personales de cicatrización queloide tienen más probabilidades de volver a cicatrizar de forma anormal y las que tienen antecedentes familiares también tienen un mayor riesgo. La ubicación de la cicatriz y la técnica quirúrgica son relevantes porque las cicatrices sobre o cerca de los músculos que están particularmente activos a menudo se extienden o se vuelven más visibles que las cicatrices formadas en zonas menos activas. La tensión de la piel y la herida durante la reparación de la herida también contribuyen al aumento de las cicatrices.
La infección de la herida aumenta el riesgo de una cicatrización anormal y, por separado, una diversidad de diferentes tipos de lesiones cutáneas pueden conducir al desarrollo de cicatrices queloides e hipertróficas, incluida la cirugía, quemaduras y procesos inflamatorios de la piel, tales como acné, psoriasis y varicela.
En los casos en los que se evalúa que el individuo tiene uno o más factores de riesgo locales o sistémicos para la formación de una cicatriz patológica o para una prolongación del proceso de reparación de la herida, el método puede incluir la etapa adicional de seleccionar al individuo para el tratamiento con APC o APC-3K3A para inhibir o prevenir la formación de una cicatriz patológica en el individuo.
Típicamente, la lesión surge de una agresión al tejido dérmico, cutáneo o de la piel. La agresión puede afectar a todas las capas del tejido dérmico, por ejemplo, al estrato basal (estrato germinativo), estrato espinoso, estrato granuloso, estrato lúcido. Ejemplos de lesiones particulares incluyen laceración, abrasión, ruptura, quemadura, contusión, compresión.
La lesión puede ser una quemadura, incluida una quemadura de 1er, 2° o 3er grado.
Típicamente, la lesión es una lesión aguda.
Típicamente, la lesión no se asocia con inflamación crónica.
Típicamente, la lesión no se asocia con fibrosis.
Típicamente, la lesión no es un trastorno inflamatorio, un trastorno alérgico o un trastorno o enfermedad idiopática. Preferiblemente, el individuo tiene uno o más factores de riesgo para la formación de una cicatriz hipertrófica y la APC se proporciona en forma de 3K3A como se define más adelante.
La APC o APC-3K3A se puede aplicar al sitio de la lesión del tejido antes de que el proceso de reparación de la herida haya formado una matriz temporal. La APC o APC-3K3A se puede aplicar al sitio de la lesión del tejido antes de que el proceso de reparación de la herida haya formado una matriz final. Típicamente, la APC o APC-3K3A se aplica aproximadamente en el momento de la formación de la matriz temporal o poco después.
Típicamente, el individuo es tratado con APC o APC-3K3A para que se complete la reparación de la herida en aproximadamente 3 a 4 semanas después de la lesión del tejido.
La cicatriz formada por el tratamiento tiene generalmente características de una cicatriz fisiológica que incluye un predominio de colágeno tipo I y una carencia general de características que son características de una cicatriz hipertrófica o queloide. Estas características pueden determinarse mediante histología de rutina o examen macroscópico.
No obstante lo anterior, los expertos en la técnica entenderán que la cantidad de dosificación de APC o APC-3K3A variará con el compuesto particular o combinación de compuestos empleados, la enfermedad o afección a tratar, la gravedad de la enfermedad o afección, el o los tipos de administración local, la tasa de excreción del compuesto, la duración del tratamiento, la identificación de cualquier otro fármaco que se esté administrando al animal, la edad, el tamaño y la especie de animal, y factores similares conocidos en las técnicas médicas. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto o combinación de compuestos será la cantidad que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. La cantidad de dosificación, la forma de dosificación y el modo de administración serán determinados por un médico tratante dentro del alcance del buen juicio médico. Cantidades de dosificación, formas de dosificación y modos de administración eficaces para los diversos compuestos y combinaciones de compuestos se pueden determinar empíricamente y la realización de tales determinaciones está dentro del conocimiento de la técnica.
En ciertos casos, es importante que la APC o APC-3K3A se proporcione para permitir el contacto de APC o APC-3K3A con las células de la piel como se describe en el presente documento en el sitio de la lesión tisular, ya que, aunque no se quiera quedar limitado por hipótesis, se cree que es por este contacto que la APC o APC-3K3A proporciona minimizar el riesgo de formación de cicatrices patológicas. Generalmente, las células que se han puesto en contacto con APC o APC-3K3A pueden reconocerse por tener las siguientes características: proliferación incrementada y apoptosis disminuida; caspasa-3 disminuida; activación de los receptores 1, 2 o 3 activados por proteasa; activación reducida de NF-kB; activación reducida de la molécula de señalización, p38; secreción reducida de TNF; proteína metaloproteinasa de la matriz (MMP)-2 incrementada y activación; MMP-9 reducida; esfingoisina-1-fosfato incrementada; angiopoyetina (Ang)1 incrementada y Ang 2 disminuida; activación incrementada de Tie2; activación de la molécula de señalización Akt. Por lo tanto, se puede establecer el contacto de células con APC o APC-3K3A y, por lo tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento mediante la evaluación de estos fenotipos celulares. En ciertos casos, una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A proporciona generalmente una mejora de la producción o expresión constitutiva de TGF-p3 y la inhibición de la producción o expresión constitutiva de TGF-p1. Este resultado puede evaluarse mediante los métodos comentados en la parte B anterior, estableciendo así si se ha proporcionado una cantidad terapéuticamente eficaz de APC.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A puede prevenir o inhibir la formación de una cicatriz patológica en un individuo. Este resultado puede evaluarse mediante las medidas cualitativas o cuantitativas que se analizan más adelante.
Se han diseñado escamas de cicatrices para cuantificar la apariencia de las cicatrices en respuesta al tratamiento. Actualmente existen al menos 5 escalas de cicatrices que fueron diseñadas originalmente para evaluar parámetros subjetivos de una manera objetiva: Escala de cicatrices de Vancouver (VSS), Escala de cicatrices de Manchester (MSS), Escala de evaluación de cicatrices del paciente y observador (POSAS), Escala analógica visual (VAS) y Escala de evaluación de cicatrices de Stony Brook (SBSES). Estas escalas dependientes del observador consideran factores tales como la altura o el grosor de la cicatriz, la flexibilidad, el área de la superficie, la textura, la pigmentación y la vascularización. Las mediciones se extienden a lo largo de un continuo de valores. Por lo tanto, las escalas se utilizan mejor para determinar el cambio dentro de un individuo en lugar de entre individuos.
Se han aplicado varias herramientas para evaluar la flexibilidad: el neumonómetro y el cutómetro se encuentran entre los más populares. El neumonómetro usa presión para medir objetivamente la flexibilidad de la piel.
El cutómetro es un dispositivo de succión no invasivo que se ha aplicado a la medición objetiva y cuantitativa de la elasticidad de la piel. Mide la viscoelasticidad de la piel analizando su deformación vertical en respuesta a la presión negativa. Se ha utilizado para medir los efectos de los tratamientos sobre las cicatrices de quemaduras y para evaluar la maduración de las cicatrices.
El durómetro aplica una carga de indentación dirigida verticalmente sobre la cicatriz para medir la firmeza del tejido. El cromámetro (Minolta, Tokio, Japón), el DermaSpectrometer (cyberDERM, Inc, Media, PA, EE.UU.), el Mexameter (Courage-Khazaka, Colonia, Alemania) y el colorímetro triestímulo se encuentran entre los dispositivos más utilizados para medir el color de cicatrices. Estos dispositivos utilizan análisis de color espectrofotométrico para calcular el eritema y el índice de melanina.
Se han utilizado escáneres de ultrasonido, tales como el sistema de palpación por ultrasonido de tejidos (TUPS) para cuantificar el grosor de la cicatriz.
Las imágenes de perfusión láser Doppler son una técnica establecida para medir la perfusión de las cicatrices por quemaduras. Ayuda en la determinación temprana de la profundidad de la quemadura y el curso de tratamiento posterior. Mediante la construcción de mapas codificados por colores de microperfusión tisular, las imágenes de perfusión con láser Doppler ofrecen una alternativa no invasiva a la biopsia de heridas por quemadura.
Se puede utilizar un sistema de perfilado óptico tridimensional (formación de imágenes Primos) para generar una representación topográfica de alta resolución de la cicatriz, caracterizando así la cicatriz. Alternativamente, se puede aplicar un digitalizador tridimensional sin contacto en el estudio de los queloides para medir el volumen de la cicatriz y la respuesta al tratamiento.
Los resultados anteriores pueden obtenerse estableciendo una concentración tisular local de APC o APC-3K3A en la región de la piel de 0,1 pg a 10 mg, preferiblemente de 1 pg a 1 mg de APC o APC-3K3A por g de tejidos cutáneos. Esto se puede determinar tomando biopsias cutáneas bajo anestesia local del mismo sitio de la lesión. La cantidad de APC o APC-3K3A puede entonces determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, los tejidos de la biopsia se trituran y se lisan en hielo. Después de la centrifugación, los sobrenadantes transparentes se utilizan para medir la concentración de PC mediante ELISA y la actividad de APC mediante el ensayo de sustrato cromogénico Spectrozyme PCa (American Diagnostica). La actividad enzimática se determina midiendo el aumento de absorbancia del cromóforo libre generado por unidad de tiempo a A450 nm.
En ciertos casos, la cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A es de 0,1 pg a 5000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 1 pg a 2000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 10 pg a 1000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 10 pg a 500 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A.
La APC o APC-3K3A se puede administrar una vez por semana hasta dos veces al día, dependiendo de la naturaleza de la lesión tisular. Por lo general, se proporciona durante no más de 20 semanas de días consecutivos, o durante no más de 6 semanas de días consecutivos.
En ciertos casos, la APC o APC-3K3A se pueden administrar cada 4 a 5 días.
D.1 Aplicación tópica
Los métodos de tratamiento tópico, por ejemplo, el uso de una pasta, gel, crema, aceite, loción, espuma, ungüento o sustancia similar son particularmente útiles cuando la región de la piel relevante es una que contiene una superficie cutánea rota, ya que esto permite la penetración de la APC o APC-3K3A se puede administrar a los estratos relevantes del tejido de la piel donde residen los fibroblastos.
La cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A puede ser de 0,1 a 2000 pg, preferiblemente de 10 a 1000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel. Generalmente se prefiere una cantidad mayor en los casos en los que la piel está más gravemente afectada o en los casos en los que el individuo tiene un riesgo particular debido a la presencia de factores locales o sistémicos para la formación de cicatrices patológicas, tal como se describió anteriormente. Se pueden preferir cantidades menores cuando la piel no se ve gravemente afectada. La concentración de APC o APC-3K3A en la formulación puede estar entre aproximadamente 100 pg/ml y 5 mg/ml. En esta realización, el volumen de composición aplicado a la región de la piel puede ser de aproximadamente 100 pl a 5 ml.
La composición se puede proporcionar a la piel generalmente con una superficie estéril, tal como un dedo o una espátula en una capa de no más de aproximadamente 10 mm de espesor, preferiblemente de aproximadamente 3 mm de espesor. Luego se puede frotar o masajear en la región de la piel y la zona circundante. La aplicación es generalmente de una vez al día a una vez por semana, y generalmente no más de 20 semanas, o no más de 12 semanas.
La composición que contiene APC o APC-3K3A se puede aplicar a un sustrato sólido, es decir, un vendaje, apósito o similar, y luego se fija el sustrato a la región relevante de la piel.
D.2 Aplicación de inyección intradérmica
Los resultados anteriores se obtienen estableciendo una concentración local de APC o APC-3K3A al menos 2 veces mayor que la línea basal. Esta cantidad de APC o APC-3K3A se puede medir midiendo la actividad de APC o APC-3K3a de la biopsia de piel usando ELISA y el ensayo de sustrato cromogénico Spectrozyme PCa como se mencionó anteriormente. La inyección intradérmica o subcutánea se prefiere generalmente como vía de administración cuando el estrato córneo está intacto y es de tal naturaleza que existe una penetración limitada de APC o APC-3K3A a través de la capa de piel. Generalmente, se puede usar una aguja de calibre fino en una aguja (~28-34G) en una jeringa de 1 ml. Se pueden administrar múltiples inyecciones para cubrir la zona de la superficie de la piel, con ~1 inyección por cm2. La cantidad por inyección variará de 10 pl a 1 ml, siendo la cantidad típica de 50 pl. Generalmente, la administración se administra de una vez al día a una vez por semana, y generalmente durante no más de 20 semanas. La inyección intradérmica o subcutánea se puede utilizar al mismo tiempo que la aplicación tópica de APC o APC-3K3A.
E. Tratamiento de cicatriz patológica
La invención proporciona una proteína C activada (APC) o un análogo de la misma para su uso en minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica en un individuo, que comprende poner en contacto una cicatriz patológica con una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o análogo de la misma. También se describe un método correspondiente para minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica en un individuo que incluye las etapas de:
- proporcionar un individuo que tiene una cicatriz patológica;
- contactar la cicatriz patológica con APC o APC-3K3A;
reduciendo así la aparición de una cicatriz patológica en el individuo.
El tratamiento puede reducir el volumen de la cicatriz, por ejemplo, reduciendo la profundidad a la que se extiende la cicatriz en el tejido adyacente, o reduciendo la zona de la superficie del tejido cubierto por la cicatriz.
En una realización, el tratamiento puede resultar en una regresión parcial o completa de la cicatriz.
El tratamiento puede dar como resultado una reducción de la pigmentación, en particular una reducción de la pigmentación oscura o roja para formar una cicatriz que tiene una pigmentación cutánea más parecida a la piel normal.
En una realización, el tratamiento implica reducir el dolor que surge de una cicatriz patológica, por ejemplo, reduciendo el suministro de tejido nervioso a la cicatriz, o mejorando la flexibilidad de la cicatriz, reduciendo así la constricción del movimiento. Las últimas realizaciones pueden implicar la reducción de la contracción del tejido por la cicatriz.
El tratamiento puede dar como resultado la reducción de la celularidad y/o la vascularización de la cicatriz patológica, o el aumento de la expresión constitutiva o la producción de TGF-p3 o la disminución o inhibición de la expresión constitutiva o la reducción de TGF-p1 en o junto a la cicatriz patológica.
La cicatriz patológica puede surgir de una cualquiera de las siguientes lesiones en el tejido dérmico, incluyendo laceración, abrasión, rotura, quemaduras, contusión, compresión.
La lesión puede ser una quemadura, incluida una quemadura de 1er, 2° o 3er grado.
La cicatriz patológica puede ser una cicatriz hipertrófica, una cicatriz queloide o una cicatriz atrófica.
En una realización particularmente preferida, la cicatriz patológica es una cicatriz hipertrófica que surge de una lesión por quemadura y la APC o análogo de la misma es 3K3A (como se define más adelante).
En ciertas realizaciones, es importante que la APC o APC-3K3A se proporcione para permitir el contacto de APC o APC-3K3A con las células de la piel como se menciona en el presente documento en el sitio de la cicatriz patológica como, sin querer estar ligado por hipótesis, se cree que es por este contacto que la APC o APC-3K3A proporciona el tratamiento de una cicatriz patológica. Generalmente, las células que se han puesto en contacto con APC o APC-3K3A pueden reconocerse por tener las siguientes características: proliferación incrementada y apoptosis disminuida; caspasa-3 disminuida; activación de los receptores 1, 2 o 3 activados por proteasa; activación reducida de NF-kB; activación reducida de la molécula de señalización, p38; secreción reducida de TNF; proteína metaloproteinasa de la matriz (MMP)-2 incrementada y activación; MMP-9 reducida; esfingoisina-1-fosfato incrementada; angiopoyetina (Ang)1 incrementada y Ang 2 disminuida; activación incrementada de Tie2; activación de la molécula de señalización Akt y así el contacto de las células con APC y, por tanto, la eficacia terapéutica del tratamiento puede establecerse evaluando estos fenotipos celulares.
En ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A proporciona generalmente la potenciación de la producción o expresión constitutiva de TGF-p3 y la inhibición de la producción o expresión constitutiva de TGF-p1. Este resultado puede evaluarse mediante los métodos discutidos en la parte B anterior, estableciendo así si se ha proporcionado una cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A.
En otra realización, los resultados anteriores se obtienen estableciendo una concentración tisular local de APC en la región de la piel de 0,1 pg a 10 mg, preferiblemente de 1 pg a 1 mg de APC o APC-3K3A por g de tejidos cutáneos. Esto se puede determinar tomando biopsias cutáneas bajo anestesia local del mismo sitio de la cicatriz patológica. La cantidad de APC puede determinarse luego mediante métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, los tejidos de la biopsia se trituran y se lisan en hielo. Después de la centrifugación, los sobrenadantes transparentes se utilizan para medir la concentración de PC mediante ELISA y la actividad de APC mediante el ensayo de sustrato cromogénico Spectrozyme PCa (American Diagnostica). La actividad enzimática se determina midiendo el aumento de absorbancia del cromóforo libre generado por unidad de tiempo a A450 nm.
En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de APC o APC-3K3A es de 0,1 pg a 5000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 1 pg a 2000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 10 pg a 1000 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A, o de 10 pg a 500 pg de APC o APC-3K3A por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC o APC-3K3A.
La APC o APC-3K3A se puede administrar una vez por semana hasta dos veces al día, dependiendo de la naturaleza de la lesión tisular. Por lo general, se proporciona durante no más de 20 semanas de días consecutivos, o durante no más de 6 semanas de días consecutivos.
En ciertas realizaciones, la APC o APC-3K3A se pueden administrar cada 4 a 5 días.
E. 1 Inyección intralesional
En ciertas realizaciones, los resultados anteriores se obtienen estableciendo una concentración local de APC o APC-3K3A puede administrarse al menos 2 veces mayor que la línea basal. Esta cantidad de APC o APC-3K3A que se puede administrar se puede medir midiendo la actividad de APC o APC-3K3A de la biopsia de piel usando ELISA y ensayo de sustrato cromogénico Spectrozyme PCa como se mencionó anteriormente. La inyección intradérmica o subcutánea generalmente se prefiere como vía de administración para el tratamiento de cicatrices patológicas como en estas circunstancias, el estrato córneo está intacto y es de tal naturaleza que existe una penetración limitada de APC o APC-3K3A a través de la capa de piel. Generalmente, se puede usar una aguja de calibre fino en una aguja (~28-34G) en una jeringa de 1 ml. Se pueden administrar múltiples inyecciones para cubrir el área de la superficie de la piel, con ~1 inyección por cm2. La cantidad por inyección variará de 10 pl a 1 ml, siendo la cantidad típica de 50 pl. Generalmente, la administración se administra de una vez al día a una vez por semana, y generalmente no más de 20 semanas. La inyección intradérmica o subcutánea se puede utilizar al mismo tiempo que la aplicación tópica de APC o APC-3K3A.
F. APC y formulaciones de la misma
APC o APC-3K3A para su uso como anteriormente puede adoptar la forma de una composición, o puede obtenerse de otro modo mediante un procedimiento, como se describe más adelante.
La APC puede prepararse mediante activación in vitro de proteína C purificada a partir de plasma o prepararse mediante técnicas de ADN recombinante mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos 4.981.952, 5.151.,268, 5.831.025, 6.156.734, 6.268.344 y 6.395.270.
Alternativamente, la APC se puede preparar directamente mediante técnicas de ADN recombinante. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos 4.981.952, 5.151.268, 6.156.734, 6.268.344 y 6.395.270. La proteína C activada recombinante puede producirse activando el zimógeno de proteína C humana recombinante in vitro o por secreción directa de células de la forma activada de proteína C. La proteína C puede producirse en animales transgénicos, plantas transgénicas o una diversidad de células eucariotas, incluyendo, por ejemplo, la secreción de células 293 de riñón humano como un zimógeno, luego se purifica y activa mediante técnicas conocidas por el experto en la materia.
La APC puede ser de cualquier especie animal, pero se prefiere la APC humana.
Pueden usarse fragmentos y derivados de APC en la práctica de la invención, siempre que exhiban las actividades descritas en este documento. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. Nos 5.151.268, 5.453.373 y 5.516.650 y las solicitudes PCT WO 89/12685, WO 01/56532, WO 01/59084 y WO 01/72328.
La APC puede ser un derivado de la APC humana que tiene actividades proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas y biológicas (anticoagulantes, anti-inflamatorias o profibrinolíticas) características de la APC humana. Ejemplos de derivados de la proteína C se describen en Gerlitz, et al., Patente de EE.UU. N° 5.453.373, y Foster, et al., Patente de EE.UU. N25.516.650.
La APC recombinante o la proteína C pueden incorporar modificaciones (p. ej., sustituciones de aminoácidos, deleciones y adiciones de secuencias de aminoácidos heterólogas), formando así análogos de APC que pueden, por ejemplo, potenciar la actividad biológica o la expresión de la proteína respectiva. Un ejemplo es 3K3A-APC de ZZ Biotech, que es una variante de APC modificada genéticamente y que tiene una actividad anticoagulante reducida. Específicamente, 3K3A-APC tiene la mutación KKK191/193AAA. Esta mutación puede corresponder al bucle 37 de APC. Otro ejemplo de un análogo de APC contiene la mutación RR229/230AA correspondiente al bucle de calcio de APC. Otro ejemplo de un análogo de APC contiene la mutación RR306/312AA correspondiente al bucle de autólisis de APC. Otro análogo de APC contiene RKRR306/314AAAA correspondiente al bucle de autólisis de APC. Cada uno de estos ejemplos de análogos de APC tiene una actividad anticoagulante reducida en comparación con la actividad de APC nativa. Sin embargo, cada uno de ellos tiene una función APC relacionada en términos de unión a EPCR y PAR-1 o PAR-3.
En una realización preferida, la invención utiliza el análogo de 3K3A-APC (KKK191/193AAA) para las diversas aplicaciones descritas en este documento, que incluyen potenciar la expresión constitutiva o producción de TGF-p3, o para inhibir la expresión constitutiva o producción de TGF-p1, o para minimizar el riesgo de formación de cicatrices patológicas, o para reducir la apariencia de una cicatriz patológica. La secuencia de aminoácidos de 3K3A-APC se muestra en SEC ID N°: 1.
Análogos de APC tienen generalmente una secuencia que es homóloga a la secuencia de la proteína C humana. El porcentaje de identidad entre un par de secuencias puede calcularse mediante el algoritmo implementado en el programa informático BESTFIT (Smith y Waterman. J. Mol. Biol, 147: 195-197, 1981; Pearson, Genomics 11: 635­ 650, 1991). Otro algoritmo que calcula la divergencia de secuencia se ha adaptado para una búsqueda rápida en la base de datos y se ha implementado en el programa informático BLAST (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997). En comparación con la secuencia humana, el polinucleótido o polipéptido de la proteína C puede ser solo aproximadamente un 60% idéntico al nivel de aminoácidos, 70% o más idéntico, 80% o más idéntico, 90% o más idéntico, 95% o más idéntico, 97% o más idénticos, o más del 99% idéntico.
Las sustituciones conservadoras de aminoácidos (p. ej., Glu/Asp, Val/Ile. Ser/Thr, Arg/Lys, Gln/Asn) también se pueden considerar al hacer comparaciones porque se espera que la similitud química de estos pares de residuos de aminoácidos resulte en equivalencia funcional en muchos casos. Las sustituciones de aminoácidos que se espera que conserven la función biológica del polipéptido conservarían los atributos químicos de los residuos de aminoácidos sustituidos, tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga de la cadena lateral o tamaño. En comparación con la secuencia humana, el polipéptido de la proteína C puede ser solo aproximadamente 80% o más similar, 90% o más similar, 95% o más similar, 97% o más similar, 99% o más similar, o aproximadamente 100% similar. La equivalencia funcional o la conservación de la función biológica pueden evaluarse mediante métodos de determinación estructural y bioensayo.
Los codones usados también pueden adaptarse para la traducción en un huésped heterólogo adoptando las preferencias de codones del huésped. Esto acomodaría la maquinaria de traducción del huésped heterólogo sin un cambio sustancial en la estructura química del polipéptido.
Se pueden producir formas recombinantes de proteína C con una estructura química seleccionada (p. ej., nativa, mutante o polimórfica). Como ilustración, un gen que codifica la proteína C humana se describe en la Patente de EE.UU. 4.775.624 y se puede utilizar para producir proteína C humana recombinante como se describe en la Patente de EE.UU. 4.981.952. La proteína C humana puede producirse de forma recombinante en cultivo de tejidos y activarse como se describe en la Patente de EE.UU. 6.037.322. La proteína C humana natural se puede purificar a partir de plasma, activar y analizar como se describe en la Patente de EE.UU. 5.084.274. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos descrita en estas patentes puede usarse como referencia para la proteína C.
La APC y/o la proteína C también se pueden glicosilar mediante métodos bien conocidos en la técnica y que pueden comprender medios enzimáticos y no enzimáticos.
Pueden producirse fragmentos funcionales adecuados de una APC escindiendo APC natural purificada o APC recombinante con proteasas bien conocidas tales como tripsina y similares, o más preferiblemente, mediante técnicas de ADN recombinante o síntesis de péptido/polipéptido. Fragmentos funcionales de este tipo pueden identificarse generando fragmentos candidatos y evaluando la actividad biológica, por ejemplo, analizando la activación de MMP-2, fomento de la reparación de una monocapa endotelial herida y/o angiogénesis en la membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM) de una manera similar a la descrita en los ejemplos proporcionados en este documento. Preferiblemente, los fragmentos funcionales tendrán una longitud de 5 a 100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente, de 10 a 30 aminoácidos de longitud. Los fragmentos funcionales pueden ser lineales o circularizados y pueden incluir modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de APC nativa de donde se derivan (p, ej., sustituciones de aminoácidos, deleciones y adiciones de secuencias de aminoácidos heterólogas). Los fragmentos funcionales también se pueden glicosilar mediante métodos bien conocidos en la técnica y que pueden comprender medios enzimáticos y no enzimáticos.
Pueden diseñarse compuestos miméticos de APC adecuados (es decir, compuestos que imitan la función de la APC) usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para diseñar miméticos de péptidos basados en secuencias de péptidos en ausencia de información estructural secundaria y terciaria. Por ejemplo, los compuestos miméticos de péptidos se pueden producir modificando cadenas laterales de aminoácidos para aumentar la hidrofobicidad de regiones definidas del péptido (p. ej., sustituyendo hidrógenos con grupos metilo en residuos aromáticos de los péptidos), sustituyendo cadenas laterales de aminoácidos con no aminoácidos, cadenas laterales (p. ej., sustituyendo residuos aromáticos de los péptidos con otros grupos arilo) y sustituyendo los extremos amino y/o carboxi con diversos sustituyentes (p. ej., sustituyendo grupos alifáticos para aumentar la hidrofobicidad). Alternativamente, los compuestos miméticos pueden ser los llamados peptoides (es decir, no péptidos) que incluyen la modificación de la cadena principal del péptido (es decir, mediante la introducción de enlaces amida sustitutos, por ejemplo, reemplazando los átomos de nitrógeno en la cadena principal con átomos de carbono), o incluyen residuos de glicina N-sustituidos, uno o más D-aminoácidos (en lugar de L-aminoácidos) y/o uno o más a -aminoácidos (en lugar de p-aminoácidos o Y-aminoácidos). Alternativas de compuestos miméticos adicionales incluyen "péptidos retro-inversos", en que los enlaces peptídicos se invierten y los D-aminoácidos se ensamblan en orden inverso al orden de los L-aminoácidos en la secuencia peptídica en la que se basan, y otras estructuras de no péptidos tales como esteroides, sacáridos, benzazepina, pirrolidinona 3,4-trisustituida, piridonas y piridopirazinas. Compuestos miméticos adecuados también se pueden diseñar/identificar mediante modelado/determinación estructural, mediante el rastreo de productos naturales, la producción de colecciones de presentación de fagos, proteínas minimizadas, selección SELEX (aptámero), colecciones combinatorias y colecciones combinatorias enfocadas, rastreo virtual/búsqueda en bases de datos y técnicas racionales de diseño de fármacos bien conocidas en la técnica. Composiciones farmacéuticas adecuadas de APC comprenden la APC y un soporte farmacéuticamente aceptable. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. Nos. 6.395.270 y 6.159.468 y las solicitudes PCT WO 98/48818, WO 01/56532 y WO 01/72328. Una composición que contiene APC puede ser generalmente una que es un producto liofilizado estable de alta pureza que comprende un agente conferidor de consistencia (tal como sacarosa, manitol, trehalosa y rafinosa), una sal (tal como cloruro de sodio y cloruro de potasio), un tampón (tales como citrato de sodio, tris-acetato y fosfato de sodio) y APC. Por ejemplo, una composición liofilizada estable puede comprender una relación en peso de aproximadamente 1 parte de APC, entre aproximadamente 7-8 partes de sal y entre aproximadamente 5-7 partes de agente conferidor de consistencia. Un ejemplo de una composición liofilizada estable de este tipo es: 5,0 mg de APC, 30 mg de sacarosa, 38 mg de NaCl y 7,56 mg de citrato, pH 6,0, por vial. Las diversas formas recombinantes y sintéticas de APC y análogos de APC se pueden testar para uso en el tratamiento de una cicatriz patológica mediante la selección de la eficacia relevante en un modelo animal establecido, ejemplos de los cuales incluyen un modelo de ratón desnudo de cicatriz hipertrófica discutido en Momtazi et al. 2013 supra.
F.1 Formulación de administración tópica
En una realización particularmente preferida, la APC o APC-3K3A se proporciona en forma de una composición o formulación que se adapta para la administración tópica a un sitio relevante de lesión tisular, según un método descrito en las Secciones D o E anteriores. Ejemplos de formulaciones de este tipo incluyen aquellas que se pueden aplicar directamente a la superficie relevante, permitiendo la administración local de la APC o APC-3K3A en el sitio relevante. Estas formulaciones incluyen geles, aceites, aerosoles, formulaciones de roll on, ungüentos, lociones, espumas y similares. En una realización, la APC o APC-3K3A se proporciona en forma de gel de metilcelulosa y puede contener estabilizadores tales como carbohidratos y sales.
El ungüento para la piel puede ser una combinación de ingredientes orgánicos, saludables, de belleza o medicinales, habitualmente en una base de aceite de petróleo. Esto le da al ungüento para la piel una fórmula más espesa y menos hidrosoluble que permanece en la superficie del cuerpo durante más tiempo, de modo que los ingredientes pueden funcionar de manera más efectiva para tratar una amplia diversidad de problemas. Hay muchos ungüentos para la piel naturales y orgánicos que se pueden solicitar a compañías (como Therapex).
También se puede utilizar espuma de propionato de clobetasol (CP) (0,05%). Se trata de una espuma en aerosol en emulsión que se ha utilizado para el tratamiento de las manifestaciones inflamatorias y pruriginosas de las dermatosis que responden a los corticosteroides en los Estados Unidos y para las manifestaciones inflamatorias y pruriginosas de la dermatitis atópica moderada a grave en Canadá (espuma Olux-E (propionato de clobetasol), 0.05% Stiefel Laboratories Inc, Research Triangle Park, NC (2011).
En los casos en los que la formulación es un gel, éste puede contener APC o APC-3K3A en una cantidad de 100­ 5000 pg/g de gel.
F.2 Formulación inyectable
Una formulación de APC es el producto vendido por Eli Lilly and Co., Indianapolis, Indiana, bajo la marca comercial Xigris™. Xigris™ se suministra como un polvo liofilizado estéril para infusión intravenosa. Los viales de 5 mg de Xigris™ contienen 5,3 mg/vial de APC recombinante humana, 31,8 mg/vial de sacarosa, 40,3 mg/vial de NaCl y 10,9 mg/vial de citrato de sodio, y los viales de 20 mg de Xigris™ contienen 20,8 mg/vial de APC recombinante humana, 124,9 mg/vial de sacarosa, 158,1 mg/vial de NaCl y 42,9 mg/vial de citrato de sodio. Los viales se reconstituyen con agua estéril para inyección, USP, para dar una concentración de aproximadamente 2 mg/ml de APC, y esta APC diluida se agrega luego a una inyección de cloruro de sodio al 0,9% para dar una concentración de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000 Mg/ml de APC para la administración a un paciente. Esta es una formulación particularmente preferida para la administración de APC mediante técnicas de inyección subcutánea como se describe en las secciones D o E anteriores.
Ya sea que se administre por vía tópica o por inyección subcutánea, en ciertas realizaciones, la formulación relevante puede contener proteína C como alternativa o además de la APC. Por ejemplo, se puede administrar una cantidad eficaz de proteína C que se activará in vivo por la ruta de la proteína C endógena para producir APC. Véanse, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.151.268 y la solicitud PCT WO 93/09807. Como se indicó anteriormente, la proteína C se puede purificar a partir de plasma o se puede preparar mediante técnicas de ADN recombinante. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. Nos 4.959.318, 4.981.952, 5.093.117, 5.151.268, 5.571.786, 6.156.734, 6.268,344 y 6.395.270. Se conocen composiciones farmacéuticas adecuadas que comprenden proteína C (véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU.Nos 5.151.268 y 5.571.786).
La producción endógena de APC también se puede incrementar administrando una cantidad de un agente que aumenta la síntesis de proteína C en el animal. Véase, p. ej., la solicitud PCT WO 93/09807. Agentes adecuados incluyen esteroides anabólicos (p. ej., danazolol). Véase, p. ej., la solicitud PCT WO 93/09807.
En ciertas realizaciones, la producción endógena de APC puede aumentarse administrando una cantidad de un activador de proteína C eficaz para provocar la producción de APC in vivo a partir de proteína C sintetizada endógenamente y/o de proteína C co-administrada. Véase, p. ej., la solicitud PCT WO 93/09807. Un activador de proteína C es cualquier compuesto que causa o aumenta la generación de APC. Activadores de la proteína C adecuados incluyen trombina, a-trombina, trombina acilada de sitio activo, análogos de trombina y mutantes (p. ej., trombina E192Q y trombina K52E), complejos solubles de trombina-trombomodulina, agentes que evitarían el aclaramiento o la descomposición de los complejos de trombina-trombomodulina, agentes que potencian la síntesis o retrasan el aclaramiento de trombomodulina, un veneno (tal como Protac o el veneno de Russel Viper), factor Xa, plasmina, tripsina y cualquier otro veneno, enzima o compuesto capaz de causar o aumentar la generación de APC a partir de la proteína C. Véase, p. ej. , la solicitud PCT WO 93/09807. Activadores de la proteína C preferidos son trombina y trombina acilada del sitio activo.
En algunas realizaciones, la APC se puede administrar con otro agente para controlar uno o más de la inflamación, la proliferación celular y la apoptosis. Un agente particularmente preferido es un anticuerpo anti-IL-17, en particular Ixekizumab, que mostró mejoras significativas en las puntuaciones de gravedad de la enfermedad de la piel en comparación con placebo en un Estudio de fase II en pacientes con psoriasis crónica en placas (NEJM, 2012). Otros ejemplos de agentes para controlar la inflamación incluyen inhibidores de TNF-a y citocinas antiinflamatorias y productos biofarmacéuticos.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína C activada (APC) o análogo de la misma para uso en minimizar o reducir la apariencia de una cicatriz patológica en un individuo, que comprende poner en contacto una cicatriz patológica con una cantidad terapéuticamente efectiva de APC o análogo de la misma.
2. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cicatriz es una cicatriz hipertrófica.
3. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la cicatriz surge de una quemadura.
4. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la APC o análogo de la misma es para administración en forma de una composición tópica o inyectable.
5. Una APC o análogo de la mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la APC o análogo de la misma se proporciona en una cantidad de 0,1 gg a 5000 gg de APC por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC, o de 1 gg a 2000 gg de APC por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC, o de 10 gg a 1000 gg de APC por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC, o de 10 gg a 500 gg de APC por cm2 de la región de la piel a la que se aplica la APC.
6. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la APC o análogo de la misma se proporciona al menos una vez al día.
7. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la APC o análogo de la misma se proporciona durante un período de 4 a 20 semanas.
8. Una APC o análogo de la misma para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el análogo de APC es 3K3A-APC.
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