CN105683212A - 高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素 - Google Patents
高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。在一个实施例中,本发明提供具活性的破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物,或具活性的整个破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素的衍生物。在另一个实施例中,本发明提供用于改善当前使用肉毒杆菌神经毒素的疗法的方法。在另一个实施例中,本发明提供应用肉毒杆菌神经毒素或肉毒杆菌神经毒素的轻链于各种治疗或美容用途的新颖方法。在一个实施例中,本发明提供的方法用于减少肉毒杆菌神经毒素于各种用途出现的免疫耐药性。
Description
相关申请
本申请要求以2013年8月21日提交的美国临时专利申请号61/868,560为优先权基础,所述优先权文件的所有内容及公开都以引用方式被纳入本申请中。
本申请引用了多篇参考文献及出版物。所述参考文献及出版物的所有内容都以引用方式被纳入本申请中以便更能全面地描述与本发明相关的现有技术。
技术领域
本发明涉及包括肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的梭菌属神经毒素的改造,以及这些神经毒素及其衍生物的用途。
背景技术
梭菌属神经毒素(ClostridiaNeurotoxins,CNTs)是其中一种最毒害人类的蛋白毒素。例如,肉毒杆菌神经毒素(BotulinumNeurotoxin,BoNT)会引起弛缓性麻痹并导致肉毒中毒,破伤风神经毒素(TetanusNeurotoxin,TeNT)则会引发痉挛性麻痹。梭菌属神经毒素的分子量约150kDa,是一个具有典型A-B链-结构/功能特性的双链蛋白,其中B区域(结合区域)与哺乳动物细胞的表面分子先结合,A区域(活性区域)随后转位至细胞内的位置(1).梭菌属神经毒素由三个功能区域组成:N-末端的催化区域(轻链,LC)、中间的转运区域(重链,HCT)及C-末端的受体结合区域(重链,HCR)(2)。梭菌属神经毒素属于锌金属蛋白酶,能够切割SNARE蛋白(SolubleN-ethylmaleimide-SensitiveFactorAttachmentREceptor,可溶性NSF附着受体),SNARE蛋白干扰突触小泡与质膜融合,最终阻止神经细胞分泌神经传导物质(1,3)。哺乳动物神经元的胞吐作用是由一种SNARE蛋白质复合物所带动,该蛋白质复合物由囊泡SNARE蛋白囊泡相关膜蛋白-2(vesicleassociatedmembraneprotein-2,VAMP2)以及两种质膜SNARE蛋白,SNAP25(分子量为25kDa的突触体相关蛋白Synaptosome-AssociatedProtein)和突触融合蛋白1a(syntaxin1a)所形成(4)。BoNT共有七个血清型(血清型A-G)能切割三种SNARE蛋白其中一种的某些特定氨基酸残基:BoNT血清型B、D、F和G及TeNT能切割VAMP2,BoNT血清型A及E能切割SNAP25,和BoNT血清型C能切割SNAP25和突触融合蛋白1a(3,5-7)。
BoNTs最被广泛使用于蛋白治疗。早在1989年,BoNT血清型A(BoNT/A)经美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛,也可用于颈部肌张力障碍、化妆品、眉间面部线条及腋窝多汗症。由于BoNT血清型A对治疗肌张力障碍和其他与不随意肌活动有关的毛病有效,并且符合安全性,BoNT血清型A在眼科、胃肠道科、泌尿外科、骨科、皮肤科、分泌及痛症各个领域已被批准作为实验性使用或药品标示外使用(8-17)。FDA于2000年12月11日批准肉毒杆菌神经毒素血清型B(MYOBLOCTM)用于治疗患有颈部肌张力障碍的患者,以减少与此病相关的头部位置异常和颈部疼痛的严重性(18,19)。
BoNT对治疗不随意肌的痉挛及收缩、美容或其它应用只有暂时性的效果,因此需要重复注射BoNT。在一些患者中,BoNT可诱发针对BoNT毒素的中和抗体的产生,并降低BoNT的可用性。由此引起的免疫耐药性限制了BoNT的成效,或会使病人对进一步治疗毫无反应(9,10,20-26)。虽然患者对BoNT治疗产生免疫耐药性的确切百分比不详,但相比BoNT血清型B的治疗,通常较少患者对BoNT血清型A的治疗产生免疫耐药性(9,26)。这可能是由于BoNT血清型A复合物所使用的剂量比BoNT血清型B复合物的较低(27)。BoNT中和抗体多见于接受颈部肌张力障碍或痉挛治疗的患者,这是由于治疗此病症需要更大剂量的毒素和定期给药。至于治疗喉张力障碍、眼睑痉挛的患者或化妆品用途,由于需要较小的BoNT剂量,中和抗体不太常见(9,28,29)。降低治疗剂量或有助减少产生BoNT治疗的免疫耐药性。
迄今为止仍未有方案能有效处理BoNT免疫耐药性的问题。过往曾有研究试图阻堵涉及诱导中和抗体的BoNT表位。研究人员将取自耐药患者的中和抗体与BoNT血清型A和BoNT血清型B的不同区域的反应,从而确定一系列可能涉及诱导中和抗体的免疫原区(39-41)。有报告指肽与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)缀合能抑制针对肽的免疫反应。BoNT血清型A的重链区域(HC/A)有较强的免疫反应,研究人员将BoNT/A重链与mPEG缀合,并在小鼠接受BoNT/A治疗前施用该缀合物以进行预先免疫。结果显示,某些mPEG缀合物减少了中和抗体的产生(42),表示该预先免疫程序或可临床应用于免疫耐药的患者。
由于BoNT的治疗特性和免疫耐药性相互关联,改造BoNT成为更高活性的毒素以降低其治疗所需剂量是克服免疫耐药性最好的方法。Rummel等人将BoNT血清型B重链区域中用来结合神经节苷脂的模序修改,相比原型毒素,改造后的毒素的结合和毒性提升高达三倍(43)。然而,BoNT的受体结合区域经改造后有可能影响结合作用的选择性。此外,改造结合区域不一定可以显着增加毒素的效力以避免产生免疫耐受性。相反,改造轻链(LC)以改变BoNT活性或更有助于避免产生免疫耐受性。因此,有必要改造梭菌属神经毒素,如肉毒杆菌神经毒素,以提高其治疗效果。
发明概述
本发明提供了调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。
在一个实施例中,本发明的方法通过提升毒素的催化活性以增强破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的底物识别。
在一个实施例中,本发明提供肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的衍生物及其应用。
在一个实施例中,本发明提供破伤风神经毒素轻链(LC/T)的衍生物或整个破伤风神经毒素的衍生物,这些衍生物的活性被更改。
在一个实施例中,本发明提供破肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/T)的衍生物或整个肉毒杆菌神经毒素的衍生物,这些衍生物的活性被更改。
在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物或肉毒杆菌神经毒素衍生物可以在各种治疗、化妆品或其它应用中使用。在另一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物或肉毒杆菌神经毒素衍生物用于治疗减少肉毒杆菌神经毒素的免疫耐药性。
在另一个实施例中,本发明提供了使用肉毒杆菌神经毒素以改善当前的疗法的方法。在另一个实施例中,本发明提供了將肉毒杆菌神经毒素的衍生物或肉毒杆菌神经毒素的轻链衍生物应用于各种治疗或美容用途的方法。
附图说明
图1所示的为破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的S2',
S1'和S1口袋,以及VAMP2的P位点。图1显示了位于口袋并与VAMP2不同P位点交互的氨基酸残基。图1A示出的是LC/T和VAMP2产生相互作用的残基,其中LC/T以表面模型来表示。图1B示出的是LC/T和VAMP2产生相互作用的残基,其中LC/T以卡通模型来表示。图1C示出的是LC/B和VAMP2产生相互作用的残基,其中LC/B以表面模型来表示。图1D示出的是LC/B和VAMP2产生相互作用的残基,其中LC/B以卡通模型来表示。以下为VAMP2的P位点和LC/T的S2',S1'和S1口袋的命名方法:形成VAMP2可切键的两个残基从C-末端到N-末端被命名为P1-P1'。从P1到C-末端方向的残基被指定为P2,P3等,而从P1'到N-末端方向的残基被指定为P2',P3'等。识别特定P位点的LC/T或LC/B口袋以相应的S口袋命名。识别VAMP2的P2’位点(即E78)的LC/T和LC/BS2’口袋分别由R374和R370组成。识别VAMP2的P1’位点(即F77)的LC/T和LC/BS1’口袋分别由L230和I227组成。识别VAMP2的P1位点(即Q76)的LC/T和LC/BS1口袋分别由K168NE170和E168NE170组成。
图2所示的為LC/T、LC/B及其衍生物裂解VAMP2的催化活性。图2A示出的為LC/T及其衍生物裂解VAMP2的活性。图2B示出的為LC/B及其衍生物裂解VAMP2的活性。误差线为每个实验重复三次的标准差。
图3所示的為LC/B、LC/T及LC/T衍生物[K168E,L230I]的S1'口袋残基的方位。图3A比较位于S1'口袋的残基LC/B(I227)、LC/T(L230)及LC/T[K168E,L230I](I230)的方位。其中线表示肽的主链骨架,而棒则表示残基。图3B示出的为S1'口袋的相对平坦的位置,当中包括LC/B的I227(黑色)及LC/T的[K168E,L230I]的I230(灰色)。图3C所示的为LC/T的S1'口袋的隆起表面(以网状曲面来表示),当中包含L230。图3D所示的为LC/T的S1'口袋的隆起表面(以固定表面来表示),当中包含L230。
图4所示的为LC/T(图4A)、LC/B(图4B)及LC/T[K168E,L230I](图4C)的S1'和S2'口袋中残基之间的距离。S1'残基侧链和S2'残基侧链之间的距离使用PyMOL程式测量。LC/T的R374和L230两者之间的距离约LC/B的R370和I227两者之间的距离约LC/T[K168E,L230I]的I230和R374两者之间的距离约
图5所示的为重组LC/B、LC/T及其衍生物裂解内源性VAMP2的结果。图5A显示LC/T及LC/T[K168E,L230I]裂解内源性VAMP2的结果。图5B显示LC/B及LC/B[S201P]裂解内源性VAMP2的结果。在每个图中,上图所示的是分析VAMP2裂解的蛋白印迹结果,当中使用针对VAMP2的抗体和针对肌动蛋白的抗体。下图则表示蛋白印迹分析的量化结果。
发明内容
为了提高BoNT的治疗效果及减少诱导BoNT的中和抗体,将BoNT改造成为更强力的衍生物是非常有用的,这可以减低BoNT于各种治疗及应用中的有效剂量。
通过研究肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的底物识别及特异性,本发明将肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素改造成新的衍生物,以提高其活性和底物特异性。
本发明中对肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)和破伤风神经毒素轻链(LC/T)的底物识别口袋中的活性部位进行比较和分析。
在一个实施例中,本发明提供了通过提升催化活性以优化破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的底物识别。
在一个实施例中,本发明提供了调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。
在一个实施例中,本发明提供增强了活性的肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物或整个肉毒杆菌神经毒素的衍生物。在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素包含SEQIDNO.:1的多肽。在另一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物的氨基酸序列带有一个或多个改变。在一个实施例中,肉毒杆菌神经毒素的衍生物包含位于SEQIDNO.:1第201位的氨基酸的改变,所述氨基酸由丝氨酸serine(S201)改变为脯氨酸proline(P201)。在另一个实施例中,肉毒杆菌神经毒素衍生物[S201P]包括SEQIDNO.:2的序列。
在一个实施例中,肉毒杆菌神经毒素的衍生物包括位于SEQIDNO.:1第263位的丙氨酸alanine的改变。在另一个实施例中,肉毒杆菌神经毒素的衍生物包括位于SEQIDNO.:1第264位的异亮氨酸isoleucine的改变。
在一个实施例中,本发明提供破伤风神经毒素轻链(LC/T)的衍生物或整个破伤风神经毒素的衍生物。在一个实施例中,本发明所述的破伤风神经毒素包括SEQIDNO.:3的多肽。在另一个实施例中,本发明所述的破伤风神经毒素衍生物的氨基酸序列带有一个或多个改变。在一个实施例中,破伤风神经毒素的衍生物包含位于SEQIDNO.:3第230位的氨基酸的改变,所述氨基酸由亮氨酸leucine(L230)改变为异亮氨酸isoleucine(I230)。在另一个实施例中,破伤风神经毒素的衍生物包括位于SEQIDNO.:3第168位的氨基酸的改变,所述氨基酸由赖氨酸lysine(K168)改变为谷氨酸glutamate(E168)。在一个实施例中,破伤风神经毒素衍生物[L230I]包括SEQIDNO.:4的序列。
在另一个实施例中,破伤风神经毒素的衍生物包括以下改变:位于SEQIDNO.:3第230位的亮氨酸leucine(L230)改变为异亮氨酸isoleucine(I230)及位于SEQIDNO.:3第168位的赖氨酸lysine(K168)改变为谷氨酸glutamate(E168)。在一个实施例中,破伤风神经毒素的衍生物[K168E,L230I]包括SEQIDNO.:5的序列。
肉毒杆菌神经毒素B轻链的原型(LC/B)(SEQIDNO.1):
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSV
肉毒杆菌神经毒素B轻链的衍生物(LC/B)(SEQIDNO.2):
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVPVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSV
破伤风神经毒素轻链的原型(LC/T)(SEQIDNO.3):
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLI
破伤风神经毒素轻链的衍生物(LC/T)(SEQIDNO.4):
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALILMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLI
破伤风神经毒素轻链的衍生物(LC/T)(SEQIDNO.5):
MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNENEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALILMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLI
在一个实施例中,本发明提供了包含肉毒杆菌神经毒素或破伤风神经毒素的衍生物的药物组合物。在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素或破伤风神经毒素及其衍生物与一个或多个辅助多肽融合或偶合,所述辅助多肽来自肉毒杆菌神经毒素、破伤风神经毒素或其他生物。在一个实施例中,与本发明所述的毒素融合或偶合的辅助多肽是天然的或重组的多肽。在另一个实施例中,与本发明所述的毒素融合或偶合的辅助多肽是人造多肽。
在一个实施例中,本发明所述肉毒杆菌神经毒素或破伤风神经毒素的轻链(LC)和重链(HC)及其衍生物的DNA被克隆到相同的表达载体中,从而表达包含轻链和重链的融合蛋白。在一个实施例中,轻链和重链均源自于相同的毒素血清型。在另一个实施例中,轻链和重链源自于不同的毒素血清型。
在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物在药物、临床或美容过程中使用。在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物用于治疗或改善各种疗法或其它应用的疾病或状况。在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物用于新颖的治疗,这些治疗产生肉毒杆菌神经毒素免疫耐药性的机会较低。
在一个实施例中,本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物用于用于治疗或改善斜视、眼睑痉挛、半面痉挛、颈部肌张力障碍、痉挛、眉间面部线条、腋窝多汗症、下泌尿道毛病、胃肠道毛病、痉挛性发声困难、颞下颌关节症、流涎、慢性糖尿病性神经病、创伤愈合、阴道痉挛、肌肉骨骼疼痛、涉及到不随意骨骼肌活动障碍如不随意肌痉挛和收缩、或任何其他适用的疾病或状况。
在一个实施例中,本发明提供使用本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物以改善或治疗疾病或状况的方法,所述方法给受试者施用有效剂量的衍生物。在另一个实施例中,本发明提供改善当前使用肉毒杆菌神经毒素的治疗方法。
在一个实施例中,本发明提供应用具有增强治疗功效或药性的肉毒杆菌神经毒素的方法。在另一个实施例中,本发明提供减少各种涉及肉毒杆菌神经毒素的治疗和应用中产生肉毒杆菌神经毒素免疫耐药性的方法。
在一个实施例中,本发明所述的破伤风神经毒素的衍生物可以用作分子标记或有效工具以研究中央神经元的胞吐作用机制。
本发明提供一种经改造的肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白,该肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列为SEQIDNO.:1,该轻链蛋白包含一个或多个如SEQIDNO.:1所示的氨基酸的变异。
在一个实施例中,本发明所述的经改造肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白,其氨基酸变异选自:Ser201,Ala263和Ile264。
在一个实施例中,本发明所述的经改造肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白包含SEQIDNO.:2的氨基酸序列。
本发明提供一种包含本发明所述的经改造肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白的组合物,该轻链蛋白与一个或多个的第二种蛋白融合或偶合,该第二种蛋白为源自肉毒杆菌神经毒素或其他生物的蛋白。
在一个实施例中,本发明所述的第二种蛋白是天然蛋白或人工蛋白。
本发明提供一种组合物,该组合物包含本发明所述的经改造肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白和一个药学可接受的载体。
本发明提供一种用于改善或治疗受试者的疾病或状况的方法,该方法包含给予受试者有效份量的本发明所述的经改造肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白。
在一个实施例中,本发明所述的疾病或状况选自:斜视,眼睑痉挛,半面痉挛,颈部肌张力障碍,痉挛,眉间面部线条,腋窝多汗症,不随意肌痉挛,下泌尿道毛病,胃肠道毛病,痉挛性发声困难,颞下颌关节症,慢性糖尿病性神经病,创伤愈合,阴道痉挛,肌肉骨骼疼痛和不随意肌收缩。
在一个实施例中,本发明的改善或治疗疾病或状况的方法,该受试者产生较低的免疫耐药性。在另一个实施例中,该受试者相比接受原型肉毒杆菌神经毒素治疗的受试者产生较少的肉毒杆菌神经毒素的免疫耐药性。
本发明提供一种经改造的破伤风神经毒素轻链蛋白,该破伤风神经毒素的氨基酸序列为SEQIDNO.:3,该轻链蛋白包含一个或多个如SEQIDNO.:3所示的氨基酸的变异。
在一个实施例中,本发明所述所述的破伤风神经毒素轻链蛋白,其氨基酸变异选自:Lys168和Leu230。
在一个实施例中,本发明所述的破伤风神经毒素轻链蛋白,包含SEQIDNO.:4或5的氨基酸序列。
本发明提供一种包含本发明所述的经改造破伤风神经毒素轻链蛋白的组合物,该轻链蛋白与一个或多个的第二种蛋白融合或偶合,该第二种蛋白为源自伤风神经毒素或其他生物的蛋白。
在一个实施例中,本发明所述的第二种蛋白是天然蛋白或人工蛋白。
在一个实施例中,本发明提供一种包含本发明所述的经改造破伤风神经毒素轻链蛋白的组合物,该组合物作为分子标记用于研究神经元的胞吐作用。
本发明提供一种组合物,该组合物包含本发明所述的经改造破伤风神经毒素轻链蛋白和一个药学可接受的载体。
本发明提供一种用于改善或治疗受试者的疾病或状况的方法,该方法包含给予受试者有效份量的本发明所述的经改造破伤风神经毒素轻链蛋白。
通过引用以下的实验细节可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员应理解所提供的实施例仅作为说明作用,而非限制本发明的范围。本发明的范围将由随后的权利要求所界定。
在本申请中的,过渡语“包含”与‘包括’﹑‘含有’或‘以…为特征’是同义的,是包括性或开放式的,当中并不排除有另外未列举的元素或方法步骤。
具体实施方式
实施例1
肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的改造
用于蛋白表达的质粒构建
表达LC/T(1-436)(破伤风神经毒素登陆号:X06214.1)﹑LC/B(1-440)(肉毒杆菌神经毒素登陆号:AB084152.1)和VAMP2(1-97)的质粒,及随后的蛋白表达和纯化根据文献所描述的来进行(30-32)。pLC/T﹑pLC/B和pVAMP2的定点突变根据文献所描述的使用QuikChange(Stratagene公司)来进行(30,31)。质粒被测序以确认突变成功及确保开放读序框(OpenReadingFrame,ORFs)没有其他突变。突变蛋白如前所述的步骤生产及纯化(30-33)。
测定LC/B和LC/T裂解VAMP2的线性速度和动力学常数
线性速度的反应物(10μl)如前所述的步骤进行(30,31,33)。VAMP2蛋白(5μM)与带有不同LC/T﹑LC/B或其衍生物浓度的10mM三羟甲基氨基甲烷及盐酸溶液(Tris-HCl)(pH7.6)及20mM的氯化钠(NaCl)置于37℃温育10分钟。通过加入SDS-PAGE缓冲液停止反应,使用SDS-PAGE分离VAMP2及其裂解产物。通过光密度测定VAMP2被裂解的数量。Km及kcat使用相同的测定法测定,其中VAMP2浓度调整至1-300μM以达至由LC/T及其衍生物进行大约10%裂解。使用Michaelis-Menten方程(反应速度与底物浓度的关係)对实验数据进行拟合,使用GraphPad程序(圣地亚哥,加州)获得动力学常数。进行至少五个独立的实验,以确定每个蛋白的动力学常数。
补偿性测定实验
根据文献所描述的方法确定LC/T的补偿性突变对裂解VAMP2及其变体VAMP2[F77D]的影响(31)。简单地说,5μM的VAMP2或VAMP2变体与LC/T或其衍生物一起温育。使用SDS-PAGE分离未裂解的VAMP2及裂解的VAMP2并将之量化。将反应中的原型LC/T或其衍生物的数量与VAMP2裂解百分比制作关系图表。然后计算裂解50%VAMP2或VAMP2突变体所需的LC浓度(EC50)。
LC结晶和结构鉴定
LC/T衍生物[K168E,L230I]经悬滴蒸气扩散法结晶。LC/T[K168E,L230I]以7.5mg/ml的浓度储存在10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)及20mM氯化钠(HCl)(pH7.9)
的缓冲液中。每个悬滴含有1μl的蛋白溶液和1μl母液(250mM硝酸镁(Mg(NO3)2)及15%聚乙二醇3350(PEG3350))。在16℃下温育4-5天直至晶体成熟。收集晶体并在添加有20%甘油的母液中冷冻保护,用作收集数据。使用RigakuMicroMaxTM-007HFX-射线衍射仪在100K的温度下收集数据并使用iMOSFLM处理数据(34)。该晶体的空间群属于单斜组C222,晶胞参数为并衍射至每个不对称的单元中有一个分子。以LC/T(PDBID:1Z7H)作为同源性模型,采用CCP4i程式套件的PHASER模块利用分子置换方法得到LC/T[K168E,L230I]的结构(35)。随后使用CCP4的REFMAC模块的进行结构修正(36)。利用WINCOOT进行人手结构重建。最终所得的结构保藏在蛋白质数据库(PDB),编号为4J1L。
利用重组LC/T、LC/B及其衍生物裂解源自Neuro2A细胞的VAMP
以添加有10%新生小牛血清、1.4%碳酸氢钠和0.5%青霉素-链霉素的MEM培养基(minimumessentialmedium),在37℃及5%二氧化碳下培养Neuro2A细胞。收集融合细胞,并在冰上用25号规格的针头反复抽放20至30次以裂解细胞。裂解产物以2500rpm离心5分钟沉淀细胞核及完整的细胞,收集上清液进行实验。细胞裂解物与不同数量的LC(反应物体积为10μl)在37℃温育10分钟后,加入等量的SDS-PAGE样品缓冲液停止反应,并在100℃下将混合物加热10分钟。使用针对VAMP2的抗体和针对肌动蛋白的抗体进行蛋白印迹(Westernblot)以分析VAMP的裂解。
结果
BoNT血清型B和TeNT在同一个可切键切割VAMP2,但具有不同的底物水解效率,LC/B的活性比LC/T高约20倍。在过往LC/B和LC/T识别VAMP2的研究中,发现两种LC用来识别VAMP2的活性位点有类似的布局。两个LC系统的主要区别在于P2'-S2'底物的识别位点(33,38)。VAMP2的P2’位点的突变(E78改变为alanine,[E78A]),减少LC/B裂解约8倍,但减少LC/T裂解约240倍,这表明VAMP2的E78在LC/B和LC/T的底物裂解有不同的作用(33)。
LC/B和LC/T的S2’口袋的生化特性分析显示,LC/B及LC/T的口袋分别由R370和R374形成(图1)。补偿性突变实验显示LC/B的R370直接与VAMP2的E78产生相互作用,但似乎没有证据显示LC/T的R374与VAMP2的E78之间有相互作用(38)。这些研究数据促使本发明研究LC/B和LC/T在VAMP2(E78)的P2’位点识别底物的不同机制。
优化LC/T和LC/B的S1'口袋以增强其催化活性
图1示出LC/B及LC/T与底物VAMP2相互作用的活性位点。比较LC/B及LC/T的结构,揭示两个轻链的S2'口袋是相似的,并包括一个精氨酸残基(LC/B为R370,LC/T为R374),然而其S1'口袋是不同的。LC/B的S1'口袋由F95、V200、S201、L226及I227组成,而LC/T的S1'口袋由F199、V204、P205、L229、L230及L231组成。当S1'口袋残基突变为丙氨酸,对LC/B底物水解没有影响,除了I227A使kcat数值减少大约80倍,但没有改变Km数值(38)。对于LC/T,S1'口袋的残基突变没有影响底物水解,除了LC/T[L230A]或LC/T[P205A]的突变使kcat数值减少大约30倍,但不影响Km数值(38)。在S1'口袋中的残基,LC/T的P205与LC/B的S201结构排列一致,而LC/T的L230与LC/B的I227结构排列一致(图1)。LC/B及LC/T的S1'口袋的不同成分不仅可能引致不同VAMP2的P1’位点识别,还可能引致不同的P2’位点识别,并进一步影响LC/B及LC/T本身已经不同的催化活性。
將LC/B及LC/T的S1'口袋中氨基酸残基互换已进行突变。LC/T[P205S]的突变使kcat数值减少大约80倍,但没有改变Km数值。LC/T[L230I]的突变使kcat数值提高大约20倍,但Km数值相近(表1,图2A)。上述数据表明,脯氨酸和异亮氨酸是形成LC/T的S1'口袋的最佳残基,用于与VAMPP1位点的氨基酸F77进行相互作用。
为了证实上述假设,对LC/B的S1'口袋的氨基酸残基亦进行了互换。LC/B[I227L]的突变使kcat数值减少大约590倍,但没有改变Km数值。LC/B[S201P]的突变使kcat数值提高大约10倍,但没有改变Km数值(表1,图2B)。上述数据进一步证实,脯氨酸和异亮氨酸是构成LC/B及LC/T的S1'口袋的最佳残基,并意味着现时LC/B及LC/T的底物识别口袋还未被优化。优化这些口袋可以改善毒素的催化活性。为了验证改变LC/B及LC/T的S1'口袋并不会改变其底物特异性,本实施例研究了上述四个突变体裂解VAMP2[F77D]的活性。VAMP2的F77是LC/B及LC/T切键活动的关键氨基酸残基,该残基的突变可能会影响LC/B及LC/T的裂解活性。由于上述LC/B及LC/T的突变体都不能裂解VAMP2[F77D],意味着LC/B及LC/T的突变体经突变后其VAMP2底物特异性没有改变(图2A-B)。
表1
LC/B和LC/T及其衍生物裂解VAMP2的动力学常数
ND:不确定,由于酶不活跃,以致不能确定动力学常数。
优化LC/T的S1'口袋能达至最佳的P2’位点识别
由于S1'及S2'口袋接近,LC/B及LC/T的S1'口袋的不同成分可能与LC/B及LC/T的S2’口袋之间的不同特性有关联。虽然LC/B及LC/T的S2'口袋兩者都包括一个精氨酸残基,先前的研究指出,LC/B的R370及VAMP的E78有直接的相互作用,而LC/T的R374与VAMP的E78则没有直接的相互作用(38)。此外,当位于VAMP的P2'位点的E78突变为丙氨酸(E78A)时,对LC/B的裂解相比LC/T裂解的影响较小(38)。
本发明改造LC/T以优化其S1'口袋,创造了LC/T[L230I]并测试其切割VAMP2E78R的活性。如表2所示,裂解50%VAMP2所需的LC/T浓度为约120nM(EC50)。可是,即使LC/T的浓度高达36,000nM,LC/T仍不能裂解VAMP2E78R。LC/T[L230I]裂解VAMP2的效率比原型LC/T(Wt-LC/T)高约24倍;虽然LC/T[L230I]裂解VAMP2E78R的效率与Wt-LC/T相近,LC/T[L230I]裂解VAMP2E78R的效率比原型LC/T(Wt-LC/T)高约360倍(表2)。上述数据显示,优化LC/T的S1'口袋可以增加LC/T对P2'位点由E78突变为R78的耐受性。LC/T的S1'口袋未被优化亦可能解释为何P2'位点E78突变对LC/T底物裂解的影响比LC/B底物裂解更大。先前的研究显示,LC/B的S2'口袋残基(R370)和VAMP2形成盐桥并产生相互作用,而LC/T的S2'口袋残基(R374)和VAMP2之间没有相互作用(38)。为了测试究竟LC/B和LC/T两者不同的S2’-P2’相互作用是否由于S1'口袋的组成未被优化,本实施例测试了LC/T[L230I,R374E]切割VAMP2E78R的效率。LC/T[L230I,R374E]不能裂解VAMP2,但LC/T[L230I,R374E]能够裂解VAMP2而且效率高于LC/T(表2)。数据显示,LC/T的S1'口袋结构较不合适,不利于LC/T的R374和VAMP2的E78的直接相互作用。
表2
LC/T裂解VAMP2及VAMP2E
78
R的补偿性突变实验结果
EC50指裂解50%VAMP2或VAMP2E78R所需的LC蛋白浓度。
优化S1'及S1底物识别口袋进一步提高LC/T的活性
先前的研究确定两个残基有助于提升LC/T的活性(38)。S1口袋残基突变(LC/T[K168E]),和S3口袋残基突变(LC/T[R188M]),被发现可提高LC/T的催化活性(38)。本实施例将上述两个突变加到LC/T[L230I]中以测试这些突变的组合如何影响LC/T的活性。双突变的突变体LC/T[K168E,L230I]的kcat数值提高,但其Km数值没有改变,显示它比原型LC/T(Wt-LC)裂解VAMP2的活性高约100倍(表1,图2A)。三重突变的突变体LC/T[K168E,L230I,R188M]刚未有观察到切割VAMP2的活性。这三个残基均位于LC/T的活性部位,同时突变三个残基可能影响LC/T的正确构象因而丧失活性(表1)。
LC/TL
230
侧链的方向影响识别P1’及P2’位点的优化
异亮氨酸和亮氨酸是疏水氨基酸,很可能通过疏水相互作用与VAMP2F77产生相互作用。然而,在LC/B和LC/T的情况下,我们发现LC/B和LC/TS1'口袋中的异亮氨酸的相互作用较为显着。这可能是由于该异亮氨酸残基在口袋內具有不同的定向并有利于与VAMP2F77的相互作用。LC/B和LC/TS1'口袋的结构分析显示LC/B的I227的定向比LC/T的L230更平坦。位于LC/T的亮氨酸较大,可能将VAMP2F77残基向外推,从而限制了R374和VAMP2的E78之间的相互作用。而LC/B的异亮氨酸的定向更平坦,可以提供最佳位置让VAMP2的F77和E78嵌合到LC/B的活性部位,因而有利于I227-F77和R370-E78的相互作用。
本实施例解构了LC/T[K168E,L230I]的晶体结构并将之与原型LC/T(WT-LC/T)的晶体结构比较。图3A显示LC/T[K168E,L230I]结构中L230I的Fo-Fc电子密度。LC/T[K168E,L230I]与原型LC/T(WT-LC/T)兩者的结构可以一致地对齐,均方根差(RootMeanSquareDeviation,RMSD)为0.150(即421个原子中有370个对齐),表示LC/T[K168E,L230I]的整体构象与原型LC/T(WT-LC/T)相近。LC/T[K168E,L230I]亦与原型LC/B(WT-LC/B)的结构一致地对齐,均方根差为0.750(即421个原子中有341个原子对齐)。分析结果显示,LC/T的亮氨酸突变成异亮氨酸将S1'口袋弄平至与LC/B相若的位置(图3)。最重要的是,LC/T的L230和R374的侧链之间的距离估计为(图4A),LC/B的I227和R370的侧链之间的距离为(图4B)。当L230突变成为异亮氨酸(L230I)时,LC/T的I230和R374侧链之间的距离为(图4C),比原型LC/T(WT-LC/T)的L230和R374的侧链距离为大(图4A)。这些数据进一步确认识别VAMP2的P1'和P2'位点的效率取决于LC/B和LC/T其S1'和S2'口袋之间的距离。S1'和S2'口袋之间更广阔的空间有利容纳VAMP2的P1'位点残基F77和P2'位点残基E78进入这两个口袋。
表3
LC/T[K
168
E,L
230
I]晶体参数衍射数据
LC/T、LC/B及其衍生物裂解内源性VAMP2的活性
为了测试LC/T衍生物裂解神经细胞中天然底物VAMP2的活性,本实施例将各种LC/T衍生物与取自Neuro2A的细胞裂解物一同温肓。如图5A所示,LC/T[K168E,L230I]裂解Neuro2A细胞的内源性VAMP2的活性较原型LC/T(Wt-LC/T)的活性高。相近地,如图5B所示,LC/B[S201P]裂解内源性VAMP2的活性亦较原型LC/B(Wt-LC/B)的活性高。
如图5A和5B的直方图所示,LC/T及LC/T[K168E,L230I]裂解内源性VAMP2的活性比LC/B及LC/B[S201P]的更低,即使LC/T[K168E,L230I]裂解重组VAMP2的活性比原型LC/B(Wt-LC/B)的稍高。神经元复杂的识别VAMP2机制或可解释在此观察的现象。在神经元中,VAMP2与SNAP25和突触融合蛋白1a(syntaxin1a)形式SNARE复合物。因此,除了VAMP2相对LC/B和LC/T的可及性外,其他因素亦可能影响毒素裂解天然VAMP2的效率。先前有关LC/A的研究发现,除了底物识别区域外,LC/A亦在SNARE复合物以外的其他位点与SNAP25产生相互作用以取得与SNAP25的初始接触(45)。这将需要进一步的研究以找出位于SNARE复合物中的VAMP2是否对LC/B和LC/T有不同的可及性。
总括而言,这些数据表明LC/B比LC/T对天然VAMP2底物有更高的裂解活性,意味著LC/B比LC/T更合适于在人类治疗中使用。
讨论
血清型A轻链(LC/A)的活性位点残基的突变[K165L],可提高底物水解4倍(44)。此外,S4口袋突变[R188M],可提高LC/T底物水解大约5倍(38)。本发明提供LC/B和LC/T的比较研究并展示改造梭菌属神经毒素轻链以提高毒素活性的可能性。
本发明发现LC/T的S1口袋的赖氨酸(K168)改变为谷氨酸(E168)可提高裂解VAMP2的速率至与LC/B相若的水平。
优化LC/T底物识别口袋
本发明发现,S1'口袋对LC/B和LC/T两种毒素的催化活性最为重要。LC/T的亮氨酸-230(L230)的侧链比LC/B的异亮氨酸-227(I227)大,因此不利容纳位于VAMP2P1'和P2'位点的残基,并显着地影响其催化活性(图3-4)。突变体LC/T[L230I]比原型LC/T(Wt-LC/T)具有高约25倍的催化活性(表2)。
本发明的发现说明肉毒杆菌神经毒素各个口袋在识别VAMP2上有密切的关系。例如,未被优化的S1'口袋能影响S2'口袋识别VAMP2。突变体LC/T[L230I]具有高约25倍的催化活性,而双突变体LC/T[K168E,L230I]则具有高约100倍的催化活性(表2)。
优化LC/B的S1'和S1底物识别口袋
LC/B的天然残基异亮氨酸-227(I227)有利于裂解VAMP2。然而,LC/B的S1口袋中的天然丝氨酸-201(S201)似乎比LC/T中相应的脯氨酸残基(P205)较不合适。本发明发现,LC/B[S201P]突变可以提高LC/B的活性多于10倍(表1)。
比较LC/B和LC/T对重组VAMP2和天然VAMP2的活性
本发明发现,LC/T[L230I]及LC/T[K168E,L230I]裂解重组VAMP2的活性比原型毒素的更高(表2)。本研究还发现,LC/T[K168E,L230I]裂解Neuro2A细胞中原有的VAMP2的活性比原型毒素更高(图5A)。本发明更具活性的LC/T衍生物可以作为更有效的工具以研究中央神经元的胞吐作用机制。
本发明显示LC/B[S201P]裂解重组VAMP2的活性比原型毒素的活性高于10倍(表1),对裂解Neuro2A中原有的VAMP2亦具有更高的活性(图5B)。本发明所述LC/B衍生物可以代替现时在各种治疗、化妆品或其它应用中使用的LC/B蛋白,或发展成为新颖疗法以尽量减低BoNT的免疫耐药性。
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41.Atassi,M.Z.,Jankovic,J.,Steward,L.E.,Aoki,K.R.,andDolimbek,B.Z.(2012)MolecularimmunerecognitionofbotulinumneurotoxinB.Thelightchainregionsthatbindhumanblockingantibodiesfromtoxin-treatedcervicaldystoniapatients.AntigenicstructureoftheentireBoNT/Bmolecule,Immunobiology217,17-27.
42.Dolimbek,B.Z.,Aoki,K.R.,andAtassi,M.Z.(2011)ReductionofantibodyresponseagainstbotulinumneurotoxinAbysyntheticmonomethoxypolyethyleneglycol-peptideconjugates,ImmunolLett137,46-52.
43.Foster,K.A.(2009)Engineeredtoxins:newtherapeutics,Toxicon54,587-592.
44.Ahmed,S.A.,Olson,M.A.,Ludivico,M.L.,Gilsdorf,J.,andSmith,L.A.(2008)IdentificationofresiduessurroundingtheactivesiteoftypeAbotulinumneurotoxinimportantforsubstraterecognitionandcatalyticactivity,ProteinJ27,151-162.
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Claims (17)
1.一种经改造的肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白,其特征在于,所述肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列为SEQIDNO.:1,所述轻链蛋白包含一个或多个如SEQIDNO.:1所示的氨基酸的变异。
2.权利要求1所述的轻链蛋白,其特征在于,所述氨基酸的变异选自:Ser201,Ala263和Ile264。
3.权利要求1所述的轻链蛋白,其特征在于,包含SEQIDNO.:2的氨基酸序列。
4.一种包含权利要求1所述的轻链蛋白的组合物,其特征在于,所述轻链蛋白与一个或多个的第二种蛋白融合或偶合,所述第二种蛋白为源自肉毒杆菌神经毒素或其他生物的蛋白。
5.权利要求4所述的组合物,其特征在于,所述第二种蛋白是天然蛋白或人工蛋白。
6.一种组合物,其特征在于,包含权利要求1所述的轻链蛋白和一个药学可接受的载体。
7.一种用于改善或治疗受试者的疾病或状况的方法,其特征在于,所述方法包含给予受试者有效份量的如权利要求1所述的轻链蛋白。
8.权利要求7所述的方法,其特征在于,所述疾病或状况选自:斜视,眼睑痉挛,半面痉挛,颈部肌张力障碍,痉挛,眉间面部线条,腋窝多汗症,不随意肌痉挛,下泌尿道毛病,胃肠道毛病,痉挛性发声困难,颞下颌关节症,慢性糖尿病性神经病,创伤愈合,阴道痉挛,肌肉骨骼疼痛和不随意肌收缩。
9.权利要求7所述的方法,其特征在于,所述受试者相比接受原型肉毒杆菌神经毒素治疗的受试者产生较少的肉毒杆菌神经毒素的免疫耐药性。
10.一种经改造的破伤风神经毒素轻链蛋白,其特征在于,所述破伤风神经毒素的氨基酸序列为SEQIDNO.:3,所述轻链蛋白包含一个或多个如SEQIDNO.:3所示的氨基酸的变异。
11.权利要求10所述的轻链蛋白,其特征在于,所述氨基酸的变异选自:Lys168和Leu230。
12.权利要求10所述的轻链蛋白,其特征在于,包含SEQIDNO.:4或5的氨基酸序列。
13.一种包含权利要求10所述的轻链蛋白的组合物,其特征在于,所述轻链蛋白与一个或多个的第二种蛋白融合或偶合,所述第二种蛋白为源自破伤风神经毒素或其他生物的蛋白。
14.权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述第二种蛋白是天然蛋白或人工蛋白。
15.权利要求13所述的组合物,其特征在于,所述组合物作为分子标记用于研究神经元的胞吐作用。
16.一种组合物,其特征在于,包含权利要求10所述的轻链蛋白和一个药学可接受的载体。
17.一种用于改善或治疗受试者的疾病或状况的方法,其特征在于,所述方法包含给予受试者有效份量的如权利要求10所述的轻链蛋白。
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