KR101284884B1

KR101284884B1 - 정상의 세포보호 활성 및 저하된 항응고 활성을 지닌활성화 단백질 ｃ 변이체

Info

Publication number: KR101284884B1
Application number: KR1020067000567A
Authority: KR
Inventors: 존 에이치. 그리핀; 로렌트 오. 모스니어; 앤드류 제이. 게일
Original assignee: 더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date: 2003-07-08
Filing date: 2004-07-08
Publication date: 2013-07-10
Also published as: CA2531695A1; JP2007528847A; US7498305B2; JP4986618B2; EP1651252A2; US20100028910A1; WO2005007820A2; EP1651252B1; WO2005007820A3; KR20060111442A; EP1651252A4; US20050037964A1

Abstract

실질적으로 항응고 활성은 감소하나 항-세포사멸 활성은 정상 레벨을 유지하는 재조합 활성 단백질 C (APC) 또는 재조합 단백질 C (APC로 전환될 수 있는 전구약물)의 변이체를 제공한다. 상기 재조합 APC 변이체의 두가지 예로는 3K3A-APC 및 229/230-APC 이 있다. 본 발명의 APC 변이체 및 전구약물은 세포보호 효과(항-세포사멸 효과) 및 출혈 위험의 대폭 감소라는 바람직한 특성을 지닌다. 본 발명은 또한 APC의 항응고 활성과 무관하게 APC의 세포보호 활성의 이익을 받게 될 환자를 치료하는데 상기 APC 변이체 또는 전구약물을 사용하는 방법도 제공한다. 이들 대상은 적어도 일부가 세포사멸로 인한 각종 기관의 혈관이나 조직의 손상 위험에 노출된 환자를 포함한다. 위험에 노출된 환자란 여러 조건 중에서도 예를 들면, 패혈증, 허혈/재관류 손상, 허혈성 뇌졸증, 급성 심근경색, 급성 또는 만성 신경퇴행성 질환, 또는 기관 이식이나 화학 요법 등을 받은 환자를 포함한다. 본 발명에 따른 유용한 재조합 단백질 C 또는 APC의 변이체를 스크리닝 하는 방법도 또한 제공된다.

Description

정상의 세포보호 활성 및 저하된 항응고 활성을 지닌 활성화 단백질 Ｃ 변이체 {ACTIVATED PROTEIN C VARIANTS WITH NORMAL CYTOPROTECTIVE ACTIVITY BUT REDUCED ANTICOAGULANT ACTIVITY}

본 발명은 정상적으로 항-응고성, 항-염증성 및 항-세포사멸 활성을 가진 효소인 재조합 단백질 C 및 활성 단백질 C 의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 활성 단백질 C 의 변이체는 현저히 감소된 항응고 활성을 가지면서도 거의 정상에 가까운 항-세포사멸(세포보호) 활성을 유지하므로, 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비는 야생형 또는 내인성 활성 단백질 C 의 경우보다 상기 변이체에서 더 크다. 본 발명은 또한 이들 변이체를 사용하는 방법에도 관한 것이다. 본 발명의 활성 단백질 C 변이체는 특히, 스트레스를 받거나 손상된 신경계 세포나 조직의 세포자살 또는 세포사멸의 억제자 및/또는 세포 생존 인자로서 유용하다. 본 발명은 또한, 적어도 일부는 세포사멸에 의해 야기된 세포 손상의 위험에 처한 대상에 대해 본 발명의 변이체를 치료학적으로 사용하는 방법, 및 활성 단백질 C 치료법의 부작용인 출혈의 위험을 낮추면서 원하는 세포보호의 유리함을 제공하는 돌연변이 단백질 함유 조성물에 관한 것이다.

단백질 C 는 비타민 K-의존형 세린 프로테아제 응집 인자 종류의 한 성분이 다. 단백질 C 는 본래 항응고 활성 및 프로피브리노겐화(profibrinolytic) 활성이 확인되었다. 혈액을 순환하는 단백질 C 는 복잡한 자연 피드백 메카니즘을 통하여 혈액 응고를 조정하기 위해 단백질 분해 활성을 필요로 하는 비활성 지모겐(zymogen) 이다. 인간 단백질 C 는 일차적으로 461 아미노산의 단일 폴리펩티드로서 간 속에서 만들어진다. 이 선구체 분자는 그 뒤 (i) 42 아미노산 신호 서열의 분열, (ii) 155번 위치의 리신 잔사물 및 156번 위치의 아르기닌 잔사물의 단일 사슬로부터 단백질 분해에 따라 분해되어 2개 사슬을 생성하는 것 (예, 디술파이드 결합에 의해 262개 아미노산 잔사물의 세린 프로테아제-함유 중사슬에 부착된 155개 아미노산 잔사물의 경사슬), (iii) 경사슬의 처음 42개 아미노산에 밀집된 글루탐산 잔사물의 카르복실화에 따라 9개의 감마-카르복시글루탐산(Gla) 잔사물을 형성하는 것, 및 (iv) 4개 위치 (1개는 경사슬 내에 다른 3개는 중사슬 내에 있음)에서의 글리코실화 반응에 의해 후번역(post-translation) 변형된다. 중사슬은 Asp257, His211 및 Ser360 의 세린 프로테아제 트리아드(triad)를 함유한다.

세포외 프로테아제의 대부부의 다른 지모겐 및 응집 인자와 마찬가지로, 단백질 C 는 지모겐 및 효소를 조정할 수 있는 N-말단 확장체 및 삽입체를 가진 키모트립신계열의 코어 구조를 갖는다. 상피 조직 성장 인자(EGF)와 유사하게 아미노산 서열에 두개의 영역(domain)이 존재한다. 인간, 원숭이, 생쥐, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 염소, 돼지, 말 및 소에 있어서 단백질 C의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드의 적어도 일부는 인간 단백질 C의 돌연변이체 및 다형질체와 더불어 공지되어 있다 (유전자은행 수탁번호 P04070 참조). 기타의 인간 단백질 C 의 변이 체는 다양한 생물학적 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

단백질 C 의 활성 작용은 (키모트립신 번호 부여시) 중사슬 15번 위치의 아르기닌 잔사물 및 16번 위치의 류신 잔사물 사이의 장소에서 작용하는 트롬빈에 의해 매개된다 (Kisiel, J.Clin. Invest., 64:761-769, 1976; Marlar et al., 59:1067-1072, 1982; Fisher et al. Protein Science, 3:588-599, 1994). 그 외의 단백질로서, Xa 인자(Haley et al., J. Biol. Chem., 264:16303-16310, 1989), 러셀의 바이퍼 베놈(Russell's viper venom) 및 트립신(Esmon et al., J.Biol. Chem. 251:2770-2776, 1976) 등도 효소적 분열을 거치고 비활성 단백질 C 를 이것의 활성 형태로 전환시키는 것으로 공지되었다.

트롬빈은 상피세포의 표면에서 막-결합 트롬빈 수용체인 트롬보모둘린(thrombomodulin)에 결합하여 이것의 엑소사이트(exosite)(I)를 통해서 트롬빈의 전구응집 활성을 차단하고 이것의 항응고성을 개선, 예컨대, 단백질 C 를 활성화 시킨다. 항응고제로서, 보조인자 단백질 S의 도움을 받는 활성화 단백질 C(APC)는 트롬빈 형성을 지속시키는 고유의 응집 경로에 필요한 활성화 보조인자 펙터(Va) 및 펙터(VIIIa)를 분열시켜 비활성화 보조인자 펙터(Vi) 및 펙터(VIIIi)를 제공한다 (Esmon et al., Biochim. Biophys. Acta., 1477:349-360, 2000a).

트롬빈/트롬보모둘린 착체 매개의 단백질 C의 활성은 단백질 C가 상피세포 단백질 C 수용체(EPCR)에 결합할 때 촉진되며, 단백질 C 를 상피세포막 표면에 국지화시킨다. EPCR 과 착제를 형성할 때, APC 항응고 활성이 저해된다; APC 는 EPCR 로부터 분리될 때 특히, 활성 혈소판이나 상피세포막 상의 음으로 하전된 인 지질에 결합했을 경우 항응고 활성을 발현한다.

단백질 C 경로의 성분들은 항응고 활성 뿐만 아니라 항-염증성 작용에도 기여한다 (Griffin et al., Sem. Hematology, 39:197-205, 2002). 최근 렉틴-유사 영역에 기인하는 것으로 밝혀진 트롬보모둘린의 항-염증 효과는 뉴트로필-매개 조직 손상으로부터 생쥐를 보호할 수 있다 (Conway et al., J. Exp. Med. 196:565-577, 2002). 세포 주기 조정에 수반된 뮤린 센트로조말(centrosomal) 단백질 CCD41 또는 센트로사이클린은 제1 N-말단의 31개 아미노산이 부족한 뮤린 EPCR 로 규정된다 (Rothbarth et al., FEBS Lett., 458:77-80, 1999; Fukodome and Esmon, J. Biol. Chem., 270:5571-5577, 1995). EPCR 은 구조적으로 MHC 제1종/CD1계열 단백질과 구조적으로 동종성이며 이들의 대부분은 염증 과정에 영향을 준다. 이 동종성은 EPCR 의 기능이 APC나 단백질 C 를 상피세포막에 국지화시키는 능력에 한정되는 것이 아니다 (Oganesyan et al., J.Biol.Chem., 277:24851-24854, 2002). APC 는 비비(baboon)에 있어서, 대장균 주입에 의한 치사적 영향에 대한 EPCR-의존적 예방 효과를 제공하고 (Taylor et al., Blood, 95:1680-1686, 2000) 또한 사이토킨 전구염증성 사이토킨 생산을 하향 조정하고 각종 모델에 있어서 조직 인자 발현 또는 혈압을 적절하게 변화시킬 수 있다 (Shu et al., FEBS Lett. 477:208-212, 2000; Isobe et al., Circulation, 104:1171-1175, 2001; Esmon, Ann. Med., 34:598-605; 2002).

염증이란 상처 및 감염에 대한 신체 반응이다. 염증에 동반되는 3가지 주요 현상은: (1) 상처 또는 감염 부위로의 혈액 공급 증가; (2) 상피세포의 수축력에 의해 실현될 수 있는 모세관 투과성의 증가; 및 (3) 모세관으로부터 주변 조직으로의 백혈구의 이동이다 (이하, 세포 여과라 함) (Roitt et al., Immunology, Grower Medical Publishing, New York, 1989).

다수의 심각한 임상적 조건이 인간에게 있어서 후술하는 염증 과정을 수반한다. 예를 들면, 복수개의 경변(MS)은 중추신경계의 염증성 질환이다. MS 에서, 순환하는 백혈구는 염증이 있는 뇌 상피 및 손상입은 미엘린을 여과함으로써, 손상된 신경 전달 및 마비라는 결과를 가져온다 (Yednock et al., Nature 366:63-66(1992)). 전신성 홍반성 낭창(SLE)은 자기 항원 지향성 항체에 의해 야기된 조직 손상을 특징으로 하는 자기면역 질환이다. 다양한 기관에서, 항원에 결합된 자기-항체는 보체 매개형 및 염증성 세포 매개형 손상을 유도한다 (Theofilopoulos, A.N., Encyclopedia of Immunology, pp. 1414-1417 (1992)).

APC 는 항응고 및 항염증 활성 뿐만 아니라 항-세포사멸 활성도 갖는다. EPCR 은 특정 세포에서, 프로테아제 활성화된 수용체-1(PAR-1)의 APC 가 EPCR-의존적이므로, APC의 항-세포사멸 활성에 대한 필수 보조인자로 밝혀졌다 (Riewald et al., Science, 2296:1880-1882, 2002; Cheng et al., Nat. Med., 9:338-342, 2003; Mosnier and Griffin, Biochem. J., 373:65-70, 2003). APC 는 또한 NFκB 서브유닛의 발현을 조절함으로써 체외에서 상피 세포에 대한 스타우로스포린-유발 세포사멸을 억제하는 잠재적 능력을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다 (Joyce et al., J. Biol. Chem., 276:11199-11203,2001). 인간의 제대 혈관 상피세포(HUVEC) 내의 스타우로스포린-유발 세포사멸 및 종양 괴사 인자-α- 매개의 HUVEC 손상은 전사적 프로파 일화에 근거한 것으로서, APC 처스타우로스포린-유래의 세포사멸은 NFκB 신호전달을 APC 가 억제함으로써 접착 분자들의 하향 조정을 야기한다는 사실을 제시한다 (Joyce et al., supra, 2001). APC 의 항-세포사멸 유전자 (예, Bc12-관련 단백질 A1 또는 Bcl2A1,세포사멸 억제자 1 또는 clAP1, 상피의 질산 산화물 합성효소 또는 eNOS 등)는 스타우로스포린 모델의 세포사멸에 있어서, APC 의 항-세포사멸 작용에 연계된 메카니즘으로 해석되어 왔다.

APC 는 심각한 패혈증 환자에 있어서 모든 원인의 28일-사망율을 19% 감소시키는 탁월한 능력을 가진 반면에 (Bernard et al., New Engl. J. Med. 344:699-709, 2001a), 안티트롬빈(III) 및 재조합체 TFP1 같은 항응고 효능의 약제는 유사한 상(III) 임상 실험에서 상기의 능력을 갖지 못했다 (Warren et al., JAMA, 286:1869-1878, 2001; Abraham et al., Crit. Care Med., 29:2081-2089). 이 차이는 최근에 개시된 APC의 항-세포사멸 활성 및 이의 항염증 활성에 관한 내용으로부터 설명할 수 있다. 패혈증 치료에 관하여 APC 에 대한 성공적인 임상 실험은 항-세포사멸 또는 항염증 활성을 매개하는 직접적인 세포 영향에 관한 것이다.

APC의 유익한 효과에 관한 수많은 체내 연구 문헌에도 불구하고, 세포에 대한 APC 의 직접적인 항염증 및 항-세포사멸 효과를 설명하는 분자 메카니즘에 관한 정보는 제한적이다. APC 는 항염증 및 세포 생존 유전자에 대한 우수한 효과와 더불어, 인간 제대 혈관 상피세포(HUVEC)의 유전자 발현을 직접적으로 조정할 수 있다 (Joyce et al., supra, 2001; Riewald et al., supra, 2002). Riewald 등은 특정 세포에 대한 APC의 직접적인 영향이 PAR-1 및 EPCR 을 필요로 한다는 사실을 입 증했으나(Riewald et al., supra, 2002), APC 의 기능적 활성과 PAR-1-신호 간의 관계에 대한 데이타는 제공하지 못했다.

Xigris(Eli Lilly & Co.)과 유사한 재조합 활성 단백질 C(rAPC)는 심각한 패혈증 치료용으로 승인 받은 것으로서 때로는 다른 바람직한 분야에 응용되기도 한다. 그러나, 임상 연구 결과 APC 치료는 심각한 출혈의 위험이 증가하는 것이 밝혀졌다. 이러한 출혈의 위험 증가는 APC 치료법의 큰 제약 요인이 된다. 패혈증에 대한 APC의 효과를 이것의 항염증 및 세포 생존 활성 때문이라고 할 수 있다면, 유리한 항-세포사멸 또는 세포보호 활성을 지속 유지함과 동시에, 낮은 항응고 활성을 갖는 화합물이 필요하다.

본 발명의 목적은, 적어도 일부는 세포사멸에 연계된 세포 손상을 완화 또는 예방하기 위해 사용되는 치료제 또는 연구 수단으로서, 재조합 APC의 변이체(변이체) 및 전구약물(예, 재조합 단백질 C의 변이체)를 제공하는 데 있다. 또한, 본 발명의 목적은 특히, 상기의 세포 손상을 겪거나 그러한 위험에 노출된 대상에 있어서, 적어도 일부는 세포사멸에 연계된 세포 손상을 완화 또는 예방하기 위한 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따라서 사용될 후보 변이체의 스크리닝 수단을 제공하는 데 있다.

본 발명은 야생형과 비교할 때 항-세포사멸 활성에 대하여 낮은 항응고 활성을 제공하고, 따라서, 세포보호 약제로 사용될 재조합 APC의 변이체 및 프로약물(단백질 C 변이체)에 관한 것이다. 이러한 재조합 APC 변이체의 두가지 예를 들면, KKK191-193AAA-APC (알라닌에 대한 리신 191, 192 및 193 의 변이체) 및 RR229/230AA-APC (알라닌에 대한 아르기닌 229 및 230 의 변이체) 가 있다. 여기서 기술하는 바와 같이, 이들 예시된 APC 변이체는 정상의 항-세포사멸 활성, 세포보호 활성을 유지하면서 출혈의 위험을 대폭 감소시킴으로써, 저하된 항응고 활성을 제공한다. 본 발명의 APC 및 단백질 C 는 항-세포사멸 대 항응고 활성의 비가 야생형 APC 의 그것보다 크다 (예, > 1.0).

본 발명의 한 구체예에서, 적어도 일부는 세포사멸에 연계된 손상을 예방 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 상기 구체예의 한 측면에 있어서, 적어도 일부는 세포사멸에 연계된 세포 손상의 위험에 노출된 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 이들 대상은 다양한 기관 내의 혈관 또는 조직이 적어도 일부는 세포사멸로 인한 손상의 위험에 처한 환자들이다. 상기의 위험에 노출된 환자는 다른 여러가지 조건 중에서도 예를 들면, (심각한) 패혈증 환자, 허혈/재관류(reperfusion) 손상, 허혈성 뇌졸증, 급성 심근경색, 급성 또는 만성 신경퇴행성 질환, 또는 기관 이식이나 화학 요법을 받은 환자들을 포함한다. 본 발명의 APC 변이체 및 전구약물은, APC 항응고 활성과 무관하게 APC 보호 활성에 따른 이점을 가질 수 있는 환자의 치료시 특히 바람직하다. 본 발명의 전구약물의 예를 들면, 단백질 C 가 APC 로 전환되어 항응고 활성이 감소되는 반면, 세포보호 활성은 정상 혹은 거의 정상에 가깝게 유지되는 것을 보여주는 재조합 단백질 C 변이체를 포함한다. 예를 들면, 단백질 C 의 변이체는 활성화 되면 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비가 1.0 보다 큰 바람직한 값을 갖는다.

본 발명의 또다른 구체예에서, APC 변이체는 세포에 대한 유익한 세포보호 효과를 제공하는 한편, 출혈의 위험이 훨씬 낮은 치료제 또는 치료 조성물로서 제공된다. 또다른 구체예에서, 낮은 항응고 활성을 갖는 한편, 바람직한 세포보호 활성 및 항-염증 활성을 유지하는 후보 재조합 APC 변이체의 스크리닝 방법도 제공한다.

야생형 활성 단백질 C 가 출혈의 위험이 있는 것과 달리, 본 발명의 APC 변이체는 현재 상용되는 야생형 재조합 APC 를 능가하는 장점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 APC 변이체는 APC 가 단순히 항응고 활성 뿐만 아니라, 항염증 또는 항-세포사멸 (세포보호) 활성을 위해 이용될 때마다, 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 사용함으로써 탁월한 치료 효과를 제공할 것으로 예상된다.

도 1a 및 1b 는 야생형(rwt-APC) 및 재조합 APC 를 이용한, Eahy 926 상피세포의 스타우로스포린-유발(STS) 세포사멸의 억제력을 도시하는 것으로서, 도 1a 는 STS-유발 세포사멸의 약량-의존적 감소를 사멸 세포의 백분율로 표시하고; 도 1b 는 STS-유발 세포사멸의 약량-의존적 감소를 대조군 STS(APC 무함유)에 비교하여 사멸 세포의 백분율로 표준화한 데이타이다.

도 2 는 야생형 재조합 APC 및 변이체에 관한 항-세포독성(세포보호) 활성 대 항응고 활성의 비를 도시한다.

도 3a 및 3b 는 rwt-APC 및 APC 변이체의 아미드 분해 활성 및 항응고 활성을 도시하는 것으로, a 는 소 크로모겐 기재 S-2366 에 대한 rwt-APC 및 APC 변이 체의 아미드 분해 활성을 나타내고; b 는 활성화 트롬보플라스틴 시간 부분 분석(APTT)을 이용하여 측정한 rwt-APC 및 APC 변이체의 항응고 활성을 나타낸다. 각 점은 3개 이상의 독립 실험의 평균 ± S.E.M. 을 나타내고, 각 부호는 다음과 같다: □ rwt-APC; ○ RR229/230AA-APC; ◇ KKK191-193AAA-APC; ■ S360A-APC.

도 4a 내지 4c 는 rwt-APC 및 항응고 손상된 APC 변이체의 항-세포사멸 활성을 도시하는 것으로, a 는 APC 에 의한 스타우로스포린(STS)-유발 세포사멸의 억제를 나타내며 (방법 단락 참조), APC 첨가가 없는 상태에서 관측된 세포사멸성 상피세포의 백분율(전체 세포의 18%)을 100% 로 했다. 각 점은 3개 이상의 독립 실험의 평균 ± S.E.M. 을 나타내고, 각 부호는 다음과 같다: □ rwt-APC; ○ RR229/230AA-APC; ◇ KKK191-193AAA-APC; ■ S360A-APC; ● 스타우스포린 무함유. b 및 c 는 스타우로스포린(2μM, 4h)에 의한 세포사멸 유발시,rwt-APC 및 APC 변이체(25nM, 5h)에 의한 활성 카스파제-3-양성 세포의 감소를 나타내는 것으로, b 는 존재하는 세포의 총수에 대한 백분율로 표시한 활성 카스파제-3-양성 세포이다. "STS 무함유" 로 표시한 세선(thin line)에서, 약 2% 의 상피세포가 스타우로스포린의 무함유 상태에서 활성 카스파제-3 에 대해 양성이었다. 각 막대 그래프는 2개내지 4개의 독립 실험의 평균± S.E.M. 을 나타낸다. c 는 활성 카스파제-3-특이적 항체(적색) 및 DAPI 핵 염색법(청색)을 이용한 활성 카스파제-3-양성 세포의 면역형광 분석 결과를 나타낸다. 컬럼은 동일한 영역을 나타내며 실제 배율은 200 x 이었다.

도 5 는 rwt-APC 및 APC 변이체에 의한 세포사멸의 억제시 PAR-1 및 EPCR 이 필요함을 나타낸다. rwt-APC 및 항응고 손상된 APC 변이체에 의한 스타우로스포린-유발 상피세포 세포사멸의 억제에 대한 PAR-1 및 EPCR-의존성을 PAR-1 (하얀 막대)(20㎍/ml의 WEDE-15 및 15㎍/ml의 ATAP-2 의 조합) 또는 EPCR (빗살 무늬 막대)(20㎍/ml 의 토끼 항-EPCR)에 대한 차단 항체를 이용하여 연구했다. 검은 막대는 "항체 무첨가"를 나타낸다. 스타우로스포린(10μM, 1h)에 의한 세포사멸의 유발 5시간 전에 세포를 rwt-APC 또는 APC 변이체(5nM) 로 배양했다. 세포사멸은 아포퍼센티지(Apopercentage) 염료의 흡수로 세포사멸을 분석하고 APC(세포 전체의 20%) 첨가 없이 관측된 세포사멸성 세포의 백분율을 100% 로 설정하여, 이에 대한 백분율로 표시했다. "수직선" 방향의 선은 APC 및 스타우로스포린이 존재하지 않을 때의 상대 세포사멸율을 나타낸다. 각 막대는 3개 이상의 독립 실험의 평균 ± S.E.M. 을 나타낸다.

도 6 은 rwt-APC 및 APC 변이체에 의한 Arg41 에서의 PAR-1 N-말단 TR33-62 펩티드의 분열을 도시한다. HPLC 는, TR33-62 펩티드 기질 정점(개방 부호)의 소멸 및 TR42-62 펩티드 산물 정점(실선 부호)의 소멸시에 시간에 따른 APC 에 의한 TR33-62 분열을 관측하는데 사용했다. 각 부호는 다음과 같다: ■,□ rwt-APC; ●,○ RR229/230AA-APC; ◆,◇ KKK191-193AAA-APC; ×,× S360A-APC. 3 내지 5개의 독립 실험의 전체 데이타 점을 rwt-APC 및 두개의 항-세포사멸 APC 변이체에 대해 표시한다. 활성 위치 Ser(×) 가 부족한 S360A-APC 에 대해 분열이 관측되지 않았다.

활성 단백질 C(APC)는 전통적으로, 보조인자 팩터(Va) 및 팩터(VIIIa)를 비 활성화 하여 트롬빈 형성 및 후속의 섬유소 응고(fibrin clot) 형성을 억제하는 것으로서, 응집 캐스캐이드 내의 항응고 효소로 간주되었다 (Esmon, supra, 2000a). 그러나, APC 는 또한 심각한 패혈증의 치사율을 감소시키는 현저한 능력이 있으며 (Bernard et al., supra, 2001a; Bernard et al., Crit. Care Med., 29:2051-59. 2001b; Hinds, Brit. Med. J., 323:881-82, 2001; Kanji et al., Pharmacother., 21:1389-1402, 2001), 항트롬빈(III) 및 조직 인자 경로 억제자 같은 다른 항응고체는 이러한 능력을 갖지 않았다 (Warren et al., supra, 2001; Abraham et al., supra, 2001). 이러한 APC 의 특성은 그간 광범위하게 연구되지 않았던 것으로서, APC에 의한 직접적인 항-염증성 및 항-세포사멸 활성에 대한 연구자의 관심을 증폭시켰다 (예, Cheng et al. Nat. Med., 9:338-42, 2003; Domotor et al., Blood, 101:4797-4801, 2003; Fernandez et al., Blood Cells Mol. Dis., 30:271-276, 2003; Esmon, J. Autoimmun., 15:113-116, 2000b). APC 는 또한 허혈성 뇌졸증에 의한 손상으로 뇌를 보호하는 잠재 능력을 갖고 있다 (Cheng et al., supra, 2003; Esmon Thrombos Haemostas, 83:639-643, 2000c).

치료제로서 APC 의 이용에 관한 주요 관련 사항은, APC 항응고 활성으로 인한 출혈 합병증의 위험 증가이다 (Bernard et al., supra, 2001a; Bernard et al., supra, 2001b). 본 발명의 APC 변이체는 내인성 APC 또는 야생형 재조합 APC 보다 더 낮은 항응고 활성을 가지면서 유익한 항-세포사멸 활성을 유지함으로써, 이 문제를 해결한다. 항-세포사멸 활성으로부터 항응고 활성을 분화시키는 것이 이 문제를 해결하는 첫번째 단계였다. 본 발명자들은 이들 활성을 조정함에 있어서 EPCR 의 역할에 부분적으로 초점을 맞추었다.

EPCR 은 본래 단백질 C 및 APC 를 동등한 친화도로 결합시킬 수 있는 수용체로서 발견되었으며 (Fukodome and Esmon, supra, 1995), EPCR 은 트롬빈-트롬보모둘린 착체에 의해 (Stearns-Kurosawa, et al., Proc.Nat'l Acad. Sci., USA, 93:10212-10216, 1996), 더 구체적으로는 트롬보모둘린-결합 트롬빈에 의한 효과적인 활성화를 위한 단백질의 공간적 국지화를 최적화 함으로써 단백질 C 의 활성화를 개선하는 것으로 확인되었다. 추측하건대, EPCR 은 상피면에 APC를 결합시키고 APC 의 활성 위치를 Arg41의 PAR-1 분열 위치와 가깝게 한다. 역설적으로, 단백질 C 활성화를 자극시켜서 EPCR 기능이 항응고성으로 될 수 있지만 (Stearns-Kurosawa, et al., supra, 1996), APC 항응고 활성은 APC 가 EPCR 에 결합될 때 실질적으로 억제된다 (Regan et al., J. Biol. Chem., 271:17499-17503, 1996). EPCR 에 대한 APC의 결합은 APC 의 항-세포사멸 활성에 중요하므로, APC 의 항-세포사멸 활성은 항응고 활성과 무관하다고 판단했다. 항응고 활성이 부족하지만 항-세포사멸 활성은 유지하는 특정의 APC 변이체를 생성할 수 있다는 가설을 세웠다. 이러한 변이체는 출혈 위험의 증가 없이 직접 세포 생존 활성을 환자에게 제공할 경우 치료학적으로 유용할 수 있다.

본 발명자들은 그들의 항-세포사멸 활성에 관한 다양한 형태의 APC 를 분석하여 항-세포사멸 활성에 필요한 APC의 구조적 성분을 결정했다. 스타우로스포린-유발의 세포사멸은 항-APC 모노클로날 항체로 APC 를 전처리하거나 APC 의 열변성에 의해 차단됨으로써, APC의 항-세포사멸 활성의 특이성이 달성된다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 스타우로스포린-유발 세포사멸의 APC-매개형 억제는, 활성 부위 Ser 를 Ala, S360A-APC(Gale et al., Protein Sci., 6:132-140, 1997)로 대체한 비활성 단백질 C 지모겐 및 비활성 APC 변이체가 항-세포사멸 활성을 전혀 갖지 않았기 때문에, APC 활성 부위를 필요로 하는 것을 확인하였다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 이 발견은 APC의 항-세포사멸 활성이 단백질 분해 작용에 의해 매개된다는 것을 뒷받침한다.

본 발명자가 EAhy926 상피세포를 가진 변형된 스타우로스포린-유발 세포사멸 모델을 이용하여 APC 에 의한 스타우로스포린-유발 세포사멸의 억제가 PAR-1 및 EPCR에 의존적이라는 사실을 입증하기 전까지는(Mosnier and Griffin, supra, 2003), 스타우로스포린-유발된 세포사멸의 APC-매개형 억제 (Joyce et al., supra, 2001)가 PAR-1 및 EPCR 에 의존적이었는지 확인되지 않았다. 인간의 뇌 상피세포에서 저산소증-유발 세포사멸의 억제도 마찬가지로 PAR-1 을 필요로 하는 것이 밝혀졌다 (Cheng et al., supra, 2003). 따라서, APC 의 단백질 분해 활성 위치가 세포사멸의 억제를 위해 필요하다는 결과에 따라 PAR-2를 제외한 PAR-1 만의 차단 항체로 세포를 사전배양시 스타우로스포린-유발 세포사멸의 APC-매개형 억제 작용이 무효화 되었다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 또한, 항-EPCR 항체에 의해 APC 항-세포사멸 활성이 사라졌으며 (Mosnier and Griffin, supra, 2003), 또 대조군의 경우, 항-EPCR 항체의 상기 효과는 펩티드 면역원으로 항체를 사전배양함으로써 중화되었음을 보여주었다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 따라서, 항체 차단 연구에 기초하여, APC 에 있어서 PAR-1 및 EPCR 은 상피세포의 스타우로스포린-유 발 세포사멸을 억제하기 위해 필요하다.

EAhy926 상피세포의 스타우로스포린-유발 세포사멸의 억제를 위한 PAR-1 및 EPCR 의 필요성은 이들 수용체가 하이폭시 뇌 미세혈관 상피세포의 고정시 APC 의 항-세포사멸 활성에 있어서도 중요하다는 발견에 부합된다 (Cheng et al., supra, 2003).

APC 는 트롬빈 분열 위치 Arg41 의 합성 세포외 N-말단 PAR-1 폴리펩티드를 분열할 수 있다 (Kuliopulos et al., Biochemistry, 38:4572-4585, 1999). 이 합성 PAR-1 폴리펩티드를 APC 를 이용하여 분열하는 것은 트롬빈에 의한 것보다 속도가 5,000 배 늦다 (Kuliopulos et al., supra, 1999). 트롬빈이 Arg41 에서 PAR-1 을 분열할 때, 잠재의 세포 신호전달 경로가 개시되기도 한다. Arg41 에서의 PAR-1의 APC 분열은 MAP 키나제의 포스포릴화를 포함한 세포 신호를 개시한다 (Riewald et al., supra, 2002). 저산소증이 될 뇌 상피세포에서, APC 신호 전달의 초기 결과는 p53 레벨 증가를 억제하는 것이다 (Cheng et al., supra, 2003). 연구 결과, APC 는 HUVEC 의 유전자 발현 프로파일을 직접 변경하고, 그 결과 다수의 항-세포사멸 유전자는 상향 조정되며 (Joyce et al., supra, 2001; Riewald et al., supra, 202), 또 APC 는 뇌 상피세포에서, 특이적으로 전구-세포사멸 인자인 Bax 의 레벨을 하향 조정하는 한편, 항-세포사멸 인자인 Bcl-2 의 레벨을 상향 조정한다는 사실을 제시한다 (Cheng et al., supra, 2003). 임계 Bax/Bcl-2 비의 특이적 변화는 세포사멸의 핵심이 되는 중요한 것이다. 이러한 현상 이외에는 PAR-1-의존형 APC 신호 전달 관련 메카니즘에 대해 거의 언급할 것이 없다. PAR-1 길항체 펩티드 TFLLRNPNDK(서열번호 1) 는 EAhy926 세포의 스타우로스포린-유발 세포사멸로부터 아무런 보호작용도 나타내지 않은 반면, 상기 길항체는 저산소증-유발 세포사멸로부터 뇌 상피세포의 일부를 구조하였다. 이는, 상기 두 모델의 APC의 PAR-1 유발 항-세포사멸 활성 간의 미미하지만 매우 중요한 차이를 제시하는 것이다.

체내 데이타는 APC의 항응고 활성 및 세포보호 활성 간의 중요한 차별성과 일치한다. 뮤린 허혈/재관류 손상 모델에 있어서, APC-유발 신경보호 효과는 섬유소 퇴적 또는 혈류 회복에 아무런 영향도 미치지 않았던 미량의 APC 투여량에서도 관측되었다. 이는 APC 의 신경보호 효과가 적어도 일부는 APC 항응고 활성과 무관하다는 것을 입증한다 (Cheng et al., supra, 2003).

APC 가 존재하지 않는 조건에서, PAR-1 또는 PAR-2 길항체 펩티드 모두 EAhy926 세포의 스타우로스포린-유발 세포사멸에 대한 아무런 억제 작용도 관측되지 않았다. 더구나, PAR-1의 원형 활성자인 트롬본은 스타우로스포린-유발 세포사멸을 억제하지 않았다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 이러한 다른 PAR-1 활성자가 세포 생존 활성의 부여에 실패하는 것은, 스타우로스포린-유발 세포사멸에 대한 APC 의 PAR-1 의존성 항-세포사멸 효과가 APC 에 대해 특이적이라는 것을 증명한다. 작용 메카니즘에 관여하지 않아도, EPCR-결합 APC 가 분열하여 PAR-1 을 활성화 할 때, 트롬빈이나 PAR-1 길항체 펩티드에 의해 촉발된 신호와 비교하면, PAR-1 의 세포내 신호 전달을 더욱 크게 조정할 수 있음을 추측할 수 있다. 복합성의 다른 가능한 제공원은 APC의 핵 전좌(translocation)를 매개하는 공지된 EPCR 의 능력에서 비롯된다 (Esmon, supra, 2000c). 각종 세포 모델의 시스템에서 APC 에 의한 세포사멸의 억제를 일으킬 세포간 신호 및 경로에 대해 설명한다.

PAR-1을 통한 APC EPCR-유발 신호 전달의 생리학적 관련성은, PAR-1 및 ECPCR 을 필요로 하는 뮤린 허혈/재관류 손상 모델에서 APC-유발 신경보호 효과에 의해 입증된다 (Cheng et al., supra, 2003). APC 는 스트레스 받은 뇌 상피세포에 대하여 EPCR 을 통하여 또는, 스트레스 받은 뉴우런에 대해 프로테아제 활성 수용체-3(PAR-3)을 통하여 작용함으로써, 이들 스트레스 받은 또는 손상된 뇌 세포에 있어서 항-세포사멸 경로 및/또는 전구-생존 경로를 활성화시킨다. 체외의 인간 뇌 상피에서 및 동물의 체내에서 (허혈성 뇌졸증 및 NMDA 모델), APC 는 스트레스 받거나 손상된 뇌세포에 있어서의 p53-신호전달 전구-세포사멸 경로를 억제할 수 있다 (국제 특허 출원 제 PCT/US03/38764호).

단백질 C 및 활성 단백질 C 의 구조-활성 관계는 내인성 단백질 C 의 발현이 있거나 없는 상태에서 숙주 세포내로 트랜스펙트된 발현 구성과 함께 생성된 변이 폴리펩티드를 이용하여 연구한다. 따라서, 단백질 C 또는 활성 단백질 C 의 개별 영역 내에서의 돌연변이는 단백질 기능의 활성이 감소하거나 증가하는 것과 관계가 있다.

출혈 위험을 감소시키는 즉, 낮은 항응고 활성을 제공하지만 바람직한 세포보호 활성은 그대로 유지하는 본 발명의 APC 변이체 및 전구약물을 제조하기 위하여, 위치 지향적 돌연변이 생성을 통해 APC 의 항-세포사멸 활성으로부터 상기 항응고 활성을 격리한다. 이것은 APC 의 프로테아제 도메인의 각 표면 고리 상에 있 는 다수의 아미노산은 알라닌으로 돌연변이시 급격한 항응고 활성 감소가 일어나지만 항-세포사멸 활성에는 아무 영향이 없었다는 사실에서 입증된다. 이와 같은 뜻밖의 발견은, APC의 항-세포사멸 활성은 보존하면서 항응고 활성을 저하시키려는 방법이 실행 가능하고 높은 가치가 있다는 것을 입증한다. 이것은 세포보호 활성을 유지하는 재조합 APC 변이체를 현재 및 앞으로의 임상적 용도에 사용할 경우 출혈 합병증을 감소시키기 쉽기 때문이다.

APC 항응고 활성의 구조적 기원은 APC 와 인자(Va)의 상호 반응에 가장 큰 중심이 있다. 인자(Va) 속의 APC 분열 위치는 Arg³⁰⁶, Arg⁵⁰⁶ 및 Arg⁶⁷⁹ 잔사물에 위치하고 앞 두가지의 분열은 보조인자 활성의 손실에 상관 관계가 있다 (Rosing and Tans, Thromb Haemost, 78:427-433, 1997; Kalafatis and Mann, J.Biol.Chem., 268:27246-57, 1993). Arg⁵⁰⁶ 의 인자(Va)의 분열이 신속히 일어나고 통상 Arg³⁰⁶ 의 분열을 실행한다. 따라서, 인자(Va) 분자의 초기 비활성화에 관한 예정 위치를 고려한다 (Norstrom et al., J.Biol. Chem. 278:24904-1133, 2003; Nicolaes, et al., J.Biol. Chem., 270:21158-66, 1995). APC 와 인자(Va) 내의 Arg⁵⁰⁶ 분열 위치의 상호 작용은 광범위하게 특징화 되었으며 그 결과, APC의 프로테아제 도메인의 양으로 하전된 표면 상의 인자(Va) 결합 위치가 정의되었다 (Gale et al., Blood, 96:585-593, 2000; Gale et al., J.Biol. Chem. 277:28836-28840, 2002; Friedrich et al., J. Biol. Chem. 276:23105-08; 2001a; Knobe et al., Proteins, 35:L218-234, 1999; Shen et al., Thromb. Haemost., 82:72-79, 1999). APC 에 결 합하는 인자(Va)를 위한 양성 엑소사이트는 트롬빈의 음이온 결합 엑소사이트(I)와 동일한 영역에 위치하는 것이 바람직하고, 단백질 C 잔사물 190-193 (키모트립신(CHT) 잔사물 36-39 과 균등한)을 함유하는 고리 37의 잔사물, 칼슘 이온-결합 고리 함유 잔사물 225-235(CHT 70-80) 및 자기소화 고리 함유 잔사물 301-316(CHT 142-153) 을 포함한다 (Mather et al., EMBO J. 15:6822-31, 1996). 또한, 단백질 C 잔사물(CHT 60-68)을 함유하는 H고리 60 의 돌연변이체는 비록 이 고리가 트롬본모듈린 및 헤파린의 상호 작용에 관계가 있다 하더라도 APC 에 의한 인자(Va) 비활성화에 대하여는 거의 영향을 주지 않는다 (Gale et al., supra, 2002; Friedrich et al., supra, 2001a; Knobe et al.,supra, 1999; Shen et al., Supra, 1999; Friedrich et al., J. Biol. Chem., 276:24122-28, 2001b).

Gale et al. (supra, 2002)는 APC 의 표면 고리 내의 돌연변이체는 항응고 활성에 영향을 준다는 것을 확인했다. APC 변이체 KKK191-193AAA(고리 37), RR229/230AA(칼슘 고리), RR306/312AA(자기소화 고리), R306A/K311A/R312A/R314A(자기소화 고리)는 각각 자연 APC 의 항응고 활성의 10%, 5%, 17%, 및 2% 미만을 나타내었다. 후속으로, 낮은 항응고 활성을 가진 APC 변이체 (예, KKK191-193AAA, RR229/230AA(Mosnier et al.,(Blood epup, 2004)), 및 RR306/312AA(Mosnier & Griffin, 공개되지 않은 관찰 결과))는 스타우로스포린 모델의 세포사멸에 있어서 APC의 항-세포사멸 활성을 지속한다.

항응고 활성에 필요한 APC의 구조적 특징 대 세포보호 활성을 구분할 수 있음을 증명하기 위하여, 현저히 낮은 항응고 활성을 가진 APC 의 재조합 변이체 형 태를 연구했다. APC 의 인자(Va) 결합 위치에서 위치-지향적 돌연변이체의 2중, 3중 및 4중의 조합체를 이용함으로써, 작은 펩티드(염색생성형) 기질에 있어서 급격히 감소된 항응고 활성과 함께 기본적으로 무변한 효소 활성을 가진 APC 변이체군을 구성했다 (Gale et al., supra, 2000; Gale et al., supra, 2002). 항응고 활성은 희석 프로트롬빈 응고 분석법에서 결정했다 (Gale et al., supra, 2002). APC의 변이체의 세포보호(항-세포사멸) 활성은 Mosnier and Griffin에서 설명한(supra, 2003) 변이체를 이용하여 EAhy926 상피세포를 가진 세포사멸의 스타우로스포린-유발 모델에서 시험했다. 활성 위치 세린 360 을 알라닌(S360A-APC, 표 1 참조)(Gale et al., supra, 1997)으로 대체된 비활성 APC 변이체는 항-세포사멸 활성이 무효화 되었기 때문에 (Mosnier and Griffin, supra, 2003), 스타우로스포린-유발 세포사멸의 APC-매개형 억제 작용은 APC 활성 부위를 필요로 한다는 것이 밝혀졌다 (도 1a 및 1b). Eahy 926 상피세포 내의 스타우로스포린-유발 세포사멸의 재조합 APC 억제는 아포퍼센티지 염색에 의하여 결정되었다. 재조합 야생형 APC(rwt-APC)에 의한 세포사멸의 억제는 투여량-의존적이었다 (도 1a). 스타우로스포린-유발 세포사멸이 최대치의 1/2 억제는 스타우로스포린 첨가에 앞서 APC 를 세포와 함께 5시간 동안 사전배양함으로써 0.24nM rwt-APC 에서 달성되었다. S360A 변이체에서의 세포사멸 활성의 부재를 주목하자(도 1b). 실시예 1 내지 3의 돌연변이체 및 야생형에 대비한 이들의 활성도(%) 를 표 1에 나타낸다. 또한 표 1에는 실시예 4에서 언급한 바와 같이, 야생형 APC 및 실시예 1 내지 3의 변이체 APC 각각에 대한 항응고 활성에 대한 항-세포사멸(세포보호) 활성의 비를 수록한다.

표 1.

APC 변이체에 대한 개요 (희석 프로트롬빈 타임(PT)에 의해 결정된 항응고 활성)

야생형 (wt) 변이체	wt-APC 서열(밑줄친 것은 알라닌으로 돌연변이된 것)	세포보호 활성 (wt-APC,%)	항응고 활성 (wt-APC, %)¹	세포보호 활성-항응고 활성의 비	FVa 비활성 Arg⁵⁰⁶ (Arg³⁰⁶)(wt-APC, %)¹	아미드 분해 활성¹ (wt-APC)	T1/2 (분)	서열번호
rwt-APC	n/a	100%	100%	1.0	100% (100%)	100%	21.4
229/230-wt	225-EYDLRRWEKWE-235							2
229/230-APC	225-EYDLAAWEKWE-235	89%	6.6%	13.5	25% (110%)	115%	27.6	3
3K3A-wt	189-DSKKKL-194							4
3K3A-APC	189-DSAAAL-194	120%	15%	8.0	11% (67%)	134%	20.7	5
306-314-wt	305-SREKEAKRNRT-315							6
306-314-APC	305-SAEKEAAANAT-315	<1%	1.6%²	0.6	1.4% (16%)	75.6%	46.2	7

1 참조 문헌(Gale et al., 1997; Gale et al., 2000; Gale et al., 2002)으로부터; 상세한 정보는 본문 및 방법을 참조할 것.

2 희석 PT 대신 APTT 을 이용하여 측정함.

n/a: 응용 불가; rwt-APC, 재조합 야생형-APC; 229/230-APC, RR229/230 AA-APC; 3K3A-APC; 3K3A-APC; KKK191-193AAA-APC; 306-314-APC, R306A/K311A/R312A/R314A-APC.

실시예 1

두개의 아르기닌 잔사물 Arg229 및 Arg230 대신, APC 의 칼슘-결합 고리에 알라닌 잔사물을 사용하여 6.6% 잔사물 항응고 활성에 불과한 APC RR229/230AA-APC ((229/230-APC) 표 1 참조) 형태가 되었다. RR229/230AA-APC 의 항응고 활성 감소는 기본적으로 Arg⁵⁰⁶ 에서의 인자(Va)(FVa)의 비활성 감소 탓이었으며 반면 Arg³⁰⁶ 에서의 인자(Va)의 분열은 훨씬 그 영향을 적게 받았다.

RR229/230AA-APC 에 의한 세포사멸 억제의 투여량-의존성(도 1a 및 1b)은 재조합 야생형(rwt)-APC 의 그 것과 유사했다. RR229/230AA-APC 에 의한 스타우로스포린-유발의 세포사멸 최대 억제율의 1/2 로 떨어지는 것은 0.27nM 일 때였다. 이 실시예는 APC의 항응고 활성이 APC의 세포보호(항-세포사멸) 활성에 필요하지 않다는 것을 확인시켜 준다.

실시예 2

이 실시예에서, 고리 37에 있는 3개의 연속 리신 잔사물을 3개의 알라닌(KKK191-193AAA-APC(3K3A-APC)으로 대체한 경우(표 1 참조), 희석 프로트롬빈 응고 분석법으로 측정시 15% 정도의 잔사물 항응고 활성을 나타내었다 (Gale et al., supra, 2002). KKK191-193AAA-APC 에 있어서 이러한 항응고 활성의 감소는 Arg⁵⁰⁶ 에서의 인자(Va)의 현저한 분열 감소(11% rwt-APC) 탓으로서 이 반면에, Arg³⁰⁶ 에서의 인자(Va)의 비활성화는 약간 영향을 받았을 뿐이다(67% rwt-APC)(표 1). 도 1a 및 1b 에서 명백한 바와 같이, KKK191-193AAA-APC 의 항-세포사멸 활성은 rwt-APC 의 그것과 거의 유사했으며 스타우로스포린 유발 세포사멸의 최대 억제율의 1/2은 0.20nM 에서 달성되었다.

실시예 3

이 실시예에서, 소위 APC의 자기소화 고리에 있는 5개의 기본 아미노산 중 4개를 알라닌 잔사물로 대체한 경우, 활성 부분 트롬보플라스틴 타임(APTT)으로 측정시 1.6% 에 불과한 잔사물 항응고 활성을 가진 APC R306A/K311A/R312A/R314A-APC (306-314-APC, 표 1 참조) 형태로 나타났다 [765]. R306A/K311A/R312A/R314A-APC 에 있어서 이러한 항응고 활성의 감소는 Arg⁵⁰⁶ 에서의 인자(Va)의 현저한 분열 감소(1.4% rwt-APC) 탓으로서 이 반면에, Arg³⁰⁶ 에서의 인자(Va)의 비활성화는 약간 영향을 받았을 뿐이다(16% rwt-APC). R306A/K311A/R312A/R314A-APC 변이체는 세포보호(항-세포사멸) 활성이 크게 부족했으며 (도 1a 및 1b), 한편 스타우로스포린-유발 세포사멸의 억제에는 rwt-APC 또는 다른 두 APC 변이체인 RR229/230AA-APC 및 KKK191-193AAA-APC 와 비교할 때 훨씬 큰 농도의 변이체 APC 가 요구된다.

실시예 4

항응고 활성에 대한 항-세포사멸 활성의 비는 도 1의 항-세포사멸 활성 데이타 및 공지의 항응고 활성(Gale et al., supra, 2000; Gale et al., supra, 2002)에 근거하여 rwt-APC 및 실시예 1-3의 각 APC 변이체에 대해 계산했다 (표 1). rwt-APC 에 관한 활성비는 1.0 으로 정의된다. 도 2에서 보는 바와 같이 이들 비는 특정의 프로테아제 도메인의 표면 고리의 잔사물에서 돌연변이인 APC 변이체는 항응고 활성과 비교시 8배 내지 14배 이상 큰 항-세포사멸 활성을 나타낼 수 있는 것으로 확인된다. 두가지 변이체, 즉, KKK191-193AAA-APC 및 RR229/230AA-APC 는 rwt-APC 에 필적하는 항-세포사멸 또는 세포보호 활성을 나타내는 한편, 항응고 활성의 감소에 따라, 8 내지 14분의 1배로 저하된 출혈 위험성을 갖는 것으로 예상된다.

재조합 APC 변이체의 항응고 활성에 대한 항-세포사멸 활성의 비는 치료 능력을 가진 본 발명의 재조합 APC의 변이체를 확인하는데 이용된다. 1.0 이상의 비는 세포 손상에 대한 급성 혹은 예방적 치료가 필요한 대상에 있어서, 본 발명에 따라 세포보호의 장점 및 출혈의 위험 저하를 갖는 치료적 재조합 APC 변이체를 가리키는 것이다. 바람직하게, 재조합 APC 의 치료 변이체는 약 2 를 넘는 항응고 활성에 대한 항-세포사멸 활성의 비를 갖는다. 더 바람직하게, 상기 비는 약 4 를 초과한다. 더욱더 바람직하게는, 상기 비는 약 8 을 초과한다.

본 발명의 전구약물 구체예는 단백질 C 가 체내 또는 체외에서 APC 로 전환함에 따라 항응고 활성 감소와 더불어 정상이나 거의 정상에 가까운 세포보호 활성의 유지를 나타내는, 즉, 항-세포사멸 대 항응고 활성의 비가 1.0 을 넘는 재조합 단백질 C 변이체를 수반한다. 바람직하게, 본 발명의 전구약물은 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비가 약 2를 초과하는 APC 변이체로 전환될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 비가 4 이상, 가장 바람직하게는 약 8을 초과한다.

본 발명은 후술하는 다수의 구체예를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 APC 변이체는 세포사멸, 세포죽음 또는 스트레스 유발된 손상의 위험에 노출된 세포에 체내 또는 체외에서 세포보호를 달성하기에 적절한 유효량으로 이용된다. 이 구체예의 한 측면에서, APC 변이체는 항응고 활성 과 관계없이 APC 세포보호 활성의 장점을 가질 수 있는 대상에게 치료량으로 투여할 수 있다. 이러한 대상은 혈관 또는 다른 조직 기관에 대한 손상으로서 적어도 일부는 세포사멸에 의해 야기되는 손상의 위험에 노출되는 환자를 포함한다. 세포 손상에 대한 위험은 패혈증, 허혈/재관류 손상, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 급성 심근 경색증, 급성 신경변성 질환, 만성 신경변성 질환, 기관 이식, 화학요법, 또는 뇌 방사선 손상 중 하나 이상의 결과이다. 이러한 세포 손상의 원인은 본 발명의 범위를 한정하지 않으며 당해 분야의 전문가라면 다른 질환 또는 손상이 세포로 하여금 적어도 일부는 세포사멸로 인한 손상의 위험에 처하게 할 수 있다는 것도 이해할 수 있다. 유효량 또는 치료량은 적어도 일부는 세포사멸에 기인하는 세포 손상을 예방 또는 완화시킴에 있어 유효한 것으로 확인된 양을 말한다. 본 구체예의 다른 측면에서, 본 발명의 변이체는 체내 또는 체외에서 세포나 조직에 응용될 수 있다.

또다른 구체예에서, 본 발명의 APC 변이체 또는 프로약물을 상술한 하나 이상의 용도에서 약제학적 조성물을 제형화 하는데 사용할 수 있다. 치료 조성물은 시험관 내에서 배양 중인 세포에, 체내의 세포에 투여하거나 또는 대상체의 체외 세포에 투여하여 동일한 대상체 또는 다른 대상체에 복귀시키는 것이다. 상기 세포는 대상체에게서 분리, 대상체에게 이식 또는 대상체 내에 존재한다 (예, 시험관 내에서 상피세포의 유전자 변형 후에 다시 뇌 상피조직에 복귀시킨다). 전구약물은 그대로 APC 로 전환될 수 있는 것으로 예상한다. 후보 약제는 또한 바람직한 특성을 가진 것을 선택하기 위해 시험관내 또는 체내에서 스크리닝될 수 있다. 세포는 상피세포로부터 얻는다 (예, 상피 또는 연근육 조직세포나 뇌 혈관의 상피조직).

본 발명의 변이체 APC 를 포함하는 치료 조성물은 투약 형태로 제공된다. 본 구체예의 한 측면에서, 본 발명의 치료 조성물은 또한 약제학적 수용가능한 담체를 포함하고 또한 대상자의 뇌에 상기 조성물을 전달하는데 유용한 성분을 더 포함한다. 이러한 약제학적 담체 및 전달 성분은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 담체 및 기타 성분들을 본 발명의 조성물에 첨가하는 것은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 투과성 재료는 국소 영역에 그 내용물을 방출할 수 있거나 시험관은 저장기의 내용물을 뇌로부터 먼 위치로 직접 전달한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 중추신경계에 직접 전하기 위해 채용되거나 또는 장이나 혈관 순환을 통해 통과시키기에 적절한 제형으로서 투여될 수 있다. 이와 별도로, 약제학적 조성물을 배양 매질에 첨가하기도 한다. 활성 화합물 이외에도, 상기 조성물은 약제학적 수용가능한 담체나 또는 투여 촉진 및/또는 흡수 개선을 위해 공지된 다른 성분들을 포함할 수 있다. 단일 투약 또는 수회에 걸쳐 다수의 투약으로 투여된다. 조성물의 단위 투약량은, 세포보호, 세포사멸 또는 세포죽음의 억제, 및/또는 세포 생존을 촉진시킬 수 있으면서 동시에 치료학적으로 탁월한 항응고 효과를 제공하지는 않거나 또는 적어도 종래의 공지된 활성 단백질 C 의 투약량과 비교할 때 더 낮은 항응고 효과를 나타내는 APC 변이체의 양을 말한다. 상기 값의 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있다: 임상 연구실은 표준 분석에 따라 통상적으로 결정하며 혈액학자들은 상황에 따라 정상 또는 비정상으로 구분한다. 이들 값을 측정하는 방법에 관한 실시예는 다음과 같다.

본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 경로를 통해 투여된다. 실시예로서, 상 기 조성물은 점막, 폐, 국부적 또는 기타 국소적이나 전신 경로 (예, 삽입식 및 비경구적)적으로 투여된다. 특히, 유효량의 활성 단백질 C, 전구약물 또는 기능적 변이체를 중추신경계에 바람직하게 사용할 수 있다. 이것은 뇌 속에 데폿(depot) 주입하거나 외과적으로 이식할 수 있다. "비경구적" 이란 피하, 경피, 근육내, 정맥내, 동맥내, 외피내 및 기타 다양한 주사나 주입 방법을 비제한적으로 포함한다.

투여량 및 타이밍, 투여 제형, 투여 경로는 대상의 바람직한 반응을 달성하기 위한 측면(예, 효능 또는 치료제), 또한 원치 않는 독성이나 다른 해악을 피하는 측면(예, 안전성)에 따라 적절히 선택할 수 있다. 투여는 볼루스(bolus)나 연속 주입식으로 행할 수 있다. 볼루스는 소정 기간 동안 규정 용량으로 약물을 투여하는 것(예, 주사법으로)이다. 연속 주입법은 소정 기간 동안 혈관에 용액을 단속없이 연속으로 주입하는 것이다. 대상에게 단 한번 투여하는 제형 볼루스는 편리한 투약 방식이지만 뇌에 대해 유효한 농도의 활성 단백질 C 를 달성하기 위해서는 더욱 충분한 양의 투여가 필요할 수도 있다. 치료에는 연속 주입(예, 뇌졸증 후 3시간동안) 또는 저속 주입(예, 뇌졸증 후 6시간 이내에 공급시 24시간 내지 72시간 동안)을 수반한다. 또는, 격일 간격, 주 1회 또는 월 1회 등으로 투여하기도 한다. 또한 대상체에 대해 변화 또는 지속되는 농도의 화합물이나 그의 유도체를 제공하기 위해 또한 적절한 치료 반응을 얻기 위해 약제학적 조성물 내의 활성 성분의 투약 레벨을 달리 할 수도 있다.

따라서, "치료적" 이란 원하는 효과를 달성하기 위해 (예, 세포사멸이나 세포죽음의 억제, 세포 생존의 촉진, 세포보호, 신경보호 또는 이의 조합) 정규적인 상태 조절이 수반되는 선택법이다. 세포보호를 최대로 하기 위해서는, 출혈 위험을 감소시킬 수 있으므로 대상체에게 투여된 변이체 단백질 C 또는 변이체 활성 단백질 C 의 양을 재조합 단백질 C 또는 활성 단백질 C 의 투약량보다 더 크게 할 수 있다. 이 방식에서, "치료학적 양" 이란 원하는 세포보호 효과를 달성하는 한편 항응고 활성 감소에 따른 출혈 위험을 저하시키기에 적합한 활성 단백질 C 변이체나 단백질 C 변이체의 총량을 말한다 (볼루스 투여시, 예를 들면, 2mg/kg 미만, 1mg/kg 미만, 0.5mg/kg 미만, 0.04mg/kg 미만, 0.03mg/kg 미만, 0.02mg/kg 미만, 0.01mg/kg 미만, 0.005mg/kg 미만 등 대상이나 치료 질환의 종류에 따라 달라진다).

치료량은 예를 들면, 약 0.01mg/kg/hr 내지 1.1mg/kg/kr 정도이며 연속 주입을 통해 4 내지 96시간에 걸쳐 투여되거나, 약 24시간 동안 약 0.01mg/kg/hr 내지 0.10mg/kg/hr의 소량으로 투여되기도 한다. 바람직하게, 연속 주입식으로 약 4 내지 72 시간 동안 치료량을 투여할 수 있다. 더 바람직하게는 약 4 내지 48 시간 동안 연속 주입, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 48 시간 동안 연속 주입, 더욱 바람직하게는 12 내지 36 시간, 더욱 바람직하게는 4 내지 36 시간, 더더욱 바람직하게는 12 내지 24 시간, 가장 바람직하게는 약 24 시간 동안 연속 주입하는 것이다.

치료량은 APC 의 혈중 농도를 약 0.01㎍/ml 내지 1.6㎍/ml 바람직하게는 약 0.01㎍/ml 내지 0.5㎍/ml 으로 적정하는 것에 기준한다. 또한 당해 분야의 전문가라면 원하는 치료 효과를 얻기에 필요한 양보다 낮은 레벨에서 투약량을 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 점진적으로 투약량을 증가시키는 것을 이해할 수 있 다. 마찬가지로, 당해 분야의 전문가라면 시험관내 및 체외에서 본 발명의 제형이 원하는 효과를 달성하도록 하는 최적의 변이체 농도, 예를 들면, 약 1 내지 100nM 를 결정할 수 있다.

그 밖에 또다른 구체예에서, 본 발명에 따른 치료 효능을 가진 다른 재조합 APC 의 변이체를 확인하기 위하여 후보 약제를 스크리닝 하는 방법이 있다. 이 구체예의 한 측면은 단백질 영역의 표면 고리 상에 재조합 APC 또는 단백질 C 를 돌연변이화 하는 단계 및 상술한 분석 방법에 따라 변이체 APC 항응고 활성 및 세포보호 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 구체예의 방법은 또한 상기 돌연변이된 재조합 활성 단백질 C, 의 항응고 활성을 측정하는 단계; 상기 돌연변이된 재조합 활성 단백질 C 의 항-세포사멸 활성을 측정하는 단계; 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비를 계산하는 단계; 및 상기 비가 1.0 보다 클 경우 상기 재조합 활성 단백질 C 가 잠재적 치료 효능을 갖고 있음을 확인하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 비는 약 2 보다 크고, 더 바람직하게는 4 보다 크며, 가장 바람직하게는 8 보다 크다. 후보 약제가 전구약물인 경우, 상기 전구약물은 체내 또는 시험관내에서 활성 단백질 C 변이체로 전환될 수 있는 단백질 C 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 성질을 위해 후보 단백질 C 변이체를 스크리닝 함에 있어서, 상기 단백질 C 변이체는 활성 측정에 앞서 활성 형태(APC)로 전환되어야 한다.

상기 구체예의 다른 측면에 있어서, 후보 약제의 라이브러리는 고리 37, 칼슘 고리 및 자기소화 고리로 이루어진 군에서 선택된 한 표면 고리의 프로테아제 도메인 내에서 잔사물 상에 하나 이상의 돌연변이를 가진 재조합 APC 또는 단백질 C의 변이체 중에서 선택된다. 본 발명은 단백질 C 변이체를 활성 단백질 C 변이체 로 전환시키는 단계; 하나 이상의 스트레스 받거나 손상된 세포를 소정량의 후보 약제의 존재하에 세포사멸 유발 농도의 스타우로스포린에 노출시킴으로써, 상기 세포에 들어있는 상기 후보 약제의 항-세포사멸 활성을 측정하는 단계; 하나 이상의 스트레스 받거나 손상된 세포를 (b) 에서와 동일한 양의 동일한 후보 약제에 노출시킴으로써 상기 세포에 들어있는 상기 후보 약제의 항응고 활성을 측정하고, 희석 프로트롬빈 응고 시간 분석법을 실행하는 단계; 상기 (a) 단계에서 측정된 항-세포사멸 활성 대 (b) 단계에서 측정된 항응고 활성의 비율을 계산하는 단계; 또한 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비가 1.0 이상인 후보 약제를 선택하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 비는 약 2 이상, 더 바람직하게는 약 4 이상, 가장 바람직하게는 약 8 이상이다.

후보 약제의 스크리닝에 관한 기초적인 방법에 관한 다양한 변형도 당해 분야의 공지 기술에 포함되며 본 발명에 속하는 것이다. 이러한 변형의 예로서 비제한적으로, 세포사멸을 유발하는 다른 방법과 또한 세포사멸 활성 및 항응고 활성을 측정할 다른 시험들을 포함한다.

방법

단백질 C 활성화

재조합 형태의 단백질 C 는 선별된 화학적 구조(예, 원형, 변이체 또는 다형체)로 제조할 수 있다. 예시로서, 인간 단백질 C 코딩 유전자는 미국 특허 4,775,624 에 개시되어 있으며 미국 특허 4,981,952 에 개시된 바와 같은 재조합 인간 단백질 C 를 제조하는데 사용할 수 있다. 인간 단백질 C 는 조직 배양에서 재조합적으로 생성되고 미국 특허 6,037,322 에 개시된 바와 같이 활성화 될 수 있다. 천연 인간 단백질 C 는 혈장으로부터 정제, 활성화 및 미국 특허 5,084,274 에 개시된 바와 같이 분석할 수 있다. 상기 특허에 개시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 단백질 C 의 기준으로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 실시예에서, 재조합 야생형 APC (wt-APC), RR229/230AA-APC (229/230-APC), KKK191/192/193AAA-APC (3K3A-APC), R306A/K311A/R312A/R314A-APC(306-314-APC) 및 S360A-APC 를 상술한 바와 같이 제조하였다 (Gale et al., supra, 1997; Gale et al., supra, 2002). 단백질 C 를 트롬빈으로 활성화 시켰다 (3281 U/mg, Enzyme Research Labs, South Bend, IN). 2mM EDTA 와 pH 7.4, 및 600㎍/mL 의 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 HBS 내의 단백질 C (HEPES 완충 염수, 50mM HEPES, 150mM NaCl)를 37℃ 에서 12㎍/mL 트롬빈으로 2.5 시간 동안 배양하고, 이어서, 트롬빈 단위당 1.1 단위의 히루딘(Sigma, St Louis, MO)을 첨가하여 트롬빈을 비활성화 시켰다. 대조군은 아미도 분해 분석, APTT 응고 분석 및 FVa 비활성화 분석을 행하여 상기 사용된 트롬빈 및 히드린이 후속의 분석에 아무런 영향도 미치지 않았음을 확인하였다.

"돌연변이" 란 자연 활성화 단백질 C 와 비교할 때 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 변화가 일어나는 것이며, 더 활성적이거나 덜 활성적인 하나 이상의 기능, 변화 또는 소거된 종래의 기능, 자연적으로 존재하지 않는 새로운 기능 및 그의 조합을 포함한다.

APC 의 활성-위치 적정

Chase and Shaw(Biochem. Biophys. Res.Commun., 29:508-514, 1967)에서 채택된 활성 위치 적정법으로서, HBS 에 함유된 약 8μM APC 와 또한 pH 7.4 에 대해 계산된 p-니트로페놀의 흡광계수가 11400M^-1cm^- ¹ 인 0.1mM 의 p-니트로페놀-구아니디노 벤조에이트를 이용하는 상기 적정법을 통해 APC 변이체를 정량화 하였다.

APC 의 역학적 분석

염색 형성 기질인 페파크롬 PCa(Pentapharm, Basel, Switzerland)에 관한 미카엘리스 상수(K_m) 및 촉매속도 상수(k_cat) 는 기질의 농도를 0.5% BSA, 5mM CaCl₂ , 및 pH 7.4, 5.7nM 의 APC 를 함유하는 HBS 내에서 1.43mM 에서 0.0446mM 로 변경하면서 결정했다. 미카엘리스 상수는 에디-홉스티 플롯(Eadie-Hofstee plot)을 이용하여 유도하였다. 이와 별도로, 5mM CaCl₂ 을 5mM EDTA 로 대체하여 마찬가지로 측정하였다. 색 발현은 옵티막스 마이크로플레이트 해독기로 측정했다 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)(Mesters et al., J. Biol., Chem. 266:24514-19, 1991).

세포 배양

EAhy926 상피세포는 Dr. C.J.S. Edgell (University of North Carolina, Chapel Hill NC)로부터 수득했으며, 상술한 바와 같이 공기 중에 5% CO₂ 를 함유하는 습윤 대기 중에서 또한 37℃ 에서, 10% 태아소 혈청(Omega Scientific, Tarzana, CA), 100 U/ml 페니실린 G 나트륨(Gibco), 100㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트(Gibco) 및 2mM 글루타민(Gibco)을 함유하는 DMEM 고함량 글루코스 내에 상기 수득한 상피세포를 유지시켰다(Edgell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., USA, 80:3734-3737, 1983).

세포사멸 분석

상피세포의 스타우로스포린-유발 세포사멸은 종래의 분석방법(Joyce et al., supra, 2001)을 변경하여 개시했다(Mosnier and Griffin, supra, 2003). 상기 변경된 방법은 젤라틴-피복된 커버슬립 상에서 세포를 배양하고 스타우로스포린 농도를 변경하고, 후술하는 바와 같이 스타우로스포린 첨가 전에 APC 사전배양 시간을 최적화 하는 것을 수반했다. ATP 유사체 및 단백질 키나제 C(PKC)의 억제자인 스타우로스포린은 공지된 세포사멸 유발자이다. 아포퍼센티지 염료는 세포막 외측면 상의 소프파티딜세린의 발현 측정값이며 따라서 전통적인 어낵신-V 라벨화에 의해 측정된다. 세포막 외측면에 포스파티딜세린을 전달하는 것은 아포퍼센티지 염료를 이것이 저장 축적되는 세포 내로 무방향적으로 전달할 수 있게 한다. 축적된 염료는 적색/자주색이고 종래의 현미경으로 확인가능하다 (Joyce et al., supra, 2001; Mosnier and Griffin, supra, 2003). 이 염료를 세포사멸을 관측하는데 사용했다. 상술한 바와 같이, 세포사멸 특이적 염료, YO-PRO-1(10μM, 5분)로 (Molecular Probes, Eugene, OR)(Idziorek et al., J. Immunol. Methods, 185:249-258, 1995) 또는 카스카제 3-유사 효소, DEVD-amc 를 위한 합성 기질(Calbiochem, San Diego, CA)로 20분 동안 배양할 수 있다. 스타우로스포린은 아포퍼센티지 염색에서 측정된 바와 같이(데이타 없음), EAhy926 상피세포내에서 시간-의존적 및 농도-의존적 세포사멸을 유발했다.

요약하면, 12mm 원형 커버슬립 (Fisherbrand, Pittsburgh, PA)을 산세척하고 증류수 및 95% 에탄올로 세정하고, 균질한 점적 방울이 형성 및 공기 건조될 때까지 10 x 젤라틴(아포퍼센티지 염료 함유의 0.5% 젤라틴)에 침지하였다. EAhy926 세포는 성장하여 24 웰 플레이트의 젤라틴-피복된 커버슬립 상에 집합되고 세포사멸 유발에 앞서 APC 에 의해 5시간 동안 배양되었다. 각종 단백질로 사전배양한 후, 세포사멸은, 아포퍼센티지 염료의 존재하에(Biocolor, Belfast, N. Ireland) 10μM 의 최종 농도가 될 때까지 스타우로스포린을 첨가하여(Calbiochem, San Diego, CA) 공급자의 지시에 따라 공급된 원액의 1/20 에 해당하는 최종 농도로 희석함으로써 유발되었다.

공기중 5% CO₂ 가 함유된 습윤 대기 중에서 및 37℃ 에서 1시간 배양한 후, 세포를 인산염 완충 염수(PBS)와 또한 페놀 레드(Gibco, Grand Island, NY) 무함유 및 5% 태아소 혈청(Omega Scientific, Tarzana, CA) 함유의 DMEM 고농도 글루코스로 세척한 뒤, 100 U/ml 페니실린 G 나트륨(Gibco), 100mg/ml 스트렙토마이신 설페이트(Gibco) 및 2mM 글루타민(Gibco) 을 세포에 첨가했다.

세포를 세척후 즉시 Spot QE 디지탈 카메라에 부착된 Zeiss IM 인버트 현미경을 이용하여 사진 찍었다. 100 x 배율에서 평균 4개 필드가 각 커버슬립에서 사진 촬영되었으며 세포사멸성 세포의 수는 영상 분석 소프트웨어 셀 카운터(Dr. L.O. Mosnier, The Scripps Research Institute)로 계수하였다. 각 실험에서, 대표적인 세포 필드는 상대조법으로 사진 촬영했고 존재하는 세포 총수를 계수했다. 세 포사멸의 백분율은 세포 총수에 대한 세포사멸성 세포수로 표시한다. 반복적인 대조군 실험도 실시하여(MTT 기반 분석, Celltiter 96 수성 비-방사성 세포증식 분석, Promega, Madison, WI) 세포가 분리되지 않았음을 확인하였다. 또한 집합된 세포층의 붕괴가 관측되는 경우 그 데이타 점을 제외시키고 다시 반복 분석했다.

응고 분석

희석 프로트롬빈 시간 응고 분석법을 다음과 같이 실시했다. 혈장(5OμL) 을, 37℃ 에서 3분간 APC 농도가 8 에서 32nM (2.7-11nM 최종 농도) 로 변경되는 조건에서 0.5% BSA 를 함유하는 HBS 내의 50μL 의 APC 와 함께 배양했다. 그 뒤, 0.5% BSA, 25mN CaCl₂ 을 함유하는 HBS 에 넣어 1:60 비율로 희석된 50μL 이노빈(Dade Behring Inc., Newark, DE) 첨가하여 응고를 개시했다. 응고 시간을 ST4 응집 측정계 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)를 사용하여 기록했다. APTT 응고 분석에서, 50μL 의 혈장을 50μL 의 APTT 시약 (Platelin LS, Organon Technika Corp, Durham, NC) 과 혼합한 뒤 37℃ 에서 3분간 사전배양했다. 그 뒤, 2μL 의 APC 를 첨가하고 다시 50μL 의 HBS, 0.5% BSA, 5mN CaCl₂ 을 첨가했다. ST4 응집 측정계 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)를 사용하여 응고 시간을 기록했다.

APC 비활성화

혈장내 존재하는 세르핀을 이용한 APC 비활성화를 Heeb et al 의 실험방법에 따라 측정했다 (J. Biol. Chemm., 265:2365-2369, 1990). 요약하면, 인간 혈장 또는 순수한 세르핀 억제제의 혼합물 (PCI 및/또는 α1-안티트립신) 을 37℃ 에서 사전 배양한 뒤 APC 를 첨가했다. 선정된 시간에 분획물을 분리하여 APC 특이적 염색형성 기질을 이용하여 APC 활성을 분석했다.

FVa 비활성화는 다음과 같이 측정했다. 1nM FVa 와 25μM 인지질 소포체의 혼합물을 100mM NaCl, 0.5% BSA, 5mM CaCl₂, 0.1mM MnCl₂ 을 함유하는 pH 7.4의 50mM HEPES 에서 제조했다. 비활성은 APC 를 첨가함으로써 개시되었다. 1 ㎕ 의 분획물을 각 시점에 분리하고 여기에 1.25nM 인자(Xa)(FXa)와 31μM 의 인지질 소포체를 함유하는 40μL 에 첨가한 뒤, 다시 10μL 의 3μM 의 프로트롬빈을 더 첨가했다 (최종 농도: 1nM FXa, 20pM FVa, 25μM 인지질 소포체 및 0.6μM 프로트롬빈). 2.5분 후, 상기 혼합물 중 15μL 의 분획물은 10mM EDTA, 0.5% BSA, pH 8.2 를 함유하는 55μL 의 HBS 에 첨가하여 반응을 중단시켰다. 염색 형성 기질 CBS 34-47 (Diagnostica Stago, Asnieres, France)을 추가하고 트롬빈 형성율은 405nm 에서의 흡수광 변화를 측정함으로써 평가했다. 이러한 FVa 배양의 유사-1차원 시간 과정은 다음의 식 1 을 이용하여 Nicolaes et al. (supra, 1995)에 따라 행해졌다:

당해 분야의 전문가라면, 본 발명에 따라서, 치료 및/또는 완화되기도 하는 기타의 질환 상태 및/또는 증세를 확인할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 심근경 색, 기타 심장 질환과 임상적 징후, 상피세포 손상, 성인 호흡기장애 증후군(ARDS), 또한 간, 신장이나 중추신경계(CNS)의 부전 등을 치료하는데 이용된다. 본 발명의 방법론적 측면에서 유리한 기타의 다른 질환들이 있으며 예를 들면, 관상동맥 질환, 부정맥, 울혈성 심부전, 심근증, 기관지염, 신경외상, 그래프트/이식 거부반응, 심근염, 당뇨성 신경염 및 뇌졸증 등이 포함된다. 생명에 위협적인 국소 및 말초 조직 손상은 수술, 외상, 또한 대부분의 관속층이 일정 시간 동안 산화되지 못하였다가(허혈) 정상적인 혈액 순환을 회복하는(재관류) 뇌졸증 과정에서 발생한다. 세포가 죽고 조직 손상이 일어나 기관의 부전 또는 기관 기능의 감퇴를 유도할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 이러한 손상의 치료나 예방에 유용하다.

요약하면, 본 발명의 재조합 APC 변이체의 두가지 변이체, 즉, KKK191-193AAA-APC 및 RR229/230AA-APC 가 제공되며, 이들은 항응고 활성이 현저히 감소하는 반면 정상 또는 정상에 가까운 수준의 항-세포사멸 활성을 유지하는 것이다. 본 발명은, 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비율이 높다는 특히 바람직한 특성을 가진 APC 변이체를 포함한다. 본 발명은 또한 더 적절한 또한, 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비율이 유리한 변이체를 포함하고; 상기의 변이체는 또한 세포보호성과 훨씬 낮은 출혈 위험을 갖는 것으로 예상된다. 본 발명은 APC 의 변이체에 한정되지 않고 바람직한 APC 변이체를 수득할 수 있는 것으로서, 예컨대, 바람직한 활성 비율을 갖는 단백질 C 변이체를 포함한다. 본 발명은 또한 고리 37, 칼슘 고리나 자기소화 고리에 대한 돌연변이체에 한정되지 않고, 원하는 수준의 항응고 활 성에 대한 세포보호 활성 비율을 가져오는 프로테아제 도메인의 다른 표면 고리 상의 잔사물의 돌연변이체도 포함한다. 따라서, 본 발명의 APC 및 단백질 C 변이체는 APC 항응고 활성과 관계없이 APC 보호 활성이 유리한 대상을 치료하는데 유용할 것으로 예상된다. 상기 대상은 각종 기관내의 혈관 또는 조직에 대하여 세포사멸로 인한 손상 위험에 처한 환자를 포함한다. 더 구체적이나 비제한적으로, 이들 대상은 예를 들면, 다른 조건 중에서도 심각한 패혈증, 허혈/재관류 손상, 허혈성 뇌졸증, 급성 심근경색, 급성 및 만성 신경퇴행성 질환 및 기관 이식 등의 대상을 포함한다.

실시예 5

방법

이 실시예는 평균화 한 추가의 실험들의 결과를 수록한 표 1로부터 추출된 데이타 및 변이체 S360A-APC 에 관한 데이타 중에서 개선된 데이타 분석을 포함한다. 더우기, 항응고 데이타는 PT 분석 대신 (표 2에서 언급한 바와 같이) APTT 분석을 이용하여 수집했다. 따라서, 상기 추출된 데이타를 표 2와 같이 표시한다. 이 실시예는 또한 APC 의 변이체의 아미드 분해, 항응고 및 항-세포사멸 활성에 대한 상세한 분석을 포함한다 (도 3 내지 6). 예를 들면, 다음의 방법을 사용했다.

인간 알파-트롬빈은 Enzyme Research Laboratories 에서 구입했다(South Bend, IN). 정상 인간 시트레이트-항응고 혈장은 George King Bio-Medical, Inc. 에서 구했다 (Overland Park, KS). 염색형성 기질 L-피로글루타밀-L-프로필-L-아르기닌-p-니트로아닐린 히드로클로라이드(S-2366)를 Chromogenix 에서 구했다 (Franklin, OH).

재조합 활성 단백질 C 의 제조

상술한 바와 같이 변이체 단백질 C 발현 벡터가 구성되고 재조합 단백질 C 변이체는 처리 매질로부터 정제되었다 (Gale et al., supra, 2002; Gale et al., supra, 1997). 정제된 단백질 C 는 트롬빈에 의해 활성화 되었다 (Gale et al., supra, 2002; Gale et al., supra, 1997), 요약하면, 2mM EDTA 및 0.5% BSA 를 함유하는 pH 7.4 의 HBS (50mM HEPES, 150mM NaCl) 내에 들어있는 600㎍/ml 농도의 단백질 C 를 12㎍/ml 의 트롬빈으로 2.5 시간 동안 37℃ 에서 배양하고 다시 트롬빈 단위당 1.1 단위의 히루딘을 첨가하여 상기 트롬빈을 비활성화 했다. 이어서, NaCl 경사 용리액을 이용한 음이온-교환 크로마토그래피법에 의해 트롬빈이 분리되었다 (Yan et al., Bitechnology, 8:655-661, 1990). 섬유소 응고에 의해 결정된 잔사물 트롬빈은 0.00025%(mol 트롬빈/mol APC) 미만의 단백질로 측정되었다. rwt-APC 및 APC 변이체의 농도는, Chase and Shaw 에서 채택한 것으로서 HBS 내의 약 8μM 의 APC 및 0.1mM 의 p-니트로페놀-구아니디노 벤조에이트, 및 상술한 바와 같이, 11,400M^-1cm^-1(pH 7.4)의 p-니트로페놀 흡광계수를 이용하는(Gale et al., supra, 2002) 활성-부위 적정법으로 결정했다 (Chase and Shaw, supra, 1967). S360A-APC 의 농도는 미국 바이오프로덕츠(Parsippany, NJ)의 아세라크롬 단백질 C ELISA 를 이용하여 측정했다 (Gale et al., supra, 1997).

APC 활성 분석

아미드 분해 분석(S-2366)은 상술한 바와 같이 실행했다 (Gale et al., supra, 2000; Gale et al., supra, 1997). APTT 응고 시간 분석법을 다음과 같은 절차대로 사용했다. 혈장(50㎕)을 카올린/세팔린으로 37℃ 에서 1분간 배양하고(C.K. Prest 2, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ), 다시 0.5nM 내지 32nM 의 최종 APC 농도에서 0.5% BSA 를 함유한 HBS 내의 25㎕ APC 를 첨가하고 추가로 3분간 배양했다. 응고는 HBS 내에 50㎕의 50mM 의 CaCl₂ 를 첨가하여 응고 작용을 개시했고 응고 시간은 Amelung KC 4a 마이크로 응집 측정기를 이용하여 기록했다 (Sigma Diagnostics, St Louise, MO).

APC 의 세포보호 효과는 상술한 바와 같은 스타우로스포린-유발 상피세포(EA.hy926) 세포사멸 (Mosnier and Griffin, supra, 2003)에 대한 분석에서 결정되었다. APC(0.16 내지 100nM)는, 별도의 언급이 없다면 스타우로스포린(10M, 1h)에 의한 세포사멸의 유도에 앞서서 5시간 동안 세포와 함께 배양했고 세포사멸은, 세포막의 외측면으로 포스파티딜세린이 이동하는 것을 측정하는 Biocolor의 아포퍼센티지 염료(Belfast, N. Ireland)로 평가했다. PAR-1 (Dr L. Brass 에서 공급한 WEDE-15 및 ATAP-2) 및 EPCR (Zymed) 에 대한 차단 항체를 상술한 바와 같이 이용했다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). 스타우로스포린-처리된(2μM, 4시간) 것으로서, 세포사멸 유발에 앞서서 APC 로 배양한(25nM, 5시간) EA.hy926 상피세포의 활성 카스파제-3 면역형광 염색 및 DAPI 핵 염색(5㎍/ml)에 관하여, 제조업자의 지시사항에 따라 토끼 항-활성화 카스파제-3 항체(Promega) 및 알렉사-플루오르- 568 라벨화된 2차 염소 항-토끼 항체를 사용하였다 (Molecular Probes).

PAR-1 펩티드 분열

PAR-1 N-말단 테일 펩티드(TR33-62)와 rwt-APC 및 APC 변이체 (500nM)의 상호작용을 합성 펩티드 표현 PAR-1 잔사물 33 내지 62 (Bio Synthesis Inc., Lewisville, TX)를 사용하여 연구했다. 펩티드 서열은 A³³TNATLDPR⁴¹SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKN⁶²(서열번호 8) 이었으며 Arg41 및 Ser42 사이의 APC 에 의해 분열되었다. 기질 펩티드 및 트롬빈이나 Arg41 상의 APC 분열의 두개의 펩티드 산물을 분해하여 역상 HPLC로 분석하고 상술한 바와 같이 정량화 했다 (Arosio et al., Biochemistry, 39:8095-8101, 2000). APC 함유의 5nM 의 히드린을 이용한 모든 TR33-62 분열 실험에서, 관측된 분열이 트롬빈 오염에 기인하지 않았음을 증명하였다.

결과

RR 229/230AA-APC 및 KKK191-193-AAA-APC 의 항-세포사멸, 항응고 및 아미도 분해 활성을 측정하고, 또한 활성 부위 잔사물 Ser360 대신 Ala 를 함유하는 가수분해적 비활성 변이체인 S360A-APC 및 재조합 야생형(rwt)-APC의 활성을 비교했다. 두개의 APC 프로테아제 도메인 고리 변이체인 RR229/230AA-APC 및KKK191-193-AAA-APC 는 소량의 염색형성 기질 S-2366 에 대하여 재조합 야생형 APC(rwt-APC)와 동등한 크기의 효소 활성을 갖고 있으며(도 3a) 이는 APC 활성 부위가 기능적 및 구조적으로 보존되고 있음을 입증하는 것이다. 다른 한편, 이들 변이체는 현저히 감 소된 항응고 활성을 나타내었으며(도 3b) 이는 인자(Va)내의 Arg506 상의 분열 손상에 기인한 것이었다 (표 2 참조).

표 2

재조합 야생형 및 변이체 APC 의 활성^*

(APTT 에 의해 측정된 항응고 활성)

야생형 (wt) 변이체	APC 서열 ( Ala 로 돌연변이됨 )	세포보호 활성(% rwt-APC)^†	항응고 활성(% rwt-APC)^‡	세포보호 대 항응고 활성의 비^$	Arg⁵⁰⁶(Arg³⁰⁶)에서의 인자(Va) 비활성 분열(rwt-APC %)∥	아미드 활성(% rwt-APC)^¶	PAR-1 펩 티드 (TR- 33-62 분 열 (% rwt-APC)^#	서열번호
rwt-APC^*	없음	100%	100%	1.0	100% (100%)	100%	100%
229/230-wt	227-DL RR WE-232							9
229/230-APC	227-DLAAWE-232	94%	13%	7.2	25% (110%)	102%	116%	10
3K3A-wt	189-DS KKK LA-195							11
3K3A-APC	189-DSAAALA-195	114%	4.6%	25	11% (67%)	109%	88%	12
S360A-wt	358-GD S GG -362							13
S360A-APC	358-GDAGG-362	< 1%^**	23%^††	0	< 1%^(<1%^)	< 1%^**	< 3%**	14

* 재조합 야생형 APC(rwt-APC) 활성은 100% 로 정의되고 변이체 APC 의 값은 rwt-APC 활성의 백분율로 정함.

† 스타우로스포린-유발 세포사멸의 최대 억제율의 1/2 이 될 때 필요한 APC 의 농도로부터 유래됨 (도 2a 참조).

‡ rwt-APC 및 APC 변이체에 대해 측정된 APTT 약량 반응 데이타(0.5nM - 32nM)에 근거함 (도 1b 참조).

$ 이 표의 전술한 두개의 컬럼에 제공된 세포보호 및 항응고 활성 간의상대비로부터 유래됨.

∥ 앞에서 측정된 겉보기 2차원 속도 상수에 근거함 (Gale et al., supra, 2002; Gale et al., supra, 1997).

¶ rwt-APC 및 APC 변이체에 대해 측정된 아미드 분해 활성에 근거함 (0.5 - 32nM) (도 1a 참조).

# rwt- APC 및 APC 변이체(500nM)에 의한 PAR-1 펩티드(TR33-62)의 분열에 관한 도 4 로부터 유래된 촉매 효능에 근거함.

** 분석 조건에서 검출 가능한 활성이 없음.

†† S360A-APC 의 항응고 활성은 인자(Va)의 단백질 분해 작용에 기인 한 것이 아니며, rwt-APC 와 대조적으로, 혈장으로 APC 를 배양하는 시간과 무관하다 (Gale et al., supra, 1997).

S360A-APC 는 아무런 염색형성 활성도 갖지 않지만(도 3a), S360A-APC의 항응고 활성은 APTT 분석에서(Fig. 3b) 약 23% 까지 이었다(도 3b). 상술한 바와 같이, 정상 rwt-APC 와 대조적으로, 상기 항응고 활성은 APC 와 혈장의 배양 시간과는 무관하며 (Gale et al., supra, 1997), 또한 인자(Xa)의 억제 및 인자(Va)에 대한 프로트롬빈 결합의 억제 등이 가능하도록 인자(Va)에 대한 APC 엑소사이트의 결합을 수반하는 것으로 나타난다.

이들 APC 변이체의 세포보호 활성을 결정하기 위해, 스타우로스포린-유발 상피세포의 세포사멸 (Joyce et al., supra, 2001; Mosnier and Griffin, supra, 2003)에 대해 연구했다. 스타우로스포린 유발 세포사멸의 APC-매개형 억제는 시간 의존성 및 투약량 의존성이고 APC 활성 위치, PAR-1 및 EPCR 을 필요로 한다 (Mosnier and Griffin, supra, 2003). rwt-APC 에 의해 스타우로스포린-유발 세포사멸의 최대 억제율의 1/2 은 해당 조건 하에(도 4a) 약 0.16nM 에서 달성되었다.

RR229/230AA-APC 및 KKK191-193AAA-APC 에 의한 세포사멸의 투약량 의존적인 억제는 각각 0.17nM 및 0.14nM 에서 최대 억제율의 1/2 을 갖는 것으로서 rwt-APC 과는 크게 구분되지 않았다 (도 4a). 활성 부위 세린 S360-APC (Gale et al., supra, 1997)가 부족한 APC 변이체에 의한 세포사멸의 증거를 관측하였다 (도 4a 내지 c). 스타우로스포린에 노출된 상피세포 내의 활성화된 카스카제 3 의 생성을 억제하기 위한 rwt-APC 및 ACP 변이체의 능력은 면역조직화학적으로 관측되었다. rwt-APC 및 변이체, 즉, RR229/230 AA-APC 및 KKK191-193 AAA-APC 는 각각 유사한 활성화 카스파제-3- 양성 세포가 약 70% 로 감소하였다. 반면에, 활성 부위의 변이체 S360A-APC 는 아무런 영향이 없었다 (도 4b-c). 따라서, APC 의 정상 항응고 활성에 매우 중요한 특정의 프로테아제 도메인 잔사물 즉, Arg 229 및 Arg 230 및 Lys191 과, Lys192 및 Lys 193 등은 APC 의 정상적인 항-세포사멸 활성을 필요로 하지 않는다.

APC 항-세포사멸 효과는 PAR-1 및 EPCR 을 필요로 한다 (Cheng et al., supra, 2003; Mosnier and Griffin, supra, 2003). 마찬가지로, 스타우로스포린-유발의 상피세포 세포사멸의 분석에 있어서 RR229/230AA-APC 및 KKK191-193AAA-APC 의 항-세포사멸 활성은 PAR-1 및 EPCR 을 필요로 했다. 그 이유는, 각 APC 변이체의 세포보호 활성은 수용체에 대한 APC 의 결합을 차단하는 EPCR 에 대한 항체의 존재하에서는 각각 72% 및 69% 가 억제되었고, 또한 차단성 항-PAR-1 항체의 존재하에서는 88% 및 55% 로 각각 억제되었다 (도 5). 이러한 결과로부터, 세포 및 rwt-APC 와 유사한 두개의 APC 변이체 사이의 반응은 PAR-1 및 EPCR 을 필요로 한다는 사실이 증명된다.

야생형 및 변이체 APC 에 의한 PAR -1 N 말단 테일의 분열

S360A-APC 의 항-세포사멸 활성의 결핍 및 PAR-1 에 대한 필요성 때문에 APC 항체-세포사멸 활성에 관한 1차 메카니즘 단계는 PAR-1 단백질 분해 활성을 동반한다 (Cheng et al., supra, 2003; Mosnier and Griffin, supra, 2003). Arg41 에서의 분열로 인해 PAR-1의 단백질 분해 활성에 대한 APC 내의 돌연변이체의 효과를 특징화 하기 위해, PAR-1N-말단 서열(잔사물 33-62(TR33-62))을 나타내는 합성 30-mer 펩티드를 APC 기질로서 연구했다. 이 TR33-62 PAR-1 펩티드는 트롬빈에 의해 Arg41 에서 분열한다 (Arosio et al., supra, 2000). APC 는 또다른 PAR-1 합성 N-말단 펩티드를 상기 트롬빈 분열 위치인 Arg41 에서 분열시킨다 (Kuliopulos et al. supra, 1999). HPLC 정량적 분석법을 이용하여, rwt-APC 가 Arg41 에서 TR33-62 펩티드를 분열시키고 또한 유사한 트롬빈 단편들 즉, TR33-41 과 TR42-62 를 생성했으나, 두가지 효소에 대한 (k_cat/K_m) 의 비교에 근거하여 (데이타 없음) 약 25,000 배 낮은 촉매 효능을 나타내었다. TR33-62 분열의 시간 경과 과정을 HPLC 를 이용하여 관측함으로써 TR33-62 기질에 대한 정점의 소멸 및 TR42-62 산물의 출현을 정량화 하였고, 그 결과 TR33-62 분열 속도는 rwt-APC, RR229/230AA-APC 및 KKK191-193AAA-APC 간에 실질적으로 큰 차이가 없었다는 사실을 발견하였다 (도 6). 마찬가지로, rwt-APC 를 두개의 항-세포사멸 APC 변이체인 RR229/230AA-APC 및 KKK191-193AAA-APC 를 비교했을 때, EA.hy926 상피세포에서 FURA-2-AM 형광 변화가 관측되었기 때문에 APC-유발된 Ca⁺⁺-세포간 플럭스에 있어서 현저한 변화는 관측되지 않았다 (데이타 없음). 이러한 결과는, APC 가 PAR-1 을 Arg41 위치에서 분열시킨다는 것과 또한 낮은 항응고 활성 및 정상의 항-세포사멸 활성을 가진 상술한 두개의 APC 변이체 내의 돌연변이체는 Arg41 위치에서 PAR-1 을 분열하기 위해 APC 의 프로테아제 도메인의 능력을 크게 감소시키기 않는다는 가설과 일치하는 것이다.

요약하면, 낮은 항응고 활성으로 인해 출혈 위험이 적어지는 재조합 APC 변이체를 생성하기 위하여, APC의 항응고 활성을 점 지향적 돌연변이 유발에 따라 APC의 세포보호 활성으로부터 분리시켰다. 스타우로스포린-유발 상피세포 세포사멸 분석법을 이용하여, 항응고 활성을 현저히 감소시킬 두개의 APC 표면 고리에 있는 Ala 돌연변이체 (RR229/230AA 및 KKK191-193AAA)가 프로테아제 활성 수용체-1 및 상피세포 단백질 C 수용체를 필요로 하는 정상적인 항-세포사멸 활성을 유지하는 두개의 APC 변이체가 된다는 것을 입증한다. 또한, 상기의 두 APC 변이체는 Arg41 에서 PAR-1 N-말단 펩티드를 분열하는 정상적인 능력을 유지한다. 이들 두 APC 변이체를 항-세포사멸 활성 및 항응고 활성 측면에서 rwt-APC 와 비교할 때 (APTT 로 측정; 표 1에서 항응고 활성은 희석 PT 에 의해 측정되었다), 관측된 rwt-APC 의 활성치를 100% 으로 가정하여 각 APC 변이체의 활성도 백분율을 투약량-반응 데이타 로부터 계산했다 (도 3 및 4). 이 표준화에 따라 rwt-APC 에 관하여 1.0의 "세포보호 활성 대 항응고 활성" 비를 수득한다 (표 2). 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비를 APC 변이체에 대해 계산했을 때(표 2), 상기 두개의 APC 변이체는 rwt-APC 와 비교한 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비가 각각 7배 및 25배 이상을 나타냈다. 상기의 비는 항응고 활성에 관련하여 희석 PT 분석법을 이용하여 계산한 표 1에서의 값과 거의 유사하다.

따라서, 이들 데이타는 인자(Va)의 Arg506 에서 분열 감소를 일으키는 APC 의 RR229/230AA 및 KKK191-193AAA 돌연변이체가 PAR-1의 Arg41 에서 분열을 일으키지 않는다는 것을 보여준다.

본 명세서에 언급된 참조 문헌 및 특허는 그 내용을 참조하기 위하여 수록한 것이다.

상기와 같이, 본 발명의 APC 변이체 및 전구약물은 정상의 세포보호 활성 및 낮은 항응고 활성을 가짐으로써, 세포사멸로 인한 각종 기관의 혈관 또는 조직 손상의 위험이 있는 환자들, 예를 들면, 패혈증, 허혈/재관류 손상, 허혈성 뇌졸증, 급성 심근경색, 급성 또는 만성 신경퇴행성 질환, 기관 이식이나 화학 요법을 받은 환자들을 치료하는데 바람직하게 사용된다.

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE <120> ACTIVATED PROTEIN C VARIANTS WITH NORMAL CYTOPROTECTIVE ACTIVITY BUT REDUCED ANTICOAGULANT ACTIVITY <150> US 60/485,792 <151> 2003-07-08 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <223> PAR-1 agonist peptide <400> 1 Thr Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Corresponds to residues 225-235 in the full-length wt-APC protein <400> 2 Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(6) <223> Residues 5-6 are R-to-A mutations corresponding to residues 229-230 in the full-length wt-APC protein <400> 3 Glu Tyr Asp Leu Ala Ala Trp Glu Lys Trp Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Corresponds to residues 189-194 in the full-length wt-APC protein <400> 4 Asp Ser Lys Lys Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(5) <223> Residues 3-5 are K-to-A mutations corresponding to residues 191-193 in the full-length wt-APC protein <400> 5 Asp Ser Ala Ala Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Corresponds to residues 305-315 in the full-length wt-APC protein <400> 6 Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (2) <223> Residue 2 is a R-to-A mutation corresponding to position 306 in the full-length wt-APC protein <220> <221> MUTAGEN <222> (7) <223> Residue 7 is a K-to-A mutation corresponding to position 311 in the full-length wt-APC protein <220> <221> MUTAGEN <222> (8) <223> Residue 8 is a R-to-A mutation corresponding to position 312 in the full-length wt-APC protein <220> <221> MUTAGEN <222> (10) <223> Residue 10 is a R-to-A mutation corresponding to position 314 in the full-length wt-APC protein <400> 7 Ser Ala Glu Lys Glu Ala Ala Ala Asn Ala Thr 1 5 10 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> Corresponds to residues 33-62 of the PAR-1 sequence <400> 8 Ala Thr Asn Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro 1 5 10 15 Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys Asn 20 25 30 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> Corresponds to residues 227-232 in the full-length wt-APC protein <400> 9 Asp Leu Arg Arg Trp Glu 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(4) <223> Residues 3-4 are R-to-A mutations corresponding to residues 229-230 in the full-length wt-APC protein <400> 10 Asp Leu Ala Ala Trp Glu 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Corresponds to residues 189-195 in the full-length wt-APC protein <400> 11 Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(5) <223> Residues 3-5 are K-to-A mutations corresponding to residues 191-193 in the full-length wt-APC protein <400> 12 Asp Ser Ala Ala Ala Leu Ala 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> Corresponds to residues 358-362 in the full-length wt-APC protein <400> 13 Gly Asp Ser Gly Gly 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MUTAGEN <222> (3) <223> Residue 3 is a S-to-A mutation corresponding to position 360 in the full-length wt-APC protein <400> 14 Gly Asp Ala Gly Gly 1 5

Claims

변이 재조합 활성 단백질 C 또는 재조합 단백질 C 변이체를 포함하고, 세포 사멸에 의해 야기된 손상에 대해 환자의 세포를 보호하기 위한 치료 조성물로서, 상기 변이 재조합 활성 단백질 C 또는 재조합 단백질 C 변이체에서 하나 이상의 돌연변이는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 세포사멸에 의해 야기된 손상은 패혈증, 허혈/재관류(reperfusion) 손상, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 급성 심근경색, 급성 신경퇴행성 질환, 만성 신경퇴행성 질환, 장기 이식, 화학요법 및 뇌 방사선 손상 중 하나 이상의 결과인 것인 치료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환하고 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 변이 재조합 활성 단백질 C는 전구약물(prodrug)로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 재조합 단백질 C 변이체는 전구약물로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 환자는 패혈증에 걸린 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 환자는 허혈/재관류 손상, 뇌졸중 및 허혈성 뇌졸중 중 하나 이상에 걸린 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 만성 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 다운 증후군, 헌팅톤병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,

상기 변이 재조합 활성 단백질 C는 4시간 내지 96시간 동안 연속 주입되어, 0.01 mg/kg/hr 내지 1.1 mg/kg/hr의 치료 량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
세포사멸에 의해 적어도 부분적으로 야기된 손상에 대하여 세포를 보호하는 인 비트로(in vitro) 방법으로서, 치료량의 재조합 활성 단백질 C를 상기 세포에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 재조합 활성 단백질 C는 항응고 활성 및 세포보호 활성을 가지고, 상기 재조합 활성 단백질 C는 표면 고리를 포함하는 프로테아제 도메인을 더 가지며; 상기 활성 단백질 C는 돌연변이를 포함하고; 상기 돌연변이는, 세포보호 활성과 무관하게, 야생형 재조합 활성 단백질 C보다 항응고 활성을 저하시키고, 상기 돌연변이는 야생형 재조합 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이인 것인 인 비트로 방법.
제11항에 있어서,

상기 돌연변이는 상기 프로테아제 도메인의 표면 고리의 잔기에 있는 것을 특징으로 하는 인 비트로 방법.
제12항에 있어서,

상기 표면 고리는 고리 37 및 칼슘 고리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인 비트로 방법.
제11항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환하고 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 인 비트로 방법.
제11항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 인 비트로 방법.
제11항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 인 비트로 방법.
유효량의 변이 재조합 활성 단백질 C 또는 재조합 단백질 C 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 변이는 야생형 재조합 또는 내인성 활성 단백질 C보다 항응고 활성을 저하시키고 세포보호 활성을 유지시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 하나 이상의 돌연변이는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
유효량의 전구약물을 포함하는 조성물로서, 상기 전구약물은 단백질 C 변이체를 포함하고, 상기 단백질 C 변이체는 활성 단백질 C 변이체로 전환될 수 있고; 상기 변이체는 야생형 재조합 또는 내인성 활성 단백질 C보다 항응고 활성을 저하시키고 세포보호 활성을 유지시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 하나 이상의 돌연변이는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환하고 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서,

상기 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서,

상기 돌연변이는 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,

상기 조성물은 환자 뇌로의 전달을 위해 변경되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서,

약제학적으로 허용가능한 담체 및, 선택적으로, 투여를 촉진하거나 및/또는 흡수를 개선하는 것으로 공지된 다른 성분들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
잠재적인 치료 능력을 가진, 재조합 활성 단백질 C의 세포보호 변이체를 선택하는 방법으로서,

a) 상기 재조합 활성 단백질 C는 프로테아제 도메인을 가지며;

상기 방법은

상기 프로테아제 도메인의 표면 고리에서 상기 재조합 활성 단백질 C를 돌연변이시켜 활성 단백질 C 변이체를 제조하는 단계; 상기 활성 단백질 C 변이체의 항응고 활성을 측정하는 단계; 상기 활성 단백질 C 변이체의 항-세포사멸 활성을 측정하는 단계; 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비를 계산하는 단계; 및, 상기 비가 1.0 보다 클 경우 상기 활성 단백질 C 변이체가 잠재적인 치료 능력을 가진 것으로 확인하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 돌연변이는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는

b) 상기 방법은

(i) 단백질 C의 변이체 또는 활성 단백질 C의 변이체인 후보 약제(candidate agent) 라이브러리를 제공하는 단계로서, 상기 단백질 C 또는 활성 단백질 C는 프로테아제 도메인을 가지며, 상기 변이체는 상기 프로테아제 도메인의 표면 고리에 있는 한 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 단백질 C 변이체는 활성 단백질 C 변이체로 전환될 수 있는 단계;

(ii) 단백질 C 변이체인 상기 후보 약제를 활성 단백질 C 변이체로 전환하는 단계;

(iii) 하나 이상의 스트레스 받거나 또는 손상된 세포를 일정량의 후보 약제의 존재하에 세포사멸 유발자에 노출시킴으로써, 상기 (i) 또는 (ii) 단계의 상기 활성 단백질 C 변이체의 항-세포사멸 활성을 측정하는 단계;

(iv) 희석 프로트롬빈 시간 응고 분석법을 실시함으로써, 상기 (iii)단계에서 분석된 상기 후보 약제의 항응고 활성을 측정하는 단계;

(v) 상기 (iii) 단계에서 측정된 항-세포사멸 활성 대 상기 (iv) 단계에서의 항응고 활성의 비를 계산하는 단계; 및

(vi) 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비가 1.0 보다 큰 후보 약제를 선택하는 단계를 포함하고, 상기 후보 약제는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 활성 단백질 C의 변이체인 것인 방법.
잠재적인 치료 능력을 가진, 재조합 단백질 C의 세포보호 변이체를 선택하는 방법으로서, 상기 단백질 C는 프로테아제 도메인을 가지며;

상기 방법은 상기 프로테아제 도메인의 표면 고리에서 상기 재조합 단백질 C를 돌연변이시켜 단백질 C 변이체를 제조하는 단계; 상기 단백질 C 변이체를 활성 단백질 C 변이체로 전환하는 단계; 상기 활성 단백질 C 변이체의 항응고 활성을 측정하는 단계; 상기 활성 단백질 C 변이체의 항-세포사멸 활성을 측정하는 단계; 항-세포사멸 활성 대 항응고 활성의 비를 계산하는 단계; 및 상기 비가 1.0 보다 클 경우 상기 단백질 C 변이체가 잠재적인 치료 능력을 가진 것으로 확인하는 단계를 포함하고,

상기 변이체는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,

상기 비는 2 보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,

상기 비는 4 보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,

상기 비는 8 보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 또는 제25항의 방법에 의해 선택된 재조합 활성 단백질 C 또는 재조합 단백질 C의 변이체를 포함하는, 세포사멸에 의해 야기된 세포 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약제.
재조합 활성 단백질 C의 하나 이상의 변이체를 포함하는, 세포 스트레스 또는 손상의 치료를 위한 조성물로서, 하나 이상의 스트레스 또는 손상은 환자의 한 종류 이상의 세포에서 개선되고, 상기 하나 이상의 변이체는 야생형 활성 단백질 C에 대해 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이 및 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 것인 조성물.
제30항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환하고 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제30항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 아르기닌 229와 230을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제30항에 있어서,

상기 하나 이상의 돌연변이는 리신 191, 192, 및 193을 알라닌으로 치환한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 세포 스트레스 또는 손상은 감소된 혈액관류(hemoperfusion), 저산소증, 허혈, 허혈성 뇌졸중, 방사선, 산화제, 재관류 손상 및 외상으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 상태에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제10항, 제17항 내지 제18항, 또는 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 손상에 대한 보호가 필요한 세포는 환자의 뇌, 심장, 신장, 간 또는 상피조직 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
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