JP7096845B2 - メラノサイトの活動亢進および／または過剰メラニンに関連する障害の治療のためのボツリヌス神経毒素 - Google Patents

メラノサイトの活動亢進および／または過剰メラニンに関連する障害の治療のためのボツリヌス神経毒素 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2017年５月31日に出願された米国仮出願第62/512,792号の利益を主張し、本明細書にその全体で援用されている。
技術分野
本明細書に記載の主題は、ボツリヌス神経毒、特にボツリヌス神経毒BoNT/DCモザイクなどのクロストリジウム毒素を含む組成物を投与することにより、メラニン関連症状の皮膚、特に色素沈着過剰などのメラニン過剰関連症状を治療する方法に関する。
背景
メラノサイトは、皮膚に存在する特殊な細胞であり、色素メラニンを生成し、別のタイプの皮膚細胞である周囲のケラチノサイトに分布させる。皮膚、毛髪および目の虹彩の色は、主にメラニンの有無によって決まる。メラニン産生が含まれるメラノサイトの代謝(つまり、毛髪の色と肌の色)は、ホルモンとUV曝露に応答して主にケラチノサイト(keratinonyte)によって放出されるさまざまな物質によって少なくとも部分的に調節される。
メラニン関連症状とも呼ばれる皮膚および毛髪の色素障害には、肝斑、皮膚損傷後の色素損失、白斑、そばかす、脂肪腫(母斑)および異型ほくろ(異形成母斑)を含めるほくろ、皮膚線維腫、類皮嚢胞、ケロイド、角化棘細胞腫、化膿性肉芽腫、脂漏性角化症、日光角化症、スキンタグ、メラノーマならびに日光黒子が含まれる。
シンタキシン-3(Stx-3)、シナプトソーム関連タンパク質23(SNAP-23)、および小胞関連膜タンパク質(VAMP、シナプトブレビンとも呼ばれる)が含まれる、SNAP(可溶性NSF付着タンパク質)受容体(SNARE)タンパク質などの特定のタンパク質は、メラノサイトのメラニン含有量に影響を与える可能性がある(Yatsu et al., J Invest Dermatol, 133(9), 2237-2246, 2013)。VAMP-2などの小胞関連膜タンパク質の切断、結合、および/または隔離は、メラノサイト細胞内小胞輸送を破壊し、メラノソーム(小胞を含む特定の色素)のメラニン形成(色素形成)を阻止しかつ/または小胞、たとえばメラニンを含むメラノソームの放出または移動を阻止する可能性がある。VAMP-2は、メラノサイトにおいて発現され、おそらくメラノソームとSNAP-23に関連する(Scott and Zhao, J Invest Dermatol, 116(2), 296-304, 2001; Van Den Bossche et al., Traffic, 7(7), 769-778 2006; Wade et al., J. Biol. Chem., 276(23), 19820-19827, 2001)。
色素沈着過剰は、黒ずんだ斑点のある斑状の異常な皮膚色であり、一般に「年齢斑」または「老人性色素斑」として知られる肝斑および日光黒子が含まれるいくつかの皮膚障害に関連している。色素沈着過剰の治療には、(1)4％ヒドロキノン(HQ)、Tri-Luma(ヒドロキノン、トレチノイン、フルオシノロンの組合せ)、レチノイド(例えばトレニノイド、アダパレン、トラザロテン)などの処方局所漂白剤；(2)化学剥脱やレーザー治療などの色素を除去または破壊する医療処置；および(3)2％HQやさまざまなハーブエキスなどの市販薬や化粧品が含まれる。現在の色素沈着過剰の治療は、皮膚刺激や炎症が含まれるいくつかの副作用があり、これは、炎症後色素沈着過剰を引き起こす可能性があるため、追加の色素沈着過剰のドライバーである。
メラニン関連症状、より詳細にはメラニン過剰関連症状を治療するための薬剤および方法が必要とされている。本発明の組成物および方法は、この必要性を満たすことを目指している。
簡単な概要
一態様において、本開示内容は、メラニン関連症状を治療する方法であって、BoNT/DCモザイクなどのボツリヌス神経毒素(BoNT)モザイクを準備または投与することを含む、上記方法を提供する。
一実施態様において、上記メラニン関連症状は、メラノサイトの活動亢進および/または過剰なメラニンに関連する障害または疾患である。一実施態様において、上記メラサイトの活動亢進は、色素沈着過剰および/または異常色素沈着をもたらす。他の実施態様において、上記症状は、例えば、肝斑、単数の日光黒子(複数の日光黒子)、母斑、またはメラノーマである。
いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス神経毒モザイクを含む液体または固体の医薬組成物が提供される。一実施態様において、上記ボツリヌス神経毒モザイクはBoNT/DCモザイクである。
一実施態様において、上記医薬組成物は液体組成物であり、注射により投与される。実施態様において、上記注射は筋肉内、皮内、真皮内または皮下である。別の実施態様において、上記医薬組成物は液体組成物または固体組成物であり、経皮的にまたは局所的に投与される。
一態様において、VAMP-2を切断する方法であって、ボツリヌス神経毒(BoNT)を準備または投与することを含む、上記方法が提供される。いくつかの実施態様において、ボツリヌス神経毒はBoNTモザイクである。一実施態様において、上記BoNTはBoNT/DCモザイクである。
緩衝液(未処理または負の対照)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/DC、または結合ドメイン部分を欠くBoNT/Dの変異体、LHn/Dで処理した後のマウスメラノサイト細胞におけるグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH；上部バンド、ローディングコントロール)および小胞結合膜タンパク質(VAMP-2、下部バンド)のウェスタンブロットを示す。 緩衝液(未処理または負の対照)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/DC、または結合ドメイン部分を欠くBoNT/Dの変異体、LHn/Dで処理した後のマウスメラノサイト細胞における、GAPDHの量に対して正規化されたVAMP-2の量を示すグラフであり、図１Ａに示されるウエスタンブロットバンド強度に基づいて、未処理対照のパーセントとして示されている。 BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、またはBoNT/DCで処理した後のマウスメラノサイト細胞のメラニンレベルを5×105細胞あたりのμg/mLで示す棒グラフである。 緩衝液(未処理または負の対照)、BoNT/A、BoNT/D、またはBoNT/DCで処理した後のマウスメラノサイト細胞のメラニン含有量を106細胞あたりのμg/mLで示す棒グラフである。 2％コウジ酸による局所治療(正の対照)、または5nMおよび10nMのBoNT/DC、5nMおよび10nMのLHn/D、またはBoNT/A(10nM)による治療の14日間後のヒト皮膚等価モデルにおける組織サンプルあたりのμgでのメラニン含有量を示す棒グラフである。 一日置きに、0.3％コウジ酸(正の対照、横縞模様のバー)または0日目に天然BoNT/DC(破線塗りつぶしのバー)または緩衝液(未処理または負の対照、白抜きのバー)の真皮内注射により適用した、いずれかの局所治療の6日後のヒト皮膚外植片の、マッソンフォンタナ染色を使用した組織学に基づいて、メラニン陽性に染色される基底層面積のパーセントとして測定される、基底層におけるメラニン量を示す棒グラフであり、これらのサンプルは紫外線にさらされなかったかあるいは紫外線にさらされた場合である。
詳細な説明
I．定義
本明細書で使用される「約」または「およそ」は、値がどのように測定または決定されるかに一部依存する(すなわち、測定システムの制限)、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当該技術の実行ごとに、１標準偏差内または１標準偏差を超えることを意味し得る。出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容誤差範囲内を意味する。
「投与」または「投与する」は、医薬組成物を被検者、あるいは医薬組成物を投与されている被検者に与える(すなわち投与する)段階を意味する。本明細書に開示される医薬組成物は、さまざまな方法により局所投与することができる。例えば、筋肉内、真皮内、皮下投与、くも膜下腔内投与、腹腔内投与、局所(経皮)、点滴、および埋め込み(例えば、ポリマー製インプラントまたはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の埋め込み)はすべて適切な投与経路であり得る。
「軽減すること」は、徴候または状態または障害の発生の減少を意味する。従って、軽減することには、ある程度の低減、大幅な低減、ほぼ全体的な低減、および全体的な低減が含まれる。
「ボツリヌス毒素」および「ボツリヌス神経毒」(BoNT)は、交換可能に使用される。これらは、クロストリジウム・ボツリヌス(Clostridium botulinum)によって産生される神経毒、および非クロストリジウム種によって組換え的に作られたボツリヌス毒素(またはその軽鎖もしくは重鎖)を意味する。本明細書で使用される「ボツリヌス毒素」という語句は、ボツリヌス毒素血清型A、B、C、D、E、F、GおよびX(Stenmark、未発表データ)、およびこれらのサブタイプおよびそのサブタイプの他のタイプ、およびDC、CDを含めるモザイク(Moriishi et al. 1996, Webb et al., 2007, Nakamura et al. 2010, Peng et al. 2012, Rossetto et al. 2014, Berntsson et al. 2013)およびFA(Hとしても知られる、Yao et al. 2017)、またはいずれの場合も前述のいずかの再設計されたタンパク質、アナログ、誘導体、ホモログ、パーツ、サブパーツ、変異体、または変形体を包含する。本明細書で使用される「ボツリヌス毒素」は、「改変ボツリヌス毒素」も包含する。本明細書で使用されるさらなる「ボツリヌス毒素」は、ボツリヌス毒素複合体(例えば、300、550(BoNT/DC、Moura et al. 2011)、600kDaおよび900kDa複合体、ならびに複雑なタンパク質とは無関係であるボツリヌス毒素の神経毒性成分(150kDa)も包含する。ボツリヌス毒素血清型A、B、C、D、E、F、G、およびDCなどのモザイクは、それぞれ、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、およびBoNT/DCとして表記することができる。
「クロストリジウム毒素」は、クロストリジウム毒素が細胞を中毒にし、クロストリジウム毒素の低親和性または高親和性クロストリジウム毒素受容体への結合、毒素/受容体複合体の内部移行、クロストリジウム毒素軽鎖の細胞質への移行およびクロストリジウム毒素基質の酵素的修飾を包含する、細胞全体のメカニズムを実行できるクロストリジウム毒素株によって産生される任意の毒素を指す。クロストリジウム毒素の非限定的な例には、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/DCモザイク、テタヌス(Tetanus)毒素(TeNT)、バラチイ(Baratii)毒素(BaNT)、およびブチリカム(Butyricum)毒素(BuNT)のようなボツリヌス毒素が含まれる。神経毒ではないB0NT/C2細胞毒素とB0NT/C3細胞毒素は、「クロストリジウム毒素」という用語から除外される。本明細書に開示されるクロストリジウム毒素には、限定されないが、例えばクロストリジウム毒素アイソフォームおよびクロストリジウム毒素サブタイプなどの天然に存在するクロストリジウム毒素変異体；例えば保存的クロストリジウム毒素変異体、非保存的クロストリジウム毒素変異体、クロストリジウム毒素キメラ変異体およびその活性クロストリジウム毒素断片、またはそれらの任意の組合せなどの天然に存在しないクロストリジウム毒素変異体が含まれる。本明細書に開示されるクロストリジウム毒素には、クロストリジウム毒素複合体、および複合タンパク質とは無関係のクロストリジウム毒素の神経毒性成分も含まれる。本明細書で使用される「クロストリジウム毒素複合体」という用語は、クロストリジウム毒素と非毒素関連タンパク質(NAP)を含む複合体、例えば、ボツリヌス毒素複合体、テタヌス毒素複合体、バラチイ毒素複合体、およびブチリカム毒素複合体を指す。クロストリジウム毒素複合体の非限定的な例としては、例えば、900kDa BoNT/A複合体、500kDa BoNT/A複合体、300kDa BoNT/A複合体、500kDa BoNT/B複合体、500kDa BoNT/C1複合体、500kDa BoNT/D複合体、300kDa BoNT/D複合体、300kDa BoNT/E複合体、300kDa BoNT/F複合体、550kDa BoNT/DC複合体、および300kDa BoNT/DC複合体などのクロストリジウム・ボツリヌスによって産生されたものが挙げられる。
「クロストリジウム毒素活性成分」は、被検者または患者への投与時または投与後に効果を発揮するクロストリジウム毒素の任意の部分を含む分子を指す。本明細書で使用される「クロストリジウム毒素活性成分」という用語は、約150kDaのクロストリジウム毒素および他のタンパク質と総称非毒素関連タンパク質(NAP)を含む複合クロストリジウム毒素複合体、単独で約150kDaのクロストリジウム毒素、または例えば、再標的クロストリジウム毒素などの改変クロストリジウム毒素を包含する。
生物活性成分に適用される「有効量」は、被検者に所望の変化をもたらすのに一般に充分な成分の量を意味する。例えば、その所望の効果がメラニン関連障害に関連する徴候の低減である場合、その成分の有効量は、その徴候の少なくとも実質的な低減を引き起こし、有意な毒性をもたらさない量である。
「有効量」は、クロストリジウム毒素組成物に添加される賦形剤または特定の賦形剤の組合せの量に関して使用される場合、望ましい安定性および/または活性を有するクロストリジウム毒素活性成分の組成を達成するために必要な各賦形剤の量を指す。この実施態様の他の態様において、クロストリジウム毒素活性成分の治療的有効濃度は、例えばメラニン関連症状などの栄養に関連する徴候を、例えば最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、最大で70％、最大で80％、最大で90％または最大100％低減する。
「重鎖」または「HC」は、ボツリヌス神経毒の重鎖を意味する。それは約100kDaの分子量を有し、H鎖とも呼ばれ得る。
HCは、重鎖のカルボキシル末端セグメント、または無傷の重鎖中のその断片に対応する部分にほぼ等しいボツリヌス神経毒の重鎖に由来する断片(約50kDa)を意味する。例えばメラノサイトなどの標的細胞への高親和性のシナプス前結合に関与する天然または野生型のボツリヌス神経毒の一部を含むと考えられている。
HNは、重鎖のアミノ末端セグメント、または重鎖の無傷のその断片に対応する部分にほぼ等しいボツリヌス神経毒の重鎖に由来する断片(約50kDa)を意味する。それは、細胞内エンドソーム膜を横切る軽鎖の転座に関与する天然または野生型のボツリヌス神経毒の部分を含むと考えられている。
「軽鎖」または「LC」は、クロストリジウム神経毒の軽鎖を意味する。それは、約50kDaの分子量を有し、ボツリヌス神経毒のL鎖、Lまたはタンパク質分解ドメイン(アミノ酸配列)と呼ばれることがある。
LC-HN/LHNは、上記軽鎖および転座ドメインから構成されるBoNTの断片(約100kDa)を意味する。同様に、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、モザイクDCのLC-HNは、それぞれLC-HN/A、LC-HN/B、LC-HN/C、LC-HN/D、LC-HN/E、LC-HN/F、LC-HN/G、およびLC-HN/DCと呼ばれることがある。
LHNまたはL-HNは、上記L鎖を含むクロストリジウム神経毒由来の断片、または上記HNドメインに結合したその機能的断片を意味する。それは、上記HCドメインを除去または修飾するために、タンパク質分解により無傷のクロストリジウム神経毒から得ることができる。同様に、BONT/A、BONT/B、BONT/C、BONT/D、BONT/E、BONT/F、BONT/G、モザイクDCのLHNは、それぞれLHN/A、LHN/B、LHN/C、LHN/D、LHN/E、LHN/F、LHN/G、LHN/DCと呼ばれることがある。
「局所投与」は、動物の体の上または体内の部位にまたは部位の近傍へ医薬品の直接投与を意味し、この部位では、例えば筋肉内注射、皮内注射、皮下注射または局所投与などを介してその医薬品の生物学的効果が望まれる。局所投与には、静脈内投与または経口投与などの全身投与経路は含まれない。局所投与は、薬剤を患者の皮膚に適用する局所投与の一種である。
「改変ボツリヌス毒素」は、天然ボツリヌス毒素と比較して、そのアミノ酸の少なくとも1つが欠失、修飾、または置換されているボツリヌス毒素を意味する。上記改変ボツリヌス毒素は、組換えにより産生された神経毒、または組換えにより産生された神経毒の誘導体または断片であり得る。改変ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素受容体に結合する能力、またはニューロンからの神経伝達物質の放出を阻害する能力など、天然ボツリヌス毒素の少なくとも１つの生物学的活性を保持する。改変ボツリヌス毒素の一例は、１つのボツリヌス毒素血清型(血清型Aなど)の軽鎖と、異なるボツリヌス毒素血清型(血清型Bなど)の重鎖を持つボツリヌス毒素である。改変ボツリヌス毒素の別の例は、サブスタンスPなどの神経伝達物質に結合したボツリヌス毒素である。
「突然変異」は、天然に存在するタンパク質または核酸配列の構造的修飾を意味する。例えば、核酸突然変異の場合、突然変異は、DNA配列内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換であり得る。タンパク質配列変異の場合、その変異はタンパク質配列中の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加または置換であり得る。例えば、タンパク質配列を含む特定のアミノ酸は、別のアミノ酸、例えば、アミノ酸アラニン、アスパラギン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または他の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸、または化学修飾されたアミノ酸が含まれる群から選択されたアミノ酸で置換することができる。タンパク質配列への突然変異は、転写されたときに、また、得られたmRNAが変換されたときに、突然変異タンパク質配列を生成するDNA配列への突然変異の結果であり得る。タンパク質配列への突然変異は、所望の突然変異を含むペプチド配列を所望のタンパク質配列に融合することにより作成することもできる。
「患者」は、医学的、美容的または獣医学的ケアを受けるヒトまたは非ヒト被検者を意味する。従って、本明細書に開示される組成物は、例えば哺乳動物などの任意の動物の治療に使用することができる。
「医薬組成物」は、例えば、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素活性成分などの活性医薬成分と、例えば、安定剤または賦形剤などの少なくとも1つの追加成分と、を含む組成物を意味する。従って、医薬組成物は、ヒト患者などの被検者への診断的、治療的、または美容的投与に適した製剤である。上記医薬組成物は、例えば、凍結乾燥または真空乾燥状態、その凍結乾燥または真空乾燥医薬組成物の再構成後に形成される溶液、または再構成を必要としない溶液または固体であり得る。
「薬理学的に許容される賦形剤」は「薬理学的賦形剤」または「賦形剤」と同義であり、哺乳動物に投与された場合に実質的に長期または永続的な有害作用を持たず、例えば安定化剤、増量剤、凍結防止剤、凍結保護剤、添加剤、ビヒクル、担体、希釈剤、または補助剤などの化合物を包含する任意の賦形剤を指す。賦形剤は、一般に、活性成分と混合されるか、その活性成分を希釈または封入することができ、固体、半固体、または液体の物質であり得る。クロストリジウム毒素活性成分を含む医薬組成物は、活性成分の医薬的に許容される組成物への加工を促進する１種以上の医薬的に許容される賦形剤を含めることができることも想定される。上記クロストリジウム毒素活性成分と不適合でない限り、薬理学的に許容される賦形剤は、医薬的に許容される組成物におけるその使用が考慮される。薬理学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、医薬剤形および薬剤送達システム(Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999)；レミントン：薬局の科学と実践(Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000)；グッドマン＆ギルマンの治療の薬理学的基礎(Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001)；および医薬品添加物ハンドブック(Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)に見出すことができ、それぞれ本明細書に全体で援用されている。
医薬組成物の構成成分は、単一の組成物(すなわち、必要な再構成液を除くすべての構成成分は、上記医薬組成物の初期配合時に存在する)または２成分系、例えば、上記医薬組成物の最初の配合には存在しない成分を含むことができる再構成ビヒクルで再構成された真空乾燥組成物として含めることができる。２成分系は、その２成分系の最初の成分との長期保存に充分に適合しない成分を組込むことができることが含まれる、いくつかの利点を与えることができる。例えば、再構成ビヒクルには、使用期間、たとえば１週間の冷蔵保管期間に微生物の増殖に対して充分な保護を与える防腐剤が含まれてもよいが、その間に上記毒素を劣化する可能性がある２年間の冷凍庫保管期間中は存在させない。長期間ボツリヌス毒素または他の成分と適合しない可能性がある他の成分は、この方法で組込むことができる；つまり、およその使用時に２番目のビヒクル(例えば、上記再構成ビヒクル)に追加することができる。医薬組成物は、ベンジルアルコール、安息香酸、フェノール、パラベン、ソルビン酸などの保存剤も含めることができる。医薬組成物は、例えば、界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；抗酸化剤；安定剤；および医薬的に許容されるポリマー材料または疎水性材料、および当該技術において公知であり、例えばGenaro編、1985、Remington's Pharmaceutical Sciences、マック出版社、ペンシルベニア州イーストンに記載され、本明細書に援用されている他の成分などの賦形剤を含めることができる。
「等張化剤」は、等張性を与えるために製剤に含まれる低分子量賦形剤を意味する。トレハロースまたはスクロースなどの二糖類、ソルビトールまたはマンニトールなどの多価アルコール、グルコースなどの単糖類、および塩化ナトリウムなどの塩は、等張化剤として役立ち得る。
「多糖類」は、二糖よりも多い分子モノマーのポリマーを意味する。そのモノマーは同一でも異なっていてもよい。
「安定剤(stabilizing agent)」、「安定剤(stabilization agent)」または「安定剤(stabilizer)」は、上記医薬組成物の効力が安定化されていない組成物と比べて増加するようにクロストリジウム毒素活性成分を安定化するように作用する物質を意味する。
「安定剤」は、賦形剤を含めることができ、タンパク質および非タンパク質分子を含めることができる。
「治療製剤」は、例えばメラニン関連症状に関連する障害または疾患などの障害または疾患を治療し、それによって軽減するために使用できる製剤を意味する。
「局所投与」は、全身投与を除外する。言い換えれば、従来の治療的経皮的方法とは異なり、ボツリヌス毒素の局所投与は、患者の循環系への有意な量の神経毒の通過をもたらさない。
「治療する」は、例えば過剰なメラニンなどの状態または障害の少なくとも１つの症状を一時的または永続的に軽減(または排除)することを意味する。
「VAMP」は、シナプトブレビンまたは小胞関連膜タンパク質を意味し、VAMP-1、VAMP-2、およびVAMP-3が含まれる。
「変異体」は、野生型ボツリヌス毒素に関係がある少なくとも１つのアミノ酸の置換、修飾、付加または欠失により改変された野生型ボツリヌス毒素血清型A、B、C、D、E、F G、またはモザイクDCなどのクロストリジウム神経毒を意味し、これは、標的細胞によって認識され、標的細胞によって内在化され、標的細胞においてSNARE(可溶性NSF付着タンパク質受容体)タンパク質を触媒的に切断する。変異体神経毒成分の一例は、置換、修飾、欠失および/または付加された１つ以上のアミノ酸を有するボツリヌス毒素の変異体軽鎖を含むことができる。この変異体軽鎖は、例えば神経伝達物質小胞の放出などのエキソサイトーシスを防止するのと同じかより良い能力を持っている可能性がある。さらに、変異体の生物学的効果は、親化学物質と比較して低下する場合がある。例えば、アミノ酸配列が除去されたボツリヌス毒素A型の変異体軽鎖は、親(または天然)ボツリヌス毒素A型軽鎖よりも生物学的持続性が短い可能性がある。
II．治療方法
一態様において、患者におけるメラニン関連症状を治療する方法が提供される。上記方法は、メラニン含有量を低減するのに有効な用量または量のボツリヌス神経毒(BoNT)などのクロストリジウム毒素をその患者に投与することを含む。いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス神経毒はBoNTモザイク、BoNT/DCである。他の関連する態様において、色素沈着過剰などのメラニン過剰の症状を治療する方法は、BoNTを含む組成物を投与することにより示される。本明細書で実証されるように、実施態様において、上記組成物は、BoNTモザイク、BoNT/DCを含む。
実施例１に詳述される最初の研究では、マウスメラノサイト細胞を同量の天然BoNT/A、天然BoNT/B、組換えBoNT/D、天然BoNT/DC、または組換えLHn/D－結合ドメイン部分を欠くBoNT/Dの変異体で処理した。これらの毒素で処理した後、VAMP-2とGAPDHがウェスタンブロットによって検出され、メラニン含有量を測定した。結果を図１Ａ～１Ｂに示す。
図１Ａは、未処理(負の対照)または毒素処理マウスメラノサイト細胞におけるGAPDH(上部バンド、ローディングコントロール)およびVAMP-2(下部バンド)タンパク質のウェスタンブロットを示す。図１Ｂは、GAPDHの量に対して正規化されたVAMP-2の量を示す棒グラフであり、未処理の対照のパーセントとして示されている(図１Ａに示されるウェスタンブロットのバンドの強度に基づく)。BoNT/A、BoNT/B、BoNT/DまたはLHn/Dではなく、BoNT/DCでメラノサイト細胞を処理すると、VAMP-2の90％を超える減少がもたらされた。従って、一態様において、ある量のBoNT/DCを被検者に投与することにより皮膚のメラノサイト細胞におけるVAMP-2を切断する方法が企図される。皮膚のメラノサイトにおける無傷のVAMP-2の減少は、メラニン含有量の減少をもたらす。別の態様において、皮膚または細胞内のVAMP-2レベルを低下させ、それにより皮膚および/またはメラノサイトにおけるメラニン含有量が減少するある量のBoNT/DCを被検者に投与することにより、皮膚のメラノサイト細胞のメラニン含有量を減少させる方法が企図される。
また、実施例１に詳述される研究において、マウスメラノサイト細胞をBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、またはBoNT/DCで処理した。20時間の処理後、メラニン含有量を測定し、結果を図２Ａに示す。図２Ｂに示された結果について、マウスメラノサイト細胞を、緩衝液(負の対照)、BoNT/A、BoNT/DまたはBoNT/DCのいずれかで処理した。24時間処理した後、その細胞内のメラニン含有量を測定した。図２Ｂの棒グラフは、緩衝液、BoNT/A、BoNT/D、またはBoNT/DCのいずれかで処理した後のマウスメラノサイト細胞のメラニンレベルを106細胞あたりのμg/mLで示している。図２Ａおよび２Ｂのデータは、メラノサイト細胞のBoNT/DCでの処理により、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、またはBoNT/Dではなく、メラニンレベルが低下することを示している。BoNT/DCによる治療は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/Dなどの別のBoNT血清型による治療と比較して、または未処理のメラノサイトと比較して、メラニン含量の少なくとも約50％の減少を達成した。従って、メラニン関連症状を治療する方法が企図され、BoNT/DCは、未処理のメラニン細胞と比較して、またはBoNT/A、BoNT/B、BoNT/CまたはBoNT/Dで処理したメラニン細胞と比較してメラノサイト中のメラニン含有量が少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％または70％の減少をもたらす量で投与される。
別の研究では、実施例２に記載されているように、ヒト表皮の多層高分化モデルを形成するために培養された正常なヒト由来表皮ケラチノサイトおよびメラノサイトに基づくヒト皮膚組織モデルを得た。この組織サンプルは、1、4、8、12日目に天然BoNT/DCまたはLHn/Dによる２つの濃度(5nMまたは10nM)でまたは10nMの天然BoNT/Aで処理し、5、8、11、15日目にメラニン含有量を評価した。対照として、水(未処理または負の対照)または２％コウジ酸(正の対照)を局所適用したのと並行して、いくつかの組織サンプルをテストした。このモデル組織のメラニン含有量が15日目に測定された代表的なデータを図３に示す。BoNT/DCによる治療は、BoNT/Aによる治療ではなく、メラニンレベルの大幅な低下をもたらした。このデータは、10nM BoNT/DCによる治療が、同じ濃度のBoNT/Aによる治療と比較して、メラニン含有量の約40％の減少を達成したことを示している。この研究では、治療後のモデル組織内の細胞の生存率をMTTアッセイ(MatTek Corp.、MTT-100)を使用して測定し、BoNT/DCによる治療が細胞生存率に影響を与えないことを確認した(データは示さず)。
別の研究が実施例３に記載されている。この研究では、ヒトの皮膚サンプルを、毎日のUV曝露の有無にかかわらず10日間保持した。BoNT/DCを0日目に真皮内に注射し、コウジ酸を1日おきに局所投与した。外植片を組織学で評価し、研究の６日目に一般的な形態(マッソントリクローム)およびメラニン含有量(マッソンフォンタナ)を評価した。BoNT/DC(2.5～10nM)のすべての用量は、組織学に基づいて忍容性が良好であった(データは示さず)。図４は、マッソンフォンタナ染色を使用した組織学に基づいて、メラニン陽性に染色された基底層面積のパーセントとして測定された、研究6日目の組織外植片中のメラニン含有量を示す。天然BoNT/DCで処理された組織外植片(破線で塗りつぶされたバー)およびUV曝露では、未処理の組織外植片(負の対照、白抜きのバー)と比較してメラニン含有量が50％減少した。天然BoNT/DCで処理された組織外植片(破線で塗りつぶされたバー)およびUV曝露なしでは、未処理の組織外植片(負の対照、白抜きのバー)と比較してメラニン含有量が30％減少した。見られるように、10nM BoNT/DCのホワイトニング効果は、0.3％コウジ酸(正の対照、横縞模様のバー)のホワイトニング効果に似ている。
これらの研究に基づいて、メラノサイトの活動亢進および/または過剰なメラニンに関連する障害および/または疾患を治療する方法が提供される。この方法は、それを必要とする患者に、(i)メラノサイトによって取り込まれ、(ii)VAMPを切断、結合、または隔離するBoNT剤の治療有効量を投与することを含む。いくつかの実施態様において、VAMPはVAMP-2である。いくつかの実施態様において、この薬剤はBoNT/DCモザイク毒素である。
「BoNT/DC」および「BoNT/DCモザイク」は、BoNT/Dの軽鎖および転座ドメインに相同な軽鎖およびBoNT/Cの結合ドメインに相同な結合ドメインを含む天然または組換え毒素を意図する。
BoNT/DC産生株の例としては、例えばBoNT/DC VPI 5995(ACCESSION：EF378947)；BoNT/DC D 4947(ACCESSION：AB037920)；BoNT/DC南アフリカ(ACCESSION：D38442)；BoNT/DC南アフリカ(ACCESSION：BAA07477)；BoNT/DC OFD04、OFD05、OFD08、OFD09、OFD12、OFD13、OFD16、およびOFD17(ACCESSION：AB461914、AB461915、AB461916、AB461917、AB461918、AB461919、AB461920、およびAB461921)；BoNT/DC Itl(Cedric Woudstra(ANSES、フランス)(ACCESSION：CM003329 JENO01000000)；BoNT/DC DC5(ACCESSION：NZ_JDRY01000170)が挙げられる。
いくつかの実施態様において、この毒素モザイクは非クロストリジウム源から産生される。非クロストリジウム毒素モザイクの例には、例えばワイセラ・オリゼ(Weissella oryzae)SG25Tが含まれる。
いくつかの実施態様において、上記方法は、それを必要としている患者に治療有効量のBoNT/DCモザイクを投与してVAMP-2を切断し、それによりメラニン関連症状を治療するために細胞内のメラニン含有量を低減または減少させることを含む。
実施例は好ましいBoNTを示しているが、当業者は、天然毒素と比較して、他のモザイクBoNTなどの他のBoNT、またはそのアミノ酸の少なくとも1つが欠失、修飾または置換された改変神経毒を使用してこれらの方法を達成できること、またはその改変ボツリヌス神経毒が、組換え産生ボツリヌス神経毒またはその誘導体もしくは断片であり得ることを理解するであろう。特定の実施態様において、この改変毒素は、対象の神経細胞または非神経細胞に対して変化した細胞標的化能力を有する。この変化した能力は、ボツリヌス毒素の天然に存在する標的化ドメインを、非ボツリヌス毒素標的細胞に存在する非ボツリヌス毒素受容体に対して選択的結合活性を示す標的化ドメインで置き換えることにより達成される。標的化ドメインへのこのような改変は、非ボツリヌス毒素標的細胞(再標的化)上に存在する非ボツリヌス毒素受容体(標的受容体)に選択的に結合することができる改変毒素をもたらす。非ボツリヌス毒素標的細胞に対する標的化活性を有する改変ボツリヌス毒素は、その非ボツリヌス毒素標的細胞上に存在する受容体に結合し、細胞質に移行し、標的細胞にそのタンパク質分解効果を発揮することができる。本質的に、酵素ドメインを含むボツリヌス毒素軽鎖は、適切な標的化ドメインを選択することにより、任意の所望の細胞に細胞内送達される。
本明細書に記載の方法に従って使用するためのボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素は、真空圧下で容器内に凍結乾燥した真空乾燥形態で、または安定した液体として保存することができる。凍結乾燥の前に、上記ボツリヌス毒素は、医薬的に許容される賦形剤、安定剤および/または担体、例えばアルブミンなどと組合せることができる。許容される賦形剤または安定剤には、アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質賦形剤、またはポロキサマー、糖類、ポリエチレングリコールなどを含める非タンパク質賦形剤が含まれる。アルブミンを含む実施態様において、このアルブミンは、例えば、ヒト血清アルブミンまたは組換えヒトアルブミンなどであり得る。この凍結乾燥された材料は、例えば生理食塩水、水などの適切な液体で再構成されて、患者に投与される上記ボツリヌス毒素を含有する溶液または組成物を作り出すことができる。
いくつかの実施態様において、上記クロストリジウム誘導体は、そのクロストリジウム誘導体を封入するポリマーマトリックスを含む制御放出システムで送られ、わずかな量のクロストリジウム誘導体が制御された様式で長期間にわたってポリマーマトリックスから放出される。制御放出神経毒システムは、例えば米国特許6,585,993号；同6,585,993号；同6,306,423号および同6,312,708号に開示されており、これらのそれぞれが本明細書に全体で援用されている。
標的組織への局所投与のために選択されるクロストリジウム毒素の量は、治療されているメラニン関連症状の重症度、選択された神経毒毒素の溶解特性、ならびに患者の年齢、性別、体重および健康などの基準に基づいて変動させることができる。例えば、影響を受ける皮膚の面積の範囲は、注入された神経毒の容量に比例すると考えられているが、メラニン関連症状抑制効果の量は、ほとんどの用量範囲で、投与されたクロストリジウム毒素の濃度に比例すると考えられている。適切な投与経路および投与量を決定する方法は、一般的に担当医によってケースバイケースベースで決定される。このような決定は、当業者にとって日常的なものである(例えば、McGraw Hill発行のAnthony Fauciら、第14版編集のHarrison's Principles of Internal Medicine(1998)を参照)。
いくつかの実施態様において、上記治療有効量は、患者のメラニン含有量を低減するのに充分な量である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は、約1pg(0.001ng)から約100μgまでの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は約0.01ngから約10μgまでの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は、約0.1ngから約１μg(1000ng)までの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は約１ngから約500ngまでの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は約10ngから約100ngまでの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は約0.1ngから約10ngまでの範囲である。いくつかの実施態様において、上記治療有効量は約0.01ngから約0.1ngまでの範囲である。
いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス毒素モザイクBoNT/DCは、その神経毒性成分および非毒素関連タンパク質(NAP)を含む毒素複合体として投与される。いくつかの実施態様において、上記BoNT/DCモザイクは、550kD複合体または300kD複合体として投与される。別の実施態様において、その神経毒性成分としてBoNT/DCが投与される。
BoNTモザイクを含めるボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素の治療有効量は、例えば、筋肉内、皮内、真皮内、皮下などの注射、点滴、静脈内、経皮および局所などによって投与される。さらに例えば、投与経路は、マイクロニードルまたはフラクショナルレーザーを使用した真皮注入であり得る。
いくつかの実施態様において、その投与方法により、この神経毒を選択された標的組織に局所投与することが可能である。投与方法には、上記のように、神経毒を含有する溶液または組成物の注射が含まれ、標的組織に神経毒を制御可能に放出する制御放出システムの埋め込みが含まれる。このような制御放出システムは、繰返し注射の必要性を減らす。組織内のボツリヌス毒素の生物学的活性の拡散は、用量の関数であると思われ、段階的に変化させることができる。Jankovic J., et al Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc.,(1994), page 150. 例えば、この神経毒はメラニン関連症状の生成に関与すると考えられる真皮細胞に主に影響するように神経毒を投与することができる。
本発明に従う、標的組織への注射または局所適用によるボツリヌス毒素の局所投与は、メラニン関連症状を軽減するための患者への医薬品の全身投与に対して優れた代替手段を与える。
メラノサイトの活動亢進および/または過剰なメラニンに関連する障害および/または疾患としては、例えば、メラニン形成亢進、肝斑に関連する色素沈着過剰、日光黒子(年齢斑)、皮膚の母斑、およびメラノーマが挙げられる。
いくつかの実施態様において、VAMPを切断する方法が提供される。上記方法は、毒素をVAMPと接触させることを含む。いくつかの実施態様において、上記毒素は、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素、その断片または変異体である。いくつかの実施態様において、上記毒素はボツリヌス毒素モザイク、その断片または変異体である。別の実施態様において、上記毒素は非クロストリジウム毒素モザイク、その断片または変異体である。いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス毒素はBoNT/D、その断片または変異体である。いくつかの実施態様において、上記方法は、BoNT/D軽鎖(LC/D)をVAMPと接触させることを含む。他の実施態様において、上記ボツリヌス毒素はBoNT/DCである。いくつかの実施態様において、VAMPはVAMP-2またはVAMP-3である。いくつかの実施態様において、上記方法は、BoNT/DCまたはBoNT/D軽鎖(LC/D)をVAMP-2またはVAMP-3と接触させることを含む。
いくつかの実施態様において、VAMP-2を切断する方法が提供される。上記方法は、ボツリヌス毒素、その断片または変異体をVAMP-2と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス毒素、その断片または変異体は、VAMP-2の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または実質的に完全な(例えば100％)切断を達成する量で準備される。いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス毒素、その断片または変異体は、BoNT/D、BoNT/D軽鎖(LC/D)、BoNT/B、またはBoNT/B軽鎖(LC/B)を含む。これらの実施態様において、VAMPは、組換えVAMPまたは溶解メラノサイトまたはインビボのメラノサイトのいずれかであり得る。
いくつかの実施態様において、VAMP-2を切断し、メラノサイトのメラニン含有量を低減する方法が提供される。上記方法は、メラノサイトをボツリヌス毒素、その断片または変異体と接触させることを含む。いくつかの実施態様において、上記ボツリヌス毒素はBoNT/DCモザイクである。いくつかの実施態様において、上記BoNT/DCモザイクは、メラノサイト細胞におけるVAMP-2の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または実質的に完全な(例えば、100％)切断を達成する量で準備される。
III．実施例
本開示内容の範囲を限定することを意図することなく、例示的な実施態様を下記の実施例により説明する。
実施例１
BoNT/DCによるメラノサイトの処理は、メラニン含有量を低減する
正常マウスメラノサイト(Melan-a)細胞を、6ウェルプレートの成長培地中で80％コンフルエンスまで成長させた。この細胞を、10nMの緩衝液(未処理または負の対照)、天然BoNT/A、天然BoNT/B、組換えBoNT/D、天然BoNT/DC、または組換えLHn/Dのいずれかの無血清培地で2回処理した。この細胞をこの毒素で24時間処理した後、無血清培地中で96時間インキュベートした。
96時間のインキュベーションの後、VAMP-2およびGADPHは、抗VAMP-2および抗GAPDHを使用したウェスタンブロットにより検出された。このメラニン含有量は、SOLVABLETM(PerkinElmer)メラニンアッセイを使用して測定した。結果を図１Ａ～１Ｂに示す。
同様の研究において、正常なマウスメラノサイト(Melan-a)細胞を6ウェルプレートの成長培地中で65～75％コンフルエンスまで成長させ、10nMの天然BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、またはBoNT/DCのいずれかの無血清培地中で20時間3回処理した後、無血清培地中でさらに96時間インキュベートした。このメラニン含有量は、SOLVABLETM(PerkinElmer)メラニンアッセイを使用して測定した。結果を図２Ａに示す。
同様の研究において、正常マウスメラノサイト(Melan-a)細胞を6ウェルプレートにおける成長培地中で80％コンフルエンスまで増殖させ、緩衝液(未処理または負の対照)、10nMの天然BoNT/A、組換えBoNT/D、または天然BoNT/DCの無血清培地中で24時間3回処理し、その後さらに96時間無血清培地中でインキュベートした。このメラニン含有量は、SOLVABLETM(PerkinElmer)メラニンアッセイを使用して測定した。結果を図２Ｂに示す。
実施例２
BoNT/DCはヒト皮膚等価モデルのメラニン含有量を低減する
ヒト皮膚組織モデル、MELANODERMTM(MatTek Corporation)を入手した。このモデルは、正常なヒト由来の表皮ケラチノサイトおよびメラノサイトに基づいて培養され、多層化された高度に分化したヒト表皮のモデルを形成した。この組織は、メラノサイトとケラチノサイトが1：10の比率で共存する３次元の共培養である。この組織サンプルを、緩衝液(未処理対照)、非特異的取込みの負の対照として5nMまたは10nMの天然BoNT/DC、天然BoNT/A、またはLHN/Dのいずれかで、1、4、8、12日目に培地中で基底送達により２回処理し、5、8、11、15日目にメラニン含有量を評価した。対照として、いくつかの組織サンプルを水(未処理対照)または２％コウジ酸(正の対照)と並行してテストし、局所適用した。
この組織サンプルを1、4、8、12日目に処理し、5、8、11、15日目にSOLVABLETM(PerkinElmer)メラニンアッセイを使用してメラニン含量について評価した。細胞生存率は、MTTアッセイ(MatTek Corp.、MTT-100)を使用して評価した。BoNT/DCによる処理は、MTTアッセイに基づく細胞生存率に影響しなかった(データは示さず)。15日目に評価されたメラニン含有量を図３に示す。
実施例３
BoNT/DCはヒト外植皮膚のメラニン含有量を低減する
45歳の白人女性からの腹部形成術からのヒト皮膚外植片を、毎日のUV曝露(0～8日目)の有無にかかわらず10日間保持した。BoNT/DCを0日目に真皮内注射(50μL)し、コウジ酸を1日おきに局所適用した。この外植片を組織学により評価して、研究の6日目に一般的な形態(マッソントリクローム)およびメラニン含有量(マッソンフォンタナ)を評価した。
BoNT/DCのすべての用量(2.5～10nM)は、組織学に基づいて充分に許容された(データは示さず)。この組織外植片中のメラニンのパーセンテージを図４に示し、ここでバーは次のような処理に対応する：天然BoNT/DCを真皮内注射してから6日後の組織外植片(点線の塗りつぶしのバー)、コウジ酸を局所適用した正の対照(横縞模様の塗りつぶしのバー)と未処理(対照、白抜きのバー)。10nM BoNT/DCのホワイトニング効果は、0.3％コウジ酸のホワイトニング効果に似ている。
実施例４
BoNT/DCによる日光黒子の治療
フォトタイプIIの皮膚を有する45歳の女性は、顔面に色素過剰の不均一な茶色の変色、様々なサイズの暗い斑点を示し、これは日光黒子と診断される。彼女はBoNT/DC毒素の製剤による表皮内治療を受けている。局所麻酔クリームを30分皮膚に塗布し、治療前に完全に除去する。
1.5μｇのBoNT/DC毒素の真空乾燥粉末を1mLの滅菌0.9％生理食塩水に溶解して、30-G針を使用して彼女の顔の皮膚の斑点の上真皮に注入する10nM溶液を構成する。この毒素を注入部位ごとに50μLを注入し、約1cm2離して注入する。この注入深さは約0.5mmである。合計約1.5μgがその患者の顔に注入される。
評価は、ベースラインおよび治療後3週間で実施される。色素沈着の定量的評価は、Canfield RBXイメージングテクノロジーを使用して行われる。ベースラインと比較して、治療後3週間で、彼女の顔の皮膚は、イメージングに基づいて斑点の顕著な照明を示している；かつ、彼女は、重度から軽度の全体的な色素沈着まで、より高い医師の総合評価と被検者満足度スコアを獲得している。
実施例５
BoNT/DCによる肝斑の治療
フォトタイプIIIの皮膚を有する37歳の妊娠女性は、色素沈着過剰の変色、頬、鼻、上唇、および額に茶色の不規則なむらのある斑点を示し、これらは肝斑と診断される。彼女はBoNT/DC毒素の製剤による表皮内治療を受けている。
4.5μgのBoNT/DC毒素の真空乾燥粉末を3mLの滅菌0.9％生理食塩水に溶解して、多針皮膚インジェクターシステムを使用して彼女の顔の皮膚の表皮に注入する10nM溶液を構成する。変色を示す領域に複数の注入部位でこの毒素溶液を注入し、この注入部位は注入点ごとに2μLで約2mm離れている。この注入深さは約0.1mmである。合計約4.5μgがこの患者の顔に注入される。
評価は、ベースラインおよび治療後3週間で実施される。色素沈着の定量的評価は、Canfield RBXイメージングテクノロジーを使用して行われる。ベースラインと比較して、治療後3週間で、彼女の顔の皮膚は、大幅に少ない変色を示している；かつ、彼女は、重度から軽度の全体的な色素沈着まで、より高い医師の総合評価と被検者満足度スコアを獲得している。
いくつかの例示的な態様および実施態様を上記で述べてきたが、当業者は、それらの特定の修正、置換、追加、および部分的組合せを認識するであろう。従って、下記の添付の特許請求の範囲および以降に導入される特許請求の範囲は、これらの真の精神および範囲内にあるようにすべてのこのような修正、置換、追加、および部分的組合せが含まれると解釈されることが意図される。

Claims (9)

  1. ボツリヌス神経毒素DC（BoNT/DC）を含む、メラノサイトの活動亢進または過剰なメラニン産生に関連する障害を治療するための組成物。
  2. ボツリヌス神経毒素DC（BoNT/DC）を含む、皮膚のメラニン過剰関連症状を治療するための組成物。
  3. ボツリヌス神経毒素DC（BoNT/DC）を含む、皮膚の色素沈着過剰を治療するための組成物。
  4. 前記障害または症状が、高メラニン形成、色素沈着過剰、肝斑、日光黒子、母斑、およびメラノーマからなる群から選択される、請求項１または請求項２記載の組成物。
  5. 液体組成物である、請求項１～４いずれか１項記載の組成物。
  6. 前記液体組成物が、等張化剤および界面活性剤のうちの１つ以上を含む、請求項５記載の組成物。
  7. 真皮注入により投与される、請求項１～５のいずれか１項記載の組成物。
  8. 固体組成物である、請求項１～４のいずれか１項記載の組成物。
  9. 局所投与用である、請求項１～５のいずれか１項または請求項８記載の組成物。
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