DE60111620T2 - Aktiviertes protein c zur behandlung von pankreatitis - Google Patents

Aktiviertes protein c zur behandlung von pankreatitis Download PDF

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Description

  • Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und umfasst insbesondere die medizinische Wissenschaft, wobei aktiviertes Protein C zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen verwendet wird, die mit einer spezifischen Geninduktion oder Genrepression assoziiert sind.
  • Protein C ist eine Serinprotease und ein natürlich vorkommendes Antikoagulans, das eine Rolle bei der vaskulären Hämostase durch die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIA in der Gerinnungskaskade spielt. Humanes Protein C wird in vivo primär in der Leber als einzelnes Polypeptid mit 461 Aminosäuren hergestellt. Dieses Vorläufermolekül wird mehreren posttranslationalen Modifikationen unter Bildung eines zirkulierenden, zweikettigen Zymogens unterzogen, das in vivo durch Thrombin im Komplex mit Thrombomodulin an einer Phospholipidoberfläche in Gegenwart ein Calciumions aktiviert wird. Die Aktivierung resultiert aus der Entfernung eines Dodecapeptids am N-Terminus der schweren Kette, was zu aktiviertem Protein C (aPC) führt.
  • Zusammen mit anderen Proteinen fungiert aPC vermutlich als der wichtigste Dämpfer der Blutgerinnung, was zu einem Schutz gegen Thrombose führt. Zusammen mit den Antikoagulationsfunktionen hat aPC durch die Wirkung über die Hemmung der Cytokinerzeugung (beispielsweise TNF und IL-1) antiinflammatorische Effekte und zeigt auch profibrinolytische Eigenschaften, die die Gerinnselauflösung erleichtern. Daher stellt das Protein C Enzymsystem einen physiologischen Hauptmechanismus der Gerinnungshemmung, Entzündungshemmung und Fibrinolyse dar.
  • Die Mechanismen, durch die Protein C seine verschiedenen Aktivitäten zeigt, waren für viele Jahre ein Forschungsgebiet. Es ist jetzt bekannt, dass Protein C an den Protein C Rezeptor von Endothelzellen (EPCR) bindet. Diese Wechselwirkung erleichtert eine effizientere Aktivierung von Protein C durch Thrombin und die Verbreitung der gerinnungshemmenden Reaktion (Stearns-Kursawa, et al., Blood, 94 (10): 2878, 1999). Es wurde postuliert, dass die entzündungshemmende Aktivität von Protein C teilweise mit der Wechselwirkung des Oligosaccharidteils des Proteins mit Selektinen zusammenhängt (Yan, et al., Glycobiology (3), 957–608, 1993). Darüberhinaus wurde von aPC gezeigt, dass es direkte antiinflammatorische Effekte auf Monozyten aufweist. Ferner legen Daten nahe, dass aktiviertes Protein C die profibrinolytischen Effekte entweder durch Stimulierung der Freisetzung der Plasminogenaktivatoren in das Blut und/oder durch Neutralisierung des Plasminogenaktivatorinhibitors (PAI-1) (F.J. Castellino, Trends in Cardiovasc. Med. (5), 55–62, 1995) und durch verringerter Erzeugung des durch Thrombin aktivierten Fibrinolyseinhibitors [TAFI] (Nesheim et al., Throm. and Haem., 78 (1): 386–391, 1997) ausübt.
  • Jedoch wurde die Wirkung von Protein C auf molekularer Ebene nicht untersucht. Daher besteht ein Bedarf in der Technik, die direkte Wirkung von Protein C auf die Induktion oder Repression von Genen zu ermitteln, die mit verschiedenen Krankheitszuständen oder pathologischen Zuständen assoziiert sind. Daher liefert die Ermittlung solcher durch Protein C regulierter Gene eine brauchbare und wertvolle Information, die zu neuen therapeutischen Behandlungen durch aPC führt.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands bereitgestellt, welche mit dem apoptotischen Zelltod assoziiert sind, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt ist ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von Bcl-2 in Zellen, die durch eine Erkrankung oder einen pathologischen Zustand betroffen sind, welche mit Apoptose assoziiert sind, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von humanem IAP Homolog B in Zellen, die durch eine Erkrankung oder einen pathologischen Zustand betroffen sind, welche mit Apoptose assoziiert sind, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer Erkrankung oder einem pathologischen Zustand leidet, welche durch NF-κB induziert sind, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands, bei denen TNF-α ein primärer Modulator der Pathophysiologie ist, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands, worin PCNA oder das Gu Protein ein Regulator des Zellwachstums und Zellüberlebens ist, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands bereitgestellt, worin die Zell-Zell-Adhäsion ein Modulator der Pathophysiologie ist, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge an aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit der Aktivität von aktiviertem Protein C umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform liefert die Verwendung von aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit einer Aktivität von aktiviertem Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands, der mit apoptotischem Zelltod assoziiert ist.
  • Eine weitere Ausführungsform liefert die Verwendung von aktiviertem Protein C oder einer Verbindung mit einer Aktivität von aktiviertem Protein C zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands, worin TNF-α ein primärer Modulator der Pathophysiologie ist, worin PCNA oder das Gu Protein ein Regulator des Zellwachstums und Zellüberlebens ist, worin die Zell-Zelladhäsion ein Modulator der Pathophysiologie ist und worin die Erkrankung oder der pathologische Zustand durch NF-κB induziert wird.
  • Es wird einbezogen, dass aktiviertes Protein C, wie es für die obigen Behandlungen erwähnt wurde, humanes aktiviertes Protein C ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Testsubstanzen bereitgestellt, die die Expression von Genen induzieren oder reprimieren, welche von aktiviertem Protein C induziert oder reprimiert werden. Das Maß der Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts wird in einer ersten Probe mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C induziert wird. Das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Transla tionsprodukts in einer zweiten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C reprimiert wird.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Testsubstanzen bereitgestellt, die die Aktivität von aktiviertem Protein C auf die Induktion oder Repression von Genen modulieren. Es wird eine Zelle mit einer Testsubstanz in Kombination mit aktiviertem Protein C zusammengebracht und das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer ersten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C alleine induziert wird. Es wird eine Zelle mit einer Testsubstanz in Kombination mit aktiviertem Protein C zusammengebracht und das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer zweiten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C alleine reprimiert wird.
  • Die erste Probe in den obigen Ausführungsformen ist ein Transkript eines Gens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gennummern 1 bis 5 besteht, wie dies in 1 aufgeführt ist. Die zweite Probe der oben erwähnten Ausführungsformen ist ein Transkript eines Gens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gennummern 1 bis 15 besteht, wie dies in 2 aufgeführt ist.
  • Die 1 ist eine Tabelle, die Gene zeigt, welche durch aktiviertes Protein C induziert werden.
  • Die 2 ist eine Tabelle, die Gene zeigt, welche durch aktiviertes Protein C reprimiert werden.
  • Zum Zweck der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin beschrieben und beansprucht ist, werden die folgenden Ausdrücke wie im folgenden definiert.
  • aPC oder aktiviertes Protein C bezieht sich auf rekombinantes aktiviertes Protein C (rhAPC). Vorzugsweise ist aPC humanes Protein C (ZOVANT®, rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C, Eli Lilly &Co.) oder ein Derivat mit den proteolytischen, amidolytischen, esterolytischen und biologischen (gerinnungshemmenden, antientzündlichen oder profibrinolytischen) Eigenschaften von humanem Protein C . Beispiele für Protein C Derivate sind von Gerlitz et al., US 5 453 373 A und Foster et al., US 5 516 650 A beschrieben, deren gesamte Beschreibungen hiermit eingeführt sind. Rekombinantes, aktiviertes Protein C kann durch die Aktivierung von humanem Protein C Zymogen in vitro oder durch direkte Sekretion aus Zellen der aktivierten Form von Protein C hergestellt werden. Protein C kann in transgenen Tieren, transgenen Pflanzen oder in einer Vielzahl an eukaryontischen Zellen, einschließlich beispielsweise einer Sekretion aus humanen 293 Nierenzellen als Zymogen hergestellt und durch dem Fachmann bekannte Techniken gereinigt und aktiviert werden.
  • Behandeln – beschreibt das Management und die Sorge für einen Patienten, um eine Erkrankung, einen Zustand oder eine Störung zu bekämpfen, um die Erkrankung, den Zustand oder die Störung zu eliminieren oder prophylaktisch, um das Einsetzen der Symptome oder Komplikationen der Erkrankung, des pathologischen Zustands oder der Störung zu verhindern.
  • Kontinuierliche Infusion – die im wesentlichen ununterbrochene Fortsetzung der Einführung einer Lösung oder Suspension in eine Vene für einen bestimmten Zeitraum.
  • Bolusinjektion – die Injektion eines Arzneimittels in einer definierten Menge (Bolus genannt) über einen Zeitraum von bis zu etwa 120 Minuten.
  • Zur Verabreichung geeignet – eine lyophilisierte Formulierung oder Lösung, die zur Verabreichung als therapeutisches Mittel geeignet ist.
  • Hyperkoagulierbare Zustände – übermäßige Koagulabilität, die mit einer disseminierten intravaskularen Koagulation, präthrombotischen Zuständen, Aktivierung der Koagulation oder einer angeborenen oder erworbenen Defizienz der Gerinnungsfaktoren wie aPC assoziiert ist.
  • Zymogen – Protein C Zymogen bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf sekretierte, inaktive Formen, ob mit einer Kette oder mit zwei Ketten, von Protein C.
  • Pharmazeutisch wirksame Menge – eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Verbindung. Die bestimmte Dosis der erfindungsgemäß verabreichten Verbindung wird natürlich vom behandelnden Arzt bestimmt, der die den Fall umgebenden einzelnen Umstände evaluiert, einschließlich der verabreichten Verbindung, dem im einzelnen zu behandelnden Zustand, den Eigenschaften des Patienten und ähnlicher Betrachtungen.
  • Man gelangte zu der Erkenntnis, dass aktiviertes Protein C einen gesamten Satz an Genen moduliert, wobei die Expression ihrer mRNA und Proteinprodukte erhöht oder verringert wird. Von diesen Genen wurde vorher nicht gezeigt, dass sie durch aktiviertes Protein C moduliert werden. Die jetzt erkannte Modulierung durch aktiviertes Protein C zeigt, dass die Gene bei der Progression oder Hemmung von verschiedenen Krankheitszuständen oder pathologischen Bedingungen beteiligt sind.
  • Die Modulation der angegebenen Gene wird durch Transkriptionsprofile bestimmt, was die gleichzeitige Verfolgung der Genexpression für einen großen Teil des Genoms eines Organismus darstellt. Die Analyse der Transkriptionsprofile liefert die Information, was der molekularen Basis der Zellentwicklung und Zelldifferenzierung zugrunde liegt, identifiziert biologische und Signalübertragungswege, bestimmt Gene, die koordiniert exprimiert werden, identifiziert die Funktion von neuen Genen und liefert Erkenntnisse über die Pathophysiologie von Erkrankungen (E.S. Lander, Science 274: 536–539, 1996, E.S. Lander Nat. Genet., 21 (Supplement): 3–4, 1999, Lockhart et al., Nature Genetics 21 (Supplement). 20–24, 1999).
  • Eine Probe aus 6800 Humangenen wird auf die Wirkung von aktiviertem Protein C bezüglich ihrer Expression untersucht. Ein solches umfassendes und neutrales Screening erlaubt die Identifizierung von vielen Genen von denen bisher nicht bekannt war, dass sie von aktiviertem Protein C moduliert werden.
  • Das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts (Protein) kann mittels jeder Technik bestimmt werden, die in der Technik bekannt ist. Es können spezifische Oligonukleotidsonden für die relevanten Gene in Hybridisierungsexperimenten verwendet werden, wie dies in der Technik bekannt ist. Es kann jedes Hybridisierungsformat zur Bestimmung von RNA Mengen verwendet werden, einschließlich unter anderem cDNA Mikrotests, RT-PCR, subtraktive Hybridisierung, Northern Blots, Slot-Blots, Dot-Blots und eine Hybridisierung an Oligonukleotidsätzen. Die Spezifität der Hybridisierung kann durch Variation des Maßes an Stringenz der Hybridisierungsbedingungen untersucht werden. Zusätzlich kann ein Vergleich von nicht ganz passenden zu perfekt passenden Oligonukleotidsonden verwendet werden, um die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Um die Expressionsmengen eines spezifischen Translationsprodukts zu untersuchen, können leicht Antikörper verwendet werden, die für das Protein spezifisch sind. Erneut kann jedes in der Technik bekannte Format zum Messen spezifischer Proteinmengen verwendet werden, einschließlich von Sandwichtests, ELISAs, Immunfällungen und Western Blots. Alle monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, einkettige Antikörper und Antikörperfragmente können in solchen Tests verwendet werden. Die Spezifität von immunologischen Reaktionen kann mittels Kompetitionsantikörper oder Proteinen wie auch durch die Variation der Immunreak tionsbedingungen untersucht werden. Das Verfolgen der Expressionsproduktmengen umfasst die Bestimmung der Mengen eines spezifischen Expressionsprodukts. Bestimmte Mengen müssen nicht absolute Mengen sein, sondern können relative Mengen sein, die unter unterschiedlichen Bedingungen bestimmt werden, beispielsweise in Gegenwart und Abwesenheit einer Testverbindung.
  • Sonden können markiert oder unmarkiert, an eine andere Substanz gebunden oder in Lösung, synthetisch hergestellt oder aus der Natur isoliert sein. Sonden können Nukleinsäure, entweder RNA oder DNA, sein, die natürlich vorkommende Nukleotidbasen oder modifizierte Basen enthalten. Die Sonden können normale Nukleotidbindungen oder Peptidbindungen aufweisen. Oligonukleotidsonden können jede Länge aufweisen, die eine sinnvolle Spezifität der Hybridisierung bereitstellt. Daher können die Sonden so klein wie 10 Nukleotide sein und weisen vorzugsweise eine Länge zwischen 12 und 30 Nukleotiden auf. Jedoch können Oligonukleotidsonden signifikant länger sein und im Bereich von 30 bis 100 Nukleotiden, 100 bis 500 Nukleotiden oder 500 bis 2000 Nukleotiden liegen. Die Sonden können an Polymere gebunden sein, die entweder löslich oder unlöslich sind. Die Sonden können an feste Substrate gebunden werden, wie Filter, Blätter, Chips, Folien und Kügelchen.
  • Hochdichte Tests sind besonders zur Verfolgung der Expressionskontrolle auf der Ebene der Transkription, RNA Prozessierung und dem Abbau brauchbar (Transkriptionsprofil). Die Herstellung und Anwendung von hochdichten Tests bei der Verfolgung der Genexpression wurden kürzlich in US 6 020 135 A beschrieben, die hiermit eingeführt ist. Jedes Oligonukleotid besetzt eine bekannte Stelle auf einem Substrat. Es wird eine Nukleinsäurezielprobe mit einem hochdichten Satz an Oligonukleotiden hybridisiert und dann wird die Menge an Zielnukleinsäuren quantifiziert, die an jede Sonde im Test hybridisiert. Ein bevorzugtes Quantifizierungsverfahren ist die Verwendung eines konfokalen Mikroskops und der Fluoreszenzmarkierungen. Das GenChip® System (Affymetrix, Santa Clara, Californien) ist besonders zur Quantifizierung der Hybridisierung geeignet, jedoch ist es für den Fachmann ersichtlich, dass alle ähnlichen Systeme oder effektiv äquivalenten Detektionsmethoden ebenfalls verwendet werden können.
  • Es kann eine Vielzahl an primären Säugerzelllinien für das Transkriptionsprofil verwendet werden, um die Wirkung von aktiviertem Protein C auf die Modulation von spezifischen Genen zu analysieren. Solche Säugerzelllinien können unter anderem umfassen: Periphere Blutleukozyten, Knochenmarkszellen, Endothelzellen, pulmonale Epithelzellen, pulmonale Makrophagen, Dünndarmepithel, Keratinozyten, neuronale Zellpopulationen, Synovialzellen, Leberzellen, Nierenzellen, von der Milz stammende Zellpopulationen, Osteoblasten, Osteoklasten, Zellen der glatten Muskulatur, Myozyten (vom Skelett und dem Herzen), dendritische Zellen oder Prostatazellen. In der vorliegenden Erfindung wird das Transkriptionsprofil verwendet, um zu analysieren, wie aPC die Entzündungsreaktion in Endothelzellen moduliert. Es wird RNA aus Humanzellen der Nabelschnurvene (HUVEC), mit aPC behandelten HUVEC, mit Tumornekrosefaktor α (TNF-α) behandelten HUVEC zur Induktion eines Zustands der Zellaktivierung oder Nachahmung einer Entzündungsreaktion und mit aPC plus TNF-α behandelten HUVEC isoliert.
  • Gene, deren Transkription durch aktiviertes Protein C induziert werden, sind in 1 gezeigt. Ähnlich sind Gene, deren Transkription durch aktiviertes Protein C reprimiert wird, in 2 und in Beispiel 2 gezeigt.
  • Aktiviertes Protein C induziert die Genexpression von humanem A1 (bcl-2 Homolog) und humanem IAP Homolog B (MIHB), wie dies in 1 und Beispiel 1 gezeigt ist. Die bcl-2 Familienmitglieder hemmen die meisten Typen des apoptotischen Zelltods und dürften durch die Regulation eines Antioxidanswegs an Stellen einer Bildung von freien Radikalen die Funktion ausüben (Hockenberry et al., Cell 75: 241–251, 1993). Apoptose ist der Ausdruck, der zur Beschreibung eines Zelltodtyps verwendet wird, der in vielen Geweben als normaler physiologischer Prozess auftritt. Auch „programmierter Zelltod" genannt, umfasst diese Form des Zellsterbens die Aktivierung eines eingebauten genetischen Programms für einen Zellselbstmord, bei dem Zellen sich im wesentlichen selbst verdauen. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Hemmung der Apoptose durch aktiviertes Protein C. Dies wurde in mehreren Zelltypen beispielhaft demonstriert, wie dies in Beispiel 3 gezeigt ist.
  • Im Gegensatz zum Effekt der Apoptose als normales zelluläres Phänomen, kann der Tod von Zellen durch Apoptose, wenn diese unregelmäßig reguliert ist, zu einer Vielzahl an Erkrankungszuständen und pathologischen Bedingungen führen. Beispielweise zeigt der Tod von Neuronen, der bei Erkrankungen auftritt, wie Alzheimersche Demenz und Parkinsonsche Erkrankung, viele Charakteristika von Apoptose. Autoimmmunerkrankungen, bei denen Immunzellen normale Gewebe unerwünscht angreifen, kommen teilweise von einer fälschlicherweise nicht auftretenden Apoptose. Zusätzlich kann der Zelltod, der durch eine virale Infektion verursacht wird, in vielen Fällen durch Apoptose auftreten, einschließlich eines T-Zelltods, der durch das humane Immundefizienzvirus (HIV) induziert wird, das AIDS verursacht.
  • MIHB ist ein Homolog von IAP, das ein hemmendes Apoptoseprotein ist. Daher hemmt die Induktion von bcl-2 und/oder MH1B die Apoptose, was wiederum Krankheiten oder pathologische Zustände hemmt, die mit Apoptose zusammenhängen. Daher ist aktiviertes Protein C durch die Induktion der Genexpression von bcl-2 und/oder MH1B zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, die mit Apoptose assoziiert sind. Bevorzugte Erkrankungen oder pathologische Zustände, die mit Apoptose assoziiert sind, bei denen Protein C zur Behandlung brauchbar ist, sind rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Vaskulitis, ischämisches Nierenversagen, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Pankreatitis, Psoriasis, multiple Sklerose, Hashimoto Thyreoiditis, Morbus Grave, systemischer Lupus erythematodes, autoimmune Gastritis, fibroide Lungenerkrankung, durch HIV-induziertes Lymphom, fulminante, vitale Hepatitis B, fulminante, vitale Hepatitis C, chronische Hepatitis, chronische Zirrhose, H. pylori-assoziierte Ulceration, Atherosklerose, Zellschutz während der Krebsbehandlung, chronische Glomerulonephritis, Osteoporose, aplastische Anämie, Myelodysplasie, Alzheimersche Erkrankung und Parkinsonsche Erkrankung. Aktiviertes Protein C induziert die Genexpression von humanem, proliferierendem Zellkernantigen (PCNA) und humanem Gu Protein, wie dies in 1 und Beispiel 1 gezeigt ist. Das proliferierende Zellkernantigen (PCNA) spielt eine wichtige Rolle beim Nukleinsäuremetabolismus als Komponente der Replikation- und Reparaturmaschinerie. Eine der gut etablierten Funktionen für PCNA ist dessen Rolle als Prozessivitätsfaktor für die DNA Polymerase δ und ε. PCNA heftet die katalytische Polymeraseeinheit an die DNA Matrize für eine schnelle und prozessive DNA Synthese und ist daher mit Zellwachstum und Zellüberleben assoziiert. Das Gu Protein ist ein Vertreter einer neuen Untergruppe an RNA Helicasen und ist mit dem Zellwachstum und Zellüberleben assoziiert. Daher ist aktiviertes Protein C zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands brauchbar, worin PCNA oder das Gu Protein ein Regulator des Zellwachstums und des Zellüberlebens ist. Beispiele für eine solche Regulation umfassen unter anderem die Regulation des Zellwachstums von Endothelzel len und die Erhöhung der Angiogenese, die bei der Wundheilung und der Wiederherstellung des Blutflusses in Geweben nach einer Verletzung oder Beschädigung erforderlich ist.
  • Das aktivierte Protein C induziert die Genexpression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (ENOS), wie dies in 1 aufgeführt ist. ENOS ist bei der Kontrolle der Blutplättchenfunktion sowohl in vitro als auch in vivo beteiligt. Die Blutplättchenhämostase wird durch die Freisetzung von ENOS aus dem Endothel, dem Endokard und den Blutplättchen selbst aufrechterhalten. ENOS, das in diesem System generiert wurde, hemmt die Adhäsion und Aggregation der Blutplättchen und fördert die Disagggregation von vorgeformten Blutplättchenaggregaten. Zusätzlich ist ENOS mit der Relaxierung des glatten Muskels assoziiert.
  • Die hemmende Aktivität von ENOS ist vor allem durch dessen Wechselwirkung mit der löslichen Guanylatcyclase und die resultierende Erhöhung von cGMP bedingt. Die anschließenden durch cGMP vermittelten Reaktionen sind weniger klar, aber sie führen zur Hemmung der Expression der Blutplättchenglycoproteine, einschließlich von IIb/IIIa und P-Selektin. Die abnehmende Bildung von endothelialer ENOS wird mit einem schädlichen Effekt auf die Integrität der Gefäßwände aufgrund der Endothelzellaktivierung und der Blutplättchenadhäsion in Zusammenhang gebracht. Daher ist aktiviertes Protein C durch die Induktion der Genexpression der endothelialen ENOS zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen aufgrund der Endothelzellaktivierung und Blutplättchenadhäsion brauchbar. Beispiele für solche Erkrankungen sind unter anderem koronare, Arterienatherosklerose, arterielle Restenose nach einer Ballonangioplastie, Bluthochdruck, Herzversagen, Koronarerkrankung nach einer Transplantation und durch Schwangerschaft induzierter Bluthochdruck und Präeklampsie.
  • Unerwarteterweise reprimiert aktiviertes Protein C die Expression des Gens für den Kernfaktor kappa B (NF-κB), wie dies in 2 aufgeführt ist. NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, der durch eine große Vielzahl an Mittel aktiviert wird, einschließlich den entzündlichen Cytokinen IL-1 und TNF. Als Transkriptionsfaktor4 reguliert NF-κB die Expression von Genen, die bei der Immunzellaktivierung, der Entwicklung von B- und T-Zellen und antiviralen und antimikrobiellen Reaktionen beteiligt ist. Die Fähigkeit von aPC zur Hemmung von Effekten, die durch NF-κB vermittelt werden, ist zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, bei den NF-κB induziert ist. Beispiele für spezifische Erkrankungen oder pathologische Zustände, die mit einer Induktion von NF-κB assoziiert sind, umfassen unter anderem neuronale Degenerationserkrankungen, Graft-versus-Host Reaktionen, akute Entzündungszustände, systemische Entzündungsreaktionen, Akutphasenreaktion, ischämische Reperfusionsverletzung, Atherosklerose, HIV Infektion und Krebs.
  • Die Wirkungen von TNF-α als entzündliches Cytokin sind in der Technik gut bekant. Die Fähigkeit von aPC zur Hemmung von Effekten, die durch TNF-α vermittelt werden, wie dies in 2 und Beispiel 1 gezeigt ist, ist zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, worin TNF-α ein primärer Modulator der Pathophysiologie ist. Beispiele für spezifische Erkrankungen oder pathologische Zustände, die mit der Induktion von TNF-α assoziiert sind, umfassen unter anderem Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Arthritis, akute peritoneale Entzündung und Herzversagen.
  • Aktiviertes Protein C unterdrückt die TNF-α Induktion der MHC Klasse 1 Gene, wie dies in 2 aufgeführt ist. In allen Vertebraten gibt es eine genetische Region, die einen Haupteinfluss auf das Überleben des Transplantats hat. Diese Region wird als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) bezeichnet. Individuen, die bezüglich dieser Region identisch sind, können Transplantate erfolgreicher austauschen als bei einem MHC mit nicht identischen Kombinationen. Die MHC Produkte spielen eine wichtige Rolle bei der Antigenerkennung durch T-Zellen. Daher ist aPC bei der Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, bei denen die MHC Klasse 1 oder HLA-B Null Allele Modulatoren der Immunfunktion sind. Beispiele für solche Erkrankungen oder pathologischen Zustände umfassen unter anderem Organtransplantation, Infektionserkrankungen oder Autoimmunerkrankungen.
  • Das aktivierte Protein C reprimiert die Transkription von B61 und der beta-Isoformvariante des Lymphotoxins, wie dies in 2 aufgeführt ist. Die Produkte dieser Gene sind proinflammatorische Cytokine. Daher ist aktiviertes Protein C zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, die von Natur aus entzündlich sind. Beispiele für diese Erkrankungen oder pathologischen Zustände sind unter anderem akute Entzündungsreaktionen, systemische Entzündungsreaktionen, Akutphasenreaktion und akute peritoneale Entzündung.
  • Das aktivierte Protein C reprimiert die Transkription von ELAM-1, VCAM-1, PECAM-1 und des humanen CX3C Chemokinvorläufers, wie dies in 2 und Beispiel 2 gezeigt ist. Die Produkte dieser Gene sind in einer Zell-Zell-Adhäsion und einer Zell-Zell-Wechselwirkung beteiligt. Daher ist aktiviertes Protein C bei der Behandlung von Erkrankungen oder pahthologischen Zuständen brauchbar, bei denen eine Zell-Zell-Adhäsion ein Modulator der Pathophysiologie ist.
  • Aktiviertes Protein C reprimiert die Transkription von Calreticulin, wie dies in 2 aufgeführt ist. Autoantikörper gegenüber Calreticulin wurden mit mehreren Autoimmunstörungen assoziiert. Daraus folgt, dass die abnehmende Menge an Calreticulin durch eine Transkriptionsrepression wiederum zu weniger gebildeten Autoantikörpern führt. Daher ist aktiviertes Protein C zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, worin Anti-Calreticulinantikörper ein Modulator der Pathophysiologie sind. Beispiele für solche Erkrankungen oder pathologischen Zustände sind unter anderem systemischer Lupus erythematodes, Sjögren Syndrom, Onchozerkose, rheumatoide Arthritis, gemischte Bindegewebserkrankung und vollständiger, angeborener Herzleitungsblock.
  • Das aktivierte Protein C reprimiert die Transkription von Thrombospondin (TSP-1), wie dies in Beispiel 2 angegeben ist. TSP-1 ist ein extrazelluläres Matrixglycoprotein, das durch eine Vielzahl an Zelltypen synthetisiert und sekretiert wird, einschließlich Endothelzellen und Tumorzellen. TSP-1, das durch aktivierte Blutplättchen freigesetzt wird, ist bei der Bildung von molekularen Brücken zwischen Blutplättchen und Leukozyten beteiligt, die als Teil des Entzündungsprozesses rekrutiert werden. TSP-1 reguliert auch die Angiogenese durch die Wirkung auf die Adhäsion und Proliferation der Endothelzellen und dürfte bei der Progression von Tumoren eine Rolle spielen. TSP-1 ist ein Aktivator von TGF-β, einem Cytokin, das im Zellwachstum, der Differenzierung und der Immunmodulation beteiligt ist. Die Induktion von TGF-β ist mit der Nierenfibrose und der kardialen Hypertrophie nach einem Myokardinfarkt assoziiert. Daher ist aktiviertes Protein C brauchbar zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen, die mit erhöhten Mengen an TSP-1 und TGF-β assoziiert sind. Beispiele für solche Erkrankungen oder pathologischen Zustände umfassen unter anderem Brustkrebs, GI Malignitäten, gynäkologische Krebsarten, Lungenkrebs, Nierenfibrose und kardiale Hypertrophie nach einem Myokardinfarkt.
  • Das aktivierte Protein C reprimiert die Transkription von RDC1, wie dies in 2 angegeben ist. RDC1 ist mit der Familie der als G-Protein-gekuppelten Rezeptoren verwandt. Es ist bekannt, dass viele signifikante biologische Prozesse durch die Teilnahme an Signalübertragungswegen vermittelt werden, die G-Proteine umfassen. Daher ist das aktivierte Protein C zur Behandlung von Erkrankungen oder pa thologischen Zuständen brauchbar, die mit erhöhten Spiegeln von RDC1 assoziiert sind. Beispiele für solche Erkrankungen oder pathologischen Zustände sind unter anderem Infektionen durch Bakterien, Pilze, Protozoen und Viren, insbesondere Infektionen, die durch HIV-1 oder HIV-2 verursacht werden, Schmerz, Krebsarten, Anorexie, Bulimie, Asthma, Parkinsonsche Erkrankung, akutes Herzversagen, zu geringer Blutdruck, Bluthochdruck, Harnverhalt, Osteoporose, Angina pektoris, Geschwüre, Allergien, benigne prostatische Hypertrophie und psychotische und neurologische Störungen, einschließlich Angst, Schizophrenie, manische Depression, Delirium, Demenz, schwere mentale Retardierung und Dyskinesien, wie Huntington Erkrankung oder Gilles de la Tourette Syndrom.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Verbindungen oder Testsubstanzen bereitgestellt, die die Expression von Genen induzieren oder reprimieren, welche durch aktiviertes Protein C induziert oder reprimiert werden. Das Maß der Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer ersten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C induziert wird. Das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer zweiten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C reprimiert wird.
  • Der bevorzugte Zelltyp für die obige Ausführungsform ist die Endothelzelle, obwohl andere Zelltypen in Betracht gezogen werden können und von der vorliegenden Erfindung miterfasst werden. Die erste Probe in der obigen Ausführungsform ist ein Gentransript von einem oder mehreren Genen, vorzugsweise 2 bis 5 Genen, vor allem 5 Genen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den in 1 beschriebenen Genen besteht. Die zweite Probe in der obigen Ausführungsform ist ein Gentranskript von einem oder mehreren Genen, vorzugsweise 2 bis 14 Genen oder bevorzugter 7 bis 14 Genen, vor allem 14 Genen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche in 2 beschrieben ist.
  • In einem weiteren Aspekt wird ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Testsubstanzen bereitgestellt, die die Aktivität von aktiviertem Protein C bezüglich der Induktion oder Repression von Genen modulieren. Es wird eine Zelle mit einer Testsubstanz in Kombination mit aktiviertem Protein C zusammengebracht und das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer ersten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C alleine induziert wird.
  • Es wird eine Zelle mit einer Testsubstanz in Kombination mit aktiviertem Protein C zusammengebracht und das Maß an Expression eines RNA Transkripts oder dessen Translationsprodukts in einer zweiten Probe wird mit dem Maß an Expression verglichen, das durch aktiviertes Protein C alleine reprimiert wird.
  • Der bevorzugte Zelltyp für die obige Ausführungsform ist die Endothelzelle, obwohl andere Zelltypen in Betracht gezogen werden können und von der vorliegenden Erfindung miterfasst werden. Die erste Probe in der obigen Ausführungsform ist ein Gentranskript von einem oder mehreren Genen, vorzugsweise 2 bis 5 Genen, vor allem 5 Genen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den in 1 beschriebenen Genen besteht. Die zweite Probe in der obigen Ausführungsform ist ein Gentranskript von einem oder mehreren Genen, vorzugsweise 2 bis 14 Genen oder bevorzugter 7 bis 14 Genen, vor allem 14 Genen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche in 2 beschrieben ist.
  • Verbindungen, die in einem oder mehreren der obigen Screenings identifiziert werden, könnten die Aktivität von aktiviertem Protein C aufweisen oder würden die Protein C Aktivität modulieren und wären zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen brauchbar, die wirksam mit aktiviertem Protein C behandelt werden, wie dies hierin beschrieben ist. Die identifizierten Verbindungen können alleine oder in Kombination mit aktiviertem Protein C verabreicht werden. Der Ausdruck "in Kombination mit" bezieht sich auf die Verabreichung einer Verbindung mit aktiviertem Protein C, entweder gleichzeitig, sequenziell oder einer Kombination hiervon.
  • Protein C kann gemäß bekannter Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, die als Wirkstoff aPC und einen pharmazeutisch annehmbaren Feststoff oder Träger umfasst. Beispielsweise wäre eine gewünschte Formulierung eine, die ein stabiles lyophilisiertes Produkt mit hoher Reinheit ist, die einen Füllstoff enthält, wie Saccharose, ein Salz, wie Natriumchlorid, einen Puffer, wie Natriumcitrat und aktiviertes, humanes Protein C. Eine bevorzugte stabile lyophilisierte Formulierung umfasst ein Gewichtsverhältnis von etwa 1 Teil aktiviertem Protein C, zwischen 7 bis 8 Teilen Salz und zwischen etwa 5 und 7 Teilen Füllstoff. Beispiele für stabile lyophilisierte Formulierungen umfassen: 5,0 mg/ml aktiviertes Protein C, 30 mg/ml Saccharose, 38 mg/ml NaCl und 7,56 mg/Gläschen Citrat, pH 6,0 und 20 mg/Gläschen aktiviertes Protein C, 120 mg/ml Saccharose, 152 mg/Gläschen NaCl, 30,2 mg/Gläschen Citrat, pH 6,0.
  • Vorzugsweise wird das Protein C parenteral verabreicht, um die Abgabe in den Blutstrom in einer wirksamen Form sicherzustellen, indem man eine Dosis von 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 10,0 mg/kg/Tag B.I.D. (zweimal am Tag) für 1 bis 10 Tage injiziert. Bevorzugter wird das Protein C B.I.D. für 3 Tage verabreicht.
  • Alternativ dazu wird das Protein C als kontinuierliche Infusion für 1 bis 240 Stunden verabreicht. Bevorzugter wird das Protein C als kontinuierliche Infusion für 1 bis 196 Stunden verabreicht. Noch bevorzugter wird Protein C als kontinuierliche Infusion für 1 bis 144 Stunden verabreicht. Noch bevorzugter wird das Protein C als kontinuierliche Infusion für 1 bis 96 Stunden verabreicht.
  • Die Menge an verabreichtem Protein C durch kontinuierliche Infusion beträgt etwa 0,01 μg/kg/h bis etwa 50 μg/kg/h. Bevorzugter beträgt die Mange an verabreichtem humanem Protein C Derivat etwa 0,1 μg/kg/h bis etwa 40 μg/kg/h. Noch bevorzugter beträgt die Menge an verabreichtem Protein C etwa 1 μg/kg/h bis etwa 30 μg/kg/h. Die am meisten bevorzugten Mengen an verabreichtem Protein C betragen etwa 24 μg/kg/h.
  • Die bevorzugten Plasmaspiegel, die durch die Menge an verabreichtem Protein C erhalten werden, betragen 0,02 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml. Bevorzugter reichen die Plasmaspiegel von etwa 0,2 ng/ml bis 50 ng/ml. Am meisten bevorzugt reichen die Plasmaspiegel von etwa 2 ng/ml bis etwa 60 ng/ml und noch bevorzugter etwa 40 ng/ml bis etwa 50 ng/ml.
  • In einer anderen Alternative wird das Protein C durch die Injektion eines Teils (1/3 bis 1/2) der geeigneten Dosis pro Stunde als Bolusinjektion über einen Zeitraum von etwa 5 Minuten bis etwa 120 Minuten, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion der geeigneten Dosis für bis zu 240 Stunden verabreicht.
  • In einer anderen Alternative wird das Protein C durch eine lokale Abgabe über einen Intrakoronarkatheter als Zusatz bei einer Hochrisikoangioplastie verabreicht (mit und ohne Stents und mit oder ohne einer antithrombotischen Kombinationstherapie mit oder ohne Antithrombozytenmitteln). Die Menge an verabreichtem Protein C reicht von etwa 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 10,0 mg/kg/Tag über eine kontinuierliche Infusion, Bolusinjektion oder eine Kombination hiervon.
  • In einer anderen Alternative wird aPC direkt in die Gelenke injiziert.
  • In einer weiteren Alternative wird Protein C subkutan mit einer Dosis von 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 10,0 mg/kg/Tag verabreicht, um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Formulierung für subkutane Präparationen wird mittels bekannter Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen ausgeführt.
  • Die folgenden Beispiele werden nur zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Der Umfang der Erfindung soll nicht so aufgefasst werden, dass er nur aus den folgenden, erläuternden Beispielen besteht.
  • Präparation 1
  • Herstellung von humanem Protein C
  • Rekombinantes, humanes Protein C (r-hPC) wird in humanen 293 Nierenzellen durch dem Fachmann gut bekannte Techniken hergestellt, wie dies in Yan, US 4 981 952 A , Bang et al., US 4 775 624 A und US 4 992 373 A und Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189–1192 beschrieben ist.
  • Rekombinantes, humanes Protein C (r-hPC) wird durch in der Technik bekannte Verfahren aktiviert. Genauer gesagt wird r-hPC mit Rinderthrombin aktiviert, wie dies in Carlson et al., US 6 159 468 A beschrieben ist.
  • Beispiel 1
  • Modulation von Apoptosemarkern durch rekombinantes, humanes, aktiviertes Protein C
  • Es wird ein Transkriptionsprofil mittels der Affymetrix DNA Chiptechnologie verwendet, um zu analysieren, wie aPC die mit der Apoptose assoziierten Gene moduliert, wobei primäre, humane Endothelzellen verwendet werden. Die RNA wird aus humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) und aus HUVEC isoliert, die folgendermaßen mit aPC behandelt werden. Gesammelte HUVEC PO96 Zellen werden als erste Passage von Clonetics (Katalog Nr. CC-2519, Batchnummer 6F0081) erhalten und in Clonetics EBM Basalmedium kultiviert, das mit 2 % fetalem Rinderserum, 12 μg/ml Gentamicin und 50 ng/ml Amphotericin B supplementiert ist (Clonetics EGM BelletKit, Katalog Nr. CC3124). Die Zellen werden dreimal passagiert und dann bis zu etwa 80–90 % Konfluenz in 60 ml Medium vor der Behandlung angezogen. Das Medium wird etwa 6 Stunden vor der Behandlung gewechselt. Zweiundfünfzig T225 Kulturflaschen werden in vier Behandlungsgruppen mit jeweils 13 Kulturflaschen aus Kontrolle, aPC, TNF-α und APC + TNF-α eingeteilt. Die Zellen werden mit 183 nM rekombinantem humanem aPC (Lilly Batchnummer PPD02890) oder einem gleichen Volumen Träger (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl) für 9 Stunden oder 1 ng/ml TNF-α (R&D Systems) oder einem gleichen Volumen an Träger (0,1 % BSA in PBS) für 7 Stunden behandelt. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und dann durch eine Behandlung mit Trypsin abgelöst (6 ml 0,025 % Trypsin/EDTA pro Kulturflasche für 5 Minuten). Nach der Hemmung des Trypsins mit 6 ml Trypsinneutralisierungslösung werden die Zellen für 5 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert. Die Zellpellets werden für maximal 30 Minuten auf Eis gehalten bis sie in Trizol (10 ml Gesamttrizol pro 13 Kulturflaschen jeder Behandlung) resuspendiert werden. Die Poly-A-RNA wird durch herkömmliche Verfahren isoliert und wird markiert und mit Oligonukleotidtests hybridisiert, die die Analyse der Genexpression erlauben. Das Experiment wird zweifach ausgeführt. Die entstehenden Daten werden mittels im Handel erhältlicher Software (GeneChip, Affymetrix) analysiert. Die revers transkribierende PCR (RT-PCR) wird verwendet, um die anfänglichen Beobachtungen aus den Genchips zu bestätigen. Wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird festgestellt, dass sowohl der Antiapoptosefaktor Bcl-2 als auch der Marker PCNA durch die Behandlung der HUVECs mit aPC hochreguliert werden.
  • Tabelle 1: Modulation von Genen, die mit dem Zellüberleben und der Apoptose assoziiert sind Relativer Expressionsspiegel
    Figure 00120001
  • Es wird auch beobachtet, dass Gene, die durch aPC supprimiert werden, das B6 Gen umfassen, ein unmittelbar früh reagierendes Gen des Endothels, das bei der Vermittlung der Reaktion des vaskulären Endothels auf proinflammatorische Cytokine beteiligt sein dürfte (Holzuman et al., MCB 10: 5830). Es wird eine signifikante Suppression beobachtet, wie dies durch den Verlust des detektierbaren mRNA Signals nach einer aPC Behandlung gezeigt wird (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu zeigen mit TNF behandelte Zellen als Kontrolle für die Genreaktion eine elffache Steigerung von B6.
  • Tabelle 2: Modulation des mit der proinflammatorischen Reaktion assoziierten B6 Gens
    Figure 00120002
  • Beispiel 2
  • Identifizierung von Genen, die durch aktiviertes Protein C moduliert werden, wobei eine subtraktive Hybridisierung verwendet wird
  • Die subtraktive Hybridisierung ist eine sehr gute Technik, die es den Forschern ermöglicht, zwei Populationen der mRNA zu vergleichen und Klone von Genen zu erhalten, die in einer Population exprimiert werden, aber nicht in der anderen. Die subtraktive Hybridisierung wird verwendet, um Gene zu identifizieren, die durch aktiviertes Protein C herauf- oder herabreguliert werden. HUVEC Zellen werden mit aPC behandelt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Poly-(A)-RNA wird aus Zellen durch herkömmliche Techniken isoliert und zur Konstruktion von revers (Genbank, die durch aPC herabreguliert wird) und vorwärts (Genbank, die durch aPC heraufreguliert wird) subtrahierten Genbanken mittels eines im Handel erhältlichen Kits verwendet (Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit). Es werden mehrere Gene in der revers subtrahierten Genbank als unterschiedlich exprimiert identifiziert, einschließlich unter anderem Thrombospondin 1 und PECAM 1. Die Herabregulierung dieser Gene durch aPC wird mittels der RT-PCR Standardanalyse der ursprünglichen RNA validiert, die aus den Kontroll- und mit aPC behandelten HUVECs isoliert wurde. Die Herabregulierung dieser Gene durch aPC wird durch Western Blot und Durchflusscytometrieanalyse bestätigt.
  • Beispiel 3
  • Hemmung von Apoptose durch rhAPC
  • Die Hemmung der Apoptose durch rhAPC in primären, humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVE) oder der immortalisierten Endothelzelllinie (Eahy926) ist im folgenden unter Verwendung des APOPervcentage® Apoptosetests gezeigt. Der APOPercentage® Apoptosetest wird gemäß den Anleitungen des Herstellers ausgeführt (Biocolor Ltd., Belfast, N. Ireland). Kurz gesagt werden adhärente Zellen (HUVEC, Eahy926 oder 293) mit 3 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgebracht und mit 1 μg/ml Staurosporin (Sigma, St. Louis, MO) für 1 Stunde oder mit Staurosporin und rhAPC (Vorbehandlung 16 Stunden) behandelt. Staurosporin ist ein Alkaloid, das aus der Kulturbrühe von Streptomyces staurospores isoliert wird und ein potenter Inhibitor der Proteinkinase C und Induktor der Apoptose ist.
  • Die Zellen werden präpariert und gemäß den Anleitungen des Herstellers gefärbt. Eine signifikante Hemmung der Apoptose durch rhAPC wird sowohl bei den HUVEC (Tabelle 3) als auch den Eahy926 (Tabelle 4) Endothelzelllinien beobachtet.
  • Tabelle 3
    Figure 00130001
  • Tabelle 4
    Figure 00130002
  • Die Hemmung der Apoptose durch rhAPC in U937 Monozyten mittels des intrazellulären Caspase-3 Färbesystems ist in Tabelle 5 gezeigt.
  • Die intrazelluläre Caspase-3 Färbung wird folgendermaßen ausgeführt. U937 Zellen werden bis 1 × 106 Zellen pro ml angezogen. Die Zellen werden für 16 Stunden mit rhAPC vorbehandelt. Dann wird Staurosporin mit 1 μg/ml für 3 Stunden zugegeben. Die Zellen werden mit HBSS gewaschen, das frei von Calcium und Magnesium ist, pelletiert und mit PBS/1 % Albumin mit 0,02 % Na-Azid gewaschen. Die Zellen werden dann fixiert und mit Cytofix/Cytoperm® Kit (PharMingen/BD, San Diego, CA) permeabilisiert. Die intrazelluläre Färbung erfolgt mit anti-aktiv Caspase-3 (PharMingen/BD, San Diego, CA) mit 10 μl pro 1 × 106 Zellen für 30 Minuten bei 4°C. Die Zellen werden pelletiert, in PBS/ Albuminpuffer mit 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert und mit einem Coulter Flow Cytometer (Coulter®) analysiert. Eine signifikante Hemmung der Apoptose durch rhAPC wird in der U937 Zelllinie beobachtet.
  • Tabelle 5
    Figure 00140001
  • Die Hemmung der Apoptose durch rhAPC in U937 Zellen und 293 Zellen mittels des Annexin V Tests ist jeweils in den Tabellen 6 und 7 gezeigt. Der Annexin V Färbetest wird wie folgt ausgeführt. Nicht adhärente Zellen (U937 Monocyten und 293 Nierenzellen) werden auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen pro ml Medium angezogen. Die Zellen werden mit rhAPC für 16 Stunden vorbehandelt. Es wird 1 μg/ml Staurosporin für 3 bis 3,5 Stunden zugegeben. Die Zellen werden auf 5 × 105 Zellen verdünnt und sowohl mit Antiannexin V-FITC und Propidiumiodid gemäß dem Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit gefärbt (Oncogene Research Products, Boston, MA). Die Fluoreszenzdetektion der Annexin V Färbung wird mittels des Coulter Flow Cytometers (Coulter®) ausgeführt. Man beobachtet eine signifikante Hemmung der Apoptose durch rhAPC sowohl in den U937 Zellen als auch den 293 Zellen.
  • Tabelle 6
    Figure 00140002
  • Tabelle 7
    Figure 00140003
  • Beispiel 4
  • Wirkung auf rhAPC auf die Adhäsionsmolekülexpression
  • Die Wirkung von rhAPC auf die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, E-Selektin und VCAM-1 ist in Tabelle 8 gezeigt. HUVEC oder Eahy926 Endothelzellen, die in T-75 Kulturflaschen auf 80–90 % Konfluenz angezogen wurden, werden für 16 Stunden mit rhAPC (5 μg/ml) und/oder Tumornekrosefaktor alpha (TNF 1 ng/ml für 7 Stunden) vorbehandelt. Die Expression des Adhäsionsproteins wird durch Durchflusscytometrie untersucht. Die Daten für die Adhäsion werden zur mittleren Maximalreaktion von TNF verglichen. Der primäre Antikörper wird mit 1–2 μg/ml in 100 μl FACS Puffer (PBS, Albumin 5 %, Natriumazid 0,02 %) für 30 Minuten bei 4°C angewendet. Der sekundäre Antikörper, ein anti-Maus-IgG-FITC wird mit 1 μg/ml in 100 μl FACS Puffer bei 4°C für 30 Minuten angewendet. Die FACS Analyse wird mittels eines Coulter Flow Cytometers (Coulter®) gemessen. Die primären Antikörper richten sich gegen die Adhäsionsmarker ICAM-1, E-Selektin und VCAM-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Man beobachtet eine signifikante Suppression durch rhAPC der Expression von ICAM-1 und E-Selektin.
  • Tabelle 8
    Figure 00150001
  • Beispiel 5
  • Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen, die mit Apoptose assoziiert sind
  • Dieses Protokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit Multipler Sklerose, die viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies vorher beschrieben wurde.
  • Für die Multiple Sklerose verabreicht der behandelnde Arzt rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Ein weiteres Protokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit Hashimoto Tyreoiditis, die viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Für eine Hashimoto Tyreoiditis verabreicht der behandelnde Art rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Ein weiteres Protokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit Graves Erkrankung, die viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Für eine Graves Erkrankung verabreicht der behandelnde Arzt rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Ein zusätzliches Behandlungsprotokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit chronischer Hepatitis, die viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Für eine chronische Hepatitis verabreicht der behandelnde Arzt rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Ein weiteres Protokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, der viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Für einen systemischen Lupus erythematodes verabreicht der behandelnde Arzt rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Ein weiteres Protokoll ist ein kontrollierter Versuch bei Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung oder Parkinsonsche Erkrankung, die viele Kennzeichen der Apoptose zeigt und mit rhAPC oder rhAPC Derivaten behandelt wird, wie dies hierin beschrieben ist.
  • Für eine Alzheimersche Erkrankung oder Parkinsonsche Erkrankung verabreicht der behandelnde Arzt rhAPC oder ein rhAPC Derivat subkutan mit einer Dosis von 0,5 mg/Tag um eine langsamere Freisetzung in den Blutstrom sicherzustellen. Die Behandlung wird fortgesetzt, bis der Patient von den Symptomen der Störung befreit ist.
  • Für alle oben erwähnten Behandlungsprotokolle wird die bestimmte Dosis des verabreichten rhAPC oder des rhAPC Derivats und der Verabreichungsweg vom behandelnden Arzt unter Evaluierung der bestimmten Umstände ausgewählt, die den Fall umgeben, einschließlich der verabreichten Verbindung, dem im einzelnen zu behandelnden Zustand, den Eigenschaften des Patienten und ähnlichen Betrachtungen.

Claims (2)

  1. Verwendung von aktiviertem Protein C oder Derivaten hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands, worin die Erkrankung Pankreatitis ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das aktivierte Protein C humanes aktiviertes Protein C ist.
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