CN110891594A - 用于治疗与黑色素细胞过度活跃和/或过量黑色素相关病症的肉毒杆菌神经毒素 - Google Patents
用于治疗与黑色素细胞过度活跃和/或过量黑色素相关病症的肉毒杆菌神经毒素 Download PDFInfo
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Abstract
提供了用于治疗与过量黑色素相关的皮肤病如色素沉着过度的方法。所述方法包括给予包含BoNT/DC的组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月31日提交的第62/512,792号美国临时申请的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本说明书。
技术领域
本文所述的主题涉及通过给予包含梭菌毒素(例如肉毒杆菌神经毒素，尤其是肉毒杆菌神经毒素BoNT/DC嵌合体)的组合物，治疗黑色素相关的皮肤病，尤其是与过量黑色素相关的疾病(如色素沉着过度)的方法。
背景技术
黑色素细胞是存在于皮肤中的专门细胞，它形成色素黑色素并将其分配给周围的角质形成细胞——另一种类型的皮肤细胞。皮肤、毛发和眼睛虹膜的颜色主要取决于黑色素的存在与否。黑色素细胞新陈代谢，包括黑色素的产生(即毛发颜色和皮肤颜色)，至少部分受到主要是由角质形成细胞响应激素和紫外线(UV)照射而释放的各种物质的调节。
皮肤和毛发色素病症，也称为黑色素相关疾病，包括黄褐斑、皮肤损伤后色素损失、白癜风、雀斑、痣(包括脂肪痣(痣)和非典型痣(发育异常痣))、皮肤纤维瘤、皮样囊肿、瘢痕瘤、角化棘皮瘤、脓性肉芽肿、脂溢性角化病、光化性角化病、皮赘、黑色素瘤和晒斑。
某些蛋白质，例如SNAP(可溶性NSF附着蛋白)受体(SNARE)蛋白(包括突触融合蛋白-3(Stx-3)、突触体相关蛋白23(SNAP-23)和囊泡相关膜蛋白(VAMP，也称为突触泡蛋白))可能影响黑色素细胞中的黑色素含量(Yatsu等人，J Invest Dermatol，133(9)，2237-2246，2013)。囊泡相关膜蛋白(如VAMP-2)的裂解、结合和/或隔离(sequestering)可能会破坏黑色素细胞胞内囊泡运输和阻断黑色素体(专门含有色素的囊泡)内的黑色素合成(色素形成)和/或释放或转移囊泡，例如含有黑色素的黑色素体。VAMP-2在黑色素细胞中表达并且可能与黑色素体和SNAP-23有关(Scott和Zhao，J Invest Dermatol，116(2)，296-304，2001；Van Den Bossche等人，Traffic，7(7)，769-7782006；Wade等人，J.Biol.Chem.，276(23)，19820-19827，2001)。
色素沉着过度(有暗斑色斑的异常的不均匀肤色)与几种皮肤病有关，包括黄褐斑和晒斑，俗称“老年斑”或“肝斑”。色素沉着过度的治疗包括：(1)处方外用漂白剂，例如4％对苯二酚(HQ)、三璐玛(对苯二酚、维甲酸和氟轻松(fluocinolone)的组合)、维生素A酸(例如treninoid、阿达帕林(adapalene)和他佐罗汀(trazarotene))；(2)去除或破坏色素的医疗方法，例如化学剥落法和激光疗法；和(3)非处方药和化妆品，例如2％HQ和各种草药提取物。目前的色素沉着过度治疗有几个副作用，包括皮肤刺激和炎症，这是一种额外的色素沉着过度的驱动因素，因为它会导致炎症后色素沉着过度。
需要治疗黑色素相关疾病，尤其是过量黑色素相关疾病的试剂和方法。本发明的组合物和方法是为了满足这一需要。
发明内容
在一方面，本公开提供了治疗黑色素相关疾病的方法，所述方法包括提供或给药肉毒杆菌神经毒素(BoNT)嵌合体，例如BoNT/DC嵌合体。
在一个实施方案中，黑色素相关疾病是与黑色素细胞过度活跃和/或过量黑色素相关的病症或疾病。在一个实施方案中，黑色素细胞过度活跃导致色素沉着过度和/或异常的色素沉着。在其它实施方案中，所述疾病为例如黄褐斑、晒斑(solar lentigo)(晒斑(solar lentigines))、痣或黑色素瘤。
在一些实施方案中，提供了包含肉毒杆菌神经毒素嵌合体的液体或固体药物组合物。在一个实施方案中，肉毒杆菌神经毒素嵌合体是BoNT/DC嵌合体。
在一个实施方案中，药物组合物是液体组合物，并通过注射给药。在实施方案中，注射是肌肉内、皮内(intracutaneous)、皮内(intradermally)或皮下注射。在另一个实施方案中，药物组合物是液体组合物或固体组合物，并且经皮给药或外用给药。
在一方面，提供了一种裂解VAMP-2的方法，该方法包含提供或给予肉毒杆菌神经毒素(BoNT)。在一些实施方案中，肉毒杆菌神经毒素是BoNT嵌合体。在一个实施方案中，BoNT是BoNT/DC嵌合体。
附图说明
图1A显示用缓冲液(未治疗或阴性对照)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/DC或缺少结合结构域部分的BoNT/D的变体LHn/D处理后的小鼠黑色素细胞中，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；上方条带，上样对照)和囊泡相关膜蛋白(VAMP-2，下方条带)的免疫印迹法；
图1B显示用缓冲液(未治疗或阴性对照)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/DC或缺少结合结构域部分的BoNT/D的变体LHn/D处理后的小鼠黑色素细胞中，基于图1A所示的免疫印迹法条带强度的VAMP-2的量，其归一化至GAPDH的量并且显示为未治疗对照的百分比；
图2A是显示用BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D或BoNT/DC处理后的小鼠黑色素细胞中黑色素水平(单位是μg/mL/5×105个细胞)的柱状图；
图2B是显示用缓冲液(未治疗或阴性对照)、BoNT/A、BoNT/D或BoNT/DC处理后的小鼠黑色素细胞中黑色素水平(μg/mL/5×106个细胞)的柱状图；
图3是显示在人体皮肤等效模型中，用2％曲酸(阳性对照)局部处理或用5nM和10nM的BoNT/DC、5nM和10nM的LHn/D或BoNT/A(10nM)处理14天后的黑色素含量(单位是μg/组织样本)的柱状图；和
图4的柱状图显示基于使用Masson's Fontana染色法的组织学，用0.3％曲酸每隔1天施用局部处理(阳性对照，水平条纹填充的柱)或在第0天皮内注射天然BoNT/DC(虚线填充的柱)或缓冲液(未处理或阴性对照，空白柱)6天后人皮肤外植体的基底层中黑色素含量，其测量为黑色素染色阳性的基底层面积百分比，其中样本不用紫外线照射或用紫外线照射。
具体实施方式
I.定义
本文所用的“约”或“大约”是指在本领域技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值(即测量系统的局限性)。例如，“约”可以指在本领域的每一个实践中标准偏差在1内或大于1。如果在本申请和权利要求中描述了特定值，除非另有说明，术语“约”是指在特定值的可接受的误差范围内。
“给予”或“给药”是指将药物组合物给予(即给药)受试者的步骤，或者受试者接受药物组合物的步骤。本文公开的药物组合物可以通过各种方法局部给药。例如，肌肉内、皮内、皮下给药、鞘内给药、腹膜内给药、局部(经皮)、滴注和植入(例如聚合植入物或微量渗透泵等缓释装置的植入)都可以是适当的给药途径。
“缓解”是指症状或病况或病症的发生减少。因此，缓解包括一些减少、显著减少、接近完全减少和完全减少。
“肉毒杆菌毒素”和“肉毒杆菌神经毒素”(BoNT)可交换使用。它们是指由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素，以及由非梭菌物种以重组方式产生的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。本文所用的短语“肉毒杆菌毒素”包含肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F、G和X(Stenmark，未发表的数据)及其亚型和任何其它类型的亚型和嵌合体(包括DC、CD)(Moriishi等人，1996；Webb等人，2007；Nakamura等人，2010；Peng等人，2012；Rosetto等人，2014；Berntsson等人，2013)和FA(也称为H，Yao等人，2017)或在每种情况下上述任何一种的任何重新改造的蛋白质、类似物、衍生物、同系物、部分、子部分、变体或变种(version)。本文所用的“肉毒杆菌毒素”还包含“经改造的肉毒杆菌毒素”。本文所用的“肉毒杆菌毒素”还包含肉毒杆菌毒素复合体(例如，300、550(BoNT/DC，Moura等人2011)、600和900kDa复合体，以及与复合蛋白无关的肉毒杆菌毒素的神经毒性成分(150kDa)。肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F、G和嵌合体(如DC)可分别记为BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和BoNT/DC。
“梭菌毒素”是指由梭菌毒素菌株产生的能够执行整体细胞机制而使细胞中毒的任何毒素，包括梭菌毒素与低亲和力或高亲和力的梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合体的内化、梭菌毒素轻链转移到细胞质和梭菌毒素底物的酶修饰。梭菌毒素的非限制性实例包括肉毒杆菌毒素，如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/DC嵌合体、破伤风毒素(TeNT)、巴氏毒素(Baratii toxin)(BaNT)和丁酸毒素(Butyricumtoxin)(BuNT)。BoNT/C2细胞毒素和BoNT/C3细胞毒素不属于神经毒素，被排除在术语“梭菌毒素”之外。本文公开的梭菌毒素包括但不限于，天然存在的梭菌毒素变体，例如，梭菌毒素同工型和梭菌毒素亚型；非天然存在的梭菌毒素变体，例如保守的梭菌毒素变体、非保守的梭菌毒素变体、梭菌毒素嵌合变体和其活性梭菌毒素片段，或其任何组合。本文公开的梭菌毒素还包括梭菌毒素复合体以及与复合蛋白无关的梭菌毒素的神经毒性成分。如本文所用，术语“梭菌毒素复合体”是指包含梭菌毒素和非毒素相关蛋白(NAP)的复合体，例如肉毒杆菌毒素复合体、破伤风毒素复合体、巴氏毒素复合体和丁酸毒素复合体。非限制性的梭菌毒素复合体的实例包括肉毒梭菌产生的那些，例如900kDa的BoNT/A复合体、500kDa的BoNT/A复合体、300kDa的BoNT/A复合体、500kDa的BoNT/B复合体、500kDa的BoNT/C1复合体、500kDa的BoNT/D复合体、300kDa的BoNT/D复合体、300kDa的BoNT/E复合体、300kDa的BoNT/F复合体、550kDa的BoNT/DC复合体和300kDa的BoNT/DC复合体。
“梭菌毒素活性成分”是指含有对受试者或患者给药时或给药后会产生影响的梭菌毒素的任何部分的分子。如本文所用，术语“梭菌毒素活性成分”包括梭菌毒素复合体，其包含约150kDa梭菌毒素和其他统称为非毒素相关蛋白(NAP)的蛋白质，单独的约150kDa的梭菌毒素或经改造的梭菌毒素(例如重定向的梭菌毒素)。
用于生物活性成分的“有效量”是指通常足以在受试者中产生期望的变化的成分的量。例如，当期望的效果是与黑色素相关疾病有关的症状减少时，成分的有效量是至少引起症状显著减少，并且不产生显著的毒性的量。
当“有效量”用于指添加到梭菌毒素组合物中的赋形剂或特定的赋形剂组合的量时，是指获得具有所需稳定性和/或活性的梭菌毒素活性成分的组合物所必需的每种赋形剂的量。在本实施方案的其他方面，治疗有效浓度的梭菌毒素活性成分将与疾病(例如黑色素相关疾病)相关的症状减少例如最多10％、最多20％、最多30％、最多40％、最多50％、最多60％、最多70％、最多80％、最多90％或最多100％。
“重链”或“HC”是指肉毒杆菌神经毒素的重链。其分子量约为100kDa，也可称为H链。
HC是指从肉毒杆菌神经毒素的重链衍生出的片段(约50kDa)，其大致相当于重链的羧基末端段，或与完整重链中该片段相对应的部分。它被认为含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素中参与高亲和力、突触前结合到靶细胞(例如黑色素细胞)的部分。
HN是指从肉毒杆菌神经毒素的重链衍生出的片段(约50kDa)，其大致相当于重链的氨基末端段，或与完整重链中该片段相对应的部分。它被认为含有天然或野生型肉毒杆菌神经毒素中参与轻链跨胞内内体膜的移位的部分。
“轻链”或“LC”是指梭菌神经毒素的轻链。其分子量约为50kDa，并且可称为L链、L或称为肉毒杆菌神经毒素的蛋白水解结构域(氨基酸序列)。
LC-HN/LHN是指由轻链和移位结构域组成的BoNT片段(约100kDa)。类似地，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、嵌合体DC的LC-HN可分别称为LC-HN/A、LC-HN/B、LC-HN/C、LC-HN/D、LC-HN/E、LC-HN/F、LC-HN/G和LC-HN/DC。
LHN或L-HN是指与HN结构域偶联的含有L链的梭菌神经毒素衍生片段，或其功能片段。它可通过蛋白质水解获自完整的梭菌神经毒素，从而去除或修饰HC结构域。类似地，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、嵌合体DC的LHN可分别称为LHN/A、LHN/B、LHN/C、LHN/D、LHN/E、LHN/F、LHN/G和LHN/DC。
“局部给药”是指在动物体上或动物体内的某一部位或附近直接给予药物，在该部位需要药物的生物学效应，例如通过肌肉内或皮内或皮下注射或外用。局部给药排除全身性给药途径，如静脉内或口服给药。外用是一种将药剂施加到患者的皮肤上的局部给药。
“经改造的肉毒杆菌毒素”是指与天然肉毒杆菌毒素相比，至少一个氨基酸缺失、改变或替换的肉毒杆菌毒素。经改造的肉毒杆菌毒素可以是以重组方式产生的神经毒素，或者是以重组方式制备的神经毒素的衍生物或片段。经改造的肉毒杆菌毒素保留至少一种天然肉毒杆菌毒素的生物活性，例如与肉毒杆菌毒素受体结合的能力，或抑制神经递质从神经元释放的能力。经改造的肉毒杆菌毒素的一个实例是具有来自一种肉毒杆菌毒素血清型(如血清型A)的轻链和来自不同肉毒杆菌毒素血清型(如血清型B)的重链的肉毒杆菌毒素。经改造的肉毒杆菌毒素的另一个实例是偶联到神经递质(如物质P)的肉毒杆菌毒素。
“突变”是指天然存在的蛋白质或核酸序列的结构变化。例如，在核酸突变的情况下，突变可以是DNA序列中一个或多个核苷酸的缺失、增加或置换。在蛋白质序列突变的情况下，突变可以是蛋白质序列中一个或多个氨基酸的缺失、增加或置换。例如，包含特定氨基酸的蛋白质序列可以被替换为另一个氨基酸，例如，选自以下的氨基酸：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或任何其他天然或非天然存在的氨基酸或化学修饰的氨基酸。蛋白质序列的突变可以是DNA序列突变的结果，即当DNA序列被转录时，产生的mRNA被翻译时，产生突变的蛋白质序列。蛋白质序列的突变也可以通过将含有所需突变的肽序列与所需蛋白质序列融合而产生。
“患者”指接受医疗、美容或兽医护理的人类或非人类受试者。因此，本文公开的组合物可用于治疗任何动物，例如哺乳动物等。
“药物组合物”是指含有活性药物成分，例如梭菌毒素活性成分(例如肉毒杆菌毒素)和至少一种额外成分(例如稳定剂或赋形剂等)的组合物。因此，药物组合物是适用于受试者(例如人类患者)的诊断、治疗或美容给药的制剂。药物组合物可以是，例如，在冻干或真空干燥条件下，冻干或真空干燥的药物组合物恢复后形成的溶液，或作为不需要恢复的溶液或固体。
“可药用的赋形剂”与“药物赋形剂”或“赋形剂”同义，是指在给予哺乳动物时基本上没有长期或永久有害影响的任何赋形剂，并且包含例如以下化合物：稳定剂、膨胀剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、添加剂、赋形剂(vehicle)、载体、稀释剂或辅助剂。赋形剂一般与活性成分混合，或允许稀释或包封活性成分，且可以是固体、半固体或液体剂。还设想包含梭菌毒素活性成分的药物组合物可以包括一种或多种可药用的赋形剂，该赋形剂促进活性成分加工成可药用的组合物。任何可药用的赋形剂，只要它不与梭菌毒素活性成分不相容，就考虑将其用于可药用的组合物中。可药用的赋形剂的非限制性实例可在例如Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Howard C.Ansel等人，eds.，Lippincott Williams&Wilkins Publishers，7th ed.1999)；Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy(Alfonso R.Gennaro ed.，Lippincott，Williams&Wilkins，20th ed.2000)；Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics(JoelG.Hardman等人，eds.，McGraw-Hill Professional，10th ed.2001)；和Handbook ofPharmaceutical Excipients(Raymond C.Rowe等人，APhA Publications，4th edition2003)中找到，每一项以引用的方式全文纳入本说明书。
药物组合物的组成成分可包括在单一组合物(即，除任何所需的恢复液外，所有组成成分在药物组合物最初混合时均存在)中或为双组分系统，例如用恢复载体(可例如含有药物组合物最初混合时不存在的成分)恢复的真空干燥组合物。双组分系统能提供多种益处，包括允许为了长期储存而掺入与双组分系统的第一组分不充分相容的成分。例如，恢复载体可以包括防腐剂，其在使用期(例如一周的冷藏储存)内提供充分保护防止微生物生长，但在两年的冷冻储存期不存在，在此期间它可能降解毒素。可能长时间不与肉毒杆菌毒素或其它成分相容的其它成分可以这种方式掺入；也就是说，在大约的使用时间加入第二载体中(例如，在恢复载体中)。药物组合物还可包括防腐剂，例如苯甲醇、苯甲酸、苯酚、对羟苯甲酸酯和山梨酸。药物组合物可以包括例如赋形剂(例如表面活性剂)；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；防腐剂；生理上可降解的组合物(例如明胶)；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂；缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；抗氧化剂；稳定剂；以及可药用的聚合或疏水材料以及本领域已知和例如Genaro，ed.，1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.中记载的其他成分，所述文献以引用的方式全文纳入本说明书。
“张度剂”是指包含在制剂中以提供等渗性的低分子量赋形剂。二糖(如海藻糖或蔗糖)、多醇(如山梨醇或甘露醇)、单糖(如葡萄糖)和盐(如氯化钠)可用作张度剂。
“多糖”是指多于两个糖分子单体的聚合物。单体可以相同或不同。
“稳定剂(Stabilizing agent)”、“稳定剂(stabilization agent)”或“稳定剂(stabilizer)”是指发挥稳定梭菌毒素活性成分的作用，使药物组合物的效力相对于不稳定的组合物有所增加的物质。
“稳定剂”可以包括赋形剂，并且可以包括蛋白质和非蛋白质分子。
“治疗制剂”是指可用于治疗从而缓解病症或疾病(例如，与黑色素相关疾病有关的病症或疾病)的制剂。
“外用给药”不包括全身给药。换句话说，与常规的经皮治疗方法不同，肉毒杆菌毒素的外用给药不会导致大量的神经毒素进入患者的循环系统。
“治疗”是指暂时或永久地缓解(或消除)病况或病症的至少一种症状，如黑色素过多。
“VAMP”是指突触泡蛋白或囊泡相关膜蛋白，其包括VAMP-1、VAMP-2和VAMP-3。
“变体”是指相对于野生型肉毒杆菌毒素，通过替换、修饰、增加或缺失至少一个氨基酸而被改造的梭菌神经毒素，如野生型肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、FG或嵌合体DC，其被靶细胞识别，由靶细胞内化，并且在靶细胞中催化裂解SNARE(可溶性NSF附着蛋白受体)蛋白。变体神经毒素组分的实例可以包含具有一个或多个被置换、修饰、缺失和/或增加的氨基酸的肉毒杆菌毒素变体轻链。这种变体轻链可能有相同或更好的能力防止胞吐作用，例如，释放神经递质囊泡。此外，与母体化学实体相比，变体的生物学效应可能会降低。例如，去除一个氨基酸序列的肉毒杆菌毒素A型的变体轻链可能比母体(或天然的)肉毒杆菌毒素A型轻链具有更短的生物持久性。
II.治疗方法
在一方面，提供了一种治疗患者黑色素相关疾病的方法。该方法包括给予患者一剂或一定量的梭菌毒素，例如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，其有效减少黑色素含量。在一些实施方案中，肉毒杆菌神经毒素是BoNT嵌合体(BoNT/DC)。在其他相关方面，提供了通过给予包含BoNT的组合物来治疗过量黑色素疾病(例如色素沉着过度)的方法。如本文所示，在实施方案中，该组合物包含BoNT嵌合体(BoNT/DC)。
在实施例1中详述的第一项研究中，将小鼠黑色素细胞用相同量的天然BoNT/A、天然BoNT/B、重组BoNT/D、天然BoNT/DC或重组LHn/D(一种缺乏结合域部分的BoNT/D变体)来处理。经毒素处理后，采用蛋白免疫印迹法检测VAMP-2和GAPDH，并测量黑色素含量。结果如图1A-1B所示。
图1A显示未处理(阴性对照)或毒素处理的小鼠黑色素细胞中GAPDH(上方条带，上样对照)和VAMP-2(下方条带)蛋白的蛋白免疫印迹法。图1B的柱状图显示VAMP-2的量，其被归一化为GAPDH的量并表示为未处理对照的百分比(基于图1A中所示的蛋白免疫印迹法条带强度)。用BoNT/DC，而不是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D或LHn/D处理黑色素细胞，使VAMP-2降低＞90％。因此，在一方面，考虑了一种通过给予受试者一定量的BoNT/DC来裂解皮肤黑色素细胞中的VAMP-2的方法。皮肤黑色素细胞中完整VAMP-2的减少导致黑色素含量的降低。在另一方面，考虑了减少皮肤黑色素细胞中黑色素含量的方法，通过给予受试者一定量的BoNT/DC以降低皮肤或细胞中的VAMP-2水平，从而降低皮肤和/或黑色素细胞中的黑色素含量。
在实施例1中也详细说明的研究中，将小鼠黑色素细胞用BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C或BoNT/DC处理。处理20小时后，测量黑色素含量，结果如图2A所示。对于图2B中所示的结果，将小鼠黑色素细胞用缓冲液(阴性对照)、BoNT/A、BoNT/D或BoNT/DC处理。处理24小时后，测量细胞中黑色素的含量。图2B中的柱状图显示用缓冲液、BoNT/A、BoNT/D或BoNT/DC处理后小鼠黑色素细胞中的黑色素水平，单位是μg/mL/106个细胞。图2A和2B中的数据显示，用BoNT/DC，而不是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C或BoNT/D处理黑色素细胞，导致黑色素水平降低。相对于用另一种BoNT血清型(例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C或BoNT/D)处理或相对于未处理的黑色素细胞，用BoNT/DC处理使黑色素含量降低了至少约50％。因此，考虑了治疗黑色素相关疾病的方法，其中相对于未处理的黑色素细胞或相对于用BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C或BoNT/D处理的黑色素细胞，给予一定量的BoNT/DC可使黑色素细胞中的黑色素含量降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
在实施例2所述的另一项研究中，得到了人皮肤组织模型，其基于培养正常的人源表皮角质形成细胞和黑色素细胞以形成多层、高度分化的人体表皮模型。用两种浓度(5nM或10nM)的天然BoNT/DC或LHn/D或10nM的天然BoNT/A在第1、4、8和12天处理组织样本，并且在第5、8、11和15天测定黑色素含量。作为对照，将一些组织样本用外用的水(未处理或阴性对照)或2％曲酸(阳性对照)进行平行测试。在第15天测量的模型组织中黑色素含量的代表性数据如图3所示。用BoNT/DC，而不用BoNT/A处理，显著降低了黑色素水平。数据显示，与用相同浓度的BoNT/A处理相比，用10nM BoNT/DC处理使黑色素含量降低约40％。在该研究中，使用MTT试验(MatTek Corp.，MTT-100)测量处理后模型组织中细胞的活力，以确认用BoNT/DC处理不影响细胞活力(数据未显示)。
实施例3描述了另一项研究。在该研究中，将人体皮肤样本在有或没有每日紫外线照射的情况下保持10天。第0天皮内注射BoNT/DC，并且每隔一天外用曲酸。在该研究的第6天用组织学评估外植体来评价总体形态(Masson's trichrome)和黑色素含量(Masson'sFontana)。基于组织学，所有剂量的BoNT/DC(2.5-10nM)均能很好地耐受(数据未显示)。图4显示使用Masson's Fontana染色法，基于组织学，该研究第6天组织外植体中的黑色素含量，其测量为黑色素染色阳性的基底层面积百分比。与未处理的组织外植体(阴性对照，空白柱)相比，用天然BoNT/DC(虚线填充的柱)和紫外线照射处理的组织外植体的黑色素含量降低50％。与未处理的组织外植体(阴性对照，空白柱)相比，用天然BoNT/DC(虚线填充的柱)和无紫外线照射处理的组织外植体的黑色素含量降低30％。如图所示，10nM BoNT/DC的增白效果与0.3％曲酸(阳性对照，水平条纹填充的柱)的增白效果类似。
基于这些研究，提供了治疗与黑色素细胞过度活跃和/或过量黑色素有关的病症和/或疾病的方法。所述方法包括向需要其的患者给予治疗有效量的BoNT试剂，其(i)被黑色素细胞摄取和(ii)裂解、结合或隔离VAMP。在一些实施方案中，VAMP是VAMP-2。在一些实施方案中，所述试剂是BoNT/DC嵌合体毒素。
“BoNT/DC”和“BoNT/DC嵌合体”意指天然的或重组的毒素，其包含与BoNT/D的轻链和移位结构域同源的轻链和与BoNT/C的结合结构域同源的结合结构域。
产生BoNT/DC的菌株的实例包括例如BoNT/DC VPI 5995(登录号：EF378947)；BoNT/DC D 4947(登录号：AB037920)；BoNT/DC南非(登录号：D38442)；BoNT/DC南非(登录号：BAA07477)；BoNT/DC OFD04、OFD05、OFD08、OFD09、OFD12、OFD13、OFD16和OFD17(登录号：AB461914、AB461915、AB461916、AB461917、AB461918、AB461919、AB461920和AB461921)；BoNT/DC It1(Cedric Woudstra(ANSES，法国)(登录号：CM003329JENO01000000)；BoNT/DCDC5(登录号：NZ_JDRY01000170)。
在一些实施方案中，毒素嵌合体是由非梭菌源产生的。非梭菌毒素嵌合体的实例包括例如稻魏斯氏菌(Weissella oryzae)SG25T。
在一些实施方案中，所述方法包括向需要其的患者给予治疗有效量的BoNT/DC嵌合体以裂解VAMP-2，从而减少或降低细胞中的黑色素含量来治疗黑色素相关的疾病。
虽然这些实施例说明了优选的BoNT，但技术人员将认识到，可以使用其他BoNT来实现这些方法，例如其他嵌合体BoNT，或与天然毒素相比至少有一个氨基酸缺失、改变或替换的经改造的神经毒素，或经改造的肉毒杆菌神经毒素可以是重组产生的肉毒杆菌神经毒素或其衍生物或片段。在某些实施方案中，经改造的毒素对目标神经元细胞或非神经元细胞的细胞靶向能力发生改变。这种能力改变是通过将肉毒杆菌毒素天然存在的靶向结构域替换为对存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞中的非肉毒杆菌毒素受体显示出选择性结合活性的靶向结构域来实现的。这种对靶向结构域的改造得到了经改造的毒素，其能够选择性地与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的非肉毒杆菌毒素受体(靶受体)结合(重新靶向)。对非肉毒杆菌毒素靶细胞具有靶向活性的经改造的肉毒杆菌毒素可以与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的受体结合，移位到细胞质中，并对靶细胞产生蛋白水解作用。本质上，包含酶结构域的肉毒杆菌毒素轻链通过选择合适的靶向结构域，在细胞内被递送到任何所需的细胞。
根据本文所述的方法使用的梭菌毒素(如肉毒杆菌毒素)可在真空压力下以冻干的、真空干燥的形式储存在容器中或为稳定的液体。在冻干前，肉毒杆菌毒素可与可药用的赋形剂、稳定剂和/或载体(如白蛋白等)结合。可接受的赋形剂或稳定剂包括蛋白质赋形剂(如白蛋白或明胶等)或非蛋白赋形剂(包括泊洛沙姆(poloxamer)、糖类、聚乙二醇等)。在含有白蛋白的实施方案中，白蛋白可以是例如人血清白蛋白或重组人白蛋白等。冻干材料可用适当的液体(例如盐水、水等)恢复，以产生给予患者的含有肉毒杆菌毒素的溶液或组合物。
在一些实施方案中，梭菌衍生物在控释系统(controlled release system)中提供，该控释系统包含包封梭菌衍生物的聚合物基质，其中少量的梭菌衍生物以受控方式在很长一段时间内从聚合物基质中释放。控释神经毒素系统已经例如在美国专利6,585,993、6,585,993、6,306,423和6,312,708中公开，其中每一项以引用的方式全文纳入本说明书。
选择用于局部给药至靶组织的梭菌毒素的量可基于以下标准变化，例如待治疗的黑色素相关疾病的严重程度、所选择的神经毒素毒素的溶解度特征以及患者的年龄、性别、体重和健康。例如，认为受影响的皮肤区域的范围与注射的神经毒素的量成正比，而认为在大多数剂量范围内，黑色素相关疾病抑制作用的量与给予的梭菌毒素的浓度成正比。确定适当的给药途径和剂量的方法一般由主治医师根据具体情况确定。这种确定对本领域技术人员而言是常规的(参见例如Harrison′s Principles of Internal Medicine(1998)，由Anthony Fauci等人编辑，第14版，由McGraw Hill出版)。
在一些实施方案中，治疗有效量是足以降低患者的黑色素含量的量。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约1pg(0.001ng)至约100μg。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约0.01ng至约10μg。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约0.1ng至约1μg(1000ng)。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约1ng至约500ng。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约10ng至约100ng。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约0.1ng至约10ng。在一些实施方案中，治疗有效量范围为约0.01ng至约0.1ng。
在一些实施方案中，给予的肉毒杆菌毒素嵌合体BoNT/DC为包含神经毒性组分和非毒素相关蛋白(NAP)的毒素复合体。在一些实施方案中，给予的BoNT/DC嵌合体为550kD复合体或300kD复合体。在其他实施方案中，给予的BoNT/DC为神经毒性成分。
治疗有效量的梭菌毒素，例如肉毒杆菌毒素，包括BoNT嵌合体，通过例如注射(例如肌内、皮内(intracutaneous)、皮内(intradermal)、皮下等)、滴注、静脉内、经皮和局部给药。此外，例如，给药途径可以是使用微量针或点阵激光的皮肤注射。
在一些实施方案中，给药方法允许将神经毒素局部给药到选定的靶组织。给药方法包括注射含有上述神经毒素的溶液或组合物，并包括植入控制地将神经毒素释放到靶组织的控释系统。这种控释系统减少了重复注射的需要。肉毒杆菌毒素的生物活性在组织中的扩散似乎是剂量的函数并且可以分级。Jankovic J.等人，Therapy With BotulinumToxin，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，150页。例如，可以给予神经毒素，以使神经毒素主要作用于被认为参与黑色素相关疾病的发生的真皮细胞。
根据本发明，通过向靶组织注射或外用肉毒杆菌毒素的局部给药，为患者全身性给药提供了更好的选择，以缓解黑色素相关的疾病。
与黑色素细胞过度活跃和/或过量黑色素有关的病症和/或疾病包括例如过量黑色素生成、与黄褐斑有关的色素沉着过度、晒斑(老年斑)、皮肤上的痣和黑色素瘤。
在一些实施方案中，提供了一种裂解VAMP的方法。该方法包括使毒素与VAMP接触。在一些实施方案中，该毒素是梭菌毒素，例如肉毒杆菌毒素、其片段或变体。在一些实施方案中，该毒素是肉毒杆菌毒素嵌合体、其片段或变体。在其他实施方案中，该毒素是非梭菌毒素嵌合体、其片段或变体。在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素是BoNT/D、其片段或变体。在一些实施方案中，所述方法包括使BoNT/D轻链(LC/D)与VAMP接触。在其他实施方案中，肉毒杆菌毒素为BoNT/DC。在一些实施方案中，VAMP是VAMP-2或VAMP-3。在一些实施方案中，所述方法包括使BoNT/DC或BoNT/D轻链(LC/D)与VAMP-2或VAMP-3接触。
在一些实施方案中，提供了一种裂解VAMP-2的方法。所述方法包括使肉毒杆菌毒素、其片段或变体与VAMP-2接触。在一些实施方案中，所提供的肉毒杆菌毒素、其片段或变体的量实现至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％或基本上完全(例如100％)的VAMP-2裂解。在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素、其片段或变体包括BoNT/D、BoNT/D轻链(LC/D)、BoNT/B或BoNT/B轻链(LC/B)。在这些实施方案中，VAMP可以是重组VAMP，或来自裂解的黑色素细胞，或来自体内黑色素细胞。
在一些实施方案中，提供了一种裂解VAMP-2和降低黑色素细胞中黑色素含量的方法。所述方法包括使黑色素细胞与肉毒杆菌毒素、其片段或变体接触。在一些实施方案中，肉毒杆菌毒素是BoNT/DC嵌合体。在一些实施方案中，所提供的BoNT/DC嵌合体的量实现至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少80％、至少90％或基本上完全(例如100％)的黑色素细胞中的VAMP-2裂解。
III.实施例
在不意欲限制本发明范围的情况下，以下实施例阐明了示例实施方案。
实施例1
用BoNT/DC处理黑色素细胞降低了黑色素含量
正常小鼠黑色素细胞(Melan-a)在6孔板的生长培养基中生长至约80％融合。在无血清培养基中，将细胞用10nM缓冲液(未处理或阴性对照)、天然BoNT/A、天然BoNT/B、重组BoNT/D、天然BoNT/DC或重组LHn/D处理，一式两份。将细胞用毒素处理24小时，然后在无血清培养基中孵育96小时。
孵育96小时后，使用抗-VAMP-2和抗-GAPDH通过蛋白免疫印迹法检测VAMP-2和GADPH。使用SOLVABLETM(PerkinElmer)黑色素试验测量黑色素含量。结果如图1A-1B所示。
在一项类似的研究中，正常小鼠黑色素细胞(Melan-a)在6孔板的生长培养基中生长至约65-75％融合，并一式三份地用10nM天然BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C或BoNT/DC在无血清培养基中处理20小时，随后在无血清培养基中再孵育96小时。使用SOLVABLETM(PerkinElmer)黑色素试验测量黑色素含量。结果如图2A所示。
在类似的研究中，正常小鼠黑色素细胞(Melan-a)在6孔板的生长培养基中生长至约80％融合，并一式三份地用缓冲液(未处理或阴性对照)、10nM的天然BoNT/A、重组BoNT/D或天然BoNT/DC在无血清培养基中处理24小时，随后在无血清培养基中再培养96小时。使用SOLVABLETM(PerkinElmer)黑色素试验测量黑色素含量。结果如图2B所示。
实施例2
BoNT/DC降低了人体皮肤等效模型中的黑色素含量
得到了人体皮肤组织模型MELANODERMTM(MatTek Corporation)。该模型是基于培养正常的、人源表皮角质形成细胞和黑色素细胞以形成多层、高度分化的人体表皮模型。组织为三维共培养物，黑色素细胞和角质形成细胞的比例为1∶10。将组织样本一式两份地用缓冲液(未处理对照)、5nM或10nM的天然BoNT/DC、天然BoNT/A或LHN/D(作为非特异性吸收的阴性对照)处理，通过于第1、4、8和12天在培养基中基底递送(basal delivery)，并于第5、8、11和15天评估黑色素含量。作为对照，使用外用的水(未处理对照)或2％曲酸(阳性对照)平行检测一些组织样本。
于第1、4、8和12天处理组织样本，并在第5、8、11和15天使用SOLVABLETM(PerkinElmer)黑色素试验测定黑色素含量。使用MTT试验(MatTek Corp.，MTT-100)评估细胞活力。基于MTT试验，用BoNT/DC处理未影响细胞活力(数据未显示)。第15天评估的黑色素含量如图3所示。
实施例3
BoNT/DC降低了人外植体皮肤中的黑色素含量
将来自45岁白人女性的腹部整形术的人皮肤外植体保持10天，每天用或不用紫外线照射(第0-8天)。在第0天皮内注射BoNT/DC(50μL)，并每隔一天外用曲酸。该研究第6天，通过组织学评估外植体来评价的总体形态(Masson's trichrome)和黑色素含量(Masson'sFontana)。
基于组织学，所有剂量的BoNT/DC(2.5-10nM)均耐受良好(数据未显示)。组织外植体中黑色素的百分比如图4所示，其中柱对应于以下治疗：用天然BoNT/DC(虚线填充的柱)、外用曲酸作为阳性对照(水平条纹填充的柱)皮内注射6天后的组织外植体，和未处理的(对照，空白柱)。10nM BoNT/DC的增白效果与0.3％曲酸的增白效果类似。
实施例4
用BoNT/DC治疗晒斑(solar lengitines)
一名II光型皮肤的45岁女性，在她的面部有色素沉着过度的不均匀的棕色变色、不同大小的暗斑，这被诊断为晒斑。她接受用BoNT/DC毒素制剂进行表皮内治疗。在皮肤上施用外用麻醉霜30分钟，并在处理前完全除去。
将1.5μg BoNT/DC毒素真空干燥粉末溶于1mL无菌0.9％盐水中，制成10nM溶液，将其用30-G针注入她的面部皮肤斑点的上真皮。每注射点注射50μL毒素，每个注射点间隔约为1cm2。注射深度约为0.5mm。在患者的面部总共注射了约1.5μg。
在基线处和治疗后3周进行评估。使用Canfield RBX成像技术对色素沉着进行定量评估。与基线相比，在治疗后3周，她的面部皮肤基于成像显示出斑显著变亮；并且她在医生的整体评估和受试者满意度评分中得分较高，从重度到轻度整体色素沉着。
实施例5
用BoNT/DC治疗黄褐斑(melasma)
一名III光型皮肤的37岁怀孕女性，在她的脸颊、鼻子、上唇和前额上出现色素沉着过度的变色、褐色不规则斑点，被诊断为黄褐斑。她接受用BoNT/DC毒素制剂进行表皮内治疗。
将4.5μg BoNT/DC毒素的真空干燥粉末溶于3mL无菌0.9％盐水中，制成10nM溶液，将其用多针真皮注射器系统注入她的面部皮肤表皮。在显示变色的区域在多处注射点注入毒素溶液，注射点间距约为2mm，每个注射点注射2μL。注射深度约为0.1mm。在患者的面部总共注射了约4.5μg。
在基线处和治疗后3周进行评估。使用Canfield RBX成像技术对色素沉着进行定量评价。与基线相比，在治疗后3周，她的面部皮肤显示出显著更少的变色；并且她在医生的整体评估和受试者满意度评分中得分较高，从重度到轻度整体色素沉着。
虽然上文已经讨论了若干示例性方面和实施方案，本领域技术人员将认识到它们的某些修改、排列、添加和子组合。因此，以下所附权利要求书和下文引入的权利要求旨在理解为包括其真实精神和范围内的所有此类修改、排列、添加和子组合。
Claims (9)
1.一种治疗与黑色素细胞过度活跃或过量黑色素产生有关的病症的方法，其包括：
向需要其的患者给予治疗有效量的BoNT/DC。
2.一种用于治疗与过量黑色素相关的皮肤病的方法，其包括：
向患有过量黑色素相关疾病的患者的皮肤给予包含BoNT/DC的组合物。
3.一种治疗皮肤色素沉着过度的方法，其包括：
向需要其的患者的皮肤给予包含BoNT/DC的组合物。
4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述病症或疾病选自过量黑色素生成、色素沉着过度、黄褐斑、晒斑、痣和黑色素瘤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述给予包括给予含有BoNT/DC的液体组合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述液体组合物包括一种或多种张度剂和表面活性剂。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述给予是通过皮肤注射。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述给予包括给予包含BoNT/DC的固体组合物。
9.根据权利要求1-5或8中任一项所述的方法，其中所述给予是局部给予。
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